Université Echahid Hamma Lakhdar -El OUED Faculté des ...

الجوهىرح الجشائزح الذوقزاطح الشعثح

République Algérienne Démocratique et Populaire

وسارج الرعلن العال والثحث العلو

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

جاهعح الشهذ حو لخصز الىاد

Université Echahid Hamma Lakhdar -El OUED

ملح علىم الطثعح والحاج

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

قسن الثىلىجا الجشئح والخلىح

Département de biologie Cellulaire et Moléculaire

MEMOIRE DE FIN D’ETUDE

En vue de l’obtention du diplôme de Master Académique en Sciences

biologiques

Spécialité : Biochimie appliquée

THEME

Présentés Par :

Melle

CHAABANE Nadjah

Mme

LATRECHE Ouidad

Devant le jury composé de :

Président: Mr. SAADI Hamza M.A.A, Université d'El Oued

Examinateur: Mme

LAOUFI Hayatte M.A.A, Université d'El Oued

Promoteur: Mme

MEDILA Ifriquia M.C.A, Université d'El Oued

Année universitaire 2019/2020

Etude in vitro de l’activité biologique de

Daucus carota L.

N série:……

الحوذ لله الذ خلق ادم هي ذزاب ول الأسواء ملها

اتارئ الفس قاصها وداها رضاك خز هي الذا وهافها

إلارضاك فذا سو هعاها فلس للفس آهاه ذحققها

واأهل خز ل هي الذا وهافها فظزج هل اسؤل

والصلاج والسلام عل هي خاطة رت تالىح ذعى للعلن فقاه

اقزأ تاسن رتل الأعل

سذ ارسىه الله

وسزي الضاء سائز الامىاى صلد علل هلائنح الزحوي

تحو الإل وراح القزاى الىجىد هشودا لوا طلعد

Dédicace Je dédie ce modeste travail à:

À la prunelle de mes yeux, la lumière de ma vie, l’homme de ma vie, mon exemple

éternel, mon soutien moral et source de joie et de bonheur, celui qui s’est toujours

sacrifié pour me voir réussir, que dieu te garde dans son vaste paradis ; à toi mon père

Hamed.

A la lumière de mes jours, la source de mes efforts, la flamme de mon cœur, la lumière à

mes yeux ma vie et mon bonheur, A ce bel ange qui fleurit les jardins du ciel sous ses

pieds, Oh mon Dieu, sauve ma mère, car elle est le paradis dans mon cœur ; maman

FRIDJET Hania.

A toutes mes cher frère : Khaled, Ali, Abdelmoneim et mes sœurs : Fatima, Zohra,

Samira, Ouahida, Siham, Kheira, Fadjra et leurs enfants.

À mes sœurs, qui n'ont pas donné naissance à ma mère, Oui, les copines ont été une

source de soutien pour moi tout au long de ce projet : HEZLA Naoual, AHMIM

Samia.

A tous mes chers amis.

A mes amies que j’ai vécu avec elles des beaux moments au cours de mon cursus à

l’université: Sara,Ouafa, Hadda, Sara, Mabrouka, Iman, Maroua, Achouak, Basma,

Afaf, Rahma, Hadjer, Loubnab.

A tous les étudiants de ma promotion de 2éme année master biochimie appliquée.

Sans oublier mon binôme: Ouidad.

A tous mes collégues au travail en particulier: DOUYEMI Attiya. Il m’a toujours

soutenu, oui, ami et frère, que dieu te garde.

Nadjah

Dédicace C'est avec grande plaisir que je dédie ce modeste travail :

A l'être le plus cher de ma vie, ma mère.

A celui qui m'a fait de moi une femme, mon père.

À Mes chers Frères et Sœurs.

A Mon époux BEN AMOR Ammar et mon baby.

A tous mes amis de promotion de 2éme année Master Biochimie appliquée, toute

personne qui occupe une place dans mon cœur.

À tous les membres de ma famille et toute personne qui porte le nom Latreche, je

dédie ce travail à tous ceux qui ont participé à ma réussite surtout mon enseignant

LOTFI Oudini.

À Tous mes amis surtout Ma binôme CHAABANE Nadjah, OUINNISSI

Fatima, BADERDINE Maroua, GHARBI Imane.

Ouidad

Remerciements Nous tenons à remercier en premier lieu ALLAH, le tout Puissant de nous avoir

donné courage, santé et patience pour achever ce travail.

Deuxièmement, après Dieu, nous exprimons notre gratitude à ceux qui ont été la

raison de notre existence dans ce monde à nos parents, qui sont notre source constante

de soutien, qui ont travaillé dur pour atteindre ce point de notre chemin de vie. Même

les remerciements ne leur suffisent pas pour faire valoir leurs droits.

À notre promotrice de mémoire, Mme MEDILA ifriqya, maître de conférence A la

faculté des sciences de la nature et de la vie -Université d'El Oued, pour qui nous a

fait l’honneur d’accepter la présidence de cette mémoire. Hommage respectueux

Nous tenons à remercier profondément GOUBI Sana et KHANOUFA Omar. En

particulier GOUBI, membres du laboratoire de la faculté des sciences de la nature et

de la vie, Université Echahid HAMMA LAKHDAR, El-Oued., pour l'attention et

l’aide qu'elle a porté à ce travail, son support, votre gentillesse et ses encouragements.

Nous vous adressons nos profondes reconnaissances pour vos remarques et conseils en

vue d’améliorer ce manuscrit. Nos remerciements s’adressent aussi à tous les

travailleurs du laboratoire.

Un grand merci à toutes frères, sœurs, les amis et les personnes qui nous ont

apportées leurs soutiens et leurs aides ainsi qu’a toutes l’équipe ils nous ont aidés dans

le travail de laboratoire afin d’obtenir des bons résultats.

Nous tenons à remercier profondément a tous ceux qui ont contribué avec nous et

nous ont soutenus dans ce travail de loin ou de près.

Finalement, nous tenons à exprimer notre profonde gratitude, Université

Echahid HAMMA LAKHDAR, El-Oued., qui nous contenait jusqu’à ce que nous

atteignions ce point.

Résume

La plante de carotte est caractérisée par leur mode d’adaptation particulier à

l’environnement. Certaines espèces possèdent des propriétés pharmacologiques qui leur

confèrent un intérêt médicinal. En Algérie, on cherche à mieux connaître le patrimoine

des espèces spontanées utilisées en médecine traditionnelle ainsi que leurs principes

actifs. C’est dans ce contexte, l’objectif visé par notre étude consiste en l’étude

phytochimique, et l’investigation des activités antioxydant et antibactérienne des trois

extraits aqueux, éthanolïques et éthérique de partie aérienne (les graines) de plante de

carotte, Daucus carota L. Les graines de cette plante ont subis une extraction par

macération (l’eau, l’éthanol et l’éther) pour obtenir les extraits ; aqueux, éthanolique et

éthérique. Le rendement d'extraction est d'environ 13.22%, 11.99% et 11.007%

respectivement.

À travers cette étude, nous avons mis en évidence l’existence des flavonoïdes, des

polyphénoles, des tanins, des alcaloïdes, des polytérpene et stérol dans cette plante. Les

teneurs en polyphénols sont plus élevées dans l’extrait éthanolique (1024.6 ± 49.8 µg

EAG/g ES) par rapport aux autres extraits aqueux et éthérique (1015.1 ± 10.9, 820.77 ±

12.33 µg EAG/g ES) respectivement. Cependant, les teneurs en flavonoïdes, sont très

important dans cette espèce dans les différents extraits, le teneur le plus élevé est

enregistré pour l’extrait éthanolique (858.95 ± 12.33 µg/mg ES) suivie par l’extrait

aqueux (824.37 ± 3.05µg/mg ES) et l’extrait éthérique (655.55 ± 8.81µg/mg ES).

L’activité antioxydante par la méthode de DPPH est plus importante pour l’extrait

éthérique avec une valeur de IC50 de (41.677 ± 0.577 μg/ml) suivi par l’extrait

éthanolique (42.677 ± 1.528 μg/ml) et de l’extrait aqueux (85.00 ± 13.08 μg/ml). Ces

trois extraits présentent une activité importante par rapport a l’acide ascorbique. En

réduisant le fer (test de FRAP), c’est l’extrait éthanolique qui s’est révélé le plus actif

(10.916 ± 0.219 mg/g ES) suivi par l’extrait aqueux (8.351 ± 0.225 mg/g ES) et l’extrait

éthérique (7.6487 ± 0.894 mg/g ES). Le test de l’activité antibactérienne réalisé a

montré que l’espèce Daucus carota L. n'a montré aucun effet antibactérien contre les

souches bactériennes utilisése.

Mots clés: Daucus carota L., Extrait aqueux, Extrait éthanolique, Extrait éthérique,

Activité antioxydante, Activité antibactérienne, Stress oxydatif, Métabolite secondaire.

Abstract

The carrot plant is characterized by their particular mode of adaptation to the

environment. Some species have pharmacological properties, which make them of

medicinal interest. In Algeria, we are trying to better understand the heritage of

spontaneous species used in traditional medicine as well as their active ingredients. It is

in this context the objective of our study consists of the phytochemical, antioxidant and

antibacterial study of the three aqueous, ethanolic and ethereal extracts of the aerial part

(the seeds) of the carrot plant. This is Daucus carota L., this plant has undergone an

extraction by maceration in (water, ethanol and ether) to obtain the aqueous, ethanolic

and ethereal extract. The extraction yield is approximately 13.22%, 11.99% and

11.007% respectively.

Through this study, we have demonstrated the existence of flavonoids,

polyphenols, tannins, alkaloids, polyterpene and sterol in this plant. The polyphenol

contents are higher in the ethanolic extract (1024.6 ± 49.8 µg EAG / g ES) compared to

other aqueous and ethereal extracts (1015.1 ± 10.9, 820.77 ± 12.33 µg EAG / g ES)

respectively. However, the flavonoid contents are very important in these species in the

different extracts the higher content is recorded for the ethanolic extract (858.95 ± 12.33

µg / mg ES) followed by the aqueous extract (824.37 ± 3.05µg / mg ES) and (655.55 ±

8.81 µg / mg ES) for the ethereal extract. The antioxidant activity by the DPPH method

is greater for the etheric extract with an IC50 value of 41.677 ± 0.577 μg / ml followed

by the ethanolic extract (42.677 ± 1.528 μg / ml) and the aqueous extract (85.00 ± 13.08

μg / ml). These three extracts are very active compared to ascorbic acid. By reducing

iron (FRAP test), it is the ethanolic extract which has been shown to be the most active

in reducing iron (10.916 ± 0.219 mg / g ES) followed by the aqueous extract (8.351 ±

0.225 mg / g ES) and etheric extract (7.6487 ± 0.894 mg / g ES). The antibacterial

activity test performed showed that Daucus carota L. species lacked the antibacterial

effect against the bacterial strains used.

Keywords: Daucus carota L., Aqueous extract, ethanolic and ethereal, Antioxidant

activity, Antibacterial activity, Oxidative stress, Secondary metabolite

هلخص

طشمخ انخبطت ـ انخكؿ يع انبئت. بعض الأاع نب خظبئض دائت حجعهب راث بببث انجزس خز

ـبئذة طبت. ـ انجزائش، حبل أ فى بشكم أـضم حشاد الأاع انسخخذيت ـ انطب انخمهذ ببلإضبـت إن

كسذة نلأ ةضبدانانشبطت انفخكبئتساست ذانيكبحب انفعبنت. ـ زا انسبق، خك ذؾ دساسخب ي

ش نهجزء انج )انبزس( ي ببث انجزس. زا زنهسخخهظبث انبئ الإزبن الإ كشببثانضبدة نه

Daucus carota L.( نهحظل زشالإزبل الإ ء)انب ـ ع طشك انمع سخخلاص. لذ خضع زا انببث نلا

٪ 11.007٪ 11.99٪ 13.22حان الاسخخلاصزش. بهػ يشدد خهض انبئ الإزبن الإعه انسخ

عه انخان.

ذاث انمه انخببث ثانبنفلا اثي خلال ز انذساست أربخب جد يشكببث انفلاـذ

± 1024.6ـ انسخخهض الإزبن ) أعه ث. يحخبث انبنفلاانببثـ زا ثانسخشلا بثخشبانبن

زشت لإيمبست ببنسخخهظبث انبئت ا انجبؾ( ي انسخخهض غ/ ؽبنكنيكبـئ ي حض ايكشؼشاو 49.8

عه انجبؾ(ي انسخخهض غ/ ي حض انؽبنكيكشؼشاو 12.33± 820.77 ،10.9± 1015.1الأخش )

خى حسجم انسخخهظبث حذيخخهؿ ـ زا انعيت جذا ـ اثذـإ يحخبث انفلاـ رنك،يع انخان.

ي انسخخهض يػيكشؼشاو يكبـئ ي انكشسخ / 12.33± 858.95 ) نهسخخهض الإزبن أعه يحخ

يكشؼشاو يكبـئ ي انكشسخ / يػ ي انسخخهض 3.05± 824.37)انجبؾ( يخبعب ببنسخخهض انبئ

.الإزشي انسخخهض انجبؾ( نهسخخهض يػيكشؼشاو يكبـئ ي انكشسخ / 8.81± 655.55) (بؾانج

( أكبش ببنسبت نهسخخهض الأرش DPPH) انحشة حزبظ انجزس ك شبط يضبداث الأكسذة باسطت طشمت

1.528± 42.677زبن )يخبعب ببنسخخهض الإ (يكشؼشاو / يم 0.577± 41.677)حبهػ IC50بمت

راث شبط يكشؼشاو / يم(. ز انسخخهظبث انزلارت 13.08± 85.00)يكشؼشاو / يم( انسخخهض انبئ

ـمذ ربج أ انسخخهض الإزبن (،FRAPيمبست بحض الأسكسبك. ع طشك حمهم انحذذ )اخخببس يى جذا

8.351ه انسخخهض انبئ غ ي انسخخهض انجبؾ / يػ 0.219± 10.916 الأكزش شبطب ـ حمهم انحذذ

. غ ي انسخخهض انجبؾ/ يػ 0.894± 7.6487 الإزشانسخخهض ي انسخخهض انجبؾ غ/ يػ ±0.225

حفخمش إن انخأرش انضبد نهبكخشب ضذ انسلالاث Daucus carota Lأ أظش اخخببس انشبط انضبد نهبكخشب

انبكخشت انسخخذيت.

، نهبكخشب يضبد شبط ، نلأكسذة يضبد شبط ، زشإ إزبن يبئ، يسخخهض انجزس، :الوفراحح النلواخ

.تزبان بثبسخملاان ، انخأكسذ الإجبد

Liste des abréviations

AlCl3 : Trichlorure d'aluminium

EAq : Extrait aqueux

Cl: colure

cm : centimètre

DMSO : Dimethyl sulfoxide

DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyle

D.carota L.: Daucus carota L.

