· Université Victor Segalen Bordeaux 2 Année 2010 Thèse n° THÈSE pour le DOCTORAT DE...

Université Victor Segalen Bordeaux 2

Année 2010

Thèse n°

THÈSE

pour le

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2

Mention : Sciences Biologiques et Médicales

Option : Biologie-Santé

Présentée et soutenue publiquement

Le 20 Décembre 2010

Par Fabien LABROUSSAA

Né le 15 Mars 1984 à Pau (Pyrénées-Atlantiques)

INTERACTIONS ENTRE SPIROPLASMA CITRI

ET SON INSECTE VECTEUR CIRCULIFER HAEMATOCEPS

La phosphoglycérate kinase de S. citri : une « actin-binding protein » impliquée dans la transmission du spiroplasme par la cicadelle

Membres du Jury M. BONNEU M., Professeur à l’IPB ENSTBB de Bordeaux............................ Président Mme. BRAULT V., Directrice de Recherche à l’INRA de Colmar ................... Rapporteur M. HEDDI A., Professeur à l’INSA de Lyon ..................................................... Rapporteur Mme. MARZACHI C., Chercheur à l’Institut de Virologie Végétale de Turin . Examinateur M. LANDRY M., Professeur à l’Université de Bordeaux 2 ............................... Examinateur Mme. SAILLARD C., Maître de Conférence à l’Université de Bordeaux 2 Directrice de thèse

THÈSE

pour le

DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 2

Mention : Sciences Biologiques et Médicales

Option : Biologie-Santé

Présentée et soutenue publiquement

Le 20 Décembre 2010

Par Fabien LABROUSSAA

Né le 15 Mars 1984 à Pau (Pyrénées-Atlantiques)

INTERACTIONS ENTRE SPIROPLASMA CITRI

ET SON INSECTE VECTEUR CIRCULIFER HAEMATOCEPS

La phosphoglycérate kinase de S. citri : une « actin-binding protein » impliquée dans la transmission du spiroplasme par la cicadelle

A mon père

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RemerciementsRemerciementsRemerciementsRemerciements

Ce travail a été réalisé dans le laboratoire de l’Unité Mixte de Recherche 1090 Génomique et Diversité du Pouvoir Pathogène (Institut National de la Recherche Agronomique et Université Victor Ségalen Bordeaux 2), dirigé par Mr Alain Blanchard, sous la direction de Mme Colette Saillard. Je tiens tout d’abord à remercier Mr Blanchard pour m’avoir permis de réaliser ma thèse, ainsi que mes précédents stages de Master 1 et 2, dans son laboratoire. Je souhaite également remercier Mr Bonneu de me faire l’honneur de présider ce jury. Je tiens à adresser mes plus sincères remerciements à Mme V. Brault et Mr A. Heddi d’avoir accepté d’examiner et de juger ce manuscrit. Je remercie également Mme C. Marzachi et Mr M. Landry d’avoir accepté de participer à ce jury de thèse. Un grand merci à Colette pour m’avoir accompagné pendant ces quatre dernières années. Merci pour son encadrement de chaque instant, pour m’avoir laissé la liberté de m’exprimer pleinement dans mon travail. Merci également pour les nombreuses heures passées à la correction de ce manuscrit et aussi lors de chacune de mes présentations orales. Si ces années de thèse ont été un réel plaisir pour moi, c’est en grande partie grâce à elle. J’espère que si j’avais à être le dernier thésard de ta carrière, j’aurais été à la hauteur de mes prédécesseurs. J’adresse aussi un grand merci à Joël et Sybille pour leur encadrement pendant mon stage de M1. Merci à Joël pour toutes les discussions scientifiques ou non, très utiles tout au long de ces années. Merci à Sybille pour son encadrement et sa rigueur qui m’ont apporté toutes les bases indispensables au travail de laboratoire. Merci à vous deux pour votre soutien. Je tiens à remercier Marie-Pierre pour sa formidable gentillesse et sa disponibilité sans failles. Merci pour m’avoir formé à toutes les techniques de Protéomique. Merci aussi pour m’avoir épargné de nombreuses taches chronophages (commandes, micro-injections des insectes, solutions, etc…). J’adresse un grand merci à Nathalie, ma nouvelle voisine de bureau, pour tout ce temps consacré aux manips de microscopie confocale. Merci aussi pour les cellules de Circulifer haematoceps. Mon travail n’aurait pas été le même sans le tien. Promis ! A la fin de ma thèse, je te donne mon bureau que tu jalouses depuis ces derniers mois ! Je remercie énormément Laure, une des rares personnes au monde à se battre pour faire des tests statistiques ! Merçi d’avoir consacrer du temps à l’éveil d’un néo-biochimiste. Je remercie ici une source intarissable d’idées, de conseils et de connaissances dans de nombreux domaines scientifiques. Je tiens également à remercier Michel Castroviejo pour avoir accepté de me prêter pour quelques heures tous ses appareils de chromato mais aussi pour sa gentillesse au cours de chacune de mes visites. Un grand Merci collectif et sincère à tout le labo « Molli ». Aux « IPPistes », Pascal SP, Claire et Guillaume et pour le travail sur Mycoplasma mycoïdes. A toute l’équipe « Phyto » au sens large : Xavier, Sylvie, Delphine, Anne, Gulnara, Sandrine, Christophe, Jam, Pascal S et Jean-Luc. A Jacqueline pour ces conseils et pour tous les autoclavages réalisés en « urgence ».

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Aux « serristes », Kaelig et Denis, pour s’occuper de toutes nos bizarreries, pour leurs connaissances pour le secours et le dépannage d’appareils défectueux, sans oublier leurs talents pour le barbecue ! Vous êtes dignes de votre illustre prédécesseur, Patrick, que je remercie également sincèrement pour son travail et sa personnalité. Aux secrétaires, Evelyne et Isa, pour leurs disponibilités et leurs sourires. Peut-être que j’arriverais un jour à vous pardonner pour les pérégrinations italiennes…. Merci aussi à Marc, Laure, Clothilde et Cédric pour les moments « détente » : pause-café, Sodexo et quelques soirées. Je me souviendrais encore longtemps des discussions non-scientifiques improbables et variées qui animaient ces moments-là. Merci à Marc pour m’avoir enseigné tous les secrets du « Bob Whitcomb Award » ! J’ai une pleine bacholle de souvenirs, y’en aura de reste ! Je tiens à remercier Suzann pour avoir mis à ma disposition ses indéniables talents artistiques pour le dessin de Circulifer haematoceps. J’espère arriver à le mettre aussi bien en valeur que ce qu’il le mérite. Toutes les brèves discussions de fin d’après-midi étaient un réel plaisir. Je remercie également Lise et Laura pour leur travail au cours de leurs stages de M1. Bonne chance à vous pour la suite. Anne, Claire et Jam, compagnons de thèse, une pensée spéciale pour vous. Bonne chance pour la suite et j’espère qu’on aura la chance de se revoir plus tard dans quelques congrès sur quelques îles paradisiaques….

En résumé, un grand merci à vous tous qui m’avait permis d’évoluer dans un cadre agréable et propice au travail et fait de ma thèse une superbe expérience et un tremplin pour ma carrière.

Assez parlé travail ! Je remercie, du fond du cœur, mes parents qui m’ont toujours permis d’étudier en toute sérénité. Merci

pour l’intérêt que vous avez toujours porté à mes études. Je vous en serais éternellement reconnaissant. Je remercie toute ma « famille ». Merci de votre soutien pendant toutes ces années et de m’avoir permis

de m’échapper du monde de la Recherche à chaque fois. Yves, Marie-Lucienne, Ben, Carole, Arnaud (compagnon de galère…Courage !) et Poys, merci de m’avoir accueilli dans votre tribu et fait partager de si bons moments.

Un grand merci à tous mes amis et plus particulièrement Flo, Céc, David, Camille et Lio. Que ce soit à

Paris, Brive, Seignosse ou Pau, il y avait toujours une bonne excuse pour fêter quelque chose ! Bonne nouvelle, voilà une nouvelle raison de faire la fête !

Même si mes recherches restent relativement floues et obscures pour beaucoup d’entre vous, je n’aurais

rien réussi sans vous ! Une dernière pensée toute particulière pour Marie qui m’a supporté avant la thèse, pendant ma thèse

(miracle !) et qui, j’espère, me supportera encore de longues années après.

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Liste des publications et des communications à des congrès Labroussaa, F.; Dubrana, M.P., Béven, L., Arricau-Bouvery, N. & Saillard, C. A minimal actin-binding region of the S.citri phosphoglycerate kinase is implicated in the transmission process by the insect vector Circulifer haematoceps. Soumis à publication à Applied and Environmental Microbiology . Labroussaa, F. ; Arricau-Bouvery, N. ; Dubrana, M.P. & Saillard, C. Entry of Spiroplasma citri into Circulifer haematoceps cells involves interaction between spiroplasma phosphoglycerate kinase and leafhopper actin. Applied and Environmental Microbiology. 2010, 76(6); 1879-1886. Labroussaa, F., Arricau-Bouvery, N., Breton, M., Dubrana, M.P., Duret, S., Bové, J.M., Renaudin, J. & Saillard, C*. Transmission of the phytopathogenic mollicute “Spiroplasma citri” by its leafhopper vector “Circulifer haematoceps” involves plasmid-encoded determinants and phosphoglycerate kinase protein from the spiroplasma. 18th Conference of the International Oraganization of Citrus Virologists (IOCV), 8-12/11/2010, Campiñas (Brésil). COMMUNICATION ORALE. Labroussaa, F.*; Dubrana, M.P., Béven, L., Arricau-Bouvery, N. & Saillard, C. Deciphering the role of the Spiroplasma citri phosphoglycerate kinase in the internalization into its insect vector cells. 16ème colloque Biologie de l’Insecte, 18-20/09/2010, Lyon. COMMUNICATION ORALE. Labroussaa, F.*; Dubrana, M.P., Arricau-Bouvery, N. & Saillard, C. Interactions between Spiroplasma citri and its insect vector Circulifer haematoceps: the dual role of the phosphoglycerate kinase. 18ème Congrès de l’Organisation Internationale de Mycoplasmologie (IOM), 11-16/07/2010, Chianciano (Italie). COMMUNICATION ORALE récompensée par le prix Robert Whitcomb. Béven, L., Bouyssou, G., Charenton, C., Dautant, A., Labroussaa, F., Sköllermo, A., Perrson, A., Blanchard, A. & Sirand-Pugnet, P.

Putative membrane ATPase of mycoplasmas: a specific evolution of ATP synthase F1 subunit. 18ème Congrès de l’Organisation Internationale de Mycoplasmologie (IOM), 11-16/07/2010, Chianciano (Italie). POSTER. Labroussaa, F.*; Arricau-Bouvery, N. ; Dubrana, M.P. & Saillard, C. Transmission de S.citri par son insecte vecteur: rôle de la phosphoglycérate kinase dans l’invasion des cellules de l’hôte. 10ème Journée scientifique de l'Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé; 28/04/2010; Arcachon. POSTER. Labroussaa, F.*; Arricau-Bouvery, N. ; Dubrana, M.P. & Saillard, C. Interactions entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur, la cicadelle Circulifer haematoceps : le double jeu de la phosphoglycérate kinase. 9ème Rencontres Plantes-Bactéries ; 18-22/01/2010, Aussois. COMMUNICATION ORALE.

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Labroussaa, F. ; Arricau-Bouvery, N.*; Dubrana, M.P. & Saillard, C. La phosphoglycérate kinase inhibe l'internalisation de Spiroplasma citri dans les cellules en culture de son insecte vecteur Circulifer haematoceps. Congrès IMMUNINV; 21-23/10/2009; Poitiers. COMMUNICATION ORALE. Labroussaa, F.*; Dubrana, M.P. ; Saillard, C. & Arricau-Bouvery, N. Interactions protéine-protéine entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circulifer haematoceps. 1ère Journées des doctorants du Département SPE, 2-3/09/2009, Rennes. COMMUNICATION ORALE. Labroussaa, F. ; Dubrana, M.P. ; Saillard, C. & Arricau-Bouvery, N*. La phosphoglycérate kinase de Spiroplasma citri, une actin-binding protein impliquée dans l'internalisation du spiroplasme dans les cellules de son insecte vecteur. 7ème Colloque national de la Société Française de Phytopathologie (SFP); 08-11/06/2009; Lyon. COMMUNICATION ORALE. Labroussaa, F.*; Dubrana-Ourabah, M.P. ; Bouvery, N. & Saillard, C. Interaction protéines-protéines entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circulifer haematoceps : identification de protéines d'insectes potentiellement impliquées dans la transmission. 9ème Journée scientifique de l'Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé; 08/04/2009; Arcachon. POSTER. Labroussaa, F.*; Dubrana-Ourabah, M.P. ; Bouvery, N. & Saillard, C. Mise en évidence chez la cicadelle Circulifer haematoceps, de protéines potentiellement impliquées dans la transmission de Spiroplasma citri. 8ème Rencontres Plantes-Bactéries ; 14-18/01/2008; Aussois. COMMUNICATION ORALE récompensée par le prix de la meilleure communication orale. Labroussaa, F. ; Bouvery, N. ; Dubrana-Ourabah, M.P. & Saillard, C*. Interaction between Spiroplasma citri and the actin cytoskeleton of its insect vector's salivary gland cells. 17ème Congrès de l’Organisation Internationale de Mycoplasmologie (IOM); 06-11/07/2008; Tianjin (Chine). COMMUNICATION ORALE. Labroussaa, F. ; Dubrana-Ourabah, M.P.*; Bouvery, N. & Saillard, C. Interaction protéines-protéines entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circulifer haematoceps : identification de protéines d'insectes potentiellement impliquées dans la transmission. 7ème Rencontre francophone de Mycoplasmologie; 17-18/07/2007; Lyon. COMMUNICATION ORALE. Bouvery, N.*; Labroussaa, F. ; Martin, E. ; Dubrana, M.P. ; Renaudin, J. & Saillard, C. Interaction entre les protéines de Spiroplasma citri et celles du cytosquelette des cellules des glandes salivaires de son insecte vecteur Circulifer haematoceps. 15ème Colloque Physiologie de l'Insecte; 09-11/07/2007; Rennes. COMMUNICATION ORALE. * auteur qui a présenté la communication ou le poster.

Table des matières

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INTRODUCTION I. Les mollicutes .................................................................................................................. 12

1. Taxonomie......................................................................................................................... 12 2. Phylogénie......................................................................................................................... 13 3. Evolution et caractéristiques importantes ......................................................................... 13

II. Mollicutes phytopathogènes............................................................................................. 14 1. Phytoplasmes..................................................................................................................... 15 2. Spiroplasmes phytopathogènes ......................................................................................... 16

2.1. Spiroplasma phoeniceum et Spiroplasma kunkelii.................................................... 16 2.2. Spiroplasma citri....................................................................................................... 17

2.2.1. Description de la maladie et mise en culture..................................................... 17 2.2.2. Caractéristiques de S. citri................................................................................. 18 2.2.3. S. citri, un organisme modèle pour l’élaboration d’outils génétiques............... 19

III. Transmission de microorganismes intracellulaires .......................................................... 21 1. Transmission par insecte vecteur ...................................................................................... 21

1.1. Relation entre le microorganisme et son insecte....................................................... 21 1.1.1. Transmission externe......................................................................................... 21 1.1.2. Transmission intracellulaire .............................................................................. 21 1.1.3. Relation entre les spiroplasmes et leurs insectes............................................... 22

1.2. Insectes vecteurs........................................................................................................ 23 1.2.1. Vecteurs mollicutes phytopathogènes............................................................... 23

1.2.1.1. Classification................................................................................................. 23 1.2.1.2. Vecteurs de S. citri........................................................................................ 23 1.2.1.3. Morphologie des cicadelles........................................................................... 24

1.2.2. Circuit du spiroplasme dans l’insecte................................................................ 25 2. Cycle cellulaire de la transmission.................................................................................... 26

2.1. Adhésion.................................................................................................................... 27 2.1.1. Adhésines de type fibrillaire ............................................................................. 27

2.1.1.1. Bactéries à Gram-négatif............................................................................... 27 2.1.1.2. Bactéries à Gram-positif................................................................................ 29

2.1.2. Adhésines de type non-fibrillaire ...................................................................... 30 2.1.2.1. Autotransporteurs .......................................................................................... 30 2.1.2.2. Effecteur Tir (translocated intimin receptor) ................................................30 2.1.2.3. Hémagglutinine filamenteuse (FHA) ............................................................31 2.1.2.4. Système de sécrétion de type 3 (SSTT) ........................................................31

2.1.3. Adhésion chez les mollicutes ............................................................................ 33 2.1.3.1. Mycoplasmes................................................................................................. 33 2.1.3.2. Phytoplasmes................................................................................................. 33 2.1.3.3. Spiroplasmes ................................................................................................. 35

2.2. Internalisation............................................................................................................ 35 2.2.1. Voie clathrine-dépendante................................................................................. 35 2.2.2. Phagocytose....................................................................................................... 36

2.2.2.1. « Zipper » mécanisme ................................................................................... 36 2.2.2.2. « Trigger » mécanisme.................................................................................. 37 2.2.2.3. Voie dépendante des microtubules................................................................ 37

2.2.3. Mycoplasmes..................................................................................................... 38 2.2.4. Virus .................................................................................................................. 39 2.2.5. Franchissement de la barrière des glandes salivaires ........................................ 40

2.3. Echappement à la machinerie lysosomiale................................................................ 41 2.3.1. Arrêt de la maturation des phagosomes ............................................................ 41

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2.3.2. Libération de la vacuole .................................................................................... 42 2.3.3. Détournement du système lysosomial............................................................... 42

2.4. Dissémination dans l’hôte ......................................................................................... 42 3. Déterminants génétiques de la transmission de Spiroplasma citri.................................... 43

3.1. Transmission expérimentale de S. citri..................................................................... 43 3.2. Identification de protéines chez S. citri candidates dans la transmission.................. 44

IV. Situation du sujet et objectifs de recherche...................................................................... 46 CHAPITRE 1: Interactions protéine-protéine entre S. citri et son insecte vecteur Circulifer haematoceps I. Introduction et objectifs ................................................................................................... 48 II. Résultats et discussion...................................................................................................... 51

1. Publication 1...................................................................................................................... 51 2. Résultats supplémentaires ................................................................................................. 52

2.1. Identification de protéines d’insectes impliquées dans une interaction avec S. citri 52 2.1.1. Comparaison des far Western monodimensionnels (1-D) réalisés avec les protéines totales et de glandes salivaires d’insectes.......................................................... 52 2.1.2. Far Western bi-dimensionnel (2-D) avec les protéines totales et celles des glandes salivaires d’insectes.............................................................................................. 53 2.1.3. Identification des protéines d’insectes impliquées par spectrométrie de masse 54

2.1.3.1. Signaux d’interaction communs aux deux far Western. ........................... 54 Signal d’interaction à 42 kDa : l’actine..................................................................... 54 Signal d’interaction à 50 kDa : la tubuline................................................................ 55 Signal d’interaction à 25 kDa : Rab GTPases ...........................................................56

2.1.3.2. Signal spécifique du far Western réalisé avec les protéines des glandes salivaires d’insectes....................................................................................................... 57

Signal d’interaction à 27 kDa : la protéine 14-3-3 ....................................................57 2.2. Recherche et identification du partenaire de l’actine chez S. citri............................ 57

2.2.1.1. Transmembrane conserved hypothetical lipoprotein (SPICI 03-098)........... 58 2.2.1.2. La phosphoglycérate kinase (PGK)............................................................... 59

III. Conclusion........................................................................................................................ 59 CHAPITRE 2: Caractérisation de la région minimale de liaison à l’actine de la PGK de S. citri et implication dans la transmission I. Introduction et objectifs ................................................................................................... 62 II. Résultats et discussion...................................................................................................... 64

1. Publication 2...................................................................................................................... 64 2. Résultats supplémentaires et discussion............................................................................ 74

2.1. Recherche du mécanisme d’interaction entre la PGK et l’actine.............................. 74 2.2. Recherche d’homologie de séquences chez la PGK d’autres organismes. ............... 76 2.3. Localisation de la PGK ............................................................................................. 77

III. Conclusion........................................................................................................................ 78 CHAPITRE 3: Réalisation d’un mutant de S. citri dépourvu de phosphoglycérate kinase I. Introduction ...................................................................................................................... 80 II. Résultats ........................................................................................................................... 81

1. Construction du vecteur pGOTpgk................................................................................... 81 2. Obtention et sélection des clones délétés dans le gène pgk............................................... 82

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3. Recherche du site d’intégration du pGOTpgk dans le chromosome de S. citri ................ 83 3.1. Approche par PCR pour détecter une intégration au niveau de l’OriC ou du promoteur de la spiraline....................................................................................................... 84 3.2. Approche par PCR « aléatoire »................................................................................ 84

4. Identification des gènes dans le chromosome de S. citri ayant subi l’intégration ............ 85 III. Discussion et conclusion .................................................................................................. 86 CHAPITRE 4: Étude préliminaire de complexes protéiques impliqués dans la transmission de S.citri par l’insecte vecteur I. Introduction et objectifs ................................................................................................... 88 II. Résultats et discussion...................................................................................................... 90

1. Recherche de complexes par la technique de BN-PAGE chez S. citri. ............................ 90 1.1. Extraction et analyse des complexes membranaires. ................................................91 1.2. Extraction et analyse des complexes cytosoliques.................................................... 92

2. Recherche chez S. citri des complexes impliquant la PGK .............................................. 94 2.1. Protéines associées à la PGK dans des complexes connus ....................................... 96

III. Discussion et conclusion .................................................................................................. 99 DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES I. Hypothèses concernant le cycle de S. citri dans l'insecte C. haematoceps.................... 102

1. Franchissement de la barrière de l'épithélium intestinal ................................................. 102 2. Franchissement de la barrière des glandes salivaires ...................................................... 102

2.1. Franchissement de la lame basale des glandes salivaires........................................ 102 2.2. Adhésion au plasmalemme des glandes salivaires.................................................. 103 2.3. Internalisation dans les cellules des glandes salivaires ........................................... 104 2.4. Devenir des vésicules d'endocytose contenant S. citri............................................ 105 2.5. Libération dans le canal salivaire ............................................................................ 105

II. Perspectives.................................................................................................................... 106 MATERIELS ET METHODES I. Matériel biologique ........................................................................................................ 109

1. Spiroplasma citri : souches et conditions de culture....................................................... 109 2. Escherichia coli : souches et utilisation .......................................................................... 109 3. L’insecte vecteur : la cicadelle Circulifer haematoceps................................................. 110

3.1. Origine et conditions d’élevage............................................................................... 110 3.2. Capture et dissection des cicadelles ........................................................................ 110 3.3. Obtention d’une lignée cellulaire ............................................................................ 111

II. Plasmides........................................................................................................................ 111 1. Commerciaux .................................................................................................................. 111

1.1. pBS.......................................................................................................................... 111 1.2. pET28a(+) ............................................................................................................... 112

2. Obtenus au laboratoire .................................................................................................... 112 2.1. pGOT1..................................................................................................................... 112

III. Méthodes d’analyse d’ADN........................................................................................... 113 1. Purification de l’ADN génomique de S. citri.................................................................. 113 2. Purification de l’ADN plasmidique................................................................................. 113 3. Purification de fragments d’ADN à partir de gel d’agarose............................................ 113 4. Hydrolyse par les endonucléases de restriction............................................................... 114

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5. Analyse des fragments d’ADN sur gel d’agarose ........................................................... 114 6. Amplification d’ADN par PCR....................................................................................... 114 7. Mutagénèse dirigée ......................................................................................................... 115 8. Clonage de fragment d’ADN amplifié par PCR ............................................................. 115

8.1. Préparation du fragment PCR ................................................................................. 115 8.2. Préparation du vecteur............................................................................................. 116 8.3. Ligation du fragment PCR et de son vecteur .......................................................... 116

9. Transformation des bactéries .......................................................................................... 116 9.1. E. coli ...................................................................................................................... 116

9.1.1. Electrocompétentes ......................................................................................... 116 9.1.2. Chimiocompétentes......................................................................................... 117

9.2. S. citri...................................................................................................................... 118 10. Marche sur le chromosome ......................................................................................... 118

IV. Méthodes d’analyse des protéines.................................................................................. 119 1. Extraction des protéines .................................................................................................. 119

1.1. Préparation des protéines de S. citri........................................................................ 119 1.1.1. Protéines pour l’électrophorèse mono-dimensionnelle ................................... 119 1.1.2. Protéines pour l’électrophorèse bi-dimensionnelle ......................................... 120 1.1.3. Fractionnement des protéines membranaires .................................................. 120

1.2. Préparation des protéines de C. haematoceps......................................................... 120 1.2.1. Totales ............................................................................................................. 120 1.2.2. Glandes salivaires............................................................................................ 121 1.2.3. Pour l’électrophorèse bi-dimensionnelle......................................................... 121

2. Production de protéines recombinantes tagguées His6.................................................... 121 2.1. His6-PGK................................................................................................................. 121 2.2. His6 PGK FL1, 2, 3, 4, 5 ......................................................................................... 122

3. Purification des protéines par chromatographie liquide.................................................. 123 3.1. Colonne de protein A Sépharose CL-4B................................................................. 123 3.2. Purification de protéines recombinantes ................................................................. 124

3.2.1. IMAC (immobilized metal affinity chromatography)..................................... 124 3.2.2. Chromatographie d’exclusion ......................................................................... 125 3.2.3. Fractionnement sur colonne échangeuse d’ions.............................................. 126

4. Dosage des protéines....................................................................................................... 126 4.1. Bradford .................................................................................................................. 126 4.2. Bradford modifié ..................................................................................................... 126

5. Séparation des protéines en gel d’électrophorèse........................................................... 127 5.1. Electrophorèse mono-dimensionnelle ..................................................................... 127

5.1.1. Gels de polyacrylamide à concentration constante ......................................... 127 5.1.2. Gels en gradient de polyacrylamide 4-15 % ................................................... 127

5.2. Electrophorèse bi-dimensionnelle ........................................................................... 128 6. Visualisation des protéines après électrophorèse............................................................ 129

6.1. Coloration au bleu colloïdal .................................................................................... 129 6.2. Coloration au nitrate d’argent classique.................................................................. 129 6.3. Coloration au nitrate d’argent compatible avec la spectrométrie de masse ............ 130

6.3.1. Méthode O’Connell et al, 1997....................................................................... 130 6.3.2. Kit Proteosilver™ Silver Stain........................................................................ 130

7. Transfert des protéines et détection immunologique ...................................................... 131 7.1. Electrotransfert des protéines sur membrane de nitrocellulose............................... 131 7.2. Détection immunologique des protéines sur membrane ......................................... 131

8. Etude d’interaction protéine-protéine par la technique de far Western .......................... 132 9. Identification des protéines par spectrométrie en masse................................................. 132

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10. Etude des complexes protéines chez S. citri ............................................................... 133 10.1. Technique de Blue-Native PAGE ....................................................................... 133

10.1.1. Préparation des protéines ................................................................................ 133 10.1.2. Electrophorèse des protéines........................................................................... 133

10.1.2.1. 1ère dimension ............................................................................................133 10.1.2.2. 2ème dimension........................................................................................... 134

10.2. Pontage des complexes protéiques associant la PGK chez S. citri ..................... 134 10.2.1. Préparation des protéines ................................................................................ 134 10.2.2. Purification sur colonne de Nickel .................................................................. 135

V. Etude de la transmission expérimentale de S. citri......................................................... 135 1. Transmission à la pervenche de Madagascar Catharanthus roseus................................ 135

1.1. Insectes .................................................................................................................... 135 1.2. Les pervenches de Madagascar ............................................................................... 135 1.3. Micro-injection intra-abdominale des cicadelles .................................................... 135 1.4. Transmission à la pervenche de Madagascar .......................................................... 136 1.5. Symptomatologie .................................................................................................... 136

2. « Recrachage » à travers une membrane de Parafilm® .................................................. 137 2.1. Injection de la culture de S. citri GII3 dans l’insecte .............................................. 137 2.2. Injection des protéines recombinantes dans l’insecte .............................................137 2.3. Transmission à travers une membrane de Parafilm® ............................................. 137 2.4. Mise en culture des spiroplasmes à partir des insectes ...........................................137

3. Effet de la PGK et des peptides sur l’adhésion et/ou l’internalisation............................ 138 3.1. Adhésion.................................................................................................................. 138 3.2. Internalisation.......................................................................................................... 138

4. Observations au microscope confocal............................................................................. 139 4.1. Glandes salivaires de C. haematoceps infectées ..................................................... 139 4.2. Cellules de C. haematoceps incubées avec la His6-PGK........................................ 140

REFERENCES………………………………………………………………………………….141

Introduction

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Introduction

12

Introduction

I. Les mollicutes

Les mollicutes sont des eubactéries sans paroi présents chez l’homme, les animaux, les

insectes et les plantes. Leur découverte date de la fin du 19ème siècle lorsque Nocard et Roux

cultivèrent pour la première fois l’agent de la péripneumonie contagieuse bovine,

Mycoplasma mycoïdes (Nocard & Roux, 1898). Ce nom de mycoplasme ne sera donné qu’en

1929 par Nowak, à la suite de l’apparition de filaments évoquant des formes mycéliennes qui

apparaissent au cours de la culture de cette bactérie. Ce n’est qu’en 1967 que l’ensemble des

mycoplasmes fut regroupé dans la classe des Mollicutes (Edward & Freundt, 1967).

1. Taxonomie

La classe des Mollicutes est constituée de plusieurs centaines d’espèces réparties en 4

ordres, eux-mêmes répartis en 5 familles et 8 genres (Tableau 1.1 ; (Tully et al., 1993; Razin

et al., 1998)).

L’ordre des Mycoplasmatales est constitué d’une seule famille, la famille des

Mycoplasmataceae comprenant deux genres: le genre Mycoplasma et le genre Ureaplasma.

Dans cet ordre, les organismes ont besoin de cholestérol pour leur croissance et sont

majoritairement aérobies. Les mollicutes du genre Ureaplasma ont la capacité d’hydrolyser

l’urée. Leurs hôtes sont préférentiellement l’homme et les animaux.

L’ordre des Acholeplasmatales comprend une seule famille, les Acholeplasmataceae,

ne contenant que le genre Acholeplasma dont les organismes n’ont pas besoin de cholestérol

pour leur croissance. Ces organismes sont quant à eux présents chez les mammifères, les

insectes et les plantes.

L’ordre Anaeroplasmatales regroupe des bactéries, anaérobies, isolées uniquement de

la panse des ruminants et classées en une famille, les Anaeroplasmataceae, comprenant deux

genres. Les membres du genre Anaeroplasma ont besoin de cholestérol pour leur croissance

contrairement aux membres du genre Asteroleplasma.

Les Entomoplasmatales sont des mollicutes isolés de la surface de plantes et

d’arthropodes. Cet ordre est scindé en deux familles : la famille des Entomoplasmataceae,

constituée des deux genres Mesoplasma et Entomoplasma, et celle des Spiroplasmataceae,

représentée par un seul genre, le genre Spiroplasma. Les spiroplasmes sont caractérisés par

Figure I.2: Arbre phylogénétique basé sur les séquences d’ADNrdes Mollicutes.(D’après Sirand-Pugnet, 2007.)

Introduction

13

leur morphologie hélicoïdale et leur motilité. Ils sont plus ou moins exigeants en stérols. Les

habitats des spiroplasmes sont les invertébrés, la surface des plantes mais également, pour

trois d’entre eux uniquement, les tubes criblés du phloème.

De nombreux mollicutes n’ont pas encore été cultivés en milieu acellulaire. De ce fait,

leur statut taxonomique n’a pu être établi selon les standards minimaux de définition

d’espèce. C’est en particulier le cas des phytoplasmes qui se multiplient dans les insectes et

les tubes criblés du phloème.

2. Phylogénie

Des études phylogénétiques basées sur l’ADN 16S de ces bactéries ont montré que les

mollicutes ont évolué de manière régressive à partir d’un ancêtre bactérien à Gram-positif et à

faible pourcentage en base G+C (Woese, 1987). Cet ancêtre serait commun avec certaines

Clostridia, comme Clostridium innocuum et Clostridium ramosum, dont ils partagent la

propriété d’être insensible à la rifampicine (Gadeau et al., 1986). Cette évolution régressive

est marquée notamment par une réduction de la taille de leur génome engendrée par la perte

massive de gènes non essentiels à l’autoréplication.

Ces études ont également permis de situer les phytoplasmes par rapport aux autres

mollicutes (Woese, 1987). Selon ces critères, les phytoplasmes sont apparentés aux

acholéplasmes.

De manière plus surprenante, les mycoplasmes du groupe mycoïdes, ainsi que

Mycoplasma capricolum, appartiennent à la même branche phylogénétique que les

spiroplasmes, bien que se trouvant dans des ordres différents dans la classification

taxonomique.

La classification phylogénétique des mollicutes est représentée figure I.2 où ces

derniers sont regroupés en 4 groupes phylogénétiques distincts : les groupes pneumoniae,

hominis, spiroplasma et phytoplasma/acholeplasma (Sirand-Pugnet et al., 2007).

3. Evolution et caractéristiques importantes

Il a été suggéré que les mollicutes évoluent plus rapidement que les autres bactéries

(Woese et al., 1984). Cette vitesse d’évolution rendrait compte de leur positionnement sur les

plus longues branches de l’arbre universel de la vie (Ciccarelli et al., 2006). De plus, leur

évolution par la perte de certains gènes a influencé certaines propriétés particulières

communes à ces bactéries (tableau I.1). En effet, les mollicutes se distinguent en premier lieu

Introduction

14

par l’absence de paroi rigide à peptidoglycane ce qui les rend constitutivement résistants à

tous les antibiotiques ayant pour cible la paroi bactérienne. Ils se caractérisent également par

une taille de génome réduite qui varie de 580 kpb pour Mycoplasma genitalium à 2200 kpb

pour Spiroplasma ixodetis. Ils possèdent un nombre limité de voies métaboliques ce qui

implique que leur culture in vitro ne peut être obtenue que dans un milieu complexe contenant

notamment du sérum d’origine animale. De plus, l’adaptation de ces organismes à des niches

écologiques précises a certainement joué un rôle prépondérant au cours de leur évolution

entraînant notamment la perte de la capacité à synthétiser certains acides aminés (Pollack et

al., 1996) voire la totalité dans le cas de Spiroplasma citri (Chang & Chen, 1981).

Leur pourcentage de moles de paires de bases G+C est faible, de 23 à 41 % (Razin et

al., 1998). De ce fait, les mollicutes ont développé un biais dans l’utilisation des codons. Pour

un même acide aminé, les codons terminés par A ou T sont utilisés préférentiellement à ceux

terminés par G ou C (Razin et al., 1998). Dans tous les genres, hormis le genre Acholeplasma,

le tryptophane est codé par le codon UGA et, dans une moindre proportion par le codon UGG

(Renaudin et al., 1986; Blanchard, 1990). UGA étant un codon de terminaison dans le code

génétique universel, l’expression de protéines dans un système hétérologue de production

comme Escherichia coli, s’avère impossible sans muter l’ensemble de ces codons dans les

gènes correspondants.

Les mollicutes sont présents dans des habitats très variés, mais toujours associés à un

hôte vivant, que ce soit l’homme, l’animal (mammifère, poisson, oiseau, insecte) ou la plante

(Razin et al., 1998). En milieu naturel, ces organismes sont des parasites obligatoires et, à ce

titre, peuvent posséder un ou plusieurs hôtes. Les mollicutes phytopathogènes ont, de ce fait,

deux hôtes que sont la plante et l’insecte vecteur par lequel ils sont transmis.

II. Mollicutes phytopathogènes

C’est en 1967 qu’une équipe japonaise observe pour la première fois, en microscopie

électronique, des organismes ressemblant à des mycoplasmes dans les tubes criblés d’une

plante atteinte de jaunisse (Doi et al., 1967). Ces organismes ont alors été nommés MLO pour

Mycoplasma-Like Organism. Le comité de taxonomie des mycoplasmes a repris, en 1994, la

proposition de Murray et Schleifer (Murray & Schleifer, 1994) de désigner, sous le nom de

genre 'Candidatus Phytoplasma', les différents groupes phylogénétiques des phytoplasmes

(IRPCM., 2004). Le phytoplasme associé à la maladie des balais de sorcières du limettier du

Sultanat d'Oman est le premier phytoplasme pour lequel cette proposition a été retenue. Il

Introduction

15

porte maintenant le nom de 'Candidatus Phytoplasma aurantifolia' (Zreik et al., 1995).

Depuis, 25 autres espèces de Candidatus Phytoplasma ont été décrites (Hogenhout et al.,

2008).

Les mollicutes phytopathogènes regroupent aujourd’hui les phytoplasmes appartenant

au genre Candidatus phytoplasma et les spiroplasmes appartenant au genre Spiroplasma. Les

phytoplasmes sont les plus nombreux et les plus importants du point de vue économique.

Cependant, ils résistent toujours à la mise en culture. En revanche, trois espèces de

spiroplasmes phytopathogènes sont connues et disponibles en culture pure : Spiroplasma citri,

Spiroplasma kunkelii et Spiroplasma phoeniceum. Parmi ceux-là, S. citri a fait l’objet de

nombreuses études biologiques et biochimiques et est devenu un organisme modèle pour

l’étude des mollicutes phytopathogènes (Garnier et al., 2001; Bove et al., 2003).

1. Phytoplasmes Au niveau mondial, les phytoplasmes sont responsables de plus de 300 maladies de

plantes appartenant à plus de 100 familles botaniques différentes (McCoy et al., 1989).

Les symptômes provoqués sur les plantes infectées sont variables et incluent des

jaunisses foliaires, un enroulement et/ou une diminution de la taille des feuilles, une

virescence (pétales non segmentés), une phyllodie (morphologie foliaire des sépales), la

prolifération de bourgeons axillaires, un raccourcissement des entre-nœuds, etc….

Les pertes économiques provoquées par des infections à phytoplasmes sont

importantes dans nos régions françaises lorsque ces infections touchent des cultures pérennes

comme la Flavescence dorée de la vigne (Daire et al., 1993b), la maladie du Stolbur (Daire et

al., 1993a), l’enroulement chlorotique de l’abricotier (Jaraush et al., 1999) et la maladie de la

prolifération du pommier (Lee et al., 2000).

L’analyse de leur ADN ribosomique 16S a permis de démontrer que ces organismes

sont phylogénétiquement proches des acholéplasmes (Lim & Sears, 1989; Seemüller et al.,

1994) avec lesquels ils partagent l’utilisation du code génétique universel contrairement aux

autres mollicutes (Lim & Sears, 1992). Le séquençage systématique de leurs ARNr 16S,

associé à la mise au point de techniques de RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism), ont permis d’établir une classification des phytoplasmes (Lee et al., 1998).

Les premières données disponibles sur le génome des phytoplasmes révèlent, en se

basant sur des études d’électrophorèse en champ pulsé, que celui-ci aurait une taille comprise

entre 530 kpb pour le Bermuda grass white leaf phytoplasma, et 1350 kpb pour le Tomato

Introduction

16

Stolbur phytoplasma (Marcone et al., 1999) avec une teneur en G+C de l’ordre de 25 à 30

moles %. Depuis le séquençage, en 2004, de Candidatus Phytoplasma asteris souche Onion

Yellows (OY) (Oshima et al., 2004), trois nouveaux génomes sont disponibles dont celui de

Candidatus Phytoplasma asteris Aster Yellows (AY) (Bai et al., 2006), Candidatus

Phytoplasma australiense (Tran-Nguyen et al., 2008) et Candidatus Phytoplasma mali (Kube

et al., 2008). La taille du génome de Candidatus Phytoplasma australiense est d’environ 20

kpb supérieure à ceux des deux phytoplasmes de l’ordre des Candidatus Phytoplasma asteris

qui atteignent environ 860 kpb. De ce fait, son génome possède environ 200 gènes « souche-

spécifique », qui ne sont pas présents chez les deux autres phytoplasmes séquencés, et qui

codent de nombreuses protéines hypothétiques mais aussi des transposases ou encore des

intégrases (Tran-Nguyen et al., 2008). Le génome de Candidatus Phytoplasma mali a révélé

une caractéristique particulière par rapport aux autres phytoplasmes déjà séquencés. En effet,

son génome de 600 kpb est linéaire. De plus, l’analyse des régions codantes de ce dernier a

révélé que la voie de la glycolyse, principale source d’énergie d’un organisme, est incomplète

et, de plus, aucune ATP synthase de type F n’a été retrouvée (Kube et al., 2008).

2. Spiroplasmes phytopathogènes

2.1. Spiroplasma phoeniceum et Spiroplasma kunkelii

Spiroplasma phoeniceum a été isolé en 1986 de pervenches de Madagascar atteintes de

jaunisse provenant de Syrie (Saillard et al., 1987). Il provoque des symptômes très similaires

à ceux observés sur des plantes infectées par S. citri. Il appartient au sérogroupe I-8 de la

dernière classification des spiroplasmes établie en 1998 (Williamson et al., 1998). Son

génome de 1860 kpb (Carle et al., 1995) possède 26 % de bases G+C (Saillard et al., 1987).

Son optimum de croissance dans un milieu riche en cholestérol est de 32°C.

S. kunkelii (sérogroupe I-3), observé pour la première fois en 1972, est l’agent

responsable de la maladie du rabougrissement du maïs ou « corn stunt », une maladie qui

s’étend depuis le sud des Etats-Unis jusqu’en Argentine. S. kunkelii, cultivé pour la première

fois en 1975 (Chen & Liao, 1975; Whitcomb & Williamson, 1975) a été caractérisé en 1986

(Whitcomb et al., 1986). Son génome, partiellement séquencé, est constitué d’un chromosome

circulaire de 1610 kpb (Carle et al., 1995) et possède 26 % de bases G+C (Whitcomb et al.,

1986). Les séquences disponibles sont accessibles sur le site web suivant:

(http://www.genome.ou.edu/ spiro_blast.html).

Introduction

17

2.2. Spiroplasma citri 2.2.1. Description de la maladie et mise en culture

En 1970, deux équipes observent pour la première fois des organismes de type

mollicute dans les tubes criblés d'orangers atteints de la maladie du stubborn (Igwegbe &

Calavan, 1970; Laflèche & Bové, 1970). Contrairement à un arbre sain dont la forme est

généralement pyramidale, l'arbre très atteint présente un aspect buissonneux provenant d'un

raccourcissement général des entre-noeuds. Les feuilles des arbres malades présentent une

chlorose foliaire. La floraison et la maturation des fruits sont perturbées. La floraison

s'échelonne tout le long de l'année et survient donc à contre saison. Les fruits sont déformés

en forme de glands et les pépins avortés ou nécrosés.

Obtenu en culture pure en France (Saglio et al., 1971) et en Californie (Fudl-Allah et

al., 1972), la caractérisation biochimique et immunologique du pathogène responsable de la

maladie du stubborn révèle que l'organisme cultivé est bien un mycoplasme du fait de

l'absence de paroi à peptidoglycane (Bébéar et al., 1974) mais, qu’il s'agit d'un mycoplasme

nouveau de par sa morphologie hélicoïdale et sa motilité (Saglio et al., 1973). Il fut nommé

Spiroplasma citri en 1973 (Saglio et al., 1973).

La transmission de S. citri à l’oranger Citrus sinensis (Markham et al., 1974) par la

cicadelle Euscelis plebejus (Fallen), infectée par micro-injection d’une culture du

spiroplasme, a permis de vérifier les postulats de Koch, démontrant ainsi le rôle de S. citri

comme agent phytopathogène.

La mise au point d'un milieu de culture de composition définie a permis de connaître

les exigences nutritionnelles de S. citri (Chang & Chen, 1981). Ainsi, il a été établi que sa

culture nécessite l'ajout de cholestérol, d'acides gras, de vitamines, de co-facteurs (acide

folique, acide p-aminobenzoïque, etc...), de source de carbone et d'acides aminés sauf les

acides aspartique et glutamique. Les sucres fermentés par S. citri sont le glucose, le fructose et

le tréhalose; les autres sucres comme le mannose ou le sorbitol ne sont pas utilisés. Le

comportement de S. citri envers le saccharose n'est pas bien défini. Les milieux couramment

utilisés, comme le milieu SP4, contiennent nécessairement du sérum animal (poulain ou veau

foetal) qui apporte les stérols et lipides, ainsi que des sucres, glucose, fructose et saccharose

comme source d'énergie (Tully et al., 1977). Ce milieu possède une pression osmotique

élevée et contrôlée de 600 mOsm du fait de l’absence de paroi du spiroplasme. La

température optimale pour la croissance de S. citri est 32°C (Saglio et al., 1973). Cette

croissance est fortement ralentie à 37°C (Garnier et al., 1984).

Introduction

18

En plus d’être l’agent du stubborn des agrumes, S. citri est également responsable de

la maladie des racines cassantes du radis noir (Fletcher et al., 1981). Au total, au moins 38

espèces végétales regroupant 12 familles botaniques sont naturellement infectées par S. citri.

La première plante découverte infectée par S. citri en Californie (Granett et al., 1976), en

Arizona (Allen & Donndelinger, 1981) ainsi qu'au Maroc (Bove et al., 1978) n'appartenant

pas à la famille des agrumes (rutacées) est la pervenche de Madagascar (Catharanthus

roseus).

Par ailleurs, en Californie, S. citri a été isolé de mauvaises herbes comme le plantin

(Plantago sp.), de plantes ornementales comme le souci (Tagetes erecta), la reine-marguerite

(Callistephus chinensis), de plantes cultivées comme la laitue (Lactuca sp.), le radis

(Raphanus sativum), la pastèque (Citrullus vulgaris) et de certains arbres fruitiers, cerisiers,

pêchers et poiriers (Calavan & Bove, 1989). Plus récemment, ce spiroplasme a également été

isolé de la carotte (Mello et al., 2009 ; Cebrian et al., 2010). S. citri a pu être transmis

expérimentalement par greffage ou insecte vecteur à environ 80 espèces végétales différentes.

2.2.2. Caractéristiques de S. citri

Depuis son obtention en culture pure, S. citri est devenu le mollicute phytopathogène

le mieux caractérisé à l’heure actuelle.

Les premières observations au microscope à fond noir révèlent que S. citri possède une

morphologie hélicoïdale et est doué de motilité malgré l’absence de flagelle ou de filament

axial normalement présent chez les bactéries mobiles (Cole et al., 1973). S. citri doit sa

motilité à deux types de mouvements, un mouvement de flexion du corps cellulaire et un

mouvement de rotation autour de l’hélice (Davis & Worley, 1973; Daniels et al., 1980). Ce

mouvement de rotation associé à sa morphologie hélicoïdale permet au spiroplasme de se

déplacer en milieu visqueux. Sur milieu solide, cette motilité a des répercussions sur l’aspect

des colonies qui sont diffuses et entourées de colonies satellites. Plus récemment, les travaux

de Trachtenberg et collaborateurs ont permis de mettre en évidence l’implication du

cytosquelette de S. citri dans sa motilité (Trachtenberg & Gilad, 2001; Trachtenberg et al.,

2003; Trachtenberg, 2004). Ce cytosquelette est composé de la protéine de fibrille

(Williamson et al., 1991) et de la protéine « actin-like » MreB (Maccheroni et al., 2001). Ce

cytosquelette agirait comme un moteur linéaire capable de se contracter permettant ainsi un

déplacement directionnel contrôlé (Trachtenberg, 2004). Des travaux complémentaires ont

montré que le déplacement du spiroplasme était également dépendant de la propagation d’une

Introduction

19

paire de « kink » le long du corps cellulaire, structures générées par des changements de

l’hélicité du spiroplasme (Shaevitz et al., 2005).

La croissance de S. citri s’effectue par allongement d’une hélice élémentaire

constituée de 2 tours donnant une hélice parentale à quatre tours. L’hélice parentale se divise

ensuite, par constriction, en deux hélices élémentaires (Garnier et al., 1984).

Aujourd’hui, 92 % de la séquence du génome de S. citri GII3 sont connus (Carle et al.,

2010). Ce génome se compose d’un chromosome de 1820 kpb avec 26 % de bases G+C et de

sept plasmides (pSciA et pSci1 à 6) qui ne possèdent pas d’homologues connus (Saillard et

al., 2008). La taille de ces plasmides varie de 7,8 kpb pour le pSciA à 35,3 kpb pour le pSci6

et leurs nombres de copies par spiroplasmes ont été estimés entre 10 et 14. L'ADN

plasmidique représenterait ainsi près de 1,6 Mpb soit 47 % de l'ADN total de S. citri GII3. Les

pSci1-6 possèdent un pourcentage en G+C (25,6 à 29 %) proche de celui du chromosome (26

%) alors que le pSciA à un pourcentage plus faible de 21,3 %. De manière intéressante,

aucune des CDS portées par les pSci ne présente d’homologie avec une protéine de

réplication (Saillard et al., 2008). Des travaux récents ont néanmoins pu restreindre l’origine

de réplication des plasmides pSci de S. citri à une région contenant une seule CDS, nommée

pE, et à sa séquence en aval présentant des motifs de fixation à la protéine initiatrice DnaA

(Breton et al., 2008).

De plus, trois formes réplicatives virales SpV1, SpV2 et SpV3 ont été identifiées dans

le chromosome de S. citri (Renaudin et al., 1990; Renaudin & Bove, 1994). Les virus SpV2 et

SpV3 ressemblent à des bactériophages classiques, alors que le virus SpV1 est filamenteux

avec un ADN monocaténaire circulaire de 8,3 kb (Renaudin et al., 1990). Une des

caractéristiques de ce virus SpV1 est le grand nombre de copies de son ADN, plus ou moins

complètes, réparties dans tout le chromosome (Carle et al., 2010).

2.2.3. S. citri, un organisme modèle pour l’élaboration d’outils génétiques

Un des premiers grands challenges concernant l’étude de S. citri fut le développement

de vecteurs d’expression de gènes, outil indispensable à la caractérisation fonctionnelle de ces

derniers. Dès le début, la présence des formes réplicatives virales a été mise à profit. A partir

de la forme réplicative SpV1, un vecteur a été développé parallèlement à une méthode de

transformation par électroporation (Stamburski et al., 1991). Cette première approche de

transfert de gènes chez S. citri n’a pas été jugée satisfaisante car ces vecteurs viraux sont

Introduction

20

instables, dans le sens où des phénomènes de recombinaisons homologues entre le vecteur et

les copies virales portées par le chromosome sont observés (Marais et al., 1996). En 1994, Ye

et collaborateurs clonent l’origine de réplication chromosomique de la souche R8A2 de S.

citri (Ye et al., 1994) qui sera utilisée plus tard pour la construction de vecteurs, tels que le

plasmide pBOT (Renaudin et al., 1995). Ce plasmide navette, dans les cas de

complémentation fonctionnelle in vivo, s’intègre dans le chromosome par simple

recombinaison homologue entre les origines de réplication (Renaudin et al., 1995).

L’ensemble de ces vecteurs navettes, et notamment le plasmide pGOT (Duret et al., 2005),

développés récemment au laboratoire dans le but d’obtenir des mutants par simple

recombinaison homologue, seront détaillés au chapitre 3.

Parallèlement, une technique de mutagénèse aléatoire par transposition avec le

transposon Tn4001 a également vu le jour au laboratoire (Foissac et al., 1997). Cette approche

a permis d’obtenir plusieurs mutants de S. citri, à savoir un mutant non motile G540 (Jacob et

al., 1997), un mutant déficient pour une ATPase de type P transporteur de calcium, un mutant

non-phytopathogène (Gaurivaud et al., 2000; Gaurivaud et al., 2001) et un mutant affecté

dans sa transmission (Boutareaud et al., 2004).

Plus récemment, une nouvelle approche basée sur l’incompatibilité plasmidique

permet de modifier le contenu plasmidique de S. citri et d’obtenir des mutants afin de

caractériser l’ensemble des gènes présents sur les plasmides pSci (Breton et al., 2010).

Ces dernières années, les travaux du laboratoire se sont orientés sur les déterminismes

génétiques impliqués dans la transmission de S. citri. En effet, S. citri est transmis de plante à

plante par des cicadelles, insectes piqueurs suceurs de sève élaborée, selon un mode circulant

multipliant, impliquant des relations étroites avec l’insecte.

De nombreuses étapes clés, régissant ce mode de transmission par l’insecte, restent à

être élucidées. En revanche, pour de nombreux microorganismes pathogènes (bactéries, virus,

champignons), les mécanismes gouvernant les étapes clefs nécessaires à leur transmission ont

été particulièrement étudiés et sont, à l’heure actuelle, parfaitement décrits.

La suite de cette introduction fait le point sur les connaissances acquises sur les

relations des spiroplasmes avec leurs insectes vecteurs puis, décrit les différentes étapes ainsi

que les mécanismes mis en jeu au cours de la transmission de pathogènes intracellulaires

qu’ils soient transmis par des insectes vecteurs ou non.

Introduction

21

III. Transmission de microorganismes intracellulaires

1. Transmission par insecte vecteur

1.1. Relation entre le microorganisme et son insecte

Il existe plusieurs types de relation entre un microorganisme et son hôte.

1.1.1. Transmission externe

Lors d’une transmission externe du microorganisme, c’est-à-dire lorsque celui-ci ne se

fixe que sur des parties externes de l’insecte (pattes, thorax, stylet), l’association entre les

deux partenaires est limitée. Aucun des deux partenaires n’influence le comportement de

l’autre.

1.1.2. Transmission intracellulaire

Lorsque l’interaction entre les deux partenaires persiste, comme cela est le cas au

cours d’une transmission intracellulaire, cette relation entre le microorganisme et son hôte se

complexifie et certaines associations peuvent engendrer une modification du comportement

de l’insecte, pouvant aller jusqu’à la mort de ce dernier. Les Baculoviridae sont les

pathogènes d'insectes les plus représentés. Ils infectent notamment les larves de lépidoptères

et d’hyménoptères (Blissard, 1996). L'infection survient une fois que des larves d'insectes

sensibles ont absorbé des aliments contaminés par le virus. Le virus s'attaque alors à

l'hémolymphe, aux tissus adipeux et à l'intestin moyen. L'insecte est ensuite paralysé et meurt.

Des interactions mutualistes entre les deux partenaires ont également été découvertes ;

le microorganisme, dans ce cas appelé endosymbiote d’insecte, peut être classé en deux

catégories.

Les endosymbiotes primaires ont été associés avec leur insecte hôte depuis des

millions d'années. Ils ont une forme d'association obligatoire et ils affichent une co-spéciation

avec leur hôte. Cette association, bénéfique aux deux organismes, permet à chacun des deux

partenaires de profiter des avantages de l’autre. Le rôle élémentaire de l’endosymbiote est de

fournir les nutriments, que l'hôte ne pourrait obtenir seul, en catabolisant la nourriture

inassimilable par l'insecte. Parmi ces endosymbiotes primaires des insectes, le plus étudié

reste la bactérie Buchnera qui colonise le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Buchnera est

capable de synthétiser les acides aminés essentiels que le puceron ne peut naturellement

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Introduction

22

obtenir par prise de nourriture tandis que ce dernier fournit à la bactérie un milieu riche lui

permettant de se répliquer (Douglas, 1998).

L’association entre les endosymbiotes secondaires et leurs insectes s’est développée

plus récemment. Ces associations ne sont pas obligatoires et, dans la plupart des cas, on parle

de relations commensales, l’insecte ne tirant aucun bénéfice de leur interaction.

1.1.3. Relation entre les spiroplasmes et leurs insectes

La plupart des espèces de spiroplasmes sont retrouvées dans l’intestin ou

l’hémolymphe de moustiques, mouches (tabanides) ou encore de tiques. De manière plus

surprenante, S. clarkii a été isolé de l’intestin d’une larve de scarabée (Whitcomb et al., 1993)

tandis que S. penaei a lui été retrouvé dans l’hémolymphe de la crevette grise, Penaeus

vannamei (Nunan et al., 2005). Plusieurs espèces de spiroplasmes ont également été

retrouvées infectant au moins 16 espèces différentes de Drosophila (Haselkorn et al., 2009).

Quelques espèces ont également été décrites influençant le comportement de l’hôte.

