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UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS

DE TOURS

ÉCOLE DOCTORALE Santé, Sciences, Technologie

Equipe Croissance et Métabolisme, Unité de Recherches Avicoles,

INRA, Nouzilly

THÈSE présentée par :

Romain JOUBERT

soutenue le : 14 Décembre 2009

pour obtenir le grade de : Docteur de l’Université François - Rabelais

Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie

Rôles et régulations de la protéine

découplante aviaire dans le métabolisme

mitochondrial de l’oiseau

THÈSE dirigée par : Mme COLLIN Anne Chargé de Recherche, INRA, Nouzilly Mme TESSERAUD Sophie Directeur de Recherche, INRA, Nouzilly

RAPPORTEURS : M. BOUILLAUD Frédéric Directeur de Recherche, INSERM, Paris M. DUCHAMP Claude Professeur, CNRS Université Claude Bernard, Lyon

JURY : M. BOUILLAUD Frédéric Directeur de Recherche, INSERM, Paris Mme COLLIN Anne Chargé de Recherche, INRA, Nouzilly M. COUET Charles Professeur, Université François Rabelais, Tours M. DUCHAMP Claude Professeur, CNRS Université Claude Bernard, Lyon Mme SKIBA Sandrine Chargé de Recherche, INRA, St-Pée-sur-Nivelle Mme TESSERAUD Sophie Directeur de Recherche, INRA, Nouzilly

Remerciements

J’exprime ma très sincère reconnaissance à Mesdames A. COLLIN, Chargé de Recherche, et

S. TESSERAUD, Directeur de Recherche, Messieurs Y. NYS et M. DUCLOS, Directeurs

successifs de l’Unité de Recherches Avicoles à l’INRA de Nouzilly, et Monsieur

P. CHEMINEAU, Directeur du département PHASE, pour m’avoir confié ce sujet de thèse

mais aussi pour leur soutien et leur aide tout au long de ces trois années de thèse.

Je tiens également à adresser mes plus vifs remerciements aux membres du jury : Monsieur

C. COUET, Professeur à l’Université François Rabelais (Tours), qui a accepté de présider

mon jury, Mesdames A. COLLIN, S. SKIBA-CASSY, Chargé de Recherche (INRA, St-Pée-

sur-Nivelle) et S. TESSERAUD, ainsi que Messieurs F. BOUILLAUD, Directeur de

Recherche à l’INSERM (Paris) et C. DUCHAMP, Professeur à l’Université Claude Bernard

(Lyon). J’exprime toute ma reconnaissance à Messieurs F. BOUILLAUD et C. DUCHAMP

pour avoir accepté d’être rapporteurs de ce travail.

A Mesdames E. AUDOUIN-CAILLEAU et S. CROCHET pour leurs soutiens techniques en

biochimie et biologie moléculaire. A Monsieur T. BORDEAU et Mademoiselle E. GODET

pour leur compétence en immunohistochimie et Monsieur M. DEROUET pour son aide en

culture cellulaire (INRA, Nouzilly).

A Messieurs E. DECUYPERE et J. BUYSE, Professeurs de la Katholieke Universiteit

Leuven (Leuven, Belgique), pour m’avoir accueilli au sein de leur laboratoire. A Mesdames

Q. SWENNEN, G. NACKAERTS, I. VAESEN et Monsieur D. VERMEULEN pour leur aide

dans les dosages des métabolites sanguins et des hormones thyroïdiennes (Department of

Biosystems, KUL, Belgique).

A Madame M. DAMON, Chargé de Recherche, et à l’UMR1079 Systèmes d’Elevage,

Nutrition Animal et Humaine pour le prêt de l’oxymètre Oroboros (INRA, St-Gilles).

A Monsieur J. BESNARD et Madame N. SELLIER, Directeurs successifs du Pôle

Expérimental Avicole de Tours (PEAT). A toutes les personnes des installations

expérimentales qui ont pris soin des animaux utilisés lors des différentes expériences ou qui

2

ont participé aux prélèvements : J.M. BRIGANT, O. CALLUT, J. DELAVEAU, F.

FAVREAU, H. RIGOREAU et M. TANZI (INRA, Nouzilly).

A Mesdames C. BERRI, M. DAMON, J. DUPONT, S. METAYER-COUSTARD et

C. WRUTNIAK-CABELLO, et Messieurs M. DUCLOS et J. SIMON pour les nombreuses

discussions scientifiques et les précieux conseils prodigués.

A Madame C. DE BUE et Monsieur A. BORDIER pour leur aide dans les démarches

administratives (INRA, Nouzilly).

A la Région Centre et au département INRA PHASE pour les financements apportés à ce

projet.

Aux stagiaires et thésards et plus particulièrement Camille, Gladys, Hamza, Maamer, Sylvain

et Vonnick pour les moments de détente et l'ambiance sympathique dans les bureaux. Merci à

Estelle, Sabine et Sonia pour les bons moments partagés.

Enfin, j’adresse mes remerciements les plus cordiaux à l’équipe Croissance et Métabolisme

(URA, INRA Nouzilly) et à toutes les personnes qui ont contribué à la réalisation de ma thèse

dans une ambiance très sympathique.

3

Résumé

Au niveau de la membrane interne de la mitochondrie, la chaîne respiratoire entraine

des protons de la matrice mitochondriale vers l’espace intermembranaire, créant un gradient

de protons. Ce gradient est alors utilisé par l’ATP synthase pour générer de l’ATP. On parle

alors de couplage entre les oxydations de la chaîne respiratoire et les phosphorylations par

l’ATP synthase. La phosphorylation oxydative n’a pas un rendement de 100 %. Il existe un

retour des protons dans la matrice mitochondriale, créant un découplage que des protéines,

notamment certaines protéines découplantes (UCP), pourraient favoriser.

Plusieurs protéines de cette famille ont été mises en évidence, principalement UCP1,

UCP2, UCP3 chez les mammifères, et l’UCP aviaire (avUCP) chez les oiseaux. Si le rôle

dans la thermogenèse sans frisson d’UCP1, quasi-spécifique du tissu adipeux brun, est bien

caractérisé, ceux des UCP2 et UCP3 de mammifères, et d’avUCP chez l’oiseau restent

controversés.

Les objectifs de cette thèse sont d’étudier, in vivo et in vitro, la régulation de

l’expression d’avUCP et de donner des éléments sur son ou ses rôle(s) dans le métabolisme

mitochondrial chez l’oiseau. Nous nous sommes focalisés sur la régulation de l’expression

d’avUCP par le système -adrénergique, impliqué dans la thermorégulation chez l’oiseau,

ainsi que sur les voies de signalisation potentiellement mises en jeu. Nous avons également

exploré l’implication d’avUCP dans le découplage mitochondrial et la limitation de la

production de radicaux libres en fonction du type contractile et métabolique du muscle de

poulet.

Par injection en intramusculaire du 2-agoniste isoprotérénol chez le poulet, nous

montrons que l’expression dans le muscle d’avUCP peut être augmentée par le système -

adrénergique. Cette stimulation est associée à l’activation de l’AMP-activated protein kinase

(AMPK) et la surexpression des facteurs de transcription peroxisome proliferator-activated

receptor (PPAR) !, PPAR /" et PPAR# coactivator-1! (PGC-1!). Cette régulation ne semble

pas être uniquement sous le contrôle des récepteurs cellulaires 2-adrénergiques. Les

hormones thyroïdiennes, le glucose et le métabolisme des acides gras, modifiés par l’injection

d’isoprotérénol, sont potentiellement co-acteurs de cette régulation. Nous avons, par la suite,

utilisé des cultures primaires de myoblastes de poussins pour affiner les mécanismes

impliqués dans la régulation de l’expression d’avUCP par le système -adrénergique. Nous

montrons que l’expression du messager d’avUCP peut être augmentée par l’isoprotérénol

4

et/ou l’ajout d’acides gras dans le milieu. L’isoprotérénol active la phosphorylation de la p38

mitogen-activated-protein kinase (p38 MAPK) in vitro. Il pourrait activer la voie de

signalisation PKA-dépendante via les récepteurs 2-adrénergiques, comme le suggère la

tendance à l’augmentation de la phosphorylation du facteur de transcription cAMP response

element binding protein (CREB). Nous rapportons également l’activation de l’AMPK par

l’ajout d’acides gras au milieu de culture des myoblastes. Les mécanismes d’activation de

cette kinase par l’isoprotérénol (in vivo) et les acides gras (in vitro) restent hypothétiques mais

pourraient faire intervenir l’acylation des acides gras qui consomme de l’ATP. L’AMPK peut

réguler directement l’expression de l’ARNm d’avUCP, ce que nous montrons en utilisant le

5-aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside (AICAR), qui active la kinase, et le

Compound C, inhibiteur de l’activation de l’AMPK induite par l’AICAR. De plus,

l’utilisation de l’agoniste PPAR! WY-14643 suggère que ce PPAR peut augmenter

l’expression du messager d’avUCP. Enfin l’analyse de la séquence promotrice d’avUCP

indique la présence d’éléments de réponse aux PPAR, à CREB et aux récepteurs des

hormones thyroïdiennes.

Concernant l’étude du rôle d’avUCP dans le métabolisme mitochondrial, nous avons

effectué, à partir de mitochondries isolées de muscle rapide glycolytique Pectoralis major

(PM), mixte oxydo-glycolytique Adductor profundus (AP), et de la partie blanche lente

oxydative du muscle Adductor superficialis (ASW), des mesures de consommation d’O2, de

découplage mitochondrial et de production de H2O2. Le messager d’avUCP est fortement

exprimé dans les muscles rapides et mixtes de types glycolytique ou oxydo-glycolytique et

très peu dans les muscles lents oxydatifs. Cependant, dans les mitochondries

subsarcolemmales isolées du muscle ASW, respirant à un niveau plus faible que celles des

muscles AP et PM à l’état IV, nous avons mis en évidence un fort potentiel de production de

H2O2, et un découplage stimulable par le HNE et inhibable par le GDP. Ces résultats ne

permettent pas d’associer directement le potentiel de production de H2O2 à une expression

d’avUCP et un découplage plus ou moins fort lié à avUCP. Néanmoins, ces données

pourraient concorder avec l’hypothèse d’une action d’avUCP dans la régulation de la

glycolyse et du cycle de Krebs dans les muscles utilisant principalement le glucose comme

substrat énergétique.

Mots-clés : Poulet, Muscles, Mitochondrie, Protéine découplante aviaire, Système -

adrénergique.

5

Résumé en anglais

By using energy substrates resulting from glycolysis or from the -oxidation of fatty

acids, a transmembrane proton gradient is created in mitochondria and then used by the ATP

synthase to generate ATP. The coupling between oxidations by the mitochondrial respiratory

chain and phosphorylation by ATP synthase is tightly regulated. In particular, protons can re-

enter the matrix without contributing to ATP synthesis. This process is known as proton leak

or mitochondrial uncoupling. Uncoupling proteins (UCP) could contribute to this mechanism

in mammals and avian species.

Several proteins belonging to the UCP family have been described, mainly UCP1,

UCP2 and UCP3 in mammals and the muscular avian UCP (avUCP) in birds. UCP1, almost

specific of the brown adipose tissue (BAT), plays a role in non-shivering thermogenesis by

dissipating the proton gradient. However the potential roles of the mammalian UCP2 and

UCP3, and of avUCP are still controversial

The aims of this thesis were to study, in vivo and in vitro, the regulation of avUCP

expression and to give elements upon the role of avUCP in avian mitochondrial metabolism.

We focused on the regulation of avUCP expression by the -adrenergic system, involved in

the thermoregulation in birds, and then on the potential signaling pathways involved in this

regulation. We also explored the involvement of avUCP in mitochondrial uncoupling and in

the limitation of ROS production in relation to different contractile and metabolic types of

chicken muscles.

By injecting isoproterenol, a 2-agonist, in chicken muscle, we demonstrated that

avUCP expression in muscle was increased by -adrenergic stimulation, and was associated

with AMP-activated protein kinase (AMPK) activation and with the upregulation of the

transcription factors peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) !, PPAR /" and

PPAR# coactivator-1! (PGC-1!). This regulation could involve other signals than the cellular

2-adrenoreceptors. Thyroid hormones, glucose and fatty acid metabolisms, which were

modified by isoproterenol injection, could be co-actors of this regulation. We next used

primary cultures of chick myoblasts to elucidate more precisely the mechanism involved in

avUCP regulation by the -adrenergic system. We showed that avUCP expression could be

increase by isoproterenol and/or adding fatty acids in the medium. Isoproterenol induced the

phosphorylation of the p38 mitogen-activated-protein kinase (p38 MAPK) in vitro. It could

6

also activate the PKA-dependent signaling pathway via 2-adrenergic receptors, as suggested

by a tendency to an increased phosphorylation of the transcription factor cAMP response

element binding protein (CREB). We reported the activation of AMPK by fatty acid addition

in the cell culture medium. Mechanisms activating AMPK after isoproterenol injection

(in vivo) and fatty acids (in vitro) remain hypothethical but could involve fatty acid acylation

that consumes ATP. AMPK could directly stimulate avUCP mRNA expression, which was

suggested by using 5-aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside (AICAR), the kinase

activator, and Compound C, inhibitor of AICAR-induced AMPK activation. Furthermore, the

use of PPAR! agonist WY-14643 suggested that this PPAR regulates avUCP transcription.

Finally, analysis of the avUCP promoter sequence indicated potential binding sites for

PPARs, CREB and for thyroid hormone receptors.

To study the role of avUCP in mitochondrial metabolism, we used subsarcolemmal

mitochondria isolated from the fast-twitch glycolytic Pectoralis major (PM), the mixed type

oxido-glycolytic Adductor profundus (AP) and the slow-twitch oxidative white part of the

Adductor superficialis (ASW). We measured O2 consumption, mitochondrial uncoupling and

H2O2 release from these mitochondria. The messenger of avUCP was highly expressed in

fast-twitch type glycolytic and mixed type oxido-glycolytic muscles and poorly expressed in

slow oxidative muscles. However, in isolated subsarcolemmal mitochondria from ASW

muscle, respiring at a lower rate than AP and PM muscle at state IV, we showed a high

potential to generate H2O2 and a HNE-stimulated, GDP-inhibited uncoupling. Present results

do not allow to directly associate the potential of H2O2 production to high or low avUCP

expressions and uncoupling. They are consistent with the hypothesis of an involvement of

avUCP in regulating glycolysis and TCA cycle in muscles predominantly using glucose as

fuel substrate.

Key-words: Chicken, Muscles, Mitochondria, Avian uncoupling protein, -adrenergic system.

7

Table des matières

Remerciements ........................................................................................................................... 2

Résumé ....................................................................................................................................... 4

Résumé en anglais...................................................................................................................... 6

Table des matières...................................................................................................................... 8

Liste des abbréviations ............................................................................................................. 11

Liste des tableaux ..................................................................................................................... 14

Liste des figures ....................................................................................................................... 15

Liste des annexes...................................................................................................................... 18

INTRODUCTION .................................................................................................................. 19

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................................ 22

1. ................................................................................................................... 23 La mitochondrie

1.1. .................................................................................................................... 23 Généralités

1.2. ................................................................................... 24 Composition des mitochondries

1.3. ............................................................................. 26 Rôles cellulaires de la mitochondrie

2. .................................................................. 26 La phosphorylation oxydative et le découplage

2.1. ...................................................................... 27 Conversion des nutriments énergétiques

2.2. ................................................................................................... 28 La chaîne respiratoire

2.3. ............................................................................................................ 29 L’ATP synthase

2.4. ............................................................................................................... 29 Le découplage

3. .................................................................................................. 31 Les protéines découplantes

3.1. ................................................................. 32 Les protéines découplantes de mammifères

3.1.1. ..................................................................................................................... 32 UCP1

3.1.2. ..................................................................................................................... 33 UCP2

3.1.3. ..................................................................................................................... 34 UCP3

3.1.4. ..................................................... 35 Autres protéines découplantes de mammifères

3.2. .................................................................................. 36 Protéine découplante de l’oiseau

4. ........................................... 37 Fonctions et mécanismes d’action des protéines découplantes

8

4.1. ............................................................................................. 37 UCP1 et la thermogenèse

4.2. ........................... 38 Fonctions des protéines homologues d’UCP1 chez les mammifères

4.2.1. ................................ 38 La thermogenèse et la régulation de la dépense énergétique

4.2.2. .......................................................... 40 Régulation du métabolisme des acides gras

4.2.3. ..................................................... 41 Régulation de la production de radicaux libres

4.2.4. ........................................................................................... 42 Sécrétion de l’insuline

4.2.5. ....................................... 42 Transport d’ions ou de substrats énergétiques chargées

5. ........................... 43 Régulations de l’expression des protéines découplantes de mammifères

5.1. ................. 43 Présentation générale des systèmes impliqués dans la régulation des UCP

5.1.1. .................................................................................. 43 Les hormones thyroïdiennes

5.1.2. .................................................................................... 44 Le système -adrénergique

5.1.3. ............................................... 44 Les Peroxysome Proliferator Activated Receptors

5.1.4. .......................................................................... 45 L’AMP-activated Protein Kinase

5.2. ............................................................................. 46 Régulation de l’expression d’UCP1

5.3. .............................................................. 47 Régulation de l’expression d’UCP2 et UCP3

6. ..... 49 Fonctions potentielles et régulation de l’expression de la protéine découplante aviaire

6.1. ............................................ 49 Fonctions potentielles de la protéine découplante aviaire

6.2. ............ 50 Mécanismes de régulation de l’expression de la protéine découplante aviaire

7. ..................................................................................... 52 Conclusions et objectifs de la thèse

MATERIELS ET METHODES ........................................................................................... 54

ETUDES EXPERIMENTALES ........................................................................................... 57

1. Etude de la régulation de l’expression d’avUCP par le système

-adrénergique.......................................................................................................................... 58

Publication N°1........................................................................................................ 61

Publication N°2........................................................................................................ 78

2. .......... 111 Etude du rôle d’avUCP en fonction du type contractile et métabolique de muscle

Publication N°3...................................................................................................... 113

DISCUSSION ....................................................................................................................... 153

CONCLUSION..................................................................................................................... 165

9

BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................... 170

ANNEXES............................................................................................................................. 199

10

Liste des abbréviations

ACC : Acétyl-CoA carboxylase

ACSL1 : Acyl-CoA synthethase long-chain family member 1

ADP : Adénosine diphosphate

AND : Acide désoxyribonucléique

ADNmt : ADN mitochondrial

AICAR : 5-aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside

AMP : Adénine monophosphate

AMPc : AMP cyclique

AMPK : AMP-activated protein kinase

ANT : Adénine nucléotide translocase

AP : Adductor profundus

ARN : Acide ribonucléique

ASW : Partie blanche de l’Adductor superficialis

ATF-2 : Activated transcription factor-2

ATP : Adénosine triphosphate

avUCP : Avian uncouplin protein

BMCP1 : Brain mitochondrial carrier protein 1

C/EBP : CCAAT/enhancer binding protein

CoQ : Coenzyme Q

COX : Cytochrome c oxydase

CPT : Carnitine palmitoyl transférase

CRE : cAMP response elements

CREB : cAMP response element binding protein

D2 : Déiodinase 2

FAD : Flavine adénine dinucléotide

GAP : D-glycéraldéhyde-3-phosphate

GDP : Guanosine diphosphate

GTP : Guanosine triphosphate

GRE : Glucocorticoïd response element

Gs : Protéine G stimulatrice

11

HAD : -hydroxyacyl-CoA déhydrogénase

HCC : Hepatocellular carcinoma

HDMCP : HCC down regulated mitochondrial carrier protein

HmUCP : Hummingbird UCP

HNE : 4-hydroxy-2-nonénal

IGF : Insulin-like growth factor

JIP2 : JNK-interacting protein 2

KMCP1 : Kidney mitochondrial carrier protein 1

KO : Knock out

LKB1 : liver tumor suppressor kinase

M tec : Million de tonne équivalent carcasse

MAM : Mitochondria-associated membranes

MAPK : Mitogen activated protein kinase

MCU : Mitochondrial calcium uniporter

MEF2 : Muscle enhancer factor 2

MKK3 : MAP kinase kinase 3

NAD : Nicotinamide adénine dinucléotide

NEFA : Non-esterified fatty acid

ORF : Open reading frame

PGC-1! : PPAR# coactivator 1!

Pi : Phosphate inorganique

PKA : Protéine kinase AMPc dépendante

PM : Pectoralis major

PPAR : Peroxisome proliferator-activated receptor

PPRE : PPAR response elements

PTP : Permeability transition pore

QM7 : Quail muscle clone 7

RAR : Retinoic acid receptor

RARE : Retinoic acid response elements

RCPG : Récepteurs couplé à la protéine G

ROS : Reactive oxygen species

RXR : Retinoic X receptor

SOD : Superoxide dismutase

12

SREBP : Sterol regulatory element binding protein

T3 : Tétraiodothyronine

T4 : Triiodothyronine (tyroxine)

TAB : Tissu adipeux brun

THRS : Thyroid hormones response sequence

TIM : Translocase of the inner membrane

TPMP : Methyltriphenyl phosphonium

TOM : Translocase of the outer membrane

TR : Thyroid hormones receptor

TRE : Thyroid hormones response elements

UCP : Uncoupling protein

VDAC : Voltage-dependant anion channel

13

Liste des tableaux

Page

Tableau I

Présentation des différentes UCP humaines et d’oiseau 31

Tableau II

Présentation des différentes amorces de PCR utilisées 55

Tableau III

Préparation des gels de polyacrylamide 56

Tableau IV

Présentation des différents anticorps utilisés en Western blot 56

14

Liste des figures

Page

Figure 1

Composition de la mitochondrie 24

Figure 2

La glycolyse 25

Figure 3

La -oxydation 26

Figure 4

Le cycle de Krebs 27

Figure 5

La phosphorylation oxydative 28

Figure 6

L’ATP synthase 29

Figure 7

Hypothèse du découplage par UCP 30

Figure 8

Gène avUCP chez le poulet (Gallus gallus) 36

Figure 9

La thermogenèse par UCP1 dans le tissu adipeux brun 37

Figure 10

Hypothèse du transport des acides gras par UCP3 40

Figure 11

Hypothèses de limitation de la production de ROS par les UCP 41

Figure 12

Limitation de la sécrétion d’insuline par UCP2 42

15

Figure 13

Hypothèse du transport du pyruvate par UCP3 43

Figure 14

Rôle potentiel d’UCP2 dans le métabolisme de la glutamine 44

Figure 15

Rôle et activation de l’AMPK 45

Figure 16

Régulation de l’expression d’UCP1 dans le tissu adipeux brun 46

Figure 17

Expression de l’ARNm d’avUCP, 3 et 5 heures après injection d’isoprotérénol chez

le poulet (expérience préliminaire) 60

Figure 18

Niveau de phosphorylation de la protéine AMPK, 3 et 5 heures après injection

d’isoprotérénol chez le poulet (expérience préliminaire) 60

Figure 19

Expression de l’ARNm de la déiodinase D2, 30 minutes et 4 heures après injection

d’isoprotérénol chez le poulet 74

Figure 20

Niveau de phosphorylation des protéines CREB et p38 MAPK, 30 minutes et 4

heures après injection d’isoprotérénol chez le poulet 74

Figure 21

Expression de l’ARNm d’avUCP dans les myoblastes de la lignée cellulaire QM7 et

de culture primaire de cellules musculaires de poussins 76

Figure 22

Expression de l’ARNm d’avUCP et de l’ARNr 18S dans la lignée cellulaire QM7 au

cours de la différenciation 76

Figure 23

Expression du récepteur 2-adrénergique dans différents tissus et cultures cellulaires 77

16

Figure 24

Niveau de phosphorylation du facteur de transcription CREB dans les myoblastes de

poussins en culture primaire, après stimulation par l’isoprotérénol et/ou ajout

d’acides gras 109

Figure 25

Expression des ARNm des facteurs de transcription PPAR!, PPAR /" et PGC-1!

dans les myoblastes de poussins en culture primaire, après stimulation par

l’isoprotérénol et/ou ajout d’acides gras 110

Figure 26

Mesure de consommation d’oxygène par des mitochondries subsarcolemmales

extraites du muscle ASW de poulet 152

Figure 27

Mesure du potentiel de membrane de mitochondries subsarcolemmales extraites du

muscle ASW de poulet 152

Figure 28

Mesures de production d’H2O2 par des mitochondries subsarcolemmales extraites

des muscles PM, AP et ASW de poulet 153

Figure 29

Hypothèses de régulation de l’expression d’avUCP par le système -adrénergique 167

17

Liste des annexes

Page

Annexe 1

Liste des publications 199

Annexe 2

Liste des communications à des congrès scientifiques 200

18

INTRODUCTION

19

La mitochondrie est un organite essentiel pour la cellule. La conversion des nutriments

énergétiques en énergie utilisable pour toutes les fonctions de la cellule est relativement

complexe et hautement régulée pour répondre à différents états nutritionnels de l’organisme, à

la limitation de la production de déchets métaboliques ou encore à un besoin de l’organisme

face à une contrainte environnementale, comme un changement de température ambiante ou

le jeûne. L’un des mécanismes mis en place par la mitochondrie est le découplage, dans lequel

interviennent en particulier les protéines découplantes (uncoupling protein, UCP). Ainsi chez

les mammifères, trois principales UCP, présentes dans différents tissus, ont été caractérisées :

l’UCP1 est à l’origine de la thermogenèse dans le tisseux adipeux brun (TAB), les UCP2 et 3

jouent, quant à elles, potentiellement un rôle dans la limitation de la production de radicaux

libres (reactive oxygen species, ROS) et dans l’utilisation des acides gras par la mitochondrie,

le transport d’ions ou de nutriments énergétiques

Chez les oiseaux, il n’existe qu’une seule UCP dérivant de l’UCP3 (Emre et al., 2007)

et principalement exprimée dans le muscle squelettique. Cette UCP aviaire (avUCP) pourrait

alors remplir un ou plusieurs des rôles des UCP de mammifères, à savoir la thermogenèse

sans frisson, l’utilisation de nutriments dans le métabolisme énergétique et le contrôle de la

production de ROS. La compréhension des mécanismes régulant ces trois fonctions a une

grande importance du point de vue cognitif, et pourrait permettre à terme d’améliorer les

stratégies de sélection ou d’élevage du poulet.

La production de volailles représente un part importante de l’économie agricole. Ainsi,

cette production atteint 1,8 millions de tonne équivalent carcasse (M tec) en France dont

77,2 % de poulets, 11,6 M tec en Union Européenne et 92,3 dans le monde (FranceAgriMer,

2008). La consommation de volailles représente, quant à elle, 29,4 % de consommation totale

de viande en France, soit 1,6 M tec et 24,5 kg par habitant. Dans le monde, cette

consommation représente 35,3 % de la consommation totale de viande, soit 92,3 M tec et

23,3 kg par habitant et par an. Améliorer le rendement et la qualité de la production est donc

un enjeu important.

Ces dernières années ont vu de gros progrès dans la sélection génétique des poulets de

chair dans le but de maximiser leur croissance. Cependant, l’amélioration de la croissance de

l’animal au profit de la masse musculaire n’a pas été suivie de celle des organes viscéraux. En

conséquence, cette sélection a rendu le poulet chair très sensible aux variations de

températures environnementales. Ainsi, des températures extrêmes, associées à la forte

production de chaleur due au métabolisme élevé de ces animaux, peut entraîner leur mort par

hyperthermie (Piestun et al., 2008) et favorise le stress oxydant (Mujahid et al., 2005). Un

20

meilleur contrôle de leur thermogénèse et/ou de leur stress oxydant via des protéines cibles

telles qu’avUCP pourrait atténuer ces phénomènes de mortalité (Mujahid et al., 2009).

Par ailleurs, l’efficacité alimentaire des poulets reste un enjeu primordial en aviculture

pour garantir la productivité et donc la durabilité économique des élevages. Une utilisation

des nutriments énergétiques (lipides et glucides) plus efficace par la mitochondrie est un

levier important pour jouer sur ce paramètre et il est nécessaire d’en comprendre les

mécanismes. Enfin, une production excessive de radicaux libres peut conduire à l’altération

des structures cellulaires. Les conséquences intéressent une grande variété de fonctions

animales, de façon directe (immédiatement après une série de chocs) ou indirecte

(affaiblissement à long terme de l’organisme). Les attaques radicalaires peuvent ainsi

conduire à une diminution du pouvoir fécondant, à une baisse de la fertilité des femelles, à des

mortalités embryonnaires et à une baisse de la vitalité des nouveau-nés. Par ailleurs, elles

peuvent ralentir la croissance des animaux et conduire à l’obtention de carcasses et de viandes

de qualités inférieures au potentiel des animaux. Ces baisses de qualité sont caractérisées par

une durée de conservation plus courte et par une diminution de la teneur des tissus en

composés intéressants pour la santé de l’homme (Aurousseau, 2002). Il est donc primordial de

connaître et de contrôler la présence ou l’activité des régulateurs potentiels de la production

de radicaux libres.

L’étude du rôle de la protéine avUCP participe à une meilleure connaissance des

mécanismes énergétiques contrôlant les grandes fonctions mitochondriales. La compréhension

des mécanismes régulant son expression est essentielle pour pouvoir, à terme, envisager de

moduler son expression dans la mitochondrie et de favoriser ou non son activité biologique.

Après une étude bibliographique sur la mitochondrie et les protéines découplantes, les

résultats des études expérimentales réalisées au cours de ce travail seront présentés sous forme

de publications. Ces dernières seront précédées d’une introduction résumant l’objectif de

chaque expérience ainsi que les principales conclusions et elles seront complétées par des

travaux non publiés. Dans la dernière partie de ce document, nous discuterons les principaux

résultats obtenus dans l’ensemble des études et présenterons les perspectives offertes par ce

travail.

21

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

22

1. La mitochondrie

La description de la mitochondrie et la présentation des différentes voies métaboliques

sont tirées des ouvrages suivants : “Biochimie moléculaire de la cellule, 2ème

édition, Alberts

et al., 1989” et “Biochimie générale, 7ème

édition, Weil J.H., 1994”.

1.1. Généralités

Les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes. Elles ont pour

rôle principal de fournir les cellules en énergie sous forme d’adénosine triphosphate (ATP)

issu de l’oxydation enzymatique des nutriments énergétiques. Les mitochondries ont une

origine exogène. Elles sont issues de l'endosymbiose d'une !-protéobactérie il y a environ

deux milliards d'années. Les mitochondries ont conservé leur propre génome.

Dans la plupart des cellules, les mitochondries ont une forme de petits bâtonnets de

0,5 à 1 µm de diamètre, pouvant atteindre une longueur maximale de 7 µm. Cependant, la

forme de ces organites peut varier selon leur emplacement dans la cellule ou le pH. Ainsi dans

les enthérocytes, les mitochondries du pôle apical sont filamenteuses alors que celles du pôle

basal sont plutôt granulaires. Un pH acide, quant à lui, tend à donner aux mitochondries une

forme vésiculaire.

Les mitochondries sont réparties sous forme de réseau dans le cytoplasme (Benard et

al., 2007). Cependant, cette distribution peut varier en fiontion la morphologie de la cellule

(Ball & Singer, 1982) et des sites cytoplasmiques qui nécessitent un plus gros apport en ATP

(phénomène de « docking ») (Leterrier et al., 1994; Wagner et al., 2003). Au niveau

musculaire, deux populations de mitochondries ont été décrites (Philippi & Sillau, 1994) : les

mitochondries subsarcolemmales et les mitochondries intermyofibrillaires. La population de

mitochondries subsarcolemmales située juste sous la membrane des cellules musculaires

présente une capacité oxydative inférieure à la population de mitochondries

intermyofibrillaires située entre les myofibrilles. Ces deux populations présentent également

une distribution différente selon le type métabolique de fibres musculaires. Ainsi, les fibres

glycolytiques présentent une proportion semblable des deux types de mitochondries alors que

les fibres oxydatives et oxydo-glycolytiques ont une plus forte proportion de mitochondries

subsarcolemmales (Philippi & Sillau, 1994). Par ailleurs, ces dernières possèdent une plus

grande quantité de mitochondries par cellule.

23

Membrane interne

Membrane externe

Espace

intermembranaire

Matrice

B

Mitochondrie

A

Figure 1 : Composition de la mitochondrie

(A). Coupe longitudinale du muscle Adductor profundus montrant des mitochondries

intermyofibrillaires.

(B). La mitochondrie est composée de deux membranes, interne et externe, délimitant deux

compartiments : l’espace intermembranaire et la matrice mitochondriale.

24

1.2. Composition des mitochondries

Les mitochondries sont formées de deux membranes (membrane externe et membrane

interne) délimitant deux compartiments : l’espace intermembranaire ou chambre externe et la

matrice mitochondriale (Figure 1).

La membrane externe est constituée d’une bicouche phospholipidique dans laquelle

les protéines représentent 60 % de la membrane. Ces protéines sont principalement des

transporteurs de protéines synthétisées dans le cytoplasme (Translocase of the Outer

Membrane, TOM) (Neupert, 1997) et des enzymes impliquées dans le métabolisme des acides

gras. La synthèse des phospholipides, constituants de la membrane externe, a lieu au niveau

du réticulum endoplasmique. Ces phospholipides sont ensuite transférés dans la membrane au

niveau de contacts entre le réticulum et la mitochondrie (MAM, Mitochondria-Associated

Membranes) (Vance, 1990). La membrane externe a la propriété d’être perméable à de petites

molécules, et ceci grâce à la présence d’un complexe protéique transmembranaire VDAC

(Voltage-Dependent Anion Channel) encore nommé porine (Forte et al., 1987; De Pinto et

al., 2008). Elle forme un canal qui laisse passer les molécules de petite taille (< à 10 kDa)

telles que des anions, des cations, différents métabolites (acides gras à chaîne courte…) et des

nucléotides.

En raison de la perméabilité relativement élevée de la membrane externe, la

composition de l’espace intermembranaire est comparable à celle du cytosol. Cet espace

intermembranaire contient cependant de nombreuses protéines qui ont un rôle important dans

la physiologie cellulaire, en particulier le cytochrome c, et un important groupe d’enzymes qui

métabolisent l’ATP : la créatine kinase, la myokinase et la nucléoside-diphosphate kinase.

La membrane interne est très différente de la membrane externe. Elle représente cinq à

dix fois la surface de la membrane externe et possède de nombreuses invaginations vers la

matrice mitochondriale nommées crêtes ou replis. Les crêtes se présentent sous des formes

très variées (laminaire, sacculaire, tubulaire, et triangulaire). Elles peuvent coexister dans la

même mitochondrie, fusionner entre elles et se diviser. La signification fonctionnelle de ces

différentes structures reste inconnue à ce jour. Cette membrane présente une proportion

beaucoup plus forte de protéines comparée à la membrane externe, de 70 % à 80 %,. On y

trouve les complexes protéiques de la chaîne respiratoire, le complexe F0F1 de l’ATP

synthase (voir Chap. 2.3.) et de nombreux transporteurs antiports ou symports chargés de faire

24

ADP

+ Pi

ADP

+ Pi

2 NAD+

+ 2 Pi

2 NADH,H+

Dihydroxycétone

phosphate

Glycéraldéhyde

3-phosphate

Aldolase

triosephosphate

isomérase

D-glycéraldéhyde

-3-phosphate

déshydrogénase

ATPADP

+ Pi ATPADP

+ Pi2 H2O

Pyruvate Phosphoénol-pyruvate 3-phospho-

glycérate

1,3-

bisphosphate-

glycérate2-phospho-glycérate

Pyruvate

kinase3-phospho-

glycérate kinase

Phosphoglycérate

mutase

Enolase

Phase consommatrice d’ATP

Phase productrice d’ATP

Glc 2 pyruvates

2 ADP 2 ATP

2 NAD+ 2 NADH,H+

Bilan énergétique :

ATP ATP

Glucose Glucose-6-phosphate Fructose-6-phosphate Fructose-1,6-bisphosphate

Héxokinase Phosphohéxokinase PhosphofructokinaseO

OH

H

H

HH

H

OH

OH

HO

PO

H

OH

OH

HH

OH

H

PO O

H

O

OH

HH

OH

H

PO O

P

P

O

O

OH

P

O

OH

O

P

O

OH

O

OP

P

O

OH

O

O-

P

OH

O

O

O-

P

O

O

O-

O

O

O-

O

OHH

H

HH

H

OH

OH

HO

CH2OH

Figure 2 : La glycolyse

Principales étapes de la glycolyse depuis une molécule de glucose jusqu’à la formation du

pyruvate (Weil, 1994).

ADP : adénosine diphosphate ; ATP : adénosine triphosphate ; H2O : dioxyde d’hydrogène

(eau) ; NAD+ : nicotinamide adénine dinucléotide ; NADH,H

+ : forme réduite de la NAD

+ ;

Pi : phosphate inorganique.