EtOH : Extrait hydro-alcoolique

FeCl3: Chlorure de fer

FRAP: Ferric reducing antioxidant

power

FV : Flavonoïdes

H : Hydrogène

H2O : eau

H2SO4 : Acide sulfurique

HCl : Acide chlorhydrique

IC 50 : Concentration inhibitrice 50

K: Potassium

K3Fe : Ferricyanure de potassium

M : molaire

min : minute

ml : millilitre

Mo8O23 : Molybdénee

Na: sodium

Na2CO3 : Bicarbonate de sodium

Nm : nanomètre

NS : différence Non Significative

O2 : Oxygène

OH : hydroxyle

OMS : Organisation Mondiale de la

Santé.

PEB : Poids de l’Extrait Brut

PH : potentiel Hydrogène

PMV : Poids de matière végétale

PP : Polyphénols

RL : Radical

SOD : Superoxide dismutase

Tm : Température de

tr/min : Tour par minute

UV : Ultraviolet

UV-Vis : UltraViolet-Visible.

Vis : Visible

W8O23 : Oxydes bleus tungsténe

°C : Degrés Celsius C

μg EAG/g MS : Microgramme

d’équivalent d’acide gallique par

gramme de extrait sec.

μg EQ/mg MS : Microgramme

d’équivalent de quercétine par

milligramme de extrait sec.

μg EAA/mg MS : Microgramme

d’équivalent d’acide ascorbique par

millilitre de extrait.

mg EAA/µg MS : Milligramme

d’équivalent d’acide ascorbique par

gramme de extrait sec

Liste des figures

Figure 01: Répartition géographique mondiale des Apiaceae. ........................................ 6

Figure 02: Les fleurs de Daucus carota.. ........................................................................ 8

Figure 03: les graines de Daucus carota.. ....................................................................... 9

Figure 04 : l’ombelle florale. ........................................................................................... 9

Figure 05: Structure de base des composés phénoliques. .............................................. 14

Figure 06 : Différentes classes des composés phénoliques ........................................... 15

Figure 07 : Structure de base des flavonoïdes ............................................................... 16

Figure 08: Structures chimiques des flavonoïdes. ......................................................... 16

Figure 09 : Structure chimique de quelques alcaloïdes. ................................................ 17

Figure 10 : Structure générale de tanins condensés ...................................................... 19

Figure 11 : Structure générale de tanins hydrolysables. ................................................ 19

Figure 12 : Structure chimique des coumarines. ........................................................... 22

Figure 13 : Structure de ramification des coumarines simples. ..................................... 22

Figure 14 : Structure de ramification des coumarines complexes (A: 6,7

furocoumarines linéaire, B: 7,8 furocoumarines angulaire). .............................. 22

Figure 15: Classification des antioxydants. ................................................................... 26

Figure 16: Illustration de la méthode des aromatogrammes sur boîte de Pétri ............. 29

Figure 17 : Les graines de l'espèce Daucus carota L. ................................................... 32

Figure 18: Protocole de préparation de l'extrait aqueux, éthanol et éther de graines

Daucus carota L.................................................................................................. 35

Figure 19 : Protocole de dosage des polyphénols totaux ............................................... 38

Figure 20 : Protocole de dosage des flavonoïdes. .......................................................... 39

Figure 21 : Mécanisme réactionnel intervenant lors du test DPPH• entre l’espèce

radicalaire (DPPH•) et un antioxydant (AH). ..................................................... 40

Figure 22 : Protocole de dosage de l’activité antioxydants par le test DPPH. ............ 41

Figure 23 : Réaction FRAP entre Fe3+-TPTZ et l’antioxydant. ................................... 41

Figure 24 : Protocole de détermination du pouvoir réducteur. ...................................... 43

Figure 25 : Stérilisation les disques à L'autoclave. ........................................................ 45

Figure 26 : Protocole de détermination l’activité antibactérienne. ................................ 46

Figure 27 : Exemple sur le test phytochimiques des alcaloïdes et tanins des différents

extraits des graines Daucus carota L. ................................................................. 49

Figure 28: Teneurs en polyphénols des différents extraits expérimentaux des graines

Daucus carota L.................................................................................................. 51

Figure 29: Teneurs en flavonoïde des différents extraits expérimentaux des graines

Daucus carota L.................................................................................................. 52

Figure 30 : La décoloration de couleur violette qui vire vers le jaune de test de DPPH 53

Figure 31: IC50 de test DPPH des différents extraits expérimentaux des graines Daucus

carota L.. ............................................................................................................. 54

Figure 32: Teneurs en FRAP des différents extraits expérimentaux des graines Daucus

carota L. .............................................................................................................. 56

Figure 33: Courbe d’étalonnage pour le dosage des polyphénols. ................................ 85

Figure 33: Courbe d’étalonnage pour le dosage des flavonoïdes. ................................ 85

Figure 33: Courbe d’étalonnage pour le test de DPPH. ................................................. 85

Figure 33: Courbe d’étalonnage pour le test de FRAP. ................................................. 86

Liste des tableaux

Tableau 01 : Les noms de plante Daucus carota. ........................................................... 7

Tableau 02 : Classification systématique Daucus carota. ............................................... 7

Tableau 03 : Différents composes de Daucus carota. ................................................... 10

Tableau 04 : Rendement, couleur et aspect des extraits secs des graines Daucus carota

L. ......................................................................................................................... 49

Tableau 05 : Résultats des tests phytochimiques des trois extraits aqueux, éthanolique

et éthérique des graines Daucus carota L. .......................................................... 50

Tableau 06 : Teneurs en polyphénols (moyenne ± écart-type) dans les trois extraits

aqueux, éthanolïque et éthylique des graines Daucus carota L. ......................... 51

Tableau 07 : Teneurs en flavonoïdes (moyenne ± écart-type) dans les trois extraits

aqueux, éthanoïque et éthylique des graines Daucus carota L.. ......................... 52

Tableau 08: IC50 de l’extrait brut et l’acide ascorbique (moyenne ± écart-type) dans les

trois extraits aqueux, éthanoïque et éthylique des graines Daucus carota L. ..... 54

Tableau 09 : L’activité réductrice du fer (moyenne ± écart-type) dans les trois extraits

aqueux, éthanolique et éthérique des graines Daucus carota L. ......................... 55

Tableau 10 : Etude de l’activité inhibitrice d’extraits de graine Daucus carota L. ...... 57

Sommaire

Dédicace .............................................................................................................................

Remerciements ..................................................................................................................

Résume ...............................................................................................................................

Liste des abréviations .......................................................................................................

Liste des figures .................................................................................................................

Liste des tableaux ..............................................................................................................

Sommaire ...........................................................................................................................

Introduction générale .................................................................................................. 1-2

Première Partie : Etude Bibliographique

Chapitre I : Généralité sur la plante étudiée

I.1.La famille des Apiaceae .......................................................................................... 5

I.2. Le plant Daucus carota ......................................................................................... 6

I.2.1. Le définitions et description botanique ............................................................... 6

I.2.2. Les noms de plante Daucus carota ..................................................................... 7

I.2.3. Le répartition de Daucus carota ......................................................................... 7

I.2.4. Le classification de la plante . ............................................................................ 7

I.2.5. Le description morphologique et cycle de vie .................................................... 8

I.2.6. Les composition chimique ................................................................................ 10

I.2.7. L’utilisation traditionnelle de la plante ............................................................. 10

CHAPITRE II : Les métabolites secondaires et l'activité biologique

I. Généralité sur les métabolites secondaires ............................................................. 13

I.1. Le définition des métabolites secondaires ........................................................... 13

I.2. Les classification des métabolites secondaires .................................................... 13

I.2.1. Les composés phénoliques ...................................................................... 13

I.2.2. Les flavonoïdes ....................................................................................... 16

I.2.3. Les alcaloïdes .......................................................................................... 17

I.2.4.Les tanins .................................................................................................. 18

I.2.5.Les huile essentielle ................................................................................. 20

I.2.6. Les coumarines ........................................................................................ 21

II. Les activités biologiques ....................................................................................... 23

II.1. Les activités antioxydants................................................................................... 23

II. 1.1. Introduction ........................................................................................... 23

II.1.2.Le stress oxydatif et les radicaux libres .................................................. 23

II.1.3. L’activité antioxydante .......................................................................... 25

II.1.3.1. L’antioxydants…………………………………………………….…25

II.1.3.1.1. Le classification des antioxydants………………...……………….25

II.2. L’activité antibactérienne ................................................................................... 27

Deuxième partie: Etude expérimental

CHAPITRE I : Matériels et Méthodes

I.1 Les matériel........................................................................................................... 32

I.1.1. Les matériel biologique .................................................................................... 32

I.1.2. Les matériel de laboratoire ............................................................................... 33

I.2. Les méthodes ....................................................................................................... 34

I.2.1. Les préparation des différents extraits à partir des graines de Daucus carota L.

(Extraction par macération) ............................................................................................ 34

I.2.2. Les tests phytochimiques .................................................................................. 36

I.2.3. Les méthodes d’analyse quantitative de l'extraits ............................................. 37

I.2.3.1. Les dosages de la composition phénolique………………………….…...37

I.2.4. L’évaluation de l’activité biologique ................................................................ 39

I.2.4.1. L’évaluation de l’activité antioxydants de l'extraits……………………..39

I.2.4.2. L’évaluation de l’activité antibactérienne de l'extraits…………………..43

I.2.5. Les analyses statistiques ................................................................................... 47

CHAPITRE II : Résultats et discussion

II.1. Résultats ............................................................................................................. 49

II.1.1. Les rendements ................................................................................................ 49

II.1.2. Les tests phytochimiques ................................................................................. 49

II.1.3. Les détermination des teneurs des composés phénoliques .............................. 50

II.1.4. L’évaluation de l’activité biologique............................................................... 53

II.1.4.1. L’évaluation de l’activité antioxydant de l'extraits…………..…………53

II.1.5.1. L’évaluation de l’activité antibactérienne de l’extraits ........................... 56

II. Discussion ............................................................................................................. 58

Conclusion ..................................................................................................................... 63

Références bibliographique ......................................................................................... 66

Annexes .......................................................................................................................... 82

Introduction générale


1

Depuis plusieurs années, l’utilisation des plantes médicinales ou des préparations

à base des plantes connaît un succès croissant. Ainsi, d’après les estimations, 80% de la

population mondiale dépend principalement de la médecine traditionnelle (OMS, 2012),

(Jean et Jiri 1983). Elles jouent un rôle croissant dans la santé humaine. Environ 25%

des médicaments d'ordonnances couramment utilisés proviennent de plantes

médicinales traditionnellement utilisées (Chaouche et al., 2015).

En Algérie en général et au Sahara en particulier, l’état de la flore spontanée dans

cette zone ainsi que les relations entre l’homme et les espèces végétales méritent une

attention particulière. Certaines espèces possèdent des propriétés pharmacologiques qui

leur confèrent un intérêt médicinal. Les plantes médicinales sont extrêmement

nombreuses. En effet, les estimations indiquent que plus de 13000 espèces de plantes

médicinales sont utilisées comme remèdes traditionnels par diverses cultures dans le

monde entier (Chaouche et al., 2013). Ces plantes ont l’aptitude de synthétiser de

nombreux composés appelés métabolites secondaires et constituent donc un immense

réservoir de composés d’une grande diversité chimique, possédant un large éventail

d’activités biologiques (Jean et Jiri, 1983). C’est le cas par exemple des polyphénols

végétaux dont le principale qui sont largement utilisés en thérapeutique comme

antimicrobiens, antioxydants et antihémolytiques. Avec d’autres catégories : les

flavonoïdes, les huiles essentielles, les térpenoides et les alcaloïdes (Chaouche et al.,

2015 et Yakhlef, 2010). L’étude de la chimie des plantes reste d’actualité malgré son

ancienneté. Cela tient principalement du fait que le règne végétal représente une source

d’une immense variété de molécules bioactives possédant un très large éventail

d'activités biologiques (Ferrari, 2002).

Au cours des dernières années, des études sur les activités antioxydants des

plantes médicinales ont augmenté de façon remarquable grâce à leur potentiel d’être

utilisées en tant que sources d’antioxydants riches et naturelles (Chaouche et al., 2013,

Hadduchi et al., 2014).

La thérapeutique des infections bactériennes se base principalement sur l’usage

des antibiotiques produite du plant médicinal (Billing et Sherman, 1998). Les

composes de plante qui portée cette activité telles que polyphénols notamment les

flavonoïdes et les tannins sont reconnus par leur toxicité vis- à -vis des microorganismes

(Cowan, 1999).

En Algérie, l’industrie pharmaceutique, mais également des médecins et des

chimistes cherchent à mieux connaître le patrimoine des espèces spontanées utilisées en


2

médicine traditionnelle. Leurs modes d'utilisation, leurs indications dans diverses

pathologies ainsi que les principes actifs sont étudiés depuis plusieurs années (Djebaili,

1984; Bouattoura, 1988; Maizak et al., 1993). Par ailleurs, on ne peut que se réjouir

du fait que l’Algérie est un bon exemple de pays en développement qui a pris

conscience de la richesse et de l’importance de sa médecine traditionnelle puisque tout

en s’efforçant de moderniser son système de santé sur le modèle occidental, elle rend

prioritaire l’étude des plantes médicinales par les laboratoires de recherche

universitaires, dans le but de rationaliser leurs utilisations encore très répandues dans ce

pays .

A la lumière de ces données, l’objectif principal de notre travail était la validation

de certaines propriétés de la plante Daucus carota L., via l’étude phytochimique, et

l’investigation des activités antioxydant et antibactérienne des trois extraits aqueux,

éthanolïques et éthérique de partie aérienne (les graines) de plante Daucus carota L.

Cette étude a été divisée en deux parties. Dans une première partie, nous

résumerons une étude bibliographique sur les connaissances botaniques et

phytochimiques de l'espèce étudiée Daucus carota L. Cette partie comprend aussi des

généralités sur les activités antioxydants et antibactériennes. La seconde décrit la partie

expérimentale, avec une présentation des techniques d’extraction, les méthodes de

dosage des composes phénoliques ainsi que les méthodes d’évaluation des activités

biologiques. La troisième partie consiste en une analyse des résultats obtenus et une

discussion qui mettra l’emphase sur leur signification. Enfin le manuscrit se termine par

une conclusion générale.

Première Partie: Etude

Bibliographique

Chapitre I: Généralité sur la

plante étudiée

Chapitre 1 Généralité sur le plant étudié

5

I.1. La famille des Apiaceae

Cette famille regroupe près de 3000 espèces, réparties en 420 genres qui sont

surtout présentes dans les régions tempérées et plus particulièrement dans l'hémisphère

Nord, Elle est très homogène, facilement reconnaissable par ses inflorescences en

embelles. Cependant, il est parfois difficile de distinguer les unes des autres (Sáenz

Laín et al., 1981).

Cette famille riche en métabolites secondaires présente des intérêts économiques

et médicinaux, comportant des coumarines, flavonoïdes, polyphénols, composés

acétyléniques et des lactones sesquiterpéniques (Sáenz, 1981).

Caractères morphologiques généraux des Apiacées:

- sont généralement des herbes qui sont annuelles comme cerfeuil, bisannuelles

comme la carotte ou, le plus souvent vivaces. L’appareil souterrain pérennant peut être

une racine pivotante, un rhizome ou un tubercule.

- La tige est fistuleuse.