Un spiroplasme a été caractérisé chez le puceron du pois. Il provoque une diminution de la

croissance et de la durée de vie du puceron ainsi qu’une baisse de la fertilité (Fukatsu et al.,

2001). S. poulsonii, l’agent du « sex-ratio », supprime la descendance mâle de plusieurs

espèces de drosophiles et se transmet de manière verticale (Williamson et al., 1999). S. apis et

S. melliferum sont des pathogènes de l’abeille Apis mellifera (Mouchès et al., 1982; Mouches

et al., 1984). D’autres encore, comme S. culiciola, S. sabaudiense, S. taiwanense sont

pathogènes pour le moustique Aedes aegypti dont ils réduisent la durée de vie et la fécondité.

De plus, S. taiwanense entraîne aussi un changement du sex-ratio en favorisant la

descendance mâle (Vazeille-Falcoz et al., 1994). La présence intracellulaire de S. mirum a

même été décrite dans des lésions cérébrales d’un patient atteint d’encéphalopathie (Bastian,

1979). Plus récemment, des expériences menées par le même groupe ont également montré

que ce spiroplasme, injecté de manière intracrânienne, produisait des symptômes comparables

avec ceux d’une encéphalopathie spongiforme (Bastian et al., 2007).

Néanmoins, la plupart des mollicutes phytopathogènes ne semblent pas perturber le

comportement de l’insecte. S. citri ne semble avoir aucun effet sur la cicadelle au cours de son

circuit à l’intérieur de celle-ci. De même, lors de l’infection de Cacopsylla melanoneura par

Candidatus phytoplasma mali, le phytoplasme n’influence pas le développement ou la

longévité de ces insectes cependant il semble avoir quelques effets sur le fitness de ces

derniers (Malagnini et al., 2010).

Figure I.4: Phylogénie de l’ordre des Hemiptera basée sur les études de phylogénie moléculaire.(D’après Campbell et al., 1995 ; Sforza, 1998).

Introduction

23

1.2. Insectes vecteurs

Les insectes vecteurs de microorganismes appartiennent tous à l’embranchement des

arthropodes. Quelques familles d’insectes responsables de la vection de microorganismes, à

l’exception des mollicutes phytopathogènes, sont regroupées dans le tableau I.3.

1.2.1. Vecteurs mollicutes phytopathogènes

1.2.1.1. Classification

Les insectes vecteurs des mollicutes phytopathogènes appartiennent à l’ordre des

Hemiptera. La classification de ces insectes a longtemps été basée sur des caractères

morphologiques (couleur, taille, ailes antérieures, tête, thorax, abdomen, parties génitales

etc...). Les hemiptères ont un développement du type hémimétabole, c’est à dire que la

nymphe est mobile et ressemble aux larves, et possèdent plusieurs caractéristiques propres

comme des antennes longues, des pièces buccales avec un long rostre et deux paires d’ailes

dont l’une peut être cornée et durcie (hémiélytre).

Ce n’est qu’en 1995, lors des travaux de Campbell et collaborateurs portant sur la

comparaison de séquences d’ADN ribosomiques 18S de ces insectes, que la classification des

hémiptères a été modifiée et est restée depuis, identique à celle présentée dans le tableau I.4

(Campbell et al., 1995).

Dès lors, les insectes vecteurs des mollicutes phytopathogènes appartiennent, au sein

du sous-ordre des Cicadomorpha, à la famille des Cicadellidae (cicadelles) ; au sein de

l’infra-ordre des Fulguromorpha, à la famille des Cixiidae (cixides) et enfin, au sein de

l’ordre des Sternorrhyncha, à la famille des Psyllidae (psylles). Au sein de la famille des

Cicadellidae, les vecteurs des mollicutes phytopathogènes appartiennent principalement à la

sous-famille des Deltocephalinae.

Dans la littérature, les membres de la famille des Cicadellidae sont regroupés sous le

terme de « leafhopper » tandis que l’infra-ordre des Fulguromorpha renferme deux familles

principales que sont les Cixiidae et les Delphacidae regroupée sous le terme de

« planthopper ». Quelques exemples de mollicutes phytopathogènes associés à leur insecte

vecteur sont présentés dans le tableau I.5.

1.2.1.2. Vecteurs de S. citri

Pour sa part, S. citri est transmis naturellement et expérimentalement par plusieurs

insectes (tableau I.5). De toutes les cicadelles précédemment décrites, C. tenellus (figure I.6)

est le vecteur majeur du spiroplasme dans le Sud-ouest des Etats-Unis (Rana et al., 1975; Liu

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Introduction

24

et al., 1983). Les vecteur identifiés dans le pourtour méditerranéen sont C. haematoceps

(figure I.6) (Fos et al., 1986) et C. tenellus (Rasooly et al., 1994). Ces cicadelles polyphages

se développent principalement sur des hôtes herbacés et sur les agrumes (rutacées) qui,

lorsqu’ils sont infectés par S. citri, présentent des taux d’infection élevés.

La transmission de plante à plante se déroule selon un mode circulant multipliant. De

ce fait, dans l’insecte, S. citri effectue un circuit au cours duquel il passe successivement du

canal alimentaire, dans l’intestin moyen puis dans l’hémolymphe et gagne les glandes

salivaires de la cicadelle afin d’être excrété avec les sécrétions salivaires.

La description anatomique de ces tissus nous permettra de mieux appréhender les

mécanismes mis en place par S. citri au cours de son trajet et notamment lors des

franchissements des deux barrières, que sont l’épithélium intestinal et celui des glandes

salivaires, indispensables à sa propagation.

1.2.1.3. Morphologie des cicadelles

Les pièces buccales des cicadelles sont composées du labrum, du labium et des stylets.

Seul les stylets pénétrent dans la plante lors du repas de l’insecte. Ils sont au nombre de quatre

et sont les vestiges des mandibules et des maxilles. La paire de stylets maxillaires se rejoint

pour former le canal salivaire et le canal alimentaire. Les stylets mandibulaires entourent en

partie les stylets maxillaires. Au niveau de la tête, les deux stylets maxillaires se séparent l’un

de l’autre et les fluides ingérés se retrouvent dans une chambre filtrante appelée precibarium.

Sa fonction est de réguler le flux de liquide avant qu’il n’entre dans le cibarium. Il est

composé d’une valve qui empêche notamment la régurgitation de fluides dans les stylets.

Le cibarium est une sorte de pompe qui constitue un sac situé dans la tête et composé d’une

couche de cellules épithéliales. Les fluides passent alors dans l’intestin antérieur de l’insecte

qui est relativement étroit avec une paroi mince et recouvert de chitine qui s’étend jusqu’au

mésothorax ou bien même jusqu’au premier fragment abdominal. Les cellules intestinales

possèdent des microvillosités à leur surface qui sont recouvertes d’une fine matrice de nature

polysaccharidique, le glycocalyx. L’épithélium intestinal est bordé d’une lame basale

composée d’un assemblage de filaments de collagène et d’une matrice amorphe constituée de

polysaccharides (Gouranton & Folliot, 1970).

Chez les insectes se nourrissant de xylème et de phloème, une chambre filtrante s’est

formée permettant le passage direct de l’eau ingérée, contenant les substances en solution, de

l’intestin antérieur à l’intestin postérieur dans le but de concentrer la solution nutritive

(Forbes, 1969). A la jonction de l’intestin moyen et postérieur se trouvent les tubes de

Figure I.6: Principaux insectes vecteurs de Spiroplasma citri.Photographies de Circulifer tenellus (à gauche) et de Circulifer haematoceps (à droite).

Figure I.7: Représentation schématique de l’appareil salivaire de cicadelles.AG: glande salivaire accessoire. I à VIII : types cellulaires différents de la glande salivaire principale. (D’après

Wayadande & Fletcher, 1995).

Introduction

25

Malpighi. Ils sont au nombre de quatre chez les cicadelles et sont composés de cellules

épithéliales très minces qui se divisent en deux parties, une partie distale qui servirait à la

sécrétion d’ions et à l’excrétion tandis que la partie proximale aurait une fonction dans la

réabsorption des solutés.

Les cicadelles possèdent une paire de glandes salivaires situées de part et d’autre de

l’œsophage. De chaque côté, il y a une glande principale et une glande accessoire toutes les

deux composées de cellules conductrices et sécrétrices. Chaque glande salivaire principale est

composée de 8 types cellulaires différents et organisés en lobes concentriques. Ces cellules

sont différenciées en fonction de leur morphologie et de leur densité aux électrons. Elles sont

binucléées et regroupées en deux lobes. Le lobe antérieur est composé de 10 cellules de type

I, 6 cellules de type II, 4 cellules de type III et IV et 2 cellules de type V. Le lobe postérieur

est constitué de 5 cellules de type VI, 3 cellules de type VII et 4 cellules de type VIII (figure

I.7) (Wayadande et al., 1997).

Les glandes salivaires accessoires sont reliées aux glandes salivaires principales par un

canal lui-même inséré dans le canal faisant la jonction avec le lobe antérieur et le lobe

postérieur des glandes salivaires principales. Ici, les cellules sont uninucléées.

Les deux principaux canaux formés par chacune des deux glandes s’unissent pour

former un canal salivaire commun qui se dévide dans la pompe salivaire.

Tous ces organes baignent dans l’hémolymphe, un fluide extracellulaire qui transporte

les métabolites vers les différents tissus de l’insecte. L’osmolarité de l’hémolymphe est

relativement élevée et comprise entre 240 et 600 mOsm. La principale source de carbone est

le tréhalose, sucre non réducteur composé de deux molécules de glucose. Ce fluide contient

également des lipides, des acides aminés libres, des acides inorganiques tel que l’acide

ascorbique et des ions Mg2+ et PO43- (Saglio & Whitcomb, 1979). Cette composition est

relativement proche de la composition du phloème de la plante à l’exception du sucre

majoritaire qui est le saccharose au lieu du tréhalose.

1.2.2. Circuit du spiroplasme dans l’insecte

Après ingestion et un passage dans la pompe alimentaire, les spiroplasmes se

retrouvent dans l’intestin où la plupart sont digérés par les enzymes présentes. Les survivants

poursuivent leur route jusqu’au niveau de l’intestin moyen ou ils pénètrent dans les cellules

constituant l’épithélium intestinal situées dans une région dépourvue de chitine. Chez

Circulifer tenellus, S. citri pénètre dans ces cellules épithéliales en passant entre les

microvillosités (figure I.8A ; (Kwon et al., 1999). Le spiroplasme franchit l’épithélium

Figure I.8: Etapes clés du cycle des spiroplasmes dans leurs insectes vecteurs.

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C: S. kunkelii franchissant la lame basale des cellules de l’épithélium intestinal de D. maidis (flèche avec l’étoile) ou bien libre dans l’hémolymphe de l’insecte (flèche à gauche). Bl: lame basale, Mt: tubes de Malpighi, Mi: mitochondrie, Gc: cellule intestinale, Pl: plasmalemme basal. Echelle: 0,5 µm. D: Agrandissement de la région encadrée montrant S. kunkelii avec une protubérance en forme de « tip » proche de la lame basale. (Ozbek et al., 2003).

E: S. citri franchissant la lame basale des cellules de l’épithélium des glandes salivaires de C. tenellusdans une vacule d’endocytose. Bl: lame basale, S: spiroplasme, Er: réticulum endoplasmique. F: S. citrilibre dans le canaliculus des glandes salivaires de C. tenellus. Echelle: 0,5 µm. (Kwon et al., 1999).

Introduction

26

intestinal par un mécanisme d’endocytose/exocytose au cours duquel il se retrouve dans une

vacuole d’endocytose où il adopte une forme ovoïde (figure I.8B ; (Ozbek et al., 2003)). Au

moment du passage dans l’hémolymphe de l’insecte, une protubérance de 70 nm de diamètre

est observée traversant la membrane de la vacuole (figure I.8C et D ; (Ozbek et al., 2003)).

Cette protubérance, non sans rappeler le « tip » observé chez plusieurs mycoplasmes (Rottem,

2003), regrouperait plusieurs protéines qui seraient les premières impliquées dans un rôle de

reconnaissance et de franchissement du plasmalemme intestinal (Ammar et al., 2004). Grâce à

l’intermédiaire de ce « tip », les vésicules d’endocytose fusionnent avec le plasmalemme

basal et les spiroplasmes sont donc libérés par exocytose. Ils se retrouvent alors dans

l’hémolymphe où ils se multiplient massivement. Un nouveau mécanisme

d’endocytose/exocytose leur permet de franchir la barrière des glandes salivaires puis, après

une nouvelle multiplication, ils sont expulsés dans le canal salivaire (figure I.8E et F; (Kwon

et al., 1999)).

En résumé, pour sa transmission, le spiroplasme a besoin de franchir deux barrières, la

barrière intestinale et la barrière des glandes salivaires. Les franchissements de ces barrières

nécessitent des interactions entre S. citri et son insecte vecteur afin de pénétrer à l’intérieur

des cellules de son hôte. Or, les mécanismes moléculaires ainsi que les protéines impliquées

dans ces étapes d’adhésion aux cellules et d’internalisation dans celle-ci, restent encore

inconnus à ce jour.

Pour d’autres organismes, les descriptions concernant ce processus d’invasion

permettraient de cerner les différents acteurs intervenant au cours de ces étapes et, par

analogie, faire un lien avec ce qui est connu concernant la transmission du spiroplasme.

2. Cycle cellulaire de la transmission

Le pouvoir pathogène d’un microorganisme intracellulaire repose sur sa capacité à

coloniser son hôte et, de ce fait, à envahir les cellules de celui-ci afin de s’y multiplier et de

s’y disséminer.

L’ensemble de ce processus, nommé « invasion » tout au long de ce manuscrit, se

décompose en plusieurs étapes successives. Après avoir été ingéré par leur hôte, les

microorganismes doivent (i) adhérer aux cellules de leur hôte, (ii) pénétrer à l’intérieur de

celles-ci, (iii) se développer tout en évitant les mécanismes de défense mis en place puis (iv)

se disséminer de cellule à cellule afin d’être transmis à un nouvel hôte.

Figure I.9: Représentation des principaux types de pili décrits chez les bactéries à

Gram-négatif et à Gram-positif.

(D’après Kline et al, 2009).

Introduction

27

Le succès d’une invasion réside dans les signaux que les deux acteurs, la cellule et

l’agent pathogène, s’échangent perpétuellement. A chaque étape du processus d’infection,

l’agent pathogène exploite la machinerie cellulaire de l’hôte à son propre profit.

2.1. Adhésion

L’adhésion des microorganismes à des cellules eucaryotes est souvent une première

étape essentielle dans la mise en place de la maladie. En effet, étant de manière générale une

étape spécifique, l’adhésion permet au pathogène de se retrouver au niveau de tissus

appropriés, à partir desquels, il peut initier son processus d’entrée.

De nombreuses molécules et de structures macromoléculaires, regroupées sous le

terme d’adhésines, permettent aux pathogènes d’assurer cette fonction. Ces adhésines peuvent

être divisées en deux familles : les adhésines de type fibrillaire et les adhésines de type non-

fibrillaire.

2.1.1. Adhésines de type fibrillaire

Les adhésines de type fibrillaire sont des structures filamenteuses visibles à la surface

des bactéries. Ces structures ont été pour la première fois observées dans le début des années

50 par deux équipes. La première, dirigée par James Duguid, appela ces structures fimbriae

(« frange ») (Duguid et al., 1955), tandis que la seconde, dirigée par Charles Brinton, décida

de les nommer pili (« cheveux ») (Brinton, 1965). Bien que les deux termes soient

synonymes, et toujours d’actualité, le terme de pili sera préféré au cours de ce manuscrit. Les

principaux types de pili, décrits aussi bien chez les bactéries à Gram-négatif qu’à Gram-

positif, sont représentés sur la figure I.9.

2.1.1.1. Bactéries à Gram-négatif

Les pili ont été, pour la première fois, décrits chez les bactéries à Gram-négatif. Ce

sont des structures de 1 à 2 µm de long, formées par l’association de plusieurs sous-unités,

généralement regroupées sous le terme de « pilines », formant des structures polymériques qui

permettent d’éviter la répulsion des charges négatives présentes à la surface des cellules de la

bactérie et de celles de l’hôte, retardant ainsi l’activation du système immunitaire de l’hôte

(Kline et al., 2009).

Trois principaux types de pili sont connus et se distinguent essentiellement par leurs

structures, mais aussi par leurs mécanismes de formation et de régulation qui, bien

Introduction

28

qu’utilisant tous le système de sécrétion Sec-dépendant pour l’export de leurs sous-unités,

diffèrent au niveau de l’assemblage de ces dernières.

Parmi eux, les pili de type I sont peut-être les mieux caractérisés (Langermann et al.,

1997). Leurs assemblages nécessitent la sécrétion de sous-unités partiellement structurées au

niveau de l’espace périplasmique où l’interaction avec une chaperone permet de finaliser sa

structuration. La sous-unité néo-formée vient se polymériser aux autres sous-unités par

l’intermédiaire d’un translocateur de la membrane externe. Chaque adhésine possède alors

deux domaines distincts : un domaine permettant la copolymérisation avec les autres sous-

unités de pilines et un second, responsable de la liaison avec les résidus carbohydrates

(Schilling et al., 2001). Ainsi, la bactérie uropathogénique E. coli (UPEC) possède un opéron

fim (FimA-fimH) dont la protéine principale FimH, située à l’extrémité de l’organelle, se lie

principalement à des résidus mannose (Choudhury et al., 1999). Cette bactérie possède

également un opéron pap qui, par l’intermédiaire de la protéine PapG, interagit avec les sous-

unités digalactoside (Hansson et al., 1995).

Les pili de type IV sont formés de sous-unités qui sont exportées à travers la

membrane interne en tant que pré-pilines, puis ces dernières sont reconnues par une peptidase

qui clive un peptide conservé en N-terminal, relarguant ainsi une piline mature. Le pili est

alors assemblé au niveau du périplasme puis est à son tour exporté à la surface de la bactérie

grâce à la formation d’un pore dans la membrane externe (Carbonnelle et al., 2005;

Carbonnelle et al., 2006). Ce type de pili est exprimé par plusieurs bactéries pathogènes

comme les espèces de Neisseria, Pseudomonas aeruginosa et quelques E. coli

entéropathogènes (EPEC). Chez deux espèces de Neisseria, Neisseria gonorrhoeae et

Neissaria meningitis, la fibre du pilus est composée de plusieurs protéines autoaggrégées de

17 à 21 kDa, nommées PilE, qui forment la structure de la fibre, ainsi que d’une protéine PilC

à son extrémité, capable de se lier aux cellules endothéliales et épithéliales des muqueuses

(Rahman et al., 1997).

Un autre groupe de bactéries, comprenant plusieurs souches d’E. coli et plusieurs

espèces de Salmonella, expriment un type de pili de type « coil » rappelant des fibres

amyloïdes. Chez Salmonella enterica, ces structures sont composées d’une protéine CsgA qui

est sécrétée par le système Sec à travers la membrane interne puis à travers un pore spécifique

de la membrane externe puis, cette protéine interagit avec CsgB pour donner la base de ces

fibres insolubles (Olsen et al., 1989; Kikuchi et al., 2005).

Introduction

29

2.1.1.2. Bactéries à Gram-positif

Chez les bactéries à Gram-positif, les premières structures de type pili ont été

découvertes chez Corynebacterium renale par microscopie électronique (Yanagawa et al.,

1968). Plus récemment, ces structures ont été découvertes chez les trois principales espèces de

streptocoques pathogènes pour l’Homme à savoir les streptocoques du groupe A, comme

Streptococcus pyogenes (Mora et al., 2005), les streptocoques du groupe B, comme

Streptococcus agalactiae (Lauer et al., 2005) et chez Streptococcus pneumoniae (Gianfaldoni

et al., 2007). Elles sont également présentes chez d’autres bactéries à Gram-positif comme

celles des espèces d’Actinomyces, de Ruminococcus, d’Enterococcus et de Clostridia.

Les espèces de Corynebacterium, ainsi que celles des streptocoques pathogènes,

possèdent des pili relativement flexibles et pouvant atteindre 3 µm. D’autres bactéries comme

Streptococcus salivarius ou Streptococcus oralis ont des pili plus courts, plus fins qui peuvent

s’allonger entre 70 et 500 nm (Willcox & Drucker, 1989).

A l’inverse des pili des bactéries à Gram-négatif, ceux des bactéries à Gram-positif

sont composés de sous-unités liées de manière covalente. En effet, ces sous-unités sont tout

d’abord sécrétées par le système de sécrétion Sec. Une transpeptidase, appelée sortase,

reconnaît chacune des sous-unités de piline par l’intermédiaire d’une séquence de type

LPXTG (ou X correspond à n’importe quel acide aminé), conservée chez l’ensemble des

sous-unités des bactéries à Gram-positif, et lie de façon covalente ces sous-unités entre-elles

avant qu’elles soient transférées au niveau de la paroi cellulaire (Mandlik et al., 2008). Chez

la plupart des bactéries à Gram-positif, l’ensemble des gènes impliqués dans la formation de

ces pili est en opéron. De plus, les gènes qui codent les sortases, nécessaires à cet assemblage,

peuvent faire partie de ce même opéron, comme cela a été démontré chez Streptococcus

agalactiae (Rosini et al., 2006).

Que ce soit chez les bactéries à Gram-positif ou à Gram-négatif, les pili sont connus

pour se lier à des éléments structuraux de la matrice extracellulaire comme les résidus

carbohydrates qui sont présents sur les récepteurs glycolipidiques ou glycoprotéiques de la

cellule (Sung et al., 2001). Chez les streptocoques, les protéines impliquées dans les pili

possèdent des séquences communes avec les protéines appartenant à la famille des

MSCRAMMS (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) qui

sont connues pour interagir avec des molécules de la matrice extracellulaire comme la

fibronectine, le fibrinogène, le collagène, la laminine et la vitronectine (Patti & Hook, 1994).

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Introduction

30

2.1.2. Adhésines de type non-fibrillaire

En plus des structures de type « pili », un grand nombre de molécules impliquées dans

l’adhésion bactérienne, ne s’associant pas en polymères, existent et reconnaissent de

nombreux éléments de la surface cellulaire de l’hôte.

Pour entrer dans des cellules non phagocytaires comme les cellules épithéliales de

l’intestin, certains pathogènes expriment une protéine de surface capable de se lier à des

récepteurs de surface eucaryote souvent impliqués lors de l’adhérence cellule-matrice ou

cellule-cellule.

Les principales protéines bactériennes impliquées dans l’étape d’adhésion, ainsi que

leurs ligands cellulaires quand ils sont connus, sont présentées dans le tableau I.10.

2.1.2.1. Autotransporteurs

Ces protéines, localisées à la surface de la bactérie, représentent la forme la plus

simpliste de système d’export protéique chez ces dernières. Les molécules sécrétées par ce

système (système de sécrétion de type V) contiennent un peptide N-terminal responsable de la

sécrétion à travers la membrane interne, d’un domaine C-terminal qui forme un pore dans la

membrane externe et d’un dernier domaine, appelé domaine passager, qui est transporté à

travers cette membrane externe afin d’être exposé à la surface de la bactérie (Henderson et al.,

2004). Chez H. pylori, la protéine BabA a été déterminée comme étant un autotransporteur

qui reconnaît l’antigène du groupe sanguin Lewis b, présent sur les cellules sanguines et les

muqueuses gastriques (Ilver et al., 1998). De plus, l’inflammation provoquée, en réponse à

cette reconnaissance, augmente l’expression de ces antigènes qui peuvent, à leur tour, être

reconnus par une seconde protéine bactérienne SabA suggèrant ainsi que H. pylori favorise

l’expression de ces propres récepteurs (Mahdavi et al., 2002).

En ce qui concerne les bactéries Yersinia enterocolitica, Neisseria meningitidis et

Haemophilus influenzae, les protéines nommées respectivement YadA, NhhA et HadA,

appartiennent à une nouvelle sous-famille d’autotransporteurs pour lesquels trois sous-unités

s’associent afin de former le pore fonctionnel dans la membrane externe (Cotter et al., 2005).

2.1.2.2. Effecteur Tir (translocated intimin receptor)

Les espèces d’E. coli EPEC et EHEC, en plus de l’ensemble de leurs structures de

type pili, utilisent un système d’adhésion unique dans lequel la bactérie fournit à la fois le

Introduction

31

récepteur et le ligand. En effet, dans un premier temps, l’attachement est réalisé par le biais

des pili qui permettent à la bactérie de détruire les microvillosités des cellules épithéliales de

l’hôte et d’accumuler les protéines du cytosquelette de l’hôte provoquant la formation de

structures ressemblant à un piédestal sur laquelle la bactérie se pose. A ce moment-là, la

bactérie injecte ses effecteurs par le biais de son système de sécrétion de type III (SSTT),

codés par une région LEE (Locus of Enterocyte Effacement). Un de ces effecteurs, l’effecteur

Tir, s’insère dans la membrane de la cellule eucaryote et sert de récepteur à une autre protéine

codée par le LEE, la protéine intimine, permettant une adhésion encore plus spécifique aux

cellules des muqueuses (Kenny et al., 1997).

2.1.2.3. Hémagglutinine filamenteuse (FHA)

Bordetella pertussis, l’agent de la coqueluche, possède également un système

d’adhésion particulier. Cette bactérie exprime une hémagglutinine filamenteuse (FHA) qui est

responsable de l’attachement aux cellules épithéliales des poumons. Cette protéine se lie à une

intégrine par le biais d’une séquence Arg-Gly-Asp. Cette interaction régule positivement

l’expression d'une seconde intégrine, le récepteur du complément 3 (CR3) qui reconnaît la

FHA par le biais d’un autre domaine (Ishibashi et al., 1994). La bactérie, sous l’action d’un

seul ligand, stimule son attachement à deux récepteurs distincts.

Certaines autres bactéries ont quant à elles détourné la première étape d’adhésion pour

interagir directement avec la machinerie cellulaire en injectant des effecteurs à l’aide de

systèmes de sécrétion. Bien qu’une étape d’adhésion stricto sensu par le biais des pili soit

toujours nécessaire, ces bactéries ne nécessitent pas de contact proche avec la cellule de

l’hôte.

2.1.2.4. Système de sécrétion de type 3 (SSTT)

Actuellement, six voies de sécrétion ont été identifiées chez les bactéries à Gram-

négatif. En plus du système de sécrétion Sec-dépendant, permettant le passage des molécules

qui, comme évoqué précédemment, sont impliquées dans la sécrétion des sous-unités de

plusieurs type de pili, un second système impliqué dans l’invasion des microorganismes, le

système de sécrétion de type III (SSTT), tient une place tout aussi importante.

Ce système de sécrétion est un système Sec-indépendant, pour la première fois mis en

évidence chez Yersinia (Cornelis & Wolf-Watz, 1997) et qui est utilisé par de nombreuses

Introduction

32

bactéries à Gram-négatif pathogènes d’animaux, de plantes mais aussi par des bactéries

symbiotiques, pour transférer leur effecteurs bactériens dans le cytosol des cellules hôtes

eucaryotes (Cornelis & Van Gijsegem, 2000). Le SSTT comprend de manière générale une

vingtaine de gènes qui sont essentiels pour la virulence de ces pathogènes et qui codent à la

fois les effecteurs sécrétés mais également les protéines formant la machinerie nécessaire à la

sécrétion. Les différentes familles de SSTT sont basées sur un même modèle structural très

conservé. Des études génétiques montrent que le SSTT présente des similarités de structure

avec le corps basal du flagelle suggérant une origine commune (Cornelis, 2006).

Les gènes codant les SSTT sont très souvent regroupés en cluster, aussi bien

chromosomique que plasmidique, appelé îlot de pathogénicité.

Par exemple, les gènes codant le SSTT de Shigella sont regroupés dans une région de

31 kpb, présente sur un plasmide de virulence, qui contient les opérons mxi/spa et ipa/ipg

codants, respectivement, l’appareil de sécrétion de type III et les protéines effectrices (Parsot,

2005). Chez Salmonella, ce SSTT inv-spa est codé par un îlot de pathogénicité

chromosomique (Ochman et al., 1996). Malgré cette différence, le mécanisme reste identique

pour les deux bactéries. Deux des composants sécrétés, nommés respectivement IpaB/C chez

Shigella et SipB/C chez Salmonella, forment un pore dans la membrane plasmique eucaryote

qui permet la pénétration des effecteurs dans le cytoplasme cellulaire. Jusqu’à que le SSTT

soit correctement assemblé, les effecteurs sont produits mais conservés dans le cytoplasme

bactérien associées avec des chaperones qui empêchent toute dégradation ou liaison

prématurée. Ensuite, le SSTT adhère avec la surface cellulaire via l’implication de IpaB et

SipB qui reconnaissent un récepteur membranaire CD44, associé à des domaines

membranaires riches en cholestérol et sphingolipides (Cossart & Sansonetti, 2004). En effet,

la présence de rafts intacts est primordiale car leur composition, riche en lipides, est optimale

pour la formation de pores. De plus, ces domaines sont enrichis en récepteurs cellulaires et en

molécules de signalisation, comme les tyrosines kinases de la famille src, importants pour la

suite du processus.

Chez les bactéries phytopathogéniques, les gènes codant le SSTT ont été identifiés

comme des gènes impliqués dans la réponse hypersensible et la pathogénicité (hrp genes ;

hypersensitive response and pathogenicity). En effet, des mutants hrp sont incapables

d’infecter leur plante hôte et provoquent une réponse de type hypersensible chez les plantes

non-hôte comme cela a été démontré chez Ralstonia solanacearum (Boucher et al., 1987).

Les bactéries pathogènes de plantes, souvent exogènes, ont besoin de coloniser l’apoplaste de

Introduction

33

ces dernières en injectant des effecteurs à l’intérieur de celle-ci. Le plus souvent, l’expression

de ces gènes est régulée par des facteurs liés à l’hôte et à l’environnement (Arlat et al., 1992).

2.1.3. Adhésion chez les mollicutes

2.1.3.1. Mycoplasmes

Chez les mycoplasmes, l’adhésion aux cellules hôtes est la première étape cruciale

dans l’établissement de l’infection. M. pneumoniae, responsable de pneumonie atypique chez

l’homme, possède une structure appelée « tip », dense aux électrons, qui sert d’organe

d’attachement à la bactérie pour se lier aux cellules du tractus respiratoire (Rottem, 2003).

Elle concentre les molécules d’adhésion comme les adhésines P1 et P30, indispensables à

l’attachement du mycoplasme (Krause, 1996). Ces protéines sont directement impliquées dans

la liaison aux récepteurs cellulaires qui sont généralement des motifs syaloglycoconjugués.

L’adhésion de M. pneumoniae nécessite également des protéines accessoires telles que les

protéines P40 et P90 et les protéines HMW 1-3 (Krause et al., 1982; Dirksen et al., 1996).

Ces protéines, localisées elles aussi dans le tip, ne sont pas des adhésines à proprement parler

du fait de l’absence de caractéristiques essentielles mais l’absence de l’une d’entre elles

inhibe l’adhésion du mycoplasme aux cellules (Razin & Jacobs, 1992). Cette structure est

également retrouvée chez M. genitalium et M. gallissepticum. Chez M. agalactiae, l’adhésion

implique également plusieurs protéines : deux adhésines P40 (Fleury et al., 2002) et P48

(Rosati et al., 2000) et une famille de protéines variables, nommées Vpma, qui sont codées

par un locus soumis à des réarrangements fréquents (Glew et al., 2002).

2.1.3.2. Phytoplasmes

Aucune structure rappelant un « tip » n’a été identifiée chez les phytoplasmes.

L’obtention de plusieurs séquences de génomes complets de phytoplasmes (Oshima et al.,

2004; Bai et al., 2006; Kube et al., 2008) ont permis de montrer l’existence de nombreuses

protéines immunodominantes liées à la membrane (IDPs, ImmunoDominant membrane

Proteins) qui pourraient être impliquées dans l’adhésion aux cellules d’insectes. Il a été

démontré que certaines de ces IDPs subissent une forte pression de sélection divergente et ce,

en particulier sur la partie hydrophile extracellulaire, ce qui suggère que ces protéines et leur

variabilité jouerait un rôle dans l’interaction avec l’hôte (Barbara et al., 2002; Kakizawa et

al., 2004; Kakizawa et al., 2009). Plus récemment, une autre protéine majoritaire de la

surface, la protéine Amp, subirait également une pression de sélection positive sur son

Introduction

34

domaine hydrophile lui accordant un rôle similaire à celui énoncé précédemment pour les

IDPs (Kakizawa et al., 2006a; Kakizawa et al., 2006b). De plus, cette protéine Amp de

Candidatus Phytoplasma asteris souche OY a été démontrée interagissant avec les

microfilaments de l’insecte (Suzuki et al., 2006). Cette interaction semble également être

corrélée avec la capacité des insectes à transmettre le phytoplasme ce qui suggère qu’elle

pourrait jouer un rôle important dans la spécificité de vection des phytoplasmes.

Une étude réalisée sur ce même phytoplasme a montré l’existence de deux souches

présentant une pathogénicité altérée (Oshima et al., 2001). Une de ces deux souches présente

la caractéristique de ne plus être transmissible par insecte vecteur après avoir été maintenue

sur plante par greffages successifs. Cette perte de transmissibilité par l’insecte vecteur a pu

être associée à la perte de deux ORF plasmidiques dans le génome de cette souche qui

pourraient intervenir dans le mécanisme de transmission (Nishigawa et al., 2002). L’absence

d’expression d’une de ces deux ORF, l’ORF3, est causée par la mutation et la délétion de

deux séquences promotrices sur les plasmides correspondants. De plus, l’expression de cette

ORF chez la souche sauvage se fait préférentiellement dans l’insecte plutôt qu’au niveau de la

plante renforçant son rôle dans une interaction avec son hôte insecte (Ishii et al., 2009a; Ishii

et al., 2009b).

La présence de système de sécrétion pouvant être impliquée, soit dans la formation des

structures de pili ou l’injection d’effecteurs responsables de l’entrée de certaines bactéries, a

également été étudiée chez les phytoplasmes. La recherche, dans les génomes disponibles, de

gènes ayant des similarités avec des gènes codant des protéines de type pili ou des systèmes

de sécrétion de type IV s’est avérée infructueuse à ce jour. Néanmoins, la présence des

protéines impliquées dans le système d’export Sec-dépendant, comme SecA, SecY et SecE,

ont été identifiées (Kakizawa et al., 2001; Kakizawa et al., 2004). L’expression de SecA a

même pu être détectée dans des plantes infectées par le phytoplasme (Kakizawa et al., 2001).

Ces protéines essentielles pour le fonctionnement du système d’export suggèrent l’existence

d’un système de translocation protéique Sec-dépendant fonctionnel et commun chez les

phytoplasmes. La protéine Amp, en plus de son rôle dans l’interaction avec les microfilaments

de l’insecte, a également été démontrée comme étant un substrat de ce système de sécrétion

(Kakizawa et al., 2004).

Introduction

35

2.1.3.3. Spiroplasmes

L’étude du protéome total de la souche de référence GII3 de S. citri a permis de mettre

en évidence la présence des sous-unités impliquées dans le système de sécrétion Sec-

dépendant comme SecA, SecY ou encore SecE. Un système Sec-dépendant est supposé être

fonctionnel chez S. citri. En revanche, aucun système de sécrétion de type III ou IV n’a pu

être identifié par homologie. L’existence d’un système de fonction analogue ne présentant

d’homologie avec les systèmes précédemment identifiés est cependant envisageable.

2.2. Internalisation

Les interactions initiales entre une cellule eucaryote et un pathogène sont

indispensables pour la virulence de ce dernier. Cette étape implique uniquement le ligand

bactérien et son récepteur, et est indépendante, dans la grande majorité des cas, du

cytosquelette. L’adhésion peut alors permettre la mise en place des étapes ultérieures de

l’invasion. En effet, les contacts mis en place au cours de cette étape entre les deux

organismes conduisent à une cascade de signaux tels que la phosphorylation et

déphosphorylation de protéines, le recrutement d’adaptateurs et d’effecteurs ainsi que

l’activation de composants du cytosquelette induisant l’internalisation de la bactérie. La

membrane plasmique est une structure dynamique assurant de nombreuses fonctions pour la

cellule comme l’adhérence entre les cellules, le transport de molécules, l’absorption de

nutriments, la défense contre les pathogènes, etc…. La plupart de ces fonctions, et notamment

les étapes nécessitant un transport actif au niveau de cette membrane, requièrent un

phénomène appelé endocytose.

2.2.1. Voie clathrine-dépendante

La voie clathrine-dépendante est la voie la plus importante pour l’internalisation des

protéines et des lipides (Brodin et al., 2000). Cette voie d’endocytose, contrôlée par une

protéine structurelle de la membrane, la clathrine, se produit dans toutes les cellules

eucaryotes. Le contact entre la bactérie et la cellule se fait par le biais d’un récepteur

spécifique qui possède, sur son domaine cytoplasmique, un signal d’induction impliquant la

formation de puits recouverts de clathrine. Ces puits sont ensuite internalisés dans une

vésicule qui est libérée vers les endosomes (Schmid & Damke, 1995). Cette voie est utilisée

par plusieurs bactéries intracellulaires comme Ricketssia conorii par l’intermédiaire du

Figure I.11: Deux mécanismes bactériens utilisés pour l’internalisation dans les cellules eucaryotes.A: Mécanisme basé sur la macropynocytose (Trigger mechanism). B: Mécanismes basé sur la phagocytose (Zipper

mechanism). (D’après Finlay et al., 1997).

Introduction

36

récepteur Ku70 (Martinez et al., 2005), Streptoccocus pneumoniae, par l’intermédiaire de la

β-arrestin 1 (Radin et al., 2005), ainsi que plusieurs autres espèces d’E. coli (Green & Brown,

2006), de Legionella (Maruta et al., 1998) ou encore Klebsiella pneumonia (Oelschlaeger &

Tall, 1997) et Brucella abortus (Detilleux et al., 1991).

2.2.2. Phagocytose

La phagocytose, quant à elle, permet notamment l’invagination des bactéries (Dramsi

& Cossart, 1998) par des cellules spécialisées telles que les macrophages, les monocytes ou

bien les neutrophiles (Aderem & Underhill, 1999). C’est un processus actif et extrêmement

régulé impliquant des récepteurs spécifiques à la surface des cellules et des cascades de

signalisation faisant intervenir de nombreuses GTPases (Hall & Nobes, 2000). Elle produit

des extensions de la membrane plasmique sous l’influence de la polymérisation des filaments

d’actine qui encerclent les particules ou les fluides extracellulaires, les faisant pénétrer à

l’intérieur de la cellule dans des phagosomes qui sont ensuite dirigés vers la machinerie

lysosomiale afin d’être dégradés.

Les bactéries sont parvenues à détourner ces processus cellulaires, mettant ainsi en

place des cascades de signalisation dans le but d’envahir les cellules de leur hôte en induisant

leur propre phagocytose. Se faisant, ces organismes intracellulaires peuvent ainsi pénétrer

dans un grand nombre de types cellulaires plus propices à leur survie.

Les voies utilisées par ces bactéries sont, là encore, nombreuses. Chez les bactéries

entéroinvasives, deux types principaux de phagocytose peuvent être néanmoins distingués :

un mécanisme « en fermeture éclair » (« zipper mechanism » ; (Cossart & Sansonetti, 2004))

qui implique le plus souvent la voie clathrine-dépendante et un mécanisme « trigger »

(Pizarro-Cerda & Cossart, 2006) qui se rapporte davantage à la macropynocytose (figure

I.11).

2.2.2.1. « Zipper » mécanisme

Ce mécanisme a été mieux caractérisé chez les bactéries Listeria et Yersinia. Comme

nous l’avons vu précédemment, ces bactéries expriment à leur surface des protéines qui se

lient aux récepteurs cellulaires. Il en résulte la formation de la vacuole phagocytaire, cette

étape étant induite par les signaux cellulaires produits après le premier contact entre les deux

partenaires. Les effecteurs, bien que différents chez les deux bactéries, induisent de légères

extensions membranaires par l’intermédiaire d’une cascade de signalisation faisant intervenir

Introduction

37

des protéines impliquées dans la régulation de la polymérisation des filaments d’actine

comme les Rho GTPases, le complexe Arp2/3 ainsi que des protéines appartenant à la famille

WASP (Wiskott-Aldrich Syndrome protein). L’induction de nouvelles protéines, cette fois-ci

impliquées dans la dépolymérisation des filaments d’actine, permettent la rétractation de la

vacuole et donc l’entrée de la bactérie (Cossart & Sansonetti, 2004).

2.2.2.2. « Trigger » mécanisme

Ce mécanisme se traduit par des gonflements importants de la membrane plasmique

qui emprisonne la bactérie. La formation de la poche, induite par des effecteurs bactériens

injectés par le biais du SSTT, implique des réarrangements locaux mais importants de la

surface nécessitant des réarrangements massifs du cytosquelette d’actine ainsi qu’une

dépolymérisation des microtubules. Certains aspects de ces cascades de signalisation

complexes restent encore partiellement inconnus.

Chez Shigella, la protéine IpaC induit la polymérisation d’actine par l’intermédiaire de

GTPases telles que Cdc42 et Rac1 (Nhieu & Sansonetti, 1999). VirA, un effecteur bactérien,

se lie à la tubuline et inhibe sa polymérisation. Une fois le processus d’internalisation engagé,

la bactérie entre dans la cellule et un nouvel effecteur IpaA se lie à la vinculine et induit la

dépolymérisation de l’actine (Bourdet-Sicard et al., 1999). Le facteur IpgD hydrolyse le

phosphatidylinositol 4,5-biphosphate en phosphoinositol phosphate et détache l’actine de la

membrane permettant la libération de la vacuole (Nhieu et al., 2005).

Chez Salmonella, le processus nécessite les mêmes étapes, à savoir une polymérisation

des microfilaments d’actine induite par SipC seule (Hayward & Koronakis, 1999).

L’interaction de cette dernière avec SopE permet l’extension brutale des filaments qui, de ce

fait, englobe littéralement la bactérie (Hardt et al., 1998). Un homologue du facteur IpgD de

Shigella, nommé SopB/SigD, permet de favoriser l’entrée de la bactérie (Norris et al., 1998).

2.2.2.3. Voie dépendante des microtubules

La dernière voie utilisée par les bactéries pour pénétrer dans les cellules de l’hôte fait

intervenir un mécanisme, moins bien défini, basé sur l’utilisation des microtubules. Cette

voie, insensible à la cytochalasine D, une drogue qui altère la polymérisation des filaments

d’actine, est totalement indépendante du réseau d’actine. L’implication de cette voie a

notamment été démontrée pour l’entrée de Campylobacter jejuni et Citrobacter freundii dans

des cellules en culture (Oelschlaeger et al., 1993).

Introduction

38

Bien entendu, ces voies ne s’excluent pas les unes des autres. Plusieurs espèces de

Chlamydia utilisent aussi bien la voie clathrine-dépendante que celle utilisant le réseau de

microtubule pour entrer dans les cellules (Majeed & Kihlstrom, 1991; Schramm & Wyrick,

1995). Il en est de même pour Saphylococcus aureus (Ellington et al., 1999). Neisseria

gonorrhoeae, quant à elle, induit son internalisation à la fois par la voie chlatrine-dépendante

par le biais d’un récepteur de type glycoprotéique (Harvey et al., 2001) mais peut aussi

induire sa phagocytose par un mécanisme proche du « zipper » mécanisme (Grassme et al.,

1996).

2.2.3. Mycoplasmes

Pour certains mycoplasmes, des approches expérimentales de microscopie

électronique combinée au marquage immunologique (Taylor-Robinson et al., 1991; Taylor-

Robinson et al., 1993; Andreev et al., 1995), de microscopie confocale (Baseman et al., 1995;

Winner et al., 2000), ont permis de visualiser l’entrée dans les cellules de l’hôte. Cette

capacité d'invasion et de survie dans les cellules de l’hôte a été, pour la première fois,

démontrée chez M. penetrans (Andreev et al., 1995). Plus récemment, cette capacité à résider

dans les cellules non phagocytaires a également été mise en évidence pour d'autres

mycoplasmes comme M. fermentans, M. hominis, M. pneumoniae, M. genitalium et M.

gallisepticum (Citti et al., 2005).

L’intervention de protéines se liant à la fibronectine a été suggérée dans le processus

d'internalisation chez M. penetrans (Giron et al., 1996) et M. pneumoniae (Dallo et al., 2002).

L'inhibition du processus d’internalisation de certains mycoplasmes comme M. penetrans

(Borovsky et al., 1998) et M. gallisepticum (Winner et al., 2000), par certaines drogues

affectant les microtubules (nocodazole, vinblastine), suggère que ces internalisations

bactériennes utilisent le cytosquelette de la cellule eucaryote. De plus, la dépolymérisation des

microfilaments par la cytochalasine D inhibe l'invasion de M. penetrans mais pas celle de M.

gallisepticum. Il semble donc que les mycoplasmes disposent de différentes stratégies de

détournement du cytosquelette pour entrer à l'intérieur des cellules eucaryotes (Winner et al.,

2000).

En parallèle, les mycoplasmes, de par leur absence de paroi, peuvent également

fusionner directement avec la membrane plasmique afin de pénétrer dans les cellules de l’hôte

(Franzoso et al., 1992).

Introduction

39

2.2.4. Virus

En tant que pathogènes intracellulaires obligatoires, de nombreux virus détournent

également l’ensemble des voies d’endocytoses pour pénétrer dans les cellules. Une revue,

parue en 2009, détaille l’ensemble de ces voies utilisées par les virus pour leur internalisation

cellulaire (Mercer & Helenius, 2009).

Dans le cas des polérovirus et des lutéovirus, ces franchissements nécessitent

l’interaction d’une protéine virale avec un récepteur membranaire conduisant à un phénomène

d’endocytose par la voie clathrine-dépendante (Gildow, 1987). Dans le cas de virus

enveloppés, comme chez les bunyavirus par exemple, l’internalisation nécessite une fusion

directe de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire (Marsh & Helenius, 1989).

Les virus de la famille des lutéovirus sont particulièrement bien connus. La protéine de

capside (CP), protéine essentielle lors de l’assemblage du virus semble pouvoir intervenir

dans la transmission mais ne suffit pas à expliquer le phénomène de transmission à elle seule.

En effet, des virus assemblés uniquement avec cette protéine ne sont pas transmissibles à la

plante de manière efficace. En revanche, ces virus sont retrouvés dans l’hémolymphe

d’insecte ayant été mis à acquérir sur une suspension virale ce qui montre que la CP est

impliquée dans le franchissement de la barrière intestinale (Reinbold et al., 2001).

L’identification d’un peptide, de structure homologue à celle de la CP des lutéovirus, pouvant

se lier aux cellules de l’épithélium intestinal empêche la pénétration des particules virales

dans l’hémolymphe renforçant un peu plus le rôle de la CP dans le franchissement de cette

barrière (Liu et al., 2010). De plus, une seconde protéine « readthrough » (RT), protéine

obtenue par translecture du codon stop de la protéine de capside, composant, avec la CP, la

coque protéique virale, semble intervenir dans ce phénomène. Des mutants viraux n’ayant pas

incorporé cette protéine ne sont pas transmissibles par insectes bien que ces mêmes mutants,

injectés à une plante lors d’une agroinfection, induisent une infection (Bruyere et al., 1997).

Cette protéine a également été impliquée dans la spécificité de vection des lutéovirus (Brault

et al., 2005). Plus récemment, l’identification de deux lectines, présentant des homologies

avec des protéines de la famille PP2 (Phloem Proteins 2) prédominantes dans le phloème des

plantes, capables d’interagir avec les particules virales du Cucurbit aphid borne yellows virus

(CABYV), semblent jouer un rôle dans le transmission de ce virus par son insecte vecteur

(Bencharki et al., 2010).

L’identification de récepteurs chez le puceron Myzus persicae a montré que la RT du

Beet western mosaic virus pouvait se lier à un homologue de Rack 1 de Drosophila

melanogaster qui joue un rôle important dans les mécanismes d’endocytose/exocytose. De

Introduction

40

plus, des particules virales de ce même lutéovirus semble pouvoir interagir avec la

glyceraldéhyde-3-phosphate deshydrogénase (GAPDH) de l’insecte qui, en régulant l’actine,

jouerait un rôle dans l’endoctytose du virus (Seddas et al., 2004).

En parallèle, des endosymbiotes du genre Buchnera, présents chez la plupart des

pucerons, produisent de grande quantité d’une protéine nommée symbionine. Cette protéine,

homologue de la chaperone GroEL de chez E. coli, possède la capacité d’interagir in vitro à

des virions ou à des protéines RT recombinantes (van den Heuvel et al., 1994). De plus, la

capacité des insectes à transmettre ces mêmes virus est fortement diminuée lorsqu’ils sont

débarrassés de leur endosymbiotes (van den Heuvel et al., 1997).

Le passage de la barrière intestinale, à l’inverse de celui de la barrière des glandes

salivaires, ne semble pas être spécifique de cette vection. En effet, de nombreux virus n’étant

pas transmis par certains insectes se retrouvent néanmoins dans l’hémolymphe de ces derniers

suggérant un blocage au niveau des glandes salivaires (Gray & Gildow, 2003).

2.2.5. Franchissement de la barrière des glandes salivaires

L’ensemble des systèmes étudiés, à partir des données concernant la caractérisation de

la transmission de virus phytopathogènes, de bactéries ou de parasites, semble indiquer que la

barrière des glandes salivaires reste l’étape essentielle pour déterminer la spécificité de

vection. Cette spécificité implique que les microorganismes sont reconnus par la membrane

des glandes salivaires, probablement par une interaction de type ligand-récepteur. Cette

caractéristique est renforcée par l’aptitude de certains pathogènes à pénétrer dans

l’hémolymphe de l’insecte, traversant ainsi la barrière intestinale, mais étant incapable de

franchir celles des glandes salivaires. Le parasite Plasmodium knowlesi est transmis par le

moustique Anopheles dirus mais, en revanche, se trouve bloqué dans l’hémolymphe d’une

autre espèce d’Anopheles non vectrice sans pouvoir envahir les glandes salivaires (Rosenberg,

1985).

De nombreux travaux ont été menés sur l’étude de cette reconnaissance de la

membrane des glandes salivaires chez Plasmodium. Les protéines PCRMP (Cysteine Repeat

modular proteins), deux protéines localisées à la surface du parasite, ainsi que la protéine

MAEBL (Kariu et al., 2002) sont impliquées dans le franchissement des glandes salivaires

sans que leurs partenaires au niveau de l’insecte ne soient identifiés. Des mutants dépourvus

d’une de ces protéines sont incapables d’envahir les glandes salivaires (Thompson et al.,

Introduction

41

2007). Récemment, une interaction de type ligand-récepteur a été identifiée. Le peptide SM1

(Salivary gland and Midgut peptide 1) se lie à la membrane des cellules épithéliales des

glandes salivaires et de l’intestin mais cette liaison inhibe l’invasion de Plasmodium berghei

dans ces organes (Ghosh et al., 2001). L’utilisation d’agents pontants a permis de déterminer

son ligand à la surface des cellules. Il s’agit d’une protéine de 50 kDa nommée sagline (Ghosh

et al., 2009). De plus, cette protéine agit comme un récepteur pour l’invasion des sporozoites

par le biais d’une interaction avec le facteur parasitaire TRAP (Thrombospondin Related

Anonymous Protein) (Ghosh et al., 2009). La mutation de deux acides aminés de cette

protéine permet d’inhiber l’invasion des glandes salivaires par le sporozoite (Matuschewski et

al., 2002). Cette cascade d’interaction reste le mécanisme le mieux décrit concernant le

franchissement de la barrière des glandes salivaires dans la transmission par insecte vecteur.

2.3. Echappement à la machinerie lysosomiale

Les microorganismes, qui ont maintenant pénétré dans la cellule, se retrouve dans une

vacuole d’endocytose. Une fois internalisés, ces derniers doivent se protéger des systèmes de

dégradation mise en place par la cellule eucaryote. Le principal mécanisme de ces systèmes

de dégradation, activés en condition de stress, repose sur le fait qu’une région du cytoplasme

se retrouve séquestrée dans un autophagosome, composé d’une double membrane, qui est

ensuite fusionné avec les lysosomes dans le but d’être dégradé (Kirkegaard et al., 2004).

En réponse à ces voies de dégradation, les bactéries ont adapté des processus de

contournement de ce système immunitaire qui peuvent être regroupés en trois groupes

distincts.

2.3.1. Arrêt de la maturation des phagosomes

L’arrêt de la maturation peut avoir lieu à des stades différents de la maturation des

phagosomes, précocement pour le genre Mycobacterium ou alors plus tardivement dans le cas

de Salmonella. Les vacuoles contenant Mycobacterium restent à un stade d’endosome

primaire et évitent le processus de fusion avec les lysosomes en empêchant l’incorporation,

dans la membrane de la vacuole, d’adenosine triphosphatase qui a pour rôle d’acidifier la

vésicule afin d’activer plusieurs enzymes responsables de la dégradation (Sturgill-Koszycki et

al., 1997). Dans le cas de Salmonella, les bactéries se retrouvent dans des vacuoles atypiques,

les SCV (Salmonella Containing Vacuole), qui sont des endosomes détournés par la bactérie

afin de ne pas subir la dégradation lysosomiale (Brumell et al., 2002).

Introduction

42

2.3.2. Libération de la vacuole

D’autres bactéries, à l’inverse, ne restent pas dans leur vésicule d’endocytose et

s’échappent des phagosomes. Elles lysent rapidement la vacuole et se retrouvent libre dans le

cytoplasme. C’est le cas des Shigella avec le facteur d’adhésion IpaB (High et al., 1992) ou

des Listeria avec la lysteriolysine O (LLO) qui forment un pore dans la vacuole permettant à

la bactérie d’être libre dans le cytoplasme dans lequel elle peut se multiplier (Gaillard et al.,

1987). Rickettsia fait également partie de ces bactéries en sécrétant une phospholipase qui

déstabilise la membrane des phagosomes (Walker et al., 2001).

2.3.3. Détournement du système lysosomial

Un dernier groupe de bactéries manipule la membrane de la cellule de son hôte pour se

retrouver à l’intérieur de vésicules non phagosomiales. Legionella se retrouve ainsi dans un

compartiment ayant des caractéristiques communes avec le réticulum endoplasmique (Tilney

et al., 2001). D’autres encore, comme les Chlamydia, peuvent produire leur propre

compartiment d’endocytose, distinct de tous ceux existants dans la cellule (Hackstadt et al.,

1996).

Là encore des bactéries possèdent plusieurs systèmes d’échappement à la dégradation

cellulaire. C’est ainsi que pour échapper à la voie autophagique, la bactérie Shigella sécrète,

par l’intermédiaire de son système de sécrétion de type III, une protéine IcsB qui inhibe la

liaison entre le facteur bactérien VirG et le ligand cellulaire Atg5 impliquée dans la

séquestration autophagique de la bactérie (Ogawa et al., 2005). Ensuite, elle peut lyser la

membrane de ce dernier afin de coloniser le cytoplasme.

2.4. Dissémination dans l’hôte

Une fois libre dans le cytoplasme, certaines bactéries utilisent une nouvelle fois le

réseau d’actine, cette fois-ci dans le but d’assurer leur motilité intra- ou intercellulaire. De ce

fait, une interaction directe entre la bactérie et le cytosquelette est nécessaire (Stevens et al.,

2006). Les bactéries possèdent donc des protéines dédiées à cette motilité et capables

d’interagir avec le système de polymérisation des filaments d’actine.

Listeria induit le recrutement et la polymérisation d’actine en exprimant une protéine

de surface ActA qui se lie au complexe Arp2/3, ce dernier formant un pont entre ActA et

l’actine (Welch et al., 1998). Il en résulte la formation d’un réseau de filaments d’actine,

Introduction

43

nommé « queue d’actine » (actin-tail) que la bactérie peut contrôler grâce à l’intervention de

plusieurs autres protéines telles que la cofiline, la profiline ou l’α-actinine qui permettent de

moduler la densité et les mouvements des filaments (Cossart & Sansonetti, 2004). Shigella,

quant à elle, exprime une protéine extracellulaire IcsA capable de recruter une protéine N-

WASP (Neural Wiskott–Aldrich syndrome protein), fonctionnellement et structuralement liée

à la protéine ActA de Listeria, qui active elle aussi le complexe Arp2/3 et, de ce fait, induit la

formation du réseau d’actine à un pôle de la bactérie (Suzuki & Sasakawa, 1998). Il en est de

même pour la bactérie Rickettsia qui utilise également cette queue d’actine par l’intermédiaire

d’un mécanisme identique faisant intervenir la protéine RickA (Gouin et al., 2004).