25

entrer dans la matrice mitochondriale tous les métabolites ou substrats nécessaires au

fonctionnement de la chaîne respiratoire, comme le transporteur du pyruvate (H+/pyruvate

translocase), des acides gras (carnitine-acylcarnitine translocase, carnitine

palmytoyltransférase), des protéines en provenance des transporteurs de la membrane externe

(Translocase of the Inner Membrane, TIM) (Neupert, 1997). Cette membrane présente

également la particularité de contenir deux lipides synthétisés dans la matrice mitochondriale :

la phosphatidyléthanolamine provenant de la décarboxylation de la phosphatidylsérine et la

cardiolipine, caractéristique de cette membrane (20 % des lipides totaux) et indispensable au

fonctionnement de la cytochrome c oxydase (COX), enzyme de la chaîne respiratoire (Trivedi

et al., 1986). Les membranes internes et externes peuvent occasionnellement être en contact

pour former un pore de perméabilité transitoire (Permeability Transition Pore, PTP), comme

c’est le cas pour la jonction entre l’Adenine Nucleotide Translocase (ANT) située dans la

membrane interne et VDAC située dans la membrane externe (Halestrap & Brennerb, 2003).

Dans les conditions normales, cette translocase, qui est un système antiport, permet l’échange

d’un ATP (provenant de la matrice) pour un ADP (de l’espace intermembranaire). Cependant,

l’ouverture de ce pore peut être stimulée lors d’un excès de Ca2+

ou d’espèces réactives de

l’oxygène dans la matrice.

De nombreuses enzymes impliquées dans le cycle de Krebs, la -oxydation des acides

gras, le cycle de l’urée, la cétogenèse ainsi que tous les métabolites qui leur sont associés sont

retrouvés dans la matrice mitochondriale. On note également la présence d’un ADN

mitochondrial (ADNmt) souvent localisé au voisinage des crêtes mitochondriales. La

mitochondrie est le seul organite cellulaire animal à posséder un génome. Cependant, chez les

plantes, les plastes (notamment les chloroplastes, lieu de la photosynthèse) possèdent

également un génome.

Le génome mitochondrial peut etre présent en plusieurs copies (1 à 11 par

mitochondrie) et représente au total 1 à 5 % de l’ADN présent dans la cellule. L’ADNmt est

le plus souvent de forme circulaire, mais peut se trouver sous forme linéaire, simple brin ou

double brin. Depuis l’endosymbiose de la mitochondrie, son génome a perdu de nombreux

gènes qui ont été transférés dans le noyau au cours de l’évolution mais il possède toujours la

capacité d’effectuer la transcription, via l’ARN polymérase 4 et la traduction au niveau des

mitoribosomes. Le génome mitochondrial code pour 13 protéines que l’on retrouve dans la

chaîne respiratoire (7 sous-unités du complexe I, 3 sous-unités du comlexe IV et une du

complexe III) encore les sous-unités de 6 et 8 de l’ATP synthase (Anderson et al., 1981;

Alexeyev et al., 2004).

25

CH3(CH2)n SCoA

H

H

H

H

O

C

26

C C

Acyl-CoA déshydrogénase

Acyl-CoA

CH3(CH2)n SCoA

H

H

O

C C C

CH3(CH2)n SCoA

OH

O

C C

H

C

H

H

CH3(CH2)n C

O

SCoA

O

C C

H

H

-!-déhydroacyl-CoA

L-!-hydroxyacyl-CoA

!-cétoacyl-CoA

Acyl-CoA Acétyl-CoA

Enoyl-CoA hydratase

(crotonase)

L- -hydroxyacyl-CoA

déshydrogénase

-cétothiolase

H SCoA

O

C C

H

H

CH3(CH2)n-2 SCoA

H

H

H

H

O

C C C +

FAD

FADH2

NAD+

NADH,H+

H2O

CoASH

-oxydation

Bilan énergétique :

Acyl-CoA à n C

n-1 FAD2

n-1 NAD+

2

n-1 FADH2

2n-1 NADH,H+

2

n acétyl-CoA2

Figure 3 : La !-oxydation

Principales étapes de la -oxydation des acides gras. Cette cascade enzymatique permet la

formation d’acétyl-CoA à partir d’acides gras activés par un CoA (Weil, 1994).

CoA : coenzyme A ; FAD : flavine adénine dinucléotide; FADH2 : forme réduite de la FAD ;

NAD+ : nicotinamide adénine dinucléotide ; NADH,H

+ : forme réduite de la NAD

+.

1.3. Rôles cellulaires de la mitochondrie

Le rôle le plus important de la mitochondrie est celui d’un convertisseur d’énergie

pour la cellule. Ce rôle sera développé dans le chapitre 2. La mitochondrie est aussi capable

de stocker une grande quantité d’ions calcium Ca2+

dans la matrice mitochondriale. En

collaboration avec le réticulum endoplasmique, la mitochondrie peut ainsi participer aux voies

de signalisation faisant intervenir des pics ou des vagues de calcium comme second messager

ou participer à la coordination de la libération de neurotransmetteurs des cellules nerveuses ou

des hormones des cellules endocrines (McCormack & Denton, 1990).

La mitochondrie est également impliquée dans la mise en route de la mort cellulaire

programmée ou apoptose. Suite aux dommages irréparables de l'ADN (chimiothérapie,

rayons-X, radicaux libres, …), à la perte de contact cellule-matrice ou cellule-cellule, ou

encore lors de la mise en jeu d'une horloge interne, la cellule déclenche un processus de mort

cellulaire programmée. La mitochondrie intervient dans ce processus en libérant ses

cytochromes c dans le cytoplasme suite à l’ouverture des PTP ou mégapores. Les

cytochromes c ainsi libérés sont à l’origine de l’activation de la voie des caspases, par clivage

de la procaspase 9, qui aboutit à la fragmentation de l’ADN nucléaire (Bras et al., 2005).

La mitochondrie est impliquée dans d’autres mécanismes cellulaires en participant par

exemple à l’homéostasie du fer et à la synthèse des porphyrines, précurseurs de l’hème. Les

étapes initiales et finales de cette synthèse s’effectuant dans la matrice mitochondriale. La

mitochondrie participe aussi à la synthèse des stéroïdes (Rone et al., 2009). Les enzymes

permettant la synthèse des stéroïdes à partir du cholestérol sont principalement situées dans la

mitochondrie ou le réticulum endoplasmique. Le cholestérol passe obligatoirement par les

mitochondries pour être converti en $5-prégnénolone qui poursuit sa transformation dans le

réticulum endoplasmique. Certains stéroïdes retournent ensuite dans la mitochondrie pour les

étapes finales de synthèse.

2. La phosphorylation oxydative et le découplage

Selon la théorie chimiosmotique de Mitchell (Mitchell, 1966), l’énergie libre produite

par la réoxydation de cofacteurs est convertie sous forme de gradient de protons à travers la

membrane interne mitochondriale. Ce gradient, généré par le transfert d’électrons au niveau

26

CO2

CO2

NADH,H+

NADH,H+

NADH,H+

FADH2

GTP

NADH,H+CO2

Cyclede

Krebs

Citrate synthase

Cis-aconitase

Isocitrate déshydrogènase

-cétoglutarate déshydrogènase

Succinate thiokinase

Succinate déshydrogènase

(Complexe II)

Fumarase

Malate déshydrogènase

Citrate

Isocitrate

!-cétoglutarate

Succinyl-CoASuccinate

Fumarate

Malate

Oxaloacétate

Acétyl-CoA

NAD+

NAD+

NAD+

FAD

GDP

+ Pi

CoASH

PyruvatePyruvate déshydrogènase

NAD+CoASH

Glycolyse -oxydation Substrat énergétique

Déchet

Figure 4 : Le cycle de Krebs

Le cycle de Krebs ou cycle acides tricarboxyliques comprend 8 réactions enzymatiques. Il

permet la formation de cofacteurs réduits nécessaires à la chaîne respiratoire. Le cycle est

alimenté par de l’acétyl-CoA, qui provient de la -oxydation ou du pyruvate de la glycolyse

(Weil, 1994).

CoA : coenzyme A ; CO2 : dioxyde de carbone ; FAD : flavine adénine dinucléotide ;

FADH2 : forme réduite de la FAD ; GDP : guanosine diphosphate ; GTP : guanosine

triphosphate ; NAD+ : nicotinamide adénine dinucléotide ; NADH,H

+ : forme réduite de la

NAD+;

Pi : phosphate inorganique.

27

de la chaîne respiratoire, est ensuite utilisé par l’ATP synthase pour catalyser la réaction

réversible de phosphorylation de l’ADP en ATP.

2.1. Conversion des nutriments énergétiques

La phosphorylation oxydative nécessite la présence de cofacteurs réduits. Ces derniers

sont générés par une suite de réactions enzymatiques débutant par la conversion des

nutriments énergétiques que sont le glucose et les acides gras. De par la nature de ces

nutriments, leur dégradation emprunte des voies différentes.

Le glucose est dégradé dans le cytoplasme de la cellule par la glycolyse, aussi appelée

voie d'Embden-Meyerhof-Parnas (Figure 2). Cette voie se décompose en deux phases : une

phase préparatoire consommant de l’énergie et une phase de remboursement productrice

d’ATP (Weil, 1994). Après son entrée dans la cellule, le glucose est pris en charge par une

cascade de réactions enzymatiques aboutissant à deux D-glycéraldéhyde-3-phosphate (GAP)

et consommant deux molécules d’ATP par glucose. Le GAP est alors pris à son tour dans une

cascade enzymatique pour former un pyruvate, tout en resynthétisant deux molécules d’ATP.

Le pyruvate rentre alors dans la mitochondrie où, associé à un coenzyme A, il est converti en

acetyl-CoA.

Après activation des acides gras libres à longue chaîne par l’acyl-CoA-synthase dans

le cytoplasme, ces derniers sont pris en charge par la carnitine palmitoyltransférase 1 (CPT1)

au niveau de la membrane externe de la mitochondrie et la carnitine palmitoyltransférase 2

(CPT2) de la membrane interne pour faire entrer les acyl-CoA dans la mitochondrie. Les

acyl-CoA peuvent également être pris en charge par les peroxysomes où ils seront

partiellement oxydés en acides gras à chaîne courte et pénétreront dans la mitochondrie par

simple diffusion à travers les membranes. L’oxydation intramitochondriale des acides gras est

alors réalisée par la voie de la -oxydation ou hélice de Lynen (Weil, 1994), qui s’exécute en

quatre étapes au terme desquelles il y a formation d’un acyl-CoA plus court de deux atomes

de carbone et d’un acétyl-CoA disponible pour le cycle de Krebs (Figure 3). Au niveau du

foie, en cas de forte production d’acétyl-CoA par la -oxydation, il peut également y avoir

formation de corps cétoniques qui peuvent ensuite être à nouveau oxydés pour former de

l’acétyl-CoA dans d’autres tissus.

Le cycle de Krebs, aussi appelé cycle de l'acide citrique ou cycle des acides tricarboxyliques,

est un cycle enzymatique de huit réactions (Figure 4). Les enzymes de ce

27

Cyt C

CoQ

C I

Cycle

De

Krebs

-oxydation

FAD FADH2

NADH,H+NAD+

H+ H+ H+

C III

C IV

C II

O2 H2O

ADP

+ Pi

H+

ATP

ATPSynthase

Matrice

Espace intermembranaire

Figure 5 : La phosphorylation oxydative

La phosphorylation oxydative comprend deux grandes étapes : (1) une cascade

d’oxydation/réduction des complexes de la chaîne respiratoire pour expulser des protons

depuis la matrice mitochondriale vers l’espace intermembranaire et (2) une phosphorylation

au niveau de l’ATP synthase qui utilise le gradient de protons pour générer de l’ATP à partir

d’ADP et de phosphate inorganique (Mitchell, 1966).

ADP : adénosine diphosphate ; ATP : adénosine triphosphate ; C I : complexe I de la chaîne

respiratoire ; C II : complexe II de la chaîne respiratoire ; C III : complexe III de la chaîne

respiratoire ; C IV : complexe IV de la chaîne respiratoire ; CoQ : coenzyme Q ; Cyt C :

cytochrome c ; FAD : flavine adénine dinucléotide ; FADH2 : forme réduite de la FAD ;

H+

: proton ; NAD+ : nicotinamide adénine dinucléotide ; NADH,H


NAD+

; O2 : dioxygène ; Pi : phosphate inorganique ; : chaîne de transfert d’électrons.

28

cycle se trouvent dans la matrice mitochondriale ou peuvent être ancrées dans la membrane

interne. La première étape correspond à la synthèse d’un citrate à partir d’un oxaloacétate

provenant d’un cycle précédent et d’un acétyl-CoA produit en fin de glycolyse ou pendant la

-oxydation. Une suite de réactions enzymatiques convertit ensuite successivement le citrate

en isocitrate, !-cétoglutarate, succinyl-CoA, succinate, fumarate, malate et enfin oxaloacétate.

Un tour de cycle permet, à partir d’un acétyl-CoA, de réduire trois molécules de nicotinamide

adénine dinucléotide (NAD+) en NADH,H

+, une flavine adénine dinucléotide (FAD) en

FADH2 et de produire une guanosine triphosphate (GTP).

2.2. La chaîne respiratoire

La chaîne respiratoire se trouve au niveau de la membrane interne de la mitochondrie.

Elle est composée de quatre complexes protéiques importants (Figure 5). Le complexe I ou

NADH-ubiquinone oxydoréductase est composé de 25 sous-unités. Le complexe II aussi

appelé succinate-ubiquinone oxydoréductase est constitué de 4 sous-unités. Les complexes III

(ubiquitinol cytochrome c oxydoréductase) et IV (COX) sont respectivement composés de

10 et 13 sous-unités. Il existe également 2 transporteurs d’électrons entre ces complexes :

le coenzyme Q (CoQ), une quinone membranaire qui fait la navette entre les complexes I, II

et III et le cytochrome c entre les complexes III et IV dans l’espace intermembranaire. Ces

complexes passent d’un état réduit à un état oxydé en transmettant des électrons de complexe

en complexe. Le complexe I, qui oxyde le NADH,H+, est ainsi réduit en prenant deux

électrons au cofacteur. L'énergie de cette oxydo-réduction permet d'éjecter des protons hors

de la matrice mitochondriale. Le complexe I retrouve ensuite son état d'oxydation antérieur en

transmettant un électron au CoQ. Le complexe II oxyde le FADH2 en FAD qui est interne au

complexe. Cette réaction est couplée à l’oxydation du succinate en fumarate lors du cycle de

Krebs réduisant le FAD en FADH2. Comme pour le complexe I, le complexe II retrouve son

état antérieur en réduisant un CoQ. Celui-ci, alors réduit, transporte ces 2 électrons à travers la

membrane jusqu'au complexe III, qui est alors réduit. Le complexe III se réoxyde en

transmettant les électrons au cytochrome c. Cette réoxydation fournit l'énergie nécessaire pour

éjecter à nouveau des protons hors de la matrice mitochondriale. Le cytochrome c transporte

les électrons jusqu'au complexe IV, le dernier de la chaîne, qui est réduit à son tour. La

réduction d’une molécule d’O2 permet au complexe IV de retrouver son état antérieur et

d’éjecter des protons vers l’espace intermembranaire. L'oxygène réduit forme, avec des

28

Figure 6 : L’ATP synthase (d’après von Ballmoos et al., 2009)

L’ATP synthase est formée de deux domaines, F0 et F1. Le domaine F0 est intermembranaire

et utilise la force proton-motrice pour tourner sur lui-même. Le domaine F1 utilise cette

rotation du domaine F0 pour générer de l’ATP à partir d’ADP et de phosphate inorganique.

a, b2, c10-15 : sous-unités du domaine F0 ; 3!3, ", #, $ : sous-unités du domaine F1.

29

protons de la matrice, des molécules d'eau, ce qui augmente encore le gradient de protons

généré par les complexes I, III et IV.

2.3. L’ATP synthase

L’ATP synthase des mitochondries (comme celles des chloroplastes et des bactéries)

est une ATPase de type F, encore appelée F1F0 ATP synthase (Ryrie & Jagendorf, 1972; von

Ballmoos et al., 2009). Cette enzyme de masse moléculaire élevée (entre 550 à 650 kDa) est

constituée de deux domaines protéiques (Figure 6). Le domaine F0, situé dans la membrane

interne de la mitochondrie, est constitué de 13 à 15 sous-unités de composition suivante

ab2c10-15. S’il est seul, il laisse passer les protons librement et ceci de manière très rapide

depuis l’espace intermembranaire vers la matrice mitochondriale par un anneau formé par les

sous-unités c. Ce passage des protons entraîne la rotation du domaine F0, à l’exception de la

sous-unité a et du dimère de sous-unités b qui forme le stator, une partie immobile, du

domaine F0. Le domaine F1, composé de neuf sous-unités de composition !3 3"#$, est situé

dans la matrice mitochondriale. Il est connecté au domaine F0 via ses sous-unités " et $ au

niveau de l’anneau de sous-unités c, et via la sous-unité # au niveau des sous-unités b. Les

sous-unités ! et forment une structure hexamèrique autour d’un axe formé par la sous-unité

". Le domaine F1 utilise la rotation du domaine F0 pour synthétiser de l’ATP à partir d’ADP

et de phosphate inorganique (Pi) au niveau de l’interface entre les sous-unités ! et . Ces trois

sites catalytiques, immobiles grâce à leur liaison au stator de F0, adoptent différentes

conformations suite à la rotation de l’axe ". Ces changements de conformation permettent de

synthétiser l’ATP.

L’ATP synthase utilise directement le gradient de protons produit par les complexes

de la chaîne respiratoire entre l’espace intermembranaire et la matrice mitochondriale pour

générer de l’ATP (Figure 5). On parle alors de phosphorylation oxydative pour caractériser le

couplage entre l’oxydation au niveau de la chaîne respiratoire et la phosphorylation au niveau

de l’ATP synthase.

2.4. Le découplage

La phosphorylation de l’ATP synthase est donc couplée à l’oxydation de la chaîne

respiratoire par l’intermédiaire du gradient de protons entre l’espace intermembranaire et la

29

Cyt C

CoQC I

FAD FADH2

NADH,H+NAD+

H+ H+ H+

C III

C IV

C II

O2 H2O

ADP

+ Pi

H+

ATP

ATPSynthase

H+

UCP

Matrice


Figure 7 : Hypothèse du découplage par UCP

Les protons expulsés par la chaîne respiratoire peuvent retourner dans la matrice sans passer

par l’ATP synthase. Il y a alors découplage entre les oxydations de la chaîne respiratoire et la

phosphorylation de l’ATP synthase. Les protéines découplantes (UCP) peuvent permettre ce

retour des protons dans la matrice mitochondriale (Nicholls, 1974).

ADP : adénosine diphosphate ; ATP : adénosine triphosphate ; C I : complexe I de la chaîne

respiratoire ; C II : complexe II de la chaîne respiratoire ; C III : complexe III de la chaîne

respiratoire ; C IV : complexe IV de la chaîne respiratoire ; CoQ : coenzyme Q ; Cyt C :

cytochrome c ; FAD : flavine adénine dinucléotide ; FADH2 : forme réduite de la FAD ;

H+

: proton ; NAD+ : nicotinamide adénine dinucléotide ; NADH,H


NAD+

; O2 : dioxygène ; Pi : phosphate inorganique ; UCP : uncoupling protein (protéine

découplante) ; : chaîne de transfert d’électrons.

30

matrice mitochondriale. Toute diminution du gradient de protons découple la phosphorylation

oxydative, on parle alors de découplage mitochondrial. Celui-ci peut être dû à une diminution

du nombre de protons pompés par la chaîne respiratoire ou à un retour des protons dans la

matrice par des fuites sans emprunter l’ATP synthase.

L’efficacité du pompage de protons par la chaîne respiratoire diminuerait quand le

potentiel de membrane augmente, suite à un “patinage” dans le transport des protons au

niveau des complexes III et IV de la chaîne respiratoire et de l’ATP synthase. Ce phénomène

n’est pas confirmé in vivo (Kadenbach, 2003; Brand, 2005).

Parallèlement à ce «patinage» des pompes à protons, il existe une fuite de protons à

travers la membrane interne de la mitochondrie. Les protons retournent dans la matrice sans

participer à la synthèse d’ATP. Cette fuite de protons, physiologiquement importante,

constitue une voie de régulation majeure de l’énergie mitochondriale (Brand et al., 1999).

Chez le rat, elle représente 20 à 30 % de la consommation d’oxygène d’hépatocytes isolés,

jusqu’à 50 % de la consommation basale d’oxygène d’un muscle perfusé et de 20 à 25 % du

métabolisme de repos de l’organisme (Rolfe & Brand, 1996). De plus, dans un état actif de

production d’ATP, ces fuites de protons correspondent encore à 15 % du métabolisme total.

Cette fuite pourrait être la conséquence d’un cycle futile des acides gras. Les acides gras sous

forme protonée pourraient traverser la membrane interne. La matrice mitochondriale étant très

alcaline, ces acides gras perdraient leur proton et retournerait dans l’espace intermembranaire

sous forme anionique. Cependant, sous forme anionique, les acides gras traversent

difficilement la membrane interne. Cette action des acides gras ne peut donc s’effectuer que

lorsque le potentiel de membrane est très élevé, permettant la translocation des acides gras

anioniques de la matrice vers l’espace intermembranaire (Skulachev, 1991). Ce cycle futile

des acides gras n’expliquerait que 5 % de la fuite de protons (Brookes et al., 1997).

Cependant, il est possible qu’un transporteur des acides gras anioniques puisse fortement

augmenter cette implication.

Une seconde possibilité pour expliquer la fuite de protons est l’intervention de

protéines de la membrane interne de la mitochondrie. L’invalidation des transporteurs

d’anions chez la levure n’a pas d’effet sur le découplage mitochondrial (Roussel et al., 2002).

Les transporteurs tel que le transporteur aspartate/glutamate (Skulachev, 1999), les

transporteurs impliqués dans le cycle du calcium (Graier et al., 2007), ainsi que les protéines

découplantes (Figure 7) pourraient être impliqués de la découplage. Il existe un dernier

transporteur, l’ANT, dont l’implication dans le découplage prend une part très importante.

Brand et al. (Brand et al., 2005) ont en effet montré, par sous-expression ou sur-expression de

30

Gène

(1ère publication)

Localisation

du gène

(chromosome

humain)

% d’homologie

(avec …)

Localisation

tissulaire

principale

Quantité

(% des protéines

mitochondriales)

UCP1

(Ricquier et Kader,

1976)

4q28-q31 TAB 5-8 %

au froid

UCP2

(Fleury et al., 1997) 11q13 55 % UCP1

Ubiquitaire

(sauf foie) 0,03 %

UCP3

(Boss et al., 1997) 11q13

57 % UCP1

71 % UCP2

Muscle

squelettique 0,01 %

UCP4

(Mao et al., 1999) 6p11, 2-q12 30 % UCP1 Cerveau ND

UCP5 (BMCP1)

(Sanchis et al.,

1998)

Xq24 33 % UCP1 Cerveau ND

HDMCP

(Tan et al., 2004) 14q32,2 25 % UCP1

Carcinome

hépatique ND

KMCP1

(Hagenauer et al.,

2005)

13q14,13 80 % UCP5 Rein ND

avUCP

(Raimbault et al.,

2001)

1

(poulet)

55 % UCP1

70 % UCP2-3

Muscle

squelettique ND

Tableau I : Présentation des différentes UCP humaines et d’oiseau

D’après Damon et Collin (2006).

ND : non déterminé ; TAB : tissu adipeux brun.

31

l’ANT, une implication de ce transporteur dans le découplage à la hauteur de 50 à 75 %, et

ceci indépendamment de son activité de transporteur d’ADP et ATP.

3. Les protéines découplantes

Les protéines découplantes forment une famille de protéines membranaires

mitochondriales. Cette famille comporte sept représentants chez les mammifères (UCP1,

UCP2, UCP3, UCP4, UCP5, HDMCP et KMCP1) et seulement un chez les oiseaux (avUCP)

(Emre et al., 2007) (Tableau I). Ces protéines d’environ 300 acides aminés ont un poids

moléculaire avoisinnant les 34 kDa et un point isoélectrique de 9. La famille des protéines

découplantes appartient à la super famille des transporteurs mitochondriaux. Ces protéines

sont des homodimères constitués de monomères de même structure : trois domaines de

100 résidus comprenant deux régions hydrophobes (hélices !) reliées par des segments

hydrophiles. Selon Arechaga et al. (Arechaga et al., 2001), les hélices ! aménagent un canal

tandis que les segments hydrophiles servent de portes assurant l’activité et la sélectivité du

transporteur.

Les UCP se retrouvent dans de nombreux autres organismes, que ce soient les

insectes, les poissons ou encore les plantes. Ceci suggère que cette famille de protéines est

très ancienne et sa conservation au cours de l’évolution montre une grande importance du

découplage dans la modulation de l’efficacité du métabolisme énergétique. Plusieurs études

ont cherché à classer les protéines découplantes du règne végétal et animal. Nogueira et al.

(Nogueira et al., 2005) ont classé 51 protéines découplantes végétales et mammaliennes en

cinq familles. Les UCP 1 à 3 appartiendraient à une même famille 1, UCP4 à la famille 3 et

UCP5 serait l’unique protéine de la famille 4. Les familles 2 et 5, quant à elles, ne

contiendraient que des protéines végétales. Sokolova et Sokolov (Sokolova & Sokolov, 2005)

suggèrent également que les UCP ont divergé très rapidement formant trois classes, la classe 1

comprenant les UCP 1 à 3, la classe 2 UCP4 et la classe 3 UCP5. Ils soutiennent également

que l’UCP6 mise en évidence chez l’huître et appartenant à la classe 1 serait la plus proche de

l’UCP ancestrale, contredisant ainsi Hanak et Jezek (Hanak & Jezek, 2001) qui voyaient en

l’UCP4, l’UCP la plus proche de l’UCP ancestrale. Cependant la localisation exclusive

d’UCP4 dans le cerveau et son activité probablement très spécifique à l’organe invalident

fortement l’hypothèse de ces derniers.

31

3.1. Les protéines découplantes de mammifères

3.1.1. UCP1

La première protéine découplante a été découverte chez les mammifères

(Nicholls, 1974). D’abord appelée thermogénine, elle fut ensuite renommée UCP1. Cette

protéine est présente dans le tissu adipeux brun (TAB) chez les mammifères nouveau-nés, les

rongeurs non hibernants exposés au froid et chez les animaux hibernants lors de la phase de

réveil. Le TAB est un organe thermogénique qui diffère du tissu adipeux blanc. Sa couleur

brune est due aux nombreuses mitochondries qu’il contient. Ces dernières sont toutes très

fortement découplées au point que la totalité de l’énergie de la chaîne respiratoire est dissipée

sous forme de chaleur. Nicholls (Nicholls, 1974) a montré qu’une forte concentration de

l’ordre du millimolaire de guanosine diphosphate (GDP) peut inhiber complètement le

découplage des mitochondries isolées du TAB. Une concentration de 10 µM peut, quant à

elle, inhiber le découplage à hauteur de 50 %. Nicholls (Nicholls, 1974) a donc émis

l’hypothèse qu’une protéine sensible au GDP pouvait moduler la perméabilité aux protons de

la membrane interne de la mitochondrie. Cette protéine fut ensuite identifiée comme UCP1,

purifiée et clonée (Ricquier & Kader, 1976; Lin & Klingenberg, 1980; Aquila et al., 1985;

Bouillaud et al., 1985; Bouillaud et al., 1986). Elle représente 5 à 8 % des protéines

mitochondriales dans le TAB. Il a longtemps été considéré qu’UCP1 était spécifique du TAB,

cependant de récentes études ont montré qu’elle est également présente dans les muscles

lisses

(Nibbelink et al., 2001) ou le thymus (Carroll et al., 2005). Par ailleurs, la présence d’ARNm

d’UCP1 a été mis en évidence dans le muscle squelettique de l’adulte, ainsi que dans une

population de cellules capables de se différencier en adipocytes semblables à ceux TAB

(Crisan et al., 2008). Chez l’homme, le gène Ucp1 se trouve au niveau du chromosome 4

(chromosome 8 chez la souris). Il est constitué de six exons pour un total de 9 kb. Chaque

exon code pour une des six hélices ! transmembranaires de la protéine. Au niveau de son

promoteur, différentes séquences correspondant à des éléments de réponse ont été identifiées.

Ainsi peuvent agir les facteurs de transcription sensibles à l’AMPc (cAMP Response Element

Binding protein, CREB) (Boyer & Kozak, 1991), les Peroxisome Proliferator-Activated

32

Receptors (PPAR) !, /# et " (Sears et al., 1996; Barbera et al., 2001; Wang et al., 2003b), les

récepteurs aux hormones thyroïdiennes (Thyroid hormones Receptor, TR), ainsi qu’aux

acides rétinoïques cis et trans (Retinoic Acid Receptor, RAR et Retinoic X Receptor, RXR)

(Cassard-Doulcier et al., 1994; Rabelo et al., 1996b) et CCAAT/enhancer binding protein

(C/EBP) (Cassard-Doulcier et al., 1993; Yubero et al., 1994). Contrairement à la majorité des

facteurs de transcription qui ont leur élément de réponse situé dans une petite zone de 210 pb

éloignée du premier exon (-2,49/-2,28 kb) (Cassard-Doulcier et al., 1993), les éléments de

réponse de C/EBP! et sont beaucoup plus proches du premier exon (-457/-440 et -

335/-318 pb) (Yubero et al., 1994).

3.1.2. UCP2

La première protéine identifiée comme homologue à UCP1 est UCP2. Son gène se

trouve sur le chromosome 11 chez l’homme et 7 chez la souris. Le gène présente huit exons

pour un total de 8,7 kb. Il possède une identité de séquence de 59 % avec UCP1 au niveau

nucléique et de 55 % au niveau protéique. L’ARN messager d’UCP2 est exprimé chez

l’homme dans de nombreux tissus comme le muscle squelettique, le poumon, le cœur, le rein,

le placenta et dans de plus fortes proportions dans la rate, le thymus, l’estomac et les

macrophages (Fleury et al., 1997). Cependant, Pecqueur et al. (Pecqueur et al., 2001) ont

montré à l’aide d’un anticorps dirigé contre la protéine UCP2 qu’elle n’est pas retrouvée dans

le cœur, le muscle et le TAB chez la souris. Ils ont également montré que la quantité de

protéines UCP2 présente dans la rate est notablement plus faible que la protéine UCP1 dans le

TAB. La séquence promotrice du gène Ucp2 présente des éléments de réponse à l’AMPc

(cAMP Response Element, CRE), au facteur myogénique MyoD, au Sterol Regulatory

Element Binding Protein (SREBP), aux glucocorticoïdes (Glucocorticoid Response Elements,

GRE), aux hormones thyroïdiennes (Thyroid hormones Response Elements, TRE) et aux

PPAR (PPAR Response Elements, PPRE) (Yamada et al., 1998; Yoshitomi et al., 1999;

Oberkofler et al., 2006; Villarroya et al., 2007). Par ailleurs, il existe deux cadres de lecture

ouverts (Open Reading Frame, ORF) pour la traduction du messager (Pecqueur et al., 2001).

Le premier dans l’exon 2 produit un petit peptide de 36 acides animés, le deuxième dans

l’exon 3 permet de synthétiser la protéine UCP2. Ces deux cadres de lecture possibles

expliquent la très faible quantité de protéines UCP2 présente en comparaison avec son ARNm

et révèlent une régulation de l’expression de la protéine au niveau traductionnel. Cette

33

régulation ne fait pas intervenir un épissage alternatif retirant l’exon 2 et ainsi l’ORF codant

pour le peptide de 36 acides aminés. La majorité des ribosomes commence la traduction au

niveau de cette première ORF et seuls quelques-uns vont traduire l’ARNm au niveau de la

deuxième ORF. Ainsi, seuls les tissus qui expriment le plus fortement l’ARNm, présentent

une protéine UCP2. Récemment, un deuxième transcrit a été mis en évidence dans les

tumeurs osseuses (Srivastava et al., 2006). Cet ARNm code pour une protéine plus courte (79

acides animés) suite à l’insertion de 22 nucléotides dans l’intron 3 introduisant ainsi un codon

stop dans l’exon 4.

3.1.3. UCP3

La troisième protéine découplante identifiée est UCP3. Elle présente 57 % d’identité

de séquence avec UCP1 et 71 % avec UCP2. L’UCP3, découverte dans un premier temps

dans le TAB, le tissu adipeux et le cœur (Boss et al., 1997), est majoritairement exprimée

dans le muscle squelettique (Schrauwen et al., 2006). Il a été mis en évidence que UCP3 est

davantage exprimée dans les muscles glycolytiques que dans les muscles oxydatifs (Hesselink

et al., 2001; Jimenez et al., 2002). La protéine UCP3 est également plus présente dans les

mitochondries subsarcolemmales que dans les mitochondries intermyofibrillaires (Jimenez et

al., 2002). Chez l’homme, le gène Ucp3 possède 7 exons dont 6 codants et couvre 8,5 kb

(Solanes et al., 1997). La colocalisation du gène Ucp3 avec celui d’UCP2 et des liaisons

intron/exon très conservées suggèrent que ces gènes sont issus d’un évènement de duplication.

Son promoteur présente des éléments de réponses aux PPAR ! et /#, à l’AMPc, à MyoD, à

MEF2 (muscle enhancer factor 2), aux hormones thyroïdiennes et une boîte CCAC (Acin et

al., 1999; Tu et al., 2000; Solanes et al., 2003). Il existe 2 transcrits pour UCP3, un court (275

acides animés, UCP3S) et un long (312 acides animés, UCP3L) qui proviennent d’un épissage

alternatif retirant ou non l’exon 7 (Solanes et al., 1997). Les deux transcrits sont exprimés

dans le muscle en proportions égales. La partie C-terminale, absente du transcrit court,

présente une forte similitude avec une région d’UCP1 comportant un site d’inhibition par les

nucléotides. La perte de cette partie C-terminale correspondant à une partie du sixième

segment transmembranaire entraîne une certaine instabilité de la protéine au niveau de

bicouche lipidique de la membrane interne. Cependant, la diminution de l’activité due à cette

instabilité pourrait être compensée par la perte de l’inhibition par les nucléotides (Boss et al.,

1997; Millet et al., 1998). L’inhibition d’UCP3 par le GDP a été mise en évidence par (Talbot

34

et al., 2004a). Ces auteurs ont également montré que l’UCP3 peut être activée par l’ion

superoxyde O2.-.

3.1.4. Autres protéines découplantes de mammifères

Chez les mammifères, quatre autres protéines découplantes sont connues : UCP4,

UCP5, HDMCP (HCC down regulated mitochondrial carrier protein) et KMCP1

(kidney mitochondrial carrier protein 1). UCP4 est exprimée majoritairement dans le cerveau

(Mao et al., 1999; Smorodchenko et al., 2009). Elle serait impliquée dans l’apoptose

neuronale (Ho et al., 2005). Zhang et al. (Zhang et al., 2006) ont montré que la surexpression

d’UCP4 protège les adipocytes de l’apoptose en inhibant la différenciation et en stimulant la

prolifération des préadipocytes. De très faibles quantités d’ARNm d’UCP4 ont également été

retrouvées dans le cœur, les poumons, le foie, le rein ou encore le muscle squelettique chez le

rat ou la souris (Alan et al., 2009).

UCP5, aussi appelée BMCP1 (brain mitochondrial carrier protein-1), est

essentiellement présente dans le cerveau et le testicule. Elle se retrouve également en très

faible quantité dans d’autres tissus comme le cœur, les poumons, le foie, les reins, les

intestins, le muscle squelettique, ou encore le tissu adipeux chez le rat ou la souris (Sanchis et

al., 1998; Yu et al., 2000; Alan et al., 2009). Son gène est localisé sur le chromosome X chez

l’homme. L’UCP5 humaine présente trois isoformes différentes issues d’un épissage alternatif

(Yu et al., 2000), une forme longue de 325 acides animés (UCP5L), une forme courte de

322 acides aminés (UCP5S) et une forme contenant un petit insert de 31 acides animés

supplémentaires, par rapport à UCP5S, pour un total de 353 acides aminés (UCP5SI). Les

trois ARNm sont exprimés dans des proportions différentes dans le muscle squelettique chez

l’homme (étude chez les indiens Pima) : 66,8 % pour UCP5L, 32,5 % pour UCP5S et 0,8 %

pour UCP5SI (Yang et al., 2002).