-Les feuilles sont alternes et isolées, munies à leurs bases d’une gaine très

développée, et dépourvue de stipule. L'inflorescence typique des Apiacées, justement

appelées ombellifères.

- Les fleurs, petites, à symétrie pentamère, sont le plus souvent blanches ou

jaunâtres, quelquefois rougeâtres comme la fleur centrale de l'ombelle de carotte.

L'ovaire porte deux styles qui s'élargissent à la base en un disque ou coussinet

nectarifère (stylopode).

- Les fruits, secs, sont des schizocarpes (diakènes) qui se scindent en deux à

maturité, chaque partie contenant une graine qui sont importants à observer pour la

détermination des espèces (Mazzoni, 1999).

- Les genres se répartissent entre les divers continents, avec une prédominance

pour le continent asiatique (265), Amérique (197), Europe (139), Afrique (126),

Australie (36). (Meng-lan et al., 2005).


6

Figure 01: Répartition géographique mondiale des Apiaceae (Meng-lan et al., 2005).

La famille des Apiaceae occupe une place importante dans la flore Algérienne où

elle est représentée par 56 genres, 130 espèces (dont 24 endémiques) et 26 sous espèces

(Pujadas Salvà et al., 2003).

I.2. Le plante Daucus carota

I.2.1. Le définitions et description botanique

Le genre Daucus est plus répandu de la carotte, est une plante bisannuelle de

climats tempérés, appartenant à la famille des Apiacées, anciennement appelée famille

des Ombellifères. (Downie et Katz-Downie, 1996). Le genre Daucus est le plus étudié

de cette famille comprend 22 espèces, parmi lesquelles Daucus carota est la plus

répandue et indigène, commune en Europe (Reduron, 2007). A été rapporté est riche en

métabolites secondaires tels que les flavonoïdes, les coumarines, les polyphénols , les

huiles essentielles, les stérols et les tanins. (Reduron, 2007).

Les espèces qui appartiennent au genre Daucus possèdent des propriétés

thérapeutiques, elles sont non seulement utilisées dans la médicine traditionnelle, mais

aussi dans l’industrie alimentaire et pharmaceutique. (Bach et al., 1979)


7

I.2.2. Les noms de plante Daucus carota

Synonyme : Daucus sativus, Daucus azoricus.

Tableau 01 : Les noms de plante Daucus carota.

Nom vernaculaire Zaroudia

Anglais Carrot

Français Carotte ou Dentelle de la reine Anne

Bambara Carotii

Sonrhai Carotto

Arabe جزس

I.2.3. Le répartition de Daucus carota

Cette plante est originaire d’Europe (Clotault, 2009); des sous-espèces sont

cultivées dans le monde entier ainsi que la présence des ces plant au Moyen-Orient et en

Afrique du Nord, (Banga, 1963 ; Clotault, 2009 ; Ferradji et al., 2010), en Algérie le

genre Daucus est représenté par des espèces vivants dans les zones arides et incultes très

répandues le long de la côte ouest Algérienne (Mazzoni et al., 1999). La récolte de

racines et ses graines se fait dès la fin de l’été. Au Mali elle est cultivée dans toutes les

régions.

Selon Foury et Pitrat (1994), la carotte est, de nos jours, un des légumes le plus

largement cultivé et réparti dans toutes les zones climatique.

I.2.4. Le classification de la plante (Botineau, 2010).

Le plant Daucus carota est classé dans le tableau suivant :

Tableau 02 : Classification systématique Daucus carota.

Régne Plantae

Sous-règne Viridaeplantae

Empire Eukaryota

Embranchement Tracheophyta

Sous-embranchement Euphyllophytina

Infra-embranchement Radiatopses

Classe Magnoliopsida

Sous-classe Cornidae

Superordre Aralianae

Ordre Araliales

Famille Apiaceae

Sous famille Apioideae

Tribu Caucalideae

Genre Daucus

Espèce carota L.


8

I.2.5. Le description morphologique et cycle de vie

Le Plante: est une plante de taille moyenne (0,6 à 2 m au moment de la

floraison). Nous la connaissons pour sa racine pivotante développée en organe de

réserve, charnue, cassante, pigmentée (rarement blanche), agréable au goût et non

ramifiée (en sol meuble, sans obstacle) (Reduron, 2007).

Les feuilles: Les feuilles sont minces, souvent mates, avec un pourtour

triangulaire. Elles sont très divisées-pennées, à divisions écartées très allongées, étroites,

linéaires ou lancéolées-linéaires (Reduron, 2007).

Les fleurs: Les inflorescences sont constituées de grandes ombelles composées de

fleurs blanches jaunâtres, allogames et protandres1, regroupées en ombellules. Chaque

fleur est constituée de cinq sépales, cinq pétales, cinq étamines et deux carpelles

(Figure 02). (Tirilly et Bourgeois, 1999)..

Figure 02: Les fleurs de Daucus carota. (Bach et al., 1979).

Les graines: Le fruit (communément appelé graine de façon abusive) est un

diakène albuminé de forme elliptique (Tirilly et Bourgeois, 1999). qui contiennent des

flavonoïdes, les polyphénols et une huile essentielle dont l’asarone, de carotol, de

pinènes, et de limonène, sesquiterpène, β-bisabolène. Les graines a contribué à la

réduction du stress oxydatif et ont montré une réduction significative du taux de

cholestérol total, de triglycérides et de HDL, VLDL (Singh et al., 2010).


9

Figure 03: les graines de Daucus carota. (Photo original).

La floraison: est estivale ; la durée de cette floraison est de 7 à 10 jours pour une

ombelle donnée, mais de 30 à 50 jours pour la plante entière (Rubatzky et al., 1999).

Figure 04 : l’ombelle florale (Rubatzky et al., 1999).

Récolte: Pour la carotte de primeur, la récolte intervient entre la mi-avril et le

début mai. Pour la carotte de saison, qu'elle soit destinée au marché de frais ou à la

transformation, la récolte se fait entre juin et mai de l'année suivante selon les régions.

En région non exposée au gel, les racines sont arrachées au fur et à mesure des besoins

(Truffaut, 1978).

Conservation: Les Carottes peuvent se conserver en terre, en recouvrant la

planche de feuilles mortes à l'approche des grands froids. C'est même le meilleur

procédé lorsque les Limaces et les Rongeurs ne sont pas trop à craindre (Truffaut,

1978).


10

On peut encore arracher les Carottes en novembre, et les conserver en silo ou en

cave, de préférence enfouies dans du sable. La pourriture due au Sclérotinia sera évitée

par désinfection ou chaulage de la cave à légumes (Truffaut, 1978).

I.2.6. Les composition chimique

Ont été mis en évidence la partie aérienne et la racine Daucus carota. Ces

différents composent telles que les métabolites secondaires sont consignés dans le

tableau 03.

Tableau 03 : Différents composes de Daucus carota.

Compose Référence

Eau

(Fokone, Edoun et al, 2013. et

Maiani et al, 2009).

Energie

Protéines

Lipides

Glucides

Fibres alimentaires

Minéraux : Ca, Mg, P, Fe, Zn

Caroténoïdes

Flavonoïdes

Acide ascorbique

Anthocyanes

Les vitamines : vitamine A, C.

L’asparagine

I.2.7. L’utilisation traditionnelle de la plante

Daucus carota est utilisée en médecine traditionnelle grâce à ses propriétés

hypolipidémique, antinoceptive et anti-inflammatoire, antioxydants.

P

lusieurs études épidémiologiques ont montré une corrélation négative entre la

consommation de carotte et l’apparition de certains cancers, certaines maladies

cardiovasculaires et les maladies liées au vieillissement comme la cataracte (Cao

et al., 1998 ; Koca et al., 2007).

Renforce l’action du foie, la sécrétion d’urines. La vitamine A contenue améliore

la vision. La racine est un traitement des oxyures chez l’enfant. Les feuilles sont

un bon diurétique, sont utilisées contre les cystites, soignent les troubles digestifs


11

et atténuent les flatulences. Les graines stimulent les règles, les flatulences et

soignent les troubles digestifs (Chevallier, 1996).

Plusieurs composants impliqués dans la protection contre le maladie

cardiovasculaires comme la vitamine C, les flavonoïdes (Pool-Zobel et al., 1997;

Van Den Berg et Van Vliet, 1998) et les caroténoïdes (Bub et al., 2000 ;

Voutilainen et al., 2006).

De nombreux travaux scientifiques ont montré que les caroténoïdes contenus dans

la plante de carotte participent dans la lutte contre le cancer des poumons, du sein

et de la prostate, mais aussi des tumeurs de l’estomac, de l’intestin ou de

l’oseophage (De Groot, 1998).

Deux études récentes ont montré que la consommation de la carotte augmentait la

capacité antioxydante et le taux de la vitamine E dans le sang (Nicolle et al.,

2003).

Du carotène et des oléorésines sont extraits de Daucus carota pour les industries

pharmaceutiques et cosmétiques (Doré et Varoquaux, 2006).

CHAPITRE II: Les

métabolites secondaires et

l'activité biologique

CHAPITRE II Les métabolites secondaires et l'activité biologique

13

I. Généralité sur les métabolites secondaires

I.1. Le définition des métabolites secondaires

Les métabolites secondaires végétaux peuvent être définis comme des molécules

indirectement essentielles à la vie des plantes, par opposition aux métabolites primaires

(protéines, lipides et glucides). Ces métabolites secondaires interviennent dans la

structure des plantes (lignines et tannins) mais également, elles exercent une action

déterminante sur l’adaptation des plantes à leur environnement (Mansour, 2009).

Ils participent ainsi, d’une manière très efficace, dans la tolérance des végétaux à

des stress variés : action anti-herbivore (menthe par exemple), inhibition des attaques

pathogènes des bactéries et des champignons, prédation d’insectes, défense contre la

sècheresse et lumière UV. Mais elles peuvent être anti-nutritives. Beaucoup de

métabolites secondaires sont toxiques, ils sont alors stockés dans des vésicules

spécifiques ou dans la vacuole (Sandrin, 2004).

D’un point de vue appliqué, ces molécules constituent la base des principes actifs

que l’on retrouve chez les plantes médicinales (Mansour, 2009).

I.2. Les classification des métabolites secondaires

Il existe plusieurs classifications de nombreux botanistes et chacune a un principe

et un point de vue différents. Et selon Mamadou, 2011 les métabolites secondaires sont

caractéristiques des plantes supérieur. Ces métabolites secondaires sont repartis en trois

grandes familles chimiques: les composés phénoliques, les terpénoides et les alcaloïdes.

I.2.1. Les composés phénoliques

I.2.1.1. Le définition et structure

Les poly-phénols sont des métabolites secondaires présents chez toutes les

plantes vasculaires. (Lebham, 2005). Ils constituent un des groupes le plus

nombreux et largement distribué des substances dans le royaume des végétaux

avec plus de 8000 structures phénoliques présents dans tous les organes de la

plante. Ils résultent biogénétiquement de deux voies synthétiques principales :

La voie shikimate et acétate (Lugasi et al., 2003).

L'élément structural de base est un noyau benzoïque auquel sont directement

liés un ou plusieurs groupes hydroxyles, libres ou engagés dans une autre fonction

chimique (éther, méthylique, ester, sucre...) (Bruneton, 1993).


14

Figure 05: Structure de base des composés phénoliques (Vermerris et Nicholson,

2006).

Les composés phénoliques sont des molécules hydrosolubles présentes dans tous

les végétaux. Ils ont divers effets sur la physiologie végétale de (part leurs actions

anti- bactériennes et anti -fongiques. Ils participent à la pigmentation des fleurs,

des légumes et de quelques fruits (raisins, agrumes, etc…). Certains d’entre eux

sont responsables d’amertume et d’astringence (Adrian et Frangne, 1991 ; Milane,

2004).

Les fonctions principales attribuées à ces composés chez les végétaux sont

la protection contre les pathogènes et les herbivores ainsi que la limitation des

dommages dus aux radiations UV. Dans ce cas, ils agissent par effet d'écran et

par effet anti oxydant (Lebham, 2005).

Les composés phénoliques (acides phénoliques, flavonoïdes simples et

proanthocyanidines) forment le groupe des composés phyto-chimiques le plus

important des plantes. (Beta et al., 2005).

I.2.1.2. Les classification des composés phénoliques

Il existe différentes classes de composés phénoliques, notamment : les acides

phénoliques, les flavonoïdes, les tannins, les stilbènes, les lignanes, les saponines, les

phytostérols ou bien phytostanols. Les plus importants sont : les acides phénols, les

flavonoïdes et les tannins.


15

Figure 06 : Différentes classes des composés phénoliques (Gervaise, 2004).

Les acides phénoliques sont largement répandus chez les plantes. Ils dérivent

principalement de l’acide benzoïque ou de l’acide cinnamique.

Les acides hydroxycinnamiques sont les acides phénoliques les plus largement

distribués parmi les plantes. Le principal représentant de cette famille est l’acide

caféique qui, par estérification avec l’acide quinique, est transformé en acide

chlorogéniqe (Tapiero, 2006).

I.2.1.3. L’activités biologiques des polyphénols

Les poly-phénols sont associés à de nombreux processus physiologiques

interviennent dans la qualité alimentaire, impliqués lorsque la plante est soumise à des

blessures Mécaniques. La capacité d’une espèce végétale à résister à l’attaque des

insectes et des microorganismes est souvent corrélée avec la teneur en composés

phénoliques (Bahorun, 1997).

Ces composés montrent des activités anti-carcinogènes, anti-inflammatoires,

antiathérogènes, anti-thrombotiques, analgésiques, antibactériens, antiviraux,

anticancéreux (Babar et al., 2007), anti-allergènes, vasodilatateurs (Falleh et al., 2008)

et antioxydants (Gomez et al., 2006).


16

I.2.2. Les flavonoïdes


Le terme flavonoïdes désigne une très large gamme de dérivés naturels de benzo-

Y-pyrane appartenant à la famille des polyphénols et très répondu dans les cellules

photosynthétiques (Šhergert et al., 2005). Cette dénomination vient du mot latin flavus

: jaune incluant les différents groupes dont les flavones, les flavonones, les isoflavones,

les flavonols, les catéchines et les pigments roses, rouges, pourpres et bleus nommés

anthocyanines (Alsalvar et al., 2005).

Ces substances se rencontrent à la fois sous forme libre ou sous forme de

glycosides. Le squelette de base à quinzeatomes de carbone, est constitué de deux unités

aromatiques (A et B), reliées par une chaîne de trois atomes de carbone (figure).

Environ 9000 structures ont été identifiées (Martens et Mithöfer, 2005).

Les composés de chaque sous classe se distinguent par le nombre, la position et la

nature des substituants (groupements hydroxyles, méthoxyles et autres) sur les deux

cycles A et B et la chaîne intermédiaire illustré dans la figure (Pietta, 2000).

Les flavonoïdes peuvent être subdivisés en plusieurs classes dont les plus

importantes sont: flavones, isoflavandiols, flavanols, flavondiols, aurones, chalcones,

anthocyanins (Effendi et al., 2008) .

Figure 07 : Structure de base des flavonoïdes (Rice-Evans, 1999)

Figure 08: Structures chimiques des flavonoïdes (Rice-Evans, 1999).