En plus de ce réseau d’actine, certains pathogènes utilisent d’autres protéines du

réseau de cytosquelette, comme les kinésines et les dynéines associées aux microtubules. Ils

interagissent avec ces « moteurs » pour se déplacer également dans le cytoplasme de la cellule

(McNiven & Marlowe, 1999). C’est le cas de Campylobacter jejuni qui se déplace le long des

filaments de microtubules grâce aux dynéines (Hu & Kopecko, 1999). Ce mode de transport a

été également observé chez Chlamydia trachomatis pour qui, l’inhibition de la dynéine

cellulaire réduit de manière considérable l’infectivité (Clausen et al., 1997).

3. Déterminants génétiques de la transmission de Spiroplasma citri

3.1. Transmission expérimentale de S. citri

Au début du repas sur une plante infectée par S. citri, la cicadelle vectrice, Circulifer

haematoceps, fait tout d’abord plusieurs piqûres d’essai afin d’identifier la plante. Au moment

de la piqûre, ce dernier sécrète une salive dite coagulante qui, en se solidifiant au contact de

l’air, va former une gaine protégeant les stylets. Juste avant l’ingestion, il sécrète une salive

plus aqueuse contenant des enzymes (amylases, protéases, oligosaccharases) aidant à la

digestion de la sève (Backus & McLean, 1985). Les spiroplasmes présents sont alors ingérés

avec cette sève. Après un temps de latence nécessaire à S. citri pour coloniser l’insecte et

gagner les glandes salivaires de celui-ci (5 à 6 jours), le spiroplasme est de nouveau injecté,

au cours du prochain repas de l’insecte, dans le phloème d’une nouvelle pervenche. Après une

période d’incubation de 2 à 3 semaines pour la souche GII3, les premiers symptômes

apparaissent sur les pervenches infectées. Les symptômes développés par la pervenche de

Madagascar, infectée par S. citri, ont été décrits (Bové et al., 1978; Calavan & Oldfield,

1979).

Pervenche infectée

Pervenche saine

Insecte vecteur

Culture de S. citri

1: ACQUISITION

2: TRANSM

ISSI

ON

3: RECRACHAGE

4: IN

JECTIO

N

INTR

AABDOMIN

ALE

Figure I.12: Différents systèmes disponibles au laboratoire permettant l’étude de la transmission de S. citri

Introduction

44

Afin d’étudier les mécanismes mis en jeu au cours de la transmission de S. citri par

l’insecte, des sytèmes expérimentaux d’acquisition et de transmission ont été mis au point au

laboratoire (figure I.12, étapes 1 et 2).

De plus, un système expérimental permet d’injecter une culture de S. citri directement

dans l’hémolymphe de l’insecte, court-circuitant ainsi le franchissement de la barrière

intestinale, afin de se concentrer uniquement sur le franchissement de la barrière des glandes

salivaires (figure I.12, étape 3)(Foissac et al., 1997). Il est également possible de réaliser des

tests d’inoculation de S. citri par C. haematoceps à travers une membrane de Parafilm®

(figure I.12, étape 4)(Foissac et al., 1996). L’acquisition de spiroplasme par l’insecte peut

également être étudiée en plaçant ces derniers sur une plante infectée ou sur une culture de la

bactérie.

3.2. Identification de protéines chez S. citri candidates dans la transmission

La mise au point d’outils génétiques comme la mutagénèse par l’utilisation de

transposons, la disruption de gènes par recombinaison homologue et les vecteurs

plasmidiques ont permis de produire et de complémenter des mutants affectés dans leur

transmission (Foissac et al., 1997; Renaudin & Lartigue, 2005). Ces derniers, étudiés dans les

systèmes de transmission expérimentaux disponibles, ont pu mettre en évidence l’implication

de protéines dans la transmission du spiroplasme par son insecte vecteur. C’est ainsi que la

spiraline, protéine majoritaire du spiroplasme, mais aussi la protéine Sc76, une lipoprotéine

présentant des homologies avec une « Solute Binding Protein » d’un ABC transporteur de

glucose, ont été impliquées (Boutareaud et al., 2004 ; Duret et al., 2003).

Certaines souches de S. citri se multiplient dans l’hémolymphe, mais ne peuvent pas

être transmises à la plante hôte par la cicadelle infectée. C’est le cas des souches R8A2 et

Israël qui, maintenues dans la pervenche par greffage pendant plusieurs années, ne peuvent

plus être transmises par Circulifer haematoceps (Bové, 1988). Il est est de même pour la

souche 44 maintenue sur agrumes depuis de longues années même si elle reste toujours

pathogène. Les mêmes caractéristiques ont également été observées pour la souche BR3-G

Circulifer tenellus (Wayadande & Fletcher, 1995). De plus, les cicadelles sont incapables

d’acquérir cette souche en se nourrissant sur une suspension de spiroplasmes. Ces premières

données suggèrent que les franchissements des barrières de l’insecte par le spiroplasme

semblent être contrôlés par des protéines dont l’expression pourrait être perdue lorsque le

spiroplasme est maintenu dans la plante ou en culture in vitro sans passage dans l’insecte. Les

Introduction

45

souches maintenues dans un tel système, en plus d’être associées à un phénotype de non-

transmissibilité, montre un protéome et un profil plasmidique différent de la souche GII3 de

référence. Une corrélation a pu être établie entre la présence des plasmides pSci et la

transmissibilité de cette bactérie par son insecte vecteur (Berho et al., 2006; Killiny et al.,

2006). Afin d’évaluer leurs contributions respectives au phénotype de transmissibilité, les

plasmides pSci 1 à 6 de la souche transmissible GII3 ont été introduits dans la souche non

transmissible 44, et la transmissibilité de transformants a été déterminée. Il est apparu que

seuls les transformants possédant le pSci6 sont transmis avec toutefois une efficacité moindre

que celle de la souche transmissible GII3 (Berho et al., 2006). Ces résultats indiquent que

contrairement aux autres plasmides pSci, le plasmide pSci6 porte des déterminants essentiels

à la transmission. Les premiers de ces déterminants appartiennent à une famille multigénique,

les protéines ScARPs (S. citri adhesion related proteins). Ces protéines membranaires

présentent de fortes homologies avec la protéine ARP1 de S. citri souche BR3 (Berg et al.,

2001) qui est impliquée dans l’adhésion in vitro aux cellules d’insectes (Yu et al., 2000).

Dans la souche de S. citri GII3, 8 gènes codent pour 8 protéines ScARPs qui sont portées par

les plasmides pSci 1 à 5 (Berho et al., 2006). Elles contiennent un peptide signal, de six à huit

séquences répétées qui pourraient servir de domaine de liaison à un ligand comme celles qui

interviennent dans les systèmes à deux composants impliqués dans la transduction de signal

intervenant dans la virulence bactérienne (Cossart, 2004). De plus, la présence d’un signal de

localisation nucléaire a également été prédite sans que son rôle ne soit élucidé. Sa présence

suggère néanmoins un éventuel rôle d’effecteur capable de modifier l’expression des gènes de

la cellule hôte.

La protéine P32 constitue un autre déterminant porté par ce plasmide pSci6 et qui

pourrait intervenir dans la transmission du spiroplasme. Cette protéine hydrophile de 238

acides aminés ne possède pas de domaines caractéristiques et ne présente aucune homologie

avec des protéines connues. L’introduction du gène p32 dans la souche 44 semble modifier la

localisation des spiroplasmes au niveau des glandes salivaires. En revanche, elle ne permet

pas de restaurer la transmissibilité (Killiny et al., 2006).

La comparaison des cartes protéique des souches transmissibles et non-transmissibles

de S. citri a permis de confirmer l’absence de ces déterminants, à savoir les protéines ScARPs

et la protéine P32, chez la souche non-transmissible 44.

Plus récemment, l’implication plus ciblée d’une CDS présente sur la pSci6 a été

décrite. Cette région codante, annotée traG, est requise pour la transmission de S. citri par

l’insecte vecteur C. haematoceps (Breton et al., 2010). Ce gène code une protéine qui

Introduction

46

présente des homologies avec la partie C-terminale d’ATPases de la famille des TraG/VirD4

impliquées dans les systèmes de sécrétion de type IV. Cette protéine cytosolique, bien

qu’atypique pour être impliquée dans la transmission du spiroplasme, pourrait permettre à

celui-ci de franchir la barrière des glandes salivaires ou de survivre à l’intérieur des cellules

de l’insecte. En effet, un spiroplasme dépourvu de cette protéine peut se multiplier dans

l’hémolymphe mais semble incapable de rejoindre le canal salivaire afin d’être injecté à la

plante (Breton et al., 2010).

L’adhésion aux cellules, comme évoqué précédemment, est considérée comme une

étape essentielle du processus de colonisation des tissus (Pizarro-Cerda & Cossart, 2006).

Chez S. citri, les protéines impliquées dans l’adhésion sont encore peu nombreuses et leurs

rôles sont assez mal compris. Même si la protéine Sc76 ainsi les protéines ScARPs,

contribuant à la transmission, semblent pouvoir assumer ce rôle d’adhésines, à ce jour, seule

la spiraline a été impliquée dans une interaction avec les protéines d’insectes (Killiny et al.,

2005). A l’origine, la spiraline est connue pour former un « manteau » protecteur à la surface

du spiroplasme (Castano et al., 2002). Cependant, cette lipoprotéine a été démontrée comme

étant une protéine de type lectine pouvant interagir avec deux glycoprotéines de l’insecte

vecteur C.haematoceps (Killiny et al., 2005). Elle semble donc être une candidate idéale pour

avoir ce rôle chez S. citri dans l’adhésion aux cellules d’insectes, étape indispensable au

franchissement des barrières intestinale et des glandes salivaires.

La mise au point récente, au laboratoire, d’une lignée cellulaire Ciha-1 de l’insecte

vecteur C. haematoceps ouvre la voie à l’étude de l’invasion de S. citri dans les cellules de

son hôte (Duret et al., 2009).

IV. Situation du sujet et objectifs de recherche

Les objectifs de cette thèse font partie intégrante de la thématique développée au

laboratoire afin d’élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans la transmission de S.

citri . Au début de ce travail, la spiraline, la P32, les ScARPs ainsi que la protéine Sc76,

étaient identifiées comme des protéines candidates dans la transmission mais seule une

interaction entre la spiraline et les protéines de l’insecte avait été démontrée. De plus, aucune

de ces protéines ne semblaient essentielle à ce processus. Mon but était donc de mettre en

évidence des interactions entre les protéines de S. citri et celles de son insecte vecteur puis

d’identifier les protéines impliquées dans celles-ci.

Introduction

47

Le premier chapitre de ce mémoire présente les résultats de la technique utilisée pour

étudier les interactions entre les protéines de S. citri et celles de son insecte vecteur.

L’identification d’une interaction entre la PGK et l’actine de l’insecte fait plus

particulièrement l’objet de ce chapitre.

Dans le second chapitre sont présentés les résultats obtenus pour définir la région

minimale de la PGK impliquée dans l’interaction avec l’actine. Sont également signalés dans

ce chapitre, les effets de cette interaction sur la transmission de S. citri par la cicadelle C.

haematoceps.

Le troisième chapitre est consacré aux tentatives d’obtenir un mutant dépourvu de

PGK afin d’étudier sa transmissibilité par l’insecte.

Aucune protéine n’étant impliquée seule dans la transmission, la recherche des

complexes multi-protéiques impliqués dans celle-ci fera l’objet du chapitre 4. Les deux

méthodologies utilisées, à savoir la technique de BN PAGE (Blue Native PAGE) et

l’utilisation d’agents pontants, ainsi que les résultats obtenus, seront discutés

Chapitre 1

Figure 1.1: Schéma montrant le franchissement par S. citri des deux barrières de son insecte vecteur ainsi que les changements de morphologie du spiroplasme au cours de son circuit.

(D’après Fletcher et al., 1998).

Chapitre 1

48

Interactions protéine-protéine entre S. citri et son insecte vecteur Circulifer haematoceps

I. Introduction et objectifs

La cicadelle identifiée dans les pays du pourtour méditerranéen comme hôte de S. citri

est Circulifer haematoceps (Fos et al., 1986). La souche de référence de S. citri, étudiée dans

notre pathosystème, a été isolée pour la première fois à partir d’un insecte C. haematoceps

capturé au Maroc (Vignault et al., 1980). Les transmissions expérimentales effectuées au

laboratoire, par injection intra abdominale de S. citri dans cette cicadelle, ont révélé qu’elle

était capable de le transmettre à la pervenche de Madagascar, Catharanthus roseus.

La transmission de S. citri par C. haematoceps est caractérisée par plusieurs facteurs

qui lui sont propres. Premièrement, elle est spécifique ce qui signifie qu’une seule espèce

d’insecte vecteur ou quelques espèces proches sont capables de transmettre le spiroplasme à la

plante. De plus, elle se déroule selon un mode circulant-multipliant nécessitant donc une

colonisation de l’insecte. Enfin, elle est persistante ; un insecte infecté le reste tout au long de

sa vie.

Au cours de son circuit dans C. tenellus, autre vecteur de spiroplasme en Californie,

celui-ci doit franchir deux barrières, à savoir la barrière intestinale et celle des glandes

salivaires (figure 1.1) (Fletcher et al., 1998).

Plusieurs questions se posent concernant ce mécanisme de transmission et les protéines

intervenantes :

Des protéines de S. citri sont-elles impliquées dans ces franchissements en

interagissant directement avec des protéines de l’insecte vecteur ? Si oui, quelles sont-elles ?

Les mêmes protéines sont-elles impliquées dans le franchissement des deux barrières

ou existe-t-il des protéines intervenant spécifiquement dans le passage de l’une de ces deux

barrières ?

Ces protéines participent-elles aux étapes d’adhésion et d’internalisation au cours du

franchissement de l’une de ces barrières biologiques ?

Comment le spiroplasme fait-il pour se déplacer à l’intérieur des cellules de

l’insecte ? Est-ce par l’intermédiaire du « tip » ? Si oui, quelles sont les protéines impliquées

dans cette structure ?

Chapitre 1

49

Les travaux réalisés par Killiny et collaborateurs en 2005 ont permis de répondre à la

première question qui a été déterminante pour la suite de cette étude. En effet, par la mise au

point d’une technique in vitro d’interaction protéine-protéine, le far Western, des interactions

ont été démontrées entre S. citri et C. haematoceps (Killiny et al., 2005). Ces interactions, au

nombre de sept, impliquent des protéines d’insecte de masses moléculaires variables. De plus,

deux de ces protéines, ayant des masses moléculaires de 50 et 60 kDa, sont des glycoprotéines

et ont été directement impliquées dans une interaction de type glycoprotéine-lectine avec la

spiraline de S. citri.

Au début de ce travail de thèse, la spiraline est donc la seule protéine de spiroplasme

impliquée dans une interaction avec des protéines d’insecte. Cependant, un mutant dépourvu

de spiraline est transmis par la cicadelle C. haematoceps à la pervenche mais l’efficacité de

transmission est moindre comparée à celle du sauvage (Duret et al., 2003). Il faut donc

admettre que d’autres protéines de spiroplasmes, liées ou non à la spiraline, interviennent dans

la transmission de S. citri par son insecte vecteur.

Afin d’identifier de nouvelles protéines impliquées dans des interactions avec

l’insecte, la technique de far Western a été utilisée pour mettre en évidence des interactions

entre les protéines des glandes salivaires de l’insecte et celles de S. citri. En effet, sachant que

la dernière étape essentielle au cours de la transmission est le franchissement de la barrière

des glandes salivaires et, étant donné que le prélèvement de ces dernières est relativement aisé

chez la cicadelle, la plupart de mes études ont porté sur les protéines de cet organe. Cette

technique, dont le principe est détaillé dans le chapitre Matériels et Méthodes, permet la

détection in vitro des interactions protéines-protéines. Elle trouve ses origines dans les travaux

sur les interactions entre les protéines de Bacillus thuringiensis et son insecte vecteur

(Hofmann et al., 1988). Des résultats intéressants ont également été obtenus dans l’étude des

interactions entre les virus végétaux et leurs cellules hôtes (Morin et al., 2000) et les

interactions de type lectine-sucre conférant la résistance à une espèce de riz transgénique

exprimant cette lectine vis-à-vis de deux insectes, Nephotettix virescens et Nilaparvate lugens

(Foissac et al., 2000). Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres

techniques de détection d’interactions protéine-protéine (double hybride, TAP-tag, GST-

pulldown, etc…) est qu’elle ne nécessite pas l’expression hétérologue de protéines. En effet,

l’utilisation du codon UGA comme codon tryptophane chez S. citri oblige la mutation de

chacun d’entre eux lors d’une expression chez E. coli. Une technique nécessitant l’expression

de protéines n’était donc pas envisageable pour une étude comme celle-ci, cherchant à

identifier, dans le protéome total du spiroplasme, des protéines candidates impliquées dans la

Chapitre 1

50

transmission. Cet avantage en fait la technique idéale pour une analyse sans a priori afin

d’obtenir des candidats qui seront alors testés par d’autres techniques plus fines.

Par la suite, l’identification d’un candidat chez C. haematoceps nous a incités à

rechercher le partenaire de cette protéine d’insecte et à rechercher le rôle d’une telle

interaction au niveau de la transmission de S. citri par son insecte vecteur. Les résultats sont

regroupés dans la publication intitulée « Entry of Spiroplasma citri into Circulifer

haematoceps cells involves interaction between spiroplasma phosphoglycerate kinase and

leafhopper actin ».

Quelques résultats complémentaires concernant notamment la technique de far

Western ainsi que quelques points clés des travaux présentés dans cette publication, seront

également détaillés au cours de ce chapitre.

Figure 1.2: Principales figures extraites de la publication n°1 (Labroussaa et al., 2010)

Figure 1

Figure 2

Figure 3

Figure 4

Figures 5 et 6

Chapitre 1

51

II. Résultats et discussion

1. Publication 1

Les résultats obtenus au cours de ce premier chapitre sont publiés dans Applied and

Environmental Microbiology sous le titre « Entry of Spiroplasma citri into Circulifer

haematoceps cells involves interaction between spiroplasma phosphoglycerate kinase and

leafhopper actin ». Les points essentiels de ce travail sont résumés ci-dessous et les figures

nécessaires à sa compréhension sont représentées sur la figure 1.2.

Le far Western monodimensionnel (1-D) entre les protéines totales d’insectes et

celles de S. citri montre que des protéines du spiroplasme interagissent avec cinq protéines

des glandes salivaires de Circulifer haematoceps (Figure 1A). Parmi ces protéines, la protéine

localisée à 42 kDa a été identifiée comme étant l’actine de l’insecte vecteur.

Cette interaction entre S. citri et l’actine de son insecte vecteur a été confirmée par

microscopie confocale sur des glandes salivaires de C. haematoceps infectées par S. citri

(Figure 1B).

Par chromatographie d’affinité, le partenaire de l’actine de l’insecte a été identifié

comme étant la phosphoglycérate kinase de S. citri (Figure 2, piste 4).

La production et la purification de la His6-PGK de S. citri ont permis de confirmer

l’interaction entre les deux partenaires et ce, à la fois en far Western 1-D à l’aide d’un

anticorps anti-actine (Figure 3) ainsi qu’en microscopie confocale sur des cellules de C.

haematoceps en culture et incubées avec cette PGK recombinante (Figure 4).

L’incubation des cellules de C. haematoceps avec différentes concentrations de la

His6-PGK a montré que cette dernière n’avait aucun rôle dans l’adhésion aux cellules

d’insectes (Figure 5) mais intervenait, de manière dose-dépendante, dans l’internalisation des

cellules d’insecte (Figure 6).

APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Mar. 2010, p. 1879–1886 Vol. 76, No. 60099-2240/10/$12.00 doi:10.1128/AEM.02384-09Copyright © 2010, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.

Entry of Spiroplasma citri into Circulifer haematoceps CellsInvolves Interaction between Spiroplasma Phosphoglycerate

Kinase and Leafhopper Actin

Fabien Labroussaa, Nathalie Arricau-Bouvery, Marie-Pierre Dubrana, and Colette Saillard*INRA et Universite Victor Segalen Bordeaux 2, UMR 1090 Genomique Diversite Pouvoir Pathogene,

71 Avenue Edouard Bourlaux BP 81, F-33883 Villenave d’Ornon, France

Received 1 October 2009/Accepted 18 January 2010

Transmission of the phytopathogenic mollicutes, spiroplasmas, and phytoplasmas by their insect vectorsmainly depends on their ability to pass through gut cells, to multiply in various tissues, and to traverse thesalivary gland cells. The passage of these different barriers suggests molecular interactions between the plantmollicute and the insect vector that regulate transmission. In the present study, we focused on the interactionbetween Spiroplasma citri and its leafhopper vector, Circulifer haematoceps. An in vitro protein overlay assayidentified five significant binding activities between S. citri proteins and insect host proteins from salivaryglands. One insect protein involved in one binding activity was identified by liquid chromatography-tandemmass spectrometry (LC-MS/MS) as actin. Confocal microscopy observations of infected salivary glands re-vealed that spiroplasmas colocated with the host actin filaments. An S. citri actin-binding protein of 44 kDa wasisolated by affinity chromatography and identified by LC-MS/MS as phosphoglycerate kinase (PGK). Toinvestigate the role of the PGK-actin interaction, we performed competitive binding and internalization assayson leafhopper cultured cell lines (Ciha-1) in which His6-tagged PGK from S. citri or purified PGK fromSaccharomyces cerevisiae was added prior to the addition of S. citri inoculum. The results suggested thatexogenous PGK has no effect on spiroplasmal attachment to leafhopper cell surfaces but inhibits S. citriinternalization, demonstrating that the process leading to internalization of S. citri in eukaryotic cells requiresthe presence of PGK. PGK, regardless of origin, reduced the entry of spiroplasmas into Ciha-1 cells in adose-dependent manner.

Phloem-feeding leafhoppers transmit plant pathogenic mol-licutes, spiroplasmas, and phytoplasmas from plant to plant ina persistent propagative manner (26, 43). These phytopatho-genic mollicutes are restricted to phloem and to certain vectortissues; thus, their vectors are phloem sap-feeding specialists.After being ingested from plant phloem by their insect vectors,they traverse the insect gut wall, move into the hemolymph,where they multiply, and invade the salivary glands (20, 33, 34,36). During their movements in the insect vector until its trans-mission to a new host plant, spiroplasmas and phytoplasmasmust traverse two major physical barriers, namely, the insectintestine and the salivary gland (35, 53). Until now, little wasknown about the molecular and cellular interactions contrib-uting to the crossing of these physical barriers. Several lines ofevidence suggest that host-pathogen interactions could be aprerequisite for invasion and colonization of insect vector or-gans (2, 48, 53). For human and animal pathogenic mollicutes,it is well established that successful colonization of the hostcells requires adhesion as the first step. This event is mediatedby surface proteins, and among these proteins adhesins play animportant role (8, 44). Recently, it was reported that an anti-genic membrane protein (Amp) of onion yellow phytoplasma

interacts with the insect microfilament complex and that inter-action plays an important role in determining the insect vectorspecificity (48). Several other immunodominant membraneproteins from various phytoplasmas have been mentioned inthe literature as candidates for involvement in host-phyto-plasma interactions (29, 30).

Spiroplasma citri, the first phytopathogenic mollicute avail-able in culture (45), has emerged as an outstanding model forstudying spiroplasma interactions with its two hosts: the peri-winkle plant and the insect vector Circulifer haematoceps. Fol-lowing observations of membrane-bound cytoplasmic vesiclesof midgut epithelium and salivary gland cells, S. citri was hy-pothesized to cross these physical barriers by receptor-medi-ated cell endocytosis (3, 33, 39). Several S. citri protein candi-dates have been identified as involved in transmission and, fora few of them, in an interaction with leafhopper vector pro-teins. Spiralin, the most abundant membrane protein, was sus-pected to be involved in the transmission for two reasons: (i) aS. citri spiralinless mutant was less effective in its transmissi-bility (19); (ii) spiralin acted in vitro as a lectin able to bind toglycoproteins of insect vectors and therefore might function asa ligand able to interact with leafhopper receptors (32). Inaddition, the ability of S. citri to be transmitted by C. haema-toceps is clearly affected by disruption of a gene predicted toencode a lipoprotein with homology to a solute-binding pro-tein of an ABC transporter (14). The proteome of nontrans-missible S. citri strains specifically lacks adhesion-related pro-teins (ScARPs) and the membrane-associated protein P32present in the proteome of transmissible strains (12, 13, 31).

* Corresponding author. Mailing address: UMR 1090 GenomiqueDiversite Pouvoir Pathogene, INRA, Universite Victor Segalen Bor-deaux 2, 71 Avenue Edouard Bourlaux BP 81, F-33883 Villenaved’Ornon, France. Phone: 33 5 57 12 23 62. Fax: 33 5 57 12 23 69.E-mail: [email protected].

Published ahead of print on 29 January 2010.

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These proteins are encoded by plasmids pSci1 to -6 (46), whichare present only in transmissible strains, and ScARPs sharestrong similarities with the adhesion-related protein SARP1 ofS. citri strain BR3, in which the presence has been correlated tothe ability for the spiroplasma to adhere to insect cells in vitro(9, 55). The specific interactions of S. citri with eukaryotic cellsremain to be elucidated, but a combination of the effects ofseveral proteins or a complex would be necessary to explain theinvasion of a variety of host cell types by S. citri (33).

Nevertheless, in the last sequence of events involved in insectvector transmission, the first contact and recognition for the effi-cient penetration of the salivary gland cells represents an essentialstep. In the present study, confocal images of infected salivaryglands show the localization of S. citri cells along the actin fila-ments. We report the results of the first attempt to decipher therole of the spiroplasma’s phosphoglycerate kinase (PGK) in theinternalization of S. citri in its insect vector’s cells.

MATERIALS AND METHODS

Spiroplasma strain, leafhoppers, and cell line culture. S. citri GII3, originallyisolated from its leafhopper vector C. haematoceps captured in Morocco (52),was cultivated in SP4 medium (50) at 32°C.

Healthy C. haematoceps leafhoppers were reared in an insect-proof cage onstock plants (Mattiola incana) at 30°C. Microinjection of S. citri GII3 into C.haematoceps has been described previously (21). Injected leafhoppers weremaintained for 2 weeks on stock plants before salivary glands were removed.

The nonphagocyte cell line Ciha-1 (Circulifer haematoceps 1) (18) was culturedat 32°C in Schneider’s Drosophila medium (Invitrogen) supplemented with 1%histidine buffer (0.057 M histidine monohydrate, pH 6.2), 10% Grace’s insect cellculture medium, 0.5% G-5 supplement, and 10% (vol/vol) heat-inactivated fetalbovine serum.

Far Western blotting experiments. Leafhopper salivary glands were dissectedin phosphate-buffered saline (PBS; 2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 0.14 MNaCl, 2 mM KCl [pH 7.4]) containing 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride(PMSF). Glands were stored frozen in buffer at 20°C until use. Glands weretransferred to a potter Elvehjem grinder containing the same buffer and homog-enized. Then the mixture was centrifuged for 1 min at 10,000 g. The proteinconcentration was determined by the Bradford procedure. Proteins were notfurther purified, to avoid inadvertently removing proteins of interest. Aliquots ofsupernatant (20 g) were fractionated by electrophoresis in a 12.5% SDS-PAGEgel before transfer onto a nitrocellulose membrane according to the methods ofKilliny et al. (32). After transfer, all steps were conducted under low agitation.Membranes were blocked in 10 ml of PBS with 6% nonfat dry milk and incubatedwith 2 ml of S. citri proteins (20 g/ml) in PBS overnight at 4°C. S. citri proteinsused as an overlay were prepared according to the methods described by Killinyet al. (32) with a few modifications. Disruption of the cells was performed bysonication (Vibracell sonicator; Sonics & Materials, Inc., Danbury, CT; rate of40% pulses/s, 50 W, 4°C; 1 min of sonication and 1 min on ice alternatively, threetimes). After incubation, blots were washed with 50 ml of PBS buffer containing0.1% Tween 20 (PBS-Tween) and incubated in 10 ml of PBS containing 1%nonfat dry milk (antibody buffer) with purified polyclonal IgGs against total S.citri proteins at a final concentration of 5 g/ml for 1 h at room temperature(RT). After three washings with PBS-Tween, blots were incubated in 10 ml ofantibody buffer with peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgGs (Sigma Al-drich) at a 1:50,000 dilution at RT for 1 h. Blots were then washed in PBS-Tweenthree times, followed by incubation with the substrate solution (Super SignalWest Pico chemiluminescent substrate) according to the manufacturer’s instruc-tions (Pierce, Rockford, IL). Then blots were exposed on X-ray film.

Two micrograms of S. citri purified recombinant PGK was used in a farWestern assay carried out to confirm interaction with leafhopper actin protein.The blot of His6-tagged PGK was overlaid with 500 g of total insect proteins.The experiment was conducted in a manner similar to that described above forthe S. citri protein overlay assay except that anti-His monoclonal antibodies(MAb; Sigma) instead of S. citri polyclonal antibodies were used.

Immunofluorescence analysis of salivary glands. Salivary glands from infectedor noninfected C. haematoceps leafhoppers were dissected and incubated in 500l of PBS containing 0.2% Triton X-100 at RT. All subsequent steps wereperformed in the same volume. Salivary glands were washed twice in PBS and

immersed in fixative (4% paraformaldehyde in PBS plus 0.2% Triton X-100)overnight at 4°C. Then, fixed salivary glands were rinsed three times with PBSwith 0.2% Triton X-100 and permeabilized with PBS containing 1% TritonX-100 (PBS-T) overnight at 4°C followed by an incubation in blocking buffer(PBS-T plus 1% bovine serum albumin [BSA]) for 1 h at RT. S. citri polyclonalantibodies diluted 1:500 in PBS containing 1% BSA were added for 2 h. Theywere washed in PBS and treated with Alexa 488-conjugated goat anti-rabbit IgG(Invitrogen) at a 1:200 dilution, and simultaneously F-actin was stained by Alexa568-phalloidin (Invitrogen) at a 1:40 dilution in PBS containing 1% BSA for 1 hat RT. After three washings in PBS, they were then mounted with ProLong Goldantifade reagent (Invitrogen). The specificity of immunostaining was evaluatedby omitting the antibodies against S. citri proteins. Immunofluorescence sampleswere imaged using a TCS SP2 upright Leica confocal laser scanning micro-scope, with a 40 water immersion or 63 oil immersion objective lens at1,024 by 1,024 pixel resolution. The images were coded green (Alexa 488) andred (Alexa 568).

Partial purification of S. citri proteins involved in an interaction with actin.Polyclonal antibodies against chicken actin (Sigma) were linked to proteinA–Sepharose CL-4B according to the manufacturer’s manual (GE Healthcare).All steps were conducted on an AKTA purifier liquid chromatography system(GE Healthcare). Noninfected leafhopper proteins were prepared as describedabove for salivary gland proteins. To trap leafhopper actin with antiactin anti-bodies, 1 mg of leafhopper proteins was loaded on the column and proteinsbound nonspecifically to the actin column were eliminated with a 10-ml stepusing 2 M NaCl. Then, 500 g of S. citri proteins, prepared as described in theprevious section for far Western experiments, was loaded on the actin column. S.citri proteins bound to actin were eluted with a 0 to 2 M NaCl gradient (totalvolume, 20 ml). All the eluted proteins were subjected to SDS-PAGE, followedby gel staining or far Western analysis. Nonspecific binding of S. citri proteins onprotein A-Sepharose and/or on antiactin antibodies was highlighted by a controlexperiment carried out without C. haematoceps proteins loaded on the column.S. citri proteins eluted from such columns were also subjected to SDS-PAGE andfar Western blotting. Far Western experiments were carried out according to theconditions described above. Blots of eluted proteins were incubated with amixture of C. haematoceps proteins, and the binding activities were revealed withpolyclonal antibodies against actin. Gels intended for mass spectrometry analysiswere stained with colloidal blue (38).

Protein identification by LC-MS/MS. Proteins of interest were excised fromstained gel and digested with trypsin as previously described (31). The resultingdigestion was used for peptide mass fingerprinting by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) as routinely performed on the proteo-mics platform of the University of Bordeaux 2, France (22).

Expression and purification of S. citri phosphoglycerate kinase recombinantprotein. S. citri uses the UGA opal codon to incorporate tryptophan rather thana stop codon as in the universal genetic code (16). For PGK expression inEscherichia coli, the two opal codons contained in the gene were changed bysite-directed mutagenesis by using overlap extension PCR (23). Primers used inthe PCR are presented Table 1. The amplified product of 1,239 bp correspondingto the pgk gene, in which the two opal codons were replaced by TGG codons, wasinserted in a plasmid (pBS) and the construct was used to transform E. coli

TABLE 1. Primers used for site-directed mutagenesisof S. citri PGKa

Primer Sequence (533)b Positionc

PGK-F GTGAGAATTCGGATTTCATATGACAAAC

19 to 9

PGK-W1F CTTTAGGGAAATATTGGGCAAG 449–471PGK-W1R CTTGCCCAATATTTCCCTAAAG 449–471PGK-W2F GTTACTTGGAATGGGCCAATG 991–1011PGK-W2R CATTGGCCCATTCCAAGTAAC 991–1011PGK-R TTATGAAGCTTTTATTTACTTTG

AACAGC1222–1250*

a All regions were amplified using the respective mutagenic forward and re-verse primers, as required. Overlapping fragments with changes were then an-nealed and amplified using PGK-F and PGK-R to generate full-length products.

b Introduced EcoRI, HindIII, and NdeI sites are underlined, and changednucleotides are shown in bold.

c A negative value indicates an position upstream from the adenine nucleotideof the starting ATG codon. *, 11 nucleotides are downstream of the stop codonlocated at position 1239.

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DH10B. The gene of interest was then transferred into a plasmid pET28a()vector (Novagen), and 1 g of the recombinant plasmid (pET28 FL) was used totransform E. coli DH10B. The desired sequence of the resulting plasmid (pET28FL) was verified by sequencing the insert. Two micrograms of the pET28 FLplasmid bearing the two desired mutations was used to transform E. coliBL21(DE3). Transformants were selected on Luria-Bertani (LB) solid mediumcontaining kanamycin (50 g/ml) at 37°C.

To check the expression of the PGK fused to the N-terminal hexahistidinesequence under the control of an isopropyl--D-thiogalactopyranoside (IPTG)-inducible promoter, one transformant was cultivated in 500 ml of LB mediumwith kanamycin (30 g/ml) until late log phase (optical density at 600 nm, 0.6).The recombinant His6-tagged PGK protein was produced at 28°C in culture byadding 0.1 mM IPTG for 3 h. Bacterial cells were centrifuged at 7,000 g for 10min at 4°C, and then the pellet was resuspended in 10 ml of lysis buffer (50 mMTris-HCl [pH 8.0], 0.3 M NaCl, 25 mM MgSO4, 2.5 mM MnCl2, 1 mM PMSF,and 100 unit/ml of DNase I). After 10 min of incubation at RT, lysozyme wasadded at 0.2 mg/ml for 10 min. The mixture was lysed by sonication (rate, 50%pulses/s; 50 W; 4°C; 1 min of sonication and 1 min on ice alternatively) until aclear lysate was obtained. The insoluble proteins were removed by subsequentcentrifugation at 13,000 g at 4°C for 10 min. The recombinant protein waspurified by affinity chromatography using Ni2-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA)prepacked columns (Qiagen) followed by cation exchange chromatography(Mono Q columns; GE Healthcare) on the AKTA purifier liquid chromatogra-phy system (GE Healthcare) according to the manufacturer’s instructions.

The purified recombinant His6-tagged PGK protein was tested with anti-HisMAb and antiactin polyclonal antibodies in a Western blot experiment con-ducted as described previously (19).

Effect of PGK on S. citri attachment and invasion. (i) Attachment of S. citri toCiha-1 cells. Monolayers of Ciha-1 cells grown in 24-well plates (approximately2 105 cells per well) were incubated with 900 l of various concentrations ofPGK from Saccharomyces cerevisiae (Sigma) or tagged PGK from S. citri inculture medium. Cells without PGK treatment were the positive controls, anduninfected cells served as negative controls. As additional controls, the effects ofBSA (Sigma) and those of His6-tagged eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E)protein on S. citri adhesion were also assayed. Each assay condition was evalu-ated in triplicate. After incubation with proteins for 2 h at 32°C, the cells wereinfected with a 100-l S. citri culture at a multiplicity of infection (MOI) of 15 to30 for 4 h at 4°C. Normally, this temperature allows spiroplasma attachment tothe cell surface but inhibits eukaryotic cell processes required for internalization.Following the incubation, the cells were then washed three times with 500 l ofSchneider’s Drosophila medium to remove any spiroplasmas that had not at-tached to the monolayer. After trypsinization for 10 min at 32°C with TrypLE(Invitrogen), dilutions of the cells associated with adherent spiroplasmas weredirectly plated on solid SP4 medium. After incubation at 32°C for 1 week, thenumber of spiroplasma colonies on each plate was counted to estimate thenumber of Ciha-1 cells that had adherent spiroplasmas (4). In addition, treat-ment of spiroplasmas with trypsin alone in the absence of Ciha-1 cells had noeffect on spiroplasma growth (18). The relative percentage of adhesion wascalculated as follows: [(number of CFU for cells with protein treatment)/(num-ber of CFU for untreated control cells)] 100%. For statistical analysis, Stu-dent’s t test was used when appropriate.

(ii) Spiroplasmal entry analysis. The effect of PGK treatment on the inter-nalization of S. citri into Ciha-1 cells was determined as previously describedusing the gentamicin protection assay (4, 28). Until S. citri infection, all the stepswere the same as those described above for attachment. Infection by 100 l of S.citri culture at an MOI of 15 to 30 was carried out at 32°C for 18 h. The cells werethereafter washed three times with 500 l of Schneider’s Drosophila mediumunder low agitation to remove unbound bacteria. In order to eliminate bacteriathat had attached but not internalized, cells were incubated with 1 ml of freshculture medium containing 400 g/ml of gentamicin (10 times the MIC) for 3 hat 32°C. Gentamicin was eliminated by three washes with 500 l of Schneider’sDrosophila medium followed by three additional washes with the same volumeof PBS (1.54 mM KH2PO4, 155.17 mM NaCl, 2.71 mM Na2HPO4 7H2O; pH7.2). After washes, a 100-l aliquot of the last wash was plated on SP4 mediumto ensure that all extracellular bacteria had been killed (data not shown). Ciha-1cells were trypsinized, plated on SP4 medium, and incubated at 32°C for 1 week.The number of colonies on each plate was counted to determine the number ofcells in which S. citri was internalized.

Binding of His6-tagged PGK to Ciha-1 cells. To determine whether the contactwith Ciha-1 cells of His6-tagged PGK, BSA, and His6-tagged eiF4E has an effecton actin cytoskeleton, cells were grown on coverslips in 24-well plates andprepared by the same process described above until infection with S. citri. Afterthe three washes in 500 l of Schneider’s Drosophila medium, cells on coverslips

were fixed for 15 min in 500 l of 4% formaldehyde at room temperature,washed three times with 500 l of PBS, and permeabilized by incubation for 15min with 500 l of 0.1% Triton X-100 in PBS–1% BSA followed by another threetimes wash with 500 l of PBS. Anti-His MAb at a 1:1,000 dilution was thenadded, followed by a secondary Alexa 514-conjugated rabbit anti-mouse antibody(1:200). Actin was stained with Alexa 568-phalloidin (1:40) and nuclei with 0.2g/ml of DAPI. The coverslips were rinsed once in water and were mounted ontoslides as described above for salivary gland observations.

The images were coded with blue (DAPI), green (Alexa 488), and red(Alexa 568).

RESULTS

In vitro protein interaction and in vivo colocalization of S.citri with host cytoskeleton. Salivary gland proteins fromhealthy leafhoppers separated by SDS-PAGE in one dimen-sion were stained with colloidal blue (Fig. 1A, lane 1) or blot-ted onto nitrocellulose and probed with S. citri proteins. Bind-ing levels were detected with polyclonal IgGs against total S.citri proteins. Spiroplasma proteins were found to bind to a setof insect salivary gland proteins having apparent molecularmasses of 42, 35, 30, 27, and 25 kDa (Fig. 1A, lane 2). In thecontrol experiment, in which S. citri proteins were omittedfrom the overlay assay, no leafhopper protein was recognizedby polyclonal IgGs (Fig. 1A, lane 3). The protein band with amobility of 42 kDa was excised from the stained gel, washed,and digested with trypsin prior to LC-MS/MS analysis. The MSspectra matched, in the NCBI nonredundant protein database,those of actin from the fruit fly (Drosophila melanogaster),brine shrimp (Artemia sp.), tapeworm (Diphyllobothrium den-driticum), and silk moth (Bombyx mori). The finding that actinwas involved in an in vitro interaction with S. citri proteinssuggested that in vivo an interaction between S. citri and theinsect actin cytoskeleton may be involved in spiroplasma inva-sion of cells.

Thus, the far Western results prompted us to explore byconfocal laser scanning microscopy the location of S. citri insalivary glands. In those infected with S. citri (Fig. 1B), spiro-plasmas (green fluorescence) are preferentially present alongthe actin filaments (red color). Salivary glands from nonin-fected leafhoppers did not show spots of green fluorescencespecific to spiroplasmas (Fig. 1B).

Identification of one S. citri protein interacting in vitro withactin. To determine the S. citri proteins interacting with actin,spiroplasma proteins were loaded on a column of leafhopperactin that was trapped by antiactin antibodies linked to proteinA-Sepharose. The presence of actin in the mixture of leafhopperproteins used to prepare the column (Fig. 2A, lane 1) was con-firmed by Western blotting using antiactin antibodies (Fig. 2A,lane 2).

As shown in Fig. 2A, lane 3, S. citri proteins eluted from theantiactin–protein A-Sepharose column were those captured onSepharose and/or on actin antibodies (control experiment).Figure 2A, lane 4, shows the profile of S. citri proteins elutedfrom the actin column. Comparison of the two protein patternsrevealed one protein at 44 kDa present among the proteinsbound to actin but absent in the control profile. To determinewhether this protein displayed an affinity for actin, a far West-ern assay was performed using as overlay a mixture of wholeleafhopper C. haematoceps proteins containing actin. A signif-icant binding activity located at approximately 44 kDa wasrevealed by rabbit antiactin IgGs followed by goat anti-rabbit

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antibodies labeled with peroxidase (Fig. 2A, lane 5). The cor-responding protein band was excised from the colloidal blue-stained gel (Fig. 2A, lane 4) and used for MS analysis. Twoproteins of S. citri were identified, one with a molecular massof 44.5 kDa and a second with a mass of 46 kDa. Sevenidentified peptides matched those of the PGK protein (44.5kDa) annotated as SPICI 03-024 in the sequence of S. citristrain GII3 and covered 23.79% of the whole theoretical pro-tein sequence (Fig. 2B). For the 46-kDa protein, nine peptideswere identified as being a part of a lipoprotein (24%) anno-tated as SPICI 03-098 in the S. citri genome. Due to previous

reports indicating that PGK has actin-binding properties, wedecided to focus our attention on it.

In vitro and ex vivo interaction of S. citri tagged-PGK withleafhopper actin. (i) Purified tagged PGK binds leafhopperactin in a gel overlay assay. His6-tagged PGK purified byNi2-NTA chromatography followed by cation exchange chro-matography was analyzed by SDS-PAGE (Fig. 3, lane 1). Asexpected, only one protein band was observed at 44 kDa, andthe presence of the tag was confirmed in a Western blot assayperformed with anti-His MAb (Fig. 3B). To determinewhether His6-tagged PGK displays an affinity for actin, far

FIG. 1. In vitro protein interactions and in vivo colocalization of S. citri with the actin filaments in leafhopper salivary glands. (A) Far Westernexperiments: binding of S. citri proteins to C. haematoceps salivary gland proteins separated by SDS-PAGE. Lane 1, gel electrophoresis patternof salivary gland proteins (20 g) stained with colloidal blue. Lane 2, blot from salivary gland proteins probed with S. citri proteins (20 g). Anti-S.citri polyclonal IgGs were used to detect bound spiroplasma proteins. Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgGs were used as secondaryantibodies, and detection was performed with chemiluminescent substrate. Arrows on the right indicate the five significant binding activitiesbetween S. citri proteins and insect salivary glands proteins with apparent molecular masses of 42, 35, 30, 27, and 25 kDa. Lane 3, control blot notprobed with S. citri proteins but subjected to the same treatment as mentioned for lane 2. The relative molecular masses are indicated on the left.(B) Confocal images of noninfected and S. citri-infected C. haematoceps salivary glands. Fixed salivary glands were incubated with S. citriantibodies. Detection was carried out with Alexa 488-conjugated anti-rabbit IgG (green fluorescence). Actin filaments were stained with Alexa568-phalloidin (red). Photos to the right are higher magnifications of the areas outlined in white boxes. Bars, 20 m.

FIG. 2. Partial purification and identification of the S. citri 44-kDa protein. (A) For purification of the actin-binding protein, a mixture of S.citri proteins was loaded on an actin column composed of leafhopper actin trapped by antiactin antibodies linked to protein A-Sepharose. A controlexperiment was carried out by omitting the leafhopper actin protein. Lane 1, the mixture of leafhopper proteins used to prepare the column wasanalyzed by SDS-PAGE and stained with colloidal blue. Lane 2, proteins extracted from whole insects were transferred onto nitrocellulosemembranes. Saturated blots were probed with rabbit polyclonal antibodies against chicken actin, followed by immunological detection as previouslydescribed (19). The band at 42 kDa reflects the presence of actin in the protein mixture and the specificity of the antiactin antibody. Lane 3, S.citri proteins eluted from the antiactin protein A-Sepharose column were analyzed by SDS-PAGE. These proteins are linked to proteinA-Sepharose or/and to actin antibodies (control experiment). Lane 4, S. citri proteins eluted from the actin column were analyzed by SDS-PAGE.Lane 5, binding of leafhopper proteins to S. citri proteins eluted from the actin column. The blot of S. citri proteins was probed with the mixtureof leafhopper proteins containing actin. Binding was detected with rabbit antiactin antibodies followed by goat anti-rabbit antibodies labeled withperoxidase. Detection was performed with chemiluminescent substrate. Only one protein at 44 kDa was found to interact with leafhopper actin,corresponding with the apparent molecular mass of the additional band present in lane 4. (B) LC-MS/MS analysis of the 44-kDa protein identifiedphosphoglycerate kinase. Three distinct peptides matching the protein sequence are marked in bold. The underlined sequence in bold of 63 aminoacids consists of four separate peptides overlap by several amino acids: KIGNSLLEVDKVEIAKT, KTFLAKGQGKIILPIDALEAPEFADVPAKV, KIILPIDALEAPEFADVPAKV, and KVTTGFDIDDGYMGLDIGPKT. Sequence coverage was 23.79%.


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Western assays were performed using a leafhopper proteinmixture. One significant binding activity was revealed withrabbit antibodies against chicken actin (Fig. 3, lane 2), whichsuggested an interaction between the His6-tagged PGK and

actin protein present in the insect protein mixture (Fig. 3B).One additional control, to confirm that the binding signal inlane 2 was only due to the presence of actin in the insectpreparation, revealed no reaction between the His6-taggedPGK preparation and antiactin antibodies (Fig. 3B).

(ii) Purified His6-tagged PGK colocates with actin of leaf-hopper Ciha-1 cells. To see the potential effect of PGK proteinon the host cell actin cytoskeleton, about 2 105 Ciha-1 cellsin insect culture medium were incubated with various quanti-ties of tagged PGK for 2 h at 32°C. As a control, Ciha-1 cellswere treated with BSA, at concentration equal to that of PGK.As an additional control, the effect of an unrelated His6-taggedprotein (eIF4E) on Ciha-1 cells was also assayed. Compared tountreated control cells (Fig. 4A), Ciha-1 cells treated for 2 h at32°C with 400 g/ml of BSA (Fig. 4B) or tagged eIF4E (Fig.4C) showed no alteration in the cell cytoskeleton. In the threecases, the cells were of similar size, showed no obvious mor-phological differences, and the actin filaments stained withphalloidin were clearly visible. These observations suggestedthat exogenous proteins and in particular the polyhistidine taghave no effect on the Ciha-1 cells. When the cells were treatedwith His6-tagged PGK (400 g for 2 105 cells), faint cellularchanges were observed and the major alterations were on theactin filaments (Fig. 4D). The immunofluorescent staining al-lows the detection of distinct spots of aggregated tagged PGK(Fig. 4E) colocated with actin filaments (Fig. 4F). These ob-servations confirm the interaction observed in vitro betweenPGK and actin.

Treatment of Ciha-1 cells with tagged PGK has no effect onspiroplasma attachment. If spiroplasmal PGK is involved inadhesion to host cell surfaces, adding exogenous PGK toCiha-1 cells should competitively inhibit the attachment of S.

FIG. 3. In vitro interaction between S. citri His6-tagged PGK andleafhopper actin. (A) Lane 1, His6-tagged PGK purified by Ni2-NTAchromatography followed by cation exchange chromatography was an-alyzed by SDS-PAGE and stained with colloidal blue. Lane 2, a farWestern assay was performed using a leafhopper protein mixture withactin as the overlay. Polyclonal antiactin antibodies were used to detectan interaction. Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgGs were usedas secondary antibodies, and detection was performed with chemilu-minescent substrate. (B) Purified S. citri His6-tagged PGK and insectproteins used in the far Western assays were tested with anti-His MAband antiactin antiserum. M, molecular mass marker; relative molecularmasses are indicated on the left.

FIG. 4. Colocalization of purified S. citri His6-tagged PGK with actin filaments in leafhoppercells (Ciha-1). Confocal images show Ciha-1 cells untreated (A) or treated for 2 h with variousproteins at 400 g/ml, BSA (B), His6-tagged eIF4E protein (C), and S. citri His6-tagged PGK(D). The three images in panels D, E, and F represent the same area. Cells were stained fornuclei with 4,6-diamidino-2-phenylindole (blue). Cellular actin was stained with Alexa 568-phalloidin (red; A, B, C, and D). (E) Detection of His6-tagged PGK was performed withanti-His MAb serum followed by a secondary Alexa 514-conjugated rabbit anti-mouse antibody(green). (F) Merged immunofluorescent images from those in panels D and E. The coincidenceof PGK and F-actin staining appears in yellow. Bars, 8 m.


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citri to this cell line. We took advantage of the PGK sequenceconservation among species to include in our experiment thecommercially prepared PGK from S. cerevisiae (hereafter re-ferred to as ScPGK). Cells without PGK treatment were thepositive controls, and cells treated prior to infection with S. citriwith BSA and His6-tagged eIF4E were also included as acontrol. As seen in Fig. 5, no difference was observed betweenthe number of CFU obtained with untreated cells and thoseobtained with cells preincubated with 50 or 400 g/ml of BSAor with 400 g/ml of His6-tagged eIF4E. Preincubation ofCiha-1 cells with either ScPGK (10, 25, 40, or 50 g/ml) orrecombinant His6-tagged PGK from S. citri (10, 25, 40, 50, 100,200, or 400 g/ml) prior to incubation with spiroplasmas hadno effect on the attachment of S. citri to Ciha-1 cells. Thepercentage of cells with attaching spiroplasmas varied between80 and 100%, whatever the concentration and origin of PGK.These results suggest that the interaction between PGK andactin is not involved in the attachment of S. citri to insect cells.

Treatment with PGK from S. citri or S. cerevisiae inhibits S.citri internalization. Ciha-1 cells were infected with S. citri, andthe percentage of internalized bacteria was determined in agentamicin protection assay. This assay involves the use ofgentamicin to kill any noninternalized spiroplasma after aninfection period of 18 h. As shown in Fig. 6, the entry levels ofS. citri in the untreated Ciha-1 cells and in cells incubated withBSA (50 or 400 g/ml) appeared to be comparable even at thehighest concentration. Treatment with tagged eIF4E at a con-centration of 400 g/ml did not affect the number of spiroplasmasable to invade the cells; invasion was not reduced by any morethan 10%. This result supports the conclusion that the polyhisti-dine tag does not inhibit the entrance of S. citri in the cells.

S. citri showed an 20-fold decrease in its ability to invade

Ciha-1 cells treated with ScPGK at a concentration of 50 g/mlcompared to untreated cells (P 0.001) (Fig. 6). With the sameconcentration of S. citri His6-tagged PGK, the entry of spiroplas-mas in Ciha-1 cells was not noticeably affected. Higher concen-trations significantly diminished invasion by S. citri but less thanwith ScPGK. An S. citri His6-tagged PGK concentration of 50g/ml reduced entry of spiroplasmas into Ciha-1 cells by 10%, at100 g/ml by 30% (P 0.001), at 200 g/ml by 50% (P 0.001),and at 400 g/ml by 70% (P 0.001).

DISCUSSION

Salivary gland invasion is an essential step of the phyto-pathogenic mollicutes life cycle in their leafhopper vectors.Fluorescence microscopy of S. citri-infected salivary glandsshowed localization of the spiroplasmas along the actin fila-ment. These results are in good agreement with those obtainedwith “Candidatus Phytoplasma asteris” (OY strain) (48) inwhich the surface immunodominant membrane protein (Amp)forms a complex with three leafhopper proteins involved in amicrofilament complex. According to the authors, these inter-actions determined the insect-vector specificity of the phyto-plasmas and played a role in the transmission.

The preferential location of spiroplasmas along actin fila-ments suggested that invasion in the host cells could involveinteractions between S. citri proteins and the cytoskeletal actin.These occurrences were not completely unexpected, as in-volvement of host cell actin in bacterial invasion has beendemonstrated in a number of bacterial pathogens, such asspecies of Shigella (24), Salmonella (56), and Streptococcus (40,51). It has been often reported that surface proteins are im-

FIG. 5. Effect of PGK treatment on S. citri attachment to Ciha-1cells. Monolayers of Ciha-1 cells were incubated for 2 h at 32°C withvarious amounts of PGK from S. cerevisiae, and His6-tagged PGK fromS. citri, BSA, or His6-tagged eIF4E. After incubation, the cells wereinfected with S. citri at a MOI of 15 to 30 for 4 h at 4°C. Untreated cellsinfected under the same conditions were the positive controls. Then,the cells were washed and plated on SP4 solid medium. After spiro-plasma growth at 32°C, the number of colonies was counted to evaluatethe number of cells associated with adherent spiroplasmas. Each valuerepresents the mean of two independent triplicate assays. Vertical linesrepresent standard error of the mean. Student’s t test was used, and nostatistical differences were found. Black bars, untreated cells; bars withdiagonal hatching, S. cerevisiae PGK; brick-filled bars, S. citri His6-tagged PGK; white bars, controls.

FIG. 6. Inhibition of S. citri invasion into Ciha-1 cells by PGKtreatment. Monolayers of Ciha-1 cells were incubated for 2 h at 32°Cwith various amounts of PGK from S. cerevisiae, His6-tagged PGKfrom S. citri, BSA, or His6-tagged eIF4E prior to infection with S. citri.Following infection with S. citri at a MOI of 15 to 30 for 18 h at 32°C,the cells were treated with gentamicin (400 g/ml) for 3 h at 32°C tokill attached spiroplasmas. Then, the cells were trypsinized and platedon SP4 medium for counting the infected cells. Cells without proteintreatment before infection were the positive controls. Each value rep-resents the mean of two independent triplicate assays. Vertical linesrepresent standard errors of the means. *, significant differences (P 0.001; Student’s t test) between S. citri internalization with PGK, BSA,and eIF4E treatment and S. citri internalization without any proteintreatment. Black bars, untreated cells; bars with diagonal hatching, S.cerevisiae PGK; brick-filled bars, S. citri His6-tagged PGK; white bars,controls.


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plicated in the interaction between bacteria and host micro-filaments (17, 25). Our microscopic analysis highlighted thepresence of actin-binding protein(s) on the membrane proteinsof S. citri.