HDMCP fut identifiée dans le foie en 2004 par Tan et al. (Tan et al., 2004). Son

expression est fortement diminuée lors d’un cancer du foie (hepatocellular carcinoma, HCC).

Son gène code pour un ARNm de 1,7 kb et une protéine de 308 acides aminés.

KMCP1 a été identifié pour la première fois dans le rein en 2005 (Haguenauer et al.,

2005). C’est une protéine de 291 acides aminés qui présente 80 % d’identité avec

BMCP1/UCP5 tronquée des 20 résidus de la partie N-terminale spécifique de cette dernière.

Son gène, situé sur le chromosome 13 chez l’homme, possède 10 exons dont neuf codants

35

Intron Exon (région codante) Exon (région non-codante)

262 387 509 723 1256 1461 2022 21262199 2385

2473 25591 2936

Figure 8 : Gène avUCP chez le poulet (Gallus gallus)

Le gène d’avUCP, long de 2,9 kb, est situé sur le chromosome 1 chez le poulet. Il possède 6

exons et code pour une protéine de 307 acides animés.

36

(le codon start étant situé dans l’exon 2). Son ARNm de 3,7 kb code une protéine d’environ

30 kDa.

3.2. Protéine découplante de l’oiseau

Chez les oiseaux, on ne trouve qu’une seule protéine découplante : avUCP. Au cours

de l’évolution, les oiseaux auraient perdu leurs UCP pour ne conserver qu’une protéine

découplante orthologue de l’UCP3 de mammifères (Emre et al., 2007; Saito et al., 2008).

Chez le poulet, cette protéine découplante possède 307 acides aminés (Raimbault et al.,

2001). Elle présente respectivement 55 % d’identité avec les UCP1 et 70 % avec UCP2 et

UCP3 au niveau protéique. Cette protéine est également exprimée chez le canard, la dinde, le

manchot, le colibri et l’eider à duvet (Vianna et al., 2001; Mozo et al., 2005). La protéine

avUCP est très fortement exprimée dans le muscle squelettique. De plus, son ARNm a été

détecté dans d’autres tissus comme le foie, le cœur, le rein, le tissu adipeux, la rate, le cerveau

ou encore les poumons chez des animaux plus jeunes (Evock-Clover et al., 2002). Le gène

avUCP, long de 2,9 kb, possède six exons (Figure 8). Il existe un polymorphisme de ce gène.

Liu et al. (Liu et al., 2007) ont mis en évidence chez le poulet, au niveau de l’exon 3, une

thymine en position 1316 remplacée par une cytosine. Ce polymorphisme est associé à des

caractères de poids de muscles et de gras abdominal différents. En 2008, Sharma et al.

(Sharma et al., 2008) ont mis à jour de nombreuses autres mutations dans le gène avUCP,

principalement dans les introns 1, 2, 3, 4 et 5, ainsi que quatre substitutions dans les exons 3

(C1270T, T1280G, T1316C) et 5 (C2234T). Ces quatre mutations sont toutes silencieuses à

l’exception de la mutation C1270T, où une valine remplace l’alanine 118, ce qui induit une

modification de la protéine au niveau du deuxième domaine transmembranaire. Au regard de

l’indice de consommation et du poids corporel, cette mutation semble être bénéfique.

Néanmoins, la faible proportion de cet allèle (environ 10 %) laisse penser que les individus

porteurs ont une viabilité moindre (Sharma et al., 2008). Des études conduites chez le

manchot royal indiquent que l’activité d’avUCP présente la même sensibilité que l’UCP3 de

mammifères à l’ion superoxyde et au GDP (Talbot et al., 2004b). Cette sensibilité à l’ion

superoxyde et au GDP n’est pas confirmée par Criscuolo et al. (Criscuolo et al., 2005) qui ont

cloné le gène avUCP dans la levure. Ces derniers ont montré également que l’acide rétinoïque

peut également stimuler l’activité découplante d’avUCP.

36

H+ H+

H+H+

CR

ATPsynthase


Matrice

A

H+ H+

H+H+

CR

ATPsynthase


Matrice

H+

H+

UCP1 chaleur

B

Figure 9 : La thermogenèse par UCP1 dans le tissu adipeux brun

Le tissu adipeux brun (TAB) est un organe qui permet la thermogenèse sans frisson.

(A). En absence d’UCP1, l’ATP synthase permet un retour limité des protons dans la matrice,

ce qui ralentit la chaîne respiratoire.

(B). En présence d’UCP1 active, une grosse quantité de protons peut retourner dans la

matrice, ce qui augmente l’activité de la chaîne respiratoire er produit plus de chaleur

(Nicholls, 1974).

CR : chaîne respiratoire ; H+

: proton ; UCP1 : protéine découplante 1.

37

4. Fonctions et mécanismes d’action des protéines découplantes

4.1. UCP1 et la thermogenèse

UCP1, ayant été la première protéine découplante mise en évidence, est la plus

étudiée. Aujourd’hui, il ne fait aucun doute que cette protéine est responsable de la

thermogenèse sans frisson dans le TAB. Nicholls (Nicholls, 1974) a montré qu’une protéine

sensible aux acides gras et au GDP est capable de moduler le découplage des mitochondries

de ce tissu. Cette protéine fut ensuite caractérisée et nommée thermogénine puis UCP1

(voir chapitre 3.1.1.). L’UCP1, activée par les acides gras libérés des stocks intracellulaires de

triglycérides suite à une stimulation -adrénergique, découple entièrement les oxydations de

la chaîne respiratoire et les phosphorylations de l’ATP synthase. Le gradient de protons est

ainsi entièrement dissipé par UCP1, accélérant ainsi la chaîne respiratoire qui va alors

produire plus de chaleur (Figure 9). Le rôle d’UCP1 dans la thermogenèse a été confirmé sur

des souris KO pour le gène Ucp1 (Enerback et al., 1997). Ces dernières sont alors plus

sensibles au froid et consomment moins d’O2 après une stimulation -adrénergique.

L’activité de la protéine peut être modulée par différentes molécules. Ainsi, les acides

gras activent le découplage alors que les purines phosphates (ADP, ATP, GDP, GTP)

l’inhibent (Sluse et al., 2006). Il a également été montré que des cofacteurs sont

indispensables à son activation comme le coenzyme Q (Echtay et al., 2000a). L’anion

superoxyde (Echtay et al., 2002), le 4-hydroxy-2-nonénal (HNE), produit de la peroxydation

lipidique (Echtay et al., 2005) ou encore les rétinoïdes (Rial et al., 1999; Tomas et al., 2004)

augmentent l’activité de la protéine.

Il a longtemps été suggéré que le découplage induit par UCP1 dans le TAB

s’effectuait par un canal protonique (Klingenberg & Huang, 1999). Le transport des protons

ne nécessiterait pas d’activité ATPasique de la part de la protéine. L’UCP1 ne ferait pas non

plus intervenir un substrat cotransporté ou échangé, mais utiliserait uniquement le gradient de

protons ou le potentiel de membrane pour faire passer des protons depuis l’espace

intermembranaire vers la matrice mitochondriale. Le transport des H+ se ferait grâce à la

présence de résidus donneurs/receveurs tel que le glutamate ou l’aspartate le long des

segments transmembranaires. Une seconde hypothèse est que l’UCP1, membre d’une famille

de transporteur d’anions, pourrait être un transporteur des acides gras anioniques (Jezek et al.,

37

1994). Ainsi, les acides gras protonés présents dans l’espace intermembranaire traverseraient

la bicouche lipidique de la membrane interne de la mitochondrie. Une fois dans la matrice qui

est très alcaline, ces acides gras libéreraient leur proton et retourneraient dans l’espace

intermembranaire sous forme anionique en passant par l’UCP1. Gonzalez-Barroso et al.

(Gonzalez-Barroso et al., 1998) mettent en doute cette fonction de transporteur d’acides gras.

Ils proposent que les acides gras, à des concentrations de l’ordre du nanomolaire, activent un

découplage proton-dépendant par UCP1. En cas de plus forte concentration d’acides gras, de

l’ordre du micromolaire, le découplage serait alors causé par un transport de substrat à la

travers la membrane, dont les acides gras, non spécifique d’UCP1. Une dernière hypothèse

quant au fonctionnement d’UCP1 repose sur une étude de mutagenèse dirigée (Echtay et al.,

2000b). La mutation du glutamate 167 diminue le transfert d’ion Cl-, révélant une possible

action d’UCP1 dans le transport d’ion chlorure.

4.2. Fonctions des protéines homologues d’UCP1 chez les mammifères

4.2.1. La thermogenèse et la régulation de la dépense énergétique

Comme nous venons de le voir, chez les mammifères, UCP1 est responsable de la

thermogenèse dans le TAB. Bien que ce tissu semble absent chez les individus adultes, la

présence d’adipocytes capables d’exprimer UCP1 ont été retrouvés chez l’homme dans le cou

(Cypess et al., 2009; Virtanen et al., 2009; Zingaretti et al., 2009). Néanmoins, leur faible

quantité ne permet pas de réaliser suffisamment de thermogenèse. Le muscle squelettique peut

également contribuer à la thermogenèse sans frisson mais ce mécanisme n’est pas très bien

identifié (Cannon & Nedergaard, 2004). A cause de leur homologie avec UCP1 et de leur

expression dans de nombreux tissus, il a été suggéré que les UCP2 et 3 pouvaient être

impliquées dans ce mécanisme de thermogenèse. Ces protéines sont mille fois moins

exprimées dans le muscle que l’UCP1 dans le TAB et donc le découplage induit par UCP2 et

3 devrait être beaucoup plus faible que celui d’UCP1. Cependant, de par l’importance de la

masse musculaire dans l’organisme (environ 40 %) et sa grande participation dans les

dépenses énergétiques, ces protéines pourraient induire un découplage suffisant pour

contribuer à une thermogenèse et un contrôle des dépenses énergétiques. Néanmoins, de

nombreuses études ne confirment pas cette hypothèse. Ainsi, des souris KO mutées pour le

gène Ucp3 ne présentent pas de réponse différente à la stimulation par la triiodothyronine (T3)

38

39

ou par un agoniste sélectif du système 3-adrénergique connu pour augmenter la

thermogenèse (Gong et al., 2000), alors que des souris KO pour Ucp1 ont une thermogenèse

fortement diminuée dans les même conditions. Des souris KO pour les gènes Ucp2 et Ucp3

présentent la même réponse à l’exposition au froid que des souris sauvages et ne sont pas

obèses (Gong et al., 2000; Vidal-Puig et al., 2000). Ces résultats contredisent donc

l’hypothèse d’une implication forte des UCP2 et UCP3 dans la thermogenèse. Néanmoins, en

cas d’activation intense du système adrénergique par la 3,4-méthylène-dioxy-

méthylamphétamine (ecstasy), les souris KO pour Ucp3 ne présentent pas d’augmentation de

leur température aussi forte que les souris « sauvages » (Mills et al., 2003). Ceci laisse penser

que la protéine UCP3 peut réguler la thermogenèse en cas de stimulation non physiologique

du muscle.

Concernant le contrôle de la dépense énergétique, Bouchard et al. (Bouchard et al.,

1997) ont montré chez l’homme qu’il existe une relation entre le métabolisme basal et le locus

UCP2-UCP3. Chez les indiens Pima, le métabolisme basal présente une corrélation positive

avec l’expression d’UCP2 (Walder et al., 1998) ou d’UCP3 (Schrauwen et al., 1999).

Cependant, les souris n’exprimant pas UCP3 ont le même métabolisme basal que les souris

sauvages (Gong et al., 2000). Ces résultats ne sont pas confirmés non plus par Boivin et al.

(Boivin et al., 2000) qui ne mettent pas en évidence de corrélation entre la variabilité des

dépenses énergétiques et la variabilité d’expression des UCP2 et 3 chez l’homme. De même,

le jeûne ou l’activité physique, qui nécessitent une utilisation de l’énergie plus efficace et

donc une diminution du découplage, augmentent l’expression des ARNm d’UCP2 et UCP3

(Millet et al., 1997; Boss et al., 1998a; Cortright et al., 1999). Récemment, un modèle de

régulation par UCP3 de la production d’ATP, dépendant de la demande en énergie, a été

proposé (Jarmuszkiewicz et al., 2004; Sluse et al., 2006). En cas de besoin réduit en ATP, le

coenzyme Q, présent en plus forte proportion sous forme réduite, serait capable de lever

l’inhibition des nucléotides phosphates, favorisant ainsi le découplage par UCP3. Dès que le

besoin en ATP augmente, le coenzyme Q, présent en plus grand nombre sous forme oxydée,

ne pourrait plus lever cette inhibition, limitant ainsi l’activité d’UCP3 et permettant au

gradient de protons d’être utilisé en plus forte proportion par l’ATP synthase pour répondre à

ce besoin en énergie.

En résumé, à l’inverse d’UCP1, les protéines UCP2 et UCP3 ne semblent pas ou peu

impliquées dans la thermogenèse ou le contrôle de la dépense énergétique. Cependant, les

résultats diffèrent selon les modèles d’études et mettent en question la pertinence des modèles

KO ou surexprimant des protéines découplantes. Ainsi, des modèles surexprimant jusqu’à

AG_

ATP

synthase

AG-CoA

AG AG

Cycle

de

Krebs -oxydationAG-CoA

AG_

MTE1

CoA-SH

H+

H+

H+

H+

ACSL

CPT1

CRUCP3

mitochondrie

Figure 10 : Hypothèse du transport des acides gras par UCP3

Les acides gras à chaîne courte peuvent entrer par simple diffusion à travers la membrane. Les

acides gras à chaîne longue doivent être activés par une acyl-CoA synthase pour être pris en

charge par la CPT1 qui va les faire rentrer dans la mitochondrie, où ils subiront la -oxydation

pour alimenter le cycle de Krebs. En présence de forte quantité d’acides gras, la mitochondrie

peut être saturée. Ceci se traduit par une très forte quantité d’acyl-CoA dans la mitochondrie

au point de diminuer la quantité de coenzyme A disponible pour la -oxydation ou le cycle de

Krebs. Une thioestérase mitochondriale (MTE1) intervient alors pour cliver les acyl-CoA et

rendre ainsi des coenzymes A disponibles pour la mitochondrie. Les acides gras sous forme

anionique pourraient être alors expulsés de la matrice par UCP3. Une fois dans l’espace

intermembranaire, ils absorberaient un proton, diminuant le gradient, pour retourner à une

forme neutre et pouvoir à nouveau entrer dans la matrice où ils relâcheraient ce proton

(Moore et al., 2004)

AG : acide gras ; AG- : acide gras sous forme anionique ; AG-CoA : acide gras activé par un

CoA ; ACSL : acyl-CoA synthase long chain ; CoA-SH : coenzyme A ; CPT1 : carnitine

palmitoyltransférase 1 ; CR : chaîne respiratoire ; H+

: proton ; MTE1 : mitochondrial

thioesterase 1 ; UCP3 : protéine découplante 3.

40

60 fois au niveau de l’ARNm ou 20 fois au niveau de la protéine découplante n’ont rien de

modèles physiologiques où les variations de protéines sont bien moins importantes (Bezaire et

al., 2005). Par ailleurs, Cadenas et al. (Cadenas et al., 2002) et Couplan et al. (Couplan et al.,

2002) discutent des limites de leurs modèles de souris surexprimant respectivement UCP3 et

UCP2 où le découplage induit n’est pas proportionnel à la surexpression et n’est pas sensible

aux activateurs traditionnels des protéines découplantes.

4.2.2. Régulation du métabolisme des acides gras

Une autre hypothèse propose l’implication d’UCP3 dans la régulation du métabolisme

des acides gras. En cas de forte quantité d’acides gras disponibles (régime riche en lipides,

jeûne, effort intense), ou encore dans les muscles glycolytiques, la capacité oxydative de la

mitochondrie peut être saturée. Cette saturation se traduit par une très forte quantité

d’acyl-CoA dans la mitochondrie au point de diminuer la quantité de coenzyme A disponible

pour la -oxydation ou le cycle de Krebs. Une thioestérase mitochondriale intervient alors

pour cliver les acyl-CoA et rendre ainsi des coenzymes A disponibles pour la mitochondrie

(Moore et al., 2001). L’absence d’acyl-CoA synthase dans la matrice mitochondriale ne

permet pas à ces acides gras anioniques d’être de nouveau activés pour la -oxydation. UCP3

permettrait alors d’exporter les acides gras anioniques hors de la mitochondrie pour qu’ils

puissent à nouveau être activés et être disponibles pour le métabolisme (Esteves & Brand,

2005) (Figure 10). De plus, une forte accumulation d’acides gras dans la matrice peut avoir un

effet toxique. Ces derniers sont alors en contact avec de nombreux ions superoxydes

entrainant leur peroxydation. En exportant ces acides gras hors de la mitochondrie, l’UCP3

protègerait la cellule des acides gras peroxydés (Bezaire et al., 2007). En 2003, Goglia et

Skulachev (Goglia & Skulachev, 2003) ont émis l’hypothèse que les UCP 2 à 5 transportent

des peroxydes d’acides gras issus de la peroxydation des phospholipides de la membrane

interne mitochondriale. Schrauwen et Hesselink (Schrauwen & Hesselink, 2004) ont

également proposé qu’une trop grande quantité d’acides gras dans la cellule augmenterait le

mécanisme de flip-flop des acides gras. Ceux-ci, alors dans la mitochondrie et non activés,

seraient évacués par UCP3. Ce mécanisme expliquerait la diminution du gradient de protons.

De nombreuses études confortent l’hypothèse d’une relation entre les acides gras et UCP3.

Ainsi, l’expression du messager d’UCP3 est plus élevée en cas de régime riche en lipides

(Matsuda et al., 1997; Schrauwen et al., 2001). De plus, la surexpression d’Ucp3 chez la

40

H+

H+


Matrice

O2°

_O2

°_

O2°

_

H+

H+

péroxydation

HNEUCPCR

ATPsynthase

H+ fort

+

_

+

B


Matrice

H+

H+

UCPCR

ATPsynthase

Substrats péroxydés

Dismutation

A

Figure 11 : Hypothèses de limitation de la production de ROS par les UCP

(A). Les protéines découplantes pourraient être chargées du transport de substrats peroxydés

pour les expulser vers l’espace intermembranaire où ils peuvent être neutralisés par

dismutation. Cette réaction, consommant des protons, diminuerait le gradient de protons

(Echtay et al., 2002).

(B). La chaîne respiratoire peut être ralentie par un fort gradient de protons. Elle laisse alors

s’échapper des électrons vers la matrice où ils forment un radical superoxyde avec les

molécules d’O2. Ces radicaux libres vont agir sur les phospholipides membranaires formant,

entre autre, du HNE. Le HNE active l’UCP ce qui diminue le gradient de protons et permet à

la chaîne respiratoire de réaccélérer produisant ainsi moins de radicaux libres (Brand et al.,

2004).

CR : chaîne respiratoire ; H+ : proton ; HNE : 4-Hydroxy-2-Nonenal ; O2

°- : radical

superoxyde ; UCP : protéine découplante.

41

souris augmente l’oxydation des acides gras et diminue les stocks intramusculaires de

triglycérides (Wang et al., 2003a; Bezaire et al., 2005). Chez l’homme, une mutation du gène

Ucp3 augmente le quotient respiratoire qui est un indicateur du taux d’oxydation des acides

gras (Argyropoulos et al., 1998).

4.2.3. Régulation de la production de radicaux libres

Bien que les radicaux libres ou espèces réactives de l’oxygène (Reactive Oxygen

Species, ROS) puissent avoir un rôle signal quand ils sont présent en petite quantité, ils

présentent un risque toxique pour la cellule s’ils s’y accumulent. Les mitochondries sont de

grandes productrices de ROS au cours de la respiration. Il existe trois sites potentiels de

production de ROS dans la chaîne respiratoire : le complexe I, le coenzyme Q et le complexe

III. Quand le gradient de protons est très élevé, la chaîne respiratoire, alors ralentie, laisse des

électrons s’échapper de la chaîne de transfert d’électrons vers la matrice mitochondriale. Ces

électrons peuvent alors réagir avec les molécules d’oxygène formant ainsi un radical

superoxyde. Cependant, une légère diminution du gradient de protons (de l’ordre de 10 %)

peut diminuer fortement (de 50 à 70 %) la production de ROS (Starkov, 2006). Ce découplage

léger pourrait être la défense majeure de la mitochondrie face à la production de ROS

endogènes. Cette fonction de découplage léger pourrait être imputée aux UCP2 et 3 et

constituer leur principal rôle physiologique (Figure 11).

Une autre explication de l’implication des UCP2 et UCP3 dans la limitation de

production des radicaux libres viendrait de leur mécanisme d’action. Echtay et al. (Echtay et

al., 2002) proposent que ces protéines soient des transporteurs d’ions superoxydes. Ces

derniers, produits dans la matrice mitochondriale, seraient pris en charge par les UCP qui les

transporteraient vers l’espace intermembranaire. Là, ils y subiraient plus facilement la

dismutation grâce à un pH plus acide, à la présence du cytochrome c, du coenzyme Q ou

d’autres molécules participant à la défense contre les radicaux libres. Cette dismutation,

absorbant des protons, serait ainsi en partie responsable de la diminution de gradient de

protons et donc du découplage.

Ces hypothèses d’un rôle dans la limitation de la génération de radicaux libres sont

étayées par de nombreuses études. L’inhibition des UCP 2 ou 3 par le GDP dans la

mitochondrie augmente le potentiel de membrane et la production de ROS (Negre-Salvayre et

al., 1997; Talbot et al., 2004a). Il a clairement été montré que le HNE (4-Hydroxy-2-

41

H+

ADP ATP

cycle

de

Krebsmitochondrie

CRUCP2ATPsynthase

ATP

Pyruvate

Glucose

GL

UT

2

Glucose

_

Ca2+

Ca2+

Canal KATP Canal Ca2+

voltage-dépendant

granules

d’insuline

sécrétion d’insuline

+

+dépolarisation

_

Figure 12 : Limitation de la sécrétion d’insuline par UCP2

Une forte quantité de glucose entraine une forte production d’ATP, ce qui inhibe les canaux

potassiques sensibles à l’ATP. Cette inhibition entraine une dépolarisation de la membrane

cellulaire et ouvre les canaux calciques. La décharge calcique déclenche alors la sécrétion

d’insuline. UCP2 en diminuant le gradient de protons et la production d’ATP, diminue donc

la sécrétion d’insuline (Green et al., 2004).

ADP : adénosine diphosphate ; ATP : adénosine triphosphate ; Ca2+

: ion calcium ;

CR : chaîne respiratoire ; GLUT2 : glucose transporteur 2 ; H+ : proton ; KATP : canal

potassique sensible à l’ATP ; UCP2 : protéine découplante 2.

42

Nonenal), issu de la peroxydation des phospholipides membranaires, diminue la production

de ROS (Echtay et al., 2003). Cette diminution de production de ROS est sensible au GDP,

excepté chez les souris KO pour UCP3. Un modèle de régulation d’UCP a été proposé par

Brand et al. (Brand et al., 2004) : le HNE, présent dans la mitochondrie suite à une trop

grosse production de ROS, active UCP2 et/ou UCP3 qui à leur tour limiteraient la production

de ROS.

4.2.4. Sécrétion de l’insuline

Il existe une relation entre la sécrétion d’insuline par les cellules du pancréas et la

protéine découplante UCP2. La régulation de la sécrétion de l’insuline repose sur une

augmentation du ratio ATP/ADP dans les cellules du pancréas. Une forte glycémie

augmente la quantité de glucose dans le cytoplasme des cellules. Ce glucose subit la glycolyse

et alimente la mitochondrie en énergie. Celle-ci voit alors l’activité de sa chaîne respiratoire

augmentée, ce qui élève le gradient de protons qui est utilisé pour générer plus d’ATP. Le

ratio ATP/ADP va donc augmenter et ainsi fermer les canaux potassiques sensibles à l’ATP

provoquant une dépolarisation de la membrane plasmique. Cette dépolarisation entraine une

hausse du calcium cytoplasmique, déclenchant la sécrétion d’insuline. Krauss et al. (Krauss et

al., 2002) proposent que l’UCP2 puisse être activée par la hausse de production de radicaux

libres résultant de l’augmentation du métabolisme de la chaîne mitochondriale en cas de forte

glycémie. L’UCP2 interviendrait ainsi en diminuant le gradient de protons et donc la synthèse

d’ATP, ce qui aboutit à une baisse de la sécrétion de l’insuline (Green et al., 2004)

(Figure 12). UCP2 agirait donc en tant que régulateur négatif de la sécrétion de l’insuline.

Ce modèle s’appuie sur des études de surexpression du gène Ucp2 chez le rat qui montrent

une diminution de la sécrétion d’insuline induite par le glucose (Chan et al., 1999; Chan et al.,

2001).

4.2.5. Transport d’ions ou de substrats énergétiques chargées

La mitochondrie fait partie avec le réticulum endoplasmique des organites capables de

stocker des ions Ca2+

. Le captage et le relargage de ces ions servent dans différentes voies de

signalisation. Trenker et al. (Trenker et al., 2007) suggèrent que les protéines UCP2 et UCP3

42

H+

H+

ATP

synthase

Cycle

de

Krebs

H+

H+

CR

Pyruvate

Pyruvate

Glucose

Lactate

Mitochondrie

UCP3

Transporteur

du pyruvate

Figure 13 : Hypothèse du transport du pyruvate par UCP3

UCP3 permettrait d’expulser du pyruvate en dehors de la mitochondrie où il pourra suivre la

voie du lactate ou être à nouveau transporté dans la matrice mitochondriale par son

transporteur qui cotransporte des protons et en diminue donc le gradient (Criscuolo et al.,

2006).


: proton ; UCP3 : protéine découplante 3.

43

sont indispensables au captage des ions Ca2+

par la mitochondrie. Ces protéines découplantes

pourraient alors faire partie du mitochondrial Ca2+

uniporter (MCU) (Graier et al., 2007).

Les protéines découplantes pourrait également transporter d’autres molécules chargées

comme le pyruvate (UCP3) ou la glutamine (UCP2) (Criscuolo et al., 2006). Le pyruvate

synthétisé dans le cytoplasme lors de la glycolyse entrerait dans la mitochondrie via le

cotransporteur pyruvate/H+. Le pyruvate pourrait alors être utilisé dans le cycle de Krebs ou

être à nouveau transporté vers le cytoplasme par l’UCP3 pour être métabolisé en lactate

(Figure 13). Pour combler la perte de pyruvate engendrée par l’UCP3, le cotransporteur

pyruvate/H+ serait plus actif et ferait ainsi rentrer plus de protons dans la matrice. L’UCP2

pourrait, quant à elle, inhiber le transport du pyruvate en diminuant le gradient de protons et

ainsi diminuer l’efficacité du cotransporteur pyruvate/H+. Cette inhibition favoriserait

l’utilisation de la glutamine dans le cycle de Krebs (Mozo et al., 2006; Bouillaud, 2009)

(Figure 14). Chez la souris KO pour le gène Ucp2, les macrophages incubés en présence de

glutamine présentent un métabolisme de la glutamine plus faible (Nubel et al., 2008).

Cependant, ce rôle dans le métabolisme de la glutamine serait indépendant de l’activité

découplante d’UCP2. Le rôle d’UCP2 serait contrôler l’alimentation du cycle de Krebs en

limitant l’apport du pyruvate, produit de la glycolyse, en faveur des acides gras et de la

glutamine (Pecqueur et al., 2008; Bouillaud, 2009).

5. Régulations de l’expression des protéines découplantes de mammifères

5.1. Présentation générale des systèmes impliqués dans la régulation des UCP

Plusieurs systèmes hormonaux, facteurs de transcription et kinases sont impliqués

dans la régulation de l’expression des UCP. Avant de détailler les mécanismes de régulation

d’UCP1 puis UCP2 et UCP3, nous présenterons les hormones thyroidiennes, le système

-adrénergique, les facteurs de transcription peroxisome proliferator-activated receptors

(PPAR) et l’AMP-activated protein kinase (AMPK).

5.1.1. Les hormones thyroïdiennes

43

H+

H+

ATP

synthase

Cycle

de

Krebs

H+

H+

CR

Pyruvate

Glucose

Mitochondrie

UCP2

Cycle

de

Krebs

Transporteur

du pyruvate

GlutamineAcides gras

_+

+

Figure 14 : Rôle potentiel d’UCP2 dans le métabolisme de la glutamine

UCP2, sensible à la glutamine, diminuerait l’efficacité du cotransporteur pyruvate/H+ en

atténuant le gradient de protons. Ceci entrainerait un changement de métabolisme du cycle de

Krebs qui utiliserait alors la glutamine et les acides gras pour fonctionner au lieu du pyruvate

(Bouillaud et al., 2009).


: protons ; UCP2 : protéine découplante 2.

44

Les hormones thyroïdiennes sont synthétisées par la glande thyroïde par iodation et

condensation de résidus tyrosine issus de la thyroglobuline (Silvestri et al., 2005). Les deux

principales hormones sont la thyroxine ou tétraiodothyronine (T4) et la triiodothyronine (T3).

Bien que la glande thyroïde soit capable de synthétiser la T4 et la T3, une grande majorité de

la T3 est produite par déiodination de la T4 au niveau des tissus périphériques, notamment par

la déiodinases D2 au niveau du muscle squelettique (Darras et al., 2006). Outre leur action à

court terme sur l’activité d’enzymes clés du métabolisme (Horst et al., 1989; Goglia et al.,

1994; Davis & Davis, 1996; Arnold et al., 1998; Moreno et al., 1998), ces hormones ont une

action à long terme sur l’expression de certaines protéines. La T3 est capable de se lier au

récepteur nucléaire aux hormones thyroïdiennes (TR) pour activer ce dernier. Celui-ci, une

fois couplé à un RXR, va se positionner sur les éléments de réponse aux hormones

thyroïdiennes présents au niveau des promoteurs des gènes pour favoriser leur transcription

(Pillar & Seitz, 1997; Wrutniak-Cabello et al., 2001). Il existe une forte relation entre les

hormones thyroïdiennes et les protéines découplantes. Ainsi, la T3 est impliquée directement

dans la régulation de l’expression de l’UCP1 de mammifères ou indirectement dans

l’expression des protéines UCP2 et UCP3.

5.1.2. Le système -adrénergique

Le système -adrénergique fait parti du système nerveux sympathique. Les récepteurs

adrénergiques ou adrénorécepteurs appartiennent à la famille des récepteurs couplés à une

protéine G (RCPG). Il existe trois récepteurs -adrénergiques ( 1, 2 et 3), tous trois couplés

à une protéine G stimulatrice (Gs). Ces récepteurs ont des sensibilités différentes aux

catécholamines. Ainsi, les récepteurs 1 et 2 sont plus sensibles à l’adrénaline qu’à la

noradrénaline alors que le 3 présente une sensibilité inverse. Après fixation du ligant sur le

récepteur, celui-ci active la protéine G qui à son tour va activer l’adénylate cyclase. Cette

enzyme va convertir l’AMP en AMP cyclique (AMPc), activant la protéine kianse sensible à

l’AMPc (PKA). Cette dernière phosphoryle alors le facteur de transcription cAMP response

element binding protein (CREB) pour l’activer et agir au niveau des promoteurs des gènes.

5.1.3. Les Peroxysome Proliferator Activated Receptors

44

A

ATP ADPAMPAMPK

anabolisme

catabolisme

_

_ +

+

B

45

sous-unité

sous-unité !

sous-unité "

Site

catalytique

T172LKB1 AMP

Figure 15 : Rôle et activation de l’AMPK

(A). L’AMPK est sensible au ratio AMP/ATP. Plus ce ratio augmente, plus la kinase s’active

pour agir sur les gènes et protéines du métabolisme.

(B). L’activation de l4AMPK passe par la fixation d’un AMP sur la sous-unité !. Ceci

provoque un changement de conformation de la sous-unité " et permet sa phosphorylation au

niveau de la thréonine 172 par LKB1 et active la kinase (Cheung et al., 2000).

AMP : adénosine monophosphate ; AMPK : AMP-activated protein kinase ; ADP : adénosine

diphosphate ; ATP : adénosine triphosphate; LKB1 : liver tumor suppressor kinase ;

T172 : thréonine 172 de la sous-unité .

Les PPAR sont à la fois des récepteurs nucléaires et des facteurs de transcription. Ils

forment des hétérodimères avec les récepteurs RXR pour pouvoir se lier aux éléments de

réponse au PPAR (PPRE) présents dans les séquences promotrices des gènes (Ordentlich et

al., 2001; Jepsen & Rosenfeld, 2002; Privalsky, 2004). En absence d’agoniste, les

hétérodimères PPAR-RXR sont capables de recruter des corépresseurs. Leur activation,

notamment par les acides gras, modifie leur conformation libérant ainsi leur corépresseur et

recrutent à la place un coactivateur, notamment PPAR! coactivator-1" (PGC-1") (Desvergne

& Wahli, 1999), pour leur permettre de se lier au PPRE. Il existe trois isoformes du facteur de

transcription PPAR. Le PPAR" a été cloné pour la première fois chez la souris (Berger &

Moller, 2002). Il est principalement exprimé dans les tissus à fort pouvoir oxydatif (foie,

cœur, muscle squelettique) et a pour principaux ligants les acides gras insaturés (Desvergne &

Wahli, 1999). Les souris KO pour PPAR" présentent une -oxydation plus faible (Hashimoto

et al., 2000) et une altération dans l’expression des gènes du métabolisme lipidique (Aoyama

et al., 1998). Le PPAR /# a été mis en évidence chez les rongeurs sous le nom de PPAR

mais s’est révélé être la même protéine que le PPAR# mis à jour chez l’homme (Barak et al.,

2002; Muoio et al., 2002a; Muoio et al., 2002b). PPAR /# servirait de régulateur général de

l’oxydation lipidique (Wang et al., 2003b). Le PPAR! est fortement lié aux adipocytes. Son

activation dans les préadipocytes induit leur différenciation en adipocytes (Hallakou et al.,

1997). Il est activé par les acides gras polyinsaturés (Calder, 2005). Le PPAR! joue également

un rôle dans le muscle squelettique. Les souris KO pour PPAR! présentent une insulino-

résistance (Hevener et al., 2003). Le coactivateur des PPAR, PGC-1", a été cloné par

Puigserver et al. (Puigserver et al., 1998). Il est fortement exprimé dans le muscle

squelettique et le TAB des souris exposées au froid. Sa surexpression dans des myoblastes en

culture est suffisante pour augmenter la biogénèse mitochondriale (Wu et al., 1999). De plus,

ce coactivateur est fortement lié à l’expression de gènes impliqués dans les voies d’oxydation

mitochondriales des acides gras (Vega et al., 2000).

5.1.4. L’AMP-activated Protein Kinase

L’AMPK est une enzyme hétérotrimérique composée d’une sous-unité catalytique ",

possédant l’activité kinase, et de deux sous-unités régulatrices et !. Ces sous-unités sont

présentes sous plusieurs isoformes ("1, "2, 1, 2, !1, !2 et !3) codées par sept gènes

différents. Ces différentes isoformes permettent ainsi la formation de 12 complexes possibles

45

PGC-1

P

promoteur du gène Ucp1

!

p38 MAPK

PKA

AMPc

PGC1

PP

AR

T4

D2

T3

CREB TR

+

+

Figure 16 : Régulation de l’expression d’UCP1 dans le tissu adipeux brun

Au niveau du tissu adipeux brun, le froid provoque une activation du système -adrénergique

par les catécholamines. Cette activation entraîne une cascade empruntant la voie PKA qui

aboutit au facteur de transcription CREB. La PKA fait également intervenir la p38 MAPK qui

favorise l’expression et l’activation du cofacteur de transcription PGC-1". Ce cofacteur se

fixe, après dimérisation avec un PPAR, sur l’élément de réponse au PPAR au niveau du

promoteur d’UCP1. Une seconde voie de signalisation parallèle est activée suite à

l’augmentation de l’activité de la déiodinase D2 qui convertit la T4 en T3. La T3 se fixe

ensuite sur son récepteur nucléaire. L’ensemble de ces signaux augmente l’expression du gène

Ucp1 (Silva et Rabelo, 1997 ; Cao et al., 2001).

AMPc : adénosine monophosphate cyclique ; CREB : cAMP response elements binding

protein ; D2 : déiodinase D2 ; p38 MAPK : p38 mitogen-activated protein kinase ; PGC-1 :

PPAR! coactivator 1 ; PKA : protéine kinase sensible à l’AMPc ; PPAR : peroxisome

proliferator-activated receptor ; T3 : triiodothyronine ; TR : récepteur aux hormones

thyroïdiennes ; T4 : thyroxine ; UCP1 : protéine découplante 1.

46

(" !). La prépondérance de chacun de ces complexes dépend du tissu (Cheung et al., 2000).