17

I.2.2.2. Les activités biologiques des flavonoïdes

Les flavonoïdes sont largement connus et étudiées dans le domaine médicinal on

leurs reconnait des activités antioxydants, anti-inflammatoires et anti-cancéreuses

(Halliwell et al., 2005), activités antivirales, antispasmodiques, antitumorales,

antiagrégation plaquettaires, antiallergiques, hypocholestérolémiantes, anti-

hypertensives et antimicrobiennes (Ferradji, 2010) , ils assurant la protection des tissus

contre les rayonnements solaires nocifs (Crozier et al., 1997; Stobieck et al., 2006).

I.2.3. Les alcaloïdes


Les alcaloïdes sont des substances organique le plus souvent d’origine végétale,

forment une grande famille de molécules chimiquement hétérogène, leurs

caractéristiques communes sont la présence d’au moins un atome d’azote et leur forte

activité biologique, l’atome d’azote accepte souvent un proton, ce qui leur confère un

caractère légèrement basique en solution (d’où leur nom d’alcaloïde). Dans leur grande

majorité, les alcaloïdes sont hétérocycliques, bien que quelque composé azoté

aliphatique (non cyclique) comme la mescaline et la colchicine soient parfois classés

dans les alcaloïdes (Sou thon et Buckingham, 1989 ; Cyril, 2001).

Figure 09 : Structure chimique de quelques alcaloïdes (Cyril, 2001).

I.2.3.2. Le classification selon la structure chimique

Selon leur structure chimique et surtout leur structure moléculaires, on peut diviser les

alcaloïdes en plusieurs groupes (Elbidi, 2016):


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Des phénylalanines: capasaicine du piment, colchicine du colchique.

Des alcaloïdes isoquinoléiques: morphine, ethylmorphine, codéine et papavérine

contenus dans l’opium du pavot.

Des alcaloïdes quinoléiques: tige feuillée de la rue commune.

Des alcaloïdes pyridiques et pipéridiques: ricine du ricin, trigonelline du

fenugrec.

Des alcaloïdes dérivés du tropane: scopolamine et atropine de la belladone.

Des alcaloïdes stéroïdes: racine de vératre, douce-amère ou acontie (aconitine).

I.2.3.3. Les activités biologiques des alcaloïdes

Les alcaloïdes provoquent chez l’Homme diverses réponses physiologiques par ce

qu’ils interférent avec les neurotransmetteurs.. De la préhistoire jusqu’à nos jours, les

alcaloïdes ou des extraits qui en renferment ont été utilises comme médicaments

relaxants musculaires, analgésique et tranquillisants. Une action sur la circulation

sanguine et améliore la circulation cérébrale avec une action antibiotique,

antiparasitaire, antihelminthique à doses variées (Hopkins, 2003 ; Judd et al., 2002).

I.2.4. Les tanins


Les tanins sont des composés phénoliques complexes, hydrosolubles ayant un

poids moléculaire. Ces composés sont naturellement produits par les plantes et se

caractérisent par leur facilité à se combiner aux protéines et sont formée d'unités

répétitives monomériques qui varient par leurs centres asymétriques, leur degré

d’oxydation. En générale, ils sont divisés en deux groupes : Les tanins condensés et les

tanins hydrolysables (Meddelton et al., 1993 ; Harbone et al., 1983).

a)- Les tanins condensés

Les tanins condensés ce sont des produits de la polymèrisation de flavan-3-ols

(cathéchines) et flavan-3,4-ols (leuco anthocyanidine), ces tanins sont largement

répandus dans l'alimentation humaine. Il sont aussi désignés sous le nom de "tanins

catéchiques" etne sont hydrolysables que dans des conditions fortement acides

(Peronny et al., 2007).


19

Figure 10: Structure générale de tanins condensés (Boubekri, 2014).

b)- Les tanins hydrolysables

Les tanins hydrolysables sont des esters de glucides ou d'acide phénols, ou de

dérivés d'acides phénols ; la molécule glucidique est en général du glucose, mais

dans certains cas des polysaccharides. Ce groupe de tanins est caractéristique des

Dicotylédones. Ils sont facilement hydrolysables par chimique ou enzymatique

(Guigniard, 1996 ; Makkar, 2003).

Figure 11: Structure générale de tanins hydrolysables (Boubekri, 2014).


20

I.2.4.2. Les activités biologiques des tanins

Le rôle biologique des tanins est lié à sa propre protection contre les infections

fongiques et bactériennes, les insectes et les animaux herbivores (Khanbabaee et Ree,

2001).

En outre, les tanins ont un très grand pouvoir, antiviral, anti-inflammatoire et une

activité antimutagène. Les plantes riches en tanins sont utilisées dans les cas de rhume,

de maux de gorge, les problèmes de sécrétions trop importantes, les infections internes

ou externes, blessures, coupures et brûlures (Laamari et Mostefaoui, 2017).

Les tanins peuvent exercer des effets nutritionnels bénéfiques chez les ruminants

qui en consomment des taux modérés. Plusieurs études suggèrent que la présence des

tanins condensés à un seuil inférieur à 6% est avantageuse et induit une amélioration des

performances animales, croissance et rendement en viande et en lait (Barry et al.,

1986) ; aussi, La présence naturelle des tanins dans les différents pâturages protège les

herbivores contre les ballonnements (Makkar, 2003).

I.2.5. Les huile essentielle

I.2.5.1. Le définition

Les huiles essentielles sont des substances huileuses, volatiles et odorantes qui

sont Sécrétées par les plantes aromatiques que l'on extrait par divers procédés dont

l’entraînement À la vapeur d’eau et l’hydro distillation (Oakes, et al., 2001), par

pressage ou incision des végétaux qui les contiennent. Elles se forment dans un grand

nombre de plantes comme sous-produits du métabolisme secondaire (Angus et al.,

1976). Elles sont très utilisées dans l'industrie des produits cosmétiques,

pharmaceutiques et agro-alimentaire (Eckert et Knutson, 1993). Les huiles essentielles

se retrouvent dans des glandes minuscules situées dans différentes parties de la plante

aromatique : les feuilles, les fleurs, les fruits, les graines, l'écorce et pour certaines

plantes dans les racines. Plus de 2000 espèces de plante sont riches en huiles essentielles

; elles sont reparties sur 60 familles dont les principaux sont: Lauraceae, Labiatea,

Umbelliferae, rutaceae, Compositae, Myrtaceae et les Pinaceae, Apiécés …… (Castro

et al., 1994).Les huiles essentielles des plantes ont trouvé leur place en aromathérapie,

en pharmacie, en parfumerie, en cosmétique et dans la conservation des aliments. Leur

utilisation est liée àleurs larges spectres d’activités biologiques reconnues (Jitaru et al.,

1997).


21

I.2.5.2. Le domaine d’utilisation des huiles essentielles

a)- Pharmacie

Dans des préparations pharmaceutiques, les terpènes phénoliques, comme le

thymol et le carvacrol, sont souvent utilisés comme antiseptiques, antibactériens, et anti

fongique (Zambonelli et al., 2004).

b)- Cosmétique et parfumerie

L’utilisation des huiles essentielles dans les crèmes et les gels permet de préserver

ses cosmétiques grâce à leurs activités antiseptiques, et antioxydants, tout en leur

assurant leur odeur agréable (Vargas et al., 1999). Elles sont utilisées aussi dans

l’industrie des produits de beauté, parfums, articles de toilette, et produits d’hygiène

(Sparg et al., 2004).

c)-Aromathérapie

Les huiles essentielles sont utilisées en milieu clinique pour soigner les maladies

inflammatoires telles que les rhumatismes, les allergies, ou l’arthrite et ainsi pour traiter

certaines maladies internes et externes : infection d’origine bactérienne ou virale,

trouble humorale ou nerveuse (Maruyama et al., 2005).

d)- Industrie agroalimentaire

En industrie alimentaire, le consommateur cherche toujours à avoir une

conservation saine et de longue durée pour les produits consommés ainsi qu’une qualité

organoleptique meilleure. Une technique pour réduire la prolifération des micro-

organismes réside dans l’utilisation des huiles essentielles (Lachowicz et al., 1998) .

I.2.6. Les coumarines


Les coumarines sont des molécules biologiquement actives, substances naturelles

aromatiques, la coumarine est utilisée en parfumerie. son odeur se rapproche de la

vanilline et du foin fraîchement coupé (Alilou, 2012). Les coumarines sont des

composés phénoliques ayant an squelette de base en C6 – C3, mais ils possèdent un

atome d'oxygène hétérocycle dans le cadre de l'unité C3, généralement hydroxylée en

position 7,en 6 et 6,7,8 (Casley-Smith et al., 1993).


22

Figure 12 : Structure chimique des coumarines ( Alilou, 2012) .

I.2.6.2. Les classification des Coumarine (Dean, 1952 ; Späth, 1937).

a)- Coumarines simples: Les coumarines les plus répandues dans le règne végétal

possèdent des substitutions (OH ou OCH3) en 6 et 7.

Figure 13 : Structure de ramification des coumarines simples.

b)-Coumarines complexes: On distingue les furocoumarines (ou furanocoumarines):

6,7 furocoumarines (linéaire)

7,8 furocoumarines (angulaire)

Figure 14 : Structure de ramification des coumarines complexes (A: 6,7

furocoumarines linéaire, B: 7,8 furocoumarines angulaire).


23

I.2.6.3. Les propriétés pharmacologiques des coumarines

Les coumarines se révèlent être des composés immunostimulantes provoquent

l’augmentation des lymphocytes T dans la circulation sanguine ( Havsteen, 2002).

l’activité antibactérienne : les coumarines sont efficaces contre les bactéries à

Gram positif (Delporte et al., 1999) .

En 1957, O’ Neal et son équipe ont montré l’efficacité des coumarines pour

bloquer Le cancer induit chimiquement par les radiations ultraviolettes. Ces

molécules sont capables de prévenir la peroxydation des lipides membranaires et

de capter les radicaux hydroxyles, superoxyde et peroxyles (Stefanova et al.,

2007).

II. Les activités biologiques

II.1. Les activités antioxydants

II. 1.1. Introduction

L'oxydation fait partie d'une réaction d'oxydo-réduction qui transfère des électrons

d'une substance vers un agent oxydant. Cette réaction peut produire des radicaux libres

qui entraînent des réactions en chaîne destructrices (Berra, 2015). la production de ces

radicaux au niveau cellulaire est étroitement contrôlée par un énorme système de

défense dit système antioxydant. Cependant, une surproduction de radicaux libres d'un

côté et (ou) une déficience du système antioxydant de l'autre côté, conduira à une

augmentation significative de la production de ces radicaux, qui submergent la défense

antioxydante et imposent un stress oxydatif pour le système physiologique (Kebili,

2016).

II.1.2.Le stress oxydatif et les radicaux libres

II.1.2.1. Le stress oxydatif

Le stress oxydatif est défini par la production excessive de molécules pro-

oxydantes appelées radicaux libres, ou une insuffisance du mécanisme antioxydants.

Le stress oxydant correspond à un déséquilibre entre génération d’espèces réactive de

l’oxygène et les défenses antioxydants de l’organisme, en faveur des premiers (Haleng

et al., 2007).

La plupart des maladies induites par le stress oxydant apparaissent avec l’âge, car

le vieillissement diminue les défenses antioxydants et augmente la production

mitochondriale des radicaux libre (Favier, 2003).


24

II.1.2.1.1. L’origine du stress oxydatif

La rupture d'équilibre entre le système pro-oxydant et antioxydant peut provenir

d'une défaillance nutritionnelle ou de la carence en un ou plusieurs antioxydants

apportés par la nutrition, comme les vitamines ou les oligo-éléments, présents en

quantité limitée dans l'alimentation. La mauvaise adaptation peut résulter d'anomalies

génétiques responsables d'un mauvais codage d'une protéine soit enzymatiquement

antioxydant, soit synthétisant un antioxydant (comme la gamma glutamyl synthétase

produisant le glutathion), soit régénérant un antioxydant. Généralement, le stress

oxydant sera la résultante de plusieurs de ces facteurs et affecte un tissu ou un type

cellulaire bien précis et non pas tout l'organisme (Favier, 2003).

II.1.2.1.2. Les conséquences du stress oxydatif

La production excessive de radicaux libres (RL) provoque des lésions directes de

molécules biologiques (oxydation de l'ADN, des protéines, des lipides et des glucides),

mais aussi des lésions secondaires dues au caractère cytotoxique et mutagène des

métabolites libérés notamment lors de l'oxydation des lipides. L'organisme peut aussi

réagir contre ces composés anormaux par production d'anticorps, qui malheureusement

peuvent aussi être des auto-anticorps créant une troisième vague d'attaque chimique

(Favier, 2003).

Le stress oxydatif est la principale cause de plusieurs maladies : cancer, cataracte,

sclérose latérale amyotrophique, syndrome de détresse respiratoire aigu, œdème

pulmonaire, vieillissement accéléré. Ainsi, le stress oxydatif est aussi un des facteurs

potentialisant l’apparition de maladies plurifactorielles telles le diabète, l’Alzheimer, le

rhumatisme et les maladies cardiovasculaires, etc. (Leverve et al., 2001).

II.1.2.2. Les radicaux libers

II.1.2.2.1. Le définition d’un radical libre

Un radical libre est une espèce chimique, atome ou molécule, contenant un

électron ou plusieurs non apparié. Extrêmement instable, ce composé peut réagir avec

les molécules les plus stables pour apparier son électron.

Les radicaux libres sont produits par divers mécanismes physiologiques car ils

sont utiles pour l’organisme à dose raisonnable. Cette production physiologique est

parfaitement maîtrisée par des systèmes de défense. Dans les circonstances normales, on

dit que la balance antioxydants/ pro-oxydants est en équilibre (Favier, 2003).


25

Dans des conditions normales elles sont générées en faible quantité et jouent un

rôle de messagers secondaires capables notamment de régulier le phénomène de

l’apoptose ou d’activer les facteurs de transcription (Haleng et al., 2007).

II.1.2.2.2. L’origine des radicaux libres

La production des espèces oxydantes est une conséquence inévitable du

métabolisme aérobie. En effet, l’organisme a besoin d’O2 pour produire de l’énergie

au cours des réactions dites de respiration oxydative. Cependant, une faible partie de

l’oxygène échappe à sa réduction en eau au niveau de la mitochondrie, elle peut alors

être à l’origine de la production de radicaux libres oxygénés (Chu et al., 2010).

Les autres sources de production de radicaux libres sont classées en deux

catégories les sources endogènes ou les RL sont des produits des réactions de

l’organisme, et les sources exogènes telque le tabagisme, les radiations UV, les

médicaments, le réactif chimique, les solvants industriels et la pollution (Pastre, 2005).

II.1.3.L’activité antioxydants

L’activité antioxydante est l’habilité d’un composé (dit antioxydant) à inhiber la

dégradation oxydative d’un substrat telle que la peroxydation des lipides et des

protéines (Pellegrini et al., 2003 ; Roginsky et Lissi, 2005). Cet antioxydant a pour

rôle d'empêcher les RL d'atteindre leurs cibles biologiques, d'où leur fonction de

protecteur chimique (Gardès-Albert et al., 2003).

