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Université de Montpellier Laboratoire de Pharmacognosie

Années 2019-2020 Professeur J. Vercauteren

1ère PARTIE : INITIATION TP UE3 - VASAM-Pharmacognosie du DFGSP2 - 2019-2020

Enseignants : technicien : GUERMACHE Raluca MCF : CRAUSTE Céline et VIGOR Claire Pr : VERCAUTEREN Joseph

Université de Montpellier

TP de VASAM-Pharmacognosie : Initiation à la reconnaissance des grandes classes de Substances Actives Médicamenteuses d’origine végétale

INTRODUCTION

Travaux pratiques de VASAM-Pharmacognosie – UE3 - DFGSP2 édition 2019 2

TRAVAUX PRATIQUES DE VASAM - PHARMACOGNOSIE

Extraction, Caractérisation et Purification (Voies d’Accès) de Substances Actives Médicamenteuses d’Origine Végétale.

Les Travaux Pratiques de Pharmacognosie débutent dès votre DFGSP2, dans le cadre du module VASAM-Pharmacognosie (Voie d’Accès aux Substances Actives Médicamenteuses d’origine végétale) de l’UE3, mais se poursuivront en DFGSP3 (UE13).

Ils correspondent en DFGSP2, à la phase d’initiation à la « chimie extractive des substances actives médicamenteuses ». Les 6 séances de TP ont pour but de vous faire découvrir les propriétés des principales classes de Substances Actives Médicamenteuses qui conditionnent leur extraction, leur caractérisation et leur réactivité.

Ils sont indispensables pour vous permettre d’accéder en DFGSP3, à la phase d’utilisation, de mise en « pratique » des compétences acquises, pendant laquelle vous aurez à préparer par vous-même, à partir d’une drogue végétale, une Substance Active pure que vous validerez avant sa transformation en Médicament.

TP de VASAM-Pharmacognosie : Initiation à la reconnaissance des grandes classes de Substances Actives Médicamenteuses d’origine végétale

CONSIGNES DE SECURITE


Sécurité dans la salle de TP Tarbouriech Travaux Pratiques de Chimie / Pharmacognosie

Au cours des travaux pratiques de Chimie / Pharmacognosie, chaque étudiant est amené à manipuler de la verrerie, des produits chimiques qui peuvent être toxiques, inflammables…, à réaliser ou utiliser des montages complexes ou à exécuter des opérations délicates. Tous ces facteurs peuvent engendrer des risques d'accidents (brûlures, coupures,…) ou d'intoxications graves pour soi-même ou pour ses voisins. C’est pourquoi, des règles élémentaires de sécurité doivent être impérativement respectées dans la salle, sous peine d’exclusion temporaire des séances de travaux pratiques. Protection oculaire :

Le port des LUNETTES de sécurité est OBLIGATOIRE pendant toute la durée de la séance de travaux pratiques, même lorsque vous ne manipulez pas (il y a toujours des personnes qui manipulent autour de vous). Les verres de contact sont à éviter : des vapeurs organiques ou corrosives

peuvent les endommager de façon irréversible ou s'infiltrer sous la lentille. Blouse : Le port d’une BLOUSE pendant la séance est OBLIGATOIRE. Les blouses doivent être en tissu de COTON résistant. Elles doivent être assez longues pour protéger les jambes et dotées de manches longues. Il est préférable de porter des chaussures qui recouvrent entièrement le pied. Cheveux : Les cheveux longs doivent être impérativement attachés pendant les séances. Comportement : Il est INTERDIT de FUMER, MANGER, BOIRE, COURIR et TÉLÉPHONER dans le laboratoire. Etiquetage des flacons : Les flacons de produits chimiques à utiliser pendant la séance sont étiquetés. Il est donc impératif de bien lire les étiquettes avant d’utiliser les produits chimiques. Au début de la première séance de travaux pratiques, il vous est demandé de PRENDRE CONNAISSANCE DES REGLES DE SECURITE s’appliquant au cours des travaux pratiques de Chimie / Pharmacognosie (cf ci-dessus) et de vous ENGAGER A RESPECTER CES CONSIGNES DE SECURITE. Le non-respect de ces consignes peut conduire à l’EXCLUSION temporaire des Travaux Pratiques de Chimie / Pharmacognosie.

TP de VASAM-Pharmacognosie : Initiation aux voies d’accès et à la reconnaissance des grandes classes de Substances Actives Médicamenteuses d’origine végétale

INTRODUCTION


TP de VASAM-Pharmacognosie : 1ère partie (DFGSP2)

Initiation à l’extraction et à la reconnaissance des grandes classes de Substances Actives Médicamenteuses (SAM) d’origine végétale

Ces travaux pratiques ont pour but de vous familiariser avec les « manipulations »

à pratiquer sur les drogues végétales pour en extraire des substances médicamenteuses. Les drogues traitées sont choisies en fonction de la nature chimique (grandes classes chimiques) des principes actifs (PA) majeurs que l’on peut en extraire.

Au cours des 4 premières séances, vous apprendrez à reconnaître des drogues végétales, sur la base de leur contenu (extraction, caractérisation) en l’une ou l’autre des 4 principales catégories de SAM suivantes :

§ ALCALOÏDES : quinquina (alcaloïdes quinoléiques). § TANINS + FLAVONOÏDES : pépins de raisin (tanins catéchiques), sophora (flavonoïdes). § SAPONOSIDES : racines de polygala (Polygala senega/tenuifolia) § ANTHRACÉNOSIDES : bourdaine, rhubarbes (Rheum officinalis et R. rhaponticum).

Ces classes de métabolites sont, en général, mises en évidence par des réactions caractéristiques, en présence de réactifs "spécifiques".

Les essais « préliminaires » sur une plante ou partie de plante (la drogue) représentent toujours la première étape de son étude chimique, et doivent permettre d'orienter les recherches ultérieures. Les techniques de détection utilisables pour une recherche des substances actives doivent être rapides, simples, reproductibles et sensibles afin de ne mettre en œuvre qu'une faible quantité de drogue.

Les méthodes abordées ici en TP, sont donc limitées à une extraction et une mise en évidence rapides des quelques groupes chimiques de Principes Actifs qui satisfont ces critères. Elles n'ont évidemment qu'une valeur indicative, et une confirmation ultérieure par des méthodes plus précises et plus sélectives peut être indispensable.

Initiation à la purification de SAM

(d’origine végétale) Lors des 5ème et 6ème séances, vous serez amené à purifier une Substance à Activité

Médicamenteuse, à partir des extraits végétaux, préalablement préparés par vos soins, au moyen de techniques chromatographiques. Il s’agira de la:

§ Purification du rutoside par CPP : Chromatographie (solide/liquide) sur Plaque Préparative (phase de silice "normale") d’un extrait de Sophora ;

§ Purification de l’épigallocatéchine-3O-gallate par SPE : Solid Phase Extraction chromatographie (solide/liquide) sur cartouche de silice greffée C18 (phase "inverse") sous moyenne pression d’un extrait de Thé vert ;


INTRODUCTION


Après enrichissement et isolement de la substance d’intérêt, vous en évaluerez l’efficacité de la purification par Chromatographie sur Couche Mince (CCM).

Au regard de ces seuls résultats et des normes de la Pharmacopée, vous serez alors en mesure de vous prononcer quant à l’efficacité de la technique de purification mise en œuvre et surtout, en tant que professionnel de santé, à décider de valider ou non la Voie d’Accès aux Substances Actives Médicamenteuses d’origine végétale.

Evaluation des Travaux Pratiques de VASAM-Pharmacognosie

Par le contrôle continu :

Il vous sera demandé, à la fin de chaque séance (de la séance 2 à la séance 6), un compte rendu succinct de votre manipulation, qui devra comporter, au minimum, la chromatographie sur couche mince (CCM) obtenue, explicitée (Rf + Composition exacte de la phase mobile) et vos conclusions, sur le document RECTO-VERSO fourni en TP (conforme au MODÈLE reproduit ci-après, p. 6 et 7).

Dans le but de nous assurer que vous avez préparé la séance avant votre TP, un contrôle préalable (5 à 10 premières minutes, max), sur le(s) principe(s) utilisé(s) au cours de celle-ci, pourra avoir lieu (via Moodle, par exemple).

Ordre de réalisation des TP :

À chaque séance, chaque groupe (A à E) est réparti en 2 séries :

La série 1 fera les TP dans l'ordre suivant : • Alcaloïdes (séance 1) • Polyphénols (séance 2) • Saponosides (séance 3) • Anthracénosides (séance 4) • Chromatographie sur Plaques préparatives (séance 5) • SPE (séance 6)

La série 2 fera les TP dans l'ordre suivant : • Polyphénols (séance 1) • Alcaloïdes (séance 2) • Anthracénosides (séance 3) • Saponosides (séance 4) • SPE (séance 5) • Chromatographie sur Plaques préparatives (séance 6)


MODELE DE COMPTE RENDU A SUIVRE POUR CHAQUE TP


Compte Rendu TP- Séance n°

Date : NOM : N° Poste : Groupe :

Titre du TP:

§ 1) Objectif du TP : § 2) Structure et nom de la (ou des) Substance(s) Active(s) Médicamenteuse(s)

principale(s) étudiée(s) : § 3) Expliquer le principe de l’étape d’extraction et/ou de purification (selon le

TP): Mettre en évidence les points importants de la manipulation permettant d’obtenir :

§ - un extrait riche en SAM, à partir de la drogue végétale, et les expliquer (TP 1 à 4) § - de purifier l’extrait afin d’isoler la SAM (TP 5,6)

Ne pas recopier le protocole du fascicule de TP


MODELE DE COMPTE RENDU A SUIVRE POUR CHAQUE TP


§ 4) Analyse des résultats Si votre étude porte sur plusieurs drogues végétales, l’analyse des résultats doit être réalisée sur chacune d’entre elles, successivement.