En présence d’un faible ratio AMP/ATP, les sous-unités " et ! n’interagissent pas et le

complexe AMPK est inactif (Figure 15). L’AMPK est activée allostériquement par fixation

d’un AMP sur la sous-unité !, entrainant la phosphorylation de la thréonine 172 de la sous-

unité " par la kinase LKB1 (liver tumor suppressor kinase) (Hawley et al., 1996; Cheung et

al., 2000). Une fois activée, l’AMPK augmente les stocks d’énergie cellulaire, notamment en

modifiant le métabolisme des acides gras en phosphorylant l’Acétyl-CoA Carboxylase 1

(ACC1). La phosphorylation d’ACC1, inhibant cette enzyme, empêche la conversion de

l’acétyl-CoA en malonyl-CoA (Blazquez et al., 1999). Le malonyl-CoA inhibe le transporteur

mitochondrial des acides gras à chaîne longue, CTP1, favorisant ainsi l’orientation des acides

gras vers la voie d'estérification. La diminution du malonyl-CoA présent dans la cellule

augmente la quantité d’acide gras disponible pour la -oxydation. De plus, l’AMPK est

capable de réguler l’expression des facteurs de transcription PGC-1" (Terada et al., 2002),

PPAR! (Habinowski & Witters, 2001) et PPAR" (Bronner et al., 2004), et d’activer PGC-1"

et CREB par phosphorylation (Jager et al., 2007; Thomson & Winder, 2009). Ces actions lui

permettent de jouer directement sur l’expression de différents gènes, notamment ceux du

métabolisme mitochondrial. Un lien potentiel a été mis à jour entre l’activation de l’AMPK et

l’UCP3 de mammifère (Stoppani et al., 2002; Putman et al., 2003).

5.2. Régulation de l’expression d’UCP1

La régulation de la protéine découplante UCP1 dans le TAB est relativement bien

connue chez les mammifères mais reste néanmoins complexe. Dans ce tissu, la thermogenèse

induite par le découplage au niveau des mitochondries suite à une exposition au froid, est sous

le contrôle du système nerveux sympathique via son neurotransmetteur, la noradrénaline. La

stimulation adrénergique par cette catécholamine induit non seulement une augmentation de

l’activité de la protéine UCP1, mais également une hausse de la quantité de protéine présente

dans la mitochondrie par augmentation de l’expression du gène Ucp1 (Figure 16). Après

activation du récepteur adrénergique par la noradrénaline, le signal intracellulaire suit une

voie classique de récepteur couplé à une protéine G (Silva & Rabelo, 1997). Le récepteur

active donc l’adénylate cyclase via la protéine G, augmentant ainsi la quantité d’AMP

cyclique (AMPc). La protéine kinase sensible à l’AMPc (PKA), à son tour activée, va

phosphoryler le facteur de transcription sensible à l’AMPc (cAMP response element binding

46

protein, CREB) et déclenche une cascade de kinases passant par la protéine JIP2

(JNK-interacting protein 2), la MAP kinase kinase 3 (MKK3) et aboutissant à la p38 Mitogen

Activated Kinase (MAPK) (Cao et al., 2001; Robidoux et al., 2005). Cette dernière va activer

les facteurs de transcription Activated Transcription Factor-2 (ATF-2) et PPAR! coactivator

1" (PGC-1"), l’expression de PGC-1" étant également augmentée par ATF-2. Les trois

facteurs de transcription vont alors activer la transcription du gène Ucp1 en se fixant sur son

promoteur au niveau des éléments de réponse CRE4 pour CREB, CRE2 pour ATF-2 et PPRE

pour le facteur de transcription PGC-1" en combinaison avec les facteurs de transcription

Peroxysome Proliferator Activated Receptors ! et " (PPAR) et Retinoid X Receptor (RXR)

(Cao et al., 2004; Villarroya et al., 2007). Parallèlement à cette voie de signalisation AMPc

dépendante, il existe une deuxième voie de signalisation faisant intervenir les hormones

thyroïdiennes (Silva & Rabelo, 1997). Les catécholamines augmentent, au niveau du TAB,

l’activité de la déiodinase D2 qui convertit la thyroxine (T4) en tri-iodothyronine (T3). Cette

dernière va alors activer les récepteurs nucléaires aux hormones thyroïdiennes (TR) pour se

fixer sur une zone du promoteur du gène Ucp1 (-2,317/-2,399 kb chez le rat) correspondant à

une séquence de réponses aux hormones thyroïdiennes (thyroid hormone response sequence,

THRS). Cette THRS contient deux éléments de réponse upTRE et dnTRE. La fixation sur ces

TRE d’un hétérodimère TR-RXR stimule l’expression du gène alors qu’un homodimère TR-

TR a plutôt un effet inhibiteur (Rabelo et al., 1996b). L’acide rétinoïque semble également

avoir un effet stimulateur sur l’expression d’Ucp1 par l’intermédiaire d’un élément de réponse

à l’acide rétinoïque (retinoic acid response element, RARE). Cette stimulation s’effectue suite

à la fixation de facteurs de transcription sous forme d’hétérodimère RAR-RXR (Rabelo et al.,

1996a). Un dernier facteur de transcription semble avoir un effet sur l’expression d’Ucp1 :

CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP). La mobilisation de ce dernier facteur de

transcription viendrait en réponse à la stimulation par l’insuline-like growth factor-I (IGF-I)

(Guerra et al., 1994). D’autres hormones semblent également avoir une action sur

l’expression d’Ucp1. Ainsi l’insuline, la leptine et les œstrogènes augmentent l’expression du

messager mais seulement en présence du système sympathique (Geloen & Trayhurn, 1990;

Scarpace & Matheny, 1998; Pedersen et al., 2001). Les glucocorticoïdes inhibent la

stimulation de l’expression du messager d’UCP1 par les catécholamines (Soumano et al.,

2000).

5.3. Régulation de l’expression d’UCP2 et UCP3

47

Les mécanismes intracellulaires de régulation de l’expression d’UCP2 et UCP3 chez

les mammifères sont moins connus que pour UCP1. Bien qu’une stimulation -adrénergique

augmente la quantité d’ARNm codant UCP2 et UCP3 dans le muscle ou dans des myotubes

en culture, le contrôle direct de leur expression par une voie AMPc dépendante n’a pas été

mis en évidence (Nagase et al., 2001). De plus, l’activation pharmacologique de la PKA dans

des lignées cellulaires d’adipocytes augmente l’expression d’Ucp2 après 12 heures, mais cette

stimulation ne peut pas être reproduite par des agonistes 2 ou 3-adrénergiques (Yoshitomi et

al., 1999). La protéine p38 MAPK semble avoir des rôles différents selon le modèle, tissu ou

type cellulaire étudié. En effet, elle aurait un rôle stimulateur de l’expression d’Ucp2 dans les

cardiomyocytes suite à un traitement par la noradrénaline (Valouskova & Modriansky, 2008).

Cette régulation fait intervenir le facteur de transcription CREB. A l’inverse, dans les

mélanomes et dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse, la p38 MAPK jouerait un

rôle inhibiteur sur l’expression d’UCP2 (Emre et al., 2007; Selimovic et al., 2008). Outre

CREB, plusieurs facteurs de transcription réguleraient l’expression d’UCP2. Dans les

préadipocytes ou les myotubes, PPAR /# a un rôle prédominant dans l’expression d’Ucp2

(Aubert et al., 1997; Chevillotte et al., 2001) alors qu’au niveau des adipocytes, c’est PPAR!

qui joue ce rôle (Aubert et al., 1997; Kelly et al., 1998), et PPAR" dans le foie ou les cellules

du pancréas (Kelly et al., 1998; Villarroya et al., 2007). Medvedev et al. (Medvedev et al.,

2002) ont également montré que le facteur de transcription Sterol Regulatory Element

Binding Protein-1 (SREBP-1) a un rôle dans la stimulation de l’expression d’Ucp2 par les

acides gras. Enfin, au niveau des cellules du pancréas, le glucose a un effet stimulateur sur

Ucp2 alors que la leptine présente un effet inhibiteur (Brown et al., 2002). La régulation de

l’expression d’Ucp3 est sous l’influence des acides gras libres (Boss et al., 1998b; Brun et al.,

1999b; Schrauwen et al., 2002). Les PPAR jouent un rôle important dans cette régulation par

les acides gras. Ainsi dans le muscle, les PPAR" (Brun et al., 1999a) et PPAR /# (Nagase et

al., 1999; Son et al., 2001), sous forme d’hétérodimère avec un RXR, augmentent

l’expression du gène Ucp3 (Solanes et al., 2003). La régulation d’Ucp3 semble également être

sous l’influence des acides rétinoïques via un RAR et du facteur de transcription myogénique

MyoD (Solanes et al., 2000). Il a également été mis en évidence une action de la AMP-

activated protein kinase (AMPK) sur l’expression d’Ucp3 (Stoppani et al., 2002; Putman et

al., 2003). Il est à noter que le niveau de régulation d’UCP3 est dépendant du type de muscle

chez le rat. Ainsi, après l’exercice, les fibres IIb de muscles squelettiques voient leur

48

expression d’UCP3 augmenter plus fortement que pour les fibres de type IIa (Anderson et al.,

2007).

6. Fonctions potentielles et régulation de l’expression de la protéine

découplante aviaire

6.1. Fonctions potentielles de la protéine découplante aviaire

Chez les oiseaux, il n’existe qu’une seule protéine découplante, essentiellement

présente dans le muscle. Elle pourrait remplir une ou plusieurs des fonctions proposées chez

les mammifères.

Les oiseaux ne possèdent pas de TAB à l’inverse les mammifères. Cependant, il existe

une thermogenèse sans frisson au niveau des muscles squelettiques (Barre et al., 1989). Ce

mécanisme de thermogenèse pourrait être imputé à avUCP. En effet, l’expression de son

ARNm dans le muscle Gastrocnemius est fortement stimulée chez les canards acclimatés au

froid (quatre semaines à 4°C) (Raimbault et al., 2001). Chez le colibri, une hausse de

l’expression de HmUCP (Hummingbird UCP) est observée durant le réveil qui suit la phase

de torpeur de l’animal au cours de laquelle la température corporelle est plus faible (Vianna et

al., 2001). Chez le poulet, l’expression du messager d’avUCP dans le muscle Pectoralis

major est également stimulée après une dizaine de jours à 4°C (Toyomizu et al., 2002) ou

dans le muscle Gastrocnemius après sept jours à 20°C par rapport aux animaux à 27°C

(Collin et al., 2003a). Chez le manchot royal, l’expression d’avUCP est plus forte chez les

animaux après un premier plongeon dans une eau à 8°C (Talbot et al., 2004b). Cette

expression est encore plus forte chez les manchots sauvages qui sont couramment dans une

eau froide. A l’opposé, un conditionnement à des températures élevées diminue l’expression

de l’ARNm d’avUCP chez le poulet (Taouis et al., 2002; Mujahid et al., 2006). Cependant,

une récente étude montre qu’une exposition chronique à la chaleur augmente l’expression

d’avUCP (Dridi et al., 2008)

Comme pour les protéines UCP2 et UCP3 de mammifères, il existe un lien entre le

métabolisme des acides gras et la protéine découplante aviaire. Chez le poulet, l’expression de

l’ARNm d’avUCP dans le muscle mixte Gastrocnemius ou le muscle glycolytique Pectoralis

49

major est plus forte chez les animaux nourris avec un régime riche en lipides que chez les

animaux recevant un régime pauvre en lipide (Collin et al., 2003b; Collin et al., 2009)

(Mujahid et al., 2009). Dans le muscle Pectoralis major de poulet, l’expression du messager

d’avUCP est également plus forte chez des animaux de génotype “gras” sélectionnés sur leur

gras abdominal, que chez les animaux de génotype divergeant “maigre” (Collin et al., 2009).

Par ailleurs, la protéine découplante aviaire semble également être sensible au jeûne. Ainsi, un

jeûne court augmente l’expression d’avUCP chez le poulet (Evock-Clover et al., 2002). A

l’inverse, chez les manchots royaux, la quantité d’ARNm d’avUCP diminue suite à un jeûne

prolongé (Rey et al., 2008).

Comparativement aux mammifères, les oiseaux possèdent une intensité de

métabolisme élevée et une glycémie forte (2 g/L), deux critères favorables à une forte

production de radicaux libres. Cependant, proportionnellement au poids, les oiseaux ont une

durée de vie longue, ce qui implique une bonne protection contre la production de radicaux

libres (Mozo et al., 2005). Talbot et al. (Talbot et al., 2003; Talbot et al., 2004b) proposent

que cette protection puisse être en partie le résultat de l’activité de la protéine découplante

aviaire. Celle-ci est activée par l’ion superoxyde chez le jeune manchot. En clonant avUCP

dans la levure, Criscuolo et al. (Criscuolo et al., 2005) ont montré que cette protéine avait un

effet protecteur contre les radicaux libres et ceci indépendamment de la superoxyde dismutase

mitochondriale (Mn-SOD). En cas de stress thermique, la diminution de l’expression

d’avUCP s’accompagne d’une hausse de la production de radicaux libres chez le poulet

(Mujahid et al., 2006; Mujahid et al., 2007).

Abe et al. (Abe et al., 2006) ont également montré qu’au cours du jeûne chez le poulet,

l’augmentation de la protéine avUCP est associée à une diminution de la production de ROS.

Chez les canetons, avUCP semble être impliquée dans la préparation à la lutte contre le stress

oxydatif dû à l’éclosion (Rey et al., 2009)

6.2. Mécanismes de régulation de l’expression de la protéine découplante aviaire

Au niveau hormonal, plusieurs systèmes semblent agir sur avUCP. Ainsi, Raimbault et

al. (Raimbault et al., 2001) ont montré que le glucagon augmente l’expression d’avUCP chez

les canards. Le glucagon est une hormone hyperglycémiante synthétisée par les cellules "

situées sur la périphérie des îlots de Langerhans dans le pancréas. Cette hormone régule la

glycémie en coopération avec l’insuline. Chez les oiseaux, le glucagon est la principale

50

hormone lipolytique (Leclercq et al., 1988). Chez le manchot, l’administration chronique de

glucagon induit une thermogenèse sans frisson associée à un découplage mitochondrial et un

relargages d’acides gras libres (Barre et al., 1989; Duchamp et al., 1989). Filali-Zegzouti et

al. (Filali-Zegzouti et al., 2000) ont montré que l’injection de glucagon augmente fortement la

sécrétion d’adrénaline et de noradrénaline. L’effet du glucagon sur la thermogenèse pourrait

donc passer par une mobilisation plus importante des acides gras et par une action du système

-adrénergique via les catécholamines. En cas de jeûne, l’augmentation de l’expression

d’avUCP est également corrélée avec les niveaux sanguins d’insuline, d’IGF-I et II (insulin-

like growth factor) (Evock-Clover et al., 2002). Cependant, l’injection chronique d’insuline

n’a aucun effet sur avUCP (Collin et al., 2003c). De même, contrairement à ce qui est observé

pour UCP1, l’injection de leptine ne présente aucun effet sur l’expression de la protéine

découplante aviaire (Evock-Clover et al., 2002).

Chez le poulet, une supplémentation en hormone thyroïdienne T3 augmente

l’expression d’avUCP, alors que l’inhibiteur de la glande thyroïdienne methimazole l’inhibe

(Collin et al., 2003c). Ces résultats sont cohérents avec ceux trouvés chez les mammifères. En

effet, comme décrit dans le chapitre 5, la T3 est impliquée dans la régulation de l’expression

d’UCP1, et de manière indirecte dans celle d‘UCP2 et UCP3.

Bien qu’il ait été clairement montré que le système -adrénergique contrôle

directement l’expression d’UCP1 chez les mammifères (Silva & Rabelo, 1997), aucune action

sur l’expression d’avUCP n’a été mise en évidence. Cependant, il existe de nombreux liens

entre la stimulation du système -adrénergique et les rôles potentiels d’avUCP chez l’oiseau.

Il a été mis en évidence chez le poulet ou sur modèle cellulaire que l’isoprotérénol, un

agoniste 2-adrénergique, modifie le métabolisme des acides gras, notamment la lipolyse

(Rosebrough & Steele, 1990; Hamano et al., 1999). De plus, le système -adrénergique

intervient au niveau de la thermogenèse sans frisson chez le caneton (Marmonier et al., 1997)

ou dans la thermorégulation du pigeon (Ophir et al., 2004).

Les informations concernant une éventuelle intervention des PPAR chez les espèces

aviaires sont très parcellaires. Toutefois, chez le poulet, une exposition des embryons ou des

animaux adultes à une température moins élevée augmente à la fois l’expression de PGC-1"

et celle d’avUCP (Ueda et al., 2005; Walter & Seebacher, 2007). A l’inverse, après un jeûne

prolongé chez le manchot royal, les expressions d’avUCP et PGC-1" diminuent

(Rey et al., 2008).

Le dernier acteur qui pourrait être impliqué dans la régulation de l’expression

d’avUCP est l’AMPK sachant que l’expression de l’UCP3 de mammifères semble liée à

51

l’activation de l’AMPK (Stoppani et al., 2002; Putman et al., 2003). L’AMPK a été

caractérisée chez le poulet dans différents tissus dont le muscle squelettique (Proszkowiec-

Weglarz et al., 2006; Tosca et al., 2008). Dans ce tissu, les principales sous-unité exprimées

sont "2, 2, !2 ou !3 (Proszkowiec-Weglarz et al., 2006; Sibut et al., 2008).

7. Conclusions et objectifs de la thèse

Chez le poulet, plusieurs hypothèses peuvent donc être formulées pour tenter

d’expliquer les mécanismes de régulation de l’expression de la protéine découplante aviaire.

Comme nous avons pu le voir, le système -adrénergique est fortement impliqué dans la

régulation de la thermogenèse. Sachant que, chez les mammifères, le système -adrénergique

régule l’expression d’UCP1 dans le tissu adipeux brun, ce système hormonal est un candidat

sérieux dans la régulation de l’expression d’avUCP. De plus, ce modèle de régulation d’UCP1

fait également intervenir les hormones thyroïdiennes, qui sont également impliquées dans la

régulation de l’expression d’avUCP. Par ailleurs, la protéine découplante aviaire et de l’UCP3

de mammifères étant orthologues, et exprimées toutes les deux dans le muscle squelettique,

pourraient posséder les mêmes mécanismes de régulation. En effet, l’expression de ces deux

protéines est sensible aux acides gras. L’activation de l’AMPK étant capable d’augmenter

l’expression d’UCP3, cette kinase pourrait être également impliquée dans la régulation

d’avUCP chez l’oiseau. Enfin, les facteurs de transcription PPAR sont fortement associés à la

régulation des protéines découplantes chez les mammifères. Leur implication dans la

régulation de l’expression d’avUCP est donc à vérifier.

L’objectif de la thèse est de déterminer d’une part quels signaux peuvent modifier

l’expression de la protéine découplante aviaire au niveau du messager et de la protéine, et

d’autre part quelles sont les voies de signalisations impliquées dans ces régulations. Nous

tenterons également de préciser le ou les rôle(s) d’avUCP dans le découplage mitochondrial et

la limitation de la production de radicaux libres.

Pour répondre à nos questions, nous avons dans un premier temps utilisé une approche

in vivo sur des poulets en croissance. Par injection intramusculaire d’un agent

pharmacologique, nous avons stimulé le système -adrénergique du poulet, système impliqué

dans la thermorégulation chez l’oiseau (Ophir et al., 2004). Nous nous sommes alors

intéressés aux paramètres sanguins pour étudier les changements métaboliques et hormonaux

52

qui ont suivi l’injection. Par une approche de RT-PCR quantitative, nous avons également

mesuré les répercussions sur les niveaux de messagers d’avUCP, de gènes clés du

métabolisme mitochondrial et de facteurs de transcription potentiellement impliqués dans la

régulation de l’expression du message d’avUCP. Par Western blot, nous avons complété ces

mesures par une étude des voies signalisation intracellulaire qui pourraient intervenir dans la

régulation de l’expression d’avUCP.

Par la suite, les mécanismes de régulation ont été approfondis par une étude in vitro.

Pour mieux comprendre la régulation fine d’avUCP par la voie -adrénergique et les acides

gras, nous avons étudié l’effet d’un -agoniste sur des myoblastes de poussins puis nous

avons utilisé différents activateurs ou inhibiteurs pharmacologiques afin de mettre en

évidence un lien direct entre différentes voies de signalisation et expression d’avUCP.

Enfin, nous avons exploré l’implication d’avUCP dans le découplage mitochondrial et

la limitation de production de radicaux libres en fonction du type de muscle considéré. Nous

avons mesuré la consommation d’O2, évalué le potentiel de membrane et la production

d’H202 sur des mitochondries isolées à partir de muscles de poulet de type contractile et

métabolique différents et tenté de faire le lien entre ces paramètres fonctionnels et

l’expression d’avUCP dans ces muscles.

53

MATERIELS ET METHODES

54

55

Nom Amorce (S et AS) N° Genbank

18S TCCAGCTAGGAATAATGGAATAGGA

CCGGCCGTCCCTCTTAAT AF173612.1

-actine CTGGCACCTAGCACAATGAA

CTGCTTGCTGATCCACATCT NM_205518.1

2-AR ACCTGCCTCTTGTGGTCATGGT

GGATGTGAAACCTCCCCTCACT XP_425195.2

avUCP CTACGACCTCATCAAGGACACA

GAAGGCAGCCACGAAGTGA AF433170.2

avANT TATCAGCTGGATGATTGCACAGA

ACGCAAAGGAGCTGATATCATGT AB088686.1

ACSL1 CCTTCGCTGCATTAACACAATTCC

CACATTCATCATGGGGAAAAC NM_001012578.1

COX4 CTTTCCACCTCCATCTGTGTGA

TGCTGGATGGCTGAAATCG NM_001030577.1

D2 AGAAGCTCCGAACTCCAGTGTAA

CCCCGGCTCCTTCAAAA NM_204114.1

HAD ATCCTTGCAAATCACGCAGTT

AATGGAGGCCACCAAATCG XM_418403.2

L-CPT1 GCCCTGATGCCTTCATTCAA

ATTTTCCCATGTCTCGGTGA NM_001012898.1

M-CPT1 GATTTCTGCTGCTTCCAATTCG

TGCAGCGCGATCTGAATG DQ314726.1

MyHCadult CCAAATTCCGCAAGATCCAAC

CTTATGCCACTTTGTTGTCACGAC M74084.1

MyHCemb3 AGGAGCTGTCCAATGTCAACCTC

GCAGAAGAAAGCAACAGAGGGTTC NM_001113709.1

MyHCneo AGCAGGCATTCACCCAACA

ATGGCGAGCAGACTGCAAAC AB021180.1

MyHCs2 CAACCTGGTGAAGTACCGCAAG

TTGAAGGTGATGACCTCCTTGG U85023.1

PGC-1" GGGACCGGTTTGAAGTTTTTG

GGCTCGTTTGACCTGCGTAA NM_001006457.1

PPAR" CAAACCAACCATCCTGACGAT

GGAGGTCAGCCATTTTTTGGA NM_001001464.1

PPAR /# CATGGAGCCCAAGTTTGAGT

CGGAGGATGTTGTCTTGGAT NM_204728.1

Tableau II : Présentation des différentes amorces de PCR utilisées

18S, ARNr 18S ; 2-AR, 2-adrénorécepteur ; AS : antisens ; avUCP, protéine découplante

aviaire ; avANT, adénine nucléotide translocase aviaire ; ACSL1, acyl-CoA synthetase

long-chain family member 1 ; COX4, sous-unité 4 de la cytochrome c oxydase ;

D2, déiodinase D2 ; HAD, -hydroxyacyl-CoA déshydrogénase ; L-CPT1, isoforme

hépatique de la carnitine palmitoyltransférase 1 ; M-CPT1, isoforme musculaire de la

carnitine palmitoyltransférase 1 ; MyHCadult, isoforme adulte rapide de chaîne lourde de

myosine (MyHC); MyHCemb3, isoforme embryonnaire rapide MyHC ; MyHCneo, isoforme

néonatale rapide de MyHC ; MyHCs2, isoforme lente 2 de MyHC; PGC-1", PPAR!

coactivator-1" ; PPAR", peroxisome proliferator-activated receptor " ; PPAR /#, peroxisome

proliferator-activated receptor /# ; S : sens.

Matériels et méthodes

Les différentes techniques employées au cours des études qui vont suivre étant décrites

dans les publications, nous nous limiterons ici à décrire brièvement les deux techniques

majeures utilisées tout au long de ces travaux.

Quantification de l’expression des gènes

La quantification de l’expression des gènes a été réalisée par mesure des niveaux

d’ARNm présents. Cela nécessite une extraction des ARN totaux présents dans les cellules en

culture ou les tissus préalablement broyés dans l’azote. Après dosage par spectrophotométrie

(DO à 260 nm), l’intégrité des ARN est vérifiée sur gel d’agarose 1 % contenant du bromure

d’éthidium. Un traitement à la DNAse puis une transcription-reverse sont ensuite effectués.

La quantification des ARNm d’intérêt est alors réalisée par PCR quantitative en temps réel

(RT-qPCR) avec le mix SYBR Green (qPCR Mastermix Plus for SYBR Green, Eurogentec).

Les amorces utilisées sont présentées dans le Tableau II. Les produits de transcription-reverse

(RT) sont utilisés comme matrice de PCR à des concentrations différentes, selon leur

provenance et les amorces. Ainsi, les amorces 18S et -actine nécessitent des RT diluées au

1/5000e ou au 1/1000

e si elles proviennent respectivement de muscles ou de cellules en

culture. Les autres sont utilisées avec des RT diluées au 1/50e ou au 1/10

e selon leur

provenance. La quantité d’ARNm est calculée par différence avec un échantillon référence et

en fonction de l’efficacité des amorces utilisées, puis normalisée par la quantité d’ARNr 18S

ou d’ARNm de -actine présente dans la RT.

Quantification des niveaux protéiques

La quantification des niveaux protéiques a été réalisée par Western blot. L’extraction

des protéines est effectuée dans un tampon de lyse selon un protocole décrit dans la

publication N°1 pour les échantillons de muscles et dans la publication N°2 pour les

échantillons de cellules en culture. La détection d’avUCP nécessite une extraction spécifique,

décrite dans la publication N°1. La séparation des protéines est réalisée par électrophorèse sur

gels de polyacrylamide (Tableau III). Après dosage par la méthode de Bradford, les

échantillons sont préparés dans du tampon de charge de Laemli (125 mM Tris-HCl pH 6,8,

55

56

Gel gradient Composition

Gel de

concentration

4 %

Gel de

resolution

10 %

Gel de

resolution

15 % 4 % 10 %

H2O 1,81 mL 3400 µL 1,9 mL 2,39 mL 2,13 mL

Tris-HCl 1 mL (1 M, pH 6,6)

1,125 mL (3 M, pH 8,8)

1,125 mL (3 M, pH 8,8)

1 mL (3 M, pH 8,8)

1,25 mL (3 M, pH 8,8)

Glycérol 50 % 900µL 900 µL

Acrylamide/bis-acrylamide

30% 950 µL 3 mL 4,5 mL 530 µL 1,66 mL

SDS 10% 40 µL 90 µL 90 µL 40 µL 50 µL

APS 10% 25 µL 250 µL 250 µL 40 µL 50 µL

Temed 2,5 µL 5 µL 5 µL 4 µL 5 µL

Tableau III : Préparation des gels de polyacrylamide

APS, amonium persulfate ; SDS, sodium dodécylsulfate ; Temed, N,N,N',N'-

Tetramethylethylenediamine.

Anticorps Fournisseur Référence Dilution Diluant Taille (kDa)

ACC CST #3661 1/1000e BSA 5% 280

phospho-ACC (Ser79) CST #3662 1/500e Lait 5% 280

AMPK Upstate 07-350 1/1000e BSA 5% 63

phospho-AMPK (Thr172) CST #2531 1/1000e BSA 5% 62

CREB Santa Cruz sc-186 1/1000e Lait 5% 43

phospho-CREB (Ser133) CST #9196 1/500e Lait 5% 43

p38 MAPK Santa Cruz sc-535 1/2000e Lait 5% 38

phospho-p38 MAPK CST #9211 1/1000e Tp Odyssey 38

avUCP 3219 EFS 1/500e BSA 5% $ 30

Vinculine SIGMA V9131 1/5000e Tp Odyssey 110

Tableau IV : Présentation des différents anticorps utilisés en Western blot

ACC, acétyl-CoA carboxylase ; AMPK, AMP-activated protein kinase ; CREB, cAMP

response elements binding protein ; p38 MAPK, p38 mitogen-activated protein kinase ;

avUCP, protéine découplante aviaire.

Les anticorps sont dilués dans du Tampon Odyssey (Blocking Buffer, Licor Bioscience) ou

bien du TBS/Tween (20 mM Tris-Base pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,1 % Tween-20) complété

avec de la BSA (bovine serum albumin) ou du lait.

CST : Cell Signaling Technology (Bervely, MA, USA) ; EFS : Etablissement Français du

Sang (Nantes, France) ; Santa Cruz : Santa Cruz biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) ;

SIGMA : Sigma Chemical Company (St Louis, MO, USA) ; Upstate : Upstate Biotechnology

(Lake Placid, NY, USA).

50 % glycérol, 4 % SDS, 0,08 % bleu de bromophénol, 5 % -mercaptoéthanol) avant dépôt

sur les gels.

La migration et le type de gel dépendent de la protéine que l’on veut détecter et de

l’origine de l’échantillon. Ainsi, une migration « classique » est réalisée dans un gel de

résolution 10 %, et s’effectue à 50 V dans le gel de concentration, puis 70 à 100 V dans le gel

de résolution, dans un tampon de migration (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1 % SDS,

pH 8,3). La migration de l’acétyl-CoA carboxylase (ACC) et de la phospho-ACC (pACC) à

partir d’échantillon de muscles s’effectue sur un gel gradient 4 % - 10 % à une tension de

50 V pendant 6 à 7 heures. La migration d’avUCP nécessite, quant à elle, un gel de résolution

15 % et migre à 35 V sur la nuit à 4°C.

Les conditions de transfert sur membrane de nitrocellulose sont également

dépendantes de la protéine étudiée. Un transfert « classique » s’effectue à 100V, pendant

1 heure dans un tampon de transfert (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,01 % SDS, 20 %

méthanol, pH 8,3). Le transfert pour l’ACC et la pACC, issues de muscles est réalisé sur la

nuit à 35 V, puis 1 heure à 70 V dans un tampon de transfert contenant le double de SDS.

Le blocage de la membrane se fait dans du TBS/Tween 5 % lait (20 mM Tris-Base

pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,1 % Tween-20), sous agitation pendant 1 heure. L’hybridation de

l’anticorps primaire (Tableau IV) est ensuite effectuée sur la nuit, sous agitation.

L’hybridation de l’anticorps secondaire est réalisée, sous agitation, pendant au moins

3 heures. Enfin la révélation est effectuée par le système Odyssey Imaging (LICOR

Biotechnology Inc., Lincoln, NE, USA). L’intensité des bandes est alors normalisée par celles

de la protéine vinculine qui sert de témoin de charge.

56

ETUDES EXPERIMENTALES

57

1. Etude de la régulation de l’expression d’avUCP par le système

-adrénergique

Les résultats présentés dans cette partie seront développés dans les publications

suivantes :

Publication N°1 : The -adrenergic system is involved in the regulation of the expression

of avian uncoupling protein in the chicken.

Romain Joubert, Sonia Métayer Coustard, Quirine. Swennen, Vonnick Sibut, Sabine

Crochet, Estelle Cailleau-Audouin, Johan Buyse, Eddy Decuypere, Chantal Wrutniak-

Cabello, Gérard Cabello, Sophie Tesseraud, Anne Collin.

Publication N°2 : Regulation of the expression of the avian uncoupling protein by

isoproterenol and fatty acids in chick myoblasts: involvement of AMPK, p38 MAPK and

PPAR .

Romain Joubert, Sonia Métayer-Coustard, Sabine Crochet, Estelle Cailleau-Audouin, Joëlle

Dupont, Michel Jacques Duclos, Sophie Tesseraud, Anne Collin.

58

Publication N°1 : The !-adrenergic system is involved in the regulation of the expression

of avian uncoupling protein in the chicken.

Le système -adrénergique est impliqué dans la régulation de l’expression de la protéine

découplante aviaire chez le poulet.

Résumé

La protéine découplante aviaire (UCP) est l’orthologue de la protéine mammalienne

UCP3. Cette protéine pourrait être impliquée dans le métabolisme des acides gras et dans la

limitation de la production d’espèces réactives de l’oxygène. Chez le poulet, le rôle et la

régulation d’avUCP doivent encore être clarifiés. Le but de cette étude est d’explorer le

contrôle du système -adrénergique sur l’expression d’avUCP in vivo. Il a été mis en évidence

que le système -adrénergique est impliqué dans la thermorégulation et l’utilisation

métabolique des lipides chez l’oiseau, ainsi que dans la régulation de l’expression de l’UCP1

chez les mammifères. Nous avons donc mesuré l’expression de l’ARNm et de la protéine

avUCP dans le muscle Pectoralis major de poulets qui ont reçu une injection d’isoprotérénol,

un 2-agoniste. Nous avons également exploré les voies de signalisation potentiellement

impliquées dans la régulation de l’expression de l’ARNm d’avUCP.

Les niveaux de messagers d’avUCP ont été multipliés par sept, 4 heures après

l’injection d’isoprotérénol, entrainant une tendance à l’augmentation de 40 % de la quantité

de protéine avUCP 24 heures après injection. Cette augmentation a été précédée, 30 minutes

après injection, par des changements du statut thyroïdien et une augmentation de l’expression

dans le muscle des facteurs de transcription PPAR!, PPAR /" et PPAR# coactivator-1!

(PGC-1!). De plus, une analyse in silico de la séquence promotrice du gène avUCP a montré

différents sites potentiels de fixation des PPAR et du récepteur aux hormones thyroïdiennes.

Nous avons également détecté l’activation par l’isoprotérénol de l’AMP-activated protein

kinase (AMPK), dont il a récemment été mis en évidence une action dans la régulation

d’UCP3 chez les mammifères.

Cette étude présente, pour la première fois, la preuve d’un contrôle -adrénergique sur

l’expression du messager d’avUCP dans le muscle de poulet et met à jour un rôle potentiel de

l’AMPK et des facteurs de transcription PPAR et PGC-1! dans cette régulation.

59

0

5

10

15

20

25

30

35Témoin

Isoprotérénol

AR

Nm

avU

CP

/ 1

8S

3 heures 5 heures

Figure 17 : Expression de l’ARNm d’avUCP, 3 et 5 heures après injection

d’isoprotérénol chez le poulet (expérience préliminaire)

L’expression de l’ARNm d’avUCP a été mesurée par RT-qPCR. Les niveaux d’expression

sont normalisés par l’ARNr 18S et rapportés à la moyenne des témoins ; n = 1.

0

2

4

6

8

10 Témoin

Isoprotérénol

Inte

nsité

de

la

ba

nd

e p

AM

PK

3 heures 5 heures

75 kDa

50 kDa

3 H

Iso Témoin

5 H 3 H 5 H

Figure 18 : Niveau de phosphorylation de la protéine AMPK, 3 et 5 heures après

injection d’isoprotérénol chez le poulet (expérience préliminaire)

Les niveaux de phosphorylation de la thréonine 172 de la sous-unité ! de l’AMPK ont été

déterminés par Western blot ; n= 1.

3 H : 3 heures ; 5 H : 5 heures ; Iso : isoprorérénol.

60

Etude préliminaire

La première partie de cette thèse avait pour but de déterminer, dans un premier temps,

si un stimulus -adrénergique pouvait stimuler l’expression de la protéine découplante aviaire

dans le muscle Pectoralis major (PM), puis dans un second temps, quelles sont les voies de

signalisation intracellulaires impliquées dans la régulation -adrénergique de l’expression

d’avUCP. Pour répondre à ces questions, nous avons utilisé un modèle in vivo de poulets,

dans lesquels a été administré un -agoniste ou une solution physiologique par injection

intramusculaire. Le muscle Pectoralis major et le sang ont alors été prélevés afin d’effectuer

les différentes mesures nécessaires pour répondre à nos questions. L’analyse de l’expression

des ARNm a été réalisée par RT-PCR quantitative. Le dosage des métabolites sanguins et la

détermination des concentrations plasmatiques d’hormones thyroïdiennes ont été effectués, en

collaboration avec la Katholieke Universiteit Leuven (KUL, Leuven, Belgique),

respectivement par dosages colorimétriques et par Radio Immuno Assay (RIA). Les niveaux

d’activation des différentes protéines, potentiellement impliquées dans les voies de

signalisations intracellulaires ont été mesurés par Western blot.