One candidate protein identified was PGK. PGK is a trans-ferase enzyme used in the seventh step of glycolysis. It transfersa phosphate group from 1,3-biphosphoglycerate to ADP, form-ing ATP and 3-phosphoglycerate. It was at first somewhatsurprising to find an interaction between host cell actin andPGK, a glycolytic enzyme classically described as a cytoplasmicprotein. Only one copy of the gene is present in the S. citrigenome sequence, and the deduced amino acid sequence ofthe protein has no N-terminal signal peptide and does notpossess a C-terminal anchor sequence or typical transmem-brane domain required for protein insertion and folding inmembranes. Yet, proteomic analysis of membrane proteinfractions has identified PGK, in a two-dimensional SDS-PAGE, as an integral or peripheral membrane protein (M. P.Dubrana, personal communication). Nevertheless, there isprecedent for microbial surface proteins without transmem-brane domains, such as enolase (10, 54), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (11), and 6-phosphogluconate-dehy-drogenase (49). Moreover, it is not the first time that PGK wasfound associated with a membrane. A proteomic analysis ofStreptococcus agalactiae identified PGK as a major outer sur-face protein (27), and in the opportunistic pathogen Candidaalbicans several lines of evidence support the conclusion thatPGK is present at the outer surface of the cell membrane andcell wall as well as in the cytoplasm as expected (1). Despite theassigned function of PGK, it may well have some other roles toplay in bacteria. The finding that the glycolytic enzyme PGK ofS. citri interacts with eukaryotic actin is supported by earlierstudies that provided evidence that several glycolytic enzymesfrom rabbit muscle can be bound in vitro to actin while retain-ing the enzymatic activity (5). Studies of actin recruitment tothe site of streptococcal attachment to cells suggest that strep-tococcus PGK acts as an actin-binding protein (15, 51).

When the S. citri His6-tagged PGK was in contact withCiha-1 cells, it was found to be colocated with actin filaments.Although actin is mainly an intracellular constituent, this pro-tein has also been reported to be present on the cell surface ofvarious cells (37). Fluorescent spots of tagged PGK are prob-ably located at the surface of cells, and so this protein is not inthe Ciha-1 cells. To determine if the PGK-actin interactioncontributes to adhesion and/or internalization during S. citriinfection, the ability of PGK to inhibit spiroplasma adhesionor/and internalization was tested in a competitive binding andinvasion assay. Our results suggested that PGKs from spiro-plasmas and from S. cerevisiae do not interfere with adhesionof S. citri to Ciha-1 cells, although actin has been reported tobe present on the cell surface of various cells (37). However,both PGKs inhibited internalization into Ciha-1 cells in a dose-dependent manner. The difference observed between the twoPGK proteins could be due to a difference in the proteinconformations. PGK from S. cerevisiae is a nonrecombinantcommercial protein, whereas spiroplasmal PGK is a taggedprotein, and the polyhistidine tag could slightly modify theconformation of the protein interaction with the actin. More-over, during expression in E. coli, posttransductional modifi-cations may also disturb the conformation of the protein and

modify the enzymatic activity. As in group B streptococci, theseresults suggest that the PGK-actin interaction plays a role inthe internalization but not in the attachment to the cells (15).Interestingly, streptococcal internalization into eukaryotic cellsis completely abolished by PGK from S. cerevisiae, but theexperiment was not conducted with the streptococci PGK.Others have reported that several bacterial glycolytic enzymes,including glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (42, 47),enolase (41), and PGK (15), bind to host cell cytoskeletalproteins like fibronectin, myosin, and actin. In Mycoplasmafermentans, the glycolytic enzyme -enolase is a membrane-associated protein located on the cell surface that binds toplasminogen (54), as in Streptococcus pneumoniae (10). Oneother human mycoplasma, Mycoplasma pneumoniae, has beenreported to bind fibronectin through cytoplasmic proteins withwell-known biological functions, elongation factor Tu andpyruvate dehydrogenase E1 -subunit (6, 7).

The identification in this work of PGK, well known to be aglycolytic enzyme present in the cytosol, as an actin-bindingprotein associated with the membrane was unexpected andindicates secondary functions for PGK. In the invasion process,the early steps in adhesion could involve interactions betweenspecific proteins exposed at the spiroplasma surface, such asspiralin, Sc76, ScARPs, and receptors on the surface of thehost cells. The lipoprotein annotated SPICI 03-098, detectedas a candidate for interaction with actin protein, could belongto this group of S. citri proteins putatively involved in thetransmission. These early steps would be important in deter-mining the insect-vector specificity. Once the specificity is es-tablished, late steps in the invasion process would not neces-sarily be specific. Taken together, our results show that theinteraction between the two highly conserved proteins, PGKand actin, might constitute one of these late steps involved ininternalization of S. citri into cells. In this respect, it was hy-pothesized that PGK might play a role in the transmission. Totest this hypothesis, the experimental transmission of mutantsgenerated by inactivation of the S. citri pgk gene through ho-mologous recombination is currently under investigation.

ACKNOWLEDGMENTS

We give special thanks to Michel Castroviejo and Laure Beven forthoughtful advice and technical suggestions for protein purification.Benedicte Doublet kindly provided the His6-tagged eIF4E.

This work was supported with funding from INRA and UniversiteVictor Segalen Bordeaux 2. F.L. was supported by a Ph.D. fellowshipfrom the Ministere de l’Enseignement Superieur et de la Recherche.

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Anticorps polyclonal de lapin

anti S. citri

Protéines totales ou de glandes salivaires

de C. haematoceps

ProtéinesS. citri

Membrane nitrocellulose

Anticorps secondaires couplés à la peroxydase

A

Figure 1.3: Far Western 1-D réalisé entre les protéines totales ou des glandes salivaires de C.haematoceps et les protéines totales de S.citri comme sonde.

A: Principe schématisé du far Western. B: Electrophorèses réalisées avec les protéines totales (piste 1) ou des protéines des glandes salivaires (piste 2) d’insectes. Piste 3: Contrôle négatif où les protéines de S. citri ont été omises. Piste 4: Far Western réalisé avec les protéines totales

d’insectes. Piste 5: Far Western réalisé avec les protéines des glandes salivaires d’insectes.

15

20

25

37

50

75

100

150

250

SDS-PAGEkDa

1 2

15

20

25

37

50

75

100

150

250

SDS-PAGEkDa

1 2

27 kDa

kDa

60 kDa

50 kDa

35 kDa

30 kDa

25 kDa

42 kDa

Far-western

3 54

27 kDa

kDa

60 kDa

50 kDa

35 kDa

30 kDa

25 kDa

42 kDa

Far-western

3 54

25

37

50

25

37

50

B

Chapitre 1

52

2. Résultats supplémentaires

2.1. Identification de protéines d’insectes impliquées dans une interaction avec S. citri

Le but principal de cette thèse était l’identification de protéines d’insecte et de

spiroplasme impliquées dans des interactions nécessaires à la transmission. La comparaison

entre les profils d’interaction, obtenus en far Western, avec les protéines totales d’insectes et

ceux obtenus avec les protéines des glandes salivaires permettrait de mettre en évidence des

protéines d’insectes impliquées uniquement dans le passage de l’une ou l’autre des deux

barrières (intestinale ou des glandes salivaires) que le spiroplasme franchit au cours de son

cuicuit.

Ce travail a donc nécessité la mise au point de cette technique de far Western, de

manière identique pour les expériences utilisant les protéines totales d’insectes et celles

utilisant les protéines des glandes salivaires. De légères mises au point ont été nécessaires par

rapport à la technique développée par Killiny et collaborateurs (Killiny et al., 2005) et sont

mentionnées au chapitre Matériels et Méthodes.

2.1.1. Comparaison des far Western monodimensionnels (1-D) réalisés avec les protéines totales et de glandes salivaires d’insectes.

Un schéma simplifié de ce far Western réalisé avec les protéines totales d’insectes et

de glandes salivaires d’insectes, est représenté sur la figure 1.3A.

En bref, les protéines du premier partenaire, dans notre cas les protéines totales

d’insectes ou celles des glandes salivaires, sont tout d’abord séparées par électrophorèse en

gel d’acrylamide, transférées sur membrane puis mises en contact avec les protéines du

second partenaire, S. citri. Les protéines du spiroplasme interagissant avec les protéines

d’insectes fixées sur la membrane sont détectées par des anticorps anti-S. citri et des anticorps

secondaires marqués à la peroxydase. La présence de peroxydase est détectée par son substrat

chemiluminescent révélant ainsi les signaux d’interaction.

La Figure 1.3B montre les résultats de ce far Western. Les pistes 1 et 2 montrent les

électrophorèses en gel SDS-PAGE réalisées avec les protéines totales d’insectes (piste 1) et

les protéines des glandes salivaires (piste2). Les pistes 3, 4 et 5 montrent les résultats obtenus

au cours de ces différents far Western.

Protéines totales

1

Protéines des glandes salivaires

2

kDa

60

50

35

30

27

25

42

Signaux spécifiques des far Western « protéines totales »

Signal spécifique du far Western « GS »

Signaux communs aux deux far Western

Signal commun aux deux far Western

Figure 1.4: Schéma des signaux d’interaction obtenus en far Western avec les protéines totales et les protéines des glandes salivaires de C.haematoceps.

Piste 1: Profil obtenu avec les protéines totales d’insecte. Piste 2: Profil obtenu avec les protéines des glandes salivaires.

*

*

*

*

Chapitre 1

53

La piste 3 est un contrôle négatif sans protéine de spiroplasme. La piste 4 montre le résultat

du far Western réalisés avec les protéines totales d’insectes tandis que la piste 5 montre le

résultat du far Western réalisé avec les protéines des glandes salivaires uniquement.

La comparaison de ces profils schématisés à la figure 1.4 montre que cinq signaux

localisés au niveau des protéines de masse moléculaire 25, 30, 35, 42 et 50 kDa sont

communs aux deux profils.

En revanche, le signal localisé à 27 kDa semble être spécifique du far Western réalisé avec les

protéines des glandes salivaires. La protéine impliquée dans cette interaction pourrait donc

intervenir de manière spécifique dans le passage de la barrière des glandes salivaires.

D’un autre côté, le signal d’interaction localisé au niveau de 60 kDa, révélé sur le profil far

Western réalisé avec les protéines totales d’insectes, est absent de celui obtenu avec les

protéines des glandes salivaires. Cette observation est corrélée par la comparaison des profils

protéiques des deux préparations de protéines d’insectes. En effet, une protéine de masse

moléculaire évaluée à 60 kDa, présente sur le profil de protéines totales, est absente de celui

des glandes salivaires malgré la quantité équivalente de protéines chargées sur le gel (20 µg)

(figure 1.3, piste 2). Lors de l’étude menée en 2005 au laboratoiresur insecte entier,

l’identification des protéines impliquées dans le signal à 60 kDa a révélé la présence d’une

glycoprotéine d’insecte capable de se lier avec la spiraline de S. citri (Killiny et al., 2005). Il

est possible cette glycoprotéine, absente du profil protéique des glandes salivaires, soit

nécessaire pour accomplir une fonction vis-à-vis du spiroplasme à l’intérieur de son insecte

vecteur ; par exemple, le passage de la barrière intestinale.

2.1.2. Far Western bi-dimensionnel (2-D) avec les protéines

totales et celles des glandes salivaires d’insectes

Pour confirmer les résultats obtenus avec les far Western 1-D, ainsi que pour faciliter

l’identification ultérieure des protéines d’insectes impliquées dans les interactions avec S.

citri , des far Western 2-D ont été réalisés avec les deux préparations protéiques d’insectes.

La figure 1.5 montre les résultats obtenus lors de ces far Western 2-D réalisés avec les

protéines totales d’insectes (A) et les protéines de glandes salivaires (B).

Avec les protéines totales d’insectes, cinq signaux d’intensité très variable sont

visibles. Ces signaux identifient des interactions entre les protéines de S. citri et des protéines

d’insectes dont les masses moléculaires sont voisines de 25, 35, 42, 50 et 60 kDa. Les masses

moléculaires des protéines impliquées dans ces signaux sont similaires à celles identifiées sur

les profils des far Western 1-D correspondants. Les signaux visibles sur ce far Western 2-D

Anticorps polyclonal de

lapin antiS. citri

Protéines totalesC. haematoceps

ProtéinesS. citri


Anticorps secondaires couplés

à la peroxydase

Anticorps polyclonal de

lapin antiS. citri

Protéines glandes salivairesC. haematoceps

ProtéinesS. citri


Anticorps secondaires couplés

à la peroxydase

A B

8IEF5

25

37

50

100

KDa

75

50 kDa

42 kDa

35 kDa

30 kDa?

25 kDa27 kDa?

32 kDa?

22 kDa?

8IEF5

25

37

50

100

KDa

75

50 kDa

42 kDa

35 kDa

30 kDa?

25 kDa27 kDa?

32 kDa?

22 kDa?

30 kDa?

25 kDa27 kDa?

32 kDa?

22 kDa?

8IEF

25

20

37

50

75

KDa

5

50 kDa

42 kDa35 kDa

60 kDa

30 kDa?25 kDa

100

8IEF

25

20

37

50

75

KDa

5

50 kDa

42 kDa35 kDa

60 kDa

30 kDa?25 kDa

100

5 8 5 8

Figure 1.5: Far Western 2-D réalisés avec les protéines totales (A) et les protéines des glandes salivaires (B) de C. haematoceps.

30 kDa?

27 kDa?

25 kDa

Chapitre 1

54

ressemblent plus à des trains de spots que de réels spots individualisés, ceci étant

particulièrement vrai pour la « trainée » visualisée à 25 kDa. Il n’est donc pas impossible que

le signal à 30 kDa, présent lors du far Western 1-D, soit confondu avec celui de 25 kDa.

Dans le cas des protéines des glandes salivaires (figure 1.5B), les résultats des far

Western 2-D sont en accord avec ceux des far Western 1-D. En effet, les signaux à 25, 35, 42

et 50 kDa sont bien retrouvés sur ce far-Western 2-D. Néanmoins, les signaux d’interaction à

27 et 30 kDa, visibles en mono-dimension, sont absents sur ce far Western. Comme

précédemment, ces signaux pourraient être englobés par le train de spots à 25 kDa. De plus, le

signal d’interaction localisé à 60 kDa, visible sur les far Western réalisés avec les protéines

totales d’insectes, est absent de ce profil, confirmant les résultats du far Western 1-D.

2.1.3. Identification des protéines d’insectes impliquées par spectrométrie de masse

L’identification des protéines d’insectes (totales ou des glandes salivaires)

interagissant avec les protéines de S. citri a donc été réalisée par LC-MS/MS (Liquid

Chromatography-tandem Mass Spectrometry) en prélevant les bandes sur gels 1-D, bandes

localisées aux masses moléculaires correspondant aux signaux d’interaction. Les signaux pour

lesquels une bande de gel a été prélevée sont indiqués par un astérisque sur la figure 1.5. Les

résultats obtenus pour les différentes bandes de gels analysées sont présentés sur la figure 1.6.

2.1.3.1. Signaux d’interaction communs aux deux

far Western.

Signal d’interaction à 42 kDa : l’actine. L’actine filamenteuse (F), protéine majoritaire du cytosquelette cellulaire est la seule

protéine révélée dans cette bande de gel localisée à 42 kDa. Sous la forme de microfilaments

(polymères de monomère d’actine globulaire), elle forme un réseau dynamique qui supporte

la structure tridimensionnelle de la cellule eucaryote. Outre la présence de ce réseau qui

« quadrille » le cytoplasme et en préserve l’intégrité, l’actine F est également présente à la

surface des cellules endothéliales et des lymphocytes, dans les fibroblastes et les muscles

lisses (Moroianu et al., 1993). De plus, l’actine est aussi liée à la membrane plasmique sous la

forme d’un complexe cortical d’actine, réseau régulièrement ciblé par de nombreux

pathogènes intracellulaires afin de permettre l’invagination de cette membrane plasmique et

de faciliter leur entrée dans la cellule hôte comme décrit pour de nombreux microorganismes

pathogènes (§ Introduction III.2.2). L’utilisation de drogues déstabilisant les microfilaments

Figure 1.6: Résultats de l’identification des protéines d’insectes impliquées dans une interaction avec les protéines de S. citri.

Bande Identification protéineNombres de scans

Nombre de peptides différents

Masse moléculaire

P10987|ACT1_DROME Actin-5C- Drosophila melanogaster (Fruit fly) 13 5 (=) 41821.6P07837|ACT2_BOMMO Actin, muscle A2- Bombyx mori (Silk moth) 13 5 (=) 41802.6P02572|ACT2_DROME Actin-42A- Drosophila melanogaster (Fruit fly) 13 5 (=) 41823.6P18601|ACT2_ARTSX Actin, clone 211 Artemia spr (Brine shrimp) 13 5 (=) 41783.6P10983|ACT1_CAEEL Actin-1/3- Caenorhabditis elegans 13 5 (=) 41795.5P22131|ACT2_PHYIN Actin-1- Phytophtora infestans(Potato late blight fungus)

11 3 41881.7

O17449|TBB1_MANSE Tubulin beta-1 chain (Beta-1 tubulin)-Manduca sexta (Tobacco hornworm)

19 6 50198.2

Q24560|TBB1_DROME Tubulin beta-1 chain (Beta-1 tubulin)-Drosophila melanogaster (Fruit fly)

15 6 50115.2

QMHM5|TBB2C_BOVIN Tubulin beta-2C chain- Bos taurus (Bovine) 15 6 (=) 49799P68372|TBB2C_MANSE Tubulin beta-2C chain- Mus musculus (Mouse) 15 6 (=) 49799Q6P9T8|TBB2C_RAT Tubulin beta-2C chain- Rattus norvegicus (Rat) 15 6 (=) 49799P06603|TBA1_DROME Tubulin alpha-1 chain-Drosophila melanogaster (Fruit fly)

3 2 49876.5

P02552|TBA1_CHICK Tubulin alpha-1 chain (Fragment)-Gallus gallus (Chicken)

3 2 45871.7

P68369|TBA1_MANSE Tubulin alpha-1 chain (Alpha-1 tubulin)-(Alpha-tubulin isotype M-alpha-1)-Mus musculus (Mouse)

3 2 (=) 50103.7

P68370|TBA1_MANSE Tubulin alpha-1 chain (Alpha-1 tubulin)-Rattus norvegicus (Rat)

3 2 (=) 50103.7

P48153|RS3_MANSE 40S ribosomal protein S3 - Manduca sexta (Tobacco hornworm)

6 3 26730.9

P29310|1433Z_DROME 14-3-3-like protein (Leonardo protein) (14-3-3 protein zeta) - Drosophila melanogaster (Fruit fly)

2 2 28227.4

P41569|RL8_AEDAL 60S ribosomal protein L8 - Aedes albopictus (Forest day mosquito)

2 2 28680.3

Q9V3G1|RL8_DROME 60S ribosomal protein L8 - Drosophila melanogaster (Fruit fly)

2 2 27892.3

Q5ZHW4|RAB5B_CHICK Ras related protein Rab-5B - Gallus gallus (Chicken)

3 3 (=) 23614.5

P61020|RAB5B_CHICK Ras related protein Rab-5B - Homo sapiens (Human) 3 3 (=) 23706.7

P61021|RAB5B_CHICK Ras related protein Rab-5B - Mus musculus (Mouse) 3 3 (=) 23706.7

Q1KME6|RAB6A_CHICK Ras related protein Rab-6A - Gallus gallus (Chicken)

3 3 (=) 23490.5

P20340|RAB6A_CHICK Ras related protein Rab-6A - Homo sapiens (Human) 3 3 (=) 23592.6

P35279|RAB6A_CHICK Ras related protein Rab-6A - Mus musculus (Mouse) 3 3 (=) 23589.6

Q5ZHW4|RAB5B_CHICK Ras related protein Rab-6.2 - Caenorhabitis elegans

3 3 (=) 23364.4

27 kDa

25 kDa

42 kDa

50 kDa

Chapitre 1

55

d’actine, comme la cytochalasine D ou la latrunculine A, a souvent été utilisée pour confirmer

le rôle de l’actine dans l’internalisation de ces derniers. Les microfilaments d’actine peuvent

donc s’avérer nécessaires dans les processus d’internalisation de pathogènes intracellulaires

mais aussi dans le mouvement de ces derniers une fois libres dans le cytoplasme comme cela

est le cas pour les Shigella ou les Listeria. L’actine peut également être impliquée dans des

étapes plus tardives comme le détachement de vésicules d’endocytose (Fujimoto et al., 2000).

Ce n’est pas la première fois que l’actine d’un insecte est impliquée dans une

interaction avec une protéine de mollicute phytopathogène transmis par la cicadelle. Une

étude, réalisée chez les phytoplasmes a montré, in vitro et in vivo en microscopie confocale,

qu’une protéine majoritaire de la membrane de Candidatus phytoplasma asteris souche OY,

Amp, interagit avec les microfilaments d’actine de son insecte vecteur (Suzuki et al., 2006).

Signal d’interaction à 50 kDa : la tubuline

La tubuline β est la seule protéine identifiée dans la bande de gel correspondant au

signal localisé à 50 kDa.

Dans les travaux précédents menés au laboratoire, une protéine d’insecte de 50 kDa

interagissant avec la spiraline a été identifiée comme une glycoprotéine (Killiny et al., 2005).

Il est tout à fait possible que ces deux protéines, à savoir la glycoprotéine et la tubuline, soient

présentes sur le gel mais que la grande proportion de tubuline dans l’insecte, masque cette

glycoprotéine lors de l’analyse en spectrométrie de masse. En effet, l’identification de cette

glycoprotéine avait nécessité l’utilisation de colonnes de Concanavalin A afin de purifier cette

protéine (Killiny et al., 2005).

Les filaments de microtubules, formés de l’association de tubuline α et β,

interviennent, tout comme l’actine, dans la morphologie des cellules eucaryotes. Chez

certaines bactéries comme les Shigella, ces microtubules, outre ce rôle dans le cytosquelette

cellulaire, sont impliqués dans l’entrée des bactéries dans la cellule. La protéine bactérienne

VirA de ces bactéries interagit avec la tubuline pour permettre l’endocytose (Gruenheid &

Finlay, 2003).

L’utilisation de drogues, comme la colchicine et le nocodazole, qui déstabilisent les

microtubules a permis de démontrer l’implication de la tubuline dans l’endocytose de la HRP

(horseradish peroxydase) dans les cellules (Piasek & Thyberg, 1980).

Parallèlement à cela, et non sans rappeler le détournement des microfilaments

d’actine, certains pathogènes utilisent le réseau de microtubules, et les moteurs qui lui sont

associés, pour se déplacer dans la cellule. C’est ainsi que le virus immunodéficient humain

Chapitre 1

56

(VIH) utilise les moteurs dynéines pour rejoindre le centrosome de la cellule et pénétrer dans

le noyau (McDonald et al., 2002). Il en est de même pour la bactérie intracellulaire

obligatoire, Chlamydia trachomatis qui se retrouve constamment à l’intérieur d’une vacuole

lorsqu’elle pénètre et traverse les cellules de son hôte (Clausen et al., 1997).

Bien que les mécanismes mis en jeu soient moins bien décrits, quelques virus

phytopathogènes utilisent également les microtubules pour leur dispersion de cellule à cellule

dans la plante comme, par exemple, le Tobbaco mosaic virus (Mas & Beachy, 2000) ou

encore le Beet yellows virus (Karasev et al., 1992).

Signal d’interaction à 25 kDa : Rab GTPases

Deux protéines sont identifiées dans la bande de gel correspondant au signal

d’interaction localisé au niveau de 25 kDa. Rab5 et Rab6 sont des protéines appartenant à la

famille des protéines Ras qui sont des GTPases. Ce sont des protéines régulatrices ayant une

activité importante dans le transport des vésicules au sein des cellules eucaryotes (Martinez &

Goud, 1998; Armstrong, 2000). La première fonction de ces protéines est le ciblage et la

fusion des vésicules avec leur récepteur membranaire. De manière intéressante, la

glyceraldehyde-3-phosphate deshydrogenase de Listeria monocytogenes interagit avec la

protéine Rab5 humaine l’empêchant ainsi de remplir sa fonction dans la maturation des

phagosomes en vue de l’élimination de la bactérie (Alvarez-Dominguez et al., 2008). Ce rôle

dans la rétention de Rab5, marqueur des endosomes précoses, est utilisé chez de nombreuses

autres bactéries comme Mycobacterium tuberculosis (Via et al., 1997), Salmonella enterica

serovar typhimurium, plusieurs espèces de Chlamydia ainsi que Legionella pneumophila

(Brumell & Scidmore, 2007) afin de stopper la maturation des phagosomes au stade

d’endosomes précoces. Chez Helicobacter pylori, la présence de Rab5 est nécessaire à la

formation de vacuoles, indispensables à l’internalisation de la bactérie (Papini et al., 1997).

Peu de données sont disponibles concernant l’implication de Rab6 dans une

manipulation par un pathogène. Rab6 a été retrouvée comme marqueur des vésicules

d’inclusion dans lesquelles se répliquent quelques espèces de Chlamydia sans que son rôle

exact n’ait pu être élucidé (Brumell & Scidmore, 2007).

Il faut noter que, outre leur implication dans la formation de vésicules d’endocytose,

ces protéines, et notamment Rab5, jouent également un rôle dans la réorganisation du

cytosquelette d’actine à l’origine de la formation de lamellipodes (Spaargaren & Bos, 1999).

Chapitre 1

57

2.1.3.2. Signal spécifique du far Western réalisé avec les protéines des glandes salivaires d’insectes

Signal d’interaction à 27 kDa : la protéine 14-3-3

La protéine 14-3-3, identifiée dans la bande de gel localisée à 27 kDa, appartient à une

famille de molécules régulatrices très conservées qui s’expriment dans toutes les cellules

eucaryotes. La protéine 14-3-3, présente dans le fluide cérébrospinal de patients est un critère

pour le diagnostic de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (Boston et al., 1982). Cette protéine est

néanmoins retrouvée dans la membrane plasmique de certaines cellules et intervient, en

désorganisant la barrière corticale d’actine, dans l’exocytose de vésicules de sécrétion (Roth

& Burgoyne, 1995). Elle participe également à la régulation de nombreux processus

cellulaires par le biais d’interaction protéine-protéine. En effet, l’interaction avec une protéine

14-3-3 peut détourner la fonction de la protéine interactante en empêchant sa liaison avec

d’autres protéines ou en induisant des changements conformationnels (Mackintosh, 2004).

Chez Trypanosoma brucei, cette protéine intervient dans le recyclage des glycoprotéines

variables de surface (GVS), permettant au trypanosome d’échapper au système immunitaire

(Benz et al., 2009).

Le rôle que chacune de ces protéines pourrait avoir au cours du cycle de S. citri dans

son insecte vecteur sera discuté à la fin de ce chapitre.

2.2. Recherche et identification du partenaire de l’actine chez S. citri

La recherche du partenaire de l’actine a été réalisée par chromatographie d’affinité sur

une colonne de Protein A-Sepharose couplée à des anticorps anti-actine sur le système

chromatographique AKTApurifier (GE Healthcare). Le principe et le protocole de cette

chromatographie ayant permis la purification des protéines interagissant avec l’actine sont

développés au chapitre Matériels et Méthodes.

Les résultats, publiés dans la publication 1, ont permis de mettre en évidence la

présence d’une bande de gel localisée à 45 kDa contenant une ou plusieurs protéines

interagissant spécifiquement avec l’actine de C. haematoceps.

Cette bande de gel est découpée puis analysée en spectrométrie de masse par LC-

MS/MS.

Figure 1.7: Identification par spectrométrie de masse des protéines candidates pour une interaction avec l’actine de C.haematoceps.

En rouge, les deux protéines candidates retenues pour la suite de l’étude.

50

37

kDa

Identification

# M

S/M

S

scan

# di

stin

ct p

ep

% c

over

age

mol

ecul

ar w

eigh

t

1 Transmembrane conserved hypothetical lipoprotéine 16 9 23,84 46014,9

2 Phosphoglycerate kinase 10 7 23,79 44387,9

3 Translation elongation factor EF-Tu 3 3 8,33 43669,9

4 Spiroplasma citri adhesion related protein (ScARP) 2b 7 6 9,79 88814

5 Spiroplasma citri adhesion related protein (ScARP) 5a 5 4 6,27 95315,4

6 Spiroplasma citri adhesion related protein (ScARP) 3c 4 3 5,94 87266,1

7 50S ribosomal protein L3 7 2 17,83 27997,3

8 Serine hydroxymethyltransferase transmembrane 2 2 5,81 45589

Spectrométrie de masse en LC-MS/MS

Chapitre 1

58

L’analyse de cette bande de gel obtenue lors de la chromatographie d’affinité sur la

colonne de protein-A Sépharose a permis de recueillir les résultats présentés dans le

tableau 1.7.

Aux vues du nombre de scans identifiés lors de l’analyse et de la masse moléculaire de la

protéine d’intérêt interagissant avec l’actine, estimée aux alentours de 45 kDa, les deux

candidats les plus intéressants pour la suite de l’étude se révèlent être une « transmembrane

conserved hypothetical lipoprotein » et la phosphoglycérate kinase.

2.2.1.1. Transmembrane conserved hypothetical lipoprotein (SPICI 03-098).

Composée de 408 acides aminés, cette protéine possède une masse moléculaire de 46

kDa. Lors du séquençage du génome de S. citri, cette protéine a été annotée comme une

lipoprotéine en raison de la présence d’un peptide signal en N-terminal, typique de ces

protéines, de 24 acides aminés. Ce peptide de séquence M R K L L S I F A A T T L V T T S

A A S A V A C est terminé par une cystéine en position 24. Grâce à ce peptide signal, cette

protéine se trouve exposée à la surface ce qui présente un avantage pour interagir avec l’actine

des cellules de l’insecte, c’est la raison pour laquelle elle nous a semblé de prime abord très

intéressante. Lors de l’analyse du protéome de S. citri réalisé au laboratoire, cette protéine a

été retrouvée à la fois dans la fraction membranaire des protéines du spiroplasme et dans

l’extraction au Triton X-114 confirmant sa nature lipoprotéique. La recherche de protéines

homologues dans les banques généralistes a permis d’identifier une seule protéine chez S.

kunkelii avec 83 % d’identité de séquence. Aucune fonction n’a été attribuée, à ce jour, à

aucune de ces deux protéines.

L’identification d’une protéine spécifique de seulement deux espèces de spiroplasmes

interagissant avec l’actine de l’insecte, protéine très conservée, semble être en accord avec le

spectre de transmission restreint qui caractérise la vection des spiroplasmes par leurs insectes.

Cette lipoprotéine semblait être un bon candidat pour la transmission de S. citri et, à ce titre,

sa caractérisation fonctionnelle pouvait s’avérer utile.

L’expression de cette protéine chez E. coli du fait de la présence de sept codons

tryptophanes UGA dans sa séquence n’a pas été obtenue.

Tableau 1.8: Ensemble des protéines identifiées et rôle éventuel dans la transmission de S. citri.

X: bande d’interaction présente dans le far Western correspondant. ? : Présence et rôle non déterminés. nd: non déterminé.

60 kDa X Glycoprotéine*Liaison avec la spiraline*Implication au niveau

du franchissement épithélium intestinal?

50 kDa X XTubuline β

Glycoprotéine

*Traffic intracellulaire? *Endocytose?

Liaison avec la spiraline

42 kDa X X Actine (F)*Interaction avec la PGK

*Internalisation dans les cellules d'insectes

35 kDa X X nd nd30 kDa X X nd nd

27 kDa X 14-3-3*Traffic intracellulaire?

*Exocytose?

25 kDa X XRab5Rab6

*Endocytose?*Détournement voie phago-lysosomiale?

Identification Rôle1-D

Masse moléculaire

de l'interaction 2-D 2-D

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1-D

Far Western "Glandes salivaires"

Far western"protéines totales"

X

X

X?

X

X

X

X?

?

X

Chapitre 1

59

2.2.1.2. La phosphoglycérate kinase (PGK)

Les principales caractéristiques de la PGK de S. citri, décrites dans la publication n°1,

ont favorisé son étude. Sa caractérisation fonctionnelle au cours de cette transmission a

nécessité son expression hétérologue chez E. coli (cf matériel et méthodes).

Il faut préciser que dans toutes les expériences affectuées avec la PGK recombinante,

celle-ci était toujours étiquetée 6xHis. En effet, malgré toutes les tentatives réalisées pour

éliminer cette étiquette, quelques soient les conditions utilisées, aucune préparation de PGK

n’a pu être « détagguée ». Ceci a nécessité l’ajout d’un contrôle utilisant une autre protéine

étiquettée elle aussi 6xHis dans toutes nos expériences.

III. Conclusion

La transmission de S. citri par C. haematoceps nécessite de nombreuses interactions

entre le spiroplasme et son insecte vecteur. De ces interactions dépendent, entre autre, les

franchissements de la barrière intestinale et de celle des glandes salivaires. La technique de far

Western 1-D et 2-D, suivie d’une identification par spectrométrie de masse, a permis au cours

de cette thèse d’identifier cinq protéines pouvant intervenir dans le processus de transmission.

De plus, certaines de ces protéines ont pu être plus spécifiquement impliquées dans le

franchissement de l’une ou l’autre des deux barrières que le spiroplasme doit franchir dans

l’insecte.

Le tableau 1.8 regroupe les résultats obtenus au cours de cette analyse en indiquant

l’ensemble des protéines d’insectes identifiées, leur localisation sur les différents far Western

ainsi que leurs rôles possibles au cours du cycle de S. citri dans C. haematoceps.

Tout d’abord, l’actine de C. haematoceps, présente au niveau du complexe cortical

sous la membrane plasmique, mais également à la surface des cellules (Moroianu et al., 1993)

pourrait être déstabilisée lors de l’internalisation de ce dernier dans les cellules de l’insecte

sous l’effet de signaux cellulaires déclenchés par le spiroplasme lors de son adhésion. Ce rôle

semble être confirmé par son implication, grâce à son interaction avec la phosphoglycérate

kinase du spiroplasme, dans l’internalisation de ce dernier dans les cellules de l’hôte. En effet,

l’ajout de cette PGK recombinante sur des cellules en culture de l’insecte vecteur infectées

par le spiroplasme inhibe, de manière dose-dépendante, l’internalisation de ce dernier dans les

cellules (Labroussaa et al., 2010). Le rôle inattendu de la PGK de S. citri, plus connue pour

son rôle dans la glycolyse, n’est pas le premier cas de caractérisation d’une protéine

bifonctionnelle chez S.citri. En effet, la protéine P46 du spiroplasme est une protéine

Chapitre 1

60

ribosomique possédant la capacité de se lier à des séquences génomiques inversées répétées

(Le Dantec et al., 1998). Plus récemment, la découverte de l’implication de la glyceraldéhyde-

3-phosphate deshydrogénase (GAPDH) de Mycoplasma pneumoniae dans l’adhésion du

mollicute aux cellules de son hôte (Dumke et al., 2010), montre que la PGK n’est pas la seule

enzyme glycolytique bifonctionnelle impliquée dans un processus d’invasion bactérienne.

Parmi les autres protéines d’insectes identifiées lors des far Western, il semble peu

probable, à la vue du rôle de l’actine dans l’internalisation de S. citri dans les cellules

d’insectes, que la tubuline soit elle aussi impliquée dans l’endocytose du spiroplasme, ou

alors dans une étape encore plus tardive. Cependant, et tout comme Chlamydia trachomatis,

S. citri, une fois internalisé et présent dans la vacuole d’endocytose, pourrait utiliser les

microtubules pour se déplacer dans la cellule. L’interaction avec ces microtubules pourrait se

faire par l’intermédiaire de protéines spécifiques localisées au niveau de sa structure en « tip »

affleurant à la surface de la vacuole (Ammar et al., 2004). Cependant, de manière similaire

aux résultats concernant les phytoplasmes (Suzuki et al., 2006), S. citri a également été

retrouvé colocalisé le long des filaments d’actine ce qui pourrait signifier que le spiroplasme

utilise ces filaments pour se mouvoir à l’intérieur de la cellule. Une étude plus poussée

permettrait de comprendre un peu mieux comment le spiroplasme parvient à se mouvoir dans

le cytoplasme des cellules de son hôte

Les protéines Rab5 et Rab6, autres protéines identifiées au cours de cette analyse,

pourraient quant à elles également participer au phénomène d’endocytose de S. citri en

désorganisant le cortex d’actine et en facilitant l’entrée du spiroplasme dans la cellule.

Néanmoins, elles pourraient aussi permettre au spiroplasme, qui détournerait alors leurs

fonctions à son profit, d’éviter la fusion phagoso-lysosomiale responsable de l’élimination de

particules étrangères et ainsi de survivre et de se multiplier dans le cytoplasme comme il a été

décrit pour d’autres microorganismes.

Enfin, la protéine 14-3-3 présente de nombreuses fonctions intéressantes pour S. citri.

Le spiroplasme pourrait détourner cette protéine de sa fonction première chez l’insecte afin

qu’elle assure un rôle dans le franchissement de la barrière des glandes salivaires. En effet, en

interagissant avec une protéine du spiroplasme, la protéine 14-3-3 pourrait permettre à ce

dernier de transiter à l’intérieur des cellules, dans les vésicules d’endocytose observées en

microscopie électronique, en détournant la voie endo-lysosomiale de l’insecte. Elle pourrait

aussi permettre à S. citri de pénétrer à l’intérieur du canal salivaire par exocytose en modifiant

le cortex cellulaire d’actine afin d’être transmis à un nouvel hôte.

Chapitre 1

61

Du fait de la très grande conservation de l’actine parmi les insectes (de 93 à 100 %

entre les différentes espèces) et celle de la PGK parmi les mollicutes (70 % environ), il est

difficile de concevoir que cette interaction joue un rôle dans la spécificité de vection entre S.

citri et C. haematoceps au cours de la transmission du spiroplasme par son insecte vecteur.

Néanmoins, les autres protéines identifiées au cours de ce travail, et surtout les deux

glycoprotéines identifiées précédemment au laboratoire, pourraient intervenir plus

précocément en interagissant avec des adhésines du spiroplasme. Ces étapes précoces

permettraient dès lors la mise en place plus tardive d’une cascade d’étapes conduisant à

l’internalisation faisant intervenir la PGK et les filaments d’actine de l’insecte. Elles seraient

donc nécessaires au spiroplasme pour franchir les barrières de l’insecte et assurer sa

propagation dans celui-ci.

Chapitre 2

Chapitre 2

62

Identification de la région minimale de liaison à l’actine de la PGK de

S. citri et implication dans la transmission

I. Introduction et objectifs

La phosphoglycérate kinase de S. citri, identifiée comme partenaire de l’actine dans

une interaction nécessaire à la transmission du spiroplasme, n’était pas pressentie au début de

ce travail de thèse. Elle vient néanmoins s’ajouter à la longue liste de protéines interagissant

avec l’actine et dont le nombre, déjà très élevé, est en constante augmentation. Les fonctions

de ces protéines, encore appelées actin-binding proteins (ABPs), sont aussi diversifiées que le

sont celles de l’actine au sein de la cellule.

L’actine tient une place prépondérante chez les eucaryotes étant, avec les microtubules

et les filaments intermédiaires, à la base du cytosquelette de la cellule. Le cytosquelette

d’actine remplit de multiples rôles notamment dans le maintien de la morphologie et de la

polarité cellulaire, dans l’endocytose, les mouvements intracellulaires, la motilité ainsi que la

division cellulaire. L’ensemble de ces fonctions nécessite l’assemblage et le désassemblage

permanent des filaments d’actine ainsi que leur structuration en un réseau organisé. La

polymérisation dynamique de ces derniers, impliquée dans la majeure partie des fonctions

énoncées précédemment, est polarisée et se caractérise par des états transitoires régulés par

plusieurs de ces ABPs. L’extrémité (+) du filament d’actine permet la formation d’un

nouveau filament sous l’action de deux ABPs, Arp2 et Arp3, associées en complexe nommé

Arp2/3. Ce dernier permet de former ce nouveau filament à partir d’un côté d’un filament

préexistant, permettant ainsi le développement d’un réseau caractéristique du cytosquelette

d’actine. Ce complexe se lie avec les monomères d’actine G et permet leur agrégation au

niveau de cette extrémité. Plusieurs autres protéines, comme les protéines WASP (Wiskott-

Aldrich syndrome protein) participent également à cette étape d’élongation des filaments

d’actine (Dominguez, 2009). De nouvelles ABPs, comme la protéine gelsoline, interagissent

avec l’extrémité néo-formée en se positionnant comme une coiffe, empêchant l’élongation

excessive du filament (Silacci et al., 2004).

Parallèlement à la formation de ce réseau, au niveau de l’autre extrémité (-) du

filament d’actine, la dépolymérisation est induite par de nouvelles ABPs. En effet, les

protéines ADF (actin depolymerizing factor), ou encore les protéines appartenant à la famille

Chapitre 2

63

des cofilines, jouent un rôle important dans le turnover des filaments d’actine en se liant à la

structure ADP/actine-F induisant leur dissociation (Dos Remedios et al., 2003).

Certaines ABPs, au lieu de modifier la structure ou la dynamique de polymérisation de

l’actine, de nombreuses autres ABPs utilisent les filaments d’actine comme support physique

pour assurer leur fonction. C’est notamment le cas de la myosine qui utilise l’actine pour se

déplacer dans la cellule. D’autres encore connectent les microfilaments à la membrane ou aux

protéines de membranes, comme les protéines talin et vinculin qui relient le cytosquelette aux

récepteurs cellulaires de type intégrines. La liaison des filaments d’actine avec les autres

filaments du cytosquelette peut également être prise en charge par les ABPs comme la

spectrine qui permet la liaison aux filaments intermédiaires (Broderick & Winder, 2005) ou

encore la protéine tau qui permet l’interaction des filaments d’actine avec les microtubules

(Maccioni & Cambiazo, 1995).

La co-cristallisation de certaines ABPs associées à l’actine a permis de mettre en

évidence des domaines plus particulièrement impliqués dans l’interaction. L’α-actinine, par

exemple, qui permet l’association de plusieurs filaments d’actine entre eux, se lie à l’actine

par le biais de deux domaines de liaison séparés par un domaine flexible (spacer) (Broderick

& Winder, 2005).

Ce second chapitre est plus particulièrement consacré aux domaines de la PGK qui se

lient à l’actine afin de déterminer si ces domaines présentent des similitudes avec ceux

impliqués dans l’interaction avec le substrat de la PGK au cours de la glycolyse. La mise en

évidence de tels domaines permettrait de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu au

cours de l’étape d’internalisation du spiroplasme dans les cellules de l’insecte.

De plus, des travaux concernant la localisation de la PGK chez le spiroplasme ont été réalisés

afin de mieux appréhender la possibilité d’une interaction entre ces deux protéines.

L’ensemble des résultats présentés dans ce second chapitre sont soumis à publication

sous le titre « A minimal actin-binding region of the S. citri phosphoglycerate kinase is

implicated in the transmission process by the insect vector Circulifer haematoceps ». Les

points clés de ce travail ainsi que les résultats complémentaires seront également détaillés.

Fig

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2.1:

Rep

rése

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lule

s C

iha-

1 (4

00µg

/ml d

e pr

otéi

nes)

Réd

uctio

n de

la

trans

mis

sion

de

S.ci

tri

412

++

+85

%48

%

302

++

+nd

nd

205

++

+nd

nd

101

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312

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ucun

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1

PGK FL2

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ucun

e

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+80

%41

%

PGK

Chapitre 2

64


1. Publication 2

Les résultats obtenus sont soumis à Applied and Environmental Microbiology sous le

titre « A minimal actin-binding region of the S. citri phosphoglycerate kinase is implicated in

the transmission process by the insect vector Circulifer haematoceps » sont résumés ci-

dessous et dans le tableau 2.1.

Afin d’étudier en détails les régions impliquées dans l’interaction entre la PGK de S.

citri et l’actine de C. haematoceps, l’obtention de cinq peptides tronqués dans certaines

parties de cette dernière, a été nécessaire. Ces peptides, nommés PGK-FL1 à PGK-FL5, ont

tous été exprimés puis purifiés chez E.coli.

L’interaction de chacun de ces peptides avec l’actine de l’insecte vecteur a été testée

en far Western, à la fois en tant que protéines « sondes » mais aussi en tant que protéines

« appât ». Ces deux far Western ont permis de confirmer l’interaction entre l’actine de C.

haematoceps et les 101 premiers acides aminés de la région N-terminale (PGK-FL3) de la

PGK de S. citri.

L’identification d’une région plus réduite a néanmoins été suggérée d’après les

résultats du far Western entre l’actine et le peptide PGK-FL5 (aa 49-154). Par déduction, la

région commune entre les peptides PGK-FL3 et PGK-FL5, allant de l’acide aminé 49 à 101, a

été démontrée comme étant la région minimale d’interaction avec l’actine de l’insecte.

L’incubation du peptide PGK-FL5, contenant la région minimale de liaison à l’actine,

avec les cellules en culture de C. haematoceps permet de diminuer l’internalisation de S. citri

dans ces cellules de manière identique à ce qui avait été observé avec la PGK « pleine

longueur ».

L’implication de l’interaction PGK-actine au cours du cycle de S. citri dans l’insecte a

pu être confirmée in vivo en bloquant partiellement la transmission du spiroplasme dans

l’insecte par injection intra-abdominale du peptide PGK-FL5.

Chapitre 2

65

Involvement of a minimal actin-binding region of S. citri phosphoglycerate kinase in the spiroplasma transmission process by the insect vector Circulifer haematoceps. Fabien Labroussaa, Marie-Pierre Dubrana, Nathalie Arricau-Bouvery, Laure Béven and Colette Saillard* INRA et Université Victor Ségalen Bordeaux 2, UMR 1090 Génomique Diversité Pouvoir Pathogène, 71 Avenue Edouard Bourlaux BP 81, F-33883 Villenave d’Ornon, France

* Corresponding author. Mailing address ; UMR 1090 Génomique Diversité Pouvoir Pathogène, INRA, Université Victor Ségalen Bordeaux 2, 71 Avenue Edouard Bourlaux BP 81, F-33883 Villenave d’Ornon, France. Phone : 33 5 57 12 23 62 Fax : 33 5 57 12 23 69 E-mail : [email protected] Running title: Minimal actin-binding region of S. citri PGK Abstract Spiroplasma citri is a wall-less bacterium that colonizes phloem vessels of a large number of host plants. Leafhopper vectors transmitted S. citri in a propagative and circulative manner, involving colonization and multiplication of bacteria in various insect organs. Previously we reported that phosphoglycerate kinase (PGK), the well-known glycolytic enzyme, was bound to leafhopper actin and unexpectedly was implicated in the internalization process of S. citri into Circulifer haematoceps cells. In an attempt to identify the actin-interacting regions of PGK, several overlapping PGK truncations were generated. Binding assays, using the truncations as probes on insect protein blots, revealed that the actin-binding region of PGK was located on the truncated peptide designated PGK-FL5 containing amino acids 49-154. To investigate the role of PGK-FL5-actin interaction, competitive spiroplasma attachment and internalization assays were performed in which His6-tagged PGK-FL5 was added to Ciha-1 cells prior to infection with S. citri. No effect was observed on the efficiency of attachment of S. citri to leafhopper cells while internalization was drastically reduced. The in vivo effect of PGK-FL5 was confirmed by competitive experimental transmission assays as injection of PGK-FL5 into S. citri infected leafhoppers significantly affected spiroplasmal transmission. These results suggest that S. citri transmission by its insect vector is directly correlated to PGK ability to bind actin.

Chapitre 2

66

INTRODUCTION The plant pathogenic mollicute Spiroplasma citri, available in culture since 1971 (Saglio et al., 1971; Saglio et al., 1973), has emerged as an outstanding model for studying spiroplasma interactions with its two experimental hosts: the periwinkle plant and the insect vector Circulifer haematoceps (Bove et al., 2003). Due to its circulative and persistent transmission, S. citri , similarly to the other plant pathogenic mollicutes, has to complete a complex journey in the insect. Successful transmission of S. citri by the leafhopper depends mainly on the ability of spiroplasmas to pass through the insect gut cells, to multiply in various tissues, and finally to cross the salivary gland cells. The crossing of these different barriers doubtlessly requires protein interactions between the spiroplasma cells and cells of its insect host. The salivary gland invasion represents the essential and ultimate step. Thus the first cell-to-cell contact may be crucial for the efficient penetration of the salivary gland membrane. Following electron microscopy observations, it has been hypothesized that leafhopper transmission of spiroplasmas and more precisely the traversal of insect membranes was mediated by the recognition of specific membrane proteins, which leads to a process of receptor mediated endocytosis (Fletcher et al., 1998; Kwon et al., 1999; Ozbek et al., 2003). Nevertheless, the mechanisms governing these crossings have not been conclusively determined. Earlier reports on Spiroplasma kunkelii describe tip structures piercing the basal laminae of midgut epithelial cells of the leafhopper vector Dalbulus maidis (Ozbek et al., 2003; Ammar et al., 2004). In order to bind, penetrate and degrade the basal laminae, these tip structures or attachment organelles very likely contain specialized enzymes, receptors and/or adhesins as human mycoplasmas (Dallo et al., 1990; Rottem, 2003). A few number of S. citri membrane or associated-membrane proteins potentially

involved in leafhopper transmission, including the solute binding protein Sc76 (Boutareaud et al., 2004), the P32 protein (Berho et al., 2006; Killiny et al., 2006), the adhesion relative proteins ScARPs (Berho et al., 2006) and spiralin (Duret et al., 2003) have been identified. Among these proteins, solely spiralin was described as interacting with host proteins. Indeed, spiralin acts as a lectin able to bind, in vitro, insect glycoproteins that may serve as receptors for the adherence of spiroplasmas (Killiny et al., 2005). Recently, we reported that confocal analysis focused on internalization and overall distribution of S. citri at the salivary gland level revealed spiroplasmas located along the actin microfilaments (Labroussaa et al., 2010). This co-localization was also observed with Ciha-1 cells, a leafhopper cell line from Circulifer haematoceps, experimentally infected by S. citri (Duret et al., 2009). This preferential location suggested that invasion in the host cells could involve interactions between S. citri proteins and the actin cytoskeleton. Among phytopathogenic mollicutes, the first interaction with actin was identified in Candidatus Phytoplasma asteris (OY strain) and involved its immunodominant membrane protein (Amp). Mechanism of this interaction is still unclear but seems to be implicated in the insect-vector specificity (Suzuki et al., 2006). The ability to bind to actin microfilaments is a characteristic feature that has been reported for many intracellular bacterial pathogens (Cossart et al., 2003; Gouin et al., 2005) and might be a general system for successful bacterial invasion within host cells. For S. citri, we previously reported that phosphoglycerate kinase (PGK), classified as a cytosolic protein, unexpectedly bound actin and mediated the process leading to internalization of S. citri in eukaryotic cells (Labroussaa et al., 2010). Thus PGK joins the group of enzymes including enolase (Yavlovich et al., 2007), glyceraldehyde-3-

Protein Primers Séquence (5’ 3’)b PositioncAmino acid

residue numero

PGKPGK-FPGK-R

GTGAGAATTCGGATTTCATATGACAAACTTATGAAGCTTTTATTTACTTTGAACAGC

-19 to +91-412

1222-1250*

PGK FL1

PGKpep-FPGKpep1-R

TGAGAAGGATTTGAATTCCATATGACAAACCAAAACCTAAGCTTTTAGTTGTAACTTTTG

-18 to +91-302

283-303

PGK FL2

PGKpep-FPGKpep2-R

TGAGAAGGATTTGAATTCCATATGACAAACCATTGTGATAAGCTTTTAAACATTTTTACTTC

-18 to +91-205

590-615

PGK FL3

PGKpep-FPGKpep3-R

TGAGAAGGATTTGAATTCCATATGACAAACCCAATAAGCTTTTATGTTTTCCTTCAAAGG

-18 to +91-101

883-906

PGK FL4

PGKpep4-FPGK-R

GTAAAAATGAATTCCATATG GATTCTGCTTTAGGTTATGAAGCTTTTATTTACTTTGAACAGC

303-324101-412

1222-1250*

PGK FL5

PGKpep5-FPGKpep5-R

TTGATAGAATTCCATATGGCACAAGAAGCAAAAGAATATTTCCCTAAAAGCTTTTAAGCAGAATC

147-16849-154

438-462

Protein Primers Séquence (5’ 3’)b PositioncAmino acid

residue numero

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883-906

PGK FL4

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147-16849-154

438-462

a All regions were amplified using the respective mutagenicforward and reverse primers, as required. b Introduced EcoRI, HindIII and NdeI sites underlined.c upstream position of nucleotide from the adenine nucleotide of the starting ATG codon. * 11 nucleotides are downstream the stop codon localized at position 1239.