- CCM (Scotcher votre CCM), analyser et conclure Détailler la composition de votre extrait/efficacité de votre purification

- Résultats des tests de reconnaissance : (spécifiques de la catégorie de SAM étudiée + résultats des tests complémentaires de reconnaissance propre à la drogue végétale, si effectués) :

Conclusion :


INITIATION

Compte Rendu TP- Séance n° 6

TP1 : Substances Actives Médicamenteuses ALCALOÏDIQUES 9

TP2 : Substances Actives Médicamenteuses POLYPHENOLIQUES : TANINS saponifiables et CONDENSÉS & FLAVONOÏDES 16

TP3 : Substances Actives Médicamenteuses SAPONOSIDIQUES 24

TP4 : Substances Actives Médicamenteuses ANTHRACÉNOSIDIQUES 31

TP5 : Chromatographie sur Plaque Préparative (purification du Rutoside) 40

TP6 : Chromatographie en Phase Inverse sous Moyenne Pression (purification de l’épigallocatéchine-3O-gallate (EGCG)) 45

TABLEAU RÉCAPITULATIF d’aide à la DIAGNOSE des principaux TYPES de SAM 56

RÉACTIFS 57


Substances Actives Médicamenteuses ALCALOÏDIQUES


TP1 : Substances Actives Médicamenteuses

ALCALOÏDIQUES

Méthode générale d’extraction des alcaloïdes

La solubilité des alcaloïdes présente la particularité de varier radicalement en fonction du pH :

Les alcaloïdes sont donc solubles dans l’eau et les solvants organiques polaires, comme les alcools, tant qu’ils sont placés en milieu acide (parce que sous forme de sels d’alcaloïdes (ammonium). Par contre, ils sont solubles dans les solvants organiques peu polaires comme le dichlorométhane, le chloroforme, etc.…, en milieu alcalin (car ils sont sous forme de base, beaucoup moins polaires). Cette propriété, spécifique des alcaloïdes, est mise à profit dans les procédés d’extraction et de purification des « totum alcaloïdiques ». Par simple modification du pH, ils passent de la phase aqueuse à la phase organique et réversiblement :

Pour l’extraction des alcaloïdes, deux possibilités s’offrent donc à nous :

• Utiliser un acide fort (H2SO4) qui permettra la solubilisation des alcaloïdes présents dans la plante en les déplaçant de leurs combinaisons avec les acides organiques faibles et/ou les tanins, dans l’eau ou le méthanol.

• Alcaliniser la plante (NaOH, Na2CO3, …) et réaliser une extraction par un solvant organique peu polaire. L’avantage de cette seconde méthode est liée à la moindre chaleur massique d’évaporation du solvant organique par rapport à l’eau et à la facilité que nous avons de concentrer le totum alcaloïdique, notamment pour la réalisation d’une chromatographie sur couche mince (CCM), par exemple.

- - - +/- +++

la solubilité des alcaloïdes dépend du pH

solvants organiques peu polaires(benzène, éther, dichlorométhane)

solvants organiques polaires (alcools) Eau

milieu basique (alc. BASES)

milieu acide (alc. SELS)

+++ + - - -H

OH

Sels d'alcaloïdes alcaloïdes Bases(solubles dans les solvants organiques)(solubles dans l'eau)

H

OH

NH3C

OH CH2OH

Oatropine

3-α

(R,S)

NH3C

OH CH2OH

Oatropinium

(R,S)

H

3-α


Substances Actives Médicamenteuses ALCALOÏDIQUES


Ensuite, en ajustant le pH, on pourra donc faire passer alternativement le totum alcaloïdique des sels aux bases, et réciproquement, et donc, de la phase aqueuse à la phase organique, et réciproquement, jusqu’à l’obtention d’un totum purifié qui peut conduire, parfois, à la cristallisation d’un PA (alcaloïde) majoritaire.

En résumé, l’extraction des alcaloïdes comporte les 3 étapes suivantes :

1. Déplacement des alcaloïdes de leurs combinaisons par un agent acide (H2SO4) ou alcalin forts (chaux, soude, potasse).

2. Extraction proprement dite des alcaloïdes (« sels » ou « bases », par un solvant (polaire (eau, méthanol) ou non polaire (dichlorométhane = CH2Cl2), selon l’agent ajouté en 1).

3. Purification par extraction liquide/liquide (de la phase aqueuse ou organique par un solvant organique (dichlorométhane = CH2Cl2) ou de l’eau acide (H2SO4 2%), selon la phase obtenue en 2).

Cristallisation, parfois.

Méthode générale de détection des alcaloïdes La méthode la plus générale pour mettre en évidence des alcaloïdes consiste

à les précipiter par les « réactifs généraux des alcaloïdes ». Ces réactions générales de précipitation sont fondées sur la capacité qu'ont les alcaloïdes à former des complexes insolubles (précipités) avec des métaux lourds : Bi, Hg, Pt, W, et/ou des métalloïdes : I-, I2, ... Il s’agit principalement, des : • R. de Bouchardat (AcOH iodo-ioduré) • R. de Mayer (mercuri-iodure de K+) • R. de Dragendorff (tétraiodo-bismuthate de K+)

Ces réactions de précipitation doivent toujours avoir lieu à partir de solutions aqueuses acides (maximum de solubilité des alcaloïdes), pour pouvoir apprécier plus facilement l’apparition de précipités.

Des réactions plus spécifiques, permettant une mise en évidence de classes particulières d’alcaloïdes, peuvent aussi être utilisées : • R. de Van Urk (p-DMAB) : à alc. indoloisopréniques de l’ergot. • R. au sulfate cérique et ammoniacal : à alc. indoliques • R. de Vitali-Morin (HNO3 fumant + KOH) : à alc. tropaniques • Test de fluorescence : à alc. du Quinquina.

Bouchardat

Mayer

Dragendorff

solut. acide


Substances Actives Médicamenteuses ALCALOÏDIQUES (quinoléiques) (TP n°1)


Alcaloïdes quinoléiques du Quinquina (RUBIACÉES)

En TP, une seule drogue sert de support à l’apprentissage de la recherche des alcaloïdes dans une drogue végétale.

il s’agit du Quinquina. Les quinquinas sont de grands arbres originaires d'Amérique du Sud, cultivés en Indonésie et

en Afrique équatoriale. Il en existe plusieurs espèces caractérisées par la couleur générale de l'écorce : jaune, rouge (qui servent à l'extraction de la quinine), et gris, plus parfumés, utilisés pour la fabrication d'apéritifs.

- Quinquina gris : Cinchona officinalis L. - Quinquina rouge : Cinchona pubescens Vahl (= succirubra Pavon) - Quinquina jaune : Cinchona calisaya Weddell ou C. calisaya var. ledgeriana Howard

Une seule espèce est nommée à la Pharmacopée Européenne ((Ph. Eur., 8ème Ed. 01/2011:0174), mais ses hybrides sont tout autant utilisables : "le quinquina est constitué par l'écorce desséchée de Cinchona pubescens Vahl (syn. C. succirubra Pavon) ou de ses variétés ou de ses hybrides".

Les PA du Quinquina : des alcaloïdes quinoléiques Les principes actifs les plus importants sont des alcaloïdes, issus du tryptophane, donc de la

voie shikimique qui se sont réarrangés en dérivés quinoléiques. Les deux principaux sont la quinine utilisée comme antimalarique et la quinidine comme antiarythmique.

Le quinquina contient également des composés polyphénoliques de type tanins condensés qui colorent la poudre en « rouge » : le « rouge de Quinquina ». Ils donnent une réaction avec le FeCl3 et de BATE-SMITH positives (voir protocole de la réaction, décrit p. 51), ce qui permettra de confirmer qu’il s’agit bien du Quinquina (voir p. 15).

DEBUT des MANIPULATIONS de TP 1 !!!

L’étude macro-/microscopique n’est pas effectuée en TP.

Étude des alcaloïdes du Quinquina

Extraction des AT du quinquina pour réactions générales + CCM

Préparer d’abord un extrait "organique", après alcalinisation de la poudre : - Dans un Erlen en polypropylène de 100 ml (muni de son bouchon), introduire

successivement :

OHOHHO

COOHHO

ac. quinique

NH

N

RH

HOcarbinol

quinuclidine

quinoléine

N

NH3CO

HOH

N

NH

HOH

N

NH3CO

HOH

N

NH

HOH

(+)-cinchonine

(–)-quinine

(–)-cinchonidine

(+)-quinidine

2 2

3 3série 2R, 3S série 2S, 3R

N

H

N

R HHO

carbinol

quinuclidine

quinoléine


Substances Actives Médicamenteuses ALCALOÏDIQUES (quinoléiques)


Poudre de quinquina 400 mg Lessive de soude à 50 g/litre 1,5 ml

Laisser en contact pendant au moins 2 minutes en homogénéisant à la spatule. L’objectif est de bien humecter (alcaliniser) la poudre, uniformément.

- Ajouter 10 ml de chlorure de méthylène (CH2Cl2). - Agiter de façon manuelle, pendant 10 min (phase d’extraction proprement

dite : "macération"). - Filtrer sur un entonnoir muni d’un coton, directement dans une ampoule à

décanter de 100 ml. - Extraire la phase organique une 1ère fois par 10 ml d’acide sulfurique à 2%

(obtenu par dilution au 1/5ème d’acide sulfurique à 10%). Vérifier que le pH de la phase aqueuse après extraction est bien acide (papier pH). Extraire une 2ème fois à nouveau par 10 ml d’acide sulfurique à 2%. Ne jeter la phase organique (poubelle à solvants chlorés), qu’après s’être assuré qu’elle est totalement extraite.

- Réunir les 2 extraits aqueux (total = 20 ml, env.) : "solution aqueuse de sels d’AT de Quinquina"

- Répartir cette solution dans 4 tubes (de 16 ml) : 0,5 à 1 ml, environ chacun*. * Le reste sera utilisé pour étudier les AT par CCM : p. 13.

Mise en évidence DES AT DU QUINQUINA par les réactifs généraux Cet extrait de Quinquina donne des réponses positives marquées aux 3 réactifs

généraux des alcaloïdes : Aux 3 premiers tubes**, ajouter 1 à 2 gouttes (pas plus) de :

1. Réactif de MAYER : il se forme un précipité jaunâtre ; 2. Réactif de BOUCHARDAT : il se forme un précipité brun ; 3. Réactif de DRAGENDORFF : il se forme un fin précipité orangé.

Observer les précipités caractéristiques. Conclure.

+ R. de Mayer+ R. de Bouchardat + R. de Dragendorff sol. Acide ** Le quatrième tube sert, tel quel, pour le test de la fluorescence (p 13). Bien vous assurer que le tube lui-même n’est pas fluorescent (choisir un tube qui, encore vide, ne montre aucune fluorescence sous la lampe UV à 365 nm).

Dragendorff

solut. acide

Bouchardat

Mayer

NE PAS JETER !!!




Confirmation n° 1 pour le Quinquina : Test de fluorescence La fluorescence est spécifique de certains alcaloïdes quinoléiques du quinquina : observer la solution sulfurique du 4ème tube* sous lumière ultraviolette à 365 nm. Une intense fluorescence bleue apparaît.

Ceci est caractéristique du noyau quinoléine méthoxylé de la quinine et de la quinidine, qui constitue le fluorochrome (= chromophore fluorescent) Cette fluorescence est exaltée en présence d’acides oxygénés (H2SO4, HNO3). Elle disparaît cependant (extinction de fluorescence), après addition d’une goutte d'un acide non oxygéné, tel HCl concentré : les halogénures sont de puissants « piégeurs » de fluorescence (« quench » de la fluorescence).