Toutefois, il a été nécessaire d’effectuer une pré-expérience afin de déterminer les

temps de prélèvement optimaux suite à la stimulation -adrénergique pour détecter la

surexpression d’avUCP. Pour cela, quatre poulets ont été utilisés pour déterminer les niveaux

d’expression du messager d’avUCP 3 heures et 5 heures après injection de l’isoprotérénol ou

de sérum physiologique (Figure 17). Les poulets stimulés par l’isoprotérénol présentaient une

forte augmentation de l’expression de l’ARN d’avUCP (3400 % à 3 heures et 300 % à

5 heures). Par ailleurs, nous avons également voulu estimer l’activation de l’AMPK sur ces

échantillons par Western blot (Figure 18). Les poulets stimulés présentaient tous deux une

phosphorylation de l’AMPK contrairement aux poulets témoins. De plus les poulets

« 3 heures » avaient un niveau de phosphorylation de l’AMPK plus élevé que les poulets

« 5 heures ».

Partant des ces résultats et pour des raisons expérimentales, nous avons choisi de

prélever les échantillons 4 heures après l’injection. De plus, pour évaluer les effets à court

terme de la stimulation, nous avons également choisi un temps de prélèvement de 30 minutes

après l’injection, en nous basant sur une étude de thermorégulation chez le pigeon qui montre

un pic de transpiration 30 minutes après injection d’isoprotérénol (Ophir et al., 2004).

60

Publication N°1

The !-adrenergic system is involved in the regulation of the

expression of avian uncoupling protein in the chicken.

Domestic Animal Endocrinology, sous presse, 2009

61

Principaux résultats présentés dans la publication

Indicateurs métaboliques

Par mesure des métabolites sanguins, nous avons pu mettre en évidence des changements

métaboliques entrainés par l’injection d’isoprotérénol. Ainsi les animaux stimulés présentent

une glycémie plus forte que les animaux témoins à 30 minutes (P < 0,001) et à 4 heures

(P = 0,01). De même l’injection de l’isoprotérénol modifie les concentrations de triglycérides

et d’acides gras libres (non-esterified fatty acids, NEFA) qui diminuent chez les animaux

stimulés après 30 minutes (respectivement P < 0,001 et P = 0,008). Après 4 heures, seules les

concentrations de triglycérides sont plus faibles chez les poulets stimulés par rapport aux

témoins (P < 0,001). L’expression de l’ARNm de l’ACSL1, M-CPT1 et HAD, enzymes clés

du métabolisme des acides gras, augmente 30 minutes après injection chez les poulets

stimulés (respectivement P < 0,01, P < 0,05 et P < 0,05).

Expression d’avUCP

Les poulets stimulés par l’isoprotérénol présentent une expression qui tend à être différente à

30 minutes (P < 0,10) et est fortement plus élevée après 4 heures (650 %, P < 0,001).

Cependant aucun changement au niveau protéique n’a pu être décelé. Une seconde expérience

a donc été réalisée dans laquelle des prélèvements de muscle ont été effectués 24 heures après

l’injection de l’isoprotérénol. La quantité de protéine avUCP présente dans ces mitochondries

tend alors à être plus élevée chez les poulets stimulés que chez les poulets témoins

(P = 0,053).

Voies de signalisation potentiellement impliquées

L’étude in silico de la séquence promotrice d’avUCP a notamment mis à jour des éléments de

réponse à CREB, aux PPAR et au récepteur des hormones thyroïdiennes. Les niveaux

d’expression des messagers de PPAR!, PPAR /" et de PGC-1! sont plus élevés 30 minutes

après injection chez les animaux stimulés (P < 0,05). Le ratio T3/T4 est plus élevé 30 minutes

après l’injection chez les poulets stimulés par rapport aux poulets témoins. Enfin la

phosphorylation de l’AMPK est significativement plus forte chez les poulets stimulés avec

l’isoprotérénol 30 minutes après l’injection (P < 0,05). Au bout de 4 heures, cette

augmentation n’est plus qu’une tendance (P < 0,10).

73

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3 Témoin

Isoprotérénol

AR

Nm

D2

/

-actin

e

30 minutes 4 heures

Figure 19 : Expression de l’ARNm de la déiodinase D2, 30 minutes et 4 heures après

injection d’isoprotérénol chez le poulet

L’expression de l’ARNm de la déiodinase D2 a été mesurée par RT-qPCR. Les niveaux

d’expression sont normalisés par l’ARNm de la -actine et sont rapportés à la moyenne des

témoins ; n = 8

D2 : déiodinase D2.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6 Témoin

Isoprotérénol

Niv

ea

u d

e p

ho

sp

hory

latio

n

30 minutes 4 heures 30 minutes 4 heures

pCREB / CREB pP38 / P38

Figure 20 : Niveau de phosphorylation des protéines CREB et p38 MAPK, 30 minutes et

4 heures après injection d’isoprotérénol chez le poulet

Les niveaux de phosphorylation de la sérine 133 de la protéine CREB, ainsi que de la

thréonine 180 et de la tyrosine 182 de la sous-unité ! de la p38 MAPK ont été déterminés par

Western blot. Les valeurs ont été rapportées à la moyenne des témoins ; n = 8.

CREB : cAMP response elements binding protein ; P38 : p38 mitogen-activated protein

kinase.

74

Résultats complémentaires

Expression de la déiodinase D2

L’activité de la déiodinase D2 n’a pas pu etre mesurée sur les échantillons après la mise en

évidence d’une augmentation du ratio T3/T4 chez les poulets stimulés 30 minutes après

l’injection. Les niveaux d’expression du messager de la déiodinase D2 dans le PM ont, en

revanche, été mesurés pour tenter d’expliquer les variations des concentrations d’hormones

thyroïdiennes (Figure 19). Bien que les poulets stimulés présentent, en moyenne, une

expression numériquement plus forte de l’ARNm de la D2 que les poulets témoins, la

signification statistique de cette hausse n’est pas atteinte à cause d’une forte variabilité

individuelle.

Activation de la p38 MAPK et de CREB

D’après le modèle de régulation d’UCP1 dans le TAB de mammifères, la stimulation du

récepteur 2-adrénergique entraine une activation de la voie PKA dans la cellule. Cette voie

aboutit à la phosphorylation du facteur de transcription CREB, et à l’activation d’une voie

parallèle par la phosphorylation de la p38 MAPK. Par Western blot, nous n’avons pu détecter

de modifications de la phosphorylation de la p38 MAPK, 30 minutes et 4 heures après

l’injection de l’isoprotérénol (Figure 20). Néanmoins, ceci pourrait être du à la cinétique

d’activation de ces protéines. D’après le modèle de régulation d’UCP1, l’activation de la p38

MAPK par la PKA précède la stimulation de l’expression du facteur de transcription PGC-1!.

Or dans notre modèle, l’expression du messager de PGC-1! est déjà augmentée 30 minutes

après l’injection. L’activation de la p38 MAPK aurait donc déjà été effectuée et pourrait être

très transitoire, expliquant notre absence de détection d’une différence de phosphorylation

dans les échantillons prélevés 30 minutes après injection.

74

Publication N°2 : Regulation of the expression of the avian uncoupling protein by

isoproterenol and fatty acids in chick myoblasts: involvement of AMPK, p38 MAPK and

PPAR .

Régulation de l’expression de la protéine découplante aviaire par l’isoprotérénol et les acides

gras dans les myoblastes de poussins : implication de l’AMPK, la p38 MAPK et de PPAR!.

Résumé

La protéine découplante aviaire (avUCP), exprimée principalement dans le muscle

squelettique, a successivement été suggérée comme impliquée dans la thermogenèse sans

frisson et/ou dans le métabolisme des acides gras et la limitation de la production d’espèces

réactives de l’oxygène. Nous avons récemment démontré que l’expression du messager

d’avUCP était augmentée par l’isoprotérénol, un 2-agoniste, dans le muscle Pectoralis major

de poulet. Cette surexpression était associée à un changement du métabolisme des acides gras,

des variations de l’activation de l’AMP-activated protein kinase (AMPK) et de l’expression

des facteurs de transcription peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) !, PPAR /"

et PPAR# coactivator-1! (PGC-1!). Le but de cette étude était d’élucider les mécanismes

impliquant l’AMPK, la p38 mitogen-actived protein kinase (MAPK) et les PPAR dans les

régulations de l’expression du messager d’avUCP dans les cultures primaires de myoblastes

de poussins.

L’expression du messager d’avUCP, associé à une activation de la p38 MAPK, est

augmentée par l’isoprotérénol et/ou les acides gras. La stimulation par les acides gras conduit

également à une activation de l’AMPK. L’action directe de l’AMPK sur l’expression

d’avUCP a été mise en évidence en utilisant l’activateur 5-aminoimidazole-4-carboxyamide

ribonucleoside (AICAR) et l’inhibiteur Compound C. L’utilisation de SB202190, un

inhibiteur de la p38 MAPK, augmente très fortement l’expression de l’ARNm d’avUCP et

active simultanément l’AMPK. Finalement, l’agoniste PPAR! WY14-643 induit une forte

augmentation de l’expression de l’ARNm d’avUCP.

75

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

AR

Nm

avU

CP

/ 1

8S

QM7 Culture Iaire

Figure 21 : Expression de l’ARNm d’avUCP dans les myoblastes de la lignée cellulaire

QM7 et de culture primaire de cellules musculaires de poussins

L’expression de l’ARNm d’avUCP a été mesurée par RT-qPCR. Les niveaux d’expression

sont normalisés par l’ARNr 18S et sont rapportées à la moyenne des témoins ; n = 1.

QM7 : quail muscle clone 7.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

AR

Nm

avU

CP

Myoblaste

Myotubes

J2 J4 J60

0,5

1

1,5

2

AR

Nr

18

S

Myoblaste

Myotubes

J2 J4 J6

a

abab

bc

a

b b

Figure 22 : Expression de l’ARNm d’avUCP et de l’ARNr 18S dans la lignée cellulaire

QM7 au cours de la différenciation

Les niveaux d’expression de l’ARNm d’avUCP et de l’ARNr 18S ont été mesurés par

RT-qPCR. Les cellules ont été mises en différenciation en utilisant du milieu de culture sans

sérum ; n = 6. Les lettres a, b, c désignent des différences significatives.

J2 : 2ème

jour après mise en différenciation ; J4 : 4ème

jour après mise en différenciation ;

J6 : 6ème

jour après mise en différenciation.

76

Etudes préliminaires

Comme nous venons de le voir, un stimulus -adrénergique peut moduler l’expression

d’avUCP in vivo. Cette régulation est associée à l’activation de différentes voies de

signalisation intracellulaires, à la modification du statut thyroïdien et aux modifications des

métabolismes lipidiques et glucidiques. Afin d’affiner la compréhension de ces régulations,

un modèle in vitro a été utilisé. Nous avions alors le choix entre deux modèles cellulaires : des

cultures primaires de poussin ou une lignée cellulaire QM7 de muscle de caille (Moscovici et

al., 1977). Les cultures primaires sont plus représentatives de la physiologie du muscle.

Cependant, ces cellules sont plus fragiles et peuvent présenter de grosses variations dans les

réponses aux stimuli entre chaque série de culture. A l’inverse, la culture des QM7 est plus

homogène mais, de part leur immortalisation, s’éloigne du métabolisme et des régulations que

l’on retrouve dans le muscle.

Nous avons donc mesuré les niveaux d’expression du messager d’avUCP dans ces

deux types cellulaires au stade myoblaste (Figure 21). Les cellules QM7 présentent plus

d’expression de l’ARNm d’avUCP. Par ailleurs, l’extraction d’ARNm des cellules de cultures

primaires est relativement limitante à cause de la faible quantité d’ARNm que l’on récupère

par rapport aux QM7, et ceci pour une même surface de culture. De plus la mesure de

l’expression des ARNm se fait par RT-PCR quantitative en mesurant le cycle auquel

l’amplification atteint un seuil déterminé (Ct). Pour les cellules de cultures primaires, ce seuil

est atteint relativement tard, ce qui amplifie les variations entre échantillons. A la vue des

résultats et des contraintes techniques, l’utilisation des QM7 a, dans un premier temps, été

privilégiée.

Nous avons ensuite déterminé le stade de différenciation des cellules musculaires le

plus propice aux stimulations (Figure 22). L’expression de l’ARNm d’avUCP varie au cours

de la différenciation. Dans les premiers jours de formation des myotubes, la quantité d’ARNm

d’avUCP diminue, puis retourne à un niveau stable et inférieur à celui du stade myoblaste, à

partir du 4ème

jour. On peut également noter que l’expression de l’ARNr 18S, pouvant servir à

normaliser les mesures d’expression, varie également très fortement au cours de la

différenciation. Pour s’affranchir de ces différentes variations, nous avons choisis d’utiliser le

stade myoblaste pour nos études de stimulation.

Les premiers essais de stimulation de l’expression de l’ARNm d’avUCP n’ont pas

montré de forte sensibilité à l’isoprotérénol dans les QM7 (données non publiées). Nous

avons alors vérifié que les cellules QM7 possèdent bien le récepteur 2-adrénergique. En

76

PMc Mc QM7 QT6 PMp T-

Récepteur 2-adrénergique

Amorces

Figure 23 : Expression du récepteur !2-adrénergique dans différents tissus et cultures

cellulaires

L’expression du récepteur 2-adrénergique a été recherchée par PCR dans le muscle

Pectoralis major de caille, le muscle Pectoralis major de poulet, les myoblastes de caille en

culture primaire, dans la lignée de myoblastes de caille QM7 et la lignée de fibroblastes de

caille QT6.

Mc : myoblastes de caille en culture primaire; PMc : muscle Pectoralis major de caille ;

PMp : muscle Pectoralis major de poulet ; QM7 : quail muscle clone 7 ; QT6 : quail tumor

clone 6 ; T- : témoin négatif de PCR (H2O).

77

effet, au cours de leur immortalisation, ces cellules ont perdu certains mécanismes de

régulation, comme par exemple le récepteur à l’insuline (Tesseraud et al., 2003). Par PCR,

nous avons ainsi mis en évidence que les cellules QM7 ne possèdent plus le récepteur

2-adrénergique (Figure 23). Pour ces raisons, nous avons finalement choisi d’effectuer notre

étude in vitro sur un modèle cellulaire de culture primaire de myoblaste de poussins, qui, bien

qu’apportant plus de contraintes techniques, est plus proche d’un modèle physiologique de

cellules musculaires.

77

Publication N°2

Regulation of the expression of the avian uncoupling protein by

isoproterenol and fatty acids in chick myoblasts: involvement of

AMPK, p38 MAPK and PPAR .

Soumis à American Jounal of Physiology - Regulatory, Integrative and

Comparative Physiology, 2010

78

Regulation of the expression of the avian uncoupling protein by

isoproterenol and fatty acids in chick myoblasts: involvement of AMPK,

p38 MAPK and PPAR

Romain Joubert,1 Sonia Métayer-Coustard,

1 Sabine Crochet,

1 Estelle Cailleau-Audouin,

1

Joëlle Dupont,2,3,4,5

Michel Jacques Duclos,1 Sophie Tesseraud,

1 Anne Collin,

1*

1INRA, UR83 Recherches Avicoles, F-37380 Nouzilly, France;

2INRA, UMR85 Physiologie de

la Reproduction et des Comportements, F-37380 Nouzilly, France; 3CNRS, UMR6175

Physiologie de la Reproduction et des Comportements, F-37380 Nouzilly, France; 4Haras

Nationaux, F-37380 Nouzilly, France; 5Université François Rabelais de Tours, F-37041

Tours, France.

Running title: Regulation of avUCP expression in myoblasts

*Corresponding author: A. Collin, INRA, UR83 Recherches Avicoles, F-37380 Nouzilly,

France (e-mail: [email protected]).

79

Abbreviations:

ACC: acetyl-CoA carboxylase; AICAR: 5-aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside;

AMPK: AMP-activated protein kinase; BAT: brown adipose tissue; FA: fatty acids; Iso:

isoproterenol; PGC-1!: PPAR# coactivator-1!; PPAR: peroxisome proliferator-activated

receptor; ROS: reactive oxygen species; UCP: uncoupling protein.

80

ABSTRACT

The avian uncoupling protein (avUCP), mainly expressed in muscle, could be involved

in fatty acid metabolism, limitation of reactive oxygen species production and/or non-

shivering thermogenesis. We recently demonstrated that avUCP messenger expression was

increased by isoproterenol, a -agonist, in chicken Pectoralis major. This upregulation was

associated with changes in fatty acid metabolism, variations in the activation of AMP-

activated protein kinase (AMPK) and in the expression of the transcription factors peroxisome

proliferator-activated receptor (PPAR) !, PPAR /" and PPAR# coactivator-1! (PGC-1!). The

aim of the present study was to elucidate the mechanisms involving AMPK, p38 MAPK and

PPAR in avUCP mRNA regulation in primary cultures of chick myoblasts. Avian UCP

messenger expression, associated with p38 MAPK activation, was increased by isoproterenol

and/or fatty acids. Fatty acid stimulation also led to AMPK activation. Furthermore, the direct

involvement of AMPK on avUCP regulation was shown by using 5-aminoimidazole-4-

carboxyamide ribonucleoside (AICAR) and Compound C. The use of SB202190, a p38

MAPK inhibitor, dramatically enhanced avUCP mRNA expression, associated with a

simultaneous AMPK activation. Finally the PPAR! agonist WY-14643 induced a strong

increase of avUCP mRNA expression.

This study highlights the control of avUCP expression by the -adrenergic system and

fatty acids in chick myoblasts, and suggests the involvement of AMPK and PPARs in this

regulation. AvUCP overexpression could then modulate energy utilization or limit oxidative

stress when mitochondrial metabolism of fatty acids is triggered by catecholamines.

Keywords: avUCP, Chicken, Myoblast, Fatty acids, AMPK.

81

INTRODUCTION

By using energy substrates resulting from glycolysis or from the -oxidation, a

transmembrane proton gradient is created and used to generate ATP by the ATP synthase in

mitochondria. The coupling between oxidations by the mitochondrial respiratory chain and

phosphorylation by ATP synthase is tightly regulated. The process known as proton leak or

mitochondrial uncoupling consists in a return of protons in the matrix without contributing to

ATP synthesis. In mammalian and avian species, some proteins belonging to the uncoupling

proteins (UCP) family (8, 12), could contribute to this mechanism. In mammals, UCP1 (33),

UCP2 (21) and UCP3 (2) may play different roles in the organism. UCP1, present in brown

adipose tissue (BAT), induces non-shivering thermogenesis (19), while UCP2, ubiquitously

expressed, and UCP3, mainly expressed in skeletal muscle, were rather suggested to be

involved in energy substrate metabolism (fatty acids (36); pyruvate (13)), calcium transport

(22), insulin secretion (6) and/or in limiting reactive oxygen species (ROS) production (26,

48). In birds, avian UCP (avUCP) is the only representative of the uncoupling proteins family

(32) and has recently been reported to be the avian ortholog of the mammalian UCP3 (18, 34).

Predominantly expressed in muscle (20), avUCP could be involved in cold- or diet-induced

thermogenesis, lipid handling and/or in the limitation of ROS production (1, 7, 9).

The expression of avUCP can be modulated by different factors such as genotype (10),

ambient temperature (7, 32, 42, 43, 45) and nutritional state (20, 28). In particular, avUCP

upregulation is observed under cold exposure in avian species (32). Messenger expression of

avUCP is stimulated by thyroid hormones and glucagon, the most active lipolytic hormones in

birds (11, 32). In agreement with the regulation of the mammalian UCP1 in BAT (4, 39) and

UCP3 in L6 myotubes (29), we have recently shown that a -adrenergic stimulation by the 2-

agonist isoproterenol upregulates avUCP at mRNA and protein level in chicken Pectoralis

82

major muscle (24). This regulation is associated with changes in glucose and fatty acid

metabolism and involves different signaling pathways. An activation of the AMP-activated

protein kinase (AMPK), a cellular energy sensor able to regulate cellular energy metabolism

in chicken (30, 38) and to regulate UCP3 expression in rats (31, 41), was observed in

isoproterenol-treated chickens. An increase in the expression of the transcription factors

peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) !, PPAR /" and PPAR# coactivator-1!

(PGC-1!) was also associated with avUCP mRNA upregulation (24, 46), and potential PPAR

response elements (PPRE) were found in avUCP gene promoter (24). As suggested for UCP1

in BAT of mammals (4, 25), the increase of avUCP expression by the -adrenergic activation

could be mediated by the post- -adrenergic cAMP/Protein kinase A and p38 MAPK signaling

pathway, which remains to be determined.

Therefore, this study aimed at studying the effects of isoproterenol and fatty acids on

avUCP mRNA expression in an in vitro model by using primary cell cultures of chick

myoblasts and going further into the comprehension of the underlying mechanisms, exploring

the involvement of AMPK, p38 MAPK and PPAR transcription factors in the regulation of

avUCP messenger expression by using pharmacological activators and inhibitors.

MATERIALS AND METHODS

Chemicals. Cell culture and reagents. Medium 199 [10012-011], chicken serum

[16110-082], Fungizone Antimycotic [15290-026], Penicillin-Streptomycin [15070-063],

Gentamicin [15750-037] and Trysin 1X, 0.25% [25050-14] were purchased from Gibco

Products (Grand Island, NY, USA). Fetal calf serum [CVFSVF00] was from Eurobio (Les

Ulis, France) and DNAse I [10104159001] from Roche Applied Science (Meylan, France).

83

Isoproterenol [I5627], fatty acid supplement [F7050], WY-14643 [C7081] and SB202190

[S7067] were purchased from Sigma-Aldrich Chimie (Saint-Quentin-Fallavier, France).

Compound C [171260] was from Calbiochem-MERCK (Darmstadt, Germany) and 5-

Aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside (AICAR) [#9944] from Cell Signaling

technology (Beverly, MA, USA).

Antibodies. Anti-phospho-AMPK! (Thr172) [#2531], anti-phospho-Acetyl-CoA

Carboxylase (Ser79) [#3661], anti-Acetyl-CoA Carboxylase [#3662] and anti-phospho-p38

MAP Kinase (Thr180/Tyr182) [#9211] antibodies were purchased from Cell Signaling

technology (Beverly, MA, USA). Anti-AMPK!1 [07-350] from Upstate Biotechnology Inc

(Lake Placid, NY, USA), anti-p38! (C-20) [sc-535] from Santa Cruz Biotechnology (Santa

Cruz, CA, USA) and anti-vinculin [V9131] was from Sigma Chemical Company (St Louis,

MO, USA).

Cell culture. Muscle cells were derived from Pectoralis major muscle satellite cells of

1-day-old chicks, fed ad libitum, as previously described (14, 15). Breast muscles were

collected under sterile conditions. The tissue was chopped finely in PBS and enzymatically

dispersed using trypsin (10 mg/g of tissue) for 1 h at 37°C. DNAse I (0.2 g/L) was added for

the last 5 min of incubation and tissue fragments were harvested by centrifugation at 1,500 ×

g for 3 min. The fragments were resuspended in Medium 199 containing 10% (v/v) fetal calf

serum, 1% (v/v) chicken serum, Fungizone Antimycotic (2,5 mg/L), Penicillin-Streptomycin

(respectively 50 kU/L and 50 mg/L), gentamicin (50 mg/L) and sodium bicarbonate (350

mg/L) and triturated through a fine pipette to disperse the cells. The population of myogenic

cells was recovered in the supernatant after centrifugation at 100 × g for 3 min. These cells

were harvested by centrifugation at 1,500 × g for 3 min. The cells were plated at the

concentration of 100,000 cells/cm2 in multiwell plates which had been precoated with gelatin

(0.1%, w/v). Cells were incubated at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO2. At

84

80% of confluence, cells were fasted for 3 h in serum-free medium before treatments.

Stimulating treatments were performed for different times as indicated in the legends of

figures using 100 nM isoproterenol, 0.1% fatty acid supplement (containing linoleic, oleic,

myristic, lauric and arachidonic acids; less than 3 mg/L final), 1 mM AICAR (activator of

AMPK) and 100 µM WY-14643 (PPAR! agonist) in 0.1% DMSO. Inhibiting treatments were

performed using 20 µM Compound C (inhibitor of AMPK) and 10 µM SB202190 (inhibitor

of p38 MAPK) in 0.1% DMSO, respectively 2 h and 1 h before stimulations. All experiments

were carried out with due regard to legislation governing the ethical treatment of animals and

investigators were certified by French government to carry out animal experiments (n° 37-

105).

RNA isolation and RT-qPCR. Total RNA was extracted from cell cultures using RNA

Now (Biogentec, Seabrook, TX, USA) according to the manufacturer’s recommendations.

RNA concentrations were measured by spectrophotometry (OD at 260 nm). RNA integrity

was electrophoretically verified using ethidium bromide. After DNAse treatment (Ambion,

Clinisciences, Montrouge, France), RNA was reverse-transcribed using Super Script II RNase

H Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in the presence of Random Primers

(Promega, Charbonnieres-les-Bains, France).

Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) was performed using an ABI Prism

7000 apparatus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) with primers (forward:

CTACGACCTCATCAAGGACACA; reverse: GAAGGCAGCCACGAAGTGA) designed and

validated on avUCP sequence (AF433170.2, GenBank, NCBI). Messenger RNA levels were

estimated on the basis of PCR efficiency and threshold cycle (Ct) deviation of an unknown

sample versus a reference sample (40). Runs were performed in duplicates. Beta-actin was

chosen as the reference gene to standardize mRNA expression. Its primers (forward:

85

CTGGCACCTAGCACAATGAA; reverse: CTGCTTGCTGATCCACATCT) were designed and

validated on -actin sequence (NM_205518.1, GenBank, NCBI).

Western blotting. Cell cultures were lyzed for 30 min on ice in buffer containing 150

mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 7.4), 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 100 mM sodium fluoride,

4 mM sodium pyrophosphate, 2 mM sodium orthovanadate, 1% Triton X100 and 0.5%

IGEPAL supplemented with a complete protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science,

Meylan, France). Lysates were centrifuged at 4°C at 12,000 × g for 30 min. Supernatants

were aliquoted and stored at -80°C. Protein concentrations were determined using the Bio-

Rad protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, USA).

Lysates were subjected to SDS-PAGE gel electrophoresis and Western blotting using

the appropriate antibody (1/1,000 for anti-phospho-AMPK! (Thr172), anti-AMPK!1, anti-

Acetyl-CoA Carboxylase, anti-phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) and anti-p38!; 1/500

for anti-phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79); 1/5,000 for anti-vinculin). After washing,

membranes were incubated with an Alexa Fluor secondary antibody (Molecular Probes,

Interchim, Montluçon, France). Bands were visualized by infrared fluorescence using

Odyssey®

Imaging System (LI-COR Inc. Biotechnology, Lincoln, NE, USA) and quantified

by Odyssey infrared imaging system software (Application software, version 1.2, 2003).

Statistical analysis. Statistical analysis was performed by analysis of variance

(ANOVA) using the Statview Software program, version 5.0 (SAS Institute, 1992-1998,

Cary, NC) and followed by a Fisher test to detect significant differences between treatments.

Values are means ± SEM and are expressed as ratio of treated to control myoblasts. P < 0.05

was considered statistically significant and P < 0.10 as a tendency for an effect.

RESULTS

86

Effect of isoproterenol and fatty acids on avUCP messenger expression.

Isoproterenol (Iso) increased the expression of avUCP mRNA in myoblasts after 1 h (+67%,

P < 0.001) and, to a lesser extent, after 2 h of stimulation (+21%, P = 0.002) compared to

control (Fig. 1A). As the expression of enzymes involved in fatty acid metabolism was altered

in vivo after isoproterenol injection (24), a fatty acid supplement (FA) was added or not into

the medium. Myoblasts treated with FA exhibited a significantly higher avUCP expression

than controls after 2 h (+54%, P < 0.001). The increase (+34%) observed after only 1 h nearly

reached the level of significance (P = 0.051). No synergic or additional effect of Iso and FA

on avUCP expression was observed (Iso+FA group). Expression of avUCP in myoblasts

treated with Iso+FA was not different from that of myoblasts treated with Iso at 1 h (P =

0.781) and with FA at 2 h (P = 0.673).

Effect of isoproterenol and fatty acids on AMPK and p38 MAPK pathways. To

explore the signaling pathways potentially activated by isoproterenol, the phosphorylation

levels of AMPK and p38 MAPK were determined by Western blotting (Fig. 1B and 1C).

After 20 min of stimulation, Iso had no effect on the phosphorylation level of AMPK

compared to control treatment (P = 0.882). FA and Iso+FA greatly increased AMPK

phosphorylation by respectively 89% and 102% (P < 0.001). This activation of AMPK was

associated to the phosphorylation of Acetyl-CoA Carboxylase (ACC), a downstream target

(5), only for cells treated with Iso+FA (+46%, P < 0.001). Iso, FA and Iso+FA stimulated p38

MAPK with respective increases by 28% (P < 0.05), 96% (P < 0.001) and 94% (P < 0.001)

compared to control. Noteworthy, the effects of FA and Iso+FA were stronger than that of Iso

alone, with no difference between FA and Iso+FA.

Involvement of AMPK in avUCP expression. To study the involvement of AMPK in

avUCP mRNA expression, 1 mM 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside

87

(AICAR) and 20 µM Compound C were used (Fig. 2A). As expected, AICAR activated

AMPK as indicated by the increased phosphorylation of the kinase after 30 min of

stimulation. Compound C, added 2 h before the beginning of the experiment, did not alter

basal AMPK phosphorylation but attenuated AICAR-induced AMPK phosphorylation. After

2 h of stimulation, AICAR increased the level of avUCP mRNA (+63%, P < 0.001) compared

to control (Fig. 2B). Compound C had no effect (P = 0.476) compared to control. The

increase of avUCP mRNA expression induced by AICAR was partly abolished by addition of

Compound C (only +29%) (P = 0.007). Consequently, AMPK phosphorylation and avUCP

mRNA expression presented very similar patterns.

Involvement of p38 MAPK in avUCP expression. By adding Iso and/or FA in chick

myoblasts, we have observed that the increase of avUCP mRNA expression was associated to

p38 MAPK activation. To assess the involvement of the kinase in avUCP mRNA regulation,

an inhibitor of p38 MAPK (SB202190, 10 µM) was used alone or during Iso+FA stimulation.

After 30 min of stimulation, myoblasts treated with the inhibitor did not present any alteration

in the phosphorylation of p38 MAPK compared to the control (P = 0.767), but the effect of

Iso+FA (P < 0.001 compared to control) was abrogated by SB202190 (P = 0.004) (Fig. 3A).

Compared to control, SB202190 significantly increased avUCP expression (+74%, P <0.001)

after 2 h of stimulation to reach a level similar to that induced by Iso+FA (+56%, P = 0.007)

(Fig. 3B). A synergic effect of SB202190 and Iso+FA was even observed (+240%, P <

0.001). Since AMPK is involved in avUCP regulation as shown in Fig. 2, we next studied the

phosphorylation of AMPK following SB202190 treatment. Interestingly, an effect of

SB202190 was observed on AMPK phosphorylation after 30 min of stimulation (Fig. 3C).

SB202190 induced an activation of AMPK (+106%, P = 0.018, compared to control) that was

not different from Iso+FA stimulation. Moreover, a stronger activation was found when p38

MAPK inhibitor was used with Iso+FA (+215%, P < 0.001, compared to control). The pattern

88

of phosphorylation of AMPK, as that of ACC phosphorylation, was similar to that of avUCP

mRNA expression.

Involvement of PPAR in avUCP expression. In vivo, the stimulation of avUCP

expression is associated with an increased PPAR! expression (24). An agonist of PPAR!

(WY-14643, 100 µM) was used to test the involvement of PPAR! in avUCP messenger

regulation. After 2 h of stimulation by WY-14643 (Fig. 4A), the expression of avUCP mRNA

was strongly increased as compared to control (+51%, P < 0.001). As indicated in Fig. 4B, the

increase induced by WY14643 did not reach the maximum within 2 h. Indeed, after 5 h of

stimulation by this agonist, avUCP mRNA expression was stronger (+104% compared to

control) than after 2 h (P < 0.05). Conversely, longer stimulations by isoproterenol and/or

fatty acids did not further increase avUCP mRNA expression (data not shown).

DISCUSSION

The aim of this work was to study in vitro the -adrenergic regulation of avUCP and to

clarify the role of different potential signaling actors in this regulation. In a previous study, we

have shown that, in chicken, an injection of the 2-agonist isoproterenol increased the

expression of avUCP mRNA and was associated with changes in glucose and fatty acid

metabolism (24). In our primary culture of chick myoblasts, isoproterenol increased avUCP

messenger expression by 60% after 1 h and 20 % after 2 h. This upregulation is consistent

with the isoproterenol-induced overexpression of UCP2 and UCP3 mRNA reported in L6

myotubes (29). To explore the involvement of fatty acids in the regulation of avUCP

expression, a fatty acid supplement was added to the culture medium. Fatty acids increased

avUCP expression by 35% after 1 h and 60% after 2 h. The simultaneous use of both factors

89

(isoproterenol and fatty acids) had not any additional or synergic effect on avUCP expression

but it showed a time complementarity. Isoproterenol induced an early increase of avUCP

expression and fatty acids appeared to have a delayed action. However, the maximum

increase we observed, induced by isoproterenol and fatty acids, was only of 60%, whereas in

chicken, isoproterenol injection resulted in a 7 to 9-fold increase of avUCP mRNA expression

(24). This could be explained by the involvement of other factors such as thyroid hormones or

blood metabolites, which were not studied here.

The kinetic differences between isoproterenol and fatty acids may involve distinct

signaling pathways. Isoproterenol could act as a fast regulator by using the post- -adrenergic

cAMP/Protein kinase A muscular signaling pathway (25). Fatty acids could activate the

AMPK pathway since we showed that fatty acid supplement induced AMPK phosphorylation

whereas isoproterenol did not. This relation between AMPK activation and avUCP

upregulation was in accordance with different studies on UCP3 (31, 41). The direct

involvement of AMPK in avUCP regulation in chick myoblasts was confirmed by the use of

two pharmacological reagents of this kinase. The activation of AMPK, realized with addition

of AICAR, induced a clear increase in avUCP mRNA expression. The activation of AMPK

by AICAR and the subsequent upregulation of avUCP were partially lowered by addition of

Compound C. Therefore, avUCP gene regulation could be under the control of AMPK. In

cultured myoblasts, we showed that this kinase was activated by addition of fatty acids

(including the long chain fatty acids linoleic, oleic, myristic, and arachidonic) in the medium.

Muscle cells have to activate long chain fatty acids with the acyl-CoA synthase (16) to use

these ones as energy substrates. This reaction consumes ATP and, by decreasing ATP/AMP

ratio, could activate AMPK. Moreover, isoproterenol, when added with fatty acids, could

improve the use of fatty acids as energy substrates as suggested after 30 min of stimulation by

the phosphorylation of ACC, a downstream target of AMPK. Following ACC inhibition (by

90

phosphorylation), malonyl-CoA synthesis decreases and thus fatty acids are more susceptible

to enter in the -oxidation pathway (3).

By referring to UCP1 model of regulation in BAT, the p38 MAPK could stimulate

avUCP messenger expression (4). This kinase was also shown to be involved in UCP2

upregulation in cardiomyocytes (47). Conversely, in melanoma cells and in bone marrow-

derived macrophage cultures, p38 MAPK is suggested to play an inhibitory role in UCP2

mRNA expression (17, 37). In chick myoblasts, avUCP stimulation by isoproterenol and/or

fatty acid supplement was associated with an increase of p38 MAPK activation. However, by

using SB202190, a selective inhibitor of p38 MAPK in mammalian cells (27), we showed a

strong increase of avUCP messenger expression. Moreover, this inhibitor induced a much

higher increase of avUCP mRNA expression when added with isoproterenol and fatty acid

supplement. Although previous studies in rat hearts showed that SB202190 has no effect on

AMPK phosphorylation (23), p38 MAPK inhibition by SB202190 was here associated with

AMPK activation. This result might make doubtful the specificity of SB202190 effect on p38

MAPK in avian cells. We can hypothesize that the avUCP upregulation observed with

isoproterenol and fatty acids is due to AMPK activation rather than to p38 MAPK inhibition.

In the present study, we also observed an activation of avUCP mRNA expression by

PPAR! agonist in vitro. In mammals, depending on the tissues considered, PPAR!, PPAR /",

PPAR# and the co-activator PGC-1! are involved in the regulation of UCP1, UCP2 and

UCP3 expression (49). In avian species, PPAR!, PPAR /" and PGC-1! are associated to

avUCP upregulation in the Pectoralis major muscle, in cold-exposed and -adrenergic

stimulated chickens (24, 46). Here we showed by using the PPAR! agonist WY-14643 an

increase in avUCP mRNA expression that did not reach a maximum before 5 h. These

findings are in accordance with the study of Teruel et al. on UCP3 regulation by WY-14643

91

(44). This involvement of PPAR! supports the hypothesis of a control on avUCP mRNA

expression by fatty acids which are PPAR activators (35).