Table1: Primers used for constructions of His6-tagged PGK and PGK truncationsa

Chapitre 2

67

phosphate deshydrogenase (Bergmann et al., 2004), and pyruvate deshydrogenase E1β subunit (Dallo et al., 2002) that besides their assigned functions may have some other roles to play in bacteria. The goal of this study was to identify PGK regions that mediate binding to actin of C. haematoceps host cells and to determine the in vivo effect of this minimal actin-binding region in the transmission process of spiroplasmas by its insect vector. MATERIALS AND METHODS Bacterial strains, leafhoppers, and cell line culture Escherichia coli strains DH10B and BL21 (DE3) were grown in Luria-Bertani (LB) medium and used to clone, express, and purify S. citri His6-tagged PGK and its truncated forms. S. citri GII3, originally isolated from its leafhopper vector C. haematoceps captured in Morocco (Vignault et al., 1980), was cultivated in SP4 medium (Tully et al., 1977) at 32°C. Healthy C. haematoceps were reared in an insect-proof cage on stock (Matthiola incana) plants at 30°C. Micro-injection of S. citri GII3 into C. haematoceps has been described previously (Foissac et al., 1996). The non-phagocyte cell line Ciha-1 from the Cicadellidae C. haematoceps was cultured at 32°C according to Duret et al. (Duret et al., 2009). Cloning, expression, and purification of PGK full length and PGK truncations Expression and purification of S. citri His6-tagged PGK was previously described and PGK truncations were produced from the pET28 FL plasmid containing the pgk gene, in which the two UGA codons were replaced by TGG codons (Labroussaa et al., 2010). The individual truncated fragments pgkFL1 to pgkFL5, were amplified (Table 1) and the resultant DNA fragments were inserted in pET28a(+) vector (Novagen). The recombinant plasmids (pET28FL1 to pET28FL5) were used to transform E. coli DH10B. The desired sequence of the resulting plasmids

was verified by sequencing the insert. Two µg of plasmid representing each truncation was used to transform E. coli BL21 (DE3). Transformants were selected on LB solid medium containing kanamycin (50 µg/ml) at 37°C. To check the expression of PGK truncations fused to the N-terminal hexahistidine sequence the experiment was carried out as previously described for PGK (Labroussaa et al., 2010). All proteins, purified by affinity chromatography using Ni2+-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) prepacked columns (Qiagen), were desalted using PD-10 columns according to manufacturer’s instructions (GE Healthcare) and protein concentrations were estimated by the Bradford procedure. Two µg of each purified His6-tagged proteins were subjected to 5-15% linear gradient SDS-PAGE and followed by gel staining with colloidal blue. Parallel gels were transferred onto membranes and blots were used for (i) immunoblotting performed with anti-His monoclonal (Mab) antibodies (1:3000 dilutions, Sigma), (ii) far Western blotting carried out with a mixture of leafhopper cell proteins. Identification of PGK truncations that interact with leafhopper actin Interactions between individual His6-tagged PGK truncations and leafhopper actin were detected by far Western experiments. Equal amounts of His6-tagged PGK and its individual truncations (2 µg) were fractionated by a 5-15% linear gradient SDS-PAGE before transfer onto a nitrocellulose membrane for 45 min at 10 V according to the conditions described by Killiny et al (Killiny et al., 2005). Membrane blots were then overlaid with proteins prepared from Ciha-1 cells as follows: the cells were transferred to a potter-Elvehjem-grinder with phosphate buffered saline (PBS) (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 0.14 M NaCl, 2mM KCl pH 7.4) containing 1mM

R

E

S

U

L

T

S

Figure 1

A4121

PGK

49 154PGK-FL5

302PGK-FL1

205PGK-FL2

101PGK-FL3

412PGK-FL4

101

B

50

37

2520

15

kDa

1 1 1 1 1 12 2 2 2 22

PGK PGK-FL1 PGK-FL2 PGK-FL3 PGK-FL4 PGK-FL5

1

1

1

Figure 1

A4121

PGK

49 154PGK-FL5PGK-FL5

302PGK-FL1

205PGK-FL2

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101

B

50

37

2520

15

kDa

1 1 1 1 1 12 2 2 2 22

PGK PGK-FL1 PGK-FL2 PGK-FL3 PGK-FL4 PGK-FL5

1

11

11

Chapitre 2

68

phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) and homogenized. Then the mixture was centrifuged twice for 1 min at 500 × g. Protein concentration in the supernatant was determined by the Bradford procedure and aliquots of 500 µg of proteins were used as overlay for incubation with the blots of His6-tagged proteins. Bindings were revealed with rabbit polyclonal antibodies against actin (1:600 dilution, Sigma) followed by goat anti-rabbit labelled with peroxidase (1:50,000 dilution, Sigma). All the steps were conducted in the same conditions that those previously published (Labroussaa et al., 2010). All individual His6-tagged truncated proteins (40 µg) were also used as overlay on a leafhopper actin protein blot and interaction was revealed using anti-His MAb (1:3,000) followed by peroxidase conjugate goat anti-mouse IgGs. For this far Western experiment, the blot of leafhopper proteins was prepared as follows: 20 µg of proteins issued from Ciha-1 cell culture were separated on 12,5 % SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membrane. Then, the experiment was conducted in a manner similar to that described previously except that anti-His MAbs in place of of anti-actin antibodies were used. Effect of recombinant PGK and its truncations on S. citri attachment to and entry into Ciha-1 cells Monolayers of Ciha-1 cells grown in 24-well plates (approximately 2 x 105 cells per well) were incubated with various concentrations of S. citri His6-tagged PGK and truncations PGK-FL4 and PGK-FL5. Cells without PGK treatment represent positive control. Cells treated with BSA were also included as a control. Each assay condition was carried out in triplicate. After incubation with proteins for 2 h at 32°C, the cells were infected with a suspension of S. citri at a multiplicity of infection (MOI) of 15 to 30. After infection with S. citri, spiroplasma

attachment to and internalization into Ciha-1 cells were estimated by counting colonies on solid SP4 medium as described previously (Labroussaa et al., 2010). Gentamicin protection assay was used for the invasion assay. Briefly, cells were incubated with 400 µg/ml of gentamycin during 3h at 32°C in order to kill extracellular bacteria. S. citri experimental transmission assays Female leafhoppers were micro-injected with 0.1 µl of a spiroplasma culture (108 spiroplasmas /ml) and caged on healthy stock (Matthiola incana) plants at 30±2°C as described previously (Foissac et al., 1996). The fourth day after this first injection, they were microinjected again with 0,2 µg of His6-tagged PGK or truncations (PGK-FL4 or PGK-FL5) in phosphate buffer (8 mM NaH2PO4, 2 mM Na2HPO4 [pH 7,4]). Injections with phosphate buffer and with a His6-tagged protein (subunit of Mycoplasma mycoïdes SC ATPase) were included as controls in the experiment. Then, for each tagged protein or control, re-injected insects were randomly divided in subgroups of 3 among Eppendorf® tubes on which a Parafilm® membrane separated the leafhoppers from SP4 medium as previously described (Foissac et al., 1996). When feeding through the Parafilm® membrane, infected leafhoppers injected S. citri into the medium. After 24 h at room temperature, the SP4 medium was collected and incubated at 32°C. After one week, the yellow colour in the tube, indicating the growth of S. citri, was noticed and the presence of spiroplasmas was verified with optical microscopic observations. Statistical analyses For attachment to and invasion of S. citri into Ciha-1 cells, Student’s t test was used. For S.citri transmission assay, a chi-square test (two-tailed) was performed to identify significant differences. RESULTS

42

50

75

37

25

A

kDa

21 3 4 5 6 7 8

PGKPGKFL1

PGKFL2

PGKFL3

PGK FL4

PGKFL5

50

10

37

25

2015

kDa

B PGKPGKFL1

PGKFL2

PGKFL3

PGK FL4

PGKFL5

21 3 4 5 6

42

50

75

37

25

A

kDa

21 3 4 5 6 7 8

PGKPGKFL1

PGKFL2

PGKFL3

PGK FL4

PGKFL5

50

10

37

25

2015

kDa

50

10

37

25

2015

kDa

B PGKPGKFL1

PGKFL2

PGKFL3

PGK FL4

PGKFL5

21 3 4 5 6

Figure 2

Chapitre 2

69

Production of recombinant PGK truncations In an attempt to identify the actin-binding region of PGK, we generated by deletion of the carboxyl-terminal region of the PGK (PGK full length: 412 amino-acids) three truncated polypeptides of varying lengths namely PGK-FL1 (302 aa), PGK-FL2 (205 aa) and PGK-FL3 (101 aa) (Figure 1A). PGK-FL4 (312 aa) was the result of the first hundred PGK amino acids deletion and represented the C-terminal part of PGK. A truncated form of PGK-FL2 consisting of amino acids 49-154 designed PGK-FL5 (106 aa) was also produced (Figure 1A). His6-tagged PGK and all the His6-tagged truncated proteins were expressed in E. coli and purified. His6-tagged proteins, PGK, PGK-FL1, PGK-FL2, PGK-FL3, PGK-FL4 and PGK-FL5 have respectively predicted molecular masses of 44.0, 33.7, 23.5, 12.2, 34.0, 12.5 kDa. On the colloidal blue-stained polyacrylamide gel, His6-tagged PGK, and His6-tagged truncations PGK-FL1, PGK-FL2 and PGK-FL4 matched their predicted molecular masses (Figure 1B, lanes 1). His6-tagged PGK-FL3 and PGK-FL5 migrated higher than their predicted molecular masses of 12.2 and 12.5 kDa and preparations of these two truncations were slightly contaminated by other E.coli proteins (Figure 1B, lanes 1). However, anti-His Mab recognized only the tagged proteins in all cases in spite of protein contaminations in PGK-FL3 and PGK-FL5 preparations (Figure 1B, lanes 2). Identification of the minimal PGK actin-binding region To identify the truncated proteins that displayed an affinity for actin, a far Western assay was performed on a blot of Ciha-1 cell proteins using as overlay the individual truncated proteins. Ciha-1 cell proteins mixture was visualized on a 12.5% colloidal blue-stained polyacrylamide gel (Figure 2A, lane 1), and the presence of actin in the Ciha 1 cell protein mixture was confirmed by Western

blotting using anti-actin antibodies (Figure 2A, lane 2). As shown on Figure 2A (lanes 3, 4, 5, 6, 8) for PGK, and PGK-FL1 to FL5 truncations, significant binding signals located at approximately 42 KDa corresponding to actin molecular mass were revealed by anti-His MAb. No signal was observed with PGK-FL4 (Figure 2A lane 7). From these results we deduced that the region in PGK from amino acid 49 to 101 possessed the capacity to bind actin. Interestingly, PGK-FL5 showed a marked decrease in its actin-binding ability (Figure 2A lane 8), especially compared to PGK-FL1, PGK-FL2, and PGK-FL3 (Figure 2A lanes 4, 5, 6). To further reinforce these findings, a second far Western assay was performed in which a blot of His6-tagged PGK or its truncations was overlaid with a Ciha-1 cells protein mixture (Figure 2B). Binding signals between PGK, its truncations and actin were revealed by polyclonal antibodies against actin. As expected, an interaction signal was detected between PGK and actin (Figure 2B, lane 1). Truncation of PGK from the N-terminal (1-101), resulting in PGK-FL4 truncated protein (101 to 412), abrogated the binding activity (Figure 2B, lane 5), suggesting that this region played an important role for PGK interaction with actin. Binding signals detected with PGK-FL1, PGK-FL2 and PGK-FL3 (Figure 2A, lane 2, 3, 4) indicated that truncation from the PGK carboxyl-terminal had no effect on the actin-binding capacity of the PGK moieties. Thus, the 101-amino acid region of PGK-FL3 was required for actin binding. The signal observed with PGK-FL5 (amino acid 49 to 154) (Figure 2B, lane 6) confirmed that an actin-binding site was located on this truncation. From these results, we deduced that the region from amino acids 49 to 101 is the minimal region that possessed the capacity to bind actin. Competitive binding assay with S. citri and truncated PGK proteins:

Rel

ativ

e %

adh

esio

n

0

20

40

60

80

100

120

0 PGK 400 peptfin 50 peptfin 400 peptm i 50 pept m i400

BSA040

0 50 400

40050 40

00

20

40

60

80

100

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0 PGK 400 peptfin 50 peptfin 400 peptm i 50 pept m i400

BSA040

0 50 400

40050 40

0

Concentration (µg/ml)

Figure 3

A

0

20

40

60

80

100

120

0 PGK 400 peptf in 50 peptf in 400 peptmi 50 pept mi 400 BSA040

0 50400 40050

400


Rel

ativ

e %

inte

rnal

izat

ion

* *

*

B

0

20

40

60

80

100

120

0 PGK 400 peptf in 50 peptf in 400 peptmi 50 pept mi 400 BSA040

0 50400 40050

400


Rel

ativ

e %

inte

rnal

izat

ion

* *

*

* *

*

B

Chapitre 2

70

Aiming at determining if the minimal binding region of PGK (PGK-FL5) is sufficient to inhibit entry into insect cells, we performed competitive adhesion and invasion assays with PGK truncations. No difference was observed between the relative percentage of adhesion obtained in the positive controls carried out without any treatment or treated with BSA prior to infection with S. citri (Figure 3A). Preincubation of His6-tagged PGK (400 µg/ml) with Ciha-1 cells before S. citri infection did not reduced the binding of S. citri to cells. To test the correlation between PGK-actin interaction and the role of this interaction in cells infection, PGK-FL4, which has no actin-binding activity and PGK-FL5, which is the minimal actin-binding region, were tested in the same competitive-binding assay. As seen in Figure 3A, competition with 50 and 400 µg/ml of either PGK-FL4 or PGK-FL5 did not noticeably alter the spiroplasmas attachment to cells. These results are in accordance with those obtained previously showing that the interaction between PGK and actin is not involved in the attachment of S. citri to insect cells (Labroussaa et al., 2010). Spiroplasma invasion of Ciha-1 cells was estimated similarly to the attachment test after a gentamicin protection assay. As shown in Figure 3B, the percentage of internalization of S. citri in cells incubated with BSA (400 µg/ml) was close to those of the positive controls. Competition with His6-tagged PGK (400 µg/ml) showed the greatest inhibition rate in invasion, by about 85%. PGK-FL4, whatever its concentration, did not significantly reduce the invasion of S. citri in Ciha-1 cells. In contrast, 50 and 400 µg/ml of PGK-FL5 compete with S. citri internalization into Ciha-1 cells with a reduction of 45 and 80% such as PGK. Effect of PGK or PGK truncations on S. citri transmission To further assess the effect of PGK in S. citri transmission by leafhoppers we

compare the ability of S. citri to be inoculated in SP4 medium by infected leafhoppers re-injected with PGK or PGK truncations. S. citri infected insects that were re-injected with phosphate buffer represented the positive controls. Two hundred and fifty seven groups of 3 leafhoppers were allowed to feed for 24 h on SP4 medium. As shown on Table 2, a spiroplasma culture was obtained for 149 out of the 257 batches. Thus, in 58% of the batches, insects succeeded to achieve bacterial transmission as assessed by inoculation of S. citri into SP4 medium. A relative percentage of 100 was attributed to this maximal transmission rate. There was no significant difference in the percentage of S. citri inoculation in SP4 medium between the positive control and infected insects re-injected with a control His6-tagged protein or PGK-FL4 (96.5% and 100%). Injection with the His6-tagged PGK protein or PGK-FL5 peptide in the S. citri infected leafhoppers resulted in a significant reduction of inoculation in SP4, compared with controls. The percentages of leafhoppers which introduce S. citri in SP4 medium was not significantly different for the His6-tagged PGK protein and the PGK-FL5 peptide (51.7 % and 58.6 %, respectively). DISCUSSION In this study we identified regions of S. citri PGK protein that interact with leafhopper actin and attempted to determine whether PGK, through its binding with actin, play a role in transmission of S. citri by the leafhopper C. haematoceps. Based on our experimental data using PGK truncated derivatives, we determined that the region of the PGK which binds to actin was located on the PGK-FL3 truncation, corresponding to the N-terminal part of PGK (amino acids 1 to 101). Four out of the 5 well defined substrate binding sites of PGK mediating interaction with 1,3-biphosphoglycerate during glycolysis are present on this fragment. In contrast, the

Number ofindependantexperiments

Number of batches (3 leafhoppers per batch)

Number of batches with

positive culture

Percentage of batches with

positive culture

Relative percentage of batches with positive culture

Phosphate buffer 12 257 149 58 100

His6 control 3 100 56 56 96.5

His6-tagged PGK 8 176 52 30 51.7

His6-tagged PGK FL4 3 82 48 58 100.9

His6-tagged PGK FL5 4 112 38 34 58,6

Number ofindependantexperiments

Number of batches (3 leafhoppers per batch)

Number of batches with

positive culture

Percentage of batches with

positive culture

Relative percentage of batches with positive culture

Phosphate buffer 12 257 149 58 100

His6 control 3 100 56 56 96.5

His6-tagged PGK 8 176 52 30 51.7

His6-tagged PGK FL4 3 82 48 58 100.9

His6-tagged PGK FL5 4 112 38 34 58,6*

*

*

*

*

*

*

*

Table 2: Effect of PGK and its truncations PGK-FL4 and PGK-FL5 on S. citri transmission

* p<0.0001, chi-square test (two- tailed)

Chapitre 2

71

PGK-FL4 fragment (amino acids 101 to 412) corresponding to the C-terminal part of PGK, exhibited none binding with actin. This PGK-FL4 fragment mainly includes the ADP binding sites and the catalytic site. The ATP molecule is well known to interact with PGK but also with actin and could thus play the role of a linking agent between these two proteins. The fact that the C-terminal part of PGK is not required for actin-binding capacity of PGK seems to prove that the interaction between PGK and actin is direct. To determine more precisely the binding segment, we constructed a PGK-FL5 truncation with an overlapping region of 53 amino acids with PGK-FL4 and in which the first 48 amino acids of PGK-FL3 were missing. Interestingly, PGK-FL5 showed a marked decrease in its actin-binding ability especially compared to PGK-FL3 (Fig 1A). This difference in actin-binding efficiency could be explained by the occurrence of two distinct actin-interacting sites located in PGK N-terminal part, the first one being specific to PGK-FL3 and located within the amino acids 1-48, and the second site being common to both fragments within amino acids 49-101. Based on sequence similarity, the molecular model proposed for S. cerevisiae PGK (Watson et al., 1982) was used to predict the surface accessibility of the two hypothetical actin-binding domains in S. citri PGK. In the modelled S. cerevisiae PGK N-terminal part, two blocks of amino acids (L29 to H54 and R66 to D91) were found to be localized side by side with a majority of the amino acids residues located at the outer surface of the molecule. In S. citri PGK, the surface exposure of the corresponding amino acids residues would allow their interaction with actin. In addition, amino acids that are believed to participate in actin-binding differ from those involved in PGK interactions with its substrate 1,3-biphosphoglycerate. Previously we have described that PGKs from S. citri and S. cerevisiae do not

interfere with adhesion of spiroplasmas to Ciha-1 cells but inhibit the internalization in the cells in a dose dependant manner (Labroussaa et al., 2010). In this study, as expected, PGK-FL4 and PGK-FL5 truncations or PGK full length had no effect on spiroplasmas adhesion to Ciha-1 cells. The fact that PGK-FL5 with the minimal actin-binding region conserved the inhibitory activity on the internalization process reinforces the hypothesis assuming that the actin-binding efficiency of PGK is directly related to the relevance of such an interaction in the internalization process. This is also confirmed by the fact that PGK-FL4, which has no effect on internalization, does not possess any actin-binding activity. These results prompted us to speculate that PGK and PGK-FL5 fragment are candidates for playing a role in transmission of S. citri. The penultimate event before the infectious bite in the phloem is invasion of C. haematoceps salivary glands by the spiroplasmas. To ascertain the role of PGK and PGK-FL5 truncation peptide in salivary gland invasion we developed an in vivo spiroplasma invasion blocking assay. Infected leafhoppers were injected with phosphate buffer or tagged proteins on the 4th day after infection. This time period corresponds to the maximum of spiroplasmas in insect (Boutareaud et al., 2004) and a large majority of them would be expected to still be circulating in the haemolymph that is the main place of S. citri multiplication. Because transmission rates of S. citri between infected leafhoppers treated with His6-tagged PGK-FL4 and those of control groups (phosphate buffer or tagged protein) were similar, it is highly unlikely that PGK-FL4 inhibits the ability of spiroplasmas to enter in salivary glands. The infected leafhoppers injected with PGK or with PGK-FL5 displayed an average reduction of almost 50% in the transmission of S. citri when compared with controls. PGK-FL5 truncation, with its minimal actin-

Chapitre 2

72

binding region, sufficient to block the entry of spiroplasmas into Ciha-1 cells, plays as expected an important role in transmission. The competition between exogenous PGK and PGK-FL5 with the spiroplasmas could reduce the available number of target sites that participate in entry of spiroplasmas in salivary glands. In summary, our results suggested a correlation between the PGK-actin interaction and the inhibitory effect during internalization in insect cells. In agreement with these data, as we show with our in vivo experimental model, S. citri could use this interaction for crossing salivary glands barrier and completing its life cycle in insects. The PGK-actin interaction might be essential for insect transmission but this complex is probably not sufficient for deciphering all steps involved in the transmission process. A comparison of the actin-binding region (amino acid 49 to 101) with the same region in various phytoplasmas revealed that this region belong to a fragment with a less well conserved sequence suggesting the fundamental importance that could have this sequence for determining insect vector specificity in plant pathogenic mollicutes. ACKNOWLEDGEMENTS Thanks are due to Claire Charenton who kindly provided the His6-tagged MSC_618. This work was supported with funding from INRA and Université Victor Ségalen Bordeaux 2. F.L. was supported by a Ph.D. fellowship from the Ministère de l’Enseignement et de la Recherche. LEGENDS Figure 1: Construction and purification of the truncated PGK proteins (A) Schematic illustration of the PGK and deletion constructs. Full-length PGK protein (amino acids 1 to 412) was deleted from C-terminus and PGK-FL1 (amino acids 1 to 302), PGK-FL2 (amino acids 1 to 205), PGK-FL3 (amino acids 1 to 101), were produced. N-terminal deletion produced PGK-FL4 (amino acids 101 to

412). PGK-FL5 (amino acids 49 to 154) was constructed by deleting both amino terminal and carboxyl terminal end of PGK. (B) All His6-tagged proteins were purified as described in Materials and Methods, and submitted to SDS-PAGE (lane 1). Parallel gels were transferred onto nitrocellulose membranes. Saturated blots were probed with anti-His monoclonal antibodies (lane 2). Figure 2: Determination of the minimal PGK region required for actin binding activity (A) Far Western experiment performed on Ciha-1 cell proteins (20 µg) overlaid with His6-tagged PGK and His6-tagged PGK truncations. Lane 1, gel electrophoresis pattern of Ciha-1 cell proteins stained with colloidal blue. Lane 2, proteins from Ciha-1 cells (20 µg) were transferred onto a nitrocellulose membrane. Saturated blots were probed with rabbit polyclonal antibodies against chicken actin followed by immunological detection. The band at 42 kDa reflects the presence of actin in the protein mixture. Lanes 3 to 8, blots from Ciha-1 cell proteins were probed with PGK or individual PGK truncations. Mouse anti-His MAbs followed by peroxidase conjugate goat anti-mouse IgGs were used to detect interactions. His6-tagged PGK and His6-tagged PGK-FL1 to PGK-FL3 and PGK-FL5 were bound to actin (lanes 3, 4, 5, 6, 8). With His6-tagged PGK-FL4, no binding signal was observed (lane 7). (B) Far-western experiments performed on PGK and its truncations overlaid with Ciha-1 cell proteins. Blots of His6-tagged PGK and His6-tagged PGK truncations were probed with the mixture of Ciha-1 cell proteins containing actin. Binding was detected with rabbit antiactin antibodies followed by goat anti-rabbit antibodies labelled with peroxydase. Detection was performed with chemioluminescent substrate. Binding signals were observed with PGK and PGK-FL1 to PGK-FL3 and

Chapitre 2

73

PGK-FL5 (lanes 1, 2, 3, 4, 6). No binding was observed with PGK-FL4 (lane5), Figure 3: Competitive assays between recombinant PGK or its truncations and S. citri for attachment to and entry into Ciha-1 cells Monolayers of Ciha-1 cells were incubated for 2 hrs at 32°C with 400 µg of His6-tagged PGK (white bars), 50 and 400 µg of His6-tagged PGK-FL4 (spot-filled bars), 50 and 400 µg of His6-tagged PGK-FL5 (brick-filled bars), 400 µg of BSA (gray bars). Untreated cells infected in the same conditions were the positive controls (black bars). (A) Effect of PGK treatment on S. citri attachment to Ciha-1 cells. After incubation, the cells were infected with S. citri at a MOI of 15-30 for 4 h at 4°C. Then the cells were washed, trypsinized and plated on SP4 solid medium. After spiroplasma growth at 32 °C, the number of colonies was counted to evaluate the

number of cells associated with adherent spiroplasmas. Each value represents the mean of two independent triplicate assays. Vertical lines represent standard error of the mean. Student’s t test was carried out and no statistical differences were found. (B) Inhibition of S. citri internalization into Ciha-1 cells by a PGK treatment. Following infection with S. citri at a MOI of 15-30 for 18h at 32°C, the cells were treated with gentamicin (400 µg/ml) during 3 h at 32°C for killing attached spiroplasmas. Then the cells were trypsinized, plated on SP4 medium, for counting the infected cells. Each value represents the mean of two independent triplicate assays. Vertical lines represent standard errors of the means. Significant differences between S. citri internalization with His6-tagged PGK, or PGK-FL5 treatment, and positive control without any protein treatment (P< 0.001, Student’s t test) are indicated by asterisks.

Figure 2.2: Représentation schématique des informations tirées de l’analyse de la structure 3-D de la PGK au cours de la glycolyse.

Positions permettant le changement conformationnel de la PGK lors de la

liaison au substrats

Positions permettant la liaison à l’ADPPositions permettant la liaison

au 1,3-biphosphoglycerate

Chapitre 2

74

2. Résultats supplémentaires et discussion

2.1. Recherche du mécanisme d’interaction entre la PGK et l’actine

Les travaux, en cours de publication, ont permis de préciser la région de la PGK

impliquée dans l’interaction avec l’actine. En effet, la région en acides aminés 49-101 de la

PGK a été caractérisée comme la région minimale de liaison à l’actine. De plus, il a été

suggéré que deux régions pourraient intervenir dans cette interaction. L’intensité du signal

obtenu lors du far Western réalisé avec le fragment PGK-FL5 (aa 49-154) est plus faible que

celle obtenue avec les autres signaux d’interaction, et notamment avec le peptide PGK-FL3

(aa 1-101). De ce fait, la région comprenant les acides aminés de 1 à 48 et celle comprenant

les acides aminés 49 à 101 pourraient être impliquées dans une interaction de la PGK avec

l’actine de C. haematoceps.

Ceci nous a incités à regarder plus en détails la séquence primaire en acides aminés,

ainsi que la structure tridimensionnelle (3-D) de la PGK afin d’identifier des structures ou des

acides aminés particuliers intervenant dans le mécanisme d’interaction de cette protéine avec

l’actine.

La fonction principale de la PGK, ou néanmoins celle qui est la plus connue, est d’être

une enzyme de la glycolyse. Plusieurs caractéristiques concernant la PGK, principalement

déduites de sa co-cristallisation avec ses substrats au cours de cette étape glycolytique, sont

représentées sur la figure 2.2.

La structure 3-D de la PGK de S. citri n’était pas disponible mais cette protéine étant

relativement conservée, la modélisation de la structure 3-D de la PGK de S. citri s’est basée

sur la structure 3-D de la PGK de S. cerevisiae, déterminée expérimentalement (Watson et al.,

1982) (figure 2.3A).

Les données disponibles sur la PGK concernent principalement son rôle au cours de la

glycolyse. La PGK transfère un groupement phosphoryl du 1,3-biphosphoglycérate à l’ADP

en vue de former une molécule d’ATP. Pour assurer ce transfert, elle possède deux domaines

de liaison distincts pour chacun de ses deux substrats : un domaine en N-terminal permettant

de lier le 1,3-biphosphoglycérate, composé de cinq acides aminés D22, N24, R37, H60 et

R120, et un second, en C-terminal, quant à lui, constitué de 11 acides aminés (G242, G310,

N334, P336, G338, V339, F340, E341, G369, D370, S371) assurant la fixation de l’ADP. De

plus, pour le transfert du groupement phosphate, la PGK doit passer d’un état « ouvert » à un

état « fermé » induisant le rapprochement des deux substrats. Cette modification

Figure 2.3: Différentes vues de la structure 3-D de la PGK de S. citri et des régions impliquées dans l’interaction avec l’actine.A: Comparaison de la structure 3-D de la PGK de S. cerevisiae et de S. citri. B: Représentation des acides aminés accessibles à la surface de la protéine au sein de la région d’intérêt 1-101. C: Représentation de l’occupation dans l’espace (space filled) des différentes structures secondaires accessibles à la surface contenues dans la région 1-101. D:Représentation des deux domaines identifiés (M27-E52 et K63-Q88) sur la PGK de S. citri potentiellement impliqués dans l’interaction avec l’actine et se trouvant côte à côte sur la structure 3-D.

A

D

B C

Chapitre 2

75

conformationnelle est assurée par une région composée de quatre acides aminés localisés aux

positions 204 à 207 (VDNP) sur la PGK de S. citri.

La région de la PGK du spiroplasme impliquée expérimentalement dans l’interaction

avec l’actine de C. haematoceps est comprise dans les 101 premiers acides aminés du coté N-

terminal. Il faut remarquer que la localisation de cette région n’est absolument pas corrélée

avec celle des sites de liaison à l’ADP qui, étant connus pour se fixer aussi bien sur la PGK

mais également sur l’actine, aurait pu faciliter cette interaction de manière aspécifique en

servant de pont entre les deux protéines. Par opposition, il semble que l’interaction, entre la

PGK de S. citri et l’actine de l’insecte, soit spécifique et directe.

Dans le but de nous conforter dans nos hypothèses énoncées suite aux résultats

obtenus en far Western, la présence de domaines accessibles à la surface de la protéine qui, de

ce fait, pourraient être responsables de la liaison avec l’actine, a été recherchée. La

figure 2.3B montre la localisation des acides aminés accessibles à la surface de la PGK de S.

citri au sein de la région d’intérêt comprenant les acides aminés de 1 à 101. Les positions dans

l’espace des structures secondaires contenues dans cette région, particulièrement bien

exposées à la surface et donc accessibles pour une interaction, sont également représentées

(figure 2.3C). Trois domaines particulièrement accessibles sont mis en évidence. Mis à part la

région N-terminale qui est souvent très flexible et donc régulièrement exposée à la surface de

nombreuses protéines, deux autres domaines présentent ces mêmes caractéristiques, chacun

de ces domaines faisant parti d’une des deux régions impliquées dans l’interaction avec

l’actine. Pour la région des 48 acides aminés en N-terminal, cette recherche montre la

présence d’un domaine particulièrement accessible allant des acides aminés M27 et E52

(figure 2.3C) formant une structure de type hélice-boucle, propice aux interactions. Pour la

région constituée des 52 acides aminés suivants, une seconde structure de type hélice-boucle a

également été déterminée. Ce domaine prédit comprend les acides aminés K63 à Q88

(figure 2.3D).

Les deux domaines identifiés, et localisés à la surface de la protéine, sont donc situés

côte à côte sur la structure tridimensionnelle (figure 2.3D). Cette particularité pourrait

expliquer les résultats du far Western obtenu avec le peptide PGK-FL5 dont le signal

d’interaction avec l’actine est moins intense que ceux obtenus avec les autres peptides.

D’après les données de la structure 3-D de la PGK, PGK-FL5, n’ayant pas la région en acides

aminés 1-48, ne possède donc pas non plus ce domaine prédit accessible pour l’interaction.

L’actine de C. haematoceps pourrait, de ce fait, interagir avec la PGK de S. citri par le seul

Figure 2.4: Comparaison des différentes régions de PGK.Pourcentage de similarité entre les différentes régions d’intérêt de la PGK de S. citri et les séquences correspondantes chez

Candidatus phytoplasma asteris souche OY, Candidatus phytoplasma asteris souche OY, Candidatus phytoplasma australienseainsi que Streptococcus agalactiae.

1-48 49-101 101-412

S. agalactiae 87% 59% 73%

Candidatus phytoplasma asteris souche AY

75% 60% 70%

Candidatus phytoplasma asteris souche OY

77% 60% 70%

Candidatus phytoplasma australiense

80% 54% 73%

Séquences S. citriSéquences correspondantes

Chapitre 2

76

domaine allant des acides aminés 63-88, présent dans la région minimale de liaison à l’actine,

mais cette interaction ne serait pas stabilisée par le second domaine manquant.

Ces deux domaines ne partagent qu’un seul acide aminé en commun avec ceux

impliqués dans la liaison avec le 1,3-biphosphoglycerate. Cela suggère que, pour se lier à

l’actine, la PGK utilise un mécanisme différent de celui impliqué pour se lier à son substrat de

la glycolyse.

Cette corrélation entre les résultats expérimentaux et les structures identifiées in silico

au cours de l’analyse de la structure 3-D de la PGK permet de confirmer que la PGK serait

effectivement une nouvelle protéine bifonctionnelle chez S. citri.

2.2. Recherche d’homologie de séquences chez la PGK d’autres organismes.

Comme évoqué précédemment, l’implication de l’interaction entre la PGK et l’actine

dans la spécificité de vection du spiroplasme est difficile à concevoir. Cependant,

l’identification de domaines spécifiques dans la séquence de la PGK de S. citri, renfermant

des structures propices à une interaction, nous a incités à comparer ces différents domaines

avec ceux d’autres organismes. Ces comparaisons pourraient nous permettre de vérifier si

cette interaction fait partie d’un processus conservé chez de nombreuses espèces bactériennes

ou si des particularités existent au sein de chaque organisme. Les comparaisons ont porté sur

la séquence de Streptococcus agalactiae utilisant l’interaction PGK-actine pour son

internalisation dans les cellules épithéliales (Burnham et al., 2005). Cette comparaison a

également été réalisée avec les séquences d’autres mollicutes phytopathogènes, les

phytoplasmes, transmissibles par insectes vecteurs, dont le génome est disponible (tableau

2.4).

Les comparaisons ont été effectuées entre les deux régions d’intérêt (1-48 et 49-101)

ainsi que sur la séquence comprenant les acides aminés de 101 à 412 ne présentant pas

d’interaction avec l’actine.

La région C-terminale (aa 101-412) montre des taux de variations identiques à ceux observés

avec les comparaisons des séquences « pleine longueur » (de 70 à 73%). Les comparaisons

des régions des 48 premiers acides aminés de la séquence indiquent que cette dernière est

particulièrement conservée (de 75 à 87% de similarité) tandis que la région comprise entre les

acides aminés 49 et 101 l’est beaucoup moins (54 à 60% de similarité).

Figure 2.5: Localisation cellulaire de la PGK de S.citri prédite par l’outil psortb v.3.0.2.

A: Interface d’interrogation avec la séquence de la PGK de S.citri et les quelques paramètres requis pour cette interrogation. B: Résultats de l’interrogation avec les données importantes encadrées en rouge.

A

SeqID: readseq.input(1), 412 bases, C98338A0 checksum. Analysis Report: CMSVM+ Unknown [No details] CWSVM+ Unknown [No details] CytoSVM+ Unknown [No details] ECSVM+ Extracellular [No details] ModHMM+ Unknown No internal helices found] Motif+ Unknown [No motifs found] Profile+ Unknown [No matches to profiles found] SCL-BLAST+ Cytoplasmic [matched 3122608: Phosphoglycerate kinase] SCL-BLASTe+ Unknown [No matches against database] Signal+ Unknown [No signal peptide detected] Localization Scores: Cytoplasmic 5.86 CytoplasmicMembrane 0.00 Cellwall 0.30 Extracellular 3.83 Final Prediction: Unknown (This protein may have multiple localization sites.)

B

Chapitre 2

77

Selon notre hypothèse, basée sur les résultats des expériences de far Western, cette

région (aa 1-48) pourrait avoir une fonction stabilisatrice nécessaire à une interaction forte

avec l’actine de l’insecte tandis que la seconde (aa 49-101) comprendrait le domaine minimal

de liaison à l’actine indispensable à cette interaction. Les résultats, extraits des comparaisons

de séquence primaire de diverses PGK, semblent confirmer ces résultats. En effet, il semble

logique qu’une région stabilisatrice soit fortement conservée, tandis que la région intervenant

dans l’interaction, à proprement parler, soit plus dégénérée assurant une meilleure spécificité

de liaison à l’actine.

Cette interaction faisant intervenir la PGK et l’actine, deux protéines conservées, ne

peut pas expliquer à elle seule la spécificité de vection. De plus, cette interaction joue un rôle

uniquement lors de l’internalisation de S. citri et non pas lors de l’étape précédente

d’attachement, qui de manière générale, est davantage pressentie pour être impliquée dans la

spécificité d’hôte faisant intervenir des protéines spécifiques. Néanmoins, la plus faible

conservation observée dans la région minimale de liaison à l’actine (aa 49-101) pourrait

indiquer un phénomène d’adaptation propre à chaque organisme nécessaire à cette étape

d’internalisation et qui pourrait intervenir au cours du processus global de spécificité de

vection.

2.3. Localisation de la PGK

Le rôle de la PGK dans la transmission de S. citri, en tant que partenaire de l’actine,

implique qu’elle soit membranaire et/ou sécrétée. Chez de nombreuses autres bactéries

pathogènes, des déterminants majeurs de la virulence ou de la transmission ont été identifiés

parmi les protéines de surface et/ou parmi les protéines sécrétées.

Suite à l’étude du protéome de S. citri au laboratoire, il a été montré que cette protéine

se retrouve dans la fraction cytoplasmique mais aussi dans la fraction membranaire. Cette

localisation membranaire, différente de sa localisation cytoplasmique connue et prédite pour

son rôle dans la glycolyse, a déjà été retrouvée chez d’autres bactéries comme Candida

albicans (Alloush et al., 1997) ou encore Streptococcus agalactiae (Hughes et al., 2002).

En parallèle, l’analyse de la séquence de la PGK, par l’outil de prédiction de

localisation cellulaire psortb v.3.0.2 (Gardy et al., 2005), a été effectuée et semble en accord

avec ces résultats expérimentaux. Cet outil combine plusieurs logiciels de prédictions tel que

des prédicteurs de peptides signaux, de présences d’hélices transmembranaires, de motifs et

de localisation tissus-spécifique afin d’identifier in silico une localisation protéique.

Figure 2.6: Western blot 2-D anti-PGK réalisé avec la fraction membranaire de S. citri.A: Coloration au rouge ponceau de la membrane de nitrocellulose sur laquelle ont été transférées une fraction de protéines membranaires de S. citri séparées par électrophorèse 2-D. B: Agrandissement de la zone de la membrane contenant la PGK de S. citri (à gauche) et western blot réalisé avec cette même membrane dont la révélation a été effectuée avec l’anticorps anti-PGK (àdroite).

A

B

Chapitre 2

78

L’interrogation (figure 2.5A) ainsi que les résultats (figure 2.5B) prédisent que cette protéine

pourrait posséder plusieurs localisations, l’une cytosolique et l’autre extracellulaire.

Afin de mettre en œuvre des techniques immunologiques permettant de visualiser la

présence de la PGK de S. citri à la surface du spiroplasme, un anticorps anti-PGK a été

produit (Protéogénix) dans la souris à partir de la protéine His6-PGK purifiée.

Un western blot a été réalisé sur une fraction protéique enrichie en protéines

membranaires. Les protéines membranaires de S. citri ont été séparées au cours d’une

électrophorèse 2-D puis transférées sur une membrane de nitrocellulose (figure 2.6A) avant

d’être incubée en présence de l’anticorps anti-PGK produit (figure 2.6B). Le résultat de ce

western blot indique, même si cette protéine possède une localisation cytoplasmique du fait de

sa fonction dans la glycolyse, la PGK est également localisée parmi les protéines

membranaires du spiroplasme.

III. Conclusion

Les résultats présentés dans ce second chapitre semblent indiquer que, outre sa

localisation cytoplasmique associée à sa fonction dans la glycolyse, la PGK peut également

être relocalisée. Le western blot réalisé avec les protéines membranaires de S. citri semble

indiquer que celle-ci pourrait se retrouver dans la membrane du spiroplasme. Cependant, la

PGK étant une protéine très fortement exprimée chez S. citri, le risque d’une contamination

n’est pas exclu. Néanmoins, la localisation « extracellulaire », prédite par le logiciel psortb,

semble confirmer cette possibilité. En l’absence d’éléments supplémentaires, cette prédiction

ne permet pas, à l’heure actuelle, d’affirmer si la PGK est associée à la membrane du

spiroplasme ou bien sécrétée par le spiroplasme afin de pouvoir interagir avec l’actine

Ces résultats laissent tout de même penser que la PGK de S. citri pourrait posséder une

seconde localisation adéquate pour une interaction avec les microfilaments de l’insecte au

cours du franchissement des cellules constituant les barrières intestinales et des glandes

salivaires de l’hôte, de manière identique obtenues à d’autres organismes utilisant également

une interaction PGK-actine pour leur internalisation dans les cellules de l’hôte, comme

Streptococcus agalactiae (Burnham et al., 2005),

L’identification de structures, différentes de celles impliquées dans l’interaction de la

PGK avec son substrat au cours de la glycolyse, permet ainsi de préciser le mécanisme

d’interaction entre ces deux protéines. Les deux domaines accessibles à la surface, localisés

Chapitre 2

79

entre les acides aminés M27-E52 et K63-G88, différents de ceux impliqués dans l’interaction

de la PGK avec son substrat dans la glycolyse, seraient plus particulèrement responsables de

sa liaison avec l’actine.

Grâce à l’utilisation des différentes PGK tronquées lors des tests de compétition sur

les cellules d’insectes, nous avons pu mettre en évidence que la région minimale de liaison

avec l’actine conserve le rôle d’inhibition de l’internalisation de S. citri dans les cellules

attribué à la PGK entière.

L’injection du peptide PGK-FL5 et de la PGK entière au niveau de l’hémolymphe de

l’insecte bloque de 50 % le recrachage de S. citri dans le milieu de culture indiquant ainsi que

l’interaction entre les deux partenaires joue un rôle prépondérant in vivo dans la transmission

de S. citri par son insecte vecteur C. haematoceps.

Chapitre 3

Figure 3.1: Voie métabolique de la glycolyse chez S. citri.Présence de la phosphoglycérate kinase (en rouge) et de la voie alternative à la formation du pyruvate (en vert). Extrait de

(http://cbib1.cbib.u-bordeaux2.fr/molligen3b/TOOLBOX/KEGG /ShowPathMulti.php)

Chapitre 3

80

Réalisation d’un mutant de S. citri

dépourvu de phosphoglycérate kinase

I. Introduction

Dans les deux premiers chapitres de ce manuscrit, nous avons montré le rôle de la

PGK dans l’internalisation du spiroplasme dans les cellules Ciha-1 (chapitre1) ainsi que dans

la transmission par l’insecte vecteur (chapitre 2). Ces effets importants de la PGK conduisent

à une réflexion sur la capacité à être transmis par C. haematoceps d’un spiroplasme dépourvu

de cette protéine.

L’obtention d’un tel mutant peut paraître utopique du fait que la PGK, protéine

essentielle de la glycolyse, semble être indispensable pour la survie d’un organisme.

Cependant, un schéma de la voie métabolique de la glycolyse chez S. citri (figure 3.1), fait

apparaître la présence d’une voie alternative à celle passant par la PGK (2.7.2.3, en rouge),

semble exister. En effet, une voie impliquant la L-lactate deshydrogénase (1.1.1.27, en vert),

présente chez S. citri, parait pouvoir substituer celle de la PGK afin de former du pyruvate,

produit final de la glycolyse. De manière surprenante, le séquençage récent du mollicute

phytopathogène Phytoplasma mali souche AT révèle que ce phytoplasme ne posséde pas le

gène codant la PGK (Kube et al., 2008) laissant supposer que l’étude d’un mutant de S. citri

dépourvu de PGK est réalisable.

Chez S. citri, les premières productions de mutants ont été celles réalisées par

mutagénèse aléatoire grâce à l’utilisation du transposon Tn4001 (Foissac et al., 1997),

originaire de Staphylococcus aureus (Lyon et al., 1984). C’est ainsi que des mutants altérés

dans leur pathogénicité (Gaurivaud et al., 2000; Gaurivaud et al., 2000) ou dans leur

transmission par l’insecte vecteur (Boutareaud et al., 2004) ont été obtenus. Cependant,

l’utilisation de cette mutagenèse aléatoire par transposition nécessite l’obtention d’une banque

de mutants d’une couverture satisfaisante, ainsi que le criblage fastidieux de cette dernière,

afin d’isoler des clones « candidats » c'est-à-dire des clones altérés, entre autres, soit dans leur

phytopathogénicité, soit dans leur transmission.

Afin d’obtenir un mutant ponctuel au niveau du gène pgk, nous avons utilisé une

technique de mutagenèse ciblée qui permet de sélectionner un évènement de recombinaison

homologue localisé dans un gène cible (Duret et al., 2003).

Figure 3.2: Réalisation d’un mutant de S. citri dépourvu de PGK.A: Clonage du fragment interne de la PGK au niveau du site BamHI du plasmide pGOT.

B: Schéma d’intégration du pGOT dans le chromosome de S. citri par recombinaison homologue au niveau du gène cible.

tcaagggatccgaaaaaaagttttagtccgtgttgattttaatgtgccaatgaaggatggtcaagttactgatgataatcgtattat

tgcagctttaccaacaattaaatatttgatagcacaagaagcaaaagtaattttattttctcatttagggaaagttaaaacagctga

tgatttagaaaaacgtgatatggctccagtagcaaaggtattagaacaaaaattaggacaaccagttaaatttattaatgcctttg

aaggaaaacaattggaagaagctattaacgaaatgcacaataaagagatctttttattt

BamHI5’

3’

BglII

A

B

tet MO T T

pBSPs GentR

∆∆∆∆PGK

pGOT

PGK

tet M O T T ∆∆∆∆PGKPsGentR∆∆∆∆PGK

tet MO T T

pBSPs GentR

∆∆∆∆PGK

pGOT

PGK


Chapitre 3

81

L’objectif du travail exposé dans ce chapitre concerne donc la production, par simple

recombinaison homologue, d’un mutant de S. citri dépourvu de PGK. Néanmoins, aucun des

mutants obtenus ne correspondant à celui attendu, l’identification des gènes ayant subi un

évènement de recombinaison chez l’ensemble des mutants produits a été mise en œuvre.

II. Résultats

1. Construction du vecteur pGOTpgk

Le vecteur navette S. citri/E. coli, nommé pGOT (figure 3.2A), a été utilisé pour

l’obtention d’un tel mutant. Ces vecteurs ont pour origine commune le plasmide pBS+ qui

leur apporte l’origine de réplication colE1 d’E. coli. De plus, ils possèdent une origine de

réplication de S. citri. Deux gènes de résistance à deux antibiotiques, la gentamycine et la

tétracycline, sont également présents. La résistance à la gentamycine, exprimée de façon

constitutive sous la dépendance d’un promoteur fort, le promoteur de la spiraline, permet la

sélection des transformants après l’électroporation tandis que la résistance à la tétracycline,

apportée par le promoteur du gène cible après une recombinaison homologue, permet de

sélectionner les clones ayant subi cet évènement. Le mutant pour le gène cible désiré est

obtenu par simple recombinaison homologue au niveau de ce gène (figure 3.2B)

Afin de tronquer de manière ciblée le gène pgk, un fragment interne de 300 pb de ce

dernier a été amplifié par PCR avec les amorces PGK_F-BamHI et PGK_R-BglII. Le choix du

fragment sur le gène pgk répond à plusieurs critères essentiels. Tout d’abord, à la vue du

schéma d’intégration représenté pour le plasmide pGOT (figure 3.2B), l’absence de la partie

N-terminale du gène est impérative car, après intégration par simple recombinaison

homologue, sa présence pourrait reconstituer le gène fonctionnel lors de la recombinaison

avec la partie C-terminale du gène présent sur le chromosome. De plus, ce fragment doit être

d’une taille suffisante pour permettre la recombinaison chez S. citri, mais doit également être

limitée. En effet, lors de la recombinaison homologue, la région N-terminale du gène cible est

reconstituée, rendant éventuellement fonctionnel ce domaine protéique. De manière générale,

une longueur autour de 300 pb est préconisée chez S. citri.

Ce fragment est ensuite inséré au niveau du site BamHI de chacun des deux plasmides.

Ces derniers sont ensuite introduits dans E. coli par électroporation. L’intégration en « sens »

du fragment du gène pgk, indispensable pour que la recombinaison puisse avoir lieu, est

vérifiée à l’aide d’une double digestion enzymatique à l’aide des enzymes de restriction

pGOT

« sens

»

BamHI+

HindIII

pGOT

«antis

ens»

BamHI+

HindIII

MW

5090 4072

3054

2036

1636

1018

506

396 201

134

75

388

88

3022 2722

5054 5054 pGOT + PGK« sens »

pGOT + PGK« antisens »

14

1018 1636 2036 30544072 5090

506

1 13 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

pb

Figure 3.3: Vérification de l’intégration en « sens » du fragment interne du gène pgk dans le plasmide pGOT.

388 pb

Chapitre 3

82

BamHI et HindIII ( figure 3.3). Cette digestion permet de réaliser en une seule étape, la

sélection des clones ayant inséré le plasmide et de plus, l’ayant inséré dans le sens désiré. La

présence d’un fragment de taille de 388 pb indique le fragment est inséré en « sens ». En

revanche, la présence d’un fragment de 88 pb signifie que le fragment interne ∆pgk n’est pas

présent ou présent en « antisens ». Les clones 4, 6, 9, 11, 13 correspondent à des clones d’E.

coli qui ont correctement intégré le fragment du gène pgk (figure 3.3). La séquence du

fragment du gène pgk a été effectuée pour s’assurer qu’aucune mutation ne s’est insérée dans

la séquence.

2. Obtention et sélection des clones délétés dans le gène pgk

Après transformation, les transformants sont sélectionnés sur milieu SP4 additionné de

100 µg/ml de gentamycine (SP4 + gentamycine). Les colonies résistantes sont ensuite

repiquées en milieu SP4 liquide + gentamycine.

A partir du 5ème passage dans ce milieu, un passage étant considéré comme

l’ensemencement d'une culture de spiroplasmes au 1/10ème dans un milieu de culture frais, la

culture des clones est poursuivie en milieu SP4 additionné cette fois-ci de 5 µg/ml de

tétracycline (SP4 + tétracycline). Alors que la résistance à la gentamicine, sous la dépendance

du promoteur de la spiraline, est constitutive, le gène de résistance à la tétracycline, ne

possédant aucun promoteur en amont, ne s’exprimera donc que lorsque l’évènement

d’intégration aura eu lieu, à partir du promoteur du gène pgk situé dès lors en amont du gène

TetM permettant aux spiroplasmes de se multiplier dans un tel milieu.

Au cours de notre étude, six clones résistants à la tétracycline ont été sélectionnés. La

présence de plasmides libres dans l’ADN total des clones sélectionnés n’a pas été mise en

évidence suite aux hybridations entre l’ADN de chaque mutant et la sonde tetM ciblant le

gène de résistance à la tétracycline. Le fait que les spiroplasmes se multiplient sur un tel

milieu indique qu’un évènement de recombinaison a eu lieu chez chacun de ces clones et

qu’un promoteur se trouve en amont du gène de résistance à la tétracycline. Cependant, rien

n’atteste que cet évènement s’est produit au niveau du gène pgk. Chacun des clones est alors

testé par PCR afin de s’assurer de la disruption du gène de la PGK. La PCR est réalisée avec

deux amorces positionnées de part et d’autre du gène pgk (figure 3.4). Dans le cas où

l’évènement de recombinaison a eu lieu au niveau du gène pgk, l’intégration complète du

plasmide, d’une taille supérieure à 8 kpb, empêche toute amplification dans les conditions

expérimentales effectuées.

Figure 3.4: Présence du gène pgk entier chez les clones obtenus avec le plasmide pGOT.Amplification obtenue avec le couple d’amorce montrant qu’aucun des clones sélectionnés avec le plasmide pGOT ne présentent de disruption du gène pgk.

tet MO T T

pBSPs GentR

∆∆∆∆PGK

pGOT

PGK


tet MO T T

pBSPs GentR

∆∆∆∆PGK

pGOT

PGK


tet MO T T

pBSPs GentR

∆∆∆∆PGK

pGOT

PGK


1018

1636

30542036

506

960pb

pb

1 2 3 4 5 6 pG

OTH 2

O

1018

1636

30542036

506

960pb

pb

1 2 3 4 5 6 pG

OTH 2

O 1

pGOT

960 pb

7864 pb

chromosome

après intégration

Chapitre 3

83

Si le gène pgk n’est pas disrupté, un fragment PCR d’environ 960 pb est attendu

correspondant à la taille du fragment présent sur le chromosome. La présence de ce fragment

de 960 pb sur le gels d’agarose après amplification (figure 3.4), indique de manière claire

qu’aucun des clones sélectionnés (clones 1 à 6) ne présentent de disruption dans le gène pgk.

Suite à ces résultats, plusieurs autres transformations suivies des mêmes processus de

sélection ont été effectuées. L’absence de mutant dépourvu de PGK ne faisant aucun doute,

les efforts afin d’obtenir un tel mutant ont été abandonnés. L’impossibilité d’obtenir une

recombinaison au niveau du gène pgk laisse supposer que l’absence du gène pgk pourrait être

létale pour les spiroplasmes et de ce fait, même si la recombinaison au gène pgk a lieu, la

sélection de tels mutants est impossible.

Aucune de ces recombinaisons n’ayant eu lieu au niveau du gène pgk, la recherche des

sites d’intégrations du plasmide au niveau du chromosome a été réalisée identifiant ainsi les

gènes disruptés. Comme ces évènements de recombinaison ont eu lieu dans des régions

codantes, du fait de l’expression du gène de résistance à la tétracycline nécessitant un

promoteur en amont, il est intéressant, une fois les gènes identifiés, de tester les mutants

obtenus dans notre système expérimental de transmission afin d’isoler de nouveaux gènes

candidats.

3. Recherche du site d’intégration du pGOTpgk dans le chromosome de S. citri

Pour expliquer qu’aucun de ces clones ne provient d’un évènement de recombinaison

au gène cible, il faut envisager que cet évènement de recombinaison a bien eu lieu de façon

homologue mais a ciblé d’autres régions présentes sur le plasmide. En effet, hormis le

fragment du gène pgk, deux autres séquences sont présents à la fois sur le plasmide pGOTpgk

et sur le chromosome de S. citri pouvant expliquer un tel phénomène. C’est le cas de la

séquence du promoteur du gène de la spiraline présent en amont du gène de résistance à la

gentamycine et de l’origine de réplication OriC.

Il est également envisageable qu’une recombinaison illégitime ait eu lieu entre une

région du plasmide pGOTpgk et une région codante du chromosome.

O T T ∆∆∆∆PGK tet M PsGentR DnaNDnaA O

DnaA O DnaN 349pb

Intégration à l’Ori ?

T T∆∆∆∆PGKtet MPs GentR SpiralineProtéine X O Ps

Protéine X Ps Spiraline

Intégration dans le promoteur de la spiraline ?

8164pb

985pb

Figure 3.5: Recherche de l’intégration du plasmide pGOTpgk au niveau de l’origine de réplication de S. citri (A) ou au niveau du promoteur de la spiraline (B).

A

B

Si intégration

Chromosome

8164pb

Si intégration

Chromosome

1018

1636 2036

30544072 5090

506

pb

985pb

1 2 3 4 5 6 pG

OTH 2

O

1018

1636 2036

30544072 5090

506

pb

985pb

1 2 3 4 5 6 pG

OTH 2

O

8164pb 1018 1636 2036 30544072 5090

506

pb

1 2 3 4 5 6 MWpG

OTH 2

O

349pb

8164pb 1018 1636 2036 30544072 5090

506

pb

1 2 3 4 5 6 MWpG

OTH 2

O

349pb

Chapitre 3

84

3.1. Approche par PCR pour détecter une intégration au niveau de l’OriC ou du promoteur de la spiraline

Le choix des amorces de part et d’autre de l’OriC et du promoteur de la spiraline

permettent, après amplification, de préciser si une intégration a eu lieu à cet endroit. Lorsque

aucune intégration ne s’est produite à cet endroit sur le chromosome, la taille de l’amplicon

correspond, pour l’Ori, à 349 pb et pour le promoteur de la spiraline, à 985 pb. Si l’intégration

du plasmide pGOTpgk s’est produite dans l’une ou l’autre de ces régions, la taille de

l’amplicon doit correspondre à une taille supérieure à 8 kpb, soit la taille du plasmide

pGOTpgk linéarisé.

Les résultats obtenus avec les clones 1 à 6 pour la recherche de l’intégration par

simple recombinaison homologue au niveau de l’OriC (figure 3.5A) et du promoteur spiraline

(figure 3.5B) montrent qu’aucune de ces deux régions ne contient le site d’intégration du

plasmide. En effet, la taille de l’amplicon obtenue correspond à celle que l’on obtiendrait si on

amplifiait la même région à partir du chromosome.

3.2. Approche par PCR « aléatoire »

La recherche de l’évènement de recombinaison s’est alors poursuivie en ciblant, de

manière aléatoire, et toujours par approche PCR, la zone du plasmide à partir de laquelle ce

dernier s’est intégré dans le chromosome. Plusieurs zones ont donc été ciblées et sont

représentées sur la figure 3.6.

L’amplification EV13/Tet1R (figure 3.6A en orange) a permis de cibler la zone allant

du gène OriC jusqu’au gène TetM. Les clones 2, 3, 4, 5, et 6, qui ne présentent pas de produit

d’amplification, ont effectivement intégré le plasmide pGOT dans cette région. Le clone 1

quant à lui a intégré le plasmide à partir d’une autre région.

Le second couple d’amorces, pM-Bam/Tet1R, a permis de réduire cette région en

ciblant de manière préférentielle la zone comprenant le fragment interne pgk ainsi que la

partie N-terminale du gène tetM pour l’ensemble de ces cinq clones (figure 3.6A en orange).

Ces clones étant sélectionnés sur milieu additionné de tétracycline, il est peu probable que

l’intégration ait eu lieu au niveau du gène de résistance à cet antibiotique. Il semblerait alors

que, pour chacun de ces clones, l’évènement de recombinaison illégitime se soit déroulé au

niveau du fragment interne ∆pgk.

Pour tester cette hypothèse deux nouveaux couples d’amorces ont été testés.

L’amplification négative obtenue avec les amorces LG1/PGK6 pour les clones 3 et 6

tet MO T T

pBSPs GentR

∆∆∆∆PGK

pGOT

tet MT T ∆∆∆∆PGKO

T T ∆∆∆∆PGKO

T ∆∆∆∆PGK tet M

EV13

Tet1R

pM-Bam

LG1

PGK6

PGK3

Tet1R

O T T∆∆∆∆PGK tet M PsGentR Cter XNter X ∆∆∆∆PGK

O T Ttet M PsGentR Cter XNter X ∆∆∆∆PGK

O T Ttet M PsGentR Cter XNter X ∆∆∆∆PGK Clones 3 et 6

Clones 5

Clones 2 et 4

Figure 3.6: Recherche de l’intégration du plasmide pGOTpgk dans le chromosome de S. citri.A: Approche PCR permettant de rechercher la région sur le plasmide pGOTpgk au sein de laquelle le plasmide s’est linéarisé afin

de s’intégrer dans le chromosome de S. citri. B: Identification de trois schémas d’intégration possibles pour cinq des six clones.