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE des AT du Quinquina

Pour la chromatographie (CCM), placer le reste de la solution (phase aqueuse : 8-10 ml environ) dans une ampoule à décanter et réextraire les AT purifiés par du CH2Cl2 neuf. Pour ce faire, ajouter :

• dichlorométhane (CH2Cl2) : 5 ml (ATTENTION densité = 1,45 à phase inférieure).

Alcaliniser la phase aqueuse par adjonction de : • lessive de soude à 200 g/l QS pH nettement alcalin (de l’ordre de 3 à 6 ml.

Ajouter graduellement !). Vérifier à l'aide du papier indicateur universel. Agiter. Décanter et soutirer la phase organique dans un Erlen sec. Répéter l’extraction par CH2Cl2 5 ml Rassemblez les 2 extraits organiques dans l’Erlen. Sécher sur Na2SO4. Filtrer sur papier filtre dans un entonnoir SEC, directement dans un ballon SEC à col rodé (100 ml) : "solution chlorométhylénique (CH2Cl2) d’AT de Quinquina".

I - Préparation de la solution pour chromatographie - Évaporer à siccité (à sec) à l’évaporateur rotatif à 60°C, la solution

chlorométhylénique (CH2Cl2), obtenue ci-dessus. - Après refroidissement du ballon, redissoudre le résidu dans 3 à 4 gouttes de

méthanol = « solution méthanolique d’AT de Quinquina pour CCM ». II – Chromatographie - Support : Silice sur feuille d’aluminium - 3 pistes - Migration sur 7,5-8 cm. À l’aide d’un capillaire, déposer :

1°) 4 fois de la solution méthanolique d’AT de Quinquina.

N

NH3CO

HOH

(–)-quinine(+)-quinidine




2°) 4 fois le « témoin » pour chromatographie des alcaloïdes du quinquina 3°) le mélange des 2 (piste centrale).

Solvant d’élution : dans une cuve à chromatographier sèche (bécher haut + couvercle de boîte de Pétri), préparer avec précision (sous la hotte) 7,4 ml du solvant :

Toluène – Acétate d’éthyle - Diéthylamine (4 / 2,4 / 1 ; v/v/v)

Bien agiter. Le solvant doit être « monophasique » ! Placer la plaque dans la cuve, la fermer. Ne plus déplacer la cuve ! Laisser le chromatogramme se développer sur 8 cm, environ. Quand le front du solvant a atteint la ligne supérieure (env. 10 min), retirer la plaque. Note : Pendant la migration, vous pouvez effectuer la réaction caractéristique des polyphénols du quinquina : la réaction de Bate-Smith (voir page 15).

III – Révélation - Placer la plaque sous la hotte, et sécher à l’air (séchoir à cheveux), afin d'éliminer toute trace de solvants. - Examiner le chromatogramme en lumière à 254nm, entourer les bandes en trait plein. - Examiner le chromatogramme en lumière ultraviolette à 365 nm, et constater qu'il n'y a pas de taches présentant une fluorescence notable. - Tamponner (à l’aide d’un bout de coton) une solution éthanolique à 5 % d'acide para toluène sulfonique (PTS). SECHER la plaque au sèche-cheveux. Observer à nouveau en lumière ultraviolette à 365 nm et repérer d'un trait de crayon pointillé les taches de fluorescence bleue. - Tamponner ensuite sur le même chromatogramme, le réactif à l'iodoplatinate. - Observer directement Caractériser les taches formées par les AT du quinquina en comparant couleurs, fluorescences et Rf à ceux des témoins :

Chromatographie des alcaloïdes du quinquina

(réactif à l’iodoplatinate) après PTS

(sous UV à 365 nm)

Témoin Mélange

0,380,32

0,47 VioletViolet

Violet

cinchoninequinidine

cinchonidine

0,25Bleu

+

+++quinine

front de solvant

1 cm2 mm2 mm

Extrait2 mm

+++

+++

(RF)




Confirmation n° 2 pour le Quinquina : Mise en évidence des polyphénols

Le quinquina contient également des composés polyphénoliques qui donnent une réaction positive au test général du FeCl3 (voir explications, p. 50). Appartenant à la classe des tanins condensés, ces polyphénols colorent la poudre d’écorces de quinquina en rouge (« rouge de quinquina ») et donnent une réaction de BATE-SMITH positive (voir principe de la réaction p. 17).

Pour faire ce test de mise en évidence des polyphénols du Quinquina (tanins condensés), procéder de la manière suivante :

Réaction de Bate-Smith :

Dans un tube à essais rodé avec bouchon en verre, ajouter :

• Poudre d’écorces de Quinquina : 200 mg • butanol chlorhydrique : 4 ml

Porter le tube au bain-marie à 90°C, 5 à 6 minutes en agitant de temps en temps.

Observer la coloration rouge (cyanidol) intense qui se développe.


Substances Actives Médicamenteuses POLYPHENOLIQUES


TP2 : Substances Actives Médicamenteuses POLYPHENOLIQUES : TANINS saponifiables et CONDENSÉS & FLAVONOÏDES Généralités sur les POLYPHENOLS

Les polyphénols se caractérisent par la présence de noyaux aromatiques porteurs de fonctions hydroxyles (phénoliques, donc).

Propriétés et méthode générale d’extraction des polyphénols

Les polyphénols sont tous des composés plutôt polaires à cause de leurs nombreuses fonctions phénoliques (donc hydrophiles), mais leurs noyaux aromatiques sont à l’origine d’une faible affinité pour l’eau et leur confèrent même, une certaine « lipophilie ». De propriété mixte, les polyphénols sont donc "amphiphiles".

Ainsi, les mélanges "eau + alcool" ou "eau + acétone" sont-ils meilleurs solvants que l’eau seule ou l’éthanol ou l’acétone seuls, pour obtenir de tels extraits.

Propriétés et mise en évidence des polyphénols

Les polyphénols (tanins au sens large = saponifiables et condensés, notamment, flavonoïdes au sens strict, …), ont la capacité de former des chélates colorés avec des sels de métaux lourds. Leur présence au sein d’une drogue à étudier est mise en évidence par l’apparition d’une coloration ou la formation d’un précipité vert-noirâtre intense, après ajout de perchlorure de fer à l’extrait de cette drogue (voir p. 21 et annexe p. 50). En TP, nous aborderons 2 des principales catégories de polyphénols que sont les tanins et les flavonoïdes.

Généralités sur les TANINS

Nature des TANINS

Il existe deux types de tanins, différant par leur structure et leur origine biogénétique : § les tanins saponifiables ou hydrolysables ou « galliques / éllagiques », et § les tanins condensés ou catéchiques ou « Oilgomères ProCyanidoliques ».

1- Les tanins saponifiables ou hydrolysables ou « galliques / éllagiques » : Ce sont des oligo- ou des polyesters d’un sucre "central", estérifié par un nombre variable de molécules d’acide phénol, les acides gallique et/ou ellagique (dimère gallique). Comme leur nom l’indique, ces tanins sont "saponifiables" (en milieu alcalin) ou "hydrolysables" (en milieu acide), car ils renferment des fonctions esters, détruites dans ces deux conditions :

Esters du glucose par des acides gallique et ellagique : tanins saponifiables

HO

COOH

HO

HO

OH

O

OH

OH

OH

OH

HO

O

HOOC

HO

O

O

O O

OO

O

O

OH

OH

OHO

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

O

HO

HOHO

O

OHO

HO

HOO

OH

O

OH OH

OH

OH

O

O OH

O

OO

O

HO

COCO

OHHO

HO

HO

OH

HO

OH

HO

OH

C

C

HO

OH

O

Oac. gallique

ac. ellagiquen

gallotanins: n= 0, 1, 2, 3,...

depsides

tanin éllagique"ellagitanins"

ac. gallique




2- Les tanins condensés ou catéchiques ou « ProCyanidoliques = OPC » :

Ce sont des polymères flavanoliques, constitués d’unités flavan-3-ols liées entre elles par des liaisons interflavaniques, C4-C6, mais le plus souvent C4-C8. Ils résultent d’un couplage ente le C4 électrophile d’une unité flavanyle, issue d’un flavan-4-ol ou d’un flavan-3,4-diol, et un carbone aromatique nucléophile (C8, plus rarement C6), d’une autre unité, généralement un flavan-3-ol, tel la catéchine ou l’épicatéchine :

Les flavan-3-ols monomères et le dimère B2

D’autres exemples d’OPC (dimères) sont donnés en annexe, p. 50.

Propriétés et caractérisation des « tanins condensés » Les polyphénols de l’extrait de pépins de raisin sont des tanins condensés

résultant de la condensation de monomères de type catéchine et épicatéchine à tanins « catéchiques » (voir p. 17). Leurs liaisons "interflavaniques" étant clivables en milieu acide (HCl), il est donc possible de les caractériser, par la couleur rouge caractéristique (cyanidol) qu’ils libèrent dans ces conditions (voir schéma réactionnel p. 17, et protocole, p. 21) : c’est la réaction de BATE-SMITH.

Réaction de BATE-SMITH (généralités)

Son principe repose sur l’hydrolyse des liaisons "interflavaniques" en milieu acide : l’unité catéchique « supérieure » forme un cation benzylique hautement oxydable (par simple contact à l’air), qui se transforme rapidement en un flavylium, le cyanidol, de couleur rouge à ce pH. En partant du dimère B2, le mécanisme de formation de cette couleur rouge est le suivant :

réaction de Bate-Smith (mécanisme de formation spécifique du pigment cyanidolique)

C’est la raison pour laquelle, ces tanins sont encore appelés « tanins ProCyanidoliques » ou OPC (Oligomères ProCyanidoliques).

O

OH

O

OH

HO

OHHO

OH

OH

OH

OH

B2 OH

HO

OH

OHOH

OH

3(S) : (+)-catéchine3(R) : (-)-épicatéchine

8

46 3

OHO

OH

OHHO

R1

R1= R2= H : afzéléchineR1= R2= OH : gallocatéchine

R2O

OHflavan-3-ol

8

46 3

4

8

liaison interflavanique

Ox

H+

O

OH

O

OH

HO

OHO

OH

OH

OH

OHH

O

OH

O

OH

HO

OHO

OH

OH

OH

OHH

H

O

OH

HO

OH

OH

OH

O

OH

O

OH

OH

H H

OH OH

OH

O

OH

HO

OH

OH

OHB2

épicatéchine

cation en 4 (benzylique)

flavylium = cyanidol (rouge)

H+

liaison interflavanique

4




Généralités sur les FLAVONOÏDES

Nature des FLAVONOÏDES (au sens strict)

Ce sont les plus abondants du groupe des flavonoïdes au sens large. Ils constituent les principaux pigments « jaunes » des fleurs avec une origine biogénétique identique à celle des flavanols mais se caractérisent par la présence d’un carbonyle en C4 accompagné ou non d’une double liaison en C2-C3 :

squelette des principales génines flavonoïdiques au sens strict

Propriétés et extraction et mise en évidence des « flavonoïdes »

Les flavonoïdes sont des polyphénols de même squelette que la catéchine. Ils en possèdent donc les principales propriétés physicochimiques : leur extraction a lieu dans des conditions assez semblables. Cependant, à la différence des tanins, ils sont fréquemment liés à des sucres (à hétérosides) et sont alors plus polaires et hydrophiles. Dans la plupart des cas, les solvants d’extraction sont alors des alcools ou des mélanges hydroalcooliques dont on fera varier la teneur en eau et/ou la température pour obtenir des polarités comparables. Comme tous les polyphénols, ils donnent une réaction positive au perchlorure ferrique (p. 21 et annexe p. 50).