II.1.3.1. L’antioxydants

Un antioxydant peut être définit comme toute substance capable, à concentration

relativement faible, d’entrer en compétition avec d’autres substrats oxydables et ainsi

retarder ou empêcher l’oxydation de ces substrats. Il doit être soluble dans les lipides,

efficace et non toxique, n’entraine ni coloration, ni d’odeur, ni saveur indésirable,

résistant aux processus technologiques, et stable dans le produit final (Estiki et Urooj.

2012).


26

II.1.3.1.1. Le classification des antioxydants

Les antioxydants peuvent être classés selon leur mode d’action, leur localisation

cellulaire et leur origine. On distingue deux grandes classes : Les antioxydants

enzymatiques et non enzymatiques (Figure 15).

Figure 15: Classification des antioxydants (Ratnam et al., 2006).


27

I1.1.3.1.2. Les mécanismes d’action des antioxydants

Les mécanismes d’action des antioxydants sont divers, incluant le captage de

l’oxygène singulier, la désactivation des radicaux par réaction d’addition covalente, la

réduction de radicaux ou de peroxydes, la chélation des métaux de transition (Favier,

2006).

D’une manière générale, un antioxydant peut empêcher l’oxydation d’un autre

substrat en s’oxydant lui-même plus rapidement que celui-ci. Un tel effet résulte d’une

structure de donneurs d’atome d’hydrogène ou d’électrons souvent aromatiques cas de

dérivés du phénol.

En plus leurs radicaux intermédiaires sont relativement stables du fait de la

délocalisation par résonance et par manque de positions appropriées pour être attaqué

par l’oxygène moléculaire. Les antioxydants sont en fait des agents de prévention, ils

bloquent l’initiation en complexant les catalyseurs, en réagissant avec l’oxygène, ou des

agents de terminaison capables de dévier ou de piéger les radicaux libres, ils agissent en

formant des produits finis non radicalaires. D’autres en interrompant la réaction en

chaine de peroxydation, en réagissant rapidement avec un radical d’acide gras avant que

celui-ci ne puissent réagir avec un nouvel acide gras. Tandis que d’autres antioxydants

absorbent l’énergie excédentaire de l’oxygène singlet pour la transformer en chaleur

(Yaacoub, 2009 ; Hellal, 2011)

II.2. L’activité antibactérienne

Dès la naissance, l'homme se trouve en contact avec des micro-organismes qui

vont progressivement coloniser son revêtement cutanéo-muqueux. Pour résister à ces

microorganismes de nombreux moyens sont mis en jeu. On peut schématiquement en

distinguer 3 groupes : les barrières anatomiques, les mécanismes de résistance naturelle

(ou innés) et l'immunité acquise (Kaufmann, 1997). La thérapeutique des infections

bactériennes se base principalement sur l’usage des antibiotiques. La prescription à

grande échelle et parfois inappropriée de ces agents peut entraîner la sélection de

souches multirésistantes d’où l’importance d’orienter les recherches vers la découverte

de nouvelles voies qui constituent une source d’inspiration de nouveaux médicaments à

base des plantes (Billing et Sherman, 1998). L'activité antibiotique correspondant à

activité d'une molécule ou composé présent au sein d'un végétal qui inhibe le

développement d'une bactérie ou la tue (Laamari et Mostefaoui, 2017). Ce sont ces


28

matériaux trouvés dans les plantes les polyphénols notamment les flavonoïdes et les

tannins sont reconnus par leur toxicité vis- à -vis des microorganismes (Cowan, 1999).

Les antibiotiques

Les antibiotiques, au sens strict, sont des produits élaborés par des micro-

organismes, mais on inclut généralement parmi eux antibiotiques les dérivés semi-

synthétiques et les produits entièrement synthétiques. Les antibiotiques qui inhibent

sélectivement certaines voies métaboliques des bactéries, sans exercer habituellement

d'effets toxiques pour les organismes supérieurs. Cette propriété les distingue des

antiseptiques (Bergogne - Berezin et Dellamonica, 1995).

Les antibiotiques sont divisés selon le mécanisme d'action en deux parties :

- Antibiotiques qui inhibent la croissance des bactéries come : Sulfonamide.

- Antibiotiques bactéricides come : Pénicilline (Monsieur, 2005).

Ces antibiotiques peuvent empêcher les fonctionnes de bactéries en :

- Arrêter la fabrication de la paroi cellulaire externe des bactéries, ce qui

conduit à leur décomposition puis à leur destruction.

- Arrêt des réactions métaboliques qui se produisent chez les bactéries.

- Influence sur la perméabilité de membrane cytoplasmique de la bactérie, ce

qui conduit à la mort des bactéries (Monsieur, 2005).

L’aromatogramme

Une technique utilisée en bactériologie médicale, a été réalisé pour étudier

l’activité antibactérienne appelée antibiogramme ou méthode par diffusion en milieu

gélosé ou encore méthode des disques. Cette méthode a l’avantage de s’appliquer à un

très grand nombre d’espèces bactériennes et d’avoir été largement évaluée par 50 ans

d’utilisation mondiale (Pibiri, 2006). La méthode est basée sur la détermination d'une

zone d'inhibition proportionnelle à la sensibilité bactérienne à l'antimicrobien présent

dans le disque. (Manuel terrestre de l'OIE, 2008). Ce test a été réalisé pour étudier

l’antibiogramme standard des germes utilisés et le comparer avec l’effet de nos extraits

bruts (Yakhlaf, 2010).


29

Figure 16: Illustration de la méthode des aromatogrammes sur boîte de Pétri (Zaika,

1988).

Deuxième partie: Etude

expérimental

CHAPITRE I: Matériels et

Méthodes

CHAPITRE I Matériels et Méthodes

32

I.1. Les matériel

Notre travail a été réalisé au sein du laboratoire pédagogique de biochimie de la

faculté des sciences de la nature et de la vie à l’université Echahid Hamma Lakhdar d’El

Oued.

I.1.1. Les matériel biologique

I.1.1.1. Les matériel végétal

Le matériel végétal utilisé dans cette étude expérimentale est les graines de carotte

(Daucus carota L.), espèce appartenant à la famille des (Apiaceae), anciennement

appelée famille des Ombellifères. Les graines sont été nettoyées puis broyées à l’aide

d’un broyeur électrique jusqu’à l’obtention d’une poudre fine. La poudre des graines

récupérée est conservée dans des flacons en verre fermés hermétiquement puis stockés à

l’abri de la lumière dans 4C°.

Figure 17 : Les graines de l'espèce Daucus carota L. (photo originale).

A : graine sec ; B : graine poudre

I.1.1.2. Les microorganismes utilisés

Les souches microbiennes utilisées dans cette recherche pour l’activité

antimicrobienne des extraits sont des souches référencées.


33

A. Les bactéries à Gram –

Escherichia coli

C’est une bactérie à Gram négatif, commensal du tube digestif de l’homme et de

l’animal, de forme non sporulée, de type aérobie facultative, généralement mobile grâce

aux flagelles, sa longueur varie de 2 à 6 μm, alors que sa largeur est de 1,1 à 1,5 μm,

elle représente la bactérie la plus impliquée dans les infections aigues d’appareil

urinaire, elle provoque également les diarrhées d’été, diarrhée infantile et les

intoxications alimentaires (Percival, 2004).

Pseudomonas aeruginosa

Ce sont des bacilles Gram négatif, de forme non sporulée, elles sont aérobies,

mobiles grâce à la présence de 1 à 2 flagelles, ce type de bactérie synthétise deux types

principaux de pigments pyocyanine : bleue phénazine, pyoverdine: jaune vert, il s’agit

de bactéries résistantes pour plusieurs antibiotiques (Percival , 2004). Pseudomonas

aeruginosa est responsable de 16% des cas de pneumonie nosocomiale, 12% des

infections urinaires, 8 % des infections suites aux blessures chirurgicales (Van Delden

et al., 1998)

Salmonella enterica serovar Typhi ATCC 14028

Ce sont des bacilles à Gram négatif, anaérobie facultatif, habituellement mobiles

grâce à une ciliature périt riche, mais des mutants immobiles peuvent exister

(Bourgeois et Mescle, 1996), responsables de la fièvre typhoïde humaine. Les

Salmonelles sont en général considérées comme pathogènes bien que leur virulence et

leur pouvoir pathogène varient énormément (Rodier et al,. 2009).

B. Les bactéries à Gram +

Staphylococcus aureus

Ce sont des cocci Gram positifs avec un diamètre de 0,5 à 1,5 μm, de forme non

sporulée, qui tendent à se grouper en paires, petites chaines, elles sont habituellement

non capsulées, ou possédant des capsules limitées, elles sont anaérobies facultatives. Le

Staphylococcus aureus représente l’agent commun des infections postopératoires de

blessures, endocardite aigue, intoxication alimentaire (Dworkin et al., 2006).

I.1.2. Les matériel de laboratoire

Les réactifs et les matériels utilisés dans les différents tests et dosage sont présenté

dans l’annexe.


34

I.2. Les méthodes

I.2.1. Les préparation des différents extraits à partir des graines de Daucus carota

L. (Extraction par macération)

A. L’extraction par macération à l’eau

L’extrait aqueux des parties aériennes de la plante sont les graines de carotte

(Daucus carota L.) ont été préparés selon la méthode décrite par Coulibaly et al.,

(2011). On a pris 50 g du matériel végétal broyé est mise à macérer dans 500 ml d’eau

distillée sous agitation magnétique et à une température ambiante. Cette macération est

répétée 3 fois successivement avec renouvellement du solvant chaque 24 heure. Les

macérât aqueux obtenus sont soumis à la double filtration sur papier filtre Whatman

N°1.

Les filtrats obtenus sont concentrés à l’évaporateur rotatif (Rotavapor BUCHI

Haeting bath R-210) à la température de 45°C et 50°C respectivement. Après séchage à

l’étuve (45 °C) pendant 24 h, les extraits brut a été stocké dans des flacons stériles

étiquetées et nommés Aq(M) puis conservées au congélateur à 4C° jusqu'à utilisés pour

les tests phytochimiques et biologiques.

B. L’extraction par macération à l’éthanol

L’extrait hydro-alcoolique des parties aériennes de la plante sont les graines de

carotte (Daucus carota L.) ont été préparés selon la méthode décrite par Coulibaly et

al., (2011). On a pris 50 g du matériel végétal broyé est mise à macérer dans 500 ml

d’un mélange éthanol-eau distillée (80/20: V/V) sous agitation magnétique et à une

température ambiante. Cette macération est répétée 3 fois successivement avec

renouvellement du solvant chaque 24 heure. Les macérât hydro-alcoolique obtenus sont

soumis à la double filtration sur papier filtre WhatmanN°1.




étiquetées et nommés EtOH (M) puis conservées au congélateur à 4C° jusqu'à utilisés

pour les tests phytochimiques et biologiques.


35

C. L’extraction par macération à l’éther

L’extrait hydro-alcoolique des parties aériennes de la plante sont les graines de

carotte (Daucus carota L.) ont été préparés selon la méthode décrite par Coulibaly et

al., (2011). On a pris 50 g du matériel végétal broyé est mise à macérer dans 500 ml

d’un mélange de éther (80/20 : V/V) sous agitation magnétique et à une température

ambiante. Cette macération est répétée 3 fois successivement avec renouvellement du

solvant chaque 24 heure. Les macérât hydro-alcoolique obtenus sont soumis à la double

filtration sur papier filtre WhatmanN°1.




étiquetées et nommés EtOH(M) puis conservées au congélateur à 4C° jusqu'à utilisés

pour les tests photochimiques et biologiques.

Figure 18 : Protocole de préparation de l'extrait aqueux, éthanol et éther de graines

Daucus carota L.


36

I.2.1.1. Les déterminations du rendement d'extraction

Le rendement désigne la masse de l’extrait déterminée après évaporation du

solvant, il est calculé suivant la formule décrite par (Falleh et al., 2008). Il est exprimé

en pourcentage par rapport à la masse initiale de la plante soumise à l’extraction.

R: est le rendement en %.

PEB: Poids de l’Extrait Brut (g).

PMV: Poids de matière végétale (g).

I.2.2. Les tests phytochimiques

Les tests phytochimiques sont réalisés sur l’extrait aqueux, éthanol et éther de

graines de Daucus carota L. Le but de mise en évidence l’existence de quelques

métabolites secondaires.

A. Des alcaloïdes: 1ml d’extrait a analysé additionnée d’une goutte de HCl

concentré, la solution obtenue est ajoutée 2 gouttes de réactif de Drajendorf.

L’apparition d’un précipité ou d’une coloration brune-rougeâtre indique la

présence des alcaloïdes (Bagre et al., 2007).

B. Des polyphénols: 1 ml d’extrait végétal, on ajoute deux gouttes de solution

alcoolique de chlorure ferrique à 2%. L’apparition d’une coloration bleue

noirâtre ou verte plus ou moins foncée signe la présence des composés

polyphénoliques (Bidie et al., 2011).

C. Des flavonoïdes: Réaction dite à la cyanidine (réaction de Shibata) : dans un tube

à essai, mettre 1mld’extrait végétal, ensuite ajouter 1ml d’alcool chlorhydrique

(4ml EtOH + 1ml HCl concentré), ajouter ensuite deux à trois copeaux de

magnésium. La présence d’une coloration rose-oranger ou violacée signe la

présence des flavonoïdes (Békro et al., 2007).

D. Des tanins: La présence des tanins est mise en évidence en ajoutant, 1ml de

l'extrait aqueux même pour l'extrait de éthanol et éther, 1 ml d'eau distillé et à

2gouttes des solutions de FeCl3 diluée. L'apparition d'une coloration vert

foncée ou bleu-vert indique la présence des tanins (Trease et Evans, 1987).

E. Des saponosides: 1 ml d’extrait végétal sont mis dans un tube à essai. Après avoir

le tube est agité pendant 15 secondes(s), puis laissé au repos pendant 15 min.

R % = (PEB/PMV) × 100


37

Une hauteur de mousse persistante, supérieure à 1 cm indique la présence de

saponosides. (Bidie et al., 2011).

F. Des polyterpènes et stérols: Dans 1ml d’extrait végétal ajouter quelques gouttes

d’anhydride acétique. Ensuite introduire 0,5 ml d’acide sulfurique concentré.

L’apparition d’une couleur rouge intense indique la présence des terpènes et

verte foncée indique la présence des stérols. (Bagré et al., 2007).

I.2.3. Les méthodes d’analyse quantitative de l'extraits

I.2.3.1. Les dosage de composition phénolique

A. Les dosages des polyphénols (PP)

Principe

Le dosage des polyphénols totaux a été effectué par une méthode adaptée par

Singleton et Ross (1965) avec le réactif de Folin-Ciocalteu. Le réactif est formé d’acide

phosphotungstique (H3PW12O40) et phosphomolibdique (H3PMo12O40), qui sont réduit

lors de l’oxydation des phénols en oxydes bleus de tungstène (W8O23) et de

molybdène(Mo8O23). Ce qui nous aide à doser les phénols dans le visible à une longueur

d’onde de l’ordre 765 nm.