A

B

1 2 3 4 5 6

EV13/Tet1R + - - - - - +

pM-Bam/Tet1R - - - - - - +

LG1/PGK6 + + - + + - +

PGK3/Tet1R + + + + - + +

ClonespGOTAmorces

EV13 pM-Bam

pM-Bam

pM-Bam

EV13

EV13

Tet1R

Tet1R

Tet1R

LG1

LG1

LG1

PGK3

PGK3

PGK3

Chapitre 3

85

permettent de conclure que ces deux clones ont intégré le plasmide dans les premiers

nucléotides du fragment pgk (figure 3.6A en jaune). De même, l’absence d’amplification

pour le clones 5 avec le couple d’amorces PGK3/Tet1R permet de localiser la linéarisation du

plasmide pGOTpgk en vue de son intégration dans les derniers nucléotides de ce même

fragment cible (figure 3.6A en bleu). Par déduction, l’intégration pour les deux clones

restants, à savoir les clones 2 et 4, s’est produite par linéarisation du plasmide au milieu du

gène ∆pgk sans aucun détail supplémentaire.

Ces résultats permettent de montrer que le plasmide s’est linéarisé de façon aléatoire

au niveau du gène cible pgk afin de s’intégrer de façon illégitime dans le chromosome du

spiroplasme selon trois schémas différents (figure 3.6B).

4. Identification des gènes dans le chromosome de S. citri ayant subi l’intégration

Comme nous l’avons vu précédemment (figure 3.6B), les trois schémas d’intégration,

déduits de l’approche par PCR « aléatoire », montrent que le gène ayant subi l’intégration du

plasmide pGOTpgk est, dans tous les cas et quel qu’il soit, placé à proximité du gène de

résistance à la tétracycline (tetM). Ce gène a donc été utilisé pour le design des amorces

nécessaires à la réalisation des PCR au cours d’une technique de marche sur le chromosome.

Deux enzymes différentes ont été testées au cours de cette technique, à savoir les

endonucléases HincII et SmaI. Le choix de ces endonucléases est soumis à plusieurs règles

qui sont détaillées dans le chapitre Matériels et Méthodes. Les amorces sélectionnées sont

positionées sur les fragments théoriques obtenus après digestion par les endonucléases (figure

3.7A). Une première amplification avec les amorces AP1 et Tet1R est réalisée suivie d’une

seconde amplification interne avec le couple d’amorces AP2/Tet7.

Aucun fragment d’amplification n’a pu être obtenu lors des digestions avec SmaI.

La digestion avec l’enzyme HincII, suivie des deux amplifications PCR, a permis

d’obtenir un fragment lors de cette seconde amplification avec chacun des clones testés

(figure 3.7B). Ces fragments, de taille variant entre 300 pb et 800 pb ont été envoyés à

séquencer.

Le tableau 3.8A présente les résultats obtenus pour ces quatre mutants étudiés. Ces

résultats montrent que, pour les clones 3 et 4, le plasmide s’est intégré dans un gène codant la

protéine hypothétique SPICI 11_005 tandis que pour les clones 5 et 6, le plasmide s’est

intégré dans un gène codant une seconde protéine hypothétique SPICI 14_001.

Figure 3.7: Approche par marche sur le chromosome pour l’identification des gènes disruptéspar recombinaison illégitime.A: Choix des amorces en fonction des deux types d’intégration précédemment déduits. B: Amplifications AP2/Tet7 au cours de la PCR niché pour chacun des quatre clones testés.

AP2AP1

Tet1RTet7

A

B

1018

1636 2036

3054

506

pb

3 4 5 6

400pb500pb800pb

S SS S HHH H

1018

1636 2036

3054

506

pb

3 4 5 6

400pb500pb800pb

S SS S HHH HH

O T T∆∆∆∆PGK tet M PsGentR Cter XNter X ∆∆∆∆PGK

O T Ttet M PsGentR Cter XNter X ∆∆∆∆PGK

AP2AP1

Tet1RTet7

Chapitre 3

86

Les schémas d’intégration pour ces quatre mutants ont pu être déduits des séquences obtenues

(figure 3.8B). Ils montrent que même si le plasmide pGOTpgk s’est intégré dans seulement

deux gènes au cours de l’évènement de recombinaison chez ces quatre mutants, l’intégration

ne s’est pas produite au même endroit dans ces gènes. Par exemple, pour le mutant 4,

l’intégration du plasmide s’est produite au niveau du nucléotide 105 du gène spici11_005. Le

plasmide s’est linéarisé au niveau du nucléotide 257 du gène pgk présent dans le pGOTpgk

donnant ainsi le schéma d’intégration décrit (figure 3.8B).

III. Discussion et conclusion

La plupart des systèmes de recombinaison décrits chez E. coli nécessite le produit du

gène recA (Kowalczykowski et al., 1994). La découverte, en 1995, d’un gène recA tronqué

chez S. citri ne facilite pas l’obtention de mutants (Marais et al., 1996). En effet, la fréquence

d’évènements de recombinaison homologue est très fortement diminuée chez un mutant

dépourvu de gène recA (Miller & Kokjohn, 1990). Chez le spiroplasme, seuls les 390

premiers nucléotides de la partie N-terminale de ce gène sont présents (Marais et al., 1996).

Malgré cela, l’utilisation du plasmide navette pGOT a permis l’obtention de mutants de S.

citri, comme le mutant GII3-gt1, disrupté au niveau du gène crr codant pour un composant

d’un système phosphotransferase (PTS)-glucose (Duret et al., 2005).

Dans le cadre de ce travail de thèse, l’obtention d’un mutant de S. citri dépourvu de

PGK a été mise en oeuvre. Cependant aucun clone dont le gène pgk a été tronqué n’a pu être

sélectionné sur un milieu sélectif spécifique Il semblerait que la présence du produit du gène

pgk soit essentielle à la survie de S. citri, contrairement à Candidatus Phytoplasma mali

souche AT, qui ne semble pas être dépendant de la voie glycolytique pour sa survie (Kube et

al., 2008). Bien que cette fonction essentielle de la PGK pour le spiroplasme ne soit pas

inattendue, la présence de voies métaboliques parallèles, capable de générer le produit final de

la glycolyse, laissait présager une fin plus favorable. Ce sentiment est renforcé par la mise en

évidence récente que la fonction de la PGK ne semble également pas essentielle à la survie de

Brucella abortus. En effet, un mutant ∆PGK de cette bactérie semble parfaitement viable

mais, de manière intéressante, semble être néanmoins affecté dans sa pathogénicité (Trant et

al., 2010).

∆∆∆∆PGK tet M

hp spici11_005

∆∆∆∆PGK tet Mhp

336

63103

10363

Figure 3.8: Identification des gènes disruptés grâce à l’utilisation du plasmide pGOT.A: Tableau récapitulatif des différents gènes identifiés pour les quatre clones étudiés.B: Schémas d’intégration déduits des séquences obtenues après la seconde amplification AP2/Tet7.

Mutant 3

A

B


hp spici11_005

tet Mhp

336

257105

105257

Mutant 4


hp spici14_001

∆∆∆∆PGKtet Mhp

36 336

33087

Mutant 5


hp spici14_001

∆∆∆∆PGK tet Mhp

336

14487

Mutant 6

hp hp631 25736

36103

1201

120330105

1

1

330 120

120

871

1 261

1 36 330

hp261

8736 144

hp261

87

1

1 14487

261

330

36

3636

MutantsProtéineidentifiée

Région d'identité

sur la protéineE value

Mutant 3hp spici11_005

PGKTetM

1-103 nt63-336 nt1-26 nt

2e-44

6e-64

2e-16


PGKTetM

11-105 nt257-336 nt

1-75 nt

1e-42

5e-36

6e-65


TetM56-87 nt1-72 nt

0,06

4e-62


PGKTetM

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AP1

Tet7


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AP1

Tet7

Chapitre 3

87

Cependant, quatre mutants délétés au niveau d’autres gènes ont été obtenus. Les deux

gènes identifiés au cours de cette étude codent deux protéines hypothétiques de 40 acides

aminés pour la protéine hypothétique SPICI 11_005 appartenant à la famille P4 de S. citri et

de 87 acides aminés pour la protéine SPICI 14_001. Aucune fonction, ainsi qu’aucune

structure particulière sur leur séquence, n’a été attribuée à ce jour à ces deux protéines. Le fait

que ces clones indépendants aient subi une recombinaison entre un des deux gènes de ces

protéines et le fragment interne pgk suggère qu’une région de forte identité nucléotidique doit

être présente sur chacun de ces fragments. De manière surprenante, la comparaison de la

séquence de ces deux gènes avec la séquence du fragment interne pgk n’a pas permis

d’identifier de régions conservées (résultats non montrés). Aucune autre donnée pouvant

expliquer ce phénomène n’est disponible à ce jour.

Chapitre 4

Figure 4.1: Schéma représentant la localisation des principales adhésines et protéines accessoires, associées entre elles, impliquées dans la formation du « tip » de Mycoplasma pneumoniae.D’après Rottem et al., 2003.

Chapitre 4

88

Étude préliminaire de complexes protéiques impliqués dans la

transmission de S.citri par l’insecte vecteur

I. Introduction et objectifs D’après les résultats des far Western, seulement deux protéines de S. citri ont été

identifiées comme interagissant avec les protéines de la cicadelle vectrice C. haematoceps : la

spiraline (Killiny et al., 2005) et la phosphoglycérate kinase (Labroussaa et al., 2010). La

spiraline, protéine majoritaire de la surface du spiroplasme, en plus de son implication au

cours de la transmission (Duret et al., 2003), interagit avec deux glycoprotéines de 50 et 60

kDa de l'insecte vecteur C. haematoceps. La PGK, quant à elle, se lie à l'actine ce qui lui

permet d'intervenir dans l'internalisation de S. citri dans les cellules en culture Ciha-1 et, par

voie de conséquence, dans la transmission. D'autres protéines ont été identifiées jouant

également un rôle dans la transmission du spiroplasme mais une interaction entre ces

protéines et celles de l'insecte vecteur n'est pas à ce jour démontrée. La protéine Sc76,

caractérisée comme une « Solute Binding Protein » (SBP) d'un ABC transporteur de glucose

(Boutareaud et al., 2004) est essentielle au spiroplasme pour être transmis aussi efficacement

que la souche sauvage GII3. Les protéines ScARPs et P32 ne sont pas essentielles lors de la

transmission mais contribuent en grande partie à la réalisation de celle-ci (Breton et al., 2010).

La plupart des protéines, prenant part à un processus cellulaire quel qu’il soit,

n'interviennent jamais de façon isolée pour assurer leur fonction. Il est admis que les

processus biochimiques soient réalisés et régulés par des complexes protéiques (Alberts,

1998) tout comme du reste dans la plupart des processus bactériens.

L’étude complète du protéome de Mycoplasma pneumoniae a permis d’énumérer de

façon exhaustive, et en tenant compte de résultats expérimentaux, toutes les fonctions

accomplies par des complexes multi-protéiques chez ce mollicute (Kuhner et al., 2009). Ces

complexes protéiques peuvent intervenir dans de nombreux processus cellulaires (traduction,

transcription, voies métaboliques, etc …) mais également dans les mécanismes de

pathogénicité ou bien d’invasion cellulaire. Lors de l’attachement aux cellules épithéliales de

son hôte, la mise en place d'une structure particulière, appelé « tip » lui permet d’adhérer

spécifiquement aux tissus appropriés jusqu’à l’établissement de son infection (Rottem, 2003).

Cette structure, contenant de nombreuses adhésines comme les protéines P1 et P30, et de

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4.2

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Chapitre 4

89

nombreuses protéines accessoires, comme les protéines High Molecular Weight (HMW) 1 à 3

ou encore les protéines P40 et P90 (figure 4.1), suggère des mécanismes de régulation

avancés et coordonnés, nécessitant de nombreuses interactions protéiques, intervenant dans un

remodelage de la membrane bactérienne. Les protéines accessoires sont au cœur de ce

remodelage et agissent pour permettre la stabilisation de ce « tip » (Seybert et al., 2006;

Kuhner et al., 2009). Plus récemment, un nouvel exemple est venu de la description, chez

Mycoplasma mobile, d’une protubérance à la surface du mollicute, non pas impliquée dans

l’adhérence de la bactérie, mais dans son « gliding » lui permettant de se mouvoir. Cette

structure, composée d’une dizaine de protéines rappelant le corps d’une méduse (« jellyfish »

structure), est un modèle supplémentaire de mécanismes multi-protéiques régulant des

fonctions importantes (Nakane & Miyata, 2007).

De nombreuses approches biochimiques, biophysiques, génétiques et informatiques

sont mises en œuvres pour mesurer qualitativement ou quantitativement les interactions

protéiques in vitro ou in vivo, visualiser ces interactions dans les compartiments cellulaires,

caractériser les interfaces d’interaction entre protéines et, bien évidemment, identifier les

protéines partenaires impliquées (Phizicky & Fields, 1995). Le tableau 4.2 présente les

principales techniques utilisées pour les études d’interaction protéine-protéine avec leurs

avantages et leurs inconvénients.

Chez S. citri, la technique privilégiée pour l'étude des interactions protéine-protéine

demeure la technique de far Western (Killiny et al., 2005; Labroussaa et al., 2010). Elle ne

nécessite pas d'expression hétérologue de protéines ce qui est un avantage considérable

connaissant l'inconvénient majeur amené par l'utilisation du codon UGA comme codon

tryptophane chez le spiroplasme. La technique de double-hybride, nécessitant l'utilisation de

protéines exprimées chez la levure, a cependant été utilisée lors de l'étude ciblée de la

caractérisation d'enzymes perméases impliquées dans le transport des sucres chez S. citri

(Andre et al., 2003). Néanmoins, ces deux techniques ne permettent pas de mettre en évidence

des complexes multi-protéiques.

Aucune des études menées jusqu'à présent n'a permis d'identifier de protéines

réduisant totalement, par leur absence, la transmission de S. citri par son insecte vecteur. Chez

le spiroplasme, les protéines candidates impliquées dans la transmission pourraient alors

intervenir en complexes pour assurer leurs fonctions en interagissent entre-elles ou avec des

protéines encore non identifiées. L’absence ou l’inhibition de la fonction de l’une de ces

Chapitre 4

90

protéines n'abolirait pas le processus de transmission qui alors, bien qu’imparfait, permettrait

à S. citri d’assurer son cycle dans l’insecte vecteur.

Des méthodes d'analyses dédiées à l'identification de complexes impliqués dans la

transmission de S. citri ont été mises au point et font l'objet de ce chapitre qui se compose de

deux parties.

La première partie correspond à la mise au point de la technique de Blue Native-

PAGE (BN-PAGE) et à la mise en évidence de complexes dans lesquels seraient impliquées

les protéines susceptibles de jouer un rôle dans la transmission (spiraline, ScARPs, P32,

Sc76).

La seconde partie sera consacrée plus particulièrement aux complexes protéiques faisant

intervenir la PGK. Le pontage des sous-unités protéiques formant ces complexes, effectué par

l'ajout d'un agent pontant, a permis l'identification de plusieurs complexes dont la composition

sera discutée.


1. Recherche de complexes par la technique de BN-PAGE chez S. citri. La technique de Two-Dimensional Blue Native/Sodium Dodecyl Sulphate

Polyacrylamide Gel Electrophoresis (2-D BN/SDS-PAGE) a été initialement mise au point

pour l’étude en conditions natives des complexes membranaires de mitochondries (Schagger

& von Jagow, 1991). Son utilisation a également permis d’étudier les complexes

membranaires de chloroplastes (Neff & Dencher, 1999), d’une cyanobactérie (Herranen et al.,

2004) ainsi que l’enveloppe cellulaire d’E. coli (Stenberg et al., 2005). Par la suite, la

technique de BN-PAGE a été modifiée pour permettre l’étude du complexome total de

cellules eucaryotes (Camacho-Carvajal et al., 2004; Claeys et al., 2005) et de bactéries telles

qu’E. coli (Lasserre et al., 2006) et H. pylori (Pyndiah et al., 2007; Bernarde et al., 2010).

Cette technique, dont le principe est détaillé au chapitre Matériels et Méthodes, permet

la solubilisation et l’enrichissement de complexes protéiques en vue de leurs migrations en

conditions non dénaturantes. Elle permet d'attribuer une masse moléculaire aux complexes

identifiés ainsi qu'aux sous-unités protéiques les composant lors de la seconde électrophorèse

en conditions dénaturantes. De plus, elle possède l’avantage de séparer ces sous-unités dans

leur état natif laissant la possibilité de caractériser leur activité enzymatique si nécessaire.

1% 500mM

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Figure 4.3: Analyse en conditions non-dénaturantes des complexes membranaires de S. citri par BN-PAGE. A: Effets du n-dodecyl-β-D maltoside et de l’acide aminicaproïque au cours de la préparation des complexes membranaires chez S. citri.B: Mise en évidence de complexes membranaires chez S. citri au cours d’une seconde expérience indépendante réalisée avec les conditions optimales d’extraction des complexes membranaires (1% n-dodecyl-β-D-maltoside; 500mM acide aminocaproïque).

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Chapitre 4

91

Le BN-PAGE présente cependant des inconvénients. Dans un premier temps,

l’enrichissement des complexes protéiques membranaires chez un organisme nécessite, pour

leur solubilisation, l’utilisation de détergents de type non-ionique. Cette extraction pose

parfois des problèmes en fonction de la nature des complexes et des détergents utilisés

(Kügler et al., 1997). La préparation de ces échantillons est un élément pouvant faire parfois

varier la stabilité des complexes et modifier la stœchiométrie des interactions. Par ailleurs, la

méthode de détection utilisée par cette technique, basée sur la coloration des gels obtenus,

peut être limitante dans la mesure où certains complexes, présents en faible quantité, peuvent

ne pas être détectés.

Toutefois, cette technique présente des résultats en accord avec ceux obtenus par

d’autres techniques. En effet, l’étude du complexe membranaire de E. coli réalisée par cette

technique (Lasserre et al., 2006) a révélé 306 complexes cytosoliques et membranaires. Parmi

ceux-ci, certains déjà connus ont permis de valider la technologie tandis que 109 nouveaux

complexes ont été identifiés, faisant de la technique de BN-PAGE l’une des techniques les

plus efficaces pour étudier le complexome total d’une bactérie.

En ce qui nous concerne, le but de l’étude n’était pas de réaliser le complexome total

de S. citri et d’identifier ainsi toutes les protéines associées en complexe chez le spiroplasme,

mais plutôt de mettre en évidence les complexes impliquant plus spécifiquement les protéines,

précédemment identifiées au laboratoire, comme protéines candidates pour jouer un rôle dans

la transmission. Pour cela, un western blot a été ajouté après l’électrophorèse en conditions

dénaturantes. Cette étape nécessite donc le transfert de cette deuxième électrophorèse sur

membrane de nitrocellulose et l’incubation de cette membrane avec des anticorps spécifiques

de ces différentes protéines.

1.1. Extraction et analyse des complexes membranaires.

Dans un premier temps, cette technique de BN-PAGE a uniquement été mise au point

pour l’extraction des complexes membranaires du spiroplasme. En effet, hormis la protéine

P32, l’ensemble des protéines candidates, que ce soit la spiraline, les ScARPs ou la Sc76, ont

été identifiées comme des protéines membranaires chez S. citri.

Plusieurs protocoles, utilisés au cours de différentes études, ont été testés pour cette

extraction (Lasserre et al., 2006; Swamy et al., 2006; Pyndiah et al., 2007; Schamel, 2008).

Le protocole utilisé est décrit dans le chapitre Matériel et Méthodes. Un seul détergent, le n-

dodecyl-β-D-maltoside, a été utilisé pour l’extraction des complexes. Ce détergent est devenu,

1% 500mM

1% 750mM 75

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kDa

Figure 4.4: Analyse en conditions dénaturantes des complexes membranaires de S. citri par BN-PAGE au cours de la seconde dimension.

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Chapitre 4

92

au cours des nombreuses et plus récentes études en BN-PAGE, le détergent permettant les

meilleures extractions et la meilleure résolution des différents complexes protéiques lors de

l’électrophorèse non dénaturante. Un second facteur variable est celui concernant la

concentration en acide aminocaproïque, un sel de faible force ionique. Ce dernier, ajouté dans

le tampon de lyse après le lavage des protéines du spiroplasme permet d’améliorer le

processus de solubilisation des complexes membranaires.

Les résultats obtenus au cours de cette première dimension sont représentés sur la

figure 4.3. L’augmentation de la concentration en n-dodecyl-β-D-maltoside ne semble pas

améliorer l’extraction de complexes membranaires chez S. citri. L’augmentation de la

concentration en n-dodecyl-β-D-maltoside, en plus de ne pas permettre l’extraction de

complexes supplémentaires, engendre un phénomène de diffusion dû à une quantité excessive

de détergent. De plus, les variations dans la concentration de l’acide aminocaproïque ne

semblent pas avoir un effet sur la solubilisation de ces complexes (figure 4.3A). Dès la

première concentration testée, soit 1 % de n-dodecyl-β-D-maltoside, associée à une

concentration de 500 mM d’acide aminocaproïque, les profils protéiques, obtenus pour deux

expériences indépendantes, montrent la présence de 12 complexes membranaires de taille

variant d’environ 550 kDa à environ 70 kDa sur le profil mieux résolus de la seconde

expérience (figure 4.3B).

Les bandes de gels correspondantes aux quatre premières conditions d’extraction sont

ensuite transférées en haut d’un gel SDS-PAGE afin de déterminer le profil protéique des

sous-unités de ces complexes (figure 4.4). Quelque soit la condition utilisée lors de la

première dimension, les profils obtenus au cours de cette seconde dimension sont relativement

semblables mais difficilement interprétables. Très peu de protéines sont individualisées et de

nombreuses stries horizontales présentes sur l’ensemble des gels viennent perturber l’analyse

de cette seconde dimension. Seules quatre à cinq sous-unités sont visibles sur cette seconde

électrophorèse et, de plus, aucune ne semble faire partie d'un même complexe (figure 4.4,

carrés blancs).

Aux vues de ces résultats, aucun western blot n'a été effectué.

1.2. Extraction et analyse des complexes cytosoliques.

Bien que prédite comme étant associée à la membrane du spiroplasme, la protéine

candidate P32 se retrouve préférentiellement dans la fraction cytosolique lors de l'extraction

669

232

140

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kDa

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100

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150 250

Identification par LC-MS/MS

EF-Tu

A

B C

Figure 4.5: Analyse des complexes cytosoliques de S. citri impliquant la P32 par BN-PAGE. A: Analyse en conditions non-dénaturantes identifiant plusieurs complexes. Piste 1: 50µg de préparation protéique. Piste 2: 100 µg de préparation protéique. B: Analyse en conditions dénaturantes sur gel SDS-PAGE. C: Western-blot réalisé avec l’anticorps anti-P32.

21

Chapitre 4

93

des protéines de S. citri (Killiny et al., 2006). Afin de caractériser les protéines associées en

complexes avec la P32, un BN-PAGE réalisé avec les protéines cytosoliques de S. citri a été

effectué. Le protocole utilisé pour l'extraction de cette fraction protéique est également basé

sur celui décrit pour la détermination des complexes cytoplasmiques chez H. pylori (Pyndiah

et al., 2007).

Les deux profils (figure 4.5A, pistes 1 et 2), réalisés en conditions non-dénaturantes avec

deux concentrations différentes d'une même préparation cytosolique (50 µg et 100 µg

respectivement pour les pistes 1 et 2), permettent d’identifier, avec une bonne résolution, huit

complexes protéiques de masses moléculaires variant d’environ 700 à 100 kDa (figure 4.5A).

Le profil obtenu lors de l’électrophorèse en SDS-PAGE, selon la seconde dimension, permet

de visualiser quelques protéines individualisées (figure 4.5B). Cependant, ce profil ne semble

pas représenter de façon exhaustive le complexome cytosolique de S. citri. En effet, trop peu

de spots sont présents pour pouvoir refléter la totalité des protéines cytoplasmiques du

spiroplasme.

Néanmoins, un western blot (figure 4.5C) a été réalisé avec l’anticorps mono-

spécifique dirigé contre la protéine P32 obtenu par l’injection à un lapin d'un spot de gel 2-D

contenant cette protéine. Quatre spots ont été révélés laissant présager la présence de la

protéine candidate. Les masses moléculaires de ces protéines, repérées sur le gel SDS-PAGE

correspondant et réagissant avec l’anticorps, sont voisines de 50 kDa pour trois d'entre elles.

Or, cette masse moléculaire n’est absolument pas en accord avec celle de la protéine P32

proche de 32 kDa. La quatrième, plus proche de la masse moléculaire appropriée se trouve

néanmoins dans une région du gel peu exploitable. L’analyse en spectrométrie de masse de

ces protéines n’a identifié la P32 dans aucune de ces zones de gel analysées signifiant que les

signaux, identifiés au cours du western blot, correspondent à des marquages non spécifiques.

La protéine reconnue par l’anticorps est EF-Tu.

En résumé, cette technique de BN-PAGE, utilisée pour l’identification des complexes

protéiques chez un grand nombre d’organismes, n’a pas permis, au cours de notre étude, de

mettre en évidence des complexes faisant intervenir des protéines préalablement impliquées

dans la transmission de S. citri. En effet, que ce soit les expériences réalisées avec les

protéines membranaires, censées identifier des complexes auxquels appartiendraient la

spiraline, la Sc76 ou encore les ScARPs, ou celles réalisées avec les protéines cytosoliques

concernant des complexes liés à la protéine P32, aucune n’a donné de résultats exploitables.

Figure 4.6: Protocole détaillé pour l’étude de complexes protéiques impliquant la PGK grâce à l’utilisation d’un agent pontant, le DSP.Cercles marrons: incubation des différentes fractions de S. citri avec la His6-PGK et le DSS. Cercles verts: Contrôles = élution des protéines non pontées sur colonne de nickel. Cercles rouges: Elutions des protéines pontées sur colonne de nickel.

+ His6-PGK

Elution de la solution protéique sur colonne de nickel

Protéines totales Protéines membranaires+ His6-PGK

+ His6-PGK

+ His6-PGK + His6-PGK

+ His6-PGK

+ DSS+ DSS

+ DSP

- DSP

+ DSP

- DSP

Mélange1Mélange2

Protéines membranaires

Protéines membranaires

Protéines totales

Protéines totales

Mélange6

Mélange5Mélange4

Mélange3

Chapitre 4

94

2. Recherche chez S. citri des complexes impliquant la PGK

Vu l’absence de résultats concernant l'identification de protéines candidates associées

en complexes par la technique de BN-PAGE, la recherche des complexes impliquant des

protéines liées au processus de transmission du spiroplasme, a été recentrée sur la PGK et ses

partenaires chez le spiroplasme en utilisant la technique de «cross-linking».

Cette technique consiste de manière générale à établir un lien covalent entre les

protéines figurant dans un complexe puis à les séparer sur gel SDS-PAGE et enfin, à analyser

les peptides obtenus par spectrométrie de masse. Une large gamme d'agents pontants permet

de former des liens de tailles définies entre les sous-unités protéiques d'un complexe allant de

un à quelques dizaines d’angström. Cette différence de longueur permet d’estimer la distance

entre deux résidus acides aminés et ainsi de dessiner une carte d’interaction entre deux

protéines. Selon l'agent pontant utilisé, les protéines peuvent être pontées par des acides

aminés réactifs spécifiques, comme des résidus lysines ou cystéines, présents à leurs surfaces

en quantités suffisantes et bien répartis dans la zone d’interaction. De plus, d’autres

caractéristiques, telles que leur perméabilité membranaire et leur caractère clivable,

permettent la sélection spécifique d’un agent pontant en lien avec les besoins de l’utilisateur.

La recherche, sans a priori, des complexes multi-protéiques impliquant la PGK chez le

spiroplasme a permis l'utilisation du disuccinimidylsubérate (DSS), un agent pontant

communément employé dans ce type d'étude. Par la suite, l'identification des sous-unités de

ces complexes a nécessité l'utilisation d'un second agent pontant, le

dithobis(succimidylpropionate) (DSP), présentant les mêmes caractéristiques que le DSS, à

l'exception du fait que les interactions pontées sont clivables par le SDS lors de

l'électrophorèse.

La figure 4.6 présente le schéma du protocole expérimental mis au point au cours de

cette étude. Les préparations protéiques, ainsi que le protocole détaillé mis en œuvre, sont

décrits dans le chapitre Matériels et Méthodes.

La recherche des partenaires de la PGK chez S. citri s’est donc déroulée en plusieurs

étapes. Pour l'identification des complexes, la PGK recombinante tagguée his6 est incubée en

présence de protéines totales de S. citri (figure 4.6, mélange 1) ou de protéines membranaires

(figure 4.6, mélange 2), en présence du DSS, agent pontant insensible au clivage par le SDS.

Les protéines qui constituent les complexes protéiques sont pontées par des liaisons

covalentes fortes. Mais le but n’étant pas de réaliser le complexome du spiroplasme, une étape

de sélection des complexes renfermant la PGK était donc nécessaire. De ce fait, chaque

Figure 4.7: Complexes impliquant la PGK chez S. citri pontés par le DSS et le DSP.Western blot réalisé avec sur la fraction des protéines totales (T) ou membranaires (M) de S. citri révélé avec l’anticorps anti-histidine permettant de visualisert les complexes « entiers » comprenant la PGK.* His6-PGK

Méla

nge

1

DSS DSP

250150100

75

50

37

25

20

15

*

Méla

nge

2 Méla

nge

4 Méla

nge

5

Chapitre 4

95

mélange (1 et 2) a été élué sur une colonne de nickel afin de retenir spécifiquement, grâce à

l’affinité de la séquence His6, les complexes dans lesquels la PGK était présente. Ces

complexes sont ensuite révélés spécifiquement avec l’anticorps anti-histidine (Sigma) sur gel

SDS-PAGE (figure 4.7, méalnge 1 et 2 DSS). Pour la fraction des protéines totales de S. citri

(mélange 1), au minimum cinq complexes spécifiques de la PGK sont observés d'une masse

moléculaire variant de 75 kDa à plus de 250 kDa tandis que, pour la fraction membranaire

(mélange 2), deux complexes sont obtenus de masses moléculaires aux environs de 250 kDa.

L’évaluation de la masse moléculaire et du nombre de complexes est difficile car ce gel ne

permet pas la résolution optimale de ces complexes de haut poids moléculaire, supérieurs à

250 kDa. La présence de la His6-PGK ajoutée lors de l’incubation des protéines est également

visualisée (figure 4.7, étoile). En revanche, le même western blot réalisé, en contrôle, avec

ces deux mêmes fractions protéines pontées par le DSP (figure 4.6, mélanges 4 et 5), clivable

par le SDS, révèle uniquement la présence de la His6-PGK comme attendu (figure 4.7) ; les

autres protéines, dissociées au cours de l’électrophorèse en conditions dénaturantes, n’étant

pas reconnues par l’anticorps anti-histidine.

Par la suite, l'identification des sous-unités associées au sein de ces complexes a été

entreprise. Les deux mêmes fractions protéiques que celles utilisées lors de l'analyse des

complexes « entiers » ont été incubées en présence de la PGK tagguée His6 et du DSP (figure

4.6, mélanges 4 et 5). Le contrôle négatif de l'expérience est constitué des protéines non

pontées et éluées sur une colonne de nickel afin de déterminer la rétention non-spécifique des

protéines de spiroplasme au cours de la purification (figure 4.6, mélanges 3 et 6). Ces

complexes sont ensuite dissociés au cours de l'analyse sur le gel de polyacrylamide, l’agent

pontant étant sensible au clivage par le SDS.

Les résultats obtenus au cours de cette seconde étude sont représentés sur la figure

4.8.

Sur la figure 4.8A, les profils obtenus avec les préparations protéiques totales et

membranaires révèlent que très peu de protéines sont retenues de façon non spécifiques sur la

colonne de nickel en l’absence d’agent pontant (mélanges 3 et 6). Deux bandes majoritaires

sont présentes de masses moléculaires proches de 25 et 44 kDa correspondant sans aucun

doute à la spiraline et à la PGK recombinante. La spiraline est la protéine majoritaire de la

surface du spiroplasme et est connue pour contaminer de nombreuses préparations protéiques.

La présence sur ces contrôles de la PGK tagguée His6, retenue sur la colonne de nickel de

façon indépendante à la présence d’agent pontant, n'est pas surprenante.

1234

5

6

7891011

121314

1516171819202122

25

20

15

37

50

75100

150

kDa

25

20

15

37

50

75100

150

kDa

25

20

15

37

50

75100

kDa

10

25

20

15

37

50

75

100

150

1 2 3 4 5 116 7 8 9 10

23

Figure 4.8: Etudes des sous-unités des complexes impliquant la PGK.A: Contrôles réalisés avec les fractions totales et membranaires après passage sur colonne de nickel. Pistes 1à 3, lavages en 0, 25 M imidazole; Pistes 4 à 6: lavages en 0, 5 M imidazole.B: Elution des différentes fractions protéiques après pontage par le DSP des protéines totales et membranaires du spiroplasme. Pistes 1 et 2: fractions non retenues; Pistes 3 à 5: 3 derniers lavages triton X-100; Pistes 6 à 8: lavages en 0, 25 M imidazole; Pistes 9 à 11: lavages en 0,5 M imidazole.

A

B

Mélange 4

Mélange 5

3 : Protéines totales

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

6 : Protéines membranaires

Chapitre 4

96

Les profils obtenus avec les mélanges 4 et 5 (figure 4.8B) révèlent la présence de

nombreuses bandes sur les gels de polyacrylamide. En ce qui concerne les protéines totales

(mélange 4), 14 bandes, de masses moléculaires variant d'environ 75 kDa à 10 kDa, sont

observées. En parallèle, neuf bandes, numérotées de 15 à 23, sont observées sur le gel de

purification réalisé avec la fraction membranaire (mélange 5) de S. citri.

Les résultats de l’analyse réalisée par LC-MS/MS des bandes de gels numérotées de 1

à 23 sont présentés en Annexe 1. Chaque protéine présente dans ce tableau, extraite des

tableaux de résultats bruts obtenus lors de cette analyse en spectrométrie de masse, a été

validée manuellement en fonction de sa masse moléculaire, du nombre de scans et de peptides

différents retrouvés qui ont permis son identification. De manière systématique, une protéine

ne présentant pas une masse moléculaire proche de la zone de gel dans laquelle la bande a été

découpée, a été éliminée. De même, les protéines identifiées pour lesquelles le nombre de

scans est inférieur ou équivalent à trois n’ont pas été prises en compte.

2.1. Protéines associées à la PGK dans des complexes connus

Dans un premier temps, la recherche des protéines associées à la PGK dans des

complexes déjà connus chez d'autres organismes a été effectuée. Chez Mycoplasma

pneumoniae, pour assurer sa fonction dans la glycolyse, la PGK est associée avec d’autres

protéines, elles aussi impliquées dans cette voie métabolique (Kuhner et al., 2009). Chez E.

coli, elle a été retrouvée associée, dans la fraction membranaire, avec une protéine USG1 de

fonction inconnue (Lasserre et al., 2006) tandis que, chez Thermotoga maritima, elle interagit

avec une triosephosphate isomérase (Schurig et al., 1995) sans que les fonctions de ces

interactions n’aient été révélées à ce jour.

Le tableau 4.9 donne la composition de deux complexes impliquant la PGK chez M.

pneumoniae: le premier associé à sa fonction dans la glycolyse et le second dans un complexe

faisant intervenir plusieurs chaperones. La PGK est associée en complexe avec certaines

protéines dont notamment la glycéraldéhyde 3-phosphate deshydrogénase (GAPDH),

l’énolase et DnaK avec lesquelles elle forme le noyau central du complexe enzymatique

glycolitique 2 (Kuhner et al., 2009). Ces protéines ont également été retrouvées chez S. citri

(tableau 4.9). L'essentiel des protéines faisant parti des complexes « glycolytic enzyme 2 » et

« protein chaperone » chez M. pneumoniae est retrouvé chez S. citri à l'exception de quatre

protéines (tableau 4.9, avec une étoile), pourtant exprimées chez le spiroplasme. La

Tableau 4.9: Tableau de comparaison entre les protéines associées à des complexes connus chez Mycoplasma pneumoniae faisant intervenir la PGK.* protéines spécifiques de Mycoplasma pneumoniae.

Protéine identifiéeMycoplasmapneumoniae

S. citri

Phosphoglycérate kinase (PGK) X XGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase X XEnolase X XChaperone protein DnaK X Xprotein GrpE X XDnaJ-like protein MG002 homolog X XChaperone ClpB X XHeat-inducible transcription repressor HrcA X XPutative protein phosphatase (SPICI16_041) XGlycyl-tRNA synthetase (SPICI03_253) XProbable NADH oxidase (SPICI03_173) XPhosphoglycérate kinase (PGK) X X50S ribosomal protein L10 X XChaperone protein DnaK X XChaperone protein DnaJ X XMgp-operon protein 3 precursor* XProbable guanosine-3',5'-bis(diphosphate)3'-pyrophosphohydrolase (SPICI10_041)

X

Uncharacterized protein Mpn441* XUncharacterized protein MG211 homolog* XDnaJ-like protein MG002 homolog* XChaperone ClpB X XHeat-inducible transcription repressor HrcA X XPutative protein phosphatase XGlycyl-tRNA synthetase XProbable NADH oxidase XProtein GrpE X X

Glycolytic enzymecomplex

2

Proteinchaperonecomplex

Chapitre 4

97

triosephosphate isomérase en complexe avec la PGK chez Thermotoga maritima (Schurig et

al., 1995; Beaucamp et al., 1997; Yu & Noll, 2001) est également rencontrée en complexe

avec la PGK de S. citri (résultat non montré).

Sur les 125 protéines identifiées au cours de cette étude, neuf d’entre elles, ont été

éliminées pour leur rôle dans les complexes précédemment cités. Sur les protéines restantes,

13 ont particulièrement attirées notre attention (figure 4.10). A celles-ci, viennent s'ajouter 22

protéines supplémentaires ne présentant pas de fonction connue mais étant, pour la plupart

transmembranaires (figure 4.11).

Un premier élément est à prendre en compte avant de commencer l’analyse de ces

protéines candidates. En choisissant de s’intéresser à des protéines qui ont été identifiées par

un grand nombre de scans lors de l’analyse en spectrométrie de masse, le risque de

s’intéresser à des protéines majoritaires chez le spiroplasme existe. Ces protéines, par nature,

sur-représentées lors de ces analyses représentent un risque de faux positifs évident. La

présence de la spiraline en est l’exemple typique. Bien que la liaison de cette protéine avec la

PGK pourrait être envisagée, une « contamination » de la bande de gel soumise à la

spectrométrie de masse est probable. De plus, cette protéine a été retrouvée lors des contrôles

négatifs réalisés avec les deux préparations protéiques.

Ce cas de figure, exposé ici pour la spiraline, semble pouvoir se transposer pour

d’autres protéines candidates. Les protéines MreB et Ftsz, homologues procaryote respectif de

l’actine et de la tubuline eucaryote sont très représentées chez S.citri.

La fibrille, formant des longues fibres polypeptidiques, représente entre 0,5 % et 3 %

des protéines totales du spiroplasme (Townsend, 1983). Cette protéine forme le cytosquelette

interne de S. citri en association avec plusieurs autres protéines, comme la protéine MreB, et

est impliquée dans la motilité de ce dernier (Trachtenberg, 2004). Plus récemment, ces deux

protéines, associées avec EF-Tu, ont été démontrées comme faisant partie d’un complexe

associé à la membrane et intervenant dans la structuration et la motilité du spiroplasme

(Trachtenberg et al., 2008).

De la même façon, la protéine EF-Tu et la glycéraldéhyde-3-phosphate

deshydrogénase (GAPDH) sont elles aussi très présentes dans le cytoplasme de la bactérie.

Toutefois, EF-Tu a déjà été identifié comme une protéine pouvant se lier à la fibronectine

humaine (Balasubramanian et al., 2008). La GAPDH, bien que déjà associée à la PGK au sein

du complexe glycolitique, interagit également avec plusieurs protéines de la matrice

extracellulaire comme le plasminogène et le fibrinogène ainsi qu’avec l’actine (Seifert et al.,

Tableau 4.10: Tableau des protéines candidates potentiellement associées en complexes avec la PGK dont la fonction est connue. Chaque protéine est associée à la ou les bandes de gel dans lesquelles elle a été identifiée.

Fraction totale

Fraction membranaire

Adhesion related protein,transmembrane (ScARPs)

1

P32_protein 7Spiralin lipoprotein 7;12;13 23Preprotein translocase SecA subunit 1Fibril protein 2;3 17ATP synthase alpha chain subunit 2ATP synthase beta chain subunit 3Translation_elongation_factor_ef-tu_protein 4 18;20Probable_cell_division_ftsz transmembrane_protein 4Cell_shape_determining_protein_mreb 6 21Probable_glyceraldehyde_3-phosphate dehydrogenase_protein

6

Probable_abc_transporter_atp_binding component_abc_transporter_protein

6;7

Soj-like protein 7;8

Présence bandeProtéine

Chapitre 4

98

2003). Les protéines GAPDH et EF-Tu, localisées à la surface de plusieurs organismes,

pourraient se révéler d’intéressantes candidates au cours de l’invasion du spiroplasme dans les

cellules de l’insecte. De plus, la protéine GAPDH vient d’être récemment identifiée comme

une adhésine pouvant faciliter l’adhésion de Mycoplama pneumoniae sur des cellules de

l’hôte renforçant l’idée que cette protéine pourrait faire partie de la famille des enzymes

multi-fonctionnelles (Dumke et al., 2010).

D’autres protéines, en revanche ne sont pas connues pour être fortement exprimées

chez un organisme. Leur présence au sein d’un complexe est peut-être plus spécifique que

celle des protéines précédemment énoncées.

C’est la cas des deux sous-unités α et β faisant partie d’une ATP synthase et de la

sous-unité d’un composant d’un ABC transporteur. Ces protéines présentent l’avantage d’être

associées à la membrane du spiroplasme ce qui pourrait faciliter un rôle éventuel de ces

dernières dans l’invasion des cellules de l’hôte. L’identification d’une sous-unité d’un ABC

transporteur était intéressante car une protéine codant pour une Solute Binding Protein (SBP)

d’un ABC transporteur a déjà été identifiée jouant un rôle dans la transmission du spiroplasme

(Boutareaud et al., 2004). La sous-unité identifiée au cours de notre étude n’est pas une SBP

mais une sous-unité de liaison à l’ATP, molécule fournissant l’énergie nécessaire au transport

des biomolécules. Cette propriété, bien entendu également connue pour l’ATP synthase, est

problématique car la PGK possède aussi cette capacité à se lier avec l’ATP au cours de la

glycolyse. Il se pourrait donc que ces interactions soient médiées par l’ATP qui pourrait

former un pont entre les différentes protéines.

La protéine Soj (homologue procaryote de la protéine ParA), présente sur l’ensemble

des sept plasmides de S. citri, est impliquée dans la partition du chromosome (Gerdes et al.,

2000). Il est assez difficile d’expliquer comment cette protéine pourrait se retrouver dans un

complexe avec la PGK et surtout comment elle pourrait participer au processus d’invasion. Sa

présence pourrait être liée à celle des sous-unités de l’ATP synthase. En effet, ces protéines

ont récemment été identifiées comme faisant partie d’un même complexe chez M.

pneumoniae (Kuhner et al., 2009). De ce fait, ces protéines pourraient être effectivement

associées en complexes entre elles, mais leur présence au cours de cette étude au sein d’un

complexe avec la PGK ne serait dû qu’à une liaison non spécifique avec l’ATP et être

considérées comme des faux-positifs.

Figure 4.11: Tableau des protéines candidates potentiellement associées en complexes avec la PGK dont la fonction n’est pas connue.Chaque protéine est associée à la ou les bandes de gel dans lesquelles elle a été identifiée.

Fraction totale

Fraction membranaire

SPICI 20_065 1;2SPICI 20_066 3SPICI 10_054 4SPICI 16_011 20pSci4_06 12SPICI 06_025 14SPICI NP12_015 14SPICI 13_023 14SPICI 07_025 14SPICI 20_002 14SPICI 12_036 14SPICI 09_055 14SPICI 14_005 17pSci5_18 5 20pSci3_14 5 20SPICI 06_095 2SPICI 11_025 4SPICI 20_028 8SPICI 06_092 9SPICI 03_189 9SPICI 17_007 10SPICI 07_016 10pSci6_20 10

Présence bandeProtéine

Putativetransmembrane protein

Hypothetical protein

Hypothetical lipoprotein

Chapitre 4

99

La protéine SecA, dont le rôle est de permettre la translocation de protéines à travers la

membrane plasmique, pourrait permettre le transport soit de la PGK, soit d’autres protéines

associées au cours des réorganisations protéiques ou des cascades de signalisation nécessaires

lors de l’entrée de la bactérie dans les cellules de l’insecte.

Deux autres protéines contribuant à la transmission de S. citri par l’insecte ont été

identifiées : les protéines ScARPs et P32.

Les protéines ScARPs appartiennent à une famille de protéines très étudiées chez S.

citri et dont les principales caractéristiques ont été précédemment énoncées (§ Introduction

III.3.2). Au cours de cette étude, 6 des 8 protéines ont été identifiées : la Scarp2b (pSci5_14),

la Scarp3d (pSci2_04), la Scarp3c (pSci3_07), la Scarp3b (pSci5_11), la Scarp3a (pSci1_05)

et enfin la Scarp2a (pSci4_07). Ces protéines, appartenant à la grande famille des adhésines,

pourraient intervenir dans l’attachement des spiroplasmes sur les cellules de l’insecte.

La protéine P32, associée à des protéines membranaires du spiroplasme, n’est

présente que chez les souches transmissibles de S.citri par C. haematoceps (Killiny et al.,

2006). Des études en microscopie électronique ont montré que cette protéine pourrait

participer, au même titre que les protéines ScARPs, à l’étape d’adhésion du spiroplasme aux

cellules de l’insecte (Killiny et al., 2006).

En parallèle, 23 protéines de fonctions inconnues ont également été identifiées par

spectrométrie de masse. Ces protéines, listées dans le tableau 4.11, sont bien évidemment des

candidats pour la transmission du spiroplasme. Au sein de ces protéines, celles annotées

« hypothetical lipoprotein », au nombre de 12, sont donc des protéines membranaires et

pourraient retenir toute notre attention.

III. Discussion et conclusion

La recherche de complexes multi-protéiques chez S. citri a été effectuée afin de mettre

en évidence ceux impliqués dans la transmission du spiroplasme. Le but de ces études

préliminaires était de montrer l'implication, au sein de complexes, des protéines candidates

telles que les protéines ScARPs, Sc76, P32, PGK ou bien encore la spiraline.

Les résultats de ces analyses, obtenus lors de l'étude par « cross-linking » des

complexes impliquant la phosphoglycérate kinase de S. citri, ont révélé l'existence de

Chapitre 4

100

plusieurs protéines qui peuvent être potentiellement associées à cette dernière. Même si nos

résultats semblent en accord avec des études précédentes, mettant en évidence des partenaires

protéiques de la PGK au sein de divers organismes comme M. pneumoniae (Kuhner et al.,

2009) et E. coli (Lasserre et al., 2006), il est néanmoins nécessaire de garder à l'esprit que

cette étude reste une étape préliminaire en vue de la caractérisation fonctionnelle de ces

complexes. Plusieurs facteurs limitants peuvent venir perturber l'analyse des résultats. La

présence de protéines fortement exprimées chez le spiroplasme pourrait créant une source de

faux positifs. La fixation aspécifique de protéines au cours l'étape de purification des

complexes comprenant la PGK tagguée sur colonne de nickel est problématique. Néanmoins,

la faible présence de telles protéines sur le gel de polyacrylamide, au cours des contrôles

négatifs effectués, est rassurante.

L'identification de plusieurs protéines interagissant avec la PGK, comme la P32 ou les

ScARPs est un premier élément pour mettre en évidence l'existence de complexes multi-

protéiques jouant un rôle dans la transmission de S. citri par son insecte vecteur. Des mutants

dans lesquels ces protéines sont absentes sont moins efficacement transmis que la souche

sauvage (Berho et al., 2006; Killiny et al., 2006). Aux vues du rôle de la PGK dans

l'internalisation dans les cellules de l'insecte, il se pourrait que ces protéines agissent de pair

avec la PGK au cours du processus d'invasion cellulaire.

L'étude de la fraction protéique membranaire de S. citri a été réalisée dans le but

d'identifier des sous-unités, interagissant avec la PGK au niveau de la surface du spiroplasme.

Peu de protéines ont été retrouvées exclusivement dans cette fraction. Il est vraisemblable que

l'étape de purification, qui apporte la spécificité à la technique, soit un facteur limitant pour la

détection de protéines faiblement exprimée. Deux protéines de fonction inconnue, les

protéines SPICI16_011 et SPICI 14_005, ont été identifiées uniquement dans cette fraction ce

qui en fait des candidates intéressantes. Néanmoins, la présence de 11 protéines, annotées

« hypothetical lipoprotein », dans la fraction des protéines totales du spiroplasme permet

d'envisager que la PGK pourrait, pour assurer sa fonction dans le processus de transmission,

interagir avec plusieurs autres protéines à la surface du spiroplasme.

Ces hypothèses nécessitent bien évidemment d'être confirmées au cours d'études

utilisant d'autres techniques d'interactions protéine-protéine comme le far Western par

exemple ou bien lors d'études ex vivo en microscopie confocale en utilisant la lignée cellulaire

Ciha-1 disponible au laboratoire. Même si l'obtention de mutants ciblés est difficile chez S.

Chapitre 4

101

citri , la mise au point d'un nouveau vecteur navette, le pGOTres, permettant l'obtention de

double-mutants, permettrait d'étudier in vivo la transmission d'un spiroplasme dans lequel

plusieurs de ces protéines candidates seraient absentes.

Hemolymphe

Lame basale

Plasmalemme basal

Canal salivaire

Plasmalemme apicalRabRab

ActineTubuline

ActineTubuline

14-3-314-3-3

Rab??

? ? 14-3-3

?

?

Barrière corticale d’actine

Filaments de microtubule

et d’actine

Hemolymphe

Lame basale

Plasmalemme basal

Canal salivaire

Plasmalemme apical

Lame basale

Plasmalemme basal

Canal salivaire

Plasmalemme apicalRabRabRabRabRabRab

ActineTubuline

ActineTubuline

ActineTubuline

ActineTubuline

ActineTubuline

ActineTubuline

14-3-314-3-314-3-314-3-314-3-314-3-3

Rab??

Rab??

Rab??

RabRab??

? ?? ?? ?? ?? ? 14-3-3

?

? 14-3-3

?

? 14-3-3

?

? 14-3-314-3-3

?

?

Barrière corticale d’actine

Filaments de microtubule

et d’actine

Sc76 ?Spiraline?

1

PGK

Actine

Rab 5 et 6?tubuline

ScARPs ?

Récep

teurs

inse

cte ?

P32 ?

?

?

?

2

4 5

14-3-3 ?

actine

Figure C.1: Schéma hypothétique du franchissement de la barrière des glandes salivaires de l’insecte C. haematoceps par S. citri.

3

Hemolymphe

glycoprotéines? ?

Discussion générale et perspectives

102


L'ensemble des résultats obtenus au cours de cette thèse et plus particulièrement

l’interaction PGK-actine, associés à ceux obtenus sur la transmission du spiroplasme m'a

permis d'émettre des hypothèses sur le mécanisme moléculaire du franchissement de la

barrière des glandes salivaires (figure C.1). En effet, dans notre système expérimental de

transmission qui court-circuite le passage de la barrière intestinale vers l'hémolymphe, seul le

passage des glandes salivaires est déterminant.

I. Hypothèses concernant le cycle de S. citri dans l'insecte C. haematoceps

1. Franchissement de la barrière de l'épithélium intestinal

La comparaison des deux profils far-Western, obtenus entre les protéines de S. citri et

les protéines totales de l’insecte et celles des glandes salivaires, montre qu’un signal

d’interaction localisé à 60kDa sur le profil far Western des protéines totales d’insecte est

absent de celui des glandes salivaires. L’absence de ce signal est du à l’absence de proteines à

60 kDa sur le profil d’électrophorèse des proteines des glandes salivaires. Cette protéine

pourrait donc être spécifique du franchissement de la barrière intestinale.

Il se pourrait également que cette protéine soit une des deux glycoprotéines d'insecte

identifiées au cours d'une précédente étude (Killiny et al., 2005). Celle-ci serait alors capable

de se lier avec la spiraline et leur association serait par conséquent impliquée dans la

transmission. La recherche de son partenaire chez le spiroplasme permettrait d'éclaircir un peu

mieux ce premier franchissement que la bactérie doit effectuer afin de poursuivre son circuit.

2. Franchissement de la barrière des glandes salivaires

2.1. Franchissement de la lame basale des glandes salivaires

Les travaux de Killiny et al 2005 ont montré que la spiraline, proteine majoritaire de la

membrane de S. citri était une lectine capable de se lier avec deux glycoprotéines de l'insecte

sans que ces dernières ne soient connues à l'heure actuelle (figure C.1, encadré 1). Sur ces


103

deux glycoprotéines mises en évidence, il se pourrait que seule celle de 50 kDa soit présente

dans les glandes salivaires et participe au franchissement de la lame basale de ces dernières.

En 2002, un mutant dont le gène sc76 codant une lipoprotéine, présentant des

homologies avec une SBP d'un ABC transporteur de glucose, a été obtenu par mutagénèse

(Boutareaud et al., 2004). Ce mutant est affecté dans sa transmission par l'insecte vecteur. De

part sa fonction au niveau de l'interaction avec des résidus de type sucre, la lipoprotéine Sc76,

pourrait donc elle aussi reconnaître un tel résidu à la surface de la lame basale. Cette

interaction pourrait faciliter le franchissement de cette dernière par le spiroplasme (figure

C.1, encadré 1).

2.2. Adhésion au plasmalemme des glandes salivaires

Les protéines P32 et ScARPs absentes des souches non transmissibles (comme la

souche 44), sont des protéines non essentielles dans la transmission mais contribuent

cependant au bon déroulement de celle-ci.

La protéine P32 est une protéine hydrophile associée à la membrane du spiroplasme.

Cette protéine ne présente aucun segment transmembranaire ce qui signifie qu'elle se trouve

du coté cytoplasmique probablement associée à des protéines membranaires. Les observations

en microscopie électronique à transmission des glandes salivaires d'insectes infectés par la

souche non transmissible 44, ne montrent pas de vésicule d'endocytose. Les spiroplasmes ont

franchi la lame basale et se sont amassés entre la lame basale et le plasmalemme. Dans le cas

des glandes salivaires infectées par les spiroplasmes de la souche 44 complémentée par le

gène p32, un contact entre ceux-ci et le plasmalemme des glandes salivaires est observé

(Killiny et al., 2006). Des adhésines, nécessaires à cette adhésion, pourraient être recrutées

par la P32 afin d'interagir avec les récepteurs membranaires présents à la surface des cellules

de l'insecte (figure C.1, encadré 2).

Les protéines ScARPs (S. citri adhesion related proteins) sont également absentes chez

la souche 44. Ces protéines présentent des homologies avec la protéine P89 (ou SARP1) qui

est une protéine amphiphile ayant un rôle dans l'adhésion de S. citri à une lignée cellulaire de

C. tenellus et donc, par extension, une protéine qui pourrait être impliquée dans une

interaction avec l'insecte lors de la transmission (Yu et al., 2000; Berg et al., 2001). Ces

ScARPs possèdent un peptide signal riche en séquences répétées par le biais desquelles elles

pourraient interagir avec un ligand. Elle possède également un signal de localisation nucléaire


104

(NLS) qui pourrait permettre la modification de l'expression de certains gènes de l'hôte et

ainsi la mise en place des étapes ultérieures de l'invasion cellulaire.

Ces protéines pourraient être recrutées par la protéine P32 au niveau de la région de la

membrane de S. citri entrant en contact avec la cellule de l'hôte impliquant une certaine

relocalisation des protéines à la surface du spiroplasme (figure C.1, encadré 2).

2.3. Internalisation dans les cellules des glandes salivaires

Les résultats obtenus concernant l’internalisation dans les cellules de l'insecte

identifient la phosphoglycérate kinase comme proteine impliquée dans ce processus. Cette

PGK, en interagissant avec l'actine de l'insecte, pourrait permettre le remodelage de la

membrane de la cellule de l'insecte permettant au spiroplasme de pénétrer (figure C.1,

encadré 3). Cette protéine, connue pour avoir une localisation cytoplasmique, pourrait être

relocalisée au niveau de la membrane afin d'interagir avec l'actine de la cicadelle. L'étude des

complexes protéiques impliquant cette protéine a permis de révéler qu'un complexe pourrait

exister entre la PGK et la P32. Cette dernière pourrait ainsi recruter la PGK au niveau de la

membrane lui permettant d'assurer sa fonction. Les ScARPs pourraient également, aux vues

des résultats présentés au chapitre 4, faire partie de ce complexe. La présence de nombreuses

lipoprotéines, identifiées au cours de l’étude des complexes associés à la PGK, amène à

penser que ces dernières pourraient jouer un rôle au cours de l'étape d'adhésion aux cellules et

entraîneraient par la suite les autres protéines du complexe qui interviendraient alors dans le

processus d'internalisation. Cependant, rien à ce jour n’indique que la PGK, ou bien

seulement un peptide, comme le peptide PGK-FL5, clivé au cours de la mise en place du

processus d’internalisation, ne puisse pas être sécrété par le spiroplasme pour aller interagir

avec l’actine de l’insecte.