Propriétés et caractérisation des « flavonoïdes »

La réaction spécifique de caractérisation des flavonoïdes est la réaction dite « de la cyanidine ».

Réaction spécifique de caractérisation des flavonoïdes : réaction « de la cyanidine »

Elle utilise en effet le pouvoir réducteur de métaux en milieu acide (formation de l’hydrogène « naissant »), pour réduire spécifiquement le noyau flavonoïdique. La réaction de la cyanidine est basée sur l’obtention de couleurs caractéristiques du noyau de départ, après sa réduction par l’hydrogène naissant :

structures flavonoïdiques mises en évidence par la réaction de la cyanidine

OHOHO

HO

OH

O

OHHO

OH

OOH

OH

flavanones chalcones

OHOHO

HO

OH

OOH

flavonols

OHOHO

HO

OH

O flavones

OHOHO

HO

OH

O

OHHO

OH

OOH

OH

flavanones chalcones

OHOHO

HO

OH

OOH

flavonols

OHOHO

HO

OH

O flavones

Mg + HCl H2

MgCl2

OHOHO

HO

OH

OHOH

OHOHO

HO

OH

OHOHO

HO

OH

OH

Mg + HCl H2

MgCl2Mg + HCl H2

MgCl2Mg + HCl H2

MgCl2

rouge cerise orange rouge violacé

négatif(ne sont pas des flavonoïdes

au sens strict)


Substances Actives Médicamenteuses POLYPHENOLIQUES (TP n°2)



Les polyphénols (tanins condensés) des pépins de raisin

Les pépins de raisin (Vitis vinifera L., VITACÉES) ne constituent pas une drogue "médicinale" et n’ont pas de monographie à la Pharmacopée, mais ils sont une source industrielle d’extraits d’OPC (pour "Oligomères ProCyanidoliques", doués de propriétés « vitaminiques P »), utilisés dans la fabrication de la spécialité pharmaceutique Endotélon®.

En TP, nous utiliserons la même source végétale, les pépins de raisin (Vitis vinifera L., VITACÉES) pour apprendre à en extraire les procyanidols (OPC), à les mettre en évidence par la réaction du perchlorure ferrique, et à les caractériser par la réaction de BATE-SMITH. Comme dans l’industrie, la chromatographie sur couche mince permettra de vérifier la qualité « oligomères procyanidoliques » de l’extrait.

Étude de la drogue : les pépins de raisin

L’étude macro-/microscopique n’est pas effectuée en TP.

Extraction des tanins catéchiques pour la CCM

L’extraction des tanins catéchiques est effectuée en gardant les pépins de raisin entiers. Afin d’obtenir une meilleure extraction, la drogue est placée directement, au contact du solvant extractif, sans broyage préalable (pour éviter les émulsions qui se formeraient avec l’huile présente dans les cotylédons de ces graines).

Dans un Erlen de 250 ml, peser la drogue : 25 g de pépins. Ajouter un mélange acétone - eau (6/3) : 45 ml (30 acétone + 15 eau)

- Laisser macérer (drogue au contact du solvant, à température ambiante), pendant au moins 10 min. Agiter sur agitateur magnétique.

- Filtrer (filtre Buchner) sous vide, dans une fiole de à vide. - Transvaser le filtrat dans un ballon rond de 250 ml. - Evaporer l’acétone au rotavapor. - Placer la « solution » aqueuse résiduelle (12 ml d’eau

environ) en ampoule à décanter (100 ml). - Extraire la phase aqueuse une 1ère fois par 10 ml d’acétate

d’éthyle (d=0.9). Séparer les 2 phases, récupérer la phase organique dans un erlen sec, puis replacer la phase aqueuse dans l’ampoule. Extraire une 2ème fois à nouveau par 10 ml d’acétate d’éthyle.

* Les tanins catéchiques sont plus solubles dans la phase organique que dans l’eau. ATTENTION : densité de l’AcOEt < celle de l’eau.

- Réunir les 2 phases organiques (supérieures) dans un Erlen SEC de 125 ml.

- Ajouter du sulfate de sodium anhydre et agiter pour sécher la phase organique. - Filtrer sur un entonnoir sec muni d’un coton, directement dans un ballon rond (à

col rodé) de 100 ml sec.

Extraction par l’acétate d’éthyle




- Concentrer à siccité par évaporation sous vide (rotavapor) : à « extrait sec d’OPC de pépins de raisin ».

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE des OPC de pépins de raisin

I - Préparation de la solution pour chromatographie - Dissoudre l’extrait sec d’OPC de pépins de raisin (dans le ballon), en

ajoutant, dans un premier temps, 4 à 5 gouttes de méthanol = "solution d’OPC". II - Chromatographie

- Support : film de Silice sur plaque aluminium - 3 pistes - Migration sur 7,5 cm. - À l’aide d’un capillaire, déposer : 1°) 4 fois de la solution préparée ci-dessus (solution d’OPC). 2°) 4 fois le témoin pour chromatographie de tanins catéchiques (catéchine). 3°) Leur mélange (piste centrale).

Ne jeter pas le reste de votre "solution d’OPC". Il est utilisé pour mettre en évidence les polyphénols (FeCl3) et identifier leur nature (Bate-Smith).

- Développer avec :

Chloroforme - Méthanol - Acide acétique (8 / 2 / 0,3 ; v/v/v). Un binôme doit réparer la quantité nécessaire de solvant pour remplir les 2 grandes cuves, mises à dispositions dans la salle, communes à tous les binômes. ATTENTION !!! La cuve à chromatographier doit impérativement être sèche.

Placer simultanément (tous les binômes utilisant une même cuve), les plaques chromatographiques et fermer la cuve (couvercle). Développer le chromatogramme sur 7-8 cm. Ne plus déplacer la cuve !

Lorsque le front du solvant a atteint la ligne supérieure (environ 30 mn) : retirer le chromatogramme.

III – Révélation - Placer le chromatogramme sous la hotte, et

sécher à l’air (séchoir à cheveux), afin d'éliminer toute trace de solvants.

- Tracer le trait du front de solvant. - Observer le chromatogramme sous lumière

UV (254 nm et 365 nm) et entourer au crayon de papier les taches observées.

- Tamponner avec un coton le réactif à l'anisaldéhyde. Chauffer au "heat-gun", pour révéler le chromatogramme.

- Repérer les monomères, les dimères et les trimères, par rapport à la position de la catéchine, témoin, calculer leur Rf.

Pour mettre en évidence et caractériser les polyphénols de cette drogue végétale, procéder de la manière suivante :

Diluer le reste de la "solution d’OPC" dans 3 ml de méthanol (MeOH). Répartir la solution en 2 tubes à essais : 1 ml et 2 ml environ.

catéchine

dimères

trimères

monomères

front de solvant (RF)




Mise en évidence des polyphénols dans l’extrait de pépins de raisin par la réaction au perchlorure ferrique

Comme tous les polyphénols, les polyphénols de l’extrait de pépins de raisin donnent une réaction positive en présence de métaux lourds (FeCl3, voir p. 16 et annexe, p. 50).

Au tube contenant 1 ml de "solution d’OPC", on ajoute : 2 gouttes de perchlorure ferrique (FeCl3 à 10%). Observer le précipité noir-vert intense, caractéristique.

Caractérisation des tanins condensés de pépins de raisin par la réaction de BATE-SMITH

Les polyphénols de l’extrait de pépins de raisin sont des tanins condensés ou « catéchiques » formés par condensation de monomères de type flavan-3-ol ((+)-catéchine, (-)-épicatéchine), voir p. 17, et formation de liaisons "interflavaniques" qui sont fragiles en milieu acide Ainsi, le réactif de BATE-SMITH, le butanol chlorhydrique (BuOH, HCl) sur les tanins condensés, provoque-t-il la libération du cyanidol de couleur rouge caractéristique (voir schéma réactionnel p. 20).

Pour caractériser la nature procyanidolique des tanins de pépins de raisin, on utilise la réaction de BATE-SMITH. Le protocole de cette réaction est le suivant : Au tube contenant 2 ml de "solution d’OPC", ajouter :

• réactif au butanol chlorhydrique : 2 ml environ

Porter au bain marie (90°C) pendant 5 minutes au moins, en agitant à intervalles réguliers (pour favoriser l’oxydation du cation benzylique).

La coloration rouge qui apparaît, caractéristique du cyanidol, témoigne de la nature ProCyanidolique des tanins de pépins de raisin.

H+

OxO2 de l'air

butanol, HCl




Les flavonoïdes (rutine) du Sophora japonica (FABACÉES) Pour réaliser ces essais « positifs », en TP, vous disposez d’une source végétale qui en est riche :

- boutons floraux de Sophora (Sophora japonica L., Fabacées)

(= rutine : 3-O-rhamnoglucososide de quercétol = 3-O-rutinosylquercétol)

Le bouton floral de S. japonica (Ph. Eur. 9ème Éd., 07/2011:2427) contient jusqu’à 20% de rutine (=rutoside). De ce fait, il constitue la source principale utilisée par l’industrie pharmaceutique. D’autres plantes en renferment et sont des sources alternatives de rutoside : Ruta graveolens L (historique), Eucaplyptus macrorrhyncha F. Muell., ou Fagopyrum esculentum Moench, Fagopyrum tataricum (L) Gaertn. ou encore Polygonum fagopyrum L.

Extraction des flavonoïdes des bourgeons floraux de Sophora

L’extraction des polyphénols est effectuée à partir de la poudre de bourgeons floraux, placée au contact du solvant d’extraction : solution hydroalcoolique.

Dans un tube à essais de 16 ml, peser la drogue : 200 mg de poudre.

Ajouter : - éthanol : 4 ml - eau : 1 ml

- Placer le tube au bain marie à 65°C, pendant au moins 10 min.