Mode opératoire

Dans un tube à essai ont été introduits à l’aide d’une micropipette 100 μl de

chaque solution d’extrait, suivis de l’addition de 500 μl de réactif de Folin Ciocalteu

((1/10) (10 fois dilué dans l’eau distillée)). Après 2 minutes, 2 ml d'une solution de

bicarbonate de sodium(Na2CO3) à 20% ont été ajoutée. Puis les solution ont été

secouées immédiatement et sont maintenues à l’obscurité pendant 30 minutes à

température ambiante. L’absorbance de chaque solution d’extrait à été déterminée à 765

nm avec UV Vis spectrophotomètre.

La courbe d'étalonnage a été réalisée par l'acide gallique à différentes

concentrations (10 - 35μg/ml), dans les mêmes conditions de dosage.

Les résultats sont ainsi exprimés en mg équivalent d'acide gallique par g d'extrait

sec (mg d'EAG/g ES). Toutes les mesures sont répétées 3 fois.


38

Figure 19 : Protocole de dosage des polyphénols totaux (Singleton et Ross 1965).

B. Les dosages des flavonoïdes (FV)

Principe

Les flavonoïdes des extraits ont été quantifiés par la méthode du trichlorure

d’aluminium (Bahorun et al., 1996). Le principe est basé sur l’oxydation des

flavonoïdes par ce réactif (AlCl3), ce qui entraîne la formation d’un complexe jaune-

orange qui absorbe à 420 nm. La coloration jaune-orange produite est proportionnelle à

la quantité de flavonoïdes présente dans l’extrait testé (Chekroun, 2015).

Mode opératoire

Mettre 1ml d’extrait dans un tube à essai de différente concentration (0.2-1mg/ml);

Ajouter 1 ml d’une solution méthanolique de chlorure d’aluminium(AlCl3) à 2%;

incuber les tubes à 60 min à température ambiante. Lire l’absorbance à l’aide d’un

spectrophotomètre UV-visible à 420 nm.


39

La concentration des flavonoïdes est déduite à partir d’une gamme d’étalonnage

établie avec la quercétine (10-35 μg/ml) et est exprimée en microgramme d'équivalent

de quercétine par milligramme d’extrait (μg EQ/mg d’extrait), le test est répété 3 fois.

(Kebieche, 2009; Talbi et al., 2014).

Figure 20 : Protocole de dosage des flavonoïdes (Bahorun et al., 1996).

I.2.4. L’évaluation de l’activité biologique

I.2.4.1. L’évaluation de l’activité antioxydant de l’extraits

La capacité antioxydant de l’ensemble des extraits a été évaluée in vitro par deux

méthodes spectrophotométriques. L’activité anti radicalaire, l’inhibition du DPPH, est

mesurée selon la méthode de Brand-williams (1995). Le pouvoir réducteur est évalué

selon la méthode d’Oyaizu et al., (1986) reprise par (Atmani et al. , 2009). Pour

chaque extrait, les tests ont été répétés trois fois. Une lyophilisation a été effectuée afin

de conserver nos échantillons et étudier l’effet de la concentration sur le pourcentage

d’inhibition du radical DPPH.

A. Le test du piégeage du radical libre DPPH

Principe du test

D'un point de vue méthodologique, le test au radical libre DPPH est recommandé

pour des composés contenant des groupes -SH, -NH et –OH. Le 2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyle possède un électron non apparié sur un d'azote. Ce radical ne forment

pas des dimères, il reste donc sous sa forme monomère qui est relativement stable

(Popovici et al., 2009).


40

La réduction du DPPH par un agent antioxydant en DPPH-H induit une perte de

sa couleur violette foncée qui va sa transforme en jaune pale (Figure 21). (Molyneux,

2004).

Cette réaction qui s'effectue à température ambiante pour éliminer tout risque de

dégradation thermique des molécules thermolabiles (Popovici et al., 2009) peut être

suivie spectrophotométriquement en mesurant la diminution de son absorbance entre

515-518 nm ( Molyneux, 2004).

Figure 21 : Mécanisme réactionnel intervenant lors du test DPPH• entre l’espèce

radicalaire (DPPH•) et un antioxydant (AH) (Molyneux, 2004).

Protocol de l'activité anti-radicalaire par le test DPPH

L’activité antioxydant des différents extraits est mesurée par la méthode décrite

par Brand-williams et al., (1995); Pour chaque extrait une différentes concentrations

comprises entre 0.02-0.1 mg/ml et des antioxydants standards (acide ascorbique) avec

différentes concentrations entre 0.001-0.08 mg/ml. Une solution de DPPH a été

préparée par solubilisation de 2 mg de DPPH dans 50 ml de méthanol. 0.5ml de solution

échantillons et témoin sont ajoutées à 1 ml de la solution de DPPH, après incubation de

30 min en obscurité à la température ambiante, les absorbances sont mesurées à 517 nm

contre le blanc correspondant.

Les résultats exprimés en IC50 qui sont calculés à partir des courbes de la variation

du pourcentage d'inhibition 1% en fonction de la concentration de chaque extrait. Il faut

rappeler que plus la valeur de IC50 est petite, plus l'activité antioxydant des extraits est

grande (Popovici et al., 2009).

Le pouvoir d'inhibition est exprimé en % et déterminé en appliquant la formule

suivante :

% d'activation antioxydant = [Abs contrôle - Abs échantillon / Abs contrôle] ×

100


41

Figure 22 : Protocole de dosage de l’activité antioxydants par le test DPPH (Brand-

williams et al., 1995).

B. La mesure du pouvoir réducteur du fer

Principe

Le pouvoir réducteur d'un extrait est associé à son pouvoir antioxydant. L'activité

réductrice du fer de nos extraits est déterminée selon la méthode décrite par Oyaizu et

al., (1986), basée sur la réaction chimique de réduction du fer ferrique (Fe3+) présent

dans le complexe K3Fe(CN)6 en fer ferreux (Fe2+

). L'absorbance du milieu réactionnel

est déterminée à 700 nm. Une augmentation de l'absorbance correspond à une

augmentation du pouvoir réducteur des extraits testés (Hubert, 2006).

Figure 23 : Réaction FRAP entre Fe3+

-TPTZ et l’antioxydant (Boutakiout et al.,

2015).


42

Mode opératoire

L’activité antioxydant des différents extraits est mesurée par la méthode décrite

par Oyaizu et al., (1986); mettre 0.25 mL de l'échantillon à différentes concentrations,

est mélangé avec 0.625 mL d'une solution tampon phosphate (0.2 M ; pH 6.6) et 0.625

mL d'une solution de ferricyanure de potassium K3Fe(CN)6 à 1% , Le mélange est

incubé à 50°C pendant 20 minutes, puis refroidi à température ambiante , 0.625 mL de

l'acide trichloracétique à 10% sont ajoutés pour stopper la réaction , puis les tubes sont

centrifugés à 4500 rpm pendant 10 minutes, 0.625 mL du surnageant sont ajoutés à

0.625 mL d'eau distillée et 0.125 ml d'une solution de trichlorure du fer (FeCl3, 6H2O) à

0.1%.

La lecture des absorbances du milieu réactionnel se fait contre un blanc à 700 nm

contre un blanc semblablement préparé, en remplaçant l’extrait par de l’eau distillée qui

permet de calibrer l’appareil (UV-VIS spectrophotomètre).

Le contrôle positif est représenté par une solution d’un antioxydant standard;

l’acide ascorbique dont l’absorbance a été mesuré dans les mêmes conditions que les

échantillons.


43

Figure 24 : Protocole de détermination du pouvoir réducteur (Oyaizu et al., 1986).

I.2.4.2. L’évaluation de l’activité antibactérienne de l'extraits

Evaluation l’activité antibactérienne de l’extraits ont été déterminée par la

méthode de diffusion en milieu gélosé cité par (Treki et al., 2009) des différents

concentrations (0.5 mg/ml, 1 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml) des trois extraits aqueux,

éthanolique et éthylique des graines Daucus carota L. Cette technique repose sur

l'apparition d’une zone d'inhibition autour du disque contenant l'extrait de la plante

(Bssaibis et al., 2009), dans le milieu de culture contre quatre souches bactériennes:


44

Salmonella enterica serovar Typhi ATCC 14028, Escherichia coli , Staphylococcus

aureus, Pseudomonas aeruginosa.

Préparation des milieux de culture

Les milieux de culture utilisés pour la réalisation des tests antimicrobiens sont la

gélose nutritive pour l’isolement des souches bactériennes et la gélose Mueller Hinton

pour l’étude de la sensibilité des bactéries pour les différents extraits de plantes préparée

comme suit :

Dissoudre 28 g de la gélose nutritive dans un litre d’eau distillée et de 38 g de la

gélose Muller-Hinton dans un litre d’eau distillée. Faire bouillir avec agitation jusqu'à

dissolution complète, puis la stérilisation à l'aide d'autoclave pendant 15 min à 121°C,

finalement couler dans les boites de Pétri à 4 mm de hauteur et on laisse quelques

minutes jusqu'à la solidification (Harrar, 2012).

Conservation des souches

Les souches bactériennes conservées à 4°C dans des boites de pétrie contenant

une solution nutritive.

Préparation des précultures (Le repiquage)

Les souches bactériennes à tester sont alors repiquées à partir de la culture dans

une boites de pétrie contenant milieu de culture la gélose nutritive et incuber pendant 18

à 24 h à 37°C dans l’étuve afin d’obtenir une culture jeune des bactéries et des colonies

isolées pour déterminé l’activité.

Préparation des dilutions des extraits (concentration)

Différentes concentrations (0.5 mg/ml, 1 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml) des trois

extrait aqueux, éthanolique et éthylique des graines de Daucus carota L. ont été préparé

par la solution diméthyle sulfoxyde (DMSO) (Meddour et al., 2013).

Préparation des disques

Nous avons préparé les disques à partir de papier wattman de 6mm de diamètre,

puis elles sont mises dans un tube à essai bien fermer et stérilisés les disques à

l’autoclave pendant 30 minutes a 120°C. Et conservées jusqu'à l’utilisation.


45

Figure 25 : Stérilisation les disques à L'autoclave.

Préparation de l'inoculum (suspensions bactériennes)

A l'aide d’une pipette pasteur stérilisés nous avons prélevée quelques colonies

bien isolées et parfaitement identiques de chacune des souches bactériennes à tester

préalablement cultivées dans la gélose nutritive 24h et sont été mises dans 10 ml d'eau

physiologique stérile. La suspension bactérienne est bien homogénéisée (Choi et al.,

2006).

L'ensemencement doit se faire en moins en quelques min après la préparation de

l'inoculum (Djelloul-Daouadji, 2010).

Ensemencement

L’ensemencement est réalisé par écouvillonnage sur boites Pétri, trempé un

écouvillon dans la suspension bactérienne, puis l’essorer en pressant fermement sur la

paroi interne du tube. Ensuit Frotté l’écouvillon sur la totalité de la surface gélosée

Mueller Hinton (GMH), de haut en bas enstries serrées.

L’opération est répétée deux fois en tournant la boite de 60° à chaque fois.

L’ensemencement est fini en passant l’écouvillon sur la périphérie de la gélose

(Djelloul-Daouadji, 2010 ; Rahal, 2011). L’écouvillon est rechargé à chaque fois

qu’on ensemence plusieurs boites de Pétri avec la même souche.

Application des disques (dépôt des disques)

A l’aide d’une pince stérile, 4 disques de 6 mm de diamètre préalablement

préparé, imprégnés des quatre concentrations de chaque extrait aqueux, éthanolique et

éthylique (0.5, 1, 1.5, 2 mg/ml).


46

Ensuit déposés les disques dans la boîte pétrie, une fois appliqué, le disque ne doit

pas être déplacé (Rahal, 2011).

=> Le témoin négatif était un disque de papier Wattman imprégnés de DMSO.

Incubation et Lecture

Après l’incubation 18-24 heures à 37°C dans l'étuve l’effet des extraits se traduit

par l’apparition autour de disque d’une zone circulaire transparente correspondant à

l’absence de la croissance. Plus le diamètre de cette zone est grand plus la souche est

sensible (Choi et al., 2006).

Test de sensibilité aux antibiotiques : antibiogramme

Ce test a été réalisé pour étudier l’antibiogramme standard des germes utilisés et

le comparer avec l’effet de nos extraits testés. Les disques d’antibiotiques (témoin

positif) sont déposés à la surface d'un milieu gélosé, préalablement ensemencé avec une

culture pure de la souche à étudier.

Figure 26: Protocole de détermination l’activité antibactérienne.


47

I.2.5. Les analyses statistiques

Les résultats des tests sont exprimés en moyenne ± écart type. L'évaluation

statistique des résultats est effectuée par le test T student; qui est basé sur la

comparaison entre deux moyennes. Pour cela, on a utilisé les logiciels de MINITAB

(version 17) et EXCEL (version 2007),

La signification est déterminée par la valeur α=0.05 ; Si :

P < 0.05 : Différence significative.

P < 0.01 : Différence hautement significative.

P < 0.001 : Différence très hautement significative.

P > 0.05 : Différence non significative.

Les valeurs d’IC50 (concentration inhibitrice à 50%) sont calculées par la

régression linéaire à partir de la courbe [% inhibition = f (concentrations)].

CHAPITRE II: Résultats et

discussion

CHAPITRE II Résultats et discussion

49

II.1. Résultats II.1.1. Les rendements

Le rendement moyen en extraits (aqueux, éthanolique et éthérique) des graines de

Daucus carota L. a été calculé en fonction de la matière végétale sèche de la partie

aérienne de la plante. Ces rendements sont présentés dans le tableau 04.

Tableau 04 : Rendement, couleur et aspect des extraits secs des graines Daucus carota L.

Extrait brut Rendement(%) Couleur Aspect

Aqueux 13.22% Marron foncée Poudre

Ethanolique 11.99% Marron foncée Poudre

Ethérique 11.007% Marron foncée Poudre

Selon les résultats obtenus, nous remarquons le rendement de extrait aqueux de

valeur 13.22% plus élèves aux autres extraits éthanolique et éthérique de valeur 11.99%

et 11.007% respectivement. Elle est presque la même pour des trois extraits brut

considérable avec une couleur marron foncée et un aspect poudre.

II.1.2. Les tests phytochimiques

Les résultats des tests phytochimiques réalisés sur les trois extraits des graines

Daucus carota L. sont regroupés dans le tableau 05.

Ces réactions sont basées sur des phénomènes de précipitations ou de colorations

par des réactifs spécifiques à chaque famille de composé (Zirar, 2014).

Figure 27: Exemple sur le test phytochimiques des alcaloïdes et tanins des différents

extraits des graines Daucus carota L. (photo original).

À travers cette étude, nous avons mis en évidence l’existence des alcaloïdes, des

tanins, des flavonoïdes, les polyterpènes, les stérols et les polyphénols dans les trois

extraits aqueux, éthanolique et éthérique, la présence des alcaloïdes et les flavonoïdes


50

avec les polyphénols qui sont plus élevées de moyen très important dans l’extrait

éthanolique par rapport aux autres extraits. Pour la classe des Saponosides, le test s’est

révélé négatif pour les trois extraits.