Cette étape d'internalisation pourrait être une étape n'intervenant pas dans la spécificité

de vection. Cette spécificité pourrait être apportée par des protéines spécifiques de S. citri

telles que les ScARPs, la P32 et la spiraline. Les spiroplasmes pourraient utiliser, une fois

cette spécificité de vection acquise, une protéine bi-fonctionnelle comme la PGK pour assurer

les étapes suivantes nécessaire à son invasion cellulaire.


105

2.4. Devenir des vésicules d'endocytose contenant S. citri

Une fois internalisé, des études de microscopie électronique ont permis de visualiser

les spiroplasmes à l'intérieur de vésicules d'endocytose (Ozbek et al., 2003).

Le premier but du spiroplasme, à ce moment, est de détourner ces vésicules de la voie

lysosomiale classique qui acidifie le contenu de ces vésicules entraînant la dégradation des

particules contenues. Pour se faire, il est vraisemblable que S. citri utilise les protéines de

l'insecte Rab5 et Rab6 ainsi que la protéine 14-3-3, protéines identifiées au cours de l'étude

des interactions par far Western (chapitre 1). En détournant ces protéines de leur fonction

dans le système de dégradation cellulaire chez l'insecte, les spiroplasmes éviteraient d’être

lysés (figure C.1, encadré 4).

Afin de rejoindre le canal salivaire, S. citri pourrait utiliser les réseaux du

cytosquelette pour sa mobilité intracellulaire. Il pourrait alors utiliser les microfilaments

d'actine de manière identique à de nombreuses bactéries, y compris les mollicutes

phytopathogènes (Suzuki et al., 2006). En parallèle, la tubuline β, identifiée au cours des

études d’interaction, pourrait également laisser présager que le spiroplasme se déplacerait le

long des microtubules à la manière des Chlamydia (Clausen et al., 1997) (figure C.1,

encadré 4).

La présence des spiroplasmes au sein de vésicules pourrait être un obstacle à

l'interaction de ceux-ci avec les protéines précédemment citées. La présence d'un « tip »

traversant la membrane des vésicules a été observée (Ammar et al., 2004). Les protéines

impliquées dans les mécanismes de mobilité intracellulaire, ou d'exocytose afin de rejoindre

le canal salivaire, pourraient être présentes dans cette structure et pourraient ainsi interagir

sans difficulté avec leurs partenaires. De plus, il n'est pas impossible que des spiroplasmes se

retrouvent libres dans le cytoplasme bien que ceux-ci n’aient pas pu être visualisés au cours

de différentes études en microscopie électronique. Cependant, une fois la membrane des

vésicules lysée, les spiroplasmes libres pourraient interagir plus facilement avec les protéines

cellulaires (figure C.1, encadré 4).

2.5. Libération dans le canal salivaire

S. citri est libéré des cellules des glandes salivaires par exocytose. Deux hypothèses

sont formulées en fonction de la présence de ce dernier au sein des vésicules précédemment

citées. Si le spiroplasme est toujours localisé à l'intérieur des vésicules d'endocytose, une


106

fusion de la membrane de celle-ci avec la membrane du canal salivaire pourrait permettre à S.

citri de se retrouver libre dans ce dernier. En revanche, si le spiroplasme est libre dans le

cytoplasme, une nouvelle protéine, qui pourrait être la protéine 14-3-3, assurerait le passage

de cette ultime membrane (figure C.1, encadré 5).

Dans le canal salivaire, le spiroplasme sera injecté à une nouvelle plante au cours du

prochain repas de l'insecte sur une plante.

II. Perspectives

Ce travail s'est principalement orientéé sur l'implication de la PGK au cours de la

transmission du spiroplasme ainsi qu'à la caractérisation fonctionnelle de son interaction avec

l'actine de la cicadelle, également impliquée dans ce processus.

Mutant dépourvu de PGK

Il aurait été intéressant d'étudier la transmission d'un mutant dépourvu de PGK.

L’idéal aurait même été de disposer d’un mutant ne possédant pas le domaine de liaison à

l’actine contenu dans la région en acides aminés 1 à 101 de la PGK. Par la suite, la

complémentation de ces mutants aurait permis de restaurer la fonction de la PGK au cours du

processus de transmission du spiroplasme et ainsi de confirmer le rôle de l’interaction PGK-

actine. Un mutant dépourvu de PGK n’a pu être obtenu ce qui semble indiquer que cette

protéine est essentielle à la survie de S. citri. Des efforts concernant la mise au point d'un

vecteur dont le gène codant la protéine essentielle, dans notre cas la PGK, serait sous la

dépendance d'un promoteur inductible, permettraient d'étudier le rôle de cette protéine dans le

système de transmission maintenu au laboratoire.

Localisation de la PGK chez S. citri

L'obtention de l'anticorps dirigé contre la PGK va permettre d’étudier la localisation

de cette dernière chez S. citri. En effet, il est indispensable de démontrer que cette protéine

possède une localisation lui permettant d’interagir avec l’actine de l’insecte. Une étude en

microscopie électronique apporterait des précisions sur la position occupée par celle-ci au


107

cours du processus d’invasion des cellules de l’hôte. De plus, l’utilisation des cellules Ciha-1

serait un avantage indéniable afin de visualiser des évènements nécessitant l’adhésion du

spiroplasme avec la cellule eucaryote. Si la localisation de la PGK, permettant l’interaction

avec l’actine, requiert la mise en place de signaux cellulaires mis en place au moment du

contact du spiroplasme avec la cellule, les études en microscopie devront être effectuées dans

un système utilisant des cellules Ciha-1 infectées.

L’étude du « sécrétome » de S. citri pourrait permettre de révéler si la PGK est

sécrétée par le spiroplasme dans le but de se lier avec l’actine. Une étude préliminaire du

secrétome de S. citri a montré la présence de celle-ci dans la fraction de protéines

potentiellement secrétées. Aux vues des résultats, ce « sécrétome » pourrait également être

étudié dans le cadre de l’infection par le spiroplasme des cellules d’insectes en culture afin de

déterminer si une éventuelle sécrétion de la PGK requiert des signaux de relocalisation ou de

clivage mis en place au moment de l’adhésion de S. citri.

L’utilisation de la cytochalasine D, une drogue qui dépolymérise les microfilaments,

pourrait également nous permettre de confirmer l’implication de l’actine dans l’internalisation

du spiroplasme. Des incubations, avec différentes concentrations de cette molécule, sur des

cellules Ciha-1 infectées par S. citri devraient influer sur la capacité de ce dernier à envahir

les cellules de l’insecte.

Ces résultats supplémentaires permettraient de confirmer ou non les hypothèses

formulées au cours de cette thèse sur la fonction de cette protéine associée à l'internalisation

dans les cellules de l'hôte.

Recherche de complexes protéines impliqués dans la transmission

L'ensemble des étapes régissant la transmission de S. citri semble être caractérisés par

l'implication de complexes multi-protéiques. Des efforts devraient être poursuivis dans cette

voie.

La confirmation, par d'autres techniques d'interactions protéine-protéine, des

complexes identifiés par la technique de « cross-linking » serait nécessaire afin d'établir des

bases solides concernant l'implication de ces derniers au cours de la transmission. La

caractérisation fonctionnelle des protéines de chacun de ces complexes sera, par la suite, une

étape indispensable à la compréhension du cycle de S. citri dans son vecteur. Ceci devra être

réalisé aussi bien pour les protéines candidates définies comme la P32 et les ScARPs mais

également pour l'ensemble des lipoprotéines hypothétiques identifiées au cours de cette thèse.


108

Ces études pourraient également être réalisées sur le mutant 9A3 depourvu de spiraline

ce qui permettrait de s’affranchir des contaminations observées au chapitre 4 mais aussi

d’étudier le devenir des complexes protéiques lorsque cette protéine majoritaire de S. citri est

absente.

La mise au point récente au laboratoire d'un vecteur navette permettant l'obtention de

« double-mutants » sera un outil essentiel afin de vérifier l'implication des sous-unités

identifiées au sein des complexes multi-protéiques. Des mutants, délétés dans plusieurs des

gènes codant des protéines candidates dans la transmission, pourront de ce fait être étudiés.

Identification des partenaires, coté S. citri, des autres protéines d’insecte

identifiées par far Western

L'étude en far Western, réalisée au cours de cette thèse a permis d'identifier plusieurs

autres protéines d'insectes potentiellement impliquées dans une interaction avec le

spiroplasme. Les partenaires de ces protéines, dont le rôle hypothétique a été énoncé

précédemment, devront être recherchés. Leurs interactions avec S. citri devront être

confirmées avant d'étudier leurs fonctions au cours de la transmission du spiroplasme. Ces

étapes pourront être réalisées en suivant la méthodologie utilisée pour l'identification de la

PGK comme partenaire de l'actine de C. haematoceps.

Séquence du génome de la souche 44 non transmissible

A notre connaissance, seules les protéines ScARPs et la protéine P32 sont absentes de

la souche non transmissible 44. Toutes les protéines mises en évidence dans la souche GII3

candidates pour jouer un rôle dans la transmission réduisent celle-ci sans jamais l’anéantir.

Ces protéines n’interviennent pas seules mais en complexe avec d’autres. La connaissance de

la séquence du génome de la souche non transmissible permettrait de faire de la génomique

comparée avec la souche transmissible GII3.La présence ou l’absence de certaines protéines

chez l’une ou l’autre souche permettraient de dresser un tableau plus complet des protéines

impliquées dans la transmission et de relier celles-ci entre elles.

Matériels et méthodes

Base autoclavée (30 min/115°C)

Mycoplasma Broth Base 1 g

Peptone 1,6 g

Tryptone 3 g

Rouge de phénol 0,5 % 1,2 ml

pH (ajusté avec NaOH) 7,8

qsp H2O 205 ml

Agar Noble (milieu solide) 3 g

Additifs stériles (filtrés sur 0,45 µm)

Sérum de veau foetal (décomplémenté 1 h à

56°C)50 ml

CMRL 1066 (acides aminés et vitamines) 15 ml

Yeastolate 4 % (p/v) 25,5 ml

Glucose 50 % 3 ml

Pénicilline G à 200 000 unités/ml 1,5 ml

Pression osmotique ~350 mOsm

Figure M.1: Composition du milieu SP4.


109

Matériel et méthodes

I. Matériel biologique

1. Spiroplasma citri : souches et conditions de culture

La souche de S. citri GII3 a été isolée à partir de cicadelles Circulifer haematoceps

capturées au Maroc (Vignault et al., 1980). Elle est la souche de référence au laboratoire

d’une part pour ses caractéristiques morphologiques (spiroplasmes hélicoïdaux et doués de

motilité) et d’autre part, elle est transmissible par l’insecte vecteur Circulifer haematoceps.

De plus, cette souche est pathogène pour la plante expérimentale utilisée au laboratoire, la

pervenche de Madagascar (Catharanthus roseus).

Les spiroplasmes sont cultivés dans le milieu SP4m liquide (Tableau M.1) à 32 °C

sans agitation. Les spiroplasmes transformés par le plasmide pGOT ont été sélectionnés en

présence de gentamycine (100 µg/ml) puis de tétracycline (5 µg/ml). La croissance de S. citri

en culture est suivie par le changement de couleur de l’indicateur coloré, le rouge de phénol,

présent dans le milieu de culture et induit par la production d’acide lactique au cours de la

croissance du spiroplasme. Cependant chaque culture est observée au microscope à fond noir

et il est communément accepté que le titre d’une culture de S. citri GII3 en fin de phase

stationnaire atteint 108 à 109 bactéries/ml. Cette culture est alors repiquée au 1/10ème dans du

milieu SP4 frais ce qui correspond à un passage, noté 1P. Les spiroplasmes cultivés pendant

de nombreux passages en milieu acellulaire semblent perdre leur capacité à être transmis par

l’insecte vecteur, des cultures stocks ayant subi un faible nombre de passage (entre 5 P et 10P)

ont été réalisées.

Le repiquage de colonies de S. citri en milieu SP4 liquide est réalisé par prélèvement

de la carotte de gélose où se trouve la colonie sous une loupe binoculaire à l’aide d’une

pipette Pasteur stérile. Cette carotte sert alors à ensemencer 1ml de milieu SP4 comprenant ou

non un antibiotique de sélection.

2. Escherichia coli : souches et utilisation

Plusieurs souches d’E. coli ont été utilisées en fonction de leurs caractéristiques et de

besoins des différentes expériences.

Composants LB SOCTryptone 10 g 2 g

Yeast extract 5 g 0, 5 gNaCl 10 g 0,06 g

KCl 1M 0, 25 mlGlucose 2M 1 ml

Mg2+ stock(1M MgCl2

.6H2O, 1M

MgSO4.7H2O)

1 ml

H2O qsp 1 L qsp 100 mlpH 7 7

Agar (milieu solide)

15 g

Milieu cicadelle

Milieu de Schneider (Invitrogen) 200 mlTampon Histidine pH 6,2(0,057 M histidine monohydrate (Sigma) 2,5 mlSérum de veau foetal (décomplémenté 1 h à 56°C) 25 mlMilieu G-5 (Invitrogen) 1,2 mlFungizone 1,25 µg/mlPenicilline G / Streptomycine 50 µg/ml

Figure M.2: Composition des milieux de culture d’E. coli.

Figure M.3: Milieu de culture de la lignée cellulaire Ciha-1.


110

La souche DH10B [F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1

endA1 araD139 ∆(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG] est couramment utilisée pour la

propagation de plasmides. Elle présente les avantages de posséder une grande efficacité de

transformation et la capacité à maintenir de façon stable des plasmides de grande taille.

La souche BL21 Star™ (DE3) a servi lors de la production des protéines et des

peptides recombinants. Elle permet d’améliorer le rendement de production dans un système

d’expression utilisant le promoteur T7 comme cela est le cas pour le vecteur d’expression

pET28a(+) (Novagen). En effet, elle porte une mutation dans le gène codant pour la RNaseE

(rne 131) qui est la principale source dégradation des ARNm.

Ces deux souches, après transformation, ont été cultivées en milieu LB (Tableau M.2)

solide à 37°C en présence d’ampicilline (100 µg/ml) ou de kanamycine (30 à 50 µg/ml).

En milieu liquide, la culture s’effectue à 37 °C sous agitation (180-200 rpm/min).

3. L’insecte vecteur : la cicadelle Circulifer haematoceps

3.1. Origine et conditions d’élevage

Les cicadelles adultes Circulifer haematoceps ont été prélevées sur Matthiola

sinuata en Corse. De retour au laboratoire, ces cicadelles ont été confinées quelques jours sur

giroflées (Matthiola incana). Dès la première ponte, les adultes ont été éliminés afin de

s’assurer que la population ne soit pas infectée par le spiroplasme. Aucune transmission

transovarienne n’ayant été démontrée chez S. citri à ce jour, les larves de ces insectes ne

présentent donc aucun risque d’être infectées par le spiroplasme. Les cicadelles saines sont

élevées dans des cages de plexiglas ventilées contenant trois giroflées et celles-ci sont

renouvelées une par une toutes les 2 semaines. La photopériode est de 16 heures à 30 °C ± 2

°C et 8 heures à 26 °C ± 2 °C. Les cages d’élevages sont regroupées dans une pièce

climatisée, isolées de l’extérieur par des filets pare-insectes et séparées des serres de

production de plantes par un sas de sécurité. Toutes les salles disposent d’un piège jaune

englué qui capte les insectes pouvant s’échapper lors de leur manipulation ou de l’entretien

des cages.

3.2. Capture et dissection des cicadelles

Les cicadelles sont capturées à l’aide d’un aspirateur à bouche muni d’un tube

collecteur. Elles sont anesthésiées sous gaz carbonique. Pour le prélèvement des glandes


111

salivaires, les insectes sont tout d’abord décapités. Les glandes salivaires sont ensuite

disséquées dans une goutte de PBS (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 0.14 M NaCl, 2 mM

KCl pH 7.4) contenant 1mM de phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF). Les glandes

salivaires sont ensuite conservées à -20 °C jusqu’à utilisation.

3.3. Obtention d’une lignée cellulaire

La lignée cellulaire de Circulifer haematoceps a été initiée à partir d’œufs embryonnés

de 8 à 10 jours. Les œufs, ayant atteint le stade « œil rouge », c'est-à-dire les oeufs pour

lesquels les yeux ont migré jusqu’au 2/3 de l’embryon, sont prélevés dans les nervures des

plantes à l’aide d’une fine aiguille. Une centaine d’embryons ont été récupérés et ont subi un

cycle de stérilisation incluant des incubations successives : 3 minutes dans une solution à 20%

eau de Javel, 2 rinçages avec de l’eau stérile, 3 minutes dans un solution à 70% d’éthanol

suivi de trois nouveaux rinçages à l’eau stérile. Les œufs ont été broyés dans 100 µl de milieu

de culture de cicadelle (Tableau M.3) puis centrifugés 3 minutes 1000 g. Le culot est alors

resuspendu dans 400 µl de tampon de dissociation cellulaire (Invitrogen) et incubé à 28 °C

pendant 10 minutes. Le volume final est ajusté à 500 µl avec du milieu de culture frais et

l’ensemble est transféré dans une flasque de culture, par la suite incubée 1 h à 28 °C. A la fin

de cette incubation, 2,5 ml de milieu de culture frais sont de nouveau ajoutés. Le milieu de

culture est remplacé le jour d’après par du milieu frais puis le milieu est remplacé au 2/3 tous

les 7 jours jusqu’à ce que la première colonie pousse.

Lorsque la surface d’une colonie a atteint environ 4 mm2 (4 mois plus tard), les

cellules ont été trypsinées (TrypLE, Invitrogen), placées dans un puit de 24 mm de diamètre

dans lequel le milieu est remplacé par 2/3 de milieu de culture frais deux fois par semaine

pendant trois mois. Après cette période, le milieu n’est changé qu’une fois tous les sept jours.

Cette nouvelle lignée cellulaire, cultivée à 32 °C, a été nommée Ciha-1 (Circulifer

haematoceps-1).

II. Plasmides 1. Commerciaux

1.1. pBS

Le plasmide pBS+ est un phagemide de 3,2 kpb utilisé comme vecteur de clonage de

fragments d’ADN dans E. coli. Ce plasmide possède l’origine de réplication colE1 qui lui

Figure M.4: Vecteur d’expression pET28a(+) (Novagen) .


112

permet de se répliquer dans E. coli, un gène de résistance à l’ampicilline et un site multiple de

clonage situé dans le gène LacZ.

1.2. pET28a(+)

Le plasmide pET28a(+) est un vecteur d’expression commercialisé par la société

Novagen (figure M.4). Il permet le clonage et l’expression de protéines recombinantes dans

E. coli. Il possède l’origine de réplication du pBR322, deux gènes de résistance à l’ampicilline

et à la kanamycine. Les gènes cibles sont placés sous la dépendance du promoteur fort,

inductible par l’IPTG, du bactériophage T7. Ce plasmide porte également deux séquences

composées de six résidus histidines présentes de part et d’autre du multi-site de clonage

permettant l’étiquetage des protéines aussi bien en N-terminal qu’en C-terminal. De plus, un

site de coupure à la thrombine permet le clivage de l’étiquette 6xHis placée en N-terminal

uniquement.

2. Obtenus au laboratoire

2.1. pGOT1

Le vecteur pGOT1 est un vecteur navette E. coli/S. citri qui a été construit dans le but

de faciliter la sélection des recombinants lors d’expériences visant à interrompre un gène de

façon ciblée. Ce plasmide possède la région PstI de 2303 pb du pSRG, contenant la cassette

aacA-aphD de résistance à la gentamycine, insérée dans le plasmide pC55 possédant l’oriC de

S. citri. Cette origine de réplication servait, lors de la mise au point de ce type de vecteur, de

région d’intégration permettant l’intégration de gènes dans le chromosome de S. citri. Dans le

plasmide pGOT, cette origine de réplication, d’une taille initiale de 349 pb, a été réduite afin

de ne pas favoriser l’intégration du plasmide dans cette région au profit d’une recombinaison

au niveau du gène cible

Il porte deux gènes de sélection, l’un conférant la résistance à la gentamycine

exprimée de manière constitutive, l’autre conférant une résistance à la tétracycline qui ne

pourra être exprimée que lorsque l’évènement de recombinaison aura eu lieu. De plus, deux

copies du terminateur de transcription du gène de la fibrille empêchent la transcription

accidentelle de ce gène à partir du promoteur lacZ.


113

III. Méthodes d’analyse d’ADN

1. Purification de l’ADN génomique de S. citri

L’ADN génomique de S. citri est extrait à partir de 10 ml de culture en fin de phase

stationnaire de croissance (environ 108-109 UFC/ml). L’extraction est réalisée avec le kit

Wizard® Genomic DNA Purification (Promega®) selon les recommandations du fournisseur.

Le principe de l’extraction repose sur les étapes classiques d’extraction d’ADN. Après

centrifugation 15 minutes à 14 000 g, les spiroplasmes collectés sont remis en suspension

dans du tampon de lyse. Après incubation à 65 °C pendant 15 minutes, le lysat est traité à la

ribonucléase pendant 30 minutes à 37 °C. Les protéines précipitées sont éliminées par

centrifugation, puis l’ADN est précipité à l’isopropanol. Le culot d’ADN est lavé à l’éthanol

70 % et repris dans 80 µl de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3 ; EDTA 1 mM). Le rendement

moyen est d’environ 4 µg d’ADN génomique par millilitre de culture.

2. Purification de l’ADN plasmidique

L’ADN plasmidique a été extrait avec le kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA

Purification System (Promega®). La méthode d’extraction est basée sur le principe de la lyse

alcaline (Birnboim & Doly, 1979). L’extraction est réalisée sur 2 ml de culture pour E. coli et

sur 10 ml pour S. citri. Les bactéries sont collectées par centrifugation et lysées en milieu

alcalin puis les protéines et l'ADN chromosomique sont éliminés par précipitation. L’ADN

plasmidique est spécifiquement adsorbé sur une matrice composée de silice de haute capacité,

puis élué dans 50 µl d’eau distillée.

3. Purification de fragments d’ADN à partir de gel d’agarose

Les fragments d’ADN sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose à 0,8 % en

tampon TBE et colorés au bromure d’éthidium. Les bandes d’intérêt sont repérées et excisées,

puis l’ADN est purifié avec le kit "Wizard SV® Gel and PCR clean up system" (Promega®)

selon le protocole recommandé par le fournisseur.

Tampon de charge (6X)EDTA pH= 8 60 mMSDS (p/v) 0,60%Glycérol (v/v) 30%Bleu de bromophénol (p/v) 0,25%Xylène cyanol (p/v) 0,25%H2O qsp 50 ml

Mix 1X Taq DNA

polymerase

Mix 1X Pfx DNA

polymerasedNTP (5 mM) 2 µl 3 µlTampon 10 X 4 µl 5 µlMgCl2 (50 mM) 2 µl 3 µl

Amorce 1 (100 µM) 0,5 µl 0,5 µlAmorce 2 (100 µM) 0,5 µl 0,5 µlH2O 30,7 µl 37,5 µl

Taq DNA polymérase 2,5 unités 0,5 µl

Figure M.6: Composition des mélanges réactionnels pour la PCR .

Figure M.5: Composition des tampons pour la migration des fragments d’ADN sur gel d’agarose .

Tampon TBE

Tris 8,9 mMBorate 8,9 mMEDTA 0,2 mMpH 8,4H2O qsp 1 L


114

4. Hydrolyse par les endonucléases de restriction

Les enzymes de restriction ont la propriété d’hydrolyser l’ADN au niveau de sites de

reconnaissance spécifiques. Une unité d’enzyme de restriction est capable d’hydrolyser 1 µg

d’ADN plasmidique et 0,1 µg d’ADN génomique. Chaque échantillon est mis en présence de

l’enzyme de restriction, du tampon d’activité de l’enzyme dans un volume final de 30 µl. La

composition du tampon d’activité et la température d’incubation dépendent de l’enzyme et

sont précisées par le fournisseur (Promega, Fermentas, New England Biolabs). Le temps de

digestion varie de une heure (ADN plasmidique) à quatre heures (ADN génomique).

5. Analyse des fragments d’ADN sur gel d’agarose

Les fragments d’ADN sont séparés par électrophorèse en gel d’agarose (0,8 à 2 %

d’agarose (p/v) selon la taille des fragments à analyser) dans du tampon TBE (Tableau M.5)

en présence de bromure d’éthidium (0.2 µg/ml). Les échantillons (1 à 2 µg d’ADN

génomique ou 0,1 µg d’ADN plasmidique) sont déposés sur gel en présence de 10 % (v/v) de

tampon de charge (Tableau M.5). L’électrophorèse est conduite dans du tampon TBE à un

voltage constant.

La taille des fragments d’ADN est estimée par comparaison avec la migration des

standards de tailles connues (marqueur "1 kb Plus DNA Ladder®") (Invitrogen).

6. Amplification d’ADN par PCR

La technique de PCR (Polymerase Chain Reaction) utilisée est celle décrite par Saiki

(Saiki et al., 1989). Elle est basée sur la répétition d’un cycle comprenant trois étapes : la

dénaturation de l’ADN séparant les deux brins qui serviront de matrices, l’hybridation d’une

amorce spécifique sur chaque brin matrice et la synthèse, à partir des amorces, d’un brin

d’ADN par une ADN polymérase thermorésistante de Thermophilus aquaticus (Taq ADN

Polymerase®, Promega).

La composition de l’essai pour un volume réactionnel de 40 µl est détaillée dans le

Tableau M.6. L’ADN polymérase Platinium® Pfx (Invitrogen) est une ADN polymérase

haute fidélité qui a été utilisée lors des étapes de mutagénèse dirigée réalisées sur le gène pgk.

Le choix des amorces et, plus précisément, leur température de fusion (ou Tm) est un

critère très important. Le Tm est défini par la température à laquelle 50 % des molécules

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115

bicaténaires sont dénaturées. Il dépend de la longueur de l’amorce, du pourcentage en G+C,

de la complémentarité de l’amorce avec sa matrice et de la composition du milieu réactionnel

(concentration en sels et/ou en agents dénaturants). Le Tm des amorces est estimé selon la

formule simplifiée de Wallace : Tm = 4 x nombre de bases (G + C) + 2 x nombre de bases (A

+ T), sachant que les bases comptabilisées sont celles qui hybrident effectivement avec le brin

matrice (les mismatches ne sont pas pris en compte). Chez S. citri, le pourcentage du génome

en G+C est faible. Ainsi, pour éviter des hybridations aspécifiques, il est préférable de choisir

des amorces dans les régions relativement riches en G+C, en particulier pour l’extrémité 3’ de

l’amorce. Dans certains cas, des sites de restriction, compatibles avec le site de linéarisation

du vecteur, ont été introduits dans les amorces pour faciliter le clonage des fragments d’ADN

amplifiés. Pour permettre une digestion efficace, les sites de restriction ont été introduits, au

minimum, à 4 bases de l’extrémité 5’ de l’amorce.

L’ensemble des amorces, ainsi que les cycles de température, utilisées dans cette étude

sont présentés dans le Tableau M.7.

7. Mutagénèse dirigée

S. citri possède un code génétique différent du code génétique universel. Le codon

UGA, qui est un des trois codons de terminaison dans le code universel, code pour le

tryptophane chez S. citri (Citti et al., 1992). Pour exprimer la PGK chez E. coli, il faut donc

muter les deux codons TGA, contenus dans la séquence du gène pgk, en TGG. La méthode

utilisée repose sur des amplifications PCR successives faisant intervenir des couples

d’amorces portant le nucléotide muté à insérer (Hames et al., 2005).

8. Clonage de fragment d’ADN amplifié par PCR

8.1. Préparation du fragment PCR

Les fragments d’ADN à cloner sont issus soit de l’hydrolyse enzymatique des produits

PCR, soit de l’hydrolyse enzymatique de plasmides recombinants préalablement obtenus. Ils

sont alors purifiés avec le kit Wizard SV® Gel and PCR clean up system (Promega). Cette

étape permet d’éliminer les enzymes, les dNTP, et les amorces encore présents dans le

mélange.

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116

8.2. Préparation du vecteur

Les vecteurs plasmidiques sont linéarisés par hydrolyse avec la/les enzymes de

restriction appropriées. Lorsque cela est nécessaire (lorsque le vecteur n’est hydrolysé que par

une seule enzyme de restriction), les extrémités 5’ sont déphosphorylées par la phosphatase

alcaline (Calf Intestinal Alkalin Phosphatase®, Promega) pour empêcher la recircularisation

du plasmide au cours de la ligation. Les vecteurs, déphosphorylés ou non, sont ensuite

déprotéinisés par purification sur colonne par le kit Wizard SV® Gel and PCR clean up

system (Promega) et repris dans 50 µl d’eau stérile.

8.3. Ligation du fragment PCR et de son vecteur

L’ADN ligase du bactériophage T4 catalyse la formation d’une liaison phosphodiester

entre les extrémités 3’-OH du vecteur déphosphorylé et les extrémités 5’-P du fragment

d’ADN à cloner. Le vecteur est mis en présence du fragment à cloner suivant un ratio 1:3 et

d’une unité de ligase dans le tampon d’activité de l’enzyme préconisé par le fournisseur

(Promega) dans un volume final de 10 µl. La ligation est réalisée par incubation à température

ambiante pendant 4 heures ou toute la nuit à 4°C.

9. Transformation des bactéries

9.1. E. coli

9.1.1. Electrocompétentes

A partir d’une préculture de 5 ml de E. coli DH10B, 500 ml de milieu LB sont

ensemencés et cultivés sous agitation et à 37 °C. Lorsque l’absorbance à 550 nm de la culture

atteint 0,7, les cellules sont centrifugées à 4 °C, pendant 10 minutes à 6 000 g. Le culot

bactérien est remis en suspension dans 500 ml d’eau stérile glacée et les cellules sont

centrifugées à nouveau à 4 °C pendant 10 minutes à 6 000 g. Les cellules sont ensuite lavées

dans 250 ml d’eau stérile glacée avant d’être centrifugées à 4 °C pendant 10 minutes à 6 000

g. Le culot de cellules est finalement remis en suspension dans 10 ml de glycérol (10 % v/v)

glacé et stérile. Les cellules sont ensuite aliquotées par fractions de 40 µl qui sont

immédiatement congelées dans un bain d’éthanol refroidi par de la carboglace puis

conservées à - 80 °C.


117

La transformation est réalisée avec un électroporateur Gene Pulser® (BIO-RAD®). Les

bactéries électrocompétentes (40 µl) sont décongelées dans la glace et mélangées à 60µl d’eau

stérile et 2 µl de mélange de ligation. Après cinq minutes dans la glace, le mélange est

transféré dans une cuve à électroporation dont les électrodes sont distantes de 0,2 cm.

L’électroporateur est réglé sur une tension de 12,5 kV/cm, une capacitance de 25 µF, et une

résistance de 200 Ω. Dans ces conditions, la durée du choc électrique est d’environ 6 ms.

Immédiatement après l’impulsion électrique, les bactéries sont transférées dans 1 ml de milieu

SOC (Tableau M.2) et incubées à 37 °C pendant 30 minutes. Deux cent microlitres du

mélange sont étalés sur milieu solide en présence du marqueur de sélection adéquat et incubés

à 37 °C. Lorsque cela est nécessaire, 40 µl d’une solution d’IPTG à 100 mM (Isopropyl-β-

thiogalactopyranoside) et 40 µl d’une solution à 2% de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-

D-galactopyranoside) ont été préalablement étalés sur les boites de Pétri. Après une nuit

d’incubation à 37 °C, les cellules transformées sont sélectionnées par leur résistance à

l’antibiotique. En fonction des vecteurs utilisés, les bactéries contenant un plasmide

recombinant sont éventuellement sélectionnées par leur capacité à produire la β-galactosidase

par α-complémentation.

9.1.2. Chimiocompétentes

La transformation au chlorure de calcium (CaCl2) (Mandel & Higa, 1970) a été utilisée

lors de la transformation de la souche d’E. coli BL21 Star™ (DE3) par le vecteur

d’expression pET28a(+) contenant soit la séquence du gène pgk, soit celles des différents

peptides de la PGK. Pour chaque transformation, trois ml de culture ont été ensemencés et

incubés à 37 °C sous agitation. Lorsque l’absorbance à 550 nm de la culture atteint 0,7, les

cellules sont incubées 30 minutes dans la glace puis centrifugées à 4 °C, pendant 10 minutes à

5 000 g. Le culot bactérien est remis en suspension dans 2 ml d’une solution à 54 mM de

CaCl2 stérile glacée. Après une incubation de 15 minutes dans la glace, les cellules sont

centrifugées à nouveau à 4 °C pendant 10 minutes à 5 000 g. Le culot de cellules est remis en

suspension dans 200 µl de CaCl2 glacé et stérile. Pour augmenter l’efficacité de

transformation, les cellules sont ensuite conservées entre 4 et 12 heures à 4 °C. Les bactéries

chimiocompétentes sont mélangées à 1-2 µg de plasmide (pET28a(+) contenant les différents

fragments ADN). Après 30 minutes dans la glace, le mélange est incubé 60 secondes à 42 °C

dans un bain-marie. Puis 1 ml de LB est ajouté sur le mélange qui est incubé 1 heure à 37 °C

Digestion enzymatique

Fragments àbouts francs

Ligationadaptateur

Séquence connue TetMFragment génomique couplé aux adaptateurs

Amorces spécifiques du TetM et de l’adaptateur

Amplification PCR

Tet1R

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AP2

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PCR nichéeProduit final contenant une partie du TetM mais aussi la partie génomique adjacente àidentifier

Séquençage

Figure M.8: Approche par marche sur le chromosome pour l’identification des gènes mutés par recombinaison illégitime.


118

sans agitation. 250 µl sont incubés sur milieu solide en présence de kanamycine (30 µg/ml) à

37 °C.

9.2. S. citri

Les spiroplasmes sont transformés par électroporation selon la méthode décrite par

McCammon (McCammon et al., 1990) et modifiée par Stamburski (Stamburski et al., 1990).

Trois millilitres d’une culture de S. citri sont centrifugés à 20 000 g pendant 15 minutes à 18

°C. Le culot de cellules est remis en suspension dans 2 ml de tampon Hepes-Saccharose (HS ;

8 mM Hepes, 280 mM Saccharose [pH 7,4]). Après une deuxième centrifugation dans les

mêmes conditions, le culot est finalement remis en suspension dans 400 µL de tampon HS.

Pour la transformation, 1 à 2 µg d’ADN plasmidique sont mélangés à 400 µl de

cellules dans une cuvette d’électroporation (distance inter-électrodes de 0,4 cm) et celle-ci est

maintenue dans la glace pendant 10 minutes. Un témoin sans ADN est systématiquement

réalisé afin de suivre l’apparition éventuelle de résistants spontanés. Les transformations sont

effectuées avec un électroporateur Gene Pulser® (BIO-RAD) réglé sur une tension de 6,25

kV/cm, une capacité de 3 µF et une résistance de 1 000 Ω. Dans ces conditions, la durée du

choc électrique est d’environ 1 à 3 ms. Après 3 heures d’expression phénotypique à 32 °C

dans 1 ml de milieu SP4, des dilutions 100, 10-1 et 10-2 du mélange de transformation sont

étalées sur milieu SP4 solide contenant de la gentamicine (100 µg/ml). Après 2 à 3 semaines

d’incubation à 32 °C, les colonies sont ensemencées en milieu liquide contenant l’antibiotique

adéquat. Ce premier ensemencement correspond au premier passage.

10. Marche sur le chromosome

La technique de marche sur le chromosome a été réalisée en utilisant le kit

GenomeWalker™ DNA walking (BD Biosciences) dont le principe est schématisé sur la

figure M.8.

2 µg d’ADN chromosomique de chacun des mutants de S. citri considéré ont été

digérés par une des deux endonucléases SmaI ou HincII pendant 4 h à 37°C. Le choix des

amorces tient compte de deux paramètres importants qui sont, dans un premier temps, que les

enzymes doivent digérer l’ADN donnant des bouts francs afin de permettre l’ajout par ligation

d’adaptateurs indispensables aux amplifications ultérieures. Dans un second temps, les

enzymes ne doivent pas coupées avec une fréquence élevée afin de ne pas digérer l’ADN dans

la région d’intérêt.


119

L’ADN ainsi digéré a été ensuite purifié puis ligué avec les adaptateurs fournis avec le

kit. La ligation s’est effectuée toute la nuit à 16°C selon les instructions du fournisseur. Le

mélange est ensuite incubé 5 min à 70°C afin de dégrader la ligase présente dans le mélange

réactionnel. 60 µl de TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) sont ajoutés au mélange.

Dans notre cas, les régions codantes à identifier ayant inséré le fragment interne pgk,

lui-même fusionné au gène tetM, ce dernier devient de ce fait le gène idéal pour servir de base

aux amplifications suivantes. En effet, afin de pouvoir séquencer et identifier le gène disrupté,

une PCR nichée est nécessaire afin d’amplifier la région comprise entre les adaptateurs et ce

gène TetM. Le design des amorces pour cette PCR nécessite obligatoirement la présence d’un

gène de séquence connue à proximité de ce dernier, ce qui est le cas du gène TetM. La

première amplification par PCR se déroule avec l’aide des oligonucléotides AP1 et Tet1R

selon les conditions détaillées à la figure M.7.

Un µl de cette première PCR a ensuite servi de matrice pour la PCR nichée suivante

qui utilise les oligonucléotides AP2 et Tet7. Les conditions utilisées au cours de cette seconde

amplification (figure M.7) ont permis d’obtenir des fragments de tailles variables (figure

4.7B) qui ont par la suite été envoyés à séquencer.

IV. Méthodes d’analyse des protéines

1. Extraction des protéines

1.1. Préparation des protéines de S. citri

1.1.1. Protéines pour l’électrophorèse mono-dimensionnelle

Cent ml de S. citri (108-109 spiroplasmes/ml) sont centrifugés à 12 000 g à 4 °C

pendant 20 minutes puis le culot est lavé trois fois dans 50 ml de tampon Hepes-Saccharose.

Les cellules sont remises en suspension dans 600 µl de PBS en présence de 1mM de

phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF). La suspension de spiroplasmes est ensuite lysée par

sonication (sonicateur Vibracell, Sonics and Materials, Inc., Danbury, CT, 40% pulses/s, 50

W, 4 °C) en suivant 3 cycles alternant 1 minute de sonication et 1 minute d’incubation dans la

glace. Le dosage de protéines est réalisé avec le kit Bio-Rad Protein Assay (§ IV.4.1). Le

rendement moyen est de 2,4 mg de protéines pour 100 ml de culture de S. citri.

Tampon de réhydratation TCT

Urée 7 MTriton X-100 (v/v) 2%Chaps (p/v) 4%Thiourée 2 MDTT 10 mMAmpholytes (v/v) 2%

Figure M.9: Composition du tampon de réhydratation pour l’électrophorèse 2-D.


120

1.1.2. Protéines pour l’électrophorèse bi-dimensionnelle

Les spiroplasmes, pris à partir de 1 L de culture en phase exponentielle de croissance,

sont centrifugés puis lavés comme précédemment (§ IV.1.1.1). Le culot est ensuite remis en

suspension dans 600 µl de tampon de réhydratation préparé extemporanément (tableau M.9).

Le dosage est réalisé selon la méthode de Bradford modifié (§ 4.2).

1.1.3. Fractionnement des protéines membranaires

Une culture de spiroplasme est tout d’abord centrifugée dans les mêmes conditions

que celles utilisées pour la préparation des protéines totales de S. citri. Le culot est ensuite

remis en suspension dans 30 ml de tampon de conservation (50 mM TrisHCl ; 500 µM PMSF,

pH 7). Les cellules sont lysées par sonication et la suspension est centrifugée à 500 g pendant

2 minutes à 4 °C afin d’éliminer un éventuel dépôt de titane dû à la sonication par ultrasons.

Le surnageant est récupéré et les membranes sont récoltées par centrifugation à 20 000 g

pendant 1 h à 4°C. Les membranes sont ensuite lavées 4 fois dans un tampon de lavage des

membranes (50 mM TrisHCl pH 7,5). Le culot final est repris dans un tampon adéquat pour la

suite de l’expérience. De manière générale, ce tampon peut être du phosphate de sodium 0,1

M (80 mM Na2HPO4 ; 20 mM NaH2PO4, pH 7,4) mais il peut aussi être remplacé par un

tampon spécifique lors des expériences de BN-PAGE (§ IV.10.1.1) ou bien de pontage par

des agents pontants (§ IV.10.2.1). Les protéines membranaires sont reprises dans un volume

minimal de tampon puis sont dosées avec le kit Bio-Rad Protein Assay (§ IV.4.1).

1.2. Préparation des protéines de C. haematoceps

1.2.1. Totales

Cent insectes sont capturés puis broyés dans un potter avec 1 ml de PBS contenant

1 mM de PMSF. Le lysat est ensuite centrifugé à 10 000 g à 4 °C pendant 1 minute afin

d’éliminer les débris (des ailes et des pattes notamment). Les protéines ne sont pas purifiées

davantage afin d’éviter la perte de protéines d’intérêt. Les protéines sont dosées avec le kit

Bio-Rad Protein Assay (§ IV.4.1) et le rendement moyen obtenu est de 3,6 mg de protéines

totales pour 100 insectes broyés.

Figure M.10: Mutagénèse dirigée suivie du clonage dans le vecteur d’expression pET28a(+) du gène pgk de S. citri.

EcoRINdeI

HindIII

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Mutagénèse dirigée des deux codons

tryptophanes TGA

pET28a(+)(5369pb)

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Kan

R

His

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PGK mutée

pBluescript KS (+)(2958pb)

PGK mutée

ApR

lacIori

Clonage EcoRI/HindIII

Clonage NdeI/HindIII

Séquençage du gène pgk muté


121

1.2.2. Glandes salivaires

Les glandes salivaires, extraites et conservées dans le PBS à -20°C, sont décongelées

lentement dans la glace. Elles sont broyées, purifiées et dosées dans les mêmes conditions que

précédemment (§ IV.1.2.1).

1.2.3. Pour l’électrophorèse bi-dimensionnelle

Cent insectes sont broyés dans un mortier avec de l’azote liquide puis la poudre est

remise en suspension dans un potter contant une solution froide (acétone ; 10 % (w/v) acide

trichloroacétique (TCA) ; 0.07 % β-mercaptoéthanol). En ce qui concerne les glandes

salivaires disséquées, le broyage s’effectue directement dans un potter contenant cette même

solution. La suite du protocole est commune aux deux préparations. Après une précipitation

de 1h à -20°C, la suspension protéique est centifugée à 20 000 g à 4°C pendant 20 minutes

puis lavée trois fois dans la même solution à laquelle le TCA a été omis. Le culot est séché à

température ambiante puis remis en suspension dans 600 µl de tampon TCT (tableau M.9).

2. Production de protéines recombinantes tagguées His6

2.1. His6-PGK

Les étapes, allant de la mutation des deux codons tryptophanes présents dans sa

séquence, indispensable à son expression chez E. coli, jusqu’au clonage dans le vecteur

d’expression pET28a(+) (Novagen), sont schématisées dans la figure M.10.

Le produit amplifié de 1 239 pb correspondant au gène pgk, dans lequel les deux codons stop

TGA ont été substitués par un codon TGG (§ IV.7), a été inséré le plasmide pBS et la

construction est utilisée pour transformer la bactérie E. coli DH10B. Le gène d’intérêt est

ensuite transféré dans le plasmide pET28a(+) (Novagen) aux sites NdeI/HindIII et 1µg du

plasmide recombinant, nommé pET28FL, sert à la transformation de E. coli DH10B. L’insert

est ensuite séquencé afin de s’assurer qu’aucune mutation n’ait été insérée au cours des

manipulations. Deux µg du pET28FL portant les deux mutations désirées sont utilisés pour

transformer E. coli BL21(DE3). Les transformants sont sélectionnés sur milieu LB solide

contenant 50 µg/µl de kanamycine à 37°C.


122

Un transformant est repiqué puis cultivé dans 500 ml de milieu LB contenant 30 µg/µl

de kanamycine jusqu’en fin de la phase exponentielle de croissance (DO600nm = 0.6). Dans

ce système d’expression, utilisant le plasmide pET28a(+), l’expression de la protéine

recombinante est sous la dépendance d’un promoteur inductible à l' isopropyl-β-D-

thiogalactopyranoside (IPTG). La concentration d’IPTG ainsi que le temps d’induction

peuvent être variables selon l’expression et la toxicité des protéines à produire. La PGK étant

très facilement induite en grande quantité, le temps d’incubation optimal est relativement

court et la concentration en IPTG relativement faible.

La His6-PGK recombinante est alors produite à 28°C en ajoutant 0,1 mM d’IPTG

pendant 4h.

La culture est ensuite centrifugée à 7 000 g pendant 10 minutes à 4°C et le culot est

resuspendu dans 10 ml de tampon de lyse (50 mM Tris HCl ; 0,3 M NaCl, pH 8). Après 10

minutes d’incubation à température ambiante, la préparation est à nouveau incubée 10

minutes supplémentaires a température ambiante avec du lysozyme à une concentration de 0,2

mg/ml. Le mélange est ensuite soniqué (50 % pulses/s ; 50W ; 4°C ; 1 minute de sonication

en alternance avec 1 minute dans la glace) jusqu’à qu’un lysat translucide soit obtenu. Les

protéines sont séparées par centrifugation à 13 000 g pendant 10 minutes à 4°C et le

surnageant, contenant les protéines solubles mais également la His6-PGK, est purifié sans

congélation préalable.

2.2. His6 PGK FL1, 2, 3, 4, 5

Les séquences nucléiques de chacun des peptides de la PGK ont été obtenues par

réamplification PCR du pET28FL, linéarisé par HindIII, contenant le gène pgk dans lequel les

deux codons TGA ont été mutés. Les amorces utilisées pour l’amplification de chacun des

peptides sont présentées dans le tableau 5.7. Chacun des inserts est inséré dans le pET28a(+)

aux mêmes sites que ceux ayant servi pour l’insertion du gène pgk, les plasmides

recombinants sont par la suite utilisés pour transformer E. coli DH10B. La séquence de

l’insert est vérifiée par séquençage puis E. coli BL21(DE3) est transformée afin de produire

chacun des peptides. L’expression des ces peptides suit le même protocole que celui utilisé

pour l’expression de la PGK pleine longueur (§ IV.2.1), à l’exception du temps d’induction

des peptides suite à l’ajout d’IPTG qui est passé de 4h à toute la nuit pour obtenir des

quantités de protéines produites satisfaisantes.

Figure M.11: Recherche du partenaire de l’actine par chromatographie d’affinité

Anticorps anti-actine

Protéines deS.citri

actine

Autres protéines d’insectes

Protéines deS.citri

1: CONTRÔLEElution de protéines de

S.citri en l’absence d’actine

2: PIEGAGEElution de protéines de

S.citri en présence d’actine


123

3. Purification des protéines par chromatographie liquide

3.1. Colonne de protein A Sépharose CL-4B

La Protein A Sepharose™ CL-4B est une résine de Sépharose CL-4B sur laquelle est

fixée de la protéine A, protéine qui possède la capacité à se lier à la région Fc des

immunoglobulines par le biais de la chaîne lourde des ces dernières. Cette liaison est réalisée

par le bromure de cyanogène (CNBr) qui est l'un des réactifs les plus utilisés pour coupler une

cible à la matrice d'une colonne. Comme seule la région Fc des anticorps est utilisée pour la

liaison avec la protéine A, la région Fab des anticorps est disponible pour interagir avec

l’antigène.

Le principe de cette chromatographie est schématisé sur la figure M.11.

Des anticorps de lapin dirigés contre l’actine de poulet (Sigma) ont été liés à la protein

A Sepharose™ CL-4B selon les instructions du fournisseur (GE Healthcare). L’ensemble du

fractionnement a été réalisé sur la chaîne de chromatographie basse pression AKTA purifier

(GE Healthcare).

Une première élution de protéines de S. citri, servant de contrôle négatif, est réalisée

en l’absence de protéines d’insecte, et donc d’actine. 500 µg de protéines de S. citri (§

IV.1.1.1) sont chargées sur la colonne. Les protéines retenues sont éluées avec 20 ml d’un

gradient de 0 à 2M NaCl. L’analyse de ces protéines permet de visualiser, sur gel de

polyacrylamide, les protéines contaminantes qui sont retenues soit sur la résine de protein A

Sépharose, soit par les anticorps anti-actine. Après un lavage de la colonne en NaCl 2M afin

d’éliminer tous ces contaminants, les protéines d’insectes sont déposées sur la colonne et

l’actine se fixe de manière spécifique sur les anticorps. Cette fixation spécifique de l’actine a

été vérifiée par un Western blot réalisé sur ces mêmes protéines d’insectes sur lesquelles

l’anticorps anti-actine reconnaît uniquement une protéine à 42 kDa, masse moléculaire de

l’actine

Pour fixer l’actine de l’insecte vecteur sur les anticorps anti-actine, 1 mg de protéines totales

d’insectes (§ IV.1.2.1) sont chargées sur la colonne. Les protéines retenues de façon non

spécifique sur la colonne sont décrochées par un lavage avec 10 ml d’une solution 2 M NaCl.

Par la suite, 500 µg de protéines de S. citri (§ IV.1.1.1) sont chargées à leur tour sur la

colonne. Les protéines liées à l’actine de façon spécifique sont éluées avec 20 ml d’un gradient

de 0 à 2M NaCl. Toutes les protéines éluées à cette étape sont fractionnées par SDS-PAGE

Tableau M.13: Composition du tampon utilisé pour la lyse des protéines au cours de l’expression des protéines recombinantes.

Tampon ANa2HPO4 0,1 M 40,5 mlNaH2PO4 0,1M 9,5 mlNaCl 0,25 MH2O qsp 100 ml

Figure M.12: Liaison d’un atome de nickel avec les acides aminés histidines de l’étiquette placée en N-terminal des protéines recombinantes.


124

puis colorées au bleu colloïdal afin d’être envoyées à la spectrométrie de masse ou bien

transférées sur membrane de nitrocellulose pour une analyse en far Western.

3.2. Purification de protéines recombinantes

Le protocole de purification de protéines recombinantes regroupe plusieurs étapes

jusqu’à l’obtention d’une protéine pure à partir d’un lysat bactérien. Il consiste à élué, dans un

premiers temps, la protéine sur une colonne d’affinité de nickel permettant une première

purification. La protéine subit ensuite un passage sur une colonne échangeuses d’ions ce qui

élimine les éventuelles contaminations protéiques laissées par la précédente étape.

La His6-PGK fut la seule protéine recombinante produite au cours de cette thèse à

subir ce protocole de purification de manière complète. Les autres peptides de la PGK

produits au cours de ce travail n’ont pas subit la dernière étape de purification sur colonne

échangeuses d’ions.

L’ensemble de ces étapes se déroulent à 4°C (dans une chambre froide ou lorsque cela

n’est pas possible, les tampons sont maintenus dans la glace).

3.2.1. IMAC (immobilized metal affinity chromatography)

La résine utilisée pour la purification de la PGK recombinante est une résine IMAC

(Immobilized Metal Affinity Chromatography) utilisant un ion de nickel (nickel-nitriloacetic

acid ou nickel-NTA) comme site actif. L'ion Ni2+ possède six liens de coordination : quatre

sont sollicités par le NTA pour l'immobiliser sur la résine; il en reste donc deux pour interagir

avec les atomes d'azote du cycle de la chaîne latérale de deux résidus histidines

(figure M.12).

Ici, nous avons utilisé une résine pré-chargée en Nickel (Qiagen ou Bio-Rad ; 50 %

slurry) pour un volume final de colonne de 1 ml. Avant de charger les échantillons, la colonne

est lavée à l’aide de 10 volumes d’H2O MilliQ afin d’éliminer l’éthanol présent puis elle est

équilibrée à l’aide de 10 volumes de tampon de lyse (§ IV.2.1). Il est important de ne jamais

laisser la colonne se dessécher.

Les surnageants, contenant les protéines solubles (environ 10 ml) obtenus après

l’induction de la protéine chez E. coli BL21(DE3), sont chargés sur la colonne. A partir de cet

instant, les protéines éluées sont récupérées en fractions de 1 ml. Après avoir récupéré les

protéines non retenues, la colonne est lavée avec 10 volumes de tampon A + 0,1 % Triton X-

Figure M.14: Elution des protéines au cours de l’étape de dessalage sur colonne PD-10.


125

100 suivis par 10 volumes de tampon A (tableau M.13) afin d’éliminer le Triton X-100

amené lors du premier lavage.

L’élution des protéines recombinantes se fait par compétition avec l’imidazole qui

entre en compétition avec les résidus histidines pour la fixation sur le nickel par

l’intermédiaire de ses propres atomes d’azote. Trois ml de concentrations croissantes

d’imidazole (0,01 M ; 0,025 M ; 0,05 M ; 0,1 M ; 0,25 M ; 0,5 M) en solution dans du tampon

A sont chargées sur la colonne. Cinquante µl de chaque fraction de 1 ml sont prélevés pour

être analysés sur gel SDS-PAGE. Le reste des élutions va subir un dessalage sur colonne

d’exclusion afin d’éliminer l’imidazole présent dans le tampon.

Une fois l’élution terminée, la colonne est lavée avec 10 volumes de tampon A +

0,5 M Imidazole suivi de 10 volumes d’éthanol 20 %. La colonne peut être ainsi conservée à

4°C sans jamais laisser la résine se dessécher.

3.2.2. Chromatographie d’exclusion

Après avoir déterminé sur gel SDS-PAGE quelles fractions d’élutions contenaient la

protéine recombinante, chaque fraction d’intérêt (1 ml) est déposée sur une colonne de gel

filtration de type PD-10 (GE Healthcare). Ces colonnes sont destinées à la séparation de

protéines de masses moléculaires supérieures à 5 000 Daltons. Les molécules de masse

moléculaire supérieure à 5 000 Da sont excluent de la matrice Sephadex G-25 et sont donc

éluées en premier. Les molécules de masse moléculaire inférieure aux pores de la matrice

peuvent donc pénétrer dans ces dernières et de ce fait sont éluées plus tardivement.

La colonne est tout d’abord équilibrée avec un tampon phosphate (80 mM Na2HPO4 ;

20 mM NaH2PO4, pH 8), tampon qui sera celui dans lequel la protéine sera éluée et

conservée. Le volume maximal d’échantillons pouvant être chargé sur la colonne est de 2,5

ml. Une première fraction d’intérêt de 1 ml est chargée sur la colonne. Une fois que la

solution protéique est entièrement pénétrée dans la matrice, le volume est ajusté à 2,5 ml final

en ajoutant du tampon d’équilibration. L’élution est réalisée dans un volume final de 3,5 ml

de tampon d’équilibration suivant la cinétique décrite dans la figure M.14. Chaque fraction

récupérée est dosée, aliquotée et conservée à -20°C dans le tampon phosphate précédemment

cité.

Polyacrylamide 40 %(pv) 1 ml 9,3 ml 7,5 ml 1,85 ml 5,6 mlTris-HCl 1 M pH 6,8 2,5 ml - - - -Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 - 9 ml 9 ml 4,5 ml 4,5 mlSDS 20 % (p/v) 50 µl 150 µl 150 µl 75 µl 75 µlqsp H2O 10 ml 30 ml 30 ml 15 ml 15 ml

APS 10 % (p/v) 50 µl 150 µl 150 µl 100 µl 100 µlTEMED 10 µl 15 µl 15 µl 10 µl 10 µl

Gel de concentration à 4 %

Gel de séparation à concentration constante

Gel de séparation en gradient (5-15 %)

12,50% 10%Solution à

5 %Solution à

15 %

Tableau M.16: Composition des différents gels SDS utilisés au cours de cette thèse.