- Filtrer à chaud l’alcoolat sur papier-filtre plissé, en 2 parts égales, dans 2 tubes à essais (16 ml) = "solution de flavonoïdes".

Mise en évidence des polyphénols de Sophora par la réaction au perchlorure ferrique

Pour mettre en évidence les polyphénols de cette drogue végétale, procéder de la manière suivante :

Dans un des 2 tubes de 2 ml environ de "solution de flavonoïdes, ajouter :

HOO OH

OH

HO

OOO

HOOH

OH

OOHO

HO OH

rutoside




1 goutte de perchlorure ferrique (FeCl3 à 10%) :

Voir p. 16 et annexe, p. 50.

Observer le précipité noir-vert intense, caractéristique des (poly)phénols.

Conclure.

Caractérisation des polyphénols (à flavonoïdes) de Sophora par la réaction de la "CYANIDINE"

Cette réaction permet de mettre en évidence spécifiquement cette deuxième catégorie de polyphénols : les flavonoïdes (voir p. 51).

Attention : Lors du test, placer votre tube à essai dans un bêcher (250 ml) rempli d’eau froide, afin d’éviter l’élévation de température et l’emballement de la réaction.

Dans le 2ème tube de "solution de flavonoïdes" : 2 ml environ, ajouter : 0,5 ml (6-7 gouttes) d’ acide chlorhydrique concentré puis une rognure de magnésium. Une coloration caractéristique du flavonoïde (rutoside majoritaire = flavonol, ici) par transformation en cyanidol (ou "cyanidine", rouge cerise), se développe lentement, avec une disparition totale de la couleur jaune citron

une réduction progressive du flavonoïde (rutoside), jaune citron, par l’hydrogène « naissant » (métal

en milieu acide) forme de la cyanidine de couleur rouge-cerise

Conclure, en fonction de votre résultat (voir p. 18 et 51).

réac

tion

à la

cyan

idin

e

réac

tion

au F

eCl 3


Substances Actives Médicamenteuses SAPONOSIDIQUES


TP3 : Substances Actives Médicamenteuses SAPONOSIDIQUES

Généralités sur les SAPONOSIDES

Les saponosides (ou saponines) existent sous forme « inactive » dans les plantes (condensés à de nombreux sucres qui sont hydrolysées quand nécessaire, ce qui les transforment en leurs formes « actives », qui en font tout l’intérêt :

• Anti-microbiens, anti-fongiques, parasiticides. • Irritants cellulaires (sternutatoires, expectorants)

• perméabilité membranaire des cellules (extirpent le cholestérol ?) : détruisent les hématies (hémolytiques)

• Toxiques pour animaux sang froid (ichtyotoxiques, molluscicides à schistosomiases)

• Anti-Inflammatoires, anti-hémorroïdaires, cicatrisants, …

Nature des SAPONOSIDES

Ce sont des hétérosides dont la génine stéroïdique ou triterpénique (lipophile) est reliée à des résidus sucrés (polaires), en nombre parfois important, et dont certains sont des acides uroniques.

dualité structurelle justifiant le caractère amphiphile des SAM saponosidiques

D’autres exemples de saponosides sont présentées en annexe, p. 52.

Propriétés et extraction des « SAPONOSIDES »

Cette structure particulière (duale) leur confère des propriétés amphiphiles qui en font de véritables savons (à saponosides). Le plus souvent, ces SAM ne sont :

- ni solubles dans l’eau seule, - ni non plus dans les solvants organiques seuls.

Pour les extraire efficacement, il convient alors d’utiliser des mélanges de ces deux types de solvants : eau et organiques miscibles, donc, polaires (acétone, éthanol, méthanol, …). La nature du solvant organique et ses proportions par rapport à l’eau, déterminent la sélectivité des types de SAM qui sont extraites de la drogue.

OH

O

HO OH O

O

O

OOCOOH

OOH

OOHO

HOOH

OH

O

HOOH

OH

OH

ESCINEplage hydrophobe

(squelette terpénique)

plage hydrophile(fonctions polaires)


Substances Actives Médicamenteuses SAPONOSIDIQUES


Mise en évidence des « SAPONOSIDES » : pouvoir aphrogène

La mise en évidence des saponosides dans une drogue végétale, est basée sur l’observation de leur pouvoir aphrogène, c'est-à-dire la capacité qu’ont leurs solutions aqueuses à mousser, après agitation.

Afin de garantir que la drogue est conforme, la teneur en saponosides a, jusqu'en Juillet 2019, été évaluée par la mesure de "l’INDICE DE MOUSSE", remplacée aujourd'hui par une mesure HPLC-UV-visible. La monographie du Polygala (traité en TP) est une des rares à toujours y recourir.

En annexe, figurent les méthodes « rapide » de mise en évidence, p. 52, et de « dosage » des saponosides, p. 52.


Substances Actives Médicamenteuses SAPONOSIDIQUES (TP n°3)



Saponosides de la racine de Polygala, Polygalacées Pour étudier cette classe de composés, en Travaux Pratiques, nous prendrons les parties

souterraines (racines/souches) de Polygala sp. (Polygalaceae) comme drogue modèle. La monographie de la Pharmacopée Européenne (Ph. Eur., 9ème Éd., 07/2019:0202) indique :

DEFINITION : Racine et souche de Polygala senega L. ou racine de Polygala tenuifolia Willd. entières ou

fragmentées, débarrassées des radicelles et séchées. La racine de Polygala tenuifolia Willd. est expectorante dans le cas de bronchite, fluidifie les

viscosités présentes dans les muqueuses, dans les catarrhes et les emphysèmes. Ainsi elle est traditionnellement utilisée dans le traitement symptomatique de la toux. De nos jours en Europe, elle est peu employée. Elle est par ailleurs traditionnellement utilisée en médecine chinoise depuis des milliers d'années pour ses propriétés expectorantes, toniques, tranquillisantes et pour le traitement des démences, de l'amnésie dans la neurasthénie.

CARACTÈRES :

• Odeur faible et douceâtre, légèrement rance ou rappelant le salicylate de méthyle. • Pulvérisée, la racine de polygala est irritante et sternutatoire. Agitée avec de

l’eau, la poudre donne une mousse abondante.

Les SAM des racines de Polygala : des saponosides La drogue renferme des lipides (environ 5%), du salicylate de méthyle, des acides phénols, des

oligosaccharides et de 5 à 10% de saponosides. Ce sont des saponosides essentiellement triterpéniques formés d'un mélange complexe de

composés bidesmosidiques avec principalement la présénégine comme aglycone. Les autres saponosides ont des structures diversifiées en fonction des espèces de polygala.

Les saponosides de P. tenuifolia sont dénommés onjisaponines.

R R1 R2 R3 R4

onjisaponine A

H

onjisaponine E

H H H

onjisaponine G

H

H H

Onjisaponins A, E, F et G de la racine de P. tenuifolia1

1 Takayuki Nagai et al. Onjisaponins, from the root of Polygala tenuifolia Willdenow, as effective adjuvants for nasal influenza and diphtheria-pertussis-tetanus vaccines. 2001, Vaccine, 19(32) pp4824-34.

O

OCH3

O

OHHO

CH3

HO O

OHHO

HOO

OH

OH

CH2OHHO

O

OCH3

OCH3

OCH3

O

OH

OH

CH2OHHO

O

OCH3

OCH3

OCH3

O

OHHO

HO

HO

COOH

CH2OH

présénégénine

OOCH2OH

OH

OHHO Glc

COOO

CH3RO

OR1

O

Fuc

OCH3

O

R2O OH

O

OH

OR3

R4O

RhaXyl




Pour caractériser des saponosides : il faut les extraire et les purifier. C’est une opération assez difficile qu’on ne pourra faire en TP. Aussi préfèrera-t-on, ici, nous en tenir à une estimation de leur pouvoir aphrogène.

Saponosides de Polygala tenuifolia Willd.

Réactions d’Identification Rapide des Saponosides

Note : Pour une recherche rapide de saponosides dans une drogue inconnue, utiliser la méthode générale de mise en évidence de ces substances, décrite p. 52, directement sur la poudre de drogue.

Étude des Saponosides en CCM A - PRÉPARATION DE L’EXTRAIT : filtrat hydroalcoolique Dans un tube à essais de 16 ml, introduire : • Poudre de polygala : 1 g • Éthanol : 7 ml • Eau : 3 ml Porter au bain-marie à 65°C, pendant 15 minutes. Filtrer à chaud l’alcoolat (papier-filtre plissé/entonnoir) dans 1 tube à essais de 16 ml.

Ce filtrat alcoolique est utilisé pour la CCM.

B – CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM) - Support : Silice sur film aluminium - 3 pistes - Migration sur 7,5 cm. - Déposer : 1°) 4 fois de la solution préparée ci-dessus 2°) 4 fois le témoin des saponosides pour chromatographie (escine). 3°) Leur mélange (piste centrale).

- Développer avec le mélange de 3 solvants acétate d’éthyle – n-propanol - H2O, dans les proportions suivantes (en volumes) :

40% - 40% - 20%.

Chaque binôme préparera le solvant pour sa propre cuve à chromatographier. - Un bon compromis, pour ne pas gaspiller de solvant inutilement, serait de préparer 7,5 ml au total avec les volumes suivants, qui respectent ces proportions :

acétate d’éthyle : 3 ml n-propanol : 3 ml H2O : 1,5 ml

Bien agiter : seul un solvant monophasique permet une élution correcte ! Lorsque le front du solvant a atteint la ligne supérieure, retirer les CCM.




Favoriser l’évaporation du solvant par agitation à l’air, ou mieux, au sèche-cheveux, sous la hotte. C – REVELATION

- Pulvériser le réactif à l'anisaldéhyde (tamponner le chromatogramme avec un coton imbibé).

- Chauffer au « heat-gun ».

- Caractériser les taches du chromatogramme correspondant au polygala par rapport à celles du témoin fourni, en comparant Rf et coloration.

Ci-contre, chromatogramme de l’extrait "saponosidique"

de P. tenuifolia

Dosage des saponosides du polygala : Indice de mousse I – Préparation de l’extrait à 1% de poudre :

- Peser exactement à peu près 1 g de poudre (= poids p), et l’introduire dans un Erlen de 250 ml avec 100 ml d’eau distillée.

- Chauffer au bain-marie à 95°C pendant 30 minutes : « infusion ». - Filtrer à chaud l’« extrait », dans un Erlen propre, à l’aide d’un grand entonnoir

muni d’un morceau de coton.

NB : vous n’êtes pas tenu d’attendre que l’intégralité de l’extrait soit filtré. Seuls 27,5 ml sont nécessaires à la mise en œuvre de la gamme de mousse.

II - Dosage des saponosides : mesure de l’« Indice de mousse » La concentration de l’extrait est d’environ 1 % = 1/100ème (p/v).