In conclusion, we provide the evidence of a short-term control by isoproterenol and a

delayed control by fatty acids on avUCP messenger expression in chick myoblasts. This time-

dependent regulation may use different signaling pathways (Fig. 5). The effect of fatty acids,

but not that of isoproterenol, could involve an AMPK-dependent signaling pathway. We

demonstrate by using pharmacological reagents that avUCP expression is directly mediated

by AMPK and by the transcription factor PPAR!. The inhibition of p38 MAPK by SB202190

induces a strong stimulation of avUCP expression, but the simultaneous AMPK activation

still questions about the potential inhibitory role of p38 MAPK on avUCP expression. The

strong relationship between AMPK, fatty acids and avUCP upregulation is in favor of a role

of avUCP in lipid metabolism and/or in the limitation of cell damages by lipid peroxidation to

respond to increases in mitochondrial metabolism.

ACKNOWLEDGEMENTS

We thank M. Derouet, T. Bordeau, H. Mameri and N. Everaert (INRA, UR83

Recherches Avicoles, F-37380 Nouzilly, France), J. Delaveau, J.M. Brigant and H. Rigoreau

(INRA, UE1295 Pôle d’Expérimentation Avicole de Tours, F-37380 Nouzilly, France) for

their skilled technical assistance. Authors are also grateful to C. Berri, C. Wrutniak-Cabello

and M. Damon for useful discussions. R. Joubert is a PhD student supported by a grant from

INRA and Région Centre, France.

92

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99

FIGURE LEGENDS

Fig. 1. Effect of isoproterenol (100 nM) and fatty acid supplement (0.1%) on the expression

of avUCP and activation of signaling proteins in chick myoblasts. (A) Avian UCP mRNA

expression after 1 h and 2 h of stimulation. Messenger levels from five independent

experiments were measured by qRT-PCR and were expressed as a ratio of treated to control

myoblasts for avUCP/ -actin; -actin was not affected by the treatments. (B) Phosphorylation

of AMPK and ACC after 20 min of stimulation. Phosphorylation levels from five independent

experiments were determined by Western blotting and the phosphorylated protein / total

protein ratio were calculated. Results were expressed as a ratio of treated to control

myoblasts. (C) Phosphorylation of p38 MAPK after 20 min of stimulation. Phosphorylation

levels from five independent experiments were determined by Western blotting and the

phosphorylated protein / total protein ratio were calculated. Results were expressed as a ratio

of treated to control myoblasts. Iso, isoproterenol; FA, fatty acid supplement; Ctl, control; a,

b, c and A, B, C = different letters indicate significant differences (P < 0.05).

Fig. 2. Involvement of AMPK in avUCP regulation in chick myoblasts. (A) Phosphorylation

of AMPK after 30 min of stimulation by AICAR and/or Compound C. Phosphorylation levels

from ten independent experiments were determined by Western blotting and the

phosphorylated protein / total protein ratio were calculated. Results were expressed as ratio of

treated to control myoblasts. (B) Avian UCP mRNA expression 2 h after stimulation by

AICAR and/or Compound C. Messenger levels from ten independent experiments were

measured by qRT-PCR and were expressed as a ratio of treated to control myoblasts for

avUCP/ -actin; -actin was not affected by the treatments. AICAR, 5-amino-4-

imidazolecarboxamide ribonucleoside (AMPK activator, 1 mM)); Cc, Compound C (AMPK

100

inhibitor, added 2 h before the beginning of the experiment, 20 µM); Ctl, control; a, b, c =

different letters indicate significant differences (P < 0.05).

Fig. 3. Effect of p38 MAPK inhibition on avUCP mRNA expression in chick myoblasts. (A)

Phosphorylation of p38 MAPK after 30 min of stimulation by Iso+FA and/or SB202190.

Phosphorylation levels from three independent experiments were determined by Western

blotting and the phosphorylated protein / total protein ratio were calculated. Results are

expressed as ratio of treated to control myoblasts. (B) Avian UCP mRNA expression after 2 h

of stimulation by Iso+FA and/or SB202190. Messenger levels from four independent

experiments were measured by qRT-PCR and were expressed as a ratio of treated to control

myoblasts for avUCP/ -actin; -actin was not affected by the treatments. (C) Phosphorylation

of AMPK and ACC after 30 min of stimulation by Iso+FA and/or SB202190.

Phosphorylation levels from three independent experiments were determined by Western

blotting and the phosphorylated protein / total protein ratio were calculated. Results were

expressed as ratio of treated to control myoblasts. Iso+FA, isoproterenol (100 nM) and fatty

acid supplement (0.1%); SB202190, p38 MAPK inhibitor, added 1 h before the beginning of

the experiment (10 µM); Ctl, control; a, b, c and A, B: different letters indicate significant

differences (P < 0.05).

Fig. 4. Effect of PPAR! agonist WY-14643 on avUCP mRNA expression in chick myoblasts.

Messenger levels were measured by qRT-PCR and were expressed as a ratio of treated to

control myoblasts for avUCP/ -actin (A) Avian UCP mRNA expression after 2 h of

stimulation from ten independent experiments; -actin was not affected by the treatments. (B)

Kinetics of WY-14643 on avUCP mRNA expression (n = 2); -actin was not affected by the

101

treatments. WY-14643, PPAR! agonist (100 µM); Ctl, control; a, b, c, d = different letters

indicate significant differences (P < 0.05).

Fig. 5. Signaling pathways potentially involved in the regulation of avUCP mRNA expression

following stimulation by isoproterenol (Iso) and fatty acids (FA) in muscular cells. Based on

in vivo data, Iso treatment induces changes in FA metabolism (24). Their mechanisms of

activation could involve as in mammals cAMP/Protein kinase A, which remains to be

demonstrated, p38 MAPK, AMP-activated protein kinase (AMPK) and PPAR transcription

factors (24, 25). Here we showed that FA controlled avUCP gene transcription using the

AMPK pathway. It could also involve PPAR! (35) since PPAR! agonist WY-14643

stimulated avUCP expression. The role (activator or inhibitor) of p38 MAPK, which can be

stimulated by FA, and to a lesser extent by Iso, remains hypothetical but the inhibition of this

kinase by SB 202190 induced a strong increase of avUCP mRNA expression and a

simultaneous AMPK activation.

102

Figure 1

Ctl

Iso+FA

Iso

FA

Aa

bc

ab

c

A A

B

C

1 h 2 h

avU

CP

/

-actin m

RN

A

0

0.5

1

1.5

2

B

bb

aa

C BCB

A

Phosphory

lation level

pAMPK /AMPK pACC /ACC

0.5

1.5

0

1

2

pACC

ACC

pAMPK

AMPK

C

c

b

aa

Phosphory

lation level

pP38 /P380

0.5

1

1.5

2

pP38

P38

103

Figure 2

Ctl

Cc

Aicar

Aicar+Cc

a

b

c c

avU

CP

/

-actin m

RN

A

0

0.5

1

1.5

2

2 h

BAa

b

c c

Phosphory

lation level

pAMPK /AMPK0

0.5

1

1.5

2

pAMPK

AMPK

104

Figure 3

SB202190

Iso+FA

+SB202190

Ctl

Iso+FA Ba

c

b b

2 h

avU

CP

/

-actin m

RN

A

0

1

2

3

4A a

b

bb

pP38 /P38

Phosphory

lation level

0

0.5

1

1.5

2

pP38

P38

C

c

b b

a

B

AB AB

A

pAMPK /AMPK

Phosphory

lation level

pACC /ACC0

1

2

3

pAMPK

AMPK

pACC

ACC

105

Figure 4

Ctl

WY14643A

2 h

avU

CP

/

-actin m

RN

A

0

0.5

1

1.5

2

a

b

B

avU

CP

/

-actin m

RN

A

0

0.5

1

1.5

2

0 1 2 3 4 5

Time (h)

d

c

b b

a

106

Figure 5

avUCP gene

PPAR

AMPKP38

MAPK

Iso FA

+

+

+

++

+

cAMP / PKA

pathway

?

FA

metabolism

Iso

107

Principaux résultats présentés dans la publication

Effet de l’isoprotérénol et des acides gras sur l’expression du messager d’avUCP

La stimulation par l’isoprotérénol entraine une hausse de l’expression de l’ARNm d’avUCP

de 67 % au bout de 1 heure (P < 0,001 par rapport aux témoins) et de 21 % au bout de

2 heures (P = 0,002 par rapport aux témoins). L’ajout d’acides gras tend à augmenter

l’expression de l’ARNm d’avUCP de 34 % au bout de 1 heure (P = 0,051 par rapport aux

témoins) et augmente de manière significative au bout de 2 heures de 54 % (P < 0,001 par

rapport aux témoins). L’ajout simultané d’isoprotérénol et d’acides gras ne met pas en

évidence d’effet additionnel ou synergique des deux stimulateurs.

Effet de l’isoprotérénol et des acides gras, après 20 minutes, sur les voies de signalisation

potentiellement impliquées

L’AMPK ne présente pas de phosphorylation plus forte après stimulation par l’isoprotérénol,

mais seulement après ajout d’acides gras dans le milieu (P < 0,001 par rapport aux témoins).

La phosphorylation de p38 MAPK est augmentée par l’isoprotérénol (P < 0,05 par rapport

aux témoins) et de manière plus forte par l’ajout d’acides gras (P < 0,001). Les cellules

stimulées simultanément par l’isoprotérénol et l’ajout d’acides gras présentent des

modifications des phosphorylations de l’AMPK et de la p38 MAPK de même amplitude que

les cellules stimulées par les acides gras seuls.

Effet de l’activation de l’AMPK sur l’expression de l’ARNm d’avUCP

Pour étudier l’implication de l’AMPK, du 5-aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside

(AICAR) a été utilisé pour stimuler l’activation de la kinase. Après 2 heures de stimulation,

l’AICAR augmente l’expression de l’ARNm d’avUCP (P < 0,001 par rapport aux témoins).

L’ajout de Compound C, inhibiteur de l’activation de l’AMPK par l’AICAR, limite en partie

la hausse de l’expression de l’ARNm d’avUCP induite par l’AICAR (P = 0,007 par rapport

aux cellules « AICAR »).

Effet de l’inhibition de la p38 MAPK sur l’expression de l’ARNm d’avUCP

La p38 MAPK a été inhibée, après stimulation par l’isoprotérénol et les acides gras, par ajout

de SB202190, un inhibiteur spécifique de la p38 MAPK. Cette inhibition augmente très

fortement l’expression de l’ARNm d’avUCP au bout de 2 heures (P < 0,001 par rapport aux

témoins). L’utilisation de l’inhibiteur seul augmente également l’expression de l’ARNm

108

Niv

ea

u d

e p

ho

sp

hory

latio

n

ab

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6témoin

Iso+AG

IsoAG

b

aba

pCREB / CREB

Figure 24 : Niveau de phosphorylation du facteur de transcription CREB dans les

myoblastes de poussins en culture primaire, après stimulation par l’isoprotérénol et/ou

ajout d’acides gras

Les niveaux de phosphorylation de la sérine 133 de la protéine CREB, issus de 5 expériences

indépendantes, ont été déterminés par Western blot. Les valeurs ont été rapportées à la

moyenne des témoins. Les lettres a, b, c désignent des différences significatives.

AG : supplément d’acides gras ; CREB : cAMP response elements binding protein ;

Iso : isoprotérénol ; Iso+AG : stimulation simultanée par l’isoprotérénol et les acides gras.

109

d’avUCP (P < 0,001 par rapport aux témoins). On peut noter que la phosphorylation de

l’AMPK présente les mêmes variations que l’expression de l’ARNm d’avUCP dans ces deux

types de stimulations.

Effet de l’agoniste PPAR! WY14-643 sur l’expression de l’ARNm d’avUCP

Au bout de 2 heures, l’ajout de l’agoniste PPAR! WY14-643 augmente l’expression de

l’ARNm d’avUCP (P < 0,001 par rapport aux témoins). L’augmentation de l’expression de

l’ARNm d’avUCP par le WY14-643 n’a pas atteint son maximum au bout de 5 heures,

contrairement à celles de l’isoprotérénol et/ou des acides gras qui chutent à partir de 3 heures

de stimulation (données non publiées).

Résultats complémentaires

Effet de l’isoprotérénol et des acides gras sur la phosphorylation de CREB

La phosphorylation de CREB après 20 minutes de stimulation par l’isoprotérénol et/ou les

acides gras a été déterminée par Western blot (Figure 24). L’isoprotérénol tend à augmenter la

phosphorylation de CREB (P = 0,08 par rapport aux témoins). L’ajout d’acides gras, en

complément de l’isoprotérénol, augmente significativement la phosphorylation de CREB

(P = 0,04 par rapport aux témoins). Ce faible niveau ou défaut de significativité peut

s’expliquer par un manque de spécificité de l’anticorps anti-phospho-CREB sur ce modèle

cellulaire, ce qui induit une quantification imprécise de l’intensité des bandes sur membrane.

Effet de l’isoprotérénol et des acides gras sur l’expression des ARNm des facteurs de

transcription PPAR et PGC-1!

L’isoprotérénol et/ou l’ajout d’acides gras ne présentent pas d’effets significatifs sur

l’expression des messagers de PPAR! et PGC-1! (Figure 25). Cependant, l’expression de

l’ARNm de PPAR /" est sensible à ces stimulations. Au bout de 1 heure, l’ajout d’acides

gras, seul ou avec de l’isoprotérénol, a un effet stimulateur sur l’expression du messager

(respectivement P = 0,002 et P < 0,001 par rapport aux témoins). Après 2 heures de

stimulation, l’ajout d’acides gras, seul ou avec de l’isoprotérénol, présente toujours une

augmentation significative (P < 0,001 par rapport aux témoins). De plus, l’isoprotérénol

stimule l’expression de l’ARNm d’avUCP après ce délai de 2 heures (P = 0,02 par rapport

aux témoins).

109

témoin

Iso+AG

Iso

AG

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

AR

Nm

PG

C-1

/

-actin

e

1 heure 2 heures

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4A

RN

m P

PA

R

/

-actin

e

1 heure 2 heures

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

AR

Nm

PP

AR!

/"/

-actin

e

1 heure 2 heures

bb

aa

DC

A

B

Figure 25 : Expression des ARNm des facteurs de transcription PPAR , PPAR /! et

PGC-1" dans les myoblastes de poussins en culture primaire, après stimulation par

l’isoprotérénol et/ou ajout d’acides gras

Les expressions des l’ARNm de PPAR , PPAR!/" et PGC-1 , issus de 5 exprériences

indépendantes, ont été mesurées par RT-qPCR. Les niveaux d’expression sont normalisés par

l’ARNm de la !-actine et sont rapportées à la moyenne des témoins. Les lettres a, b, c, et A,

B, C, D désignent des différences significatives.

AG : supplément d’acides gras ; Iso : isoprotérénol ; Iso+AG : stimulation simultanée par

l’isoprotérénol et les acides gras ; PGC-1 : PPAR! coactivator-1 ; PPAR : peroxisome

proloferator-activated receptor.

110

2. Etude du rôle d’avUCP en fonction du type contractile et métabolique

de muscle

Les résultats présentés dans cette partie seront développés dans la publication

suivante :

Publication N°3 : Is the avian uncoupling protein expression related to potential H2O2

generation in isolated subsarcolemmal mitochondria from contrasted muscles in

chicken?

Romain Joubert, Cécile Berri, Marie Damon, Annie Vincent, Pascal Chartrin, Masaaki

Toyomizu, Ludivine Mur, Sandrine Skiba-Cassy, Louis Lefaucheur, Michel Jacuqes Duclos,

Patrick Herpin, Sophie Tesseraud, Anne Collin.

111

Publication N°3 : Is the avian uncoupling protein expression related to potential H2O2

generation in isolated subsarcolemmal mitochondria from contrasted muscles in

chicken?

L’expression de la protéine découplante aviaire est-elle associée au potentiel de production

d’H2O2 dans les mitochondries subsarcolemmales de différents muscles de poulet ?

Résumé

La protéine découplante aviaire (avUCP), orthologue de la protéine découplante

mammalienne UCP3, est exprimée majoritairement dans le muscle squelettique. Cependant,

on ne sait pas si l’expression d’avUCP est dépendante du type de fibres musculaires et de la

production potentielle de H2O2, comme c’est le cas chez les mammifères. Ainsi, cette étude a

pour but de mesurer l’expression d’avUCP dans un large panel de muscles squelettiques et

d’explorer les liens potentiels avec les fonctions mitochondriales dans trois muscles

sélectionnés pour leurs types contractiles et métaboliques contrastés : la partie blanche lente

oxydative du muscle Adductor superficialis (ASW), le muscle mixte oxydo-glycolytique

Adductor profundus (AP) et le muscle rapide glycolytique Pectoralis major (PM).

Le messager d’avUCP est fortement exprimé dans les muscles rapides et mixtes de

types glycolytiques ou oxydo-glycolytiques et très peu dans les muscles lents oxydatifs.

Cependant, dans les mitochondries subsarcolemmales isolées du muscle ASW, respirant à un

niveau plus faible que celles des muscles AP et PM à l’état IV, nous avons mis en évidence

un fort potentiel de production de H2O2, et un découplage stimulable par le HNE et inhibable

par le GDP. Ces résultats ne permettent pas d’associer directement le potentiel de production

de H2O2 à une expression et un découplage plus ou moins fort lié à avUCP. Néanmoins, ces

données pourraient concorder avec l’hypothèse d’une action d’avUCP dans la régulation de la

glycolyse et du cycle de Krebs dans les muscles utilisant principalement le glucose comme

substrat énergétique.

112

Publication N°3

Is the avian uncoupling protein expression related to potential

H2O2 generation in isolated subsarcolemmal mitochondria from

contrasted muscles in chicken?

Manuscrit en préparation, 2009

113

Manuscrit en préparation

Is the avian uncoupling protein expression related to potential H2O2

generation in isolated subsarcolemmal mitochondria from contrasted

muscles in chicken?

R. Joubert1, C. Berri

1, M. Damon

2,3, A. Vincent

2,3, P. Chartrin

1, M. Toyomizu

4, L. Mur

1,

S. Skiba-Cassy5, L. Lefaucheur

2,3, M.J. Duclos

1, P. Herpin

6, S. Tesseraud

1, A. Collin

1

1INRA, UR83 Recherches Avicoles, F-37380 Nouzilly, France.

2INRA, UMR1079 Systèmes d’Elevage, Nutrition Animale et Humaine, F-35590 Saint-Gilles,

France.

3Agrocampus Ouest, UMR1079 Systèmes d’Elevage Nutrition Animale et Humaine, F-35000

Rennes, France.

4 Nutritional Biochemistry of Animals, Life Sciences, Graduate School of Agricultural

Science, Tohoku Univ., 1-1 Tsutsumidori-Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai 981-8555, Japan.

5INRA, UMR1067 Nutrition Aquaculture et Génomique, F-64310 Saint-Pée-sur-Nivelle,

France.

6INRA, Direction Scientifique Animal et Produits Animaux, F-35590 Saint-Gilles, France.

Short title: Expression of avUCP depends on muscle type in chicken

114

Abstract :

The avian uncoupling protein (avUCP), orthologous to the mammalian uncoupling

protein UCP3, is predominantly expressed in muscle. However, it is not known whether its

expression is dependant on muscle fibre type and potential to H2O2 release as it is the case in

mammals. Therefore the present experiment aimed at measuring the expression of avUCP in a

wide range of skeletal muscles and to explore the potential links to mitochondrial function in

three muscles selected for their contrasted contractile and metabolic types: the slow-twitch

oxidative white part of the Adductor superficialis (ASW), the mixed type oxido-glycolytic

Adductor profundus (AP) and the fast-twitch glycolytic Pectoralis major (PM). The

messenger of avUCP was highly expressed in fast-twitch glycolytic and mixed type oxido-

glycolytic muscles and poorly expressed in slow oxidative muscles. However, isolated

subsarcolemmal mitochondria from ASW muscle, that respired at a lower rate than those of

AP and PM muscle at state IV, were characterized by a high potential to generate H2O2 and

by a HNE-stimulated, GDP-inhibited uncoupling. Present results do not allow to directly

associating the potential for H2O2 production to high or low avUCP expressions and

uncoupling. They are consistent with the recently proposed hypothesis of an involvement of

avUCP in regulating glycolysis and TCA cycle in muscles predominantly using glucose as

fuel substrate.

Keywords: avUCP, muscle, oxidation, glycolysis, uncoupling

115

1. Introduction

Several proteins belonging to the UCP family have been described, mainly UCP1 [1],

involved in thermogenesis by mitochondrial uncoupling, UCP2 [2] and UCP3 [3] in

mammals, and avian UCP (avUCP) in birds [4]. UCP3 is primarily expressed in skeletal

muscle, a tissue which accounts for a large part of metabolic rate [5]. UCP3 has first been

proposed to be responsible for a part of basal proton conductance. However, studies using

UCP3 knock-out mice did not confirm the hypothesis of a major involvement of this protein

in cold-induced thermogenesis or mitochondrial proton conductance [6-9]. Due to its strong

overexpression during fasting or endurance exercise, UCP3 was rather suggested to play a

role in the limitation of mitochondrial lipotoxicity by exporting fatty acid anions and/or

fatty

acid peroxides [8,10,11]. Recent studies in rat muscle fibres showed that UCP3 was more

expressed in white (glycolytic) than in red (oxidative) gastrocnemius muscles [12]. In relation

to the higher potential to generate H2O2 of type IIB glycolytic fibres, the greater induction of

UCP3 in glycolytic muscles could be a compensatory mechanism to attenuate the emission of

reactive oxygen species (ROS) when fatty acid metabolism is stimulated [13]. In birds, the

predominantly muscular avUCP [4] has recently been shown to be the avian ortholog of the

mammalian UCP3 [14,15]. AvUCP expression was described to be increased by a high-

fat/low-protein diet, and also to be higher in a fat than in a lean line of chickens [16,17].

Crisculolo et al. [18] reported a low involvement of this protein in mitochondrial proton

conductance, except in case of stimulation by retinoic acid. As for mammalian UCP3, this

protein could limit ROS production [18,19], but it was also suggested to be involved in

pyruvate transport [20] and cold- or diet-induced thermogenesis [4,21-25]. Cold acclimation

of chickens induced an increase in avUCP expression associated with changes in the

metabolic properties of the fast-twitch glycolytic Pectoralis major muscle towards oxidative

116

metabolism [26]. Furthermore, avUCP expression was described to be under the control of

glucagon, thyroid hormones and !-adrenergic pathway stimulating lipolysis in birds [4,27,28].

Altogether these data suggest that avUCP could be linked to the metabolic and/or contractile

properties of skeletal muscles.

There are some discrepancies regarding muscle fibre types between avian and

mammalian species [29-31]. Indeed, there are very few totally-slow type oxidative muscles in

chickens, and these muscles are generally characterized by a specific slow tonic fibre type. In

fast muscles, fibre contractile typology cannot simply be related to myosin expression, and

developmental isoforms (embryonic or neonatal) can later reappear. Only a few of fast

muscles, among which the Pectoralis major, finally express the adult fast isoform of myosin

heavy chain (MyHC). Furthermore, in birds, it is not known whether avUCP expression is

associated or not with the contractile and metabolic properties of muscle, including H2O2

release potential. The present study aimed at determining the expression of avUCP in a wide

range of skeletal muscles characterized by their contractile properties in the chicken. In

isolated mitochondria of three muscles chosen for their contrasted contractile and metabolic

properties, we explored O2 consumption, uncoupling and H2O2 generation in relation to

levels of avUCP expression.

2. Materials and methods

In a first part of the study, the expression of avUCP was assessed in a wide range of

chicken skeletal muscles that we characterized for their content in MyHC isoforms. In a

second part, the study focused on three muscles, diverging for their metabolism and typing, to

further characterize metabolism and mitochondrial functioning potentially associated to

avUCP activity.

117

2.1. Muscle sampling

To study the pattern of avUCP expression in relation to muscle fibre type, 8 muscles or

muscle parts were removed from 6 male chickens raised until 9 wk of age in an

environmentally-controlled poultry house. After chicken decapitation, muscles were excised

and snap frozen until further RNA extraction The muscles considered for the study were 1)

the fast-twitch glycolyic Pectoralis major (PM) and Posterior Latissimus dorsi (PLD), 2) the

fast oxido-glycolytic Iliotibialis (ILIO), 3) the mixed-type oxido-glycolytic Sartorius

(SART), Adductor profundus (AP, relative to the median axis of the chicken) and red part of

the Adductor superficialis (ASR), and 4) the slow oxidative Anterior Latissimus dorsi (ALD)

and white part of the Adductor superficialis (ASW) [29-32].

To further characterize metabolism and mitochondrial functioning associated to avUCP

expression, 7 male Ross chickens were raised as described above and killed by decapitation (1

chicken per day) between 4 and 5 weeks of age. For four of them, the fast-twitch glycolytic

PM, the oxido-glycolytic mixed type AP, and the slow-twitch oxidative ASW muscles were

excised, while in the three other chickens only PM and ASW muscles were excised. For each

muscle, a sample was immediately snap-frozen for mRNA extraction and measurement of

enzyme activities. A sample was also rapidly frozen in isopentane cooled with liquid nitrogen

and then stored at -80°C until histological analysis. The resting tissue was rapidly immerged

in an appropriate ice-cold buffer (see below) for mitochondrial extraction. We also used

muscle samples originated from one chicken and immerged in ice-cold fixative buffer for

further electronic microscopy analysis.

All experiments were carried out with due regard to legislation governing the ethical

treatment of animals and investigators were certified by French government to carry out

animal experiments (Certificate number 37-105).

118

2.2. RNA isolation, reverse transcription and RT-PCR

Total RNA was extracted from muscle samples using RNA Now (Biogentec, Seabrook,

TX, USA) according to the manufacturer’s recommendations. After DNAse treatment

(Ambion, Clinisciences, Montrouge, France), RNA was reverse-transcribed using Super

Script II RNase H Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in the presence of

Random Primers (Promega, Charbonnieres-les-Bains, France) as previously described [33].

The expression levels of avUCP, of the avian adenine nucleotide transferase (avANT),

potentially involved in mitochondrial uncoupling, and of the main isoforms of chicken MyHC

were determined by real-time polymerase chain reaction (PCR). These reactions were

performed using an ABI Prism 7000 apparatus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

with primers specifically designed and validated (Table 1). The level of 18S ribosomal RNA

(18S rRNA), chosen as the reference gene, was determined using the Pre-developed TaqMan

Ribosomal RNA control kit (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) according to the

manufacturer’s recommendations. Messenger RNA levels were estimated on the basis of PCR

efficiency and threshold cycle (Ct) deviation of an unknown sample versus a reference

sample. Runs were performed in duplicates.

2.3. Fibre type and mitochondria characterisation

The muscle fibre ATPase activity at pH 4.1 was determined on 10-µm-thick cross-

sections as described by Rémignon et al. [34]. The myosin contents of fibres were further

determined by using monoclonal antibodies against the three major avian Myosin Heavy

Chain fast isoforms (MyHC adult, neonatal and embryonic 3) and the Myosin Light Chain

slow 1 isoform (MyLC1s). Antibodies (AB8, 2E9, EB165, S21) were purchased at the

Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, University of Iowa, IA) and revealed with

119

the peroxidase activity using the Vectastain Elite ABC system (Vector Lab, AbCys, Paris,

France).

For electron microscopic examination, PM, ASW and AP muscle samples were

carefully removed and placed in ice-cold fixative buffer (4% glutaraldehyde in 0.1 M sodium

cacodylate buffer) for 24 h. The specimens were washed three times in 0.1 M sodium

cacodylate buffer and postfixed (2% OsO4 in 0.1 M sodium cacodylate buffer) for 2 h at

20°C. Samples were washed once in 0.1 M sodium cacodylate buffer and twice in ultrapure

water. The fixed pellets were dehydrated in graded ethanol steps, washed with propylene

oxide for 10 min and embedded within successive bathings in Epon resin and propylene

oxide. Ultrathin 70 nm thick sections for electron microscopy were stained with uranyle

acetate 5% and 0.4% lead citrate solution (in NaOH 0.1N) and examined by a CM 10 electron

microscope (Philips, Eindhoven, Netherlands). Transmission electron micrographs were

obtained at magnifications of ×5,800. Average numbers of mitochondria and area covered by

mitochondria were then calculated on 5 micrographs per muscle.

2.4. Measurement of "-hydroxyacyl CoA dehydrogenase (HAD), citrate synthase (CS) and

lactate dehydrogenase (LDH) activities in muscle

Samples were thawed and homogenised in ice-cold phosphate buffer using an ultra-

homogeniser (Ultraturrax, Ilka-Verke, Staufen, Germany). The homogenates were sonicated

for 2 min at 8.5 – 8.8 Watts and centrifuged (1500g, 10 min., 4°C) before collecting the

supernatant. The activities of HAD, CS and LDH, classically used to characterise the

oxidative and glycolytic potentials of muscles, were determined at 30°C using the

spectrophotometric method of Bass et al. [35].

120

2.5. Isolation of mitochondria

Muscle subsarcolemmal mitochondria were isolated from PM, AP and ASW muscles.

Muscles were trimmed of fat and connective tissue, weighed and minced with scissors. The

minced tissue was suspended in ice-cold buffer A (containing 100 mM sucrose, 100 mM KCl,

50 mM Tris base, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 1mM ATP, pH 7.4 at 0°C) and homogenised

with a Potter-Elvehjem homogeniser (4 passages). The homogenate was centrifuged at

800 × g for 10 min. The supernatant was centrifuged at 1000 × g for 10 min and then 8700 × g

for 10 min. The resulting pellet containing subsarcolemmal mitochondria was suspended in

buffer A and centrifuged at 8700 × g for 10 min, then suspended in buffer B (containing

250 mM sucrose, 1 mM EGTA and 20 mM Tris base, pH 7.4 at 0°C) and washed by

centrifugation at 8700 × g for 10 min. The final mitochondrial pellet was suspended in a

minimal volume of buffer B and kept on ice. Rapid determination of protein concentrations

was realised using a the Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, USA) and validated

afterwards by the bicinchoninic acid method (Uptima, Interchim, Montluçon, France).

2.6. AvUCP protein quantification

Subsarcolemmal mitochondria extracted from frozen PM, ADP and ADSW muscles

were subjected to SDS-PAGE gel electrophoresis and Western blotting using an anti-avUCP

antibody previously used in our laboratory [28]. After washing, membranes were incubated

with an Alexa Fluor secondary antibody (Molecular Probes, Interchim, Montluçon, France).

Bands were visualised by infrared fluorescence using Odyssey®

Imaging System (LI-COR

Inc. Biotechnology, Lincoln, NE, USA) and quantified by Odyssey infrared imaging system

software (Application software, version 1.2).

2.7. Determination of mitochondrial respiration, membrane potential, and H2O2 production

121

Subsarcolemmal mitochondrial oxygen consumption was measured polarographically

using a 1.5-ml Clark type electrode (Oroboros, Innsbruck, Austria). A suspension of 0.25

mg/ml of muscle mitochondria was equilibrated in an air-saturated medium containing 75

mM sucrose, 30 mM KCl, 20 mM KH2PO4, 6 mM MgCl2, 1 mM EDTA (pH 7.4).

Measurements were conducted at 25°C in the presence of 5 mM malate and 5 mM pyruvate as

substrates of the respiratory chain. At state IV (basal respiration induced by 10 #M

oligomycin blocking ATP synthase), 100 µM 4-hydroxynonenal (HNE) was added to activate

UCP [7] in the presence of 0.2% fatty acid-free BSA. To evaluate the potential contribution of

avUCP in mitochondrial respiration, measurements were then performed in the presence of

2.5 mM guanosine diphosphate (GDP), previously suggested being an avUCP inhibitor after

superoxide-induced activation [25].

Semi-quantitative evaluation of membrane potential was assessed using safranin O

uptake measurements [26]. Briefly, mitochondria were resuspended at a final concentration of

1.3 mg/ml in respiration buffer (pH 7.4) containing 12 µM safranin O. Hence, the

safranin/protein ratio lied within the experimental range validated by Holden and Sze [36] and

used by Ueda et al. [26]. Fluorescence was determined at 485-nm excitation, 586-nm

emission at 37°C using a Gemini EM Spectromax fluorometer (Molecular Devices,

Sunnyvale, CA). Measurements were successively done in the respiration buffer

supplemented with pyruvate and malate (5 mM each) as respiratory substrates and 10 µM

oligomycin to induce respiratory state IV, after adding 1) mitochondria, 2) 100 µM HNE and

3) 2.5 mM GDP. Average changes in net safranin O uptake in each muscle were calculated as

differences of fluorescence between samples and a reference sample without mitochondria.

They were expressed per second during the period of observation and per mg of protein in the

sample.

122

Amplex Red© (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was used to measure H2O2 released

from mitochondria isolated from the different muscles. This fluorescent dye reacts with H2O2

in the presence of horseradish peroxidase, producing highly fluorescent resorufin. Horseradish

peroxidase (0.5 U/ml) and Amplex red reagent (5 µM) were added to the assay medium

(respiration medium containing 10 µM oligomycine) and then mitochondria (1.5 mg/ml) were

applied. H2O2 formation was initiated by addition of pyruvate and malate (5 mM each) and

fluorescence was detected at 37 °C by using a Gemini EM Spectromax (Molecular Devices,

Sunnyvale, CA) fluorometer. The excitation and emission fluorescent wavelengths were 560

and 590 nm, respectively. The calibration signal was produced by successive additions of

known amounts of H2O2 during each experiment. At state IV induced by 10 #M oligomycin,

100 µM HNE was added to activate UCP in the presence of 0.2% fatty acid-free BSA.

Measurements were then performed in the presence of 2.5 mM GDP. At state IV, % free

radical leak (FRL) was calculated as the rate of H2O2 production (in percent) divided by two

times the rate of O2 consumption to account for the fraction of electrons out of sequence

reducing O2 to H2O2 at the respiratory chain instead of reaching cytochrome oxidase to

reduce O2 to water [13;37]. Citrate synthase activity of mitochondria [35] was also measured

as described in §2.4 to express H2O2 production (pmol H2O2/mg protein/min) relative to

oxidative capacities of mitochondria.

2.8. Statistical analyses

Variance of avUCP/18S, avANT/18S and MyHC isoforms/18S contents being

heterogeneous among muscles, statistical analysis for gene expressions determined in 8

muscles was performed using non parametric Kruskal-Wallis test, followed by Mann-Whitney

comparisons (Statview Software program; SAS Institute, Cary, NC). Correlation coefficients

between messenger expressions were calculated, followed by a Fisher test. For the study on

123

the three selected muscles, data were analysed by ANOVA followed by a test of Student-

Newman-Keuls to detect significant differences between muscles and, where necessary,

muscles × state, except for state IV H2O2 production (reported to CS activity) that did not

present homogeneous variance. The use of safranine O did not allow comparing uncoupling

between muscles. However, for each muscle, differences in fluorescence between stimulation

states were compared by ANOVA followed by Student-Newman-Keuls test. P-values under

0.05 were considered statistically significant.

3. Results

3.1. AvUCP and avANT expressions in relation to MyHC in 8 different chicken muscles

The different chicken muscles studied were characterised by widely differing levels of

MyHC isoforms mRNA. The PM muscle expressed a dramatically higher MyHCadult than

that observed in other muscles: it was 5-fold higher than in other fast-twitch PLD and ILIO

muscles and at least 20-fold higher than in mixed-type (SART, AP, ASR) and slow-twitch

(ASW, ALD) muscles (P < 0.001; Figure 1A). The embryonic 3 MyHC isoform

(MyHCemb3) was expressed in all fast and mixed-type muscles, the PLD muscle containing

however around twice more of this form than the other fast (PM and ILIO) and mixed-type

(SART, ASR and AP) muscles (Figure 1B). The level of MyHCemb3 mRNA was very low in

the slow-twitch muscles ALD and ASW. The fast MyHC neonatal form (MyHCneo) was

preferentially expressed in the fast-twitch ILIO muscle (figure 1C). Finally, the slow 2 MyHC

isoform was predominantly expressed in the ALD and AS (especially the white part) muscles.

The expression of the MyHCs2 was particularly low in fast-twitch PM, ILIO and PLD

muscles as well as in AP mixed-type muscle (Figure 1D).