Tableau M.15: Composition du tampon de charge utilisé pour l’électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes.

Tampon Laemmli 2XTris-HCl pH 6,8 100 mMβ-mercaptoéthanol 10 % (v/v)SDS 4 % (p/v)Bleu de bromophénol 0,2 % (p/v)Glycérol 20 % (v/v)


126

3.2.3. Fractionnement sur colonne échangeuse d’ions

Une dernière étape de purification supplémentaire peu s’avérer nécessaire lorsque la

pureté de la protéine n’est pas suffisante. En effet, produite en grande quantité, le profil

élution après dessalage montrait de nombreuses contaminations protéiques. Les profils

d’élution des autres peptides de la PGK ne montraient pas de contaminations majeures

susceptibles d’inférer avec la suite des analyses. Un fractionnement par chromatographie

d’échanges d’ions a donc été réalisé uniquement lors de la purification de l’His 6-PGK. Ce

type de chromatographie permet de séparer des protéines ayant des propriétés ioniques

différentes.

Les fractions protéiques d’intérêt sont reprises dans un tampon phosphate à pH 8. Le

pI théorique de la PGK recombinante est de 6,54 (http://expasy.org/tools/pi_tool.html). A un

pH de 8, la charge globale nette de la protéine est donc négative. Pour cette seconde étape de

purification, une colonne échangeuse de cations a donc été utilisée. Celle-ci, chargée

positivement, retiendra de manière spécifique la PGK. L’élution des protéines fixées a été

effectuée par un gradient linéaire de NaCl (0 à 1 M) dans le tampon phosphate pH 8. Les

fractions récupérées sont analysées sur un gel d'électrophorèse.

4. Dosage des protéines

4.1. Bradford Le principe de ce dosage repose sur le changement de couleur d'un colorant en réponse

à différentes concentrations en protéines. La procédure utilisée est celle décrite par le

fournisseur (BIO-RAD) en utilisant une gamme de dilution standard de bovine serum

albumine (BSA).

4.2. Bradford modifié Ce protocole de dosage Bradford est adapté pour le dosage des protéines en

suspension dans le tampon de réhydratation des gels 2-D qui contient un certain nombre de

réactifs faussant le dosage classique. Le dosage des protéines s’effectue néanmoins par

comparaison avec une gamme de BSA de concentration connue (Ramagli & Rodriguez,

1985).

Tampon électrophorèse SDSTris 25 mMGlycine 0,2 MSDS (p/v) 0,10%H2O qsp 1 L

Tableau M.17: Composition du tampon utilisé pour l’électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes.

Figure M.18: Représentation schématique du dispositif de mélange d’acrylamide pour les gels en gradient.


127

5. Séparation des protéines en gel d’électrophorèse

5.1. Electrophorèse mono-dimensionnelle

Dans le système (SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel

Electrophoresis), les protéines saturées par les molécules de SDS (détergent anionique),

chargées négativement, migrent dans un champ électrique en fonction de leur masse. Les gels

de polyacrylamide utilisés sont coulés entre deux plaques de verre séparées par des bandes de

téflon de 1,5 mm d’épaisseur. Les échantillons sont incubés dans le même volume de tampon

de charge Laemmli 2X (tableau M.15) avant d’être déposés sur gel.

5.1.1. Gels de polyacrylamide à concentration constante

La technique utilisée est celle décrite par Sambrook et coll. (Sambrook et al., 1989).

Le gel est constitué d’un gel de séparation d’environ 12 cm, préalablement polymérisé (sous 1

ml de butanol saturé en eau) surmonté d'un gel de concentration d’environ 3 cm. La

composition des gels de polyacrylamide est décrite dans le tableau M.16. Après le dépôt des

échantillons, l’électrophorèse est conduite à 80 V pendant la migration dans le gel de

concentration (1 h) afin d’éviter toute diffusion des protéines puis le reste de l’électrophorèse

est réalisée à voltage constant (50 à 60 V), jusqu’à ce que le front de migration se trouve à 1

cm de la bordure du gel de séparation (migration toute la nuit). Le tampon d'électrophorèse est

indiqué dans le tableau M.17.

5.1.2. Gels en gradient de polyacrylamide 4-15 %

La technique utilisée est celle décrite par Swamy et al. (2006). Le gel se compose d’un

gel de concentration identique à celui décrit ci-dessus, et d’un gel de séparation dont la

composition est décrite dans le tableau M.16. Le gradient exponentiel de polyacrylamide est

réalisé par un mélangeur (figure M.18). Ce type de gel permet une meilleure résolution des

protéines qui possèdent des masses moléculaires élevées (supérieures à 100 kDa) tout en

conservant les protéines de faibles masses moléculaires dans le gel et est très utilisé dans

l’étude des complexes protéiques. L'électrophorèse est conduite de manière identique à celle

utilisée pour les gels de concentration constante à l’exception de celle menée pour la

migration des complexes protéiques en BN-PAGE (§ IV.10.1.2.1).

Tampon équilibration I: 10 ml base équilibration + 250 µl DTT 2M

Tampon équilibration II: 10 ml base équilibration + 231,2 mg iodoacétamide

Base équilibration

Urée 6 MTris 50 mMSDS (p/v) 2%Glycérol (v/v) 30%H2O qsp 500 ml

Tableau M.19: Composition des tampons utilisés pour l’équilibration des protéines en vue d’une électrophorèse en conditions dénaturantes.


128

5.2. Electrophorèse bi-dimensionnelle

La combinaison des techniques d’IEF (IsoElectric Focusing) et de SDS-PAGE permet

d’obtenir un degré de résolution élevé, recherché pour la séparation de mélanges complexes

de protéines. La technologie actuelle utilise des gels pré-coulés à gradient de pH immobilisé

(IPG strips: Immobilized non-linear pH gradient strips) qui présente l’avantage de posséder le

gradient de pH définitivement fixé dans le strip évitant ainsi les problèmes de déplacement de

pH au cours de la migration qui était le cas avec la séparation d’IEF en tube. Dans ce travail,

les IPG strips utilisés qui ont d’une longueur de 17 cm de longueur avec une gamme de pH 5-

8 (BIO-RAD).

Les protéines de S. citri ou d’insectes qui doivent être analysées en électrophorèse

bidimensionnelle sont préparées comme décrit précédemment (§ IV.1.1.2 et § IV.1.2.3

respectivement). Trois cent µg de protéines sont déposés dans un volume minimal de 300 µl

et les strips sont réhydratés activement à 50 volts, 20°C entre 12 et 20 h en ayant pris soin de

recouvrir le strip avec 1 ml d’huile minérale afin d’éviter les risques d’évaporation. Après

réhydratation, la focalisation s’effectue selon le protocole fourni par BIO-RAD. L’ensemble

de ces opérations s’effectue dans l'appareil PROTEAN IEF Cell (BIO-RAD).

Avant de réaliser la seconde dimension, il est nécessaire d’ioniser les protéines avec

du SDS et de les réduire. Cette opération est effectuée par l’incubation du strip dans 10 ml de

tampon d’équilibration I (tableau M.19), pendant 10 min. Lorsque l’agent réducteur est le

DTT, il est nécessaire de procéder à une seconde incubation pendant 10 min avec le tampon

d’équilibration II qui contient de l’iodoacétamide (tableau M.19). Ceci prévient la ré-

oxydation des protéines au cours de l’électrophorèse et alkyle le DTT résiduel, minimisant les

traînées verticales qui sont observées sur certains gels. Ces tampons doivent être préparés

extemporanément.

Le strip est ensuite soudé avec de l’agarose 1 % dans une solution de Tris-HCl 1 M pH

6,8 au sommet du gel de concentration d’un gel SDS-PAGE (T = 12,5 %, C= 0,5 %, 1 mm

d’épaisseur). La deuxième électrophorèse sépare donc les protéines en fonction de leur masse

moléculaire. L’électrophorèse s’effectue à 70V jusqu’à ce que le front de migration se trouve

à 1 cm de la bordure du gel de séparation.

Solution de fixationEthanol 50 % (v/v)

Acide phosphorique 2 % (v/v)Solution de lavage Acide phosphorique 2 % (v/v)

Solution de sensibilisation

Ethanol 17 % (v/v)Acide phosphorique 2 % (v/v)

Sulfate d'ammonium 15 % (v/v)

Solution de coloration

Ethanol 17 % (v/v)Acide phosphorique 2 % (v/v)

Sulfate d'ammonium 15 % (v/v)Brillant Blue G-250 0,1% (p/v)

Solution de décoloration

H2O distillée

Solution de conservation

Acide acétique 1 % (v/v)

Tableau M.20: Composition des tampons utilisés pour la coloration des protéines au bleu colloidal.

Tableau M.21: Composition des tampons utilisés pour la coloration des protéines au nitrate d’argent.

Méthode classique Méthode compatible avec une analyse MALDI-TOF

Préfixateur 1: Méthanol 50 %, Acide Acétique 7 %

Préfixateur 2: Méthanol 10 %, Acide Acétique 10 %

Fixateur: Glutaraldéhyde 8,3 %

Solution pour augmenter l’efficacité

de la révélation- Thiosulphate de sodium 0,02 %

Solution de nitrate d’argent

NiAg, 1 g dans 20 ml d’eau, ajoutés dans 380 ml de la

solution soude (NaOH 0,4 % dans Ethanol 20 %, 1,5 ml

NH3)

NiAg 0,1 %

Solution de RévélationFormaldéhyde 200 µl

Ethanol 20 %

Carbonate de sodium 2 %Formaldéhyde 200 µl

Thiosulphate de sodium 0,01‰

Solution d’inactivationAcide Acétique 1 %Ethanolamine 200 µl

Ethanol 20 % Acide Acétique 1 %

Ethanol 50 %Acide Acétique 10 %

Solutions de Fixation


129

6. Visualisation des protéines après électrophorèse

Après électrophorèse, les gels sont colorés par l’une des techniques exposées ci-

dessous, en fonction de la sensibilité désirée et de l’analyse qui suivra. Quelle que soit la

méthode de coloration utilisée, chacune des étapes s’effectue à température ambiante et sous

agitation.

6.1. Coloration au bleu colloïdal

La coloration au bleu colloïdal, bien que moins sensible que celle au nitrate d’argent,

présente l’avantage d’être compatible avec des analyses ultérieures en spectrométrie de

masse. Les solutions nécessaires au cours de cette coloration sont regroupées dans le tableau

M.20. Le gel est tout d’abord fixé pendant 1 h dans une solution de fixation puis cette

solution est renouvelée pour 1 h supplémentaire de fixation. Le gel est ensuite incubé 1 h dans

une solution de lavage, 20 min dans une solution de sensiblisation puis coloré jusqu’à

obtention de la coloration désirée dans une solution contenant 0,1 % (w/v) de bleu colloïdal

G250. Le gel est ensuite lavé plusieurs fois avec de l’eau MilliQ afin d’éliminer le bruit de

fond éventuellement présent puis le gel est conservé dans une solution d’acide acétique 1 %

(v/v).

6.2. Coloration au nitrate d’argent classique

Cette méthode de coloration au nitrate d’argent donne des résultats très satisfaisants

mais interfère avec l’analyse de protéines par spectrométrie de masse. Les solutions utilisées

sont détaillées dans le tableau M.21. Après la séparation des protéines sur gel, ce dernier est

lavé dans de l’eau milli Q pendant 2 min. La fixation des protéines dans le gel s'effectue dans

une solution de préfixateur 1 pendant 4 h puis, dans un second temps, le même gel est incubé

dans une solution de préfixateur 2 toute la nuit. Le gel est ensuite lavé dans de l’eau milli Q

pendant 15 min et immergé 45 min dans une solution de fixation. Après trois lavages dans

l’eau de 15 min chacun, le gel est plongé deux fois 15 min dans une solution d'éthanol à 20 %.

La solution de coloration est réalisée extemporanément de la façon suivante: 1 g de

NiAg est dissout dans 20 ml d’eau milli Q. Celle-ci est versée doucement à la surface d'une

solution de soude tout en remuant pour éviter la précipitation. Si un précipité brun apparaît, il

faut ajouter une solution d'ammoniaque pure jusqu'à ce qu'il disparaisse.

Tampon transfertTris 25 mMGlycine 150 mMMéthanol (v/v) 10%H2O qsp 1 L

Tableau M.22: Composition du tampon utilisé pour le transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose.

Anticorps Spécificité Dilution UtilisationAnti-S. citri GII3 Polyclonal 5 µg/ml Far Western anti-S. citri

Anti-P32 Polyclonal 1:50ème BN-PAGE

Anti-actine Polyclonal 1:200èmeRecherche partenaire actine (chromatographie d'affinité)

Far Western anti-actine

Anti-PGK Polyclonal pur Localisation PGK(Western blot anti-PGK)

Anti-His Monoclonal 1:3000ème Western-blot anti-his

Anti-IgG lapincouplé à la peroxydase

Monoclonal 1:50000ème

Anti-IgG souriscouplé à la peroxydase

Monoclonal 1:20000ème

Tableau M.23: Différents anticorps utilisés au cours de cette thèse.


130

Le gel est incubé immédiatement dans cette solution de coloration pour une heure à

l’abri de la lumière. Après deux lavages à l'éthanol 20 %, la révélation est effectuée par

immersion du gel dans la solution de révélation. Lorsque le contraste désiré est atteint, la

réaction est stoppée par immersion du gel dans la solution inactivation.

6.3. Coloration au nitrate d’argent compatible avec la spectrométrie de masse

6.3.1. Méthode O’Connell et al, 1997

Cette méthode, bien que moins sensible que la coloration au nitrate d’argent classique,

présente les avantages d'être plus sensible que celle au bleu colloïdal, compatible avec

l’analyse par spectrométrie de masse, mais aussi d'être rapide (O'Connell & Stults, 1997).

Après électrophorèse, le gel est lavé 30 min dans de l’eau milli Q et fixé pendant 30

min dans une solution éthanol 50 % et acide acétique 10 %. Il est ensuite lavé dans de

l'éthanol à 50 %, pendant 10 min. Les protéines sont sensibilisées au nitrate d'argent par

incubation de 5 min dans une solution de thiosulfate de sodium à 0,02 % (p/v). Le gel est

alors lavé 5 min dans l’eau milliQ puis immergé pendant 30 min à l’abri de la lumière dans

une solution de nitrate d’argent à 0,1 % (p/v), elle-même préalablement incubée 5 min dans la

glace à l’abri de la lumière. Après incubation, le gel est rincé rapidement deux fois dans l’eau

milliQ, puis développé dans une solution de révélation à base de carbonate de sodium, de

formaldéhyde et de thiosulfate de sodium (tableau M.21) jusqu'à obtention du contraste

désiré. La réaction est stoppée par immersion du gel dans une solution d'acide acétique à 1 %

(v/v).

6.3.2. Kit Proteosilver™ Silver Stain

Ce kit de coloration à l’argent permet une coloration sensible des protéines mais

présente surtout le grand avantage d’être très rapide tout en minimisant les inconvénients

d’une coloration à l’argent classique comme notamment le besoin d’être à l’obscurité afin un

bruit de fond important. De plus, cette coloration présente le grand avantage d’être compatible

avec une identification protéique par spectrométrie de masse. L’ensemble des gels a été coloré

en suivant les instructions du fournisseur (Sigma).

Tableau M.24: Quantités de protéines utilisées au cours des différents far Western réalisés au cours de cette thèse.

Utilisation Protéines "appât" Protéines "sondes"Anticorps utilisépour la révélation

Far Western anti-S. citri20 µg protéines

glandes salivaires insecte40 µg protéines totales S. citri Polyclonal anti-S. citri

Far Western anti-actine 20 µg protéines S. citri20 µg protéines

glandes salivaires insectePolyclonal anti-actine

Confirmation interactionpartenaire actine

Protéines éluéeschromatographie d'affinité

500 µg protéines totales insecte Polyclonal anti-actine

Far Western anti-PGKet anti-PGKFL1 à 5

2 µg His6-PGK2 µg His6-PGKFL1 à 5

500 µg protéines totales insecte500 µg protéines cellules Ciha-1

Polyclonal anti-actine

Confirmation interaction His6-PGKet His6-PGK FL1 à 5avec actine insecte

20 µg protéines cellules Ciha-140 µg His6-PGK

et His6-PGKFL1 à 5Monoclonal anti-histidine


131

7. Transfert des protéines et détection immunologique

7.1. Electrotransfert des protéines sur membrane de nitrocellulose

Après électrophorèse, les protéines sont transférées électriquement sur membrane de

nitrocellulose selon la méthode décrite par Towbin et coll. en 1979 (Towbin et al., 1979).

L’appareil utilisé est le "semi-dry transfer apparatus" de chez BIO-RAD. Trois feuilles de

papier Whatman 3MM imbibées de tampon de transfert (tableau M.22) sont déposées sur le

fond de la cuve qui constitue l’anode. La membrane de nitrocellulose également imbibée de

tampon de transfert est déposée sur les papiers Whatman. Le gel de polyacrylamide,

préalablement immergé 15 min dans du tampon de transfert, est déposé sur la membrane. Il

est ensuite recouvert de trois nouvelles feuilles de papier Whatman imbibées de la même

solution. Le couvercle correspondant à la cathode est ensuite déposé sur l’ensemble. Dans ces

conditions, les protéines étant chargées négativement, vont migrer du gel vers l’anode et ainsi

se déposer sur la membrane de nitrocellulose. Le transfert est réalisé sous une tension de 10

volts pendant un temps variable dépendant de la concentration en polyacrylamide du gel, de

sa taille et de la masse moléculaire des protéines d’intérêts à transférer. Par exemple, 25 min

sont suffisant au transfert de l’His6-PGK tandis que 45 min sont nécessaires au transfert d’un

profil total de protéines de S. citri sur un gel SDS-PAGE (T = 12,5 %, C= 0,5 %, 12 x 12 cm,

1,5 mm d’épaisseur).

Afin de vérifier l’efficacité du transfert des protéines sur la membrane, cette dernière

est colorée par une solution contenant 0,1 % (p/v) de rouge ponceau et 1 % d’acide acétique

(v/v). La coloration est éliminée par plusieurs rinçages à l’eau permutée stérile.

7.2. Détection immunologique des protéines sur membrane

Après le transfert, la membrane est saturée 1 h à température ambiante dans du lait

écrémé 6 % (p/v). La membrane est ensuite incubée 1 h avec les anticorps primaires dans une

solution de lait écrémé 1 % (p/v). L’ensemble des anticorps primaires utilisés au cours de ce

travail est regroupé dans le tableau M.23. Après 3 lavages de 15 min dans du PBS-Tween 20

(0,1 % v/v) suivi d’un lavage de 15 min en PBS, la membrane est incubée 1 h avec les

anticorps secondaires couplés à la peroxydase (anticorps de chèvre anti IgG (molécule

entière) de lapin ou anticorps de chèvre anti IgG (fragment Fc) de souris). Les anticorps

secondaires sont dilués dans la même solution 1 % lait écrémé (p/v). Après incubation, la

membrane est lavée dans le tampon PBS-Tween (3 fois pendant 15 min) suivi de nouveau

Figure M.25: Principe de la technique de far Western

1- Electrophorèse des protéines

d’insectes2- Transfert sur

membrane

3- Mise en contact avec les protéines de S. citri

5- Incubation avec des anticorps secondaires couplés à la peroxydase

6- Révélation

4- Incubation avec des anticorps anti-S. citri


132

d’un lavage de 15 min dans le PBS. L’activité de la peroxydase est révélée en présence d’un

substrat de la peroxydase : le Super Signal® West Pico (Thermo Scientific) selon le protocole

préconisé par le fournisseur. La membrane est incubée en présence d’un mélange composé

d’un volume de solution «Luminol/Enhancer» et d’un volume de solution «Stable Peroxyde»

pendant 5 min, égouttée puis placée dans une poche plastique. La révélation est réaliser par

chemiluminescence sur des films autoradiographiques (Hyperfilm™ ECL ; GE Healthcare).

8. Etude d’interaction protéine-protéine par la technique de far Western

A la vue des nombreux far Western différents réalisés au cours de ce travail, les

quantités de protéines nécessaires à chacune de ces analyses sont regroupées dans le tableau

M.24.

Outre ces spécificités, le protocole reste identique quelque soit les protéines utilisées.

Le schéma M.25 présente les différentes étapes composant cette technique d’étude in vitro.

Les protéines du premier partenaire sont déposées sur un gel SDS-PAGE puis sont transférées

sur membrane de nitrocellulose. Toutes les étapes du protocole se déroulent sous faible

agitation et les étapes d’incubation nécessitent la mise sous poche plastique de la membrane

afin de réduire les volumes à utiliser (contrairement aux étapes de lavages qui se déroulent en

bac pour permettre des lavages plus efficaces). La membrane est ensuite saturée dans du lait

écrémé 6 % (p/v dans du PBS) pendant 24 h à 4°C. La membrane est lavée succinctement

dans du PBS pour éliminer l’excédent de la solution de saturation avant que les protéines du

second partenaire ne soient mises à incuber en solution dans du PBS toute la nuit à 4°C. La

membrane est ensuite lavée dans du PBS-Tween (3 x 15 min) puis 15 min dans du PBS. Le

reste de la révélation est strictement identique au protocole utilisé pour le Western-blot.

9. Identification des protéines par spectrométrie en masse

Les bandes ou spots de gels, colorés au bleu colloïdal ou au nitrate d’argent

compatible, contenant les proteines d’intérêt sont soumis à une analyse par spectrométrie de

masse en LC-MS/MS réalisée au Pôle Protéomique de la plateforme de Génomique

Fonctionelle de l’Université de Bordeaux 2.

L’interrogation est réalisée soit contre la base de données généraliste nr de SwissProt,

soit directement contre la banque de protéines de S. citri.


133

10. Etude des complexes protéines chez S. citri

10.1. Technique de Blue-Native PAGE

10.1.1. Préparation des protéines

La préparation des protéines de S. citri pour l’analyse en BN-PAGE a nécessité

plusieurs ajustements de protocole aussi bien pour les protéines cytoplasmiques que

membranaires, notamment en ce qui concerne la concentration des détergents utilisés pour

l’extraction. Dans ce manuscrit, il est uniquement reporté le protocole ayant permis le

meilleur fractionnement protéique adapté de Pyndiah et coll (Pyndiah et al., 2007).

Un litre d’une culture de S. citri en fin de phase exponentielle de croissance est

centrifugé 12 000 x g pendant 30 min à 4°C. Le culot est remis en suspension dans un volume

suffisant d’Hepes-Sucrose puis centrifugé à nouveau pendant 30 min à 4°C. Ce cycle de

lavage est recommencé 2 nouvelles fois. Le dernier culot est alors remis en suspension dans

5 ml de tampon de resuspension BN (500 ou 750 mM acide aminocaproïque, 50 mM TrisHCl,

pH 7) conservé à 4°C. La suspension est alors passé trois fois à la French Press à une pression

de 2 kbars. Le lysat, alors supplémenté avec 2 mg/ml de DnaseI et 25 mM de MgSO4, est

incubé 1 h à 25°C puis centrifugé à 10 000 g pendant 15 min à 4°C. Le surnageant est

récupéré puis soumis à une nouvelle ultra-centrifugation à 100 000 g pendant 30 min à 4°C.

Le surnageant, correspondant aux protéines cytoplasmiques, est dessalé contre du

tampon de resuspension BN en utilisant une 5-ml HiTrap™ desalting column. Les protéines

ainsi purifiées sont aliquotées puis conservées à - 20°C.

Le culot contenant les protéines membranaires est quant à lui repris dans 5 ml du

même tampon de resuspension BN puis subit un nouveau cycle à la French Press à 2 kbars

suivi d’une ultracentrifugation à 100 000 g dans les mêmes conditions que précédemment. Le

culot final est repris dans 600 µl de tampon de resuspension BN supplémenté de 1 à 2 % de β-

D-dodecyl-n-maltoside, aliquoté puis conservé à - 20°C.

10.1.2. Electrophorèse des protéines

10.1.2.1. 1ère dimension

Les électrophorèses des fractions cytoplasmiques et membranaires ont été réalisées sur

des gels de dimensions identiques à ceux ayant précédemment servis pour l’électrophorèse

monodimensionnelle SDS-PAGE.

Tampon electrophorèse BN Anode Cathode

Tris 50 mM 50 mMGlycine 75 mM 75 mMServa blue G (p/v) 0,002%

Tableau M.26: Composition du tampon utilisé pour l’électrophorèse des complexes protéiques au cours des expériences de BN-PAGE.


134

Les migrations ont été réalisées sur des gels en gradient 5-15% pour la séparation des

complexes en conditions non dénaturantes (tableau M.16). 1 µl de tampon de charge (500

mM acide aminocaproique, 5 % Serva Blue-G) est ajouté à chaque échantillon avant le dépôt

sur gel. Les compositions des tampons anode et cathode sont détaillées dans le tableau M.26.

La migration est visualisée grâce au marqueur de masse moléculaire adapté aux conditions

dénaturantes (GE Healthcare).

Les électrophorèses ont été menées à watt constant (1 W) jusqu’à ce que le bleu soit à

1 cm du bord du gel.

10.1.2.2. 2ème dimension

Chaque bande individuelle ayant subi l’électrophorèse en conditions non dénaturantes

est découpée puis incubée successivement dans les deux tampons d’équilibrations (tableau

M.17, § IV.5.2) afin d’être équilibrée. La bande est ensuite placée entre les deux plaques de

verre à environ 2 cm du haut du gel. Le gel SDS-PAGE est ensuite coulé jusqu’à environ 0,5

cm de la bande (tableau M.16). Une fois ce gel de séparation polymérisé, le gel de

concentration est polymérisé afin de permettre la migration des complexes protéiques.

Les conditions d’électrophorèse sont alors les mêmes que celles précédemment

énoncées lors d’une électrophorèse SDS-PAGE classique (§ IV.5.1.1).

10.2. Pontage des complexes protéiques associant la PGK chez S. citri

10.2.1. Préparation des protéines

Les protéines totales et membranaires sont préparées comme précédemment décrits (§

IV.1.1.1 pour les protéines totales et § IV.5.1.1 pour les protéines membranaires) puis sont

remises en suspension dans un tampon phosphate 0,05 M pH 7,4. Les protéines sont dosées et

les concentrations sont ajustées à 1 mg/ml. La His6-PGK recombinante est alors incubée en

présence des protéines selon un ratio 1:10 et l’agent pontant utilisé (DSS ou DSP) est à son

tour ajouté à une concentration de 0,25 mM pendant 30 min à 4°C. La réaction est stoppée par

l’ajout de 1,5 M TrisHCl pH 7,4.

Lors du contrôle négatif, pour lequel l’agent pontant n’est pas ajouté au mélange

réactionnel, le même volume de tampon dans lequel a été dissous l’agent pontant utilisé au


135

cours de l’expérience parallèle, est ajouté au début de la période d’incubation. Le même

volume de Tris HCl est également ajouté à la fin du temps d’incubation.

10.2.2. Purification sur colonne de Nickel

Le mélange réactionnel est ensuite incubé sur une colonne de nickel, colonne

identique à celle ayant servi lors de la purification de la PGK de S. citri recombinante ou des

différents peptides de cette dernière. La colonne est équilibrée avec 10 ml de tampon 50 mM

Tris HCl pH 7,4. Le mélange réactionnel est incubé puis la colonne est lavée avec 10 volumes

de ce même tampon additionné de Triton X-100 suivis de 10 volumes de ce même tampon

pour lequel le Triton X-100 est absent. Les protéines retenues spécifiquement sur la colonne

sont alors éluées par trois volumes de tampon phosphate additionné de 0,25 M Imidazole puis

trois volumes du même tampon additionné cette fois ci de 0,5 M Imidazole.

V. Etude de la transmission expérimentale de S. citri

1. Transmission à la pervenche de Madagascar Catharanthus roseus

1.1. Insectes

L'élevage et la capture des cicadelles Circulifer haematoceps sont détaillés aux

paragraphes I.3.1 et I.3.2.

1.2. Les pervenches de Madagascar

Les pervenches saines produites, à partir de semis, sont cultivées à 25°C ± 2°C sous

une photopériode de 16 heures obtenue grâce à des éclairages par des lampes à vapeur de

sodium. Pour les expériences de transmission expérimentale, les pervenches sur lesquelles les

insectes sont déposés sont âgées de environ 4 semaines (stade 4-6 feuilles).

1.3. Micro-injection intra-abdominale des cicadelles

La micro-injection est réalisée au laboratoire selon le protocole décrit par Markham et

al. (Markham & Townsend, 1979) et modifiée par Foissac et al. (Foissac et al., 1996). Les

cicadelles capturées dans les cages d'élevage sont anesthésiées quelques secondes par du gaz

carbonique, et déposées sur une surface froide (un bloc réfrigérant entouré de Parafilm) afin


136

de les maintenir endormies. Les cicadelles sont triées à l'aide de pinces souples et de pinceaux

fins. Seules les femelles, plus grosses et plus résistantes sont sélectionnées pour être injectées.

Des aiguilles de verre très fines, confectionnées à partir de pipette Pasteur, sont remplies avec

une culture de spiroplasmes. La micro-injection est réalisée sous une loupe binoculaire. Les

insectes sont piqués latéralement entre les deux dernières sternites abdominales de manière à

n'endommager ni la chaîne nerveuse ventrale, ni les tubes de Malpighi, situés plus

antérieurement. L'aiguille est reliée à une pompe soufflante par l'intermédiaire d'un tube

connecteur percé. La culture est injectée en obturant du doigt l'orifice latéral du tube

connecteur. Le volume injecté (environ 0,1 µl d’une culture à 108 à 109 UFC/ml) doit être

suffisant pour qu'un gonflement de l'abdomen de l'insecte soit observé. Après injection, les

cicadelles sont déposées sur du papier absorbant dans une boîte de Pétri.

1.4. Transmission à la pervenche de Madagascar

Après avoir été injectées, les cicadelles sont placées sur des giroflées (Matthiola

incana) recouvertes de bonnettes à raison de 10 insectes par plante pour une période de

latence de 10 jours. Les cicadelles sont ensuite prélevées à l’aide d’un aspirateur à bouche et

encagées à nouveau sur de jeunes plants de pervenches de Madagascar dans une pièce

climatisée (30°C ± 2°C), réservée à cet usage, pour une période d'une durée de 15 jours.

Toutes les plantes sont recouvertes d'une bonnette individuelle protégeant ainsi l'essai de toute

intrusion d'autres insectes. La mortalité des insectes est déterminée tous les 3 jours. A la fin de

la période de transmission, les insectes sont éliminés et les plantes traitées avec un insecticide

de contact. Les plantes sont alors transférées dans une autre pièce climatisée (30°C ± 2°C),

réservée aux plantes infectées et dépourvue de tout insecte, et y sont ainsi maintenues jusqu’à

la fin de l’expérience (environ 12 semaines après injection).

1.5. Symptomatologie

Le développement des symptômes sur pervenches issues des transmissions est observé

toutes les semaines. Une pervenche infectée par GII3 présente une jaunisse généralisée 5

voire 6 semaines après la fin de la période de transmission et arrête de grandir. Il s’ensuit un

flétrissement létal environ 4 semaines après l’apparition de ces symptômes.

Injection de la culture de S.citri

4 jours

Injection des protéines recombinantes

24h

Membrane Parafilm®

Gaze

Transmission(3 insectes par tube)

Nombre de tubes dans lesquels S.citri s’est multiplié

1 semaine

107-108 S. citri /ml106-108 S.citri /ml

R

E

S

U

L

T

S

Milieu SP4

Injection de la culture de S.citri

4 jours

Injection des protéines recombinantes

24h

Membrane Parafilm®

Gaze

Transmission(3 insectes par tube)

Nombre de tubes dans lesquels S.citri s’est multiplié

1 semaine

107-108 S. citri /ml106-108 S.citri /ml

R

E

S

U

L

T

S

Milieu SP4

Figure M.27: Méthode d’étude de la transmission de S. citri par son insecte vecteur par « recrachage » à travers une membrane de Parafilm®.


137

2. « Recrachage » à travers une membrane de Parafilm®

L’ensemble des étapes concernant cette méthode d’étude de la transmission de S. citri

par son insecte vecteur est schématisé sur la figure M.27.

2.1. Injection de la culture de S. citri GII3 dans l’insecte

Une culture de S. citri est injecté aux insectes comme décrit précédemment (§ V.1.3).

Les insectes sont placés en latence sur giroflées pendant 4 jours afin que les spiroplasmes se

multiplient dans l’insecte.

2.2. Injection des protéines recombinantes dans l’insecte

A la suite de la période de latence respectée après l’injection de la culture de

spiroplasmes, les insectes sont prélevés à l’aide d’un aspirateur à bouche. Ils sont ensuite ré-

injectés une seconde fois, en suivant le même protocole que pour S. citri, mais cette fois-ci

avec une solution contenant soit l’His6-PGK ou bien les peptides His6-PGKFL4 et His6-

PGKFL5 à une concentration de 1 µg/µl.

2.3. Transmission à travers une membrane de Parafilm®

Trois insectes ayant subi cette deuxième injection sont alors placés dans un tube

Eppendorf® percé de multiples trous afin de laisser l’air entrer. Ce système expérimental est

décrit dans la figure M.27. Les insectes sont laissés dans une atmosphère humide, afin

d’éviter toute dessiccation, pendant 16 à 24 h dans des tubes dont le capuchon stérile est

rempli de milieu SP4 leur permettant de se nourrir et ainsi de recracher les spiroplasmes dans

leur milieu de culture. A la fin de cette période de recrachage, le milieu SP4 est prélevé à

l’aide d’une seringue et transférés dans des tubes Laloux® en verre stériles dont le volume

final de culture est ajusté à 1 ml avec du milieu de culture SP4 frais. Les tubes sont placés à

32°C et le changement de couleur du milieu de culture est observé environ 1 semaine après la

mise en culture.

2.4. Mise en culture des spiroplasmes à partir des insectes

Les insectes sont broyés par groupe de 3 dans un potter avec 1 ml de milieu SP4m.

Après 15 min d’incubation à température ambiante, le mélange est filtré sur 0,45 µm. Une


138

série de dilutions au 1/10ème est réalisée à partir du filtrat. Après incubation à 32°C, le

changement de couleur est noté et le nombre de spiroplasmes est déterminé.

3. Effet de la PGK et des peptides sur l’adhésion et/ou l’internalisation

3.1. Adhésion

Les cellules Ciha-1, cultivées dans des plaques 24 puits (environ 105 cellules par puit),

sont incubées pendant 2 h à 32°C dans 900 µl de milieu cicadelle additionné de différentes

concentrations de PGK de Saccharomyces cerevisiae (Sigma), de His6-PGK ou de His6-

PGKFL4 et FL5. Les cellules n’ayant subi aucun traitement servent de contrôles positifs tandis

que les cellules non infectées par S. citri servent de contrôles négatifs. Des concentrations

équivalentes de BSA ou de His6-eIF4E servent également de contrôles. Chaque condition est

réalisée en triplicat au cours de chacune des expériences indépendantes menées.

Après cette incubation, les cellules sont infectées avec 100 µl d’une culture de S. citri

avec une multiplicité d’infection (MOI) d’environ 15-30 pendant 4 h à 4°C. Cette température

permet aux spiroplasmes d’adhérer aux cellules de l’hôte mais inhibe les processus eucaryotes

mis en place au cours de l’internalisation. Les cellules sont ensuite lavées dans 500 µl de

milieu de Schneider (Lonza) afin d’éliminer les spiroplasmes libres. Les cellules sont

trypsinées 10 min à 32°C avec un tampon TrypLE™ (Invitrogen) puis des dilutions des

cellules, sur lesquelles des spiroplasmes ont adhérés, sont réalisées. Le traitement avec cette

solution de trypsine n’a aucun effet sur les spiroplasmes (Duret et al., 2009). Ces différentes

dilutions sont étalées sur des boites contenant le milieu de culture des spiroplasmes. Après un

temps d’incubation d’environ une semaine à 32°C, le nombre de colonies est dénombré afin de

déterminer le nombre de cellules sur lesquelles au moins un spiroplasme a adhéré. Un

pourcentage relatif d’adhésion des spiroplasmes sur les cellules Ciha-1 est calculé comme suit:

[(Nombre de colonies dénombrées avec incubation protéine exogène / nombre de colonies

dénombrées sans traitement) x 100%]. Un test de Student a été réalisé afin de déterminer

l’indice de confiance des résultats obtenus.

3.2. Internalisation

L’effet du traitement par les différents peptides de la PGK sur l’internalisation des

spiroplasmes dans les cellules Ciha-1 a été déterminé par un test de protection à la

gentamycine (Isberg & Falkow, 1985). La méthodologie utilisée est identique à celle mise au


139

point pour le test d’adhésion des spiroplasmes sur ces mêmes cellules en culture. Les cellules

sont infectées avec 100 µl d’une culture de S. citri avec une multiplicité d’infection de 15-30

pendant 18 h à 32°C. Les cellules sont lavées trois fois avec 500 µl de milieu de Schneider

(Lonza). Dans le but d’éliminer les spiroplasmes qui ont adhéré aux cellules mais qui n’ont

pas été internalisés, les cellules sont incubées avec 1 ml de milieu de cicadelle frais additionné

de 400 µg/ml de gentamycine pendant 3 h à 32°C. La gentamycine est éliminée par trois

lavages avec 500 µl de milieu de Schneider suivi de trois nouveaux lavages avec 500 µl de

PBS. 100 µl du dernier lavage PBS sont étalés sur boite contenant du milieu SP4 afin de

s’assurer que le traitement à la gentamycine à éliminer la totalité des spiroplasmes adhérents.

Les cellules sont alors trypsinées, étalées sur boites contenant ce même milieu SP4 et incubées

pendant une semaine à 32°C. Le nombre de colonies sur chaque boite est dénombré afin de

déterminer le nombre de cellules dans lesquelles au moins un spiroplasme a été internalisé.

Un pourcentage relatif d’internalisation, ainsi qu’un test statistique correspondant, ont été

calculés de manière identique à ceux réalisés pour le test d’adhésion.

4. Observations au microscope confocal

4.1. Glandes salivaires de C. haematoceps infectées

Les glandes salivaires des insectes C. haematoceps infectés et non infectés par S. citri

sont incubées dans 500 µl de PBS contenant 0.2% Triton X-100 à température ambiante. Les

étapes suivantes se sont toutes effectuées dans ce même volume d’incubation. Les glandes

salivaires sont lavées deux fois dans du PBS et sont fixées toute la nuit à 4°C dans une

solution de 4% paraformaldéhyde diluée dans du PBS additionné de 0,2% Triton X-100 . Les

glandes salivaires sont rincées trois fois dans du PBS avec 0.2% Triton X-100 puis sont

perméabilisées toute la nuit à 4°C dans du PBS contenant 1% Triton X-100 (PBS-T). Elles

sont ensuite bloquées 1 h à température ambiante dans du PBS-T additionné de 1% BSA

(tampon de blocage).

Les glandes salivaires sont ensuite incubées 2 h à température ambiante avec une solution

d’anticorps polyclonaux de S. citri dilués au 1: 500ème dans du PBS additionné de 1% BSA.

Après trois lavages dans du PBS, les glandes salivaires sont ensuite traitées 1 h à température

ambiante avec un anticorps anti-lapin couplé à un fluorochrome (Alexa 488) dilué au 1:200ème

dans du tampon de blocage. En parallèle, l’actine est marquée par la phalloïdine couplée à un

fluorochrome (Alexa 568) dilué au 1:40ème. Les glandes salivaires sont une nouvelle fois


140

lavées trois fois dans du PBS puis incubées dans un milieu ProLong Gold (Invitrogen). La

spécificité du marquage est évaluée sur des images sur lesquelles l’anticorps polyclonal dirigé

contre le spiroplasme a été omis. Les observations sont réalisées sur un microscope confocal

Leica (TCS SP2) avec une immersion de 40x dans l’eau et de 63x dans l’huile avec un objectif

de 1024 x 1024 pixels de résolution. Les images sont transcrites en vert (Alexa 488) et en

rouge (Alexa 568).

4.2. Cellules de C. haematoceps incubées avec la His6-PGK Afin de visualiser si l’incubation de la His6-PGK sur les cellules Ciha-1 avait un effet

sur le cytosquelette d’actine, des cellules sont cultivées dans des plaques 24 puits comme vu

précédemment pour le test d’adhésion cellulaire de S. citri. Après trois lavages dans 500 µl de

milieu de Schneider, les cellules sont fixées pendant 15 min dans 500 µl dans une solution de

4% paraformaldéhyde diluée dans du PBS additionné de 0,2% Triton X-100 puis

perméabilisées pendant 15 min dans 500 µl d’une solution de 0.1% Triton X-100 in PBS

additionné de 1% BSA. Les cellules sont lavées trois fois dans 500 µl de PBS puis elles sont

incubées dans une solution de PBS contenant les anticorps monoclonaux anti-hisditine dilués

au 1:1000ème suivi par une incubation avec les anticorps secondaire anti-souris couplés à un

fluorochrome (Alexa 514). En parallèle, l’actine est marquée par la phalloïdine couplée à un

fluorochrome (Alexa 568) dilué au 1:40ème et les noyaux sont marqués suite à l’ajout de 0,2

mg/ml de DAPI. Les observations sont réalisées dans des conditions similaires à celles

décrites pour les marquages des glandes salivaires. Les images sont transcrites en bleu

(DAPI), en vert (Alexa 514) et en rouge (Alexa 568).

Annexe 1

Bande Identification protéineNombres de scans

Nombre de peptides différents

Masse moléculaire

pSci5_14_adhesion_related_protein,_transmembrane 16 13 88760,7pSci2_04_adhesion_related_protein,_transmembrane 14 12 91391,07SPICI20_065_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 13 12 84385,27pSci3_07_adhesion_related_protein,_transmembrane 12 10 87213,79SPICI03_235_hypothetical_prolipoproteindiacylglyceryl_transferase

12 11 73645,74

SPICI03_025_preprotein_translocase_seca_subunit 10 10 90265,48pSci5_11_adhesion_related_protein,_transmembrane 9 8 91125,27pSci1_05_adhesion_related_protein,_transmembrane 9= 7= 91747,91pSci4_07_adhesion_related_protein,_transmembrane 9= 7= 92358,8SPICI12_021_hypothetical_oligopeptide_abc_transportersubstrate-binding_component_lipoprotein_transmembrane

8 8 83385,73

SPICI09_031_putative_abc_transporter_permeaseand_atp-binding_component_transmembrane_protein

7 6 71279,55

SPICI01B_013_probable_cell_division_protein_ftsh 7 6 74934,32SPICI19_067_putative_atpase_with_chaperone_activity,clp_protease_subunit_protein

4 3 80133,05

SPICI18_008_pts_system_fructose-specific_Iiabccomponent_transmembrane_protein

4 2 72600,02

SPICI17_005_putative_transketolase_protein 4 3 73789,59SPICI12_006_fibril_protein 51 21 58651,63SPICI10_020_groel_chaperonin_protein 41 17 58100,15SPICI02_009_atp_synthase_alpha_chain_protein 12 6 57316,46SPICI19_064_chaperone_dnak_protein 11 9 64799,91SPICI03_235_hypothetical_prolipoproteindiacylglyceryl_transferase

11 9 73645,74

SPICI03_195_probable_2,3-bisphosphoglycerate-independentphosphoglycerate_mutase_protein

11 7 58000,02

SPICI06_095_hypothetical_protein 8 7 59453,99SPICI01B_013_probable_cell_division_protein_ftsh 5 4 74934,32SPICI20_066_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 4= 4= 63859,34SPICI18_008_pts_system_fructose-specific_Iiabccomponent_transmembrane_protein

4 2 72600,02

SPICI17_005_putative_transketolase_protein 4 4 73789,59SPICI16_043_pts_enzyme_II_glucose-specific_Iicbcomponent_transmembrane_protein

4 3 75483,36

SPICI16_005_enolase_protein 28 11 50253,8SPICI10_020_groel_chaperonin_protein 24 10 58100,15SPICI19_064_chaperone_dnak_protein 11 10 64799,91SPICI03_280_nadp-dependent_glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase_oxidoreductase_protein

10 9 51673,97

SPICI20_066_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 8 7 63859,34SPICI12_006_fibril_protein 8 7 58651,63SPICI01A_065_inosine-5'-monophosphate_dehydrogenasetransmembrane_protein

8 8 52179,75

SPICI02_011_atp_synthase_beta_chain_protein 5 5 50589,71SPICI01B_005_seryl-trna_synthetase_protein 5 5 49016,57SPICI03_304_putative_trigger_factor_containingpeptidyl-prolyl_isomerase_domain_protein

4 4 49326,21

SPICI01B_078_translation_elongation_factor_ef-tu_protein 136 20 43642,32SPICI03_024_phosphoglycerate_kinase_protein 11 7 44360,34SPICI03_293_pyrimidine-nucleoside_phosphorylase_protein 10 9 47753,98

1 (75 et

80 kDa)

3 (50 et

60 kDa)

2 (60 et

75 kDa)

SPICI04_123_probable_cell_division_ftsztransmembrane_protein

8 8 44315,66

SPICI19_066_putative_transcription_repressortranscription_regulator_protein (HrcA)

8 6 40051,67

SPICI11_025_conserved_hypothetical_protein 6 4 44656,45SPICI10_054_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 5 4 48245,63SPICI16_005_enolase_protein 4 4 50253,8pSci5_18_putative_transmembrane_protein 34 14 46113,84pSci3_14_putative_transmembrane_protein 32 14 46305,96SPICI16_011_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 32 9 41852,52SPICI03_175_putative_pyruvate_dehydrogenase_e1component_alpha_subunit_protein

18 7 41677,84

SPICI01B_078_translation_elongationfactor_ef-tu_protein

16 7 43642,32

SPICI04_123_probable_cell_division_ftsztransmembrane_protein

12 10 44315,66

SPICI03_076_putative_arginine_deiminase_protein 6 6 45440,68SPICI03_063_gtp-dependent_nucleicacid-binding_protein

4 4 40978,23

SPICI01B_002_putative_dna_polymerase_III,beta_chain_protein

4 3 42138,87

SPICI01A_048_cell_shape_determining_protein_mreb 64 13 37976,37SPICI01A_049_cell_shape_determining_protein_mreb 43 12 38625,32SPICI13_009_cell_shape-determining_protein_mreb1 40 11 38067,4SPICI03_043_probable_glyceraldehyde_3-phosphatedehydrogenase_protein

20 9 36173

SPICI03_091_probable_abc_transporter_atp_bindingcomponent_abc_transporter_protein

14= 7= 34577,77

SPICI03_176_probable_pyruvate_dehydrogenase_e1component_beta_subunit_protein

12= 7= 36740,09

SPICI01A_046_cell_shape_determining_protein_mreb 7 5 38100,62SPICI01B_015_probable_abc_transporteratp_binding_protein

5 4 34990,68

SPICI04_139_spiralin_lipoprotein 57 14 25234,46SPICI08_046_hypothetical_abc_transporter_atp-bindingcomponent_abc_transporter_protein

59 10 34811,19

pSci6_27_P32_protein 14 7 27567,95SPICI06_063_hypothetical_protein 11 4 27609,18SPICI03_168_putative_phosphate_abc_transporteratp_binding_component_protein

10 6 30309,97

SPICI03_105_50s_ribosomal_protein_l2 5 3 30778,64pSci4_11_SOJ-like_protein 4 3 29495,7SPICI03_090_probable_abc_transporter_atp-bindingcomponent_abc_transporter_protein

4 3 32620,41

pSci6_01_SOJ-like_protein 28 7 29240,38SPICI03_060_soj-like_partition_protein_para 13 6 28081,76pSci6_39_SOJ-like_protein 11 3 29672,78SPICI20_028_conserved_hypothetical_protein 8 5 27328,42SPICI19_065_hypothetical_dnak_cofactor_protein (grpE) 7 4 23503,24pSci5_01_SOJ-like_protein 6 3 29921,41pSci3_05_SOJ-like_transmembrane_protein 6= 5= 29050,27SPICI03_055_putative_transcription_antiterminationnusg_transmembrane_protein

6 3 24554,66

SPICI20_031_putative_potassium_uptake_protein 5 3 26007,91pSci2_02_SOJ-like_transmembrane_protein 4 3 29638,64SPICI03_029_triosephosphate_isomerase_protein 12 5 27084,1

8 (20 et

25 kDa)

6 (35 kDa

env)

5 (40 et

45 kDa)

7 (25 kDa

env)

4 (45 kDa

env)

SPICI19_065_hypothetical_dnak_cofactor_protein (grpE) 10 6 23503,24pSci6_20_hypothetical_protein 9 5 16883,83SPICI09_079_hypothetical_prophage_major_tail_protein 9 4 19218,62SPICI06_092_hypothetical_protein 9 5 22612,95SPICI03_189_hypothetical_transmembrane_protein 9 8 27094,91SPICI03_067_hypothetical_rnadna-directed_polymerase_protein

5 2 21007,63

SPICI03_055_putative_transcription_antiterminationnusg_transmembrane_protein

5 4 24554,66

SPICI20_031_putative_potassium_uptake_protein 4 3 26007,91SPICI17_007_hypothetical_protein 15 4 22654,25SPICI20_046_50s_ribosomal_protein_l1 13 6 24709,48pSci6_20_hypothetical_protein 11 5 16883,83SPICI17_003_probable_purine_nucleosidephosphorylase_transmembrane_protein

7 4 26271,39

SPICI04_138_hypothetical_23.8_kda_in_tsf_3'regiontransmembrane_protein

6 4 23813,04

SPICI07_016_hypothetical_protein 4 4 20873,26SPICI03_119_30s_ribosomal_protein_s5 4 3 21977,05SPICI16_022_probable_30s_ribosomal_protein_s4 13 5 23579,45SPICI03_119_30s_ribosomal_protein_s5 8 5 21977,05SPICI03_103_50s_ribosomal_protein_l4 7 4 22947,41SPICI20_046_50s_ribosomal_protein_l1 6 2 24709,48

SPICI04_139_spiralin_lipoprotein 14 2 25234,46

pSci4_06_putative_transmembrane_lipoprotein 4 3 27758,46

13 (15 et

20 kDa)SPICI04_139_spiralin_lipoprotein 13 2 25234,46

SPICI06_025_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 15 4 17674,88SPICI01B_076_30s_ribosomal_protein_s7 15 6 17756,57SPICINP12_015_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 12 6 19589,11SPICI13_023_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 9 3 20532,19SPICI07_025_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 9 5 20315,25SPICI20_002_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 8 6 18434,41SPICI12_036_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 8 3 20241,23SPICI09_055_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 8 4 17855,11

15 (60 et

70 kDa)SPICI04_139_spiralin_lipoprotein 14 2 25234,46

16 (60 kDa

env)SPICI10_020_groel_chaperonin_protein 49 21 58100,15

SPICI12_006_fibril_protein 11 7 58651,63

SPICI14_005_hypothetical_transmembrane_protein 6 6 62773,45

SPICI03_024_phosphoglycerate_kinase_protein 36 15 44360,34SPICI01B_078_translation_elongation_factor_ef-tu_protein 8 6 43642,32SPICI03_086_glucose-6-phosphate_isomerasetransmembrane_protein

5 5 47471,54

19 (40 kDa

env)SPICI04_139_spiralin_lipoprotein 22 2 25234,46

SPICI16_011_hypothetical_lipoprotein_transmembrane 14 7 41852,52pSci3_14_putative_transmembrane_protein 5= 2= 46305,96pSci5_18_putative_transmembrane_protein 5= 2= 46113,84

9 (20 kDa

env)

20 (40 kDa

17 (55 kDa

env)

18 (45 kDa

env)

14 (10 kDa

env)

12 (15 et

20 kDa)

11 (15 et

20 kDa)

10 (20 kDa

env)

SPICI19_063_putative_chaperone_dnaj_protein 5 4 42805,7SPICI01B_078_translation_elongation_factor_ef-tu_protein 5 4 43642,32SPICI01A_049_cell_shape_determining_protein_mreb 20 6 38625,32SPICI01A_048_cell_shape_determining_protein_mreb 15 8 37976,37SPICI13_009_cell_shape-determining_protein_mreb1 9 6 38067,4SPICI03_043_probable_glyceraldehyde_3-phosphatedehydrogenase_protein

8 5 36173

SPICI03_102_50s_ribosomal_protein_l3 7 4 27980,07Chr_653333_654279_2 4= 4= 34814,77SPICI04_087_probable_methionyl-trnaformyltransferase_protein

4= 4= 35780,2

23 (25 kDa

env)SPICI04_139_spiralin_lipoprotein 134 24 25234,46

env)

21 (35 et

40 kDa )

22 (35 kDa

env)

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Interactions entre Spiroplasma citri et son insecte vecteur Circulifer haematoceps. La phosphoglycérate kinase de S. citri : une « actin-binding protein » impliquée dans la transmission du spiroplasme par la cicadelle Spiroplasma citri est un mollicute phytopathogène transmis de plante à plante par des cicadelles du genre Circulifer selon un mode persistant circulant-multipliant. Les franchissements de l’épithélium intestinal et des glandes salivaires sont basés sur un mécanisme d’endocytose/exocytose. Ce processus d’invasion met en jeu, au sein de complexes protéiques, des protéines bactériennes spécifiques qui reconnaissent des motifs déterminés présents à la surface des cellules eucaryotes. La recherche de protéines de l’insecte vecteur interagissant avec S. citri a notamment conduit à l’identification de l’actine. Cette interaction a pu être confirmée à la fois in vitro et in vivo. L’interaction de l’actine avec son partenaire chez S. citri, qui s’est avéré être la phosphoglycérate kinase (PGK), est impliquée dans l’internalisation du spiroplasme dans les cellules de l’insecte. La région minimale de liaison à l’actine de la PGK a également été déterminée. La réalisation d’un mutant de S. citri dépourvu de PGK a été entreprise avec le plasmide navette pGOT mais n’a pas permis la sélection de spiroplasmes mutés dans ce gène essentiel. Néanmoins, la recherche de l’évènement de recombinaison chez les clones obtenus a permis de mettre en évidence la mutation de deux gènes chez ces derniers. L'ensemble des protéines impliquées dans la transmission du spiroplasme, identifiées au préalable chez ce dernier, n’étant pas essentielle au cours de ce processus, une étude préliminaire des complexes multi-protéiques contenant plusieurs de ces protéines a été réalisée. L’identification de complexes impliquant à la fois la PGK, la P32 et les ScARPs pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes régissant la vection de S. citri par son insecte. Mots-clés: mollicute phytopathogène, Spiroplasma citri, transmission, insecte vecteur, actine, phosphoglycérate kinase, interactions protéine-protéine. Interactions between Spiroplasma citri and its insect vector Circulifer haematoceps. S .citri phosphoglycerate kinase: an actin-binding protein involved in the spiroplasma transmission by leafhoppers. Spiroplasma citri is a phytopathogenic mollicute transmitted from plant to plant by leafhoppers of the genus Circulifer in a persistent and propagative manner on condition to cross the intestinal and salivary glands barriers of the insect. These crossings are based on a endocytosis/exocytosis mechanism which involves bacterial protein complexes in order to recognize specific patterns on the surface of eukaryotic cells. Specific molecular interactions between S. citri proteins and those of C. haematoceps were investigated using far Western technology and had notably led to the identification of actin. This interaction has been confirmed both in vitro and in vivo. The interaction of actin with his partner in S. citri, which has been identified as the phosphoglycerate kinase (PGK), is involved in the internalization of spiroplasma into the insect cells. The minimal actin-binding region of PGK was also determined. The realization of a S. citri PGK mutant was carried out using the shuttle plasmid pGOT but the selection of spiroplasmas mutated in this essential gene failed. Nevertheless, findings in the localization of recombination events in S. citri chromosome, allowed us to identify mutations in two genes that could be tested in our experimental transmission system. The set of proteins involved in the spiroplasmal transmission, previously identified as non essential proteins in the invasion process, prompted us to study the role of multi-protein complexes containing several of these proteins. Identification of complexes involving both the PGK, the P32 and ScARPs should enable us to better understand mechanisms governing the transmission of S. citri by its insect. Keywords: phytopathogenic mollicute, Spiroplasma citri, transmission, insect vector, actin, phosphoglycerate kinase, protein-protein interactions.

· Université Victor Segalen Bordeaux 2 Année 2010 Thèse n° THÈSE pour le DOCTORAT DE...

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