Ces résultats, confirment la richesse des graines Daucus carota L. par la majorité

des métabolites secondaires.

Tableau 05 : Résultats des tests phytochimiques des trois extraits aqueux, éthanolique

et éthérique des graines Daucus carota L.

Composés

Réactifs

Daucus carota L.

Extraits

Aqueux Ethanol Ether

Alcaloïdes Dragendorff ++ +++ +

Polyphénols FeCl3 ++ +++ ++

Flavonoïde D’alcool chlorhydrique ++ +++ +

Polyterpènes D’acide sulfurique + ++ ++

Stérols D’acide sulfurique + ++ ++

Saponosides Test de mousse - - -

Tanins FeCl3 ++ + +++

(+) présence, (++) abondant, (+++) très abondant, (-) absence

II.1.3. Les détermination des teneurs des composés phénoliques

A. Le dosage des polyphénols (PP)

L'étude quantitative des trois extraits réalisés par le dosage spectrophotomètrique

par la méthode de Folin-Ciocalteu avait pour objectif la détermination de la teneur totale

en polyphènol présent dans l’extrait de Daucus carota L. Cette teneur sont déterminées

à partir de l’équation de la régression linéaire de courbe d’étalonnage de l’acide

gallique, exprimée en microgramme d'équivalent d’acide gallique par gramme d’extrait

sec (µg EAG/g ES): y = 0.0866x + 0.296 avec (R2 = 0.963). Les résultats obtenus sont

représenté dans le tableau 06 pour les trois extraits.

Nous avons constaté que la teneur en polyphénols est plus élevée dans l’extrait

éthanolique avec une valeur de (1024.6 ± 49.8 µg EAG/g d’extrait sec), suivie par celle

d’extrait aqueux (1015.1 ± 10.9 µg EAG/g d’extrait sec). L’extrait éthérique possède la

teneur le plus faible en polyphénols avec une valeur de (820.77 ± 4.54 µg EAG/g

d’extrait sec) par rapport aux autres extraits.


51

Tableau 06 : Teneurs en polyphénols (moyenne ± écart-type) dans les trois extraits

aqueux, éthanolïque et éthylique des graines Daucus carota L.

Daucus carota L. Teneurs en polyphénols (μgEAG /g ES)

Extrait aqueux 1015.1±10.9

Extrait éthanolique 1024.6±49.8

Extrait éthérique 820.77±4.54

Figure 28: Teneurs en polyphénols des différents extraits expérimentaux des graines

Daucus carota L.

*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ; NS

P > 0.05 comparaison l'extrait aqueux avec

l'extrait éthanolique.

a p < 0.05;

b p < 0.01;

c p < 0.001 ;

NS’ P > 0.05 comparaison l'extrait aqueux avec l'extrait

éthérique.

a' p < 0.05;

b' p < 0.01;

c' p < 0.001 ;

NS'' P > 0.05 comparaison l'extrait éthanolique avec

l'extrait éthérique.

Les résultats présentés dans la figure 28: montrent une augmentation non

significative (p > 0,05) du teneur de polyphénols de l’extrait éthanolique et diminution

très hautement significative (p < 0.001) du extrait éthérique par rapport a l'extrait

aqueux de graine Daucus carota L. En revanche une diminution très hautement

significative (p < 0.001) de teneur en polyphénols de l’extrait d’éther par rapport a



52

B. Le dosage des flavonoïdes (FV)

Le dosage des flavonoïdes a été réalisé selon la méthode au trichlorure

d’aluminium (AlCl3) et l’étalon été la quercétine. La teneur en flavonoïde a été

déterminée dans l’extrait des graines Daucus carota L. à partir de équation de la

régression linéaire de courbe d’étalonnage est exprimée en microgramme d'équivalent

de quercetine par milligramme d’extrait sec: y =3.051 + 0.144 avec (R2

= 0.986). Les

résultats obtenus sont représentés dans les tableaux 07.

Pour les trois extraits, nous avons remarqué que les teneurs en flavonoïdes sont

plus élevées dans l’extrait éthanolique 858.95±12.33 µg EQ/mg ES, suivie par celle

d’extrait aqueux avec une valeur de 824.37±3.05 (µg EQ/mg d’extrait sec), tandis que le

teneur le plus faible est celle de l’extrait éthérique (655.55±8.81µg EQ/mg d’extrait

sec).

Tableau 07 : Teneurs en flavonoïdes (moyenne ± écart-type) dans les trois extraits

aqueux, éthanoïque et éthylique des graines Daucus carota L.

Daucus carota L. Teneurs en flavonoïdes (µg EAG /mg ES)

Extrait éthanolïque 858.95±12.33

Extrait aqueux 824.37±3.05

Extrait éthylique 655.55±8.81

Figure 29 : Teneurs en flavonoïde des différents extraits expérimentaux des graines

Daucus carota L.


53

*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ; NS

P > 0.05 comparaison l'extrait aqueux avec


a p < 0.05;

b p < 0.01;

c p < 0.001 ;

NS' P > 0.05 comparaison l'extrait aqueux avec


a' p < 0.05;

b' p < 0.01;

c' p < 0.001 ;



Les résultats présentés dans la figure 29: montrent une augmentation hautement

significative (p < 0.01) du teneur de flavonoïde de l’extrait éthanolique et une

diminution hautement significative (p < 0.01) de l’extrait d’éther par rapport au l'extrait

aqueux de graine Daucus carota L. En revanche; une diminution, très hautement

significative (p < 0.001) de extrait de éther par rapport au l'extrait éthanolique.

II.1.4. L’évaluation de l’activité biologique

II.1.4.1. L’évaluation de l’activité antioxydant de l’extraits

La mise en évidence du pouvoir antioxydant des trois extraits des graines Daucus

carota L. été réalisée par deux techniques chimiques (test de piégeage du radical libre

DPPH, pouvoir réducteur du fer (FRAP).

A. Le test de DPPH

L’activité anti radicalaire est réalisée par la méthode du radical 2,2-diphényl-

1picrylhydrazyle (DPPH) qui est une méthode fréquemment utilisée pour sa simplicité.

L’inhibition de la décoloration du radical DPPH est en fonction de la concentration de

l’extraits utilisée (Cuendet et al., 1997).

Le radical libre DPPH a permis l’estimation de l’activité antioxydant. C’est un

radical synthétique de couleur violette qui vire vers le jaune quand il est capté par les

extraits testés. L’intensité de la couleur jaune reflète la capacité antiradicalaire de

l’extrait, et dépend de la nature, la concentration et la puissance de cet extrait.

Figure 30: La décoloration de couleur violette qui vire vers le jaune de test de DPPH

(photo original)


54

L’activité antioxydant des différents extraits aqueux, éthanolique et éthérique des

graines de Daucus carota L. est exprimée en IC50, il définit la concentration efficace du

substrat qui cause la perte de 50% de l’activité du radical DPPH. Dans ce test on a

utilisé l’acide ascorbique comme standard, les résultats obtenus est représente dans le

tableau 08.

Le meilleur résultat obtenu est celui de l’extrait éthérique qui a donné un IC50 de

l’ordre de 41.677±1.528 µg/ml E suivi par ceux de extrait éthanolique 42.677±0.577

µg/ml E respectivement, les deux extraits sont plus actifs mais moins activité par

rapport a l’acide ascorbique de IC50 de l’ordre 15.000±1.000 µg/ml. Par contre, l’extrait

aqueux possède un pouvoir de piégeage du DPPH plus faible 85.00±13.08 µg/ml E par

rapport aux autres extraits et l’acide ascorbique.

Ces capacités sont nettement très importantes, cependant, l’extrait aqueux révèle

une capacité faible.

Tableau 08: IC50 de l’extrait brut et l’acide ascorbique (moyenne ± écart-type) dans les

trois extraits aqueux, éthanoïque et éthylique des graines Daucus carota L.

Daucus carota L. IC50 (µg/ml de E)

Extrait aqueux 85.00± 13.08

Extrait éthanolique 42.677± 0.577

Extrait éthérique 41.677± 1.528

Acide ascorbique 15.000 ±1.000

Figure 31 : IC50 de test DPPH des différents extraits expérimentaux des graines Daucus

carota L.


55

*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ; NS

P > 0.05 comparaison les trois extraits aqueux,

éthanolique et éthérique avec le acide ascorpique.

a p < 0.05;

b p < 0.01;

c p < 0.001 ;



a' p < 0.05;

b' p < 0.01;

c' p < 0.001 ;

NS'' P > 0.05 comparaison l'extrait aqueux avec


Les résultats présentés dans la figure 31 : montrent une augmentation significative

(p < 0.05) de extrait aqueux et très hautement significative (p < 0.001) du extrait de

éthanol et hautement significative (p < 0.01) du extrait de éther du teneur de IC50 de test

DPPH des l'extraits des graines Daucus carota L. par rapport a l’acide ascorbique. En

revanche une diminution très hautement significative (p < 0.001) de l’extrait

éthanolique et étherique par rapport a l'extrait aqueux.

B. Les pouvoir réducteur du fer : FRAP (Ferric reducing antioxidant power)

En présence d'extrait de la plante le fer ferrique Fe3+

a été réduit à la forme

ferreuse Fe2+

.Par conséquent, Fe2+

peut être évalué en mesurant et en surveillant

l'augmentation de la densité de la couleur bleu dans le milieu réactionnel à 593 nm.

Les résultats montrent que l'activité réductrice du fer a été déterminée dans les

trois extraits aqueux, éthanolique et éthérique des graines Daucus carota L. à partir de

l’équation de la régression linéaire de courbe d’étalonnage est exprimée en milligramme

d'équivalent d’acide ascorbique par gramme d’extrait sec: y = 0.535x + 0.484 (R2 =

0.994). Les résultats obtenus sont illustrés dans le tableau 09.

Tableau 09: L’activité réductrice du fer (moyenne ± écart-type) dans les trois extraits

aqueux, éthanolique et éthérique des graines Daucus carota L.

Daucus carota L. L’activité réductrice du fer (mg/g de ES)

Extrait éthanolïque 10.916± 0.219

Extrait aqueux 8.351± 0.225

Extrait éthylique 7.6487± 0.894

La capacité à réduire le fer est plus élevée pour l’extrait éthanolique 10.916±0.219

(mg EAA/g ES). Elle est presque la même pour les extraits aqueux 8.351±0.225 (mg

EAA/ g ES). Alors que l’extrait de éther révèle la moins activité 7.6487± 0.894 (mg

EAA/ g ES) par rapport aux autres extraits. Les trois extraits des graines Daucus carota

L. Présentent un pouvoir antioxydant plus important.


56

Figure 32: Teneurs en FRAP des différents extraits expérimentaux des graines Daucus

carota L.

*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ;

NS P > 0.05 comparaison l'extrait aqueux avec


a p < 0.05;

b p < 0.01;

c p < 0.001 ;



a' p < 0.05;

b' p < 0.01;

c' p < 0.001 ;



Les résultats présentés dans la figure 32 : montrent une augmentation significative

(p < 0.05) de extrait éthanolique et diminution hautement significative (p < 0.01) du

extrait de éther du teneur de FRAP de l'extrait de graine Daucus carota L. par rapport

au l'extrait aqueux. En revanche une diminution hautement significative (p < 0.01) de

extrait de éther par rapport au l'extrait éthanolique.

II.1.4.1. L’évaluation de l’activité antibactérienne de l’extraits

Nous avons étudié in vitro le pouvoir antibactérienne des trois extraits isolés des

graines Daucus carota L. par la méthode de diffusion en milieu gélosés solides,

Mueller-Hinton pour les souches bactéries à tester.

L’activité antibactérienne des extraits a été estimée en termes de diamètre de la

zone d'inhibition autour des disques contenant les extraits à tester vis-à-vis de quatre

(04) souches bactériennes. Tous les extraits n'ont pas réagi avec les souches

bactériennes testées. On remarque aussi l'absence de pouvoir inhibitrice d'extrait contre

la croissance bactérienne comparativement au témoin positif qui a réagi fortement. Le


57

tableau 10 indique les résultats des tests d’activité antimicrobienne d’extrait issus de la

plante Daucus carota L. sur les souches bactériennes utilisée.

Tableau 10 : Etude de l’activité inhibitrice d’extraits de graine Daucus carota L.

Concentration de

plante pour les trois extraits (aqueux,

éthanolique et éthérique) en (mg/ml)

Souche

Dia

mèt

res

d’i

nh

ibit

ion

(m

m)

PEN GEN VAN DMSO 0.5 1 1.5 2

Escherichia coli 6 32.6 22.3 6 0 0 0 0

Pseudomonas

aeruginosa

6 31 20.6 6 0 0 0 0

Salmonella Enteric

Serovar Typhi

ATCC 14028

10.3 28.6 20.6 6 0 0 0 0

Staphylococcus aureus 8 26 9.67 6 0 0 0 0

PEN: pénicilline; GEN: gentamycine; VAN: Vancomycine.


58

II.2. Discussion

Parmi la flore Algérienne, nous sommes intéressés à une espèce plus consommée,

connu pour sa richesse floristique diversifiée. Il s’agit de Daucus carota L. plante

médicinale appartenant à la famille des Apiacées, utilisée en phytothérapie pour ses

propriétés sédatives, antioxydantes (Singh et al., 2010), anti cancéreuse (De Groot,

1998) et la protection contre les maladies cardiovasculaires ect. (Lecerf, 1999).

L’utilisation des plantes médicinales est aujourd’hui la forme de médecine de plus en

plus utilisée à travers le monde. Le recours au traitement par les plantes ainsi que la

recherche des nouvelles substances à activités biologiques constituent une des plus

grandes préoccupations scientifiques (Djedioui, 2010).

Notre étude a porté dans un premier temps à l'identification des groupes

phytochimiques, qui caractérisent les différents extraits aqueux, éthanolique et éthérique

des graines Daucus carota L. avec le dosage des composes phénoliques tel que le

polyphénols et les flavonoïdes et la recherche d'activité biologique que peuvent avoir

cet extrait in vitro à savoir les capacités antioxydantes et antibactériennes.

Le rendement d’extraction des différents extraits: aqueux, éthanolique et étherique

des graines Daucus carota L. donne un résultat de 13.22 % ; 11.99 % et 11.007 %

respectivement. Ces résultats sont on accorde avec une étude menée par Almaïmoune

Maiga, 2014, pour les rendements des différents extraits des tubercules de Daucus

carota (aqueux par macération, décoction et l’infusion), alors que pour l’extrait

éthanolique, l’extrait éthérique et l’extrait chloroformique, possèdent des rendements

très élève que notre étude .

Ces rendements peuvent être considérés comme élève comparativement à celui

obtenu à partir des fruits de Daucus glaber Forssk (Mansour et al., 2004) qui est de 4%

et de celui obtenu par (Ksouri et al., 2015) à partir des graines et des feuilles de Daucus

carota ssp. carota qui est entre (3% et 2.1%) respectivement. De même, (Saad et al.,

1995) ont aussi trouvé un rendement de 2.63% à partir des fruits de Daucus carota ssp.

maximus.