The relative mRNA expression of avUCP was between 8- to 16-fold higher in fast-

124

twitch glycolytic and mixed-type muscles than in slow-twitch oxidative muscles (Figure 1E).

Correlations were calculated between the expression of avUCP and that of the different

MyHC isoforms. Avian UCP was strongly positively correlated to the fast MyHCneo (r =

0.67; P < 0.001), MyHCadult (r = 0.48; P < 0.001) and MyHCemb3 (r = 0.43; P < 0.01),

while negatively correlated to the slow MyHCs2 isoform (r = -0.58; P < 0.001). Avian ANT

being susceptible to be involved in mitochondrial uncoupling [25], we measured its mRNA

level in all 8 muscles. No difference between muscles was observed concerning the level of

this messenger (data not shown).

3.2. Metabolism, mitochondrial characteristics and respiration properties of muscles in

relation to their avUCP expression profiles

To further address the role of avUCP in energy metabolism, we focused our study on

three muscles diverging for their contractile and metabolic properties and avUCP expression.

In accordance with mRNA levels reported in Figure 1 for the different MyHC isoform, ASW

muscle contained a unique type of fibres expressing mainly slow MyLC1s isoform, for which

ATPase activity is stable in acidic conditions (Figure 2A). AP muscle was characterized by a

mixed contractile type of fibres expressing either adult or embryonic 3 fast MyHC (Figures

2B and 2C). Immunostaining did not reveal fibres expressing slow MyLC1s and very few

showed ATPase activity stable in acidic conditions in AP muscle (Figure 2D). As expected,

PM muscle contained a unique type of fibres expressing predominately the adult form of fast

MyHC. In accordance with their slow-twitch contractile properties, the activity of the

glycolytic LDH enzyme was 18- and 50-fold lower (P < 0.001; Figure 3A) in ASW than in

AP and PM muscles, respectively. By contrast, the activities of both oxidative CS (Figure 3B)

and HAD (Figure 3C) enzymes were approximately 4-fold higher in ASW and AP than in PM

muscle. Electronic microscopy showed also major differences in mitochondrial contents of

125

ASW, AP and PM muscles (Figure 4 and Table 2). The oxidative AP and ASW muscles

presented 3.3 and 2.5-fold higher numbers of mitochondria than the PM muscle, respectively

(P < 0.05). Besides, the area covered by mitochondria in AP muscle was 2- and 4-fold higher

than that of ASW and PM muscles, respectively. Finally, at the protein level the avUCP

contents were respectively 75 and 68% higher in the fast-twitch PM and AP muscles than in

the slow-twitch ASW muscle (P < 0.001; Figure 5).

3.3. Mitochondrial respiration, uncoupling and H2O2 release

Mitochondria from AP respired at higher rate than PM muscle, while ASW presented

the lowest O2 consumption, whatever the state considered (P < 0.001; Figure 6). In all

muscles, HNE increased state IV mitochondrial respiration, by 400% in ASW muscle and

only by approximately 200% in AP and PM muscles. In pmol/sec/mg protein, these increases

were not different between muscles. Addition of 2.5 mM GDP did not decrease O2

consumption after HNE stimulation in any of the muscles considered.

Uncoupling as estimated by safranin O incorporation was significantly influenced by

the stimulation state in each muscle considered (Figure 7; P < 0.001). In all three muscles,

uncoupling was significantly increased in mitochondria by HNE addition, but GDP

significantly decreased uncoupling only in ASW muscle (P < 0.05).

Finally, mitochondrial H2O2 release was not affected by HNE or GDP addition in any

of the muscles considered (data not shown). At state IV, when reported to mitochondrial CS

activity, H2O2 release was higher in PM and ASW muscles than in ADP muscle (Figure 8A;

P < 0.05). Free radical leak was higher in ASW muscle than in AP and PM muscles (Figure

8B; P < 0.01).

4. Discussion

126

The present study allowed characterising for the first time the expression pattern of

avUCP in a large panel of muscles, exhibiting contrasted contractile properties as shown by

patterns of MyHC isoforms. This panel of muscles included two fast-twitch glycolytic

muscles expressing high amounts of adult and embryonic 3 isoforms of fast MyHC (PM and

PLD), one fast-twitch oxido-glycolytic muscle expressing specifically the neonatal isoform,

and at a lesser extent embryonic 3 and adult isoforms (ILIO), three mixed-type oxido-

glycolytic muscles with various levels of slow as well as embryonic 3, neonatal and adult fast

isoforms of MyHC (SART, AP, ASR) and finally two slow oxidative muscles expressing

predominantly the slow 2 MyHC isoform (ASW and ALD). In agreement with results

obtained in mammals [12,38] on muscles containing different fibre types, we report

dramatically lower avUCP mRNA levels in slow oxidative muscles than in mixed-type or

fast-twitch muscles. For analysing the potential incidence of such expressional differences in

mitochondrial function, we next focused on three muscles, the PM, AP and ASW,

representative of different contractile and metabolic types. Their contractile types were

confirmed by histology by using monoclonal antibodies directed against the different avian

MyHC isoforms and by revealing ATPase activity after acid preincubation. In accordance

with its slow-twitch contractile type [32], the ASW muscle showed a more oxidative

metabolism but also a lower level of avUCP than the fast-twitch PM and AP muscles. By

comparison to PM, AP muscle exhibited both lower glycolytic and higher oxidative enzyme

activities, and can be referred as oxido-glycolytic muscle. Despite the contractile and

metabolic differences between these muscles, their avUCP contents were similar. This could

suggest that avUCP content partly depends on the contractile properties of muscles. High

positive correlations between expressions of fast MyHC isoforms and avUCP mRNA also

accredit a link between muscle contractile properties and avUCP.

127

To explore the incidence of such differences in avUCP content on mitochondrial

function, we measured O2 consumption, mitochondrial uncoupling and H2O2 generation in

isolated subsarcolemmal mitochondria from ASW, AP and PM muscles. Surprisingly enough,

state IV oxygen consumptions were different depending on the muscle considered. Whereas

in mammals malate-pyruvate supported State IV O2 consumption is usually not different in

red and white muscle types [39-41], in chicken isolated mitochondria this parameter was

graduated as followed: ASW<PM<AP. The highest state IV O2 consumption obtained in AP

subsarcolemmal mitochondria was probably representative of a higher metabolic potential of

this muscle, as also suggested by both intermediary LDH and high CS and HAD activities,

and particularly high area covered by mitochondria in AP muscle as observed using electronic

microscopy. The lower O2 consumption recorded in the presence of oligomycine (inhibiting

ATP synthesis) could be linked to a lower proton leak peculiar in mitochondria from ASW

muscle, for which we can hypothesize that a low avUCP contributes.

Addition of hydroxynonenal stimulated state IV respiration and induced uncoupling in

isolated subsarcolemmal mitochondria from all muscles considered. This finding is in

accordance with results from Echtay et al. [7] suggesting HNE-dependant UCP and

uncoupling stimulation in mammals. However, subsequent GDP addition did not exert any

effect on O2 consumption. Furthermore, safranine O uptake measurements only revealed

GDP-inhibited uncoupling in ASW, the muscle containing the lowest avUCP mRNA and

protein contents. A lack of GDP effect on proton conductance was described by Criscuolo et

al. [18] in mitochondria of yeast overexpressing avUCP, whereas Talbot et al. [42] reported a

GDP-sensitive component of superoxide-activated proton conductance, but not of basal

proton conductance in king penguin pectoral muscle mitochondria. It is now recognised that

HNE-stimulation can be partly attributed to the activity of adenine nucleotide transferase

(ANT) [7,43], and one can hypothesize that muscle-specific ANT expressions or activities

128

could account for a part of HNE-stimulated respiration and uncoupling observed in our study.

In the present experiment, no difference in ANT mRNA contents as measured by real-time

PCR was observed between muscles. Altogether these data suggest that the differences in

avUCP content between ASW, AP and PM muscles may not exert a major impact on

mitochondrial basal respiration and uncoupling activity.

Avian UCP is reported to be involved in the prevention of free radical damage in birds

[18,19,44,45]. Therefore in the present study we measured H2O2 production in mitochondria

from ASW, AP and PM muscles to exhibit potential links with muscle avUCP content. State

IV malate/pyruvate-supported free radical leak was higher in mitochondria from ASW muscle

(slow oxidative fibres) expressing low avUCP content than in AP (mixed-type muscle) and

PM (type IIb fibres) muscles expressing high avUCP content. This partly contradicts results

obtained in rat by Anderson and Neufer [13] who showed higher free radical leak in

permeabilised type IIb glycolytic fibres than in type I oxidative or type IIa oxido-glycolytic

fibres. Lower H2O2 release reported to CS activity was also found in type I permeabilised

fibres than type IIb fibres in rabbit (Damon M. et al., personal communication). When

adjusted for the mitochondrial metabolic capacity by calculating the ratio of state IV H2O2

generation and mitochondrial CS activity, we found higher potential for H2O2 generation in

slow oxidative and fast glycolytic muscles than in the mixed-type muscle. This could indicate

that, in birds, totally slow oxidative muscles might exhibit at least as high potential for H2O2

mitochondrial production as fast glycolytic fibres. The discrepancies observed between

studies in mammals and birds could be partly due to peculiarities of chicken slow oxidative

muscles. However, the biological material used in our study, i.e. isolated subsarcolemmal

mitochondria, might be less representative of muscle physiology than permeabilised fibres

that contain both subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria in a relatively preserved

biochemical environment.

129

It has been suggested that high UCP3 expression observed in fast glycolytic IIb fibres

could contribute to limit ROS generation in fibres with high potential for H2O2 generation

when fatty acid utilisation is stimulated [12]. Yet present results together with the lack of

effect of HNE or GDP on H2O2 production in any of the muscles considered, questions about

the potential links between H2O2 production and high or low avUCP expressions or

mitochondrial uncoupling. A default in avUCP expression in mitochondria of ASW muscle

could be linked to its high potential for H2O2 production, if we consider that this protein is

involved in anti-oxidant defense [18,19,45]. Interestingly, we observed higher avUCP

amounts in muscles mainly relying on glucose as fuel substrate, PM being predominantly

anaerobic and AP being able to switch between aerobic and anaerobic metabolism than in

oxidative muscle. Therefore, our results are quite consistent with the hypothesis of Criscuolo

et al. [20] proposing the involvement of UCP3 and avUCP in glucose metabolism, especially

in pyruvate utilisation. The higher avUCP expression in oxido-glycolytic and glycolytic

muscles as compared to the oxidative ASW could favour the transport of pyruvate out of

mitochondria to regulate TCA cycle and glycolysis in these muscles predominantly using

glucose as fuel substrate.

In conclusion, the present study showed that avUCP mRNA is differently expressed

according to the metabolic and contractile type of the muscle considered. Present data do not

support a strong involvement of avUCP in uncoupling while its links to H2O2 release by

isolated subsarcolemmal mitochondria might be different than what is described in

permeabilised muscle fibres of different types in mammals. Further investigation is required

to understand the characteristics of slow fibres in chickens in relation to their apparent pro-

oxidant potential and their very low avUCP content.

130

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Physiol B. [Epub ahead of print].

136

Acknowledgements

Authors gratefully thank M. Fillaut, P. Ecolan, E., M. Alix, C. Demay and F. Le Gouevec

(INRA, UMR1079 Systèmes d’Elevage Nutrition Animale et Humaine, Saint-Gilles, France),

E. Godet, S. Crochet, T. Bordeau, G. Biclot, M. Jlali and N. Millet (INRA, UR83 Recherches

Avicoles, Nouzilly, France), D. Klett (INRA, UMR85 Physiologie de la Reproduction et des

Comportements, Nouzilly, France) and B. Delaleu (Atelier de microscopie électronique;

INRA, UMR85 Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Nouzilly, France),

J.M. Brigant, H. Rigoreau and F. Mercerand (INRA, UE1295 Pôle d’Expérimentation

Avicole de Tours, Nouzilly, France) for their skilled technical assistance. E.Baeza, N. Rideau

and S. Métayer-Coustard (INRA, UR83 Recherches Avicoles, Nouzilly, France), N. Gueguen

(INSERM, U694, Angers, France), C. Duchamp (Laboratoire de Physiologie Intégrative,

Cellulaire et Moléculaire, CNRS, Université Lyon 1, Université de Lyon, Villeurbanne,

France), F. Criscuolo and F. Bouillaud (Université Paris Descartes, CNRS, UPR9078, Faculté

de Médecine, Necker Enfants Malades, Paris, France) are also thanked for scientific

discussion about avUCP. R. Joubert is a PhD student supported by a grant from INRA and

Région Centre, France. This work was supported by INRA Department Physiologie Animale

et Systèmes d’Elevage (PHASE).

137

Table 1: Primer sequences

Primer Forward Reverse

GenBank

accession number

avUCP CTACGACCTCATCAAGGACACA GAAGGCAGCCACGAAGTGA AF433170.2

avANT TATCAGCTGGATGATTGCACAGA ACGCAAAGGAGCTGATATCATGT AB088686.1

MyHCemb3 AGGAGCTGTCCAATGTCAACCTC GCAGAAGAAAGCAACAGAGGGTTC NM_001113709.1

MyHCneo AGCAGGCATTCACCCAACA ATGGCGAGCAGACTGCAAAC AB021180.1

MyHCadult CCAAATTCCGCAAGATCCAAC CTTATGCCACTTTGTTGTCACGAC M74084.1

MyHCs2 CAACCTGGTGAAGTACCGCAAG TTGAAGGTGATGACCTCCTTGG U85023.1

138

Table 2: Mitochondrial characteristics of Pectoralis major (PM), Adductor profundus (AP)

and in the white part of the Adductor superficialis (ASW) muscles. Mitochondria numbers

and areas are expressed per micrograph (195 µm2).

Muscle ASW AP PM P-value

ANOVA

Mitochondrial number 38 ± 6 a 49 ± 5 a 15 ± 2 b < 0.001

Mitochondrial area, µm2 0.319 ± 0.029 b 0.542 ± 0.027 a 0.461 ± 0.053 a < 0.01

Area covered by mitochondria, µm2 12 ± 2 b 27 ± 4 a 7 ± 2 b < 0.001

Different letters represent statistically different values (P < 0.05)

139

Figure captions

Figure 1: Messenger RNA expressions of myosin heavy chain (MyHC) isoforms and avian

uncoupling protein (avUCP) reported to the reference gene 18S rRNA expression in 8

different chicken skeletal muscles. MyHCadult, fast adult MyHC; MyHCemb3, fast

embryonic 3 MyHC; MyHCneo, fast neonatal MyHC; MyHCs2, slow 2 MyHC. Muscles

were: PM, Pectoralis major; PLD, Posterior latissimus dorsi; ILIO, Iliotibialis; SART,

Sartorius; AP, Adductor profundus; ASR, Red part of the Adductor superficialis; ASW,

White part of the Adductor Superficialis; ALD: Anterior latissimus dorsi. Different letters

represent significantly different values (P < 0.05).

Figure 2: Transversal sections of the white part of the Adductor Superficialis (ASW),

Adductor profundus (AP) and Pectoralis major (PM) muscles. A. ATPase activity after

incubation at pH = 4.10; B. Immunodetection of the adult isoform of myosin heavy chain

(MyHC); C. Immunodetection of the fast embryonic and adult MyHC; D. Immunodetection

of the slow isoform of myosin light chain MyLC1s.

Figure 3: Enzyme activities in homogenates from the Pectoralis major (PM), the Adductor

profundus (AP) and the white part of the Adductor Superficialis (ASW) muscles. LDH:

lactate dehydrogenase; CS: citrate synthase; HAD: !-hydroxyacyl dehydrogenase. Different

letters represent significantly different values (P < 0.05).

Figure 4: Cross-sections of the white part of the Adductor Superficialis (ASW), Adductor

profundus (AP) and Pectoralis major (PM) muscles by electronic microscopy. Transmission

140

electron micrographs were obtained at magnifications of ×5,800. Examples of mitochondria

are highlighted by arrows.

Figure 5: Avian uncoupling protein (avUCP) content in subsarcolemmal mitochondria from

the Pectoralis major (PM), the Adductor profundus (AP) and the white part of the Adductor

Superficialis (ASW) measured by Western blot. Different letters represent significantly

different values (P < 0.05)

Figure 6: Oxygen consumption of subsarcolemmal mitochondria from the Pectoralis major

(PM), the Adductor profundus (AP) and the white part of the Adductor Superficialis (ASW)

as measured by Clark-type electrode. Basal respiration was measured at malate/pyruvate-

supported state IV (State IV) in the presence of 10 #M oligomycin and 0.2% fatty acid-free

BSA, followed by an addition of 100 µM 4-hydroxynonenal (HNE). Measurements were

then performed in the presence of 2.5 mM guanosine diphosphate (GDP), suggested to inhibit

the avian uncoupling protein avUCP [25].

Figure 7: Evaluation of uncoupling in subsarcolemmal mitochondria from the Pectoralis

major (PM), the Adductor profundus (AP) and the white part of the Adductor Superficialis

(ASW) measured by safranin O fluorescence. Average changes in net safranin O uptake in

each muscle were calculated as differences of fluorescence between samples and a reference

sample without mitochondria, per second and per mg of protein. Fluorescence decreases when

membrane potential is high. Measurements were successively done in the respiration buffer

(containing 10µM oligomycin and 0.2% BSA), after addition of mitochondria at state IV,

subsequent addition of 100 µM 4-hydroxynonenal (HNE) and then of 2.5 mM guanosine

141

diphosphate (GDP). Different letters represent significantly different values (P < 0.05)

between successive steps within each muscle.

Figure 8: Hydrogen peroxide (H2O2) release of subsarcolemmal mitochondria from the

Pectoralis major (PM), the Adductor profundus (AP) and the white part of the Adductor

Superficialis (ASW) measured by using Amplex Red©. H2O2 formation was initiated by

addition of pyruvate and malate (5 mM each). The calibration signal was produced by

successive additions of known amounts of H2O2 during each experiment. 8A. Citrate

synthase activity of mitochondria [35] was measured to express H2O2 production (pmol

H2O2/mg protein/min) relative to the oxidative capacities of each muscle. 8B. At state IV, %

free radical leak (FRL) was calculated as the rate of H2O2 production divided by two times

the rate of O2 consumption and multiplied by 100 [13,37]. Different letters represent

significantly different values (P < 0.05).

142

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

ALD ASW ASR AP SART ILIO PLD PM

Muscle

MyH

Cne

om

RN

A/1

8S

a

b

ee

c

b

de

Figure 1

E

A B

DC

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8


Muscle

MyH

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b3 m

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A/1

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ab

b

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1.2

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2.0


Muscle

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a

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0.00

0.02

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Muscle

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0

1

2

3

4


Muscle

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0.0

0.5

1.0

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Figure 1

E

A B

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Muscle

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Muscle

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143

A

B

C

D

100µm100µm

100µm100µm

100µm100µm

100µm100µm

AP ASW PM

Figure 2

144

Fig

ure

3

ABC

a

b

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b

aa

b

0.0

0

0.0

2

0.0

4

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6

0.0

8

0.1

0

AS

WA

PP

M

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/mg protein)

0.0

0

0.0

2

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2

AS

WA

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Muscle

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/mg protein)

0 5

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20

AS

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/mg protein)

AS

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AP

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3

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Muscle


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/mg protein)

AS

W

AP

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1

45

Figure 4

AP

ASW

PM

146

Figure 5

a

a

b

PM ASW AP

30 kDa

0

5

10

15

20

25

30

PM ASW AP

Muscle

avU

CP

pro

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conte

nt (a

.u.)

Figure 5

a

a

b

PM ASW AP

30 kDa

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PM ASW AP

Muscle

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a

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PM ASW AP

Muscle

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147

Muscle P < 0.001

State P < 0.001

Muscle × State: NS

Figure 6

0

20

40

60

80

100

120

140

ASW AP PM

Muscle

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(pm

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State IV

HNE

GDP

Muscle P < 0.001

State P < 0.001

Muscle × State: NS

Figure 6

0

20

40

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ASW AP PM

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State IV

HNE

GDP

148

ADSW ADP PM

Figure 7

ASW AP PM

-4

-3

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0

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Muscle

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Figure 7

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Malate-pyruvate-BSA

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149

A

B

Figure 8

0

0.1

0.2

0.3

0.4

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0.6

0.7

Muscle

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activity)

a

a

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(%)

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a

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Figure 8

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Muscle

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/CS

activity)

a

a

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Muscle

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Muscle

Fre

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(%)

ASW

AP

PMa

a

b

bb

b

150

Principaux résultats présentés dans la publication.

Expression d’avUCP dans trois types contractiles et métaboliques de muscles

L’expression de l’ARNm d’avUCP est plus forte dans le muscle mixte oxydo-glycolytique

Adductor profundus (AP) et le muscle rapide glycolytique Pectoralis major (PM) que dans la

partie blanche lente oxydative du muscle Adductor superficialis (ASW). La quantité de

protéines avUCP dans les mitochondries subsarcolemmales présente la même distribution.

Consommation d’O2, découplage et production d’H2O2 des mitochondries extraites des trois

types contractiles et métaboliques de muscles

Les résultats de mesure de consommation d’O2, de découplage et de production d’H2O2 dans

la publication sont sous formes de d’histogrammes. Les figures 26 à 28 représentent des

exemples de ces mêmes mesures sous leur forme graphique intiale avant traitement des

données pour analyse statistique.

Les mitochondries de l’ASW présentent une consommation d’O2 inférieure à celles des

mitochondries de l’AP et du PM (P < 0,001). Pour ces trois muscles, le HNE induit une

augmentation de la consommation en O2 qui n’est pas sensible au GDP.

L’évaluation qualitative du potentiel de membrane des mitochondries, mesurée par

l’incorporation de la safranine O, permet de rendre compte du découplage mitochondrial.

Pour les trois muscles, l’ajout de HNE augmente le découplage (P < 0,001), mais celui-ci

n’est significativement inhibé par le GDP que chez les mitochondries de l’ASW (P < 0,05).

La production de H2O2 n’est pas affectée par le HNE ou le GDP pour nos trois muscles

(données non publiées). En revanche, la production de H2O2 à l’état IV, rapportée à l’activité

citrate synthase, est plus forte dans les mitochondries du PM et de l’ASW que dans celles de

l’AP (P < 0,05).

151

Co

ncen

tra

tion

O2

(nm

ol /m

L)

Co

nso

mm

atio

n e

n O

2(p

mol /s

/mL)

250

200

150

100

50

0

150

120

90

60

30

0

ADP 0,1mM ADP 1mM Oligomycine HNE

152

GDP FCCP

Figure 26 : Mesure de consommation d’oxygène par des mitochondries

subsarcolemmales extraites du muscle ASW de poulet

La consommation d’oxygène par les mitochondries (courbe rouge) est calculée à partir de la

vitesse de baisse de la concentration en oxygène dans le milieu (courbe bleue). Les mesures

sont effectuées après ajout de malate et de pyruvate. Différents réactifs sont injectés pour

moduler cette consommation. Les deux doses d’ADP permettent de vérifier l’intégrité des

mitochondries. L’oligomycine induit l’état IV (état basal de respiration) en inhibant l’ATP

synthase. Le HNE est agent découpleur par les UCP chez les mammifères et le GDP, quant à

lui, inhibe le découplage chez les oiseaux après stimulation par l’ion superoxyde. Enfin le

FCCP découple entièrement la mitochondrie et permet de rendre compte de la capacité

maximum de respiration.

ADP : adénosine diphosphate ; FCCP : p-trifluoromethoxy-carbonyl-cyanide-phenyl hydrazone ; GDP : guanosine diphosphate ; HNE : 4-hydroxy-2-nonénal.

Tampon

Mitochondries

GDP FCCP

HNE

-600

-500

-400

-300

-200

-100

0

100

500 1000 1500 2000

temps (s)

Ab

s m

uscle

-A

bs b

lanc

Figure 27 : Mesure du potentiel de membrane de mitochondries subsarcolemmales

extraites du muscle ASW de poulet

Le potentiel de membrane des mitochondries est évalué par colorimétrie (Safranine O). Les

mesures sont effectuées après ajout de tampon malate/pyruvate. Différents réactifs sont

injectés pour moduler le découplage et ainsi le potentiel de membrane. Le HNE est agent

découpleur par les UCP chez les mammifères et le GDP, quant à lui, inhibe le découplage

chez les oiseaux après stimulation par l’ion superoxyde. Enfin le FCCP découple entièrement

la mitochondrie et annule donc le potentiel de membrane.

Abs : absorbance ; FCCP : p-trifluoromethoxy-carbonyl-cyanide-phenyl hydrazone ; GDP :

guanosine diphosphate ; HNE : 4-hydroxy-2-nonénal.

152

-1000

0

1000

2000

3000

4000

500 1000 1500 2000 2500 3000

Temps (s)

Ab

s m

uscle

-A

bs t

am

pon

PM

ASW

AP

Tampon

Mitochondries

GDPHNE

Figure 28 : Mesures de production d’H2O2 par des mitochondries subsarcolemmales

extraites des muscles PM, AP et ASW de poulet

La production d’H2O2 par les mitochondries est calculée par colorimétrie (Amplex Red). Les

mesures sont effectuées après ajout de tampon malate/pyruvate. Différents réactifs sont

injectés pour moduler cette production. Le HNE est agent découpleur par les UCP chez les

mammifères et le GDP, quant à lui, inhibe le découplage chez les oiseaux après stimulation

par l’ion superoxyde.

Abs : absorbance ; AP : Adductor profundus ; ASW : Adductor superficialis ; GDP :

guanosine diphosphate ; HNE : 4-hydroxy-2-nonénal ; PM : Pectoralis major.

153

DISCUSSION

153

Discussion générale

Mon travail de thèse avait pour but d’étudier la régulation de la protéine découplante

aviaire et de mettre en évidence le ou les rôles potentiel(s) d’avUCP dans le métabolisme

mitochondrial du poulet. En utilisant une approche in vivo, nous avons étudié, dans un

premier temps, la variation de l’expression d’avUCP en réponse à un stimulus hormonal

impliqué dans la thermogenèse en réponse en froid. Nous avons également, au cours de cette

expérience, exploré les modifications du métabolisme de l’animal et des voies de signalisation

potentiellement associées à l’expression d’avUCP. Dans un deuxième temps, nous avons

cherché, par une approche in vitro, à mettre en évidence quelles sont les voies de signalisation

directement impliquées dans la régulation d’avUCP, en réponse au stimulus hormonal. Pour

cela, nous avons utilisé des agents pharmacologiques spécifiques des acteurs clés des voies de

signalisation suggérées par les données de la littérature sur la régulation des UCP de

mammifères. Enfin, nous nous sommes focalisés sur le rôle d’avUCP dans le métabolisme

mitochondrial en étudiant, à partir de mitochondries isolées de muscles de poulet présentant

des types métaboliques et contractiles différents, le découplage mitochondrial et la

production de radicaux libres en relation avec l’expression de ce gène.

Surexpression d’avUCP en réponse à une stimulation -adrénergique

Afin de déterminer si une stimulation du système !-adrénergique pouvait moduler

l’expression de la protéine avUCP, nous avons utilisé administré à nos poulets de

l’isoprotérénol, un !2-agoniste, en injection intramusculaire (Publication N°1). Nous avons

ainsi pu déterminer, par une approche de PCR quantitative, que l’expression de l’ARNm

d’avUCP augmentait dans le muscle Pectoralis major (PM) après injection de l’agoniste.

Cette variation de l’expression du messager, doublée dès 30 minutes après l’injection,

représente neuf fois la valeur de l’expression basale après 4 heures de stimulation. Par la suite,

nous avons pu constater par Western blot que cette variation de l’expression du messager

d’avUCP se traduisait, 24 heures après l’injection, par une forte tendance à l’augmentation de

la quantité de protéines avUCP présentes dans les mitochondries subsarcolemmales. Compte

tenu de la demi-vie des UCP 2 et 3 qui est relativement faible (de 1 à 4 heures) (Azzu &

Brand, 2009), une détection aussi tardive ne pourrait pas très réprensative des changements de

teneur en protéine avUCP dans les mitochondries suite à la stimulation !-adrénergique.

154

Aucun changement n’ayant été détecté après 4 heures, des mesures intermédiaires auraient pu

permettre de mieux apprécier les variations de quantité de protéine avUCP dans les

mitochondries. Cependant, les contraintes expérimentales n’ont pas rendu possibles ces

prélèvements.

Les amplitudes de variation de l’expression du messager d’avUCP mesurées sont

beaucoup plus fortes que celles observées dans de précédents modèles de stimulation

hormonale. Ainsi, des poulets supplémentés pendant 2 semaines en T3 présentent une

expression d’avUCP doublée par rapport aux témoins (Collin et al., 2003c). Chez le canard,

l’injection chronique du glucagon pendant 4 semaines résulte en une expression d’avUCP

multipliée par 3 (Raimbault et al., 2001). Dans des modèles d’exposition ou d’acclimatation

au froid, l’expression d’avUCP varie de 20 à 300 % (Raimbault et al., 2001; Toyomizu et al.,

2002; Collin et al., 2003a). Enfin, les modèles de jeûne court ou de supplémentation en

lipides présentent une variation de 50 à 300 % de l’expression d’avUCP (Evock-Clover et al.,

2002; Collin et al., 2009; Mujahid et al., 2009). Le système !-adrénergique possèderait donc

un potentiel relativement élevé de régulation de l’expression d’avUCP in vivo.

Cependant, dans les exemples précédemment cités, la variation de l’expression

d’avUCP fait suite à des stimulations hormonales ou environnementales prolongées. Dans

notre modèle, la stimulation du système !-adrénergique se fait de manière ponctuelle à une

dose de 4 mg/kg. La forte réponse après l’injection est-elle alors le résultat d’une implication

importante du système !2-adrénergique sur la régulation d’avUCP ou la réponse à un stress

cellulaire due à une surdose d’isoprotérénol ? Ohta et al. (Ohta et al., 1988) ont bien montré

que l’isoprotérénol pouvait avoir un effet toxique sur le cœur chez le poussin mais ceci à des

doses de 80 à 240 mg/kg en injection chronique. Par ailleurs, l’isoprotérénol a été utilisé à des

doses comparables à la nôtre dans de précédentes études chez le poulet (4 mg/kg en

perfusion ; (Hamano et al., 1999), le poussin (5 mg/kg ; (Turner & Walker, 1987), ou encore

le pigeon (4 mg/kg ; (Ophir et al., 2004). De plus, l’injection d’isoprotérénol à ces doses

semble favoriser les mécanismes de protection face à l’ischémie (Turner & Walker, 1987). La

forte augmentation de l’expression d’avUCP dans notre modèle ne résulterait donc pas d’une

surdose d’agent pharmacologique, ce qui conforterait l’existence d’une forte relation entre le

système !-adrénergique et la régulation de l’expression d’avUCP.

Cet effet de l’isoprotérénol a pu être vérifié in vitro (Publication N°2). Ainsi les

myoblastes de poussins stimulés par 100 nM d’isoprotérénol présentent une augmentation de

l’expression du messager d’avUCP maximale au bout d’une heure. Cette surexpression

perdure jusqu’à 2 heures après l’ajout du réactif puis décline. Cette surexpression est

155

concordante avec une étude de Nagase et al. (Nagase et al., 2001) qui avaient montré que

l’isoprotérénol augmente l’expression d’UCP3 dans la lignée de cellules musculaires L6.

Cependant, l’amplitude de cette surexpression est bien moindre que celle observée in vivo.

Elle atteint au maximum +67 %. Ceci pourrait être expliqué par l’intervention, dans le modèle

in vivo, de signaux autres que post-récepteurs !-adrénergiques qui agiraient en synergie.

Les concentrations plasmatiques d’hormones thyroïdiennes chez nos poulets

présentent des variations suite à la stimulation par l’isoprotérénol. Le ratio T3/T4 augmente à

30 minutes, puis diminue 4 heures après stimulation. L’augmentation de l’expression

d’avUCP pourrait donc être en partie le résultat d’une stimulation par l’hormone thyroïdienne

T3. En effet, les poulets supplémentés en T3 présentent une plus forte expression du messager

de la protéine découplante (Collin et al., 2003c). Dans le TAB chez les mammifères,

l’intervention les hormones thyroïdiennes dans la régulation d’UCP1 passe par une

augmentation de la conversion de la T4 en T3 (Silva & Rabelo, 1997). Cette conversion est

assurée par la déiodinase D2 dont l’activité est augmentée par les catécholamines. Dans notre

modèle, l’activité de la déiodinase D2 n’a pas été mesurée. Les niveaux d’expression du

messager de cette enzyme, mesurés dans le muscle PM 30 minutes après injection,

augmentent numériquement chez les animaux traités à l’isoprotérénol. Cependant, une forte

variabilité individuelle explique le défaut de signification statistique de cette différence. En

résumé, la stimulation de l’expression d’avUCP par l’isoprotérénol pourrait être associée à

une modification des niveaux intracellulaires d’hormones thyroïdiennes. La mesure de

l’activité de la D2 musculaire permettrait de confirmer ou non cette hypothèse inspirée de la

régulation d’UCP1 dans le TAB (de Jesus et al., 2001).

L’analyse des métabolites sanguins a également permis de mettre en évidence des

modifications du métabolisme du glucose et des lipides suite à l’injection d’isoprotérénol. En

effet, la glycémie des poulets stimulés est augmentée comme l’avaient indiqué Hamano et al.

(Hamano et al., 1999). Au niveau des cellules ! du pancréas de l’homme, le glucose a un effet

stimulateur sur l’expression de l’ARNm d’UCP2 (Brown et al., 2002). De plus, il a été

montré qu’une corrélation positive existe entre l’expression d’UCP2 dans le tissus adipeux et

la glycémie chez le porc (Ramsay et al., 2008). Cette sensibilité au glucose pourrait être

expliquée par la fonction qu’occuperait UCP2 dans la mitochondrie. En effet, Mozo et al. ,

puis Bouillaud (Mozo et al., 2006; Bouillaud, 2009) proposent que UCP2 inhibe le transport

du pyruvate, produit final de la glycolyse, dans la mitochondrie, favorisant ainsi une

alimentation du cycle de Krebs par la glutamine et les acides gras. Cependant, aucune étude

n’a mis en évidence les mécanismes intracellulaires de contrôle par le glucose de l’expression

156

d’une protéine découplante. Pour vérifier une réelle implication du glucose sur l’expression

d’avUCP, nous utilisons, dans une étude en cours, des myoblastes de QM7 (quail muscle

clone 7) mis en culture dans un milieu contenant différentes concentrations de glucose. En

présence de 3 g/L de glucose, les myoblastes présentent une expression d’avUCP plus élevée

(+ 30 %) que ceux mis en présence de glucose à 2 g/L, correspondant à la glycémie basale des

oiseaux. Ces premiers résultats, qui restent à confirmer, suggèrent qu’il existerait un contrôle

de l’expression d’avUCP par le glucose. Cette surexpression pourrait, par analogie avec

l’hypothèse évoquée pour UCP2 et UCP3 (Criscuolo et al., 2006; Mozo et al., 2006;

Bouillaud, 2009), réguler l’utilisation mitochondriale du pyruvate pour limiter un excès de

pyruvate dans la matrice mitochondriale en cas de forte disponibilité du glucose.

La stimulation par l’isoprotérénol altère les concentrations plasmatiques de

triglycérides et de NEFA qui voient leur concentrations diminuer dès 30 minutes, et jusqu’à

4 heures pour les NEFA. Ces résultats sont concordants avec de précédentes études sur les

variations des paramètres sanguins suite à l’injection d’isoprotérénol chez le poulet (Buyse et

al., 1991; Hamano et al., 1999). Cependant, chez les mammifères, c’est plutôt une

augmentation des concentrations en NEFA plasmatiques qui est observée après stimulation

!-adrénergique (Reeds & Mersmann, 1991). Dans cette étude, nous n’avons pas étudié la

captation des acides gras par le muscle ou les cycles triglycérides/acides gras qui pourraient

être modifiés sous l’effet de l’isoprotérénol. Cependant, nos mesures d’expression des

messagers d’enzymes clés du métabolisme des acides gras (M-CPT1, HAD, ACSL1)

suggèrent que les cellules musculaires semblent adapter leur appareil enzymatique pour

augmenter leur capacité d’utilisation mitochondriale des acides gras. Ces mesures sont à

confirmer au niveau des protéines et de leur activité. Par ailleurs, il a déjà été montré que les

lipides jouaient un rôle dans la régulation d’avUCP. Ainsi les poulets nourris avec un régime

riche en lipides présentent une expression de la protéine découplante plus forte (Collin et al.,

2003b; Collin et al., 2009; Mujahid et al., 2009). Nous avons confirmé le rôle des acides gras

dans la régulation d’avUCP sur modèle in vitro. L’ajout d’un supplément en acides gras,

contenant les acides arachidonique, laurique, linoléique, oléique et myristique, dans le milieu

de culture, augmente l’expression du messager d’avUCP sur une cinétique différente de celle

de l’isoprotérénol seul. Le maximum n’est atteint qu’après 2 heures. Cependant, l’ajout du

supplément en acides gras simultané à celui de l’isoprotérénol ne montre pas d’effet

additionnel ou synergique sur l’expression d’avUCP.