Dans 10 tubes à essais calibrés (tous de même diamètre), introduire les quantités selon le tableau :

Tube n° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Extrait dilué (ml) 0,1 0,3 0,6 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

Eau (ml) 9.9 9.7 9.4 9 8,5 8 7,5 7 6,5 6

- Boucher (avec le doigt). - Agiter vigoureusement chaque tube, en position horizontale pendant 15 secondes environ, et "abandonner" le tube sur son portoir. - Après 10 minutes au repos, mesurer les hauteurs de mousse.

O

H

Oanisaldéhyde




- Noter pour le calcul, le tube ayant une hauteur de mousse résiduelle de 1 cm.

gamme de dilutions décroissantes de l’extrait de polygala pour la mesure de l’INDICE DE MOUSSE

On appelle « Indice de mousse », l’inverse de la dilution correspondant à ce tube.

Exemple de calcul : Imaginons que c’est le tube 5 qui a une hauteur de mousse de 1 cm : il contient 1,5 ml d’extrait à 1% et 8,5 ml d’eau, la concentration de ce tube est donc de :

= 0,0015 g de polygala par litre d’eau, c’est-à-dire à une dilution finale de 0,0015 / 1 = 1,5/1 000ème

Dans ce cas, l’indice de mousse, qui est égal à l’inverse de la dilution, serait 667 :

Remarque : Il est nécessaire de tenir compte du poids p exactement pesé au départ. Exemple : si p est égal à 0,95 g et non pas 1 g, la concentration réelle initiale est de 0,0095. Par conséquent le calcul devient :

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1

100x 1,5

10

dilution dans le tube n°5(de l'extrait)

0,01= 0,15x 0,0015 g de polygala / litre=

1g d’extrait concentration initiale de l'extrait

volume d'eau pour préparer l'extrait

Indice de mousse =1000

1,5667inverse de =

1000

1,5

0,95

100x 1,5

10

dilution dans ce tube n°5(de l'extrait)

0,0095= 0,15x 0,001425= g de polygala / litre

poids réel pour préparer l'extraitconcentration initiale

(de l'extrait)

volume d'eau pour préparer l'extrait




Donc, l’indice de mousse exact, dans ces conditions, est 702 :

Si aucun tube ne montre une mousse de 1cm exactement, alors il faut trouver le tube virtuel qui serait de 1cm, situé entre le tube plus petit que 1cm et le suivant, plus grand que 1cm, et calculer la concentration de ce tube virtuel au pro rata des dilutions de ces 2 tubes (voir exemple de calcul dans la 4ème question de l’examen du 21 décembre 2017, p. 33 des annales corrigées).

Indice de mousse =0,001425

1= 702


Substances Actives Médicamenteuses ANTHRACÉNOSIDIQUES


TP4 : Substances Actives Médicamenteuses ANTHRACÉNOSIDIQUES

Généralités sur les SAM ANTHRACENOSIDIQUES Les anthracénosides, à propriétés laxatives (stimulants) et purgatives, constituent une classe

chimique homogène. Ces SAM dérivent toutes de la même structure anthracénique avec quelques modifications fonctionnelles qui différencient les aglycones.

R3 R6

chrysophanol (cascara) CH3 H

émodol (bourdaine) CH3 OH

aloe-émodol (cascara, sénés) CH2OH H

rhéine (sénés) COOH H

physcion (rhubarbe) CH3 OCH3

Ces substances existent sous deux formes réduite et oxydée :

Les formes réduites (dont le carbone 10 est "libre" = méthylène) sont les formes très

majoritaires de la plante fraîche. C’est ce qui les rend inutilisables en pharmacie, telles quelles, car elles sont trop drastiques. Pour être délivrées par le pharmacien, les drogues officinales ne doivent contenir que des formes oxydées. Il existe deux voies principales d’oxydation, à partir des drogues fraîches : Pl. fraîche : Plante sèche : Majoritairement 2 processus possibles : (formes oxydées) Hétér. d'anthrones monomères oxydation chimique à hétér. d’anthraquinones (formes réduites) oxydation enzymatique à hétér. de dianthrones ex. : le séné :

La dimérisation des anthrones du séné (rhéine anthrone) en sennosides est le procédé majeur

d’oxydation, à condition de ne pas dénaturer les enzymes (oxydases) par une trop forte température, lors du séchage de la drogue. Une telle transformation en dianthrones, tout comme en C-hétérosides ou en hétérosides d’anthraquinones, correspond à un "blocage" du méthylène en 10 et à une disparition du pouvoir drastique. C’est ce dont le pharmacien doit s’assurer.

O O

O

OH

anthraquinoneanthroneanthranolanthracène

Otautomérie

OO OH

COOH

Glc

H H

OO OHGlc

Glc O

COOHCOOH

OHOGlc

O

COOH

OHO

O8-glucoside de rhéine 8-glucoside

de rhéine anthrone

sennosides A et B

enzymes

si temp. < 40°C(Air, lumière)

plante fraîche :plante séchée à temp. > 40°C : plante séchée à temp. < 40°C :

O

anthraquinones dianthrones

101010

10

8a7

510a

4

29a

9

104a

8

6 3

1

O

OH

R6

O

R3

OH




Méthode générale d’extraction des ANTHRACENOSIDES

Les anthracénosides sont tous des composés plutôt polaires à cause de leurs fonctions phénoliques et de leurs nombreuses fonctions alcools des sucres : ils sont donc hydrophiles et solubles dans les solvants polaires. Étant donné le mode d’identification général utilisé pour cette catégorie de substances, la réaction de Bornträger sur la génine seule (voir ci-dessous), l’extrait « aqueux » qui est obtenu à partir de la drogue, sera traité systématiquement en milieu acide et/ou oxydant dans le but de transformer l’ensemble des principes actifs en anthraquinones libres.

Ces génines ont perdu leur polarité et acquis une certaine « lipophilie » : elles ne sont extractibles qu’en milieu organique peu polaire : toluène, chlorure de méthylène, éther … . Ainsi, l’action de mélanges "eau + acide minéral" ou "eau + acide oxydant" ou "eau + acide + oxydant", directement sur la drogue, suivie d’une « extraction » par un solvant organique peu polaire sont-ils la meilleure manière de préparer de tels extraits qui permettent de réaliser directement la réaction de Bornträger.

Mise en évidence des anthracénosides : réaction de BORNTRÄGER

La caractérisation des principes actifs anthracéniques dans une drogue végétale est effectuée par la réaction de BORNTRÄGER. Elle est basée sur la coloration rouge intense que fournissent les 1,8-dihydroxy anthraquinones (jaune-citron et organosolubles, au départ), lorsqu’elles sont placées en milieu fortement alcalin (KOH = réactif de Bornträger) : formation d’un dianion rouge (polaire, donc hydrosoluble) à phase aqueuse.

en milieu alcalin fort (KOH, NaOH) : formation du polyanion anthraquinonique (rouge)

L’espèce responsable de cette coloration est au minimum un dianion, tel que décrit ci-dessus, du fait de la délocalisation (conjugaison) des charges anioniques sur l’ensemble du système aromatique (anthraquinone). La couleur n’apparaît donc qu’avec les anthraquinones 1,8-dihydroxylées libres.

hydrolyses (HCl, H2SO4) ET oxydations (HNO3 ou FeCl3 + HCl) préalables impératives

selon la nature des anthracénosides de la drogue analysée

O

O

O

CH3

O

HO

O

O

OH

CH3

OH

HO

18 KOH

éléments nécessairement "libres" pour une réaction de Bornträger positive

O

O

O

R1

O

HO

O

O

OH

R1

OH

HO

18 KOH

O OH

R1

O

O

R2

R3

O OH

R1

O

O

R2

R3 H+dianthrones

O

O

OH

R1

O

O

R2

R3

O-hétérosides d'anthraquinonesH+

O-hétérosides d'anthronesH+

[O]

[O]

H+

O

R4

OH

R1

O

O

R2

R3

C-hétérosides d'anthrones[O]

O OH

R1

O

O

R2

R3




Les O-hétérosides doivent être préalablement hydrolysés de leurs sucres. Les anthrones (formes réduites) doivent être oxydées en anthraquinones et hydrolysées (si glycosylées). Les C-hétérosides, comme les dianthrones, sont beaucoup plus difficiles à hydrolyser et à oxyder. Elles ne forment les anthraquinones qu’après un traitement énergique en milieu acide et oxydant fort (HNO3, ou FeCl3 + HCl).

Cela explique la difficulté variable à obtenir la réponse positive et les différents protocoles employés pour pratiquer cette réaction, en fonction de la composition de chaque drogue.

En TP, trois drogues serviront de support à l’apprentissage de la recherche d’anthracénosides, il s’agit de :

- la Bourdaine, - la Rhubarbe de Chine (officinale), et - la rhubarbe des jardins = le Rhapontic

Généralités sur les drogues à ANTHRACENOSIDES

• la Bourdaine, Rhamnus frangula L., ou Frangula alnus Miller, RHAMNACÉES, La drogue (Ph. Eur., 9ème Éd., 04/2011:0025), récoltée au moment de la floraison, est constituée par l’écorce desséchée de la tige et des branches, voir Annexe p. 53. Pour être conforme, la drogue (l’écorce de tiges et branches desséchée) doit contenir au minimum 7% en poids de glucofrangulines, exprimées en glucofranguline A.

• la Rhubarbe de Chine (officinale), Rheum palmatum L., POLYGONACÉES, La drogue (Ph. Eur., 9ème Éd., 01/2008:0257, corrigé 6.0) est constituée par les organes souterrains entiers ou coupés, séchés de Rheum palmatum L. ou de Rheum officinale Baillon ou de leurs hybrides (voir Annexe p. 54).

NB : Cette Rhubarbe est souvent falsifiée par la rhubarbe des jardins, le RHAPONTIC, Rheum rhaponticum L., une autre POLYGONACÉES. Il est possible de mettre en évidence une telle falsification par l’analyse du contenu chimique de la drogue : elle renferme du rhaponticoside, un stilbénoïde fluorescent qu’il faut apprendre à reconnaître, ici, en TP.

• la rhubarbe des jardins = le Rhapontic, Rheum rhaponticum L., R. rhabarbarum L., R x hydridum Murray (R. cultorum), POLYGONACÉES. Le rhapontic, ou rhubarbe des jardins, utilisée à des fins ornementales et pour ses pétioles comestibles, est considéré comme étant une falsification de la rhubarbe de Chine. Le rhapontic n’est guère utilisé qu’en pharmacie vétérinaire (bien que classé officiellement dans la catégorie des laxatifs stimulants ; Note explicative, 1998).