Ces différences sont dues à plusieurs facteurs : l’origine géographique, les

facteurs écologiques notamment climatiques (la température et l’humidité), l’espèce

végétal elle-même, l’organe végétal étudié, le stade de la croissance, la période de

cueillette, la conservation du matériel végétal, le méthode de séchage de partie utilisée

de plant pour l’étude et la méthode d’extraction (Granger et al., 1973; Rosua et


59

Granados, 1987; Fournier et al., 1989; Haeckel et Omar, 1993; khajeh et al., 2005;

Viljoen et al., 2006; Sefidkon et al., 2007).

Les rendements varient d’une méthode d’extraction à une autre et d’une partie de

la plante à une autre. Cette différence est expliquée par la diffusion du solvant dans la

poudre des plantes dans l’étape de macération et probablement à la nature et la polarité

des solvants utilisés pour l’extraction (Naczk et Shahidi, 2004 ; Barroso et al,. 2014).

En général, les rendements les plus élevés sont obtenus avec les solvants polaires tels

que l'eau, le méthanol, l'éthanol et l’éther (Markom et al., 2007; Iloki-Assanga et al.,

2015).

Les résultats de l'analyse phytochimique sur les différents extraits : aqueux,

éthanolique et éthérique effectuée sur les graines Daucus carota L. ont montré la

présence de plusieurs composés bioactifs : alcaloïdes, polyphénols, flavonoïdes, stérols,

polyterpènes et les tanins dans les trois extraits, alors que les saponines sont absentes

avec une différence entre les extraits en quantité de présence de ces composants. Ces

résultats sont en accord avec la littérature (Almaïmoune Maiga, 2014). Les composés

polyphénoliques sont bien connus comme des agents antioxydants (Lebham, 2005). La

présence de ces composés est responsable de plusieurs activités biologiques, tels que

des flavonoïdes qui ont une activité anti-inflammatoires, anti-cancéreuses (Halliwell et

al., 2005), et inhiber la croissance tumorale (antitumorales) (Ferradji, 2010). Les

alcaloïdes port une effets pharmacologiques pour leurs effets analgésique et

tranquillisants (Hopkins, 2003), avec une rôle détoxifiant et un antihypertenseur

(Awoyinka et al., 2007). Les tanins sont responsables des propriétés hémostatiques

(Asquith et Butler, 1986), avec un pouvoir, antiviral, anti-inflammatoire et une activité

antimutagène (Laamari et Mostefaoui, 2017).

Selon Bidie et al., (2011), les composés phénoliques sont largement distribués

dans les tissus des plantes parmi lesquels se retrouvent de nombreuses molécules

antiradicalaires et antioxydantes qui, en général, peuvent céder facilement un électron

ou un proton pour neutraliser les radicaux libres. Les composés phénoliques sont les

éléments les plus abondants identifiés dans les parties aériennes de Daucus carota L. La

présence de ces composés, tels que des phénols et des flavonoïdes dans l'extrait de

Daucus carota L. donner un pouvoir antioxydant à cette plante.

Les résultats de dosage de polyphénols montrent que des différents extraits :

aqueux, éthanolique et éthérique des graines Daucus carota L. est très riche en

polyphénols 1015.1 ± 10.9, 1024.6 ± 49.8 et 820.77 ± 4.54 µg EAG/ g d’extrait sec


60

respectivement. Ces résultats sont plus elevées par rapport à celles trouvés par (Noui,

2018), concernant d’autres espèces de mêmes famille Apiaceae et de même genre sur

des extraits butanolique, Acetate d’ethyl, méthanolique et chloroformique de plant

Daucus muricatus (164.42±10.20, 169.66±11.50, 119.16±2.37et 16.52±1.01 μg

EAG/mg d’extrait respectivement) .

Ces résultats peuvent être considérés comme très élève comparativement à celui

obtenu à partir des partie aériennes (tige, feuilles) de Daucus crinitus (Ayachi, 2014)

(extrait méthanolique et extrait aqueux de valeur de 130.19±5 et 89.80±3 µg EAG/mg

d’extrait sec respectivement).

Cette variabilité est due à plusieurs facteurs : le choix du système de solvant

d’extraction est très important dans la détermination des teneurs en polyphénols totaux

(Tirichine, 2010). La faible spécificité du réactif de Folin-Ciocalteu est l'inconvénient

principal du dosage colorimétrique. Le réactif est extrêmement sensible à la réduction

de tous les groupes d’hydroxyles non seulement celles des composés phénoliques, mais

également de certains sucres et de protéines etc. (Gmez-Caravaca et al., 2006;

Vuorela, 2005). Le solvant d'extraction élu des substances non phénoliques comme les

sucres, les protéines et les colorants qui peuvent interférer pendant toute évaluation

phénolique (Djeridane et al., 2007). Le dosage par ce réactif donne donc une évaluation

brute de tous les composés phénoliques d’un extrait. Il n'est pas spécifique aux

polyphénols, mais beaucoup de composés peuvent réagir avec le réactif, donnant un

taux phénolique apparent élevé (Tawaha et al., 2007).

Les résultats quantitatifs des flavonoïdes, révèlent que sa teneur est plus

importante dans notre différents extraits aqueux, éthanolique et éthérique 824.37±3.05,

858.95±12.33 et 655.55±8.81 µg EQ/mg d’extrait sec respectivement. Ces résultats sont

plus élevées avec un étude rapportés par (Ayachi, 2014) de d’autres espèce de même

genre des extraits méthanolique et aqueux de partie aérienne (tige, feuilles) de Daucus

crinitus de valeur 86.72±4 et 49.77±2 µg/mg ES respectivement.


obtenu (Noui, 2018), de extrait butanolique, extrait Acetate d’ethyl, extrait

méthanolique et de extrait chloroformique de plant Daucus muricatus 158.09±9.76,

89.34±6.18 65.87±0.83, 04.87±2.16 μg EQ/mg d’extrait respectivement.

Cette différence dépend d'un certain nombre de facteurs: les conditions de séchage

(Couto et al., 2012), l'organe de plant analysé (Tirichine, 2010), d’extraction en terme

de méthode, temps et température d’extraction, granulométrie, solvant qui sont utilisés,


61

nombre d’étapes d’extraction, l’expression des résultats, l’état et la provenance

géographique (Luthria, 2008 ; Kahouli, 2010 ; Rodriguez et al., 2012).

Dans le but d'évaluer l'activité antioxydants des différents extraits aqueux,

éthanolique et éthérique des graines Daucus carota L., nous avons utilisé deux

mécanismes antioxydants différents: le piéger le radical DPPH et pouvoir réducteur du

fer (FRAP) par méthode UV-Vis .

Les graines de Daucus carota L. présente une capacité antioxydants évalue par

test DPPH très important pour l’extraits éthanolique, éthérique et aqueux des IC50

42.677±0.577, 41.677±1.528, 85.00±13.08 µg EAA/ mg d’extrait sec respectivement

en comparaison avec du antioxydante standard (acide ascorbique) des IC50 15.000±1.00

µg EAA/mg ES .

Ces résultats peuvent être considérés comme élève comparativement à celui

obtenu à partir des parties aériennes (tige, feuilles) et les racines de d’autre espèce

Daucus crinitus (Ayachi, 2014), qui est de extrait méthanolique et aqueux des IC50 de

partie aérienne 0.492 et 0.710 mg EAA/ml extrait respectivement et des racines 0.068 et

0.644 mg EAA/ml d’extrait.

Alors que ce différent extrait de Daucus carota L. aqueux, éthanolique et

éthérique possède une capacité antioxydants importante de l'ordre de 8.351±0.225,

10.916±0.219 et 7.6487± 0.894 mg équivalent AA/g de la matière sèche pour le test de

FRAP respectivement .


obtenu par Noui, (2018), de extrait butanolique, méthanolique et chloroformique de

plant Daucus muricatus 5.55±0.89, 4.87±1.30 et 11.44±2.06 µg/ml d’extrait

respectivement.

Les solvants de haute polarité utilisés sont des piégeurs de radicaux plus efficaces

que ceux ayant une faible polarité, ce qui indique que des antioxydants ou composés

actifs de polarité différente pourraient être présents dans l’extrait (Turkmen et al.,

2006).

L’activité antioxydant des extraits des plantes aromatiques est en relation directe

avec leur composition chimique. Pour cette raison, la présence d’une haute teneur en

composés phénoliques dans les extraits donne une forte capacité antioxydante (Sagdic

et al., 2011; Yavaşer et al., 2015). Selon notre littérature, il n y a pas des études qui

expliquent la capacité antioxydante totale des utilisant cette méthode, et en même temps


62

il est difficile d’attribuer l’activité à un seul composé puisque un effet de synergie entre

les différents composés que ce soit minoritaires ou majoritaires peut avoir lieu .

Concernant l’activité antibactérienne les résultats montrent quelles différents

extraits des graines Daucus carota L. n'a aucun effet inhibiteur sur la croissance des

souches bactériennes testées (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella

Enteric et Staphylococcus aureus).

Ces résultats sont en accord avec (Ayachi, 2014), l’activité antibactérienne de

l'huile essentielle du extrait des parties aériennes (tige, feuilles) Daucus crinitusn

présent un effet inhibiteur sur la croissance des souches microbiériennes la levure

Candida albicans et la bactérie Staphylococcus aureus et n’ont montré aucune

inhibition pour les bactéries Escherichia coli et Bacillus cereus. Et pour le Daucus

carota ssp. hispanis. forte activité antimicrobienne contre la levure Candida albicans. et

le bactérie Bacillus Subtilis. Les autres souches bactériennes (Listeria monocytogenes,

Bacillus cereus, Staphylococcu aureus, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae et

Escherichia coli) n'ont montré aucune inhibition la croissance des souches bactériennes.

Ces résultats peuvent être expliqués par l’absence des principes actifs doués d’une

activité antibactérienne. La membrane externe de l'enveloppe cellulaire des bactéries à

GRAM négatif constituer une barrière efficace à haut niveau de résistance (Kebili,

2016).

Conclusion

Conclusion

64

Ce travail a été réalisé dans le but de valoriser les connaissances de la flore

Algérienne par l'étude de l’activité biologique d’une plante issues de cette flore appelée

Daucus carota L. et la mise en évidence des propriétés pharmacologiques de cette

plante. Cette plante appartenant à la famille des Apiaceae anciennement appelée famille

des Ombellifères. L’objectif était d’apporter des éléments pour la validation de certaines

propriétés de la plante étudiée, l’étude phytochimique et l’évaluation de l’activité

antioxydants et antibactérienne.

Notre travail nous a permis de réaliser une étude phytochimique des l'extraits la

partie aérienne (les graines) de la plante Daucus carota L. L’extrait à été préparé par

macération de la partie arienne dans les trois solvants l'eau distillée, l’éthanol et l’éther.

Cette étude a été l’occasion de mettre en œuvre les différentes facettes de l’analyse

développée au cours de cette thèse telles que l’extraction, le dosage ainsi que les tests

d’activité antioxydants et antibactérienne.

La détermination de rendement en extraits bruts a montré une rentabilité

importante de 13.22% pour l’extrait aqueux, 11.99% pour l’extrait éthanolique et

11.007% pour l’extrait éthérique.

Les principaux résultats de l’analyse phytochimique de la plante Daucus carota L.

pour les trois extraits aqueux, éthanolique et éthérique montrent une composition riche

et variée ; la présence des polyphénoles, des alcaloïdes, des flavonoïdes, des tanins, les

stérols et les polyterpénes due à leur rôle important dans la plante, dont ils sont des

produits considerés comme métabolites secondaires. Aussi on remarque l’absence des

saponosides dans les différents extraits.

Les analyses spectrophotométriques effectuées ont montré que les différents

extraits contient des polyphéols pour l’extrait aqueux 1015.1±10.9 μg EAG/mg ES,

éthanolique 1024.6±49.8 μg EAG/mg ES et éthérique 820.77±4.54 μg EAG/mg ES et

des flavonoïdes 824.37±3.05 μg EQ/mg ES pour l’extrait aqueux, 858.95±12.33 μg

EQ/mg ES de l’extrait éthanolique et 655.55±8.81 μg EQ/mg ES de l’extrait éthérique.

L'UV-Vis montre une activité antioxydants puissante par le Test du piégeage du

radical libre DPPH, donne une Valeur IC50 de 85.00± 13.08 µg/ml E pour l’extrait

aqueux, 42.677± 0.577 µg/ml E de l’extrait éthanolique et 41.677± 1.528 µg/ml E qui

est un valeur très importants par rapport l’acide ascorbique 15.000±1.000 µg/ml.

Les résultats de l’activité antioxydants, par le test de pouvoir réducteur du fer

(FRAP), montrent que les différents extraits a une activité antioxydant importante

Conclusion

65

8.351± 0.225 mg/g ES pour l’extrait aqueux, 10.916± 0.219 mg/g ES de l’extrait

éthanolique et 7.6487± 0.894 mg/g ES de l’extrait éthérique.

L’évaluation qualitative de l’activité antibactérienne des différents extrait aqueux,

éthanolique et éthérique étudiée n'a montré aucun effet antibactérien contre les souches

bactériennes a testé par rapport aux antibiotiques standards utilisés.

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Annexes

Annexes

83

Annexes 01

A. Les matériels utilisés

Balance analytique (Photo originale). Evaporateur de type Rotavapor BUCHI

Haeting bath R-210 (Photo originale).

Autoclave (TIMO) (Photo originale). Etuve (Memmert) (photo originale).

Spectrephotomètre (Photo originale). Bain marie (Photo originale).

Annexes

84

B. Les produits et réactifs chimique

Eau distillée; éthanol; éther; méthanol; solution méthanolique de chlorure

d'aluminium a 2 % (AlCl3); FolinCioclateu (1/10); 2,2-diphényle-1-picryl hydrazyl

(DPPH); acide ascorbique; acide gallique; quercetine; acide sulfurique (H2SO4); Fecl3

diluée; sérum physiologique 0.9 %; méthanol; bicarbonate de sodium; HCl concentré;

réactif de Mayer; réactive de Wagner; réactif de Drajendorf; solution alcoolique de

chlorure ferrique à 2%; copeaux de magnésium; alcool chlorhydrique (4ml EtOH + 1ml

HCl concentré); acide trichloroacétique; tampon phosphate (0.2 M, PH 6,6);

ferricyanure de potassium K3Fe (CN)6 (1%); chlorure ferrique ( 0.1%), DMASO, gélose

nutritif et de Muller-Hinton.

C. Les verreries et petits matériels

Erlenmeyer, Eprouvet, Béchers de 500 ml et 1000 ml, Tubes à essai, Tubes sec,

Micropipette 10 ul; 50ul et 1000 ul, Flacons en verre, papier filtre Whatman N°1, Boite

bertie, Pipettes Pasteur, Lans de platine, Seringue de 10ml, Disques de papier wattman,

Bec Benzène, Ecouvillon stérile.

Annexes

85

Annexe 02

Figure 33: Courbe d’étalonnage pour le dosage des polyphénols.

Figure 34: Courbe d’étalonnage pour le dosage des flavonoïdes.

Figure 35: Courbe d’étalonnage pour le test de DPPH.

Annexes

86

Figure 36: Courbe d’étalonnage pour le test de FRAP.

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