157

L’expression d’avUCP peut donc être augmentée suite à une stimulation

-adrénergique. Cependant, cette régulation ne semble pas être sous le seul contrôle d’une

activation des récepteurs 2-adrénergiques musculaires. Des signaux résultant d’un effet

-adrénergique sur d’autres organes semblent entrer en jeu. Ainsi les hormones

thyroïdiennes, les métabolismes glucidiques et lipidiques qui sont modifiés par la

stimulation -adrénergique sont potentiellement co-acteurs de cette régulation.

Voies de signalisation régulant l’expression d’avUCP

Le contrôle de l’expression d’avUCP par le système 2-adrénergique ayant été montré,

nous nous sommes alors intéressés aux voies de signalisation intracellulaires pouvant relayer

les signaux extracellulaires impliquant des kinases et des facteurs de transcription. Nous

avons donc, dans un premier temps, étudié par Western blot l’activation de protéines clés de

différentes voies de signalisation. Pour cela, nous nous sommes basés sur les modèles de

régulation d’UCP1 et d’UCP3. La régulation d’UCP1 dans le TAB est relativement bien

connue. Une voie AMPc/PKA dépendante aboutissant au facteur de transcription CREB et

faisant intervenir également une voie p38 MAPK fait le lien entre le récepteur -adrénergique

et le promoteur du gène Ucp1 (Silva & Rabelo, 1997; Cao et al., 2004). La régulation

d’UCP3, moins élucidée, fait notamment intervenir l’AMPK, senseur énergétique de la cellule

(Stoppani et al., 2002; Putman et al., 2003). Nous avons donc concentré nos mesures sur la

protéine CREB, pour détecter l’activation de la voie PKA, sur la p38 MAPK et sur l’AMPK.

L’activation de la PKA permet à cette dernière de phosphoryler la sérine 133 de

CREB, qui va alors pouvoir recruter des coactivateurs transcriptionnels. La mesure de la

phosphorylation de CREB permet donc de rendre compte de l’activation de la voie PKA. Par

Western blot, nous n’avons pas détecté d’augmentation de la phosphorylation de CREB chez

les poulets stimulés par l’isoprotérénol. Cependant, l’isoprotérénol est un activateur

pharmacologique de cette voie de signalisation. L’absence de réponse sur la protéine CREB

peut donc être expliquée par les temps de prélèvement (30 minutes après injection) qui ne

correspondraient pas à la cinétique d’activation de cette voie chez l’oiseau. Néanmoins, pour

vérifier que cette voie est bien activée, des mesures ont été effectuées in vitro sur les

myoblastes stimulés par l’isoprotérénol. Ces derniers présentent bien, 20 minutes après le

début de la stimulation, une tendance à l’augmentation de la phosphorylation de CREB

(résultats complémentaires). Le manque de signification statistique peut s’expliquer, à

158

nouveau, par une cinétique d’activation différente de celle des prises de mesures mais

également par un manque de spécificité de l’anticorps anti-phospho-CREB sur ce modèle

cellulaire, ce qui induit une quantification imprécise de l’intensité des bandes sur le Western

blot.

Une deuxième kinase potentiellement impliquée dans la régulation de l’expression

d’avUCP après stimulation -adrénergique est la p38 MAPK. Son activation a été mesurée

par quantification des phosphorylations de la thréonine 180 et de la tyrosine 182 de la sous-

unité !. Dans le modèle d’activation décrit pour UCP1, celle-ci est activée par la PKA pour

stimuler l’expression du gène Ucp1. Comme pour CREB, le modèle in vivo ne permet pas de

mettre en évidence son activation suite à l’injection d’isoprotérénol et ceci vraisemblablement

pour la même raison de cinétique différente de celle des prélèvements. Le modèle in vitro de

myoblastes stimulés par l’isoprotérénol et/ou les acides gras montre bien que la p38 MAPK

est activée par l’isoprotérénol 20 minutes après le début de la stimulation. De plus, on peut

remarquer que l’ajout d’acides gras augmente plus fortement son activation, ce qui indique

que les acides gras peuvent potentiellement agir sur la voie p38 MAPK. Afin de démontrer

son action directe sur l’expression d’avUCP, un inhibiteur pharmacologique de la p38 MAPK

a été utilisé. Bien que l’inhibition de la p38 MAPK, suite à une stimulation par l’isoprotérénol

et les acides gras, ait été confirmée, l’expression d’avUCP n’a pas été pour autant diminuée,

mais au contraire a été stimulée par l’ajout de cet inhibiteur. Il a été montré que la p38 MAPK

avait un rôle stimulateur de l’expression d’UCP1 dans le TAB (Cao et al., 2004), mais qu’à

l’inverse, dans les mélanomes et dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse, elle

pouvait intervenir dans l’inhibition de l’expression d’UCP2 (Emre et al., 2007{Selimovic,

2008 #675). Dans notre modèle, nous montrons que l’inhibition de cette kinase par le

SB202190 augmente l’expression d’avUCP dans les myoblastes. La p38 MAPK pourrait donc

potentiellement avoir un rôle inhibiteur dans la régulation d’avUCP.

La dernière kinase qui pourrait être impliquée dans la régulation de l’expression

d’avUCP est l’AMPK. Il a été montré que l’injection d’AICAR, un activateur

pharmacologique de l’AMPK, augmente l’expression d’UCP3 dans le muscle de rat (Stoppani

et al., 2002; Putman et al., 2003). Chez le poulet, l’injection d’isoprotérénol a bien augmenté

la phosphorylation de la thréonine 172 de la sous-unité ! de l’AMPK, indiquant l’activation

de la kinase 30 minutes et 4 heures (tendance) après l’injection d’isoprotérénol. Cependant,

dans le modèle in vitro de myoblastes en culture primaire, l’activation de l’AMPK n’est pas

induite par l’isoprotérénol, mais par l’ajout d’acides gras dans le milieu de culture.

L’activation de l’AMPK observée dans le modèle in vivo pourrait donc résulter de

159

modifications du métabolisme des lipides et non d’un contrôle direct 2-adrénergique. Afin de

vérifier que l’AMPK peut réguler l’expression d’avUCP, nous avons utilisé de l’AICAR sur

notre modèle cellulaire. L’ajout d’AICAR entraine bien une augmentation de l’expression

d’avUCP. Cependant, comme l’AICAR n’est pas spécifique de l’AMPK et peut, entre autre,

activer la p38 MAPK chez les mammifères (Lemieux et al., 2003), nous avons également

utilisé du Compound C qui inhibe l’activation de l’AMPK induite par l’AICAR. L’ajout de

cet inhibiteur, après stimulation par l’AICAR, diminue bien la phosphorylation de l’AMPK

mais également l’expression d’avUCP dans les mêmes proportions. Par cette approche, nous

avons donc montré que l’AMPK peut contrôler l’expression d’avUCP chez le poulet. Ceci

pourrait être confirmé par invalidation de la kinase. Par ailleurs, au cours de l’utilisation de

l’inhibiteur de la p38 MAPK, la phosphorylation de l’AMPK est augmentée, ce qui pourrait

expliquer que l’expression d’avUCP est plus forte en présence de l’inhibiteur de la

p38 MAPK. Cela pose également la question de la spécificité de cet inhibiteur chez l’oiseau,

car chez les mammifères, ce réactif n’active pas l’AMPK (Jaswal et al., 2007). De manière

générale, l’expression d’avUCP et la phosphorylation de l’AMPK présentent le même pattern

dans le modèle cellulaire quel que soit le type de stimulation testé, au point notamment de

masquer l’effet de l’inhibition de la p38 MAPK. Ces résultats vont dans le sens d’un rôle

prononcé de l’AMPK dans la régulation d’avUCP. Néanmoins quel est le lien entre

l’activation de l’AMPK et la stimulation -adrénergique par l’isoprotérénol dans le modèle in

vivo ? L’AMPK est une protéine sensible au ratio AMP/ATP. En présence de faible quantité

d’ATP, elle est activée par l’AMP. L’approche in vitro a permis de mettre en évidence que

l’ajout d’acides gras dans le milieu entraine une activation de l’AMPK. De plus, nous avons

montré que l’expression du messager de l’ACSL1 est augmentée par l’injection de

l’isoprotérénol chez le poulet. L’ACSL1 est une enzyme qui active les acides gras en leur

fixant un coenzyme A (Ellis et al., 2000). L’action de l’ACSL1, qui est consommatrice

d’énergie, pourrait expliquer une diminution temporaire d’ATP qui active l’AMPK. Dans les

adipocytes, l’acylation des acides gras, utilisatrice d’ATP, a été proposée comme mécanisme

d’activation de l’AMPK par l’isoprotérénol (Gauthier et al., 2008). Dans notre modèle, les

acides gras seraient activés pour leur permettre d’être pris en charge par le système de

transport mitochondrial carnitine-dépendant et ainsi être disponibles pour la -oxydation. Une

seconde hypothèse pouvant expliquer l’activation de l’AMPK fait intervenir le cycle du

glucose. Il a été suggéré que le système -adrénergique peut affecter la glycogénogenèse

consommatrice d’ATP in vivo (DeFronzo et al., 1984). L’isoprotérénol peut également

augmenter la captation de glucose et la synthèse du glycogène dans la lignée de cellules

160

musculaires L6 (Yamamoto et al., 2007), ce qui pourrait consommer de l’ATP et activer

l’AMPK.

Les voies de régulation de l’expression de la protéine découplante aviaire convergent

au niveau de la séquence promotrice de son gène. Nous nous sommes donc focalisés sur

l’étude in silico du promoteur d’avUCP. Nous avons mis en évidence deux sites de fixation de

CREB, ainsi que, par une recherche manuelle, deux sites PPAR et plusieurs séquences

correspondant à de potentiels éléments de réponse aux hormones thyroïdiennes. Nous avons

particulièrement étudié les facteurs de transcription PPAR et leur coactivateur PGC-1!, qui

présentent chez les mammifères une forte relation avec l’expression des protéines

découplantes UCP1, 2 et 3 (Villarroya et al., 2007). Par une approche de PCR quantitative,

nous avons déterminé l’effet de l’injection d’isoprotérénol sur l’expression de ces facteurs de

transcription. Les poulets stimulés présentent, 30 minutes après injection d’isoprotérénol, une

plus forte expression des messagers de PPAR!, PPAR /" et de PGC-1!, pouvant ainsi

augmenter la quantité de ces facteurs de transcription agissant sur le promoteur d’avUCP.

Cependant, sur le modèle cellulaire, seule l’expression du messager du facteur de

transcription PPAR /" est sensible à l’ajout d’acides gras et/ou d’isoprotérénol. L’utilisation

d’un agoniste PPAR! sur les myoblastes montre que ce facteur de transcription peut

augmenter l’expression d’avUCP. Nous avons également tenté d’utiliser un agent

pharmacologique agoniste de PPAR /" sur nos cultures primaires de myoblastes, mais celui-

ci a affecté la survie des cellules. Les PPAR sont activés par des acides gras (Schoonjans et

al., 1996). Ils pourraient donc être impliqués dans la stimulation d’avUCP induite par les

changements d’utilisation des acides gras susceptibles d’intervenir après injection

d’isoprotérénol. L’absence de surexpression des trois facteurs de transcription ou la faiblesse

de son amplitude dans le modèle in vitro, par rapport au modèle in vivo, pourrait ainsi

expliquer que les stimulations par l’isoprotérénol et les acides gras sur les myoblastes ne

présentent pas d’effet additionnel ou synergique sur avUCP comme il semblerait que ce soit le

cas in vivo. Il faut toutefois noter que ces réponses des PPAR ont été étudiées en termes

d’ARNm et non de protéines et/ou de phosphorylation/activation.

Nous avons pu mettre en évidence, par expérimentations in vivo et in vitro,

l’implication de différentes voies de signalisation dans la régulation d’avUCP en réponse à

un stimulus -adrénergique. Cependant ces différents acteurs n’agissent pas de manière

autonome, sans interactions avec les autres. Ainsi, la stimulation du système

-adrénergique, en plus d’activer une voie PKA-dépendante dans les cellules musculaires,

161

pourrait modifier par l’intermédiaire d’autres organes certains paramètres hormonaux,

comme les hormones thyroïdiennes, ou les métabolismes glucidiques et lipidiques. Ces

changements agissent également comme signaux, entrainant des cascades de signalisation

dans les cellules musculaires. Les hormones thyroïdiennes pourraient directement agir via

le récepteur nucléaire à la T3. Bien qu’une glycémie forte soit associée une expression plus

forte d’avUCP, comme cela laisse présager une étude en cours, nous n’avons pas encore

entrepris de décortiquer les mécanismes intracellulaires impliqués. La modification du

métabolisme lipidique semble, quant à elle, être impliquée dans la régulation de

l’expression d’avUCP. Une modification de l’utilisation des acides gras pourrait activer

l’AMPK et les facteurs de transcription PPAR! et /", leur permettant de se fixer sur le

promoteur d’avUCP. L’AMPK pourrait également stimuler l’expression d’avUCP via la

phosphorylation et l’activation des facteurs de transcription CREB (Thomson & Winder,

2009) ou PGC-1! (Jager et al., 2007), ce qui reste à démontrer chez l’oiseau.

Rôle d’avUCP dans le métabolisme mitochondrial du muscle

Pour déterminer la part que prend avUCP dans le métabolisme mitochondrial du

muscle de poulet, nous nous sommes basés sur un modèle d’étude de différents types

métaboliques et contractiles de muscles de poulets (Publication N°3). Après avoir caractérisé

les propriétés contractiles d’un large panel de muscles en mesurant les niveaux d’ARNm de

plusieurs isoformes de chaîne lourde de myosine (MyHC), nous nous sommes focalisés sur

trois muscles aux propriétés contractiles et métaboliques différentes : un muscle rapide

glycolytique, le Pectoralis major (PM) ; un muscle lent oxydatif, la partie blanche de

l’Adductor superficialis (ASW) ; et un muscle mixte oxydo-glycolytique, l’Adductor

profundus (AP). Cette étude nous a permis de caractériser finement plusieurs muscles chez

l’oiseau. Elle nous a également permis de donner plus d’éléments sur l’implication potentielle

d’avUCP dans le fonctionnement mitochondrial du muscle de poulet. Nous avons mesuré

l’expression d’avUCP dans les trois différents muscles. L’expression d’avUCP est beaucoup

plus importante dans les muscles glycolytiques et oxydo-glycolytiques que dans les muscles

oxydatifs, comme chez les mammifères (Hesselink et al., 2001; Anderson et al., 2007). Ces

résultats sont confirmés au niveau protéique par Western blot. L’ASW présente moins de

protéine avUCP dans ses mitochondries subsarcolemmales que le PM et l’AP.

162

Sur ces trois muscles de propriétés contractiles et métaboliques différentes et où

avUCP est exprimée de manière différente, nous nous sommes donc intéressés à la

répercussion potentielle de ces différences d’expression sur le découplage mitochondrial et la

production de radicaux libres. Pour cela, nous avons mesuré la consommation d’O2 et évalué,

de manière qualitative, le découplage des mitochondries subsarcolemmales isolées de ces trois

muscles. A l’état IV induit par l’oligomycine, les mitochondries présentent des

consommations d’O2 différentes. Cela signifie que la consommation d'O2 liée aux fuites de

protons (et non à l'ATP synthase) serait plus grande dans l'AP et le PM (contenant plus

d'avUCP) que dans l'ASW. Ce résultat ne contredit pas une implication d'avUCP dans le

découplage mitochondrial. Il pourrait également correspondre à une particularité des

mitochondries des muscles oxydatifs de poulet (composition des lipides membranaires…),

puisque, à notre connaissance, chez les mammifères, la consommation mitochondriale d’O2

ne diffère pas selon les types musculaires à l’état IV (Jackman & Willis, 1996; Gueguen et al.,

2005). L’addition de HNE augmente la consommation d’O2 et le découplage pour les trois

types de muscles, comme c’est cas chez les mammifères où il a été suggéré que le HNE

augmente le découplage par les UCP 1, 2 et 3 (Echtay et al., 2003). Nous n’avons pas pu

mettre en évidence d’effet du GDP sur la consommation d’O2 et le découplage, excepté pour

l’ASW, qui pourtant possède le moins d’avUCP. Cependant, bien que le GDP limite le

découplage induit par l’ion superoxyde dans les mitchondries de le manchot royal, il n’a pas

été montré d’effet du GDP sur ces mitochondries à l’état basal (Talbot et al., 2003). Cette

insenbilité au GDP pourrait signifier que le découplage induit par le HNE ne ferait pas ou peu

intervenir avUCP. Le HNE peut également stimuler le découplage via l’ANT (Echtay et al.,

2003). L’utilisation d’atractyloside ou de carboxyatractylate, inhibiteurs de l’ANT, pourrait

permettre de confirmer ou réfuter cette hypothèse chez le poulet.

Si on considère dans cette étude que la production de H2O2 de mitochondries isolées

peut témoigner de la production de radicaux libres du tissu, il n’a pas non plus été mis en

évidence d’effet ni du HNE, ni du GDP dans la production de ROS des trois types de muscles

étudiés. Par ailleurs, Anderson et al. (Anderson et al., 2007) avaient émis l’hypothèse qu’une

expression importante d’UCP3 dans les fibres glycolytiques de type IIb contribuait à limiter la

génération de radicaux libres lorsque l’utilisation des acides gras est stimulée dans ces

muscles à plus fort potentiel de production de ROS par rapport aux fibres de type IIa

(Anderson & Neufer, 2006). La production basale d’H2O2 relative à l’activité citrate

synthase, témoin de la capacité oxidative de la mitochondrie, confirme en effet que le muscle

PM possède un potentiel de production de radicaux libres plus important que l’AP qui

163

contiendrait majoritairement des fibres proches du type IIa de mammifères. Cependant, le

muscle ASW présente un potentiel de production de radicaux libres au moins aussi fort que le

muscle PM, alors qu’il ne contient que des fibres de type lent oxydatif. Ce muscle ne semble

donc pas se comporter comme les muscles lents oxydatifs des mammifères. Par ailleurs,

l’expression d’avUCP dans ces trois muscles n’est pas concordante avec leur potentiel de

production de radicaux libres, ce qui ne corrobore pas complètement l’hypothèse d’une

avUCP limitatrice de la génération de radicaux libres, à moins de considérer que c’est un

défaut d’avUCP dans le muscle oxydatif qui concourt à son fort potentiel de production de

ROS. En revanche, une plus forte expression d’avUCP dans les muscles glycolytiques et

oxido-glycolytiques utilisant de manière prépondérante le glucose comme substrat

énergétique pourrait être liée à un rôle dans la régulation du dans le cycle de Krebs et de la

glycolyse comme suggéré par Criscuolo et al. (2006).

Il est important de souligner que nos résultats sont spécifiques de notre modèle d’étude

et reposent sur un seul type musculaire de mitochondries. De plus, les mesures ont été

effectuées sur des mitochondries isolées et à une température de 25 °C pour éviter une

dégradation trop rapide des mitochondries mais qui n’est pas la température optimale pour les

enzymes. Une étude sur fibres isolées aurait permis de s’affranchir partiellement des ces

limitations. Cependant, nos essais de perméabilisation de fibres musclulaires n’ont pas été

concluants en raison de la fragilité des fibres musculaires chez le poulet. Par ailleurs,

l’utilisation d’une même technique pour isoler les mitochondries de muscles aux

caractéristiques contractiles et métabolique différentes ne permet probablement pas d’extraire

la même fraction mitochondriale de chaque tissu.

Ces résultats ne permettent pas de mettre en évidence un rôle prépondérant d’avUCP dans

le découplage mitochondrial ou la limitation de la production de ROS. Cependant, nous

avons travaillé sur un modèle de mitochondries subsarcolemmales isolées, qui peut ne pas

être représentatif des mitochondries intégrées au fonctionnement de la fibre musculaire. De

plus, il existe une autre population de mitochondries dans le muscle, les mitochondries

intermyofibrillaires. Ces dernières n’ont pas été étudiées ici mais pourraient avoir des

propriétés différentes et être plus représentatives du type musculaire auquel elles sont

associées.

164

CONCLUSION

165

Conclusions et perspectives

L’ensemble du travail réalisé au cours de ma thèse a permis de mettre en évidence

différentes voies de signalisation impliquées dans la régulation de l’expression d’avUCP suite

à un stimulus -adrénergique, mais également de discuter du rôle de la protéine découplante

dans le métabolisme mitochondrial chez l’oiseau.

Nous avons pu mettre en évidence qu’une augmentation de la glycémie, provoquée par

le stimulus -adrénergique dans le modèle in vivo, est associée à une hausse de l’expression

d’avUCP. Cependant, au cours de cette thèse, nous n’avons pas étudié les mécanismes de

signalisation qui pourraient être mis en jeu dans le contrôle d’avUCP par le glucose.

Criscuolo et al. (Criscuolo et al., 2006) suggèrent qu’avUCP pourrait être chargée d’exporter

le pyruvate, produit de la dégradation du glucose, en dehors de la mitochondrie. Nos essais

préliminaires, montrant une surexpression d’avUCP sur modèle cellulaire en présence d’une

forte concentration de glucose, semblent étayer cette hypothèse dans la mesure où une plus

grande quantité de glucose disponible entrainerait une saturation en pyruvate dans la

mitochondrie. De plus, l’expression plus forte d’avUCP dans des muscles utilisant

préférentiellement le glucose ne contredit pas cette hypothèse.

Par ailleurs, l’étude de la régulation de l’expression d’avUCP permet également de

discuter d’un rôle potentiel d’avUCP dans l’utilisation des acides gras. Nous avons montré

que l’expression d’avUCP est augmentée dans le PM, en cas de stimulation -adrénergique

modifiant les taux circulants de NEFA, et probablement la captation et l’utilisation des acides

gras dans les cellules musculaires, ce qui reste à démontrer. Le PM étant un muscle

glycolytique, il est peu équipé pour oxyder les acides gras. Cependant, les cellules

musculaires des poulets traités à l’isoprotérénol présentent une expression plus forte des

enzymes clés dans l’utilisation des acides gras pour alimenter la chaîne respiratoire (ACSL1,

CPT1, HAD). Si ces surexpressions étaient relayées au niveau de la quantité et de l’activité de

ces enzymes, ceci indiquerait que les cellules du muscle PM augmentent leur capacité

oxydative sous l’effet de l’isoprotérénol. On peut alors suggérer que si avUCP est associée au

transport des acides gras ou de peroxydes, sa surexpression en cas de stimulation

-adrénergique et/ou en présence de forts taux d’acides gras pourrait assurer un rôle

protecteur contre le stress oxydant. Un rôle antioxydant d’avUCP est mis en avant dans les

études de Rey et al. (2009) lors des phases d’hypoxie/réoxygénation chez l’oiseau et par

166

promoteur du gène avUCP Noyau

CREB TR

PGC-1

PP

AR

Stimulation!-adrénergique

p38MAPK

Métabolismelipidique

Métabolismeglucidique

PKA

AMPc

!2-AR

+

T3

T3

T4

AMPK

PPAR

?

+

+

?

+

+ +

Cytoplasme

Figure 29 : Hypothèses de régulation de l’expression d’avUCP par le système

-adrénergique

La stimulation du système -adrénergique régule l’expression d’avUCP (1) par une voie de

signalisation PKA-dépendante aboutissant au facteur CREB, (2) par les hormones

thyroïdiennes dont la conversion de la T4 en T3 est augmentée, (3) par une voie de

signalisation AMPK-dépendante déclenchée par modification du métabolisme des acides gras

et qui pourrait activer PGC-1! et CREB, (4) par activation des facteurs de transcription

PPAR, eux-mêmes activés par les acides gras.

La p38 MAPK, sensible aux acides gras et activé par la PKA, semble impliquée mais son rôle

exact n’a pu être défini. Enfin, l’augmentation de la glycémie entraine une surexpression

d’avUCP par des mécanismes inconnus.

AMPc : adénosine monophosphate cyclique ; AMPK : AMP-activated protein kinase ; 2-AR

: 2-adrénorécepteur ; CREB : cAMP response elements binding protein ; p38 MAPK : p38

mitogen-activated protein kinase ; PGC-1! : PPAR" coactivator 1! ; PKA : protéine kinase

sensible à l’AMPc ; PPAR : peroxisome proliferator-activated receptor ; T3 :

triiodothyronine ; T4 : tyroxine ; TR : récepteur aux hormones thyroïdiennes ; avUCP :

protéine découplante aviaire.

167

Mujahid et al . (2006) en cas d’exposition à la chaleur. Il faudrait maintenant mesurer la

respiration et la production d’H2O2 mitochondriales en présence ou non d’acides gras chez

des poulets ayant reçu une injection d’isoprotérénol et des poulets témoins pour évaluer

l’activité biochimique liée à la surexpression d’avUCP. Le découplage mitochondrial pourrait

également être évalué dans ce modèle par une méthode plus quantitative que l’utilisation de la

safranine O (électrodes au methyltriphenyl phosphonium et pH).

L’étude du rôle d’avUCP, en utilisant différents types musculaires exprimant plus ou

moins fortement avUCP de manière constitutive, n’a pas permis de confirmer le ou les rôle(s)

potentiel(s) de la protéine dans le métabolisme mitochondrial. Dans nos conditions

expérimentales, avUCP est probablement peu impliquée dans le découplage induit par le

HNE. De plus le HNE n’est peut-être pas spécifique d’avUCP chez l’oiseau puisqu’il active

également l’ANT chez les mammifères. Nos résultats concernant la production de H2O2

indiquent que les mitochondries d’un muscle lent oxydatif exprimant peu avUCP auraient un

potentiel de production de radicaux libres au moins aussi élevé qu’un muscle rapide

glycolytique exprimant davantage cette protéine. Néanmoins, ces résultats ont été obtenus sur

une seule des deux populations mitochondriales rencontrées dans le muscle : les

mitochondries subsarcolemmales. Il faudrait vérifier si ces résultats sont reproductibles sur

l’autre population de mitochondries musculaires, les mitochondries intermyofibrillaires, plus

nombreuses dans le muscle.

Par des approches in vivo et in vitro, nous avons pu déterminer qu’une activation du

système -adrénergique entraine une surexpression du messager de la protéine avUCP dans le

muscle de poulet et que cette surexpression augmente la quantité de protéines avUCP dans les

mitochondries subsarcolemmales. Nous proposons alors le modèle suivant de régulation, basé

sur nos résultats et les hypothèses que l’on peut en tirer, et sur les données obtenues chez les

mammifères (Figure 29). Cette hypothèse de régulation fait intervenir différentes voies de

signalisation qui pourraient agir simultanément. Tout d’abord une voie PKA-dépendante

activée par fixation du ligand sur le récepteur 2-adrénergique. Ce récepteur initie une

cascade de réactions passant, entre autres, par l’augmentation de la concentration en AMPc,

ce qui active la PKA. Cette dernière phosphoryle alors le facteur de transcription CREB, qui

peut alors agir sur le promoteur du gène d’avUCP. Une deuxième voie, moins directe, pourrait

faire intervenir les hormones thyroïdiennes. La conversion de la T4 en T3 serait augmentée

suite au traitement par l’isoprotérénol, probablement par stimulation de l’activité de la

167

déiodinase D2. La T3 active son récepteur nucléaire (TR) qui va se fixer sur son ou ses

élément(s) de réponse dans le promoteur d’avUCP. Un autre signal parvient à la cellule

musculaire par l’intermédiaire d’un changement dans le métabolisme lipidique. L’activation

des acides gras par l’ACSL1 est consommatrice d’énergie, ce qui entrainerait une baisse

ponctuelle de la quantité d’ATP dans la cellule, activant l’AMPK. L’action de l’AMPK sur

l’expression d’avUCP semble être prononcée, comme l’indiquent les profils de

phosphorylation de l’AMPK et d’expression d’avUCP qui sont très semblables pour chaque

type de stimulation testé sur le modèle cellulaire. Bien que nous n’ayons pas pu mettre à jour

les mécanismes d’action de cette kinase sur l’expression d’avUCP, on peut supposer qu’elle

est capable de phosphoryler CREB et le cofacteur de transcription PGC-1! comme suggéré

chez les mammifères (Jager et al., 2007; Thomson & Winder, 2009). Les facteurs de

transcription PPAR! sont également capables d’augmenter l’expression d’avUCP. Ces

derniers, après activation par les acides gras et fixation de PGC-1! pourraient se fixer sur le

promoteur du gène de la protéine découplante.

Dans les études in vitro, nous avons observé que la p38 MAPK est également activée.

Cette kinase est impliquée dans la surexpression d’UCP1 chez les mammifères. Cependant,

d’autres études ont montré qu’elle pouvait avoir un rôle inhibiteur dans la régulation de

l’expression d’UCP2 dans les mélanomes et les macrophages dérivés de la moelle osseuse

(Emre et al, 2007 ; Selimovic et al, 2008). Son inhibition dans le modèle cellulaire a bien

entrainé une surexpression d’avUCP, mais ceci pourrait être la conséquence de l’activation en

parallèle de l’AMPK au cours de ces tests. Il serait donc intéressant d’utiliser un activateur de

la p38 MAPK autre que l’isoprotérénol, classiquement utilisé chez les mammifères mais qui

n’est en aucun cas spécifique de cette kinase dans nos études. De même, il serait intéressant

pour s’affranchir de la voie AMPK qui semble être fortement impliquée dans la régulation

d’avUCP, d’utiliser un modèle cellulaire invalidé pour l’AMPK. L’emploi d’un adnénovirus

dominant négatif permettrait d’exprimer une protéine AMPK non phosphorylable sur la

thréonine 172 et donc non activable (Tosca et al., 2008). Outre confirmer son contrôle dans

l’expression d’avUCP après un stimulus -adrénergique, un tel modèle pourrait également

permettre de déterminer si cette kinase contrôle également l’expression basale d’avUCP.

A plus long terme, l’étude in silico du promoteur ne permettant que de prédire des

séquences correspondantes à des éléments de réponses, une étude fonctionnelle du promoteur

permettrait de confirmer que les facteurs de transcription PPAR, CREB et TR peuvent se fixer

sur la séquence promotrice du gène avUCP. Enfin, l’utilisation de siRNA dans un modèle de

168

cellule musculaire aviaire permettrait de déterminer les effets d’une invalidation d’avUCP sur

le métabolisme mitochondrial du pyruvate et des acides gras, le découplage et la production

d’H2O2 pour tenter de répondre aux nombreuses questions soulevées par les études sur la

régulation d’avUCP.

169

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ANNEXES

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Annexe 1

Liste des publications

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Collin A., Swennen Q., Skiba-Cassy S., Buyse J., Chartrin P., Le Bihan-Duval E., Crochet S.,

Duclos M.J., Joubert, R., Decuypere E., Tesseraud S.; 2009. Regulation of fatty acid

oxidation in chicken (gallus gallus): interactions between genotype and diet composition.

Comparative Biochemistry and Physiology, Part B , Vol. 153 (2) , 171-177.

Collin A., Joubert R., Swennen Q., Damon M., Métayer Coustard S., Skiba-Cassy S.,

Evaraert N., Buyse J., Tesseraud S. Involvement of thyroid hormones in the regulation of

mitochondrial oxidations in mammals and avian species. In: Thyroid Hormones:

Functions, Related Diseases and Uses. F.S. Kuehn and M.P. Lozada (Eds.), Nova Science

Publishers, Inc. In press, 2008.

200

Annexe 2

Liste des communications à des congrès scientifiques

Bedrani L., Berri C., Grasteau S., Jégo Y., Yahav S., Everaert N., Jlali M., Joubert R.,

Métayer Coustard S., Praud C., Temim S., Tesseraud S., Collin A. Effects of embryo

thermal conditioning on thermotolerance, parameters of meat quality and muscle energy

metabolism in a heavy line of chicken. 4th

Workshop on Fundamental Physiology and

Perinatal Development in Poultry, 10-12 septembre 2009, Bratislava (CZE).

Joubert R., Crochet S., Métayer Coustard Sonia, Duclos MJ., Dupont J., Tesseraud S., Collin

A.; 2009. Régulation de l’expression de la protéine découplante avUCP par le système -

adrénergique dans le myoblaste de poussin. 3ème

Colloque MeetOchondrie, 4-7 mai 2009,

La Grande Motte (FRA).

Métayer Coustard S., Mameri H., Joubert R., Lescoat P., Berri C., Collin A., Tesseraud S.;

2008. Alimentation séquentielle et régulation à court terme du métabolisme du glycogène

chez le poulet : impact sur la qualité de la viande. 7èmes

Journées Francophones de

Nutrition, 26-28 novembre 2008, Brest (FRA).

Joubert R., Crochet S., Cailleau-Audouin E., Derouet M., Métayer Coustard S., Buyse J.,

Tesseraud S., Collin A.; 2008. Beta-adrenergic pathway regulates the expression of the

avian uncoupling protein. 9th

International Symposium on Avian Endocrinology, 11-15

juillet 2008, Leuven (BEL).

Joubert R., Tesseraud S., Métayer Coustard S., Crochet S., Buyse J., Swennen Q., Leterrier

C., Bouvarel I., Collin A.; 2008. 48h-cycle sequential feeding with diets varying in protein

and energy contents alters thyroid axis and energy metabolism in chicken. 9th

International

Symposium on Avian Endocrinology, 11-15 juillet 2008, Leuven (BEL).

Joubert R., Collin A., Berri C., Lefaucheur L., Vincent A., Fillaut M., Ecolan P., Mur L.,

Godet E., Crochet S., Bordeau T., Skiba-Cassy S., Tesseraud S., Herpin P., Damon M.;

2007. Expression of uncoupling proteins and mitochondrial activity are dependent on

muscular fibre type in rabbits and chickens. 2nd

International Symposium on energy and

protein metabolism and nutrition, 09-13 septembre 2007, Vichy (FRA).

201

202

Collin A., Swennen Q., Métayer-Coustard S., Skiba-Cassy S., Joubert R., Briclot G., Crochet

S., Decuypere E., Buyse J., Tesseraud S.; 2007. Regulation of mitochondrial and tissue

oxidations by thyroid hormones in chicken muscle. Energy and protein metabolism and

nutrition. 2nd

International Symposium on energy and protein metabolism and nutrition,

09-13 septembre 2007, Vichy (FRA).

Romain JOUBERT

Rôles et régulations de la protéine

découplante aviaire dans le métabolisme

mitochondrial de l’oiseau.

Résumé

La protéine découplante aviaire (avUCP), majoritairement exprimée dans le muscle, pourrait être

impliquée dans le transport de substrats énergétiques, la limitation de la production de radicaux libres et/ou la

thermogenèse sans frisson. La stimulation in vivo chez le poulet du système -adrénergique par l’isoprotérénol

augmente l’expression d’avUCP. Cette régulation pourrait faire intervenir la voie de signalisation

post- 2-adrénorécepteur des cellules musculaires, mais aussi des modifications du statut thyroïdien, des

métabolismes du glucose et des acides gras. Sur myoblastes de poussin en culture primaire, nous mettons en

évidence l’implication de l’AMPK et du facteur de transcription PPAR! dans la régulation de l’expression

d’avUCP, qui est modulée par l’isoprotérénol et les acides gras. L’expression d’avUCP diffère en fonction du

type contractile et métabolique de muscle, ce qui pourrait être lié à un rôle dans l’utilisation des substrats

énergétiques par le muscle.

Mots-clés : Poulet, Muscle, Mitochondrie, Protéine découplante aviaire, Système -adrénergique.

Abstract

Avian uncoupling protein (avUCP), mainly expressed in muscle, could be involved in energy substrates

transport, limitation of reactive oxygen species production and/or non-shivering thermogenesis. The in vivo

stimulation of the -adrenergic system by isoproterenol increased avUCP expression in chicken. This

regulation may involve the post- 2-adrenoreceptor signaling pathway in muscle cells, but also modulations of

thyroid status, glucose and fatty acid metabolisms. By using primary culture of chick myoblasts, we showed

the involvement of AMPK and of the transcription factor PPAR! in the regulation of avUCP expression, that

was controlled by isoproterenol and fatty acids. AvUCP expression depended on the contractile and the

metabolic types of chicken muscles, which could be related to a role of avUCP in the regulation of fuel

substrate utilisation in chicken muscles.

Key-words: Chicken, Muscle, Mitochondria, Avian uncoupling protein, -adrenergic system.

203

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