La distinction entre la rhubarbe et le rhapontic par examen macroscopique et microscopique est malaisée. Ainsi, toute falsification de la drogue rhubarbe par du rhapontic se fondera sur une évaluation de la composition chimique de l’extrait de poudre de plante à évaluer.

En effet, le rhapontic, outre le fait qu’il renferme, bien qu’en quantité moindre, des dérivés anthracéniques, présente des quantités plus importantes de dérivés stilbénoïques, en particulier le rhaponticoside ou rhaponticide, un composé fluorescent, pratiquement absent chez les rhubarbes officinales.

Il faut noter que la seule observation de la CCM pour comparer les différentes espèces, reste délicate. En effet, la racine de rhubarbe officinale renferme, elle aussi, quelques dérivés stilbéniques susceptibles de laisser apparaître une faible fluorescence. Aussi, la Pharmacopée Européenne 8ème édition, préconise-t-elle une recherche spécifique du rhaponticoside.

OH

O-Glc

OHH3CO rhaponticoside


Substances Actives Médicamenteuses ANTHRACÉNOSIDIQUES (TP n°4)



Vous vous familiariserez à l’extraction et à la mise en évidence d’anthracénosides, à partir de ces 3 drogues végétales qui en sont riches :

- la bourdaine, - la rhubarbe de Chine (officinale), et - la rhubarbe des jardins = le rhapontic.

Les deux rhubarbes seront étudiées comparativement (en parallèle), puisqu’il faut savoir distinguer le rhapontic de la Rhubarbe officinale, qu’il falsifie souvent.

Étude des anthracénosides de la Bourdaine (RHAMNACÉES)

Mise en évidence des anthracénosides de la bourdaine : réaction de BORNTRÄGER

Étant donné que la majorité des SAM anthracénosidiques de la bourdaine sèche sont de simples O-hétérosides et déjà oxydées sous forme d’anthraquinones (frangulosides et glucofrangulosides) par la conservation de la drogue pendant un an au moins, leur hydrolyse est facile, et ne nécessite pas l’ajout d’eau oxygénée (voir p. 55).

Un simple traitement par l’H2SO4 à chaud, suffit à les transformer en anthraquinones libres pour avoir une réaction de Bornträger pratiquement totale et donc, fortement positive.

Pour mettre en évidence les anthracénosides de la bourdaine sèche par la réaction de Bornträger : Dans un tube à essais, introduire :

- poudre d’écorce de Bourdaine : 200 mg environ - acide sulfurique à 10% : 5 ml

Porter au bain-marie bouillant (à 95°C) pendant 10 minutes (hydrolyse des sucres). - Filtrer à chaud sur papier-filtre dans un tube à essais de 16 ml à col rodé.

Note : Si vous laissez refroidir avant de filtrer, les anthraquinones ne seront plus "solubles" dans l’eau froide et seront éliminées lors de la filtration !

Laisser refroidir le filtrat. Ajouter un égal volume (3 à 4 ml) d’éther éthylique (travailler sous la hotte). Agiter par retournement du tube fermé (bouchon rodé) DOUCEMENT, pour ne pas

former d’émulsions.

O

O

OH

CH3

OHO

O

OH

CH3

OH

HO

émodol chrysophanol

O O OH

OCH3

R

Rha-O Api-O

OR

CH3O

OHO

R= Glc : glucofranguloside A glucofranguloside BR= H : franguloside A franguloside B

hydrolyse

(H2SO4)

+

Bornträger 100%déjà oxydées en quinones




Décanter l’éther (phase supérieure) en le prélevant à l’aide d’une pipette Pasteur. Répéter l’opération afin de bien extraire les anthraquinones. Placer les 2 phases éthérées dans un autre tube à essais et ajouter un égal volume de lessive de NaOH à 50 g/l. Agiter énergiquement.

La phase aqueuse (inférieure) se colore en rouge pourpre (émodol dianion, majoritaire), tandis que la phase organique (supérieure), initialement colorée en jaune citron (anthraquinones), se décolore totalement. Sous forme de sels (dianions), elles ne sont plus solubles que dans l’eau (phase inférieure) et lui donnent une couleur rouge intense. Conclure.

Étude des anthracénosides des rhubarbes (POLYGONACÉES) TRAITER LES 2 RHUBARBES EN MÊME TEMPS

Les anthracénosides de la rhubarbe de Chine et du rhapontic Étant donné que la nature des PA des rhubarbes sont des mélanges de O-

hétérosides de plusieurs anthraquinones, mais aussi, de O,C-diglucosides de monomères (rhéinosides), et de dimères (sennosides), il sera plus difficile que dans la bourdaine d’avoir une réaction positive avec ces drogues.

Il est donc nécessaire d’utiliser le cas général (hydrolyse + oxydation*) de la réaction de Bornträger, selon la monographie p. 55, pour une bonne caractérisation des anthracénosides présents.

* NOTE : Cependant, il faut savoir que cette oxydation détruit en grande partie le rhaponticoside, un polyphénol fluorescent caractéristique du rhapontic, dont la présence frauduleuse n’est décelable que par l’observation de sa fluorescence.

Comme la Pharmacopée Européenne 9ème éd., préconise une recherche spécifique du rhaponticoside, il est indispensable de faire sa recherche, avant l’étape d’oxydation. Ainsi, le protocole général (p. 55), doit-il être adapté. Il se fait en 2 temps :

- Hydrolyse à observation de la fluorescence (UV 365 nm) ; - Oxydation à extraction à test de Bornträger, proprement dit.

60% de 6 et 8-O-Glucosides de

chrysophanol + aloé-émodol+ physcion + émodol

Glc O

R

OHO

O

OO OH

COOHR

Glc

GlcO OHO

HH

40% desennosides A et B + sennosides C et D

O

O

OH

R

OH

chrysophanol + émodol + aloe émodol

+ physcion

OOH OH

COOHR

OH OHO

HH[ox]

R

OH OHO

O

rhéine + aloe émodol + émodol + chrysophanol

+ physcion

Bornträger 60% dilués

R Rhydrolyse

(H2SO4)

Bornträger 100%

40%




Analyse des anthracénosides de la rhubarbe de Chine et du rhapontic : test de Bornträger adapté 1) Hydrolyse à observation de la fluorescence (UV 365 nm)

Introduire dans un 1er tube à essai : - poudre de rhizome de Rhubarbe de Chine: environ 300 mg - acide sulfurique à 10% : 4 ml

Introduire dans un 2ème tube à essai : - poudre de rhizome de Rhubarbe des jardins : environ 300 mg - acide sulfurique à 10% : 4 ml

Porter au bain-marie bouillant à 95°C pendant 3 minutes.

À CE STADE, comparer la FLUORESCENCE SOUS UV à 365 nm des deux extraits, Observation sous lumière Ultraviolette : recherche du rhaponticoside*

Les extraits sulfuriques (env. 4 ml) « Rhu » (Rhubarbe officinale) et « Rha » (Rhapontic), placés chacun dans un tube à essais sont observés en UV à 365 nm. « Rhu » (tube contenant la rhubarbe de Chine) ne doit pas avoir de fluorescence bleue mais une couleur jaune-verte (anthraquinones).

« Rha » (tube contenant le rhapontic) présente une fluorescence bleue « sombre » (rhaponticoside). Conclure sur la possible falsification du lot de Rhubarbe de Chine étudié, par le rhapontic.

2) Oxydation à extraction des anthraquinones

Réaliser ensuite l’étape d’oxydation*, ajouter à vos 2 tubes : - eau oxygénée (H2O2) à 30 vol. : 1 ml

Porter au bain-marie bouillant (à 95°C) pendant 8 minutes. Filtrer à chaud sur papier-filtre dans un tube à essais rodé (À CHAUD !).

Laisser refroidir le filtrat. Ajouter un égal volume d’éther (4 ml environ). Travailler sous la hotte. Agiter par retournement du tube fermé par un bouchon rodé, DOUCEMENT, pour ne pas former d’émulsions.

Décanter l’éther (phase supérieure) et le prélever à l’aide d’une pipette Pasteur SÈCHE. Le répartir en 2 parties égales :

- une première portion dans 1 tube à essais (test de BORNTRÄGER) et - une deuxième portion dans un tube à hémolyse SEC (pour réaliser la CCM) :

Comparaison des extraits des 2

rhubarbes par fluorescence à 365 nm

Rhu Rha




soit, 4 tubes au total pour les 2 rhubarbes (2 tubes à essais + 2 tubes à hémoiyse). Répéter l’opération autant que nécessaire, afin de bien extraire les anthraquinones : elles colorent en jaune citron la phase éthérée.

2 suite à test de Bornträger, proprement dit

Aux deux tubes à essais ( !!! ), contenant les extraits éthérés de rhubarbe de chine (« Rhu ») et de rhubarbe des jardins (« Rha »), ajouter un égal volume de lessive de NaOH à 50 g/l. Agiter énergiquement.

La phase aqueuse (inférieure) se colore en rouge pourpre (dianions de diverses anthraquinones), la phase organique, initialement colorée en jaune citron (anthraquinones), se décolore totalement. Sous forme de sels (dianions), les anthraquinones, polaires, ne sont plus solubles que dans l’eau et deviennent rouges (voir p. 32).

Conclure en comparant les résultats des deux extraits.

Comparaison des aglucones anthraquinoniques des 2 rhubarbes en CCM

Préparation de la CCM

Les deux tubes à hémolyse contenant la deuxième portion d’éther de chacune des 2 rhubarbes sont utilisés pour comparer leur composition en anthracénosides par CCM. À chacun d’eux, ajouter un peu de Na2SO4, (le moins possible : une pointe de spatule !) : q.s. pour sécher vos extraits, uniquement si nécessaire. Support : Silice sur film aluminium - 3 pistes Déposer : 1°) 40 fois* l’extrait « Rhubarbe de chine » 2°) 40 fois* l’extrait « Rhapontic » 3°) 2 fois le témoin pour chromatographie des anthraquinones (mélange

d’émodol, aloé-émodol, chrysophanol et rhéine). * oui, 40 fois !

NaOH




ATTENTION : 2 migrations sur 3,75 et 7,5 cm dans 2 solvants différents : Développer une première fois jusqu’à la moitié de la plaque CCM, avec l’ÉLUANT n°1 :

acétate d'éthyle - méthanol - eau (7,7/1,3/1 ; v/v/v) Bien le mélanger. Dans une cuve à chromatographier, placer 10 ml de ce solvant. Laisser les vapeurs saturer la cuve (10 min, env.). Placer la plaque CCM et développer le chromatogramme. Lorsque le front du solvant a atteint la ligne intermédiaire, à mi-chemin du parcours total, retirer le chromatogramme de la cuve.

Évaporation totale du solvant : sécher la plaque au sèche-cheveux.

Développer une deuxième fois jusqu’à 1cm du haut de la plaque CCM, avec l’ÉLUANT n°2 : toluène - formiate d’éthyle - acide formique (7,5/2,4/0,1 ; v/v/v) Note : 2 gouttes de pipette Pasteur = ± 0,1 ml d’ac. formique. Dans une cuve à chromatographier, placer 10 ml de ce solvant. Bien le mélanger. Laisser les vapeurs saturer la cuve à chromatographier. Placer la CCM complètement sèche (plus de solvant de la première migration), et développer. Lorsque le front du solvant a atteint la ligne supérieure retirer le chromatogramme. Évaporer le solvant de migration au sèche-cheveux (sous la hotte). Révélation du chromatogramme :

- Sans aucune révélation les taches d’anthraquinones sont colorées en jaune.

- Révéler à 365 nm et entourer en pointillé les taches visibles (fluorescentes).

- Observer également à 254 nm et entourer (trait plein) les taches visibles.

- Révéler ensuite le chromatogramme en tamponnant avec un coton imbibé de potasse éthanolique (réactif de BORNTRÄGER).

Chromatogramme des aglucones

anthraquinoniques des 2 rhubarbes (sans révélateur)

TémoinExtraits

Rhu

Rha

2èm

e m

igra

tion

avec

sol

vant

n°

2

Tém

.

TémoinExtraits

Rhu

Rha

avec

sol

vant

n° 1

Tém

.

STOP

1ère m

igra

tion




sous UV à 365 nm réactif de Bornträger

Caractériser les taches fournies par les 2 rhubarbes en comparant leur RF et leur couleur à ceux du témoin.

Noter par des croix leurs importances relatives selon la rhubarbe. Conclure sur les différences entre les deux rhubarbes étudiées, grâce aux trois tests effectués.

Rhu

Rha

Tém

.

Rhu

Rha

Tém

.

rhéine

aloé-émodol

émodol

chrysophanol


Extraction et purification par CHROMATOGRAPHIE (TP n°5)


TP5 : Chromatographie sur Plaque Préparative (purification du Rutoside)

Rappels sur la CHROMATOGRAPHIE

La chromatographie est une technique de séparation au cours de laquelle les composés sont distribués, en fonction de leur affinité, entre deux phases : l’une stationnaire (solide ou liquide) et l’autre mobile (liquide, essentiellement). Il s’agit de la technique de choix, pour la purification de substances naturelles. Différents types d’interaction existent entre la substance à enrichir et le système chromatographique choisi. En fonction de ces interactions, on parlera de : chromatographie d’adsorption, chromatographie de partition, chromatographie d’échange d’ions, chromatographie d’exclusion, chromatographie d’affinité…

La Chromatographie sur Plaque Préparative (CPP) La Chromatographie sur Plaque Préparative est une chromatographie d’adsorption. Une phase stationnaire solide, constituée d’un matériau approprié, est répandue en couche d’épaisseur variable et uniforme sur un support (plaque) le plus souvent en verre. Des plaques préparatives « préfabriquées » sont disponibles dans le commerce, il est également possible de les fabriquer, ce que vous ferez lors de vos TP. Des solutions d’analytes sont alors déposées sur la plaque. La séparation s’effectue par développement du chromatogramme et la migration de solutés, les analytes mis en solution, en fonction de leur polarité, dans un solvant ou un mélange de solvants appropriés (phase mobile) à travers la couche de support solide (phase stationnaire). On parle aussi de chromatographie liquide/solide. Il s’agit de l’une des méthodes de purification les plus anciennement utilisées.

AVANTAGES : Technique peu coûteuse, rapide à mettre en œuvre et permettant l’utilisation d’une large gamme de support solide (silice, alumine, cellulose, amberlite, …) et de solvants (des plus polaires aux plus apolaires)

INCONVENIENTS : Dépôt de l’échantillon et/ou récupération du produit purifié parfois délicats, purification de quantités de produits relativement faibles (quelques mg seulement), avec des résolutions parfois médiocres. Déroulement de la séance de TP : 1. Préparation de la phase mobile et saturation de la cuve ; 2. Dépôt sur la plaque de silice et développement de celle-ci ; 3. Pendant le développement de la plaque chromatographique, préparation de

nouvelles plaques qui seront utilisées par les groupes suivants p. 50 ; 4. Récolte de la bande d’intérêt une fois la migration achevée ; 5. Désorption du rutoside ;




6. Evaluation de l’efficacité de la purification par plaque préparative.

Afin d’illustrer cette technique de purification, vous allez : - Préparer une plaque chromatographique préparative, support de votre

chromatographie ;

- Recevoir un extrait de boutons floraux de Sophora (Sophora japonica L., Fabacées), riche en flavonoïdes, à ûrifier

- Procéder au dépôt de l’extrait sur la plaque et à sa migration, puis à la récolte de la bande correspondant au produit d’intérêt (le rutoside) pour enfin le désorber de la phase stationnaire ;

- Évaluer le degré de pureté du composé obtenu.

APPAREILLAGE : Plaques chromatographiques préparative : préparation Préparer le dispositif, « étaleur de plaque, plaques de verre » (1 plaque par binôme) de telle sorte qu’il soit possible de procéder à l’étalement directement après la préparation du support solide. Préparer ensuite un mélange homogène (= une pâte sans grumeau) à partir d’environ 50 g de silice GF 254 (silice renfermant un indicateur de fluorescence à 254 nm et du plâtre) et 100 ml d’eau distillée : 1g de silice / 2ml d’eau. Parce qu’il est important de travailler sous la hotte, vous procéderez comme suit : sous une hotte efficace, dans un bocal préalablement taré, placer environ 10 cuillères à soupe de silice. Le bocal refermé, évaluer la quantité de silice présente. En fonction de votre pesée, additionner la quantité suffisante et nécessaire d’eau. Refermer le bocal et homogénéiser la mixture. Il est possible que vous soyez obligés d’additionner un peu d’eau au mélange, afin d’arriver à la bonne consistance (type pâte à crêpes épaisse). Le mélange préparé est placé rapidement (avant qu’il ne sèche) dans l’étaleur de plaques puis étalé immédiatement après.

sens de progression

des plaquesplaque 2plaque 1

Zone de dépôt du mélange

HO O OH

OH

HO

OOO

HOOH

OH

OOHO

HO OHrutoside




La plaque de verre, une fois garnie de support solide, est placée sur la paillasse puis tapotée (plaque légèrement soulevée, 0.5 cm environ, puis relâchée sur la surface plane) ceci afin de s’assurer de la répartition homogène du support, mais également afin de faire remonter les éventuelles bulles d’air en surface.

Les plaques seront placées ultérieurement à sécher environ 24h dans une étude à 90°C (activation).

NB : préconditionnement des plaques. Il peut être nécessaire de laver les plaques avant la séparation. Cette opération peut être effectuée par migration d’un solvant approprié. Les plaques peuvent aussi être imprégnées par des procédés tels que le développement, l’immersion ou la pulvérisation. Juste avant leur utilisation, les plaques peuvent être activées si nécessaire, par chauffage à l’étude à 100-105°C pendant 1 heure. . Cuve à chromatographie :

La cuve à chromatographie peut être à fond plat ou à double bac (notre cas ici en TP), en matière transparente et inerte, de dimensions appropriées aux plaques utilisées et munie d’un couvercle assurant une fermeture étanche (surfaces rodées en vis à vis).

Micropipette, microseringue, capillaires calibrés ou jetables ou tout autre dispositif d’application adapté au dépôt correct des solutions : vous aurez à votre disposition des pipettes Pasteur. Un dispositif de visualisation des composés : il peut s’agir d’un dispositif de détection de fluorescence permettant d’observer la fluorescence directe (l365 nm) ou les taches sombres (inhibition de fluorescence à l254 nm, si la phase stationnaire renferme un indicateur de fluorescence) ou de réactifs de visualisation permettant de détecter les taches séparées, par pulvérisation, exposition aux vapeurs ou immersion, de tout ou partie de la plaque de chromatographie. En TP, le produit d’intérêt s’observe à la lumière visible, aucun dispositif n’est donc nécessaire à la délimitation de la bande d’intérêt. MODE OPERATOIRE :

Il est important de commencer le TP par la « saturation » de la cuve à chromatographier (par les vapeurs du solvant d’élution = phase mobile). Pour faciliter cette saturation, il est possible de tapisser les parois de la cuve avec du papier filtre, avant d’y verser une quantité de phase mobile suffisante par rapport au volume de la cuve pour obtenir après imprégnation du papier filtre, une hauteur de liquide adaptée aux dimensions de la plaque. Placer ensuite le couvercle et laisser « saturer » à 20-25°C pendant 1h.

Pour une question de temps, en TP, nous nous limiterons à une saturation simple, sans papier filtre, le temps nécessaire à la préparation de l’extrait et son dépôt sur la plaque chromatographique.

Préparation de la phase mobile : Dans un erlen propre et sec de 250 ml, préparer 50 ml du mélange suivant : eau, acide formique, acétate d'éthyle dans des proportions 1/1/8 ; v/v/v. Placer ce solvant d’élution homogénéisé (!) dans la cuve à chromatographier, et la fermer hermétiquement pour la laisser se saturer.

La solution d’extrait à purifier vous est distribuée en séance :




Protocole à titre indicatif : Chauffer à ébullition 2 g de boutons floraux pulvérisés dans 15 ml d'éthanol à 70%, pendant 2 min. Filtrer sur papier directement dans un ballon à col rodé propre et sec de 100 ml. Évaporer à siccité sous pression réduite (rotavapor), puis reprendre le résidu avec 1 ml de méthanol. Il sera nécessaire de placer le ballon à chaud (bain marie à 70°C), voire même de « soniquer » (cuve à ultrasons), pour faciliter la solubilisation du résidu.

À l’aide du guide et d’une pipette Pasteur, déposer 1 ml de cette solution à environ 3 cm du bord inférieur (seconde encoche du guide) et environ 1,5 cm des côtés de la plaque préparative. Réservez la place (env. 1cm) pour déposer également le témoin de rutoside

dépôt de la solution avec l’aide du guide développement du chromatogramme Procéder par portions suffisamment petites pour obtenir une bande la moins large possible. Il est probable que vous soyez amené à déposer plusieurs fois sur la même bande, auquel cas, il faut sécher (au sèche cheveux) entre chaque application. Placer la plaque à développer pendant 45 à 50 mn (moitié de plaque, environ !). Il est possible d’avoir à effectuer une double migration de la plaque afin d’optimiser la résolution des bandes. Pour une question de temps, nous nous limiterons en TP à une seule migration.

Sécher la plaque et récolter la bande d’intérêt par « grattage » au moyen d’une spatule, en ayant pris soin de placer sous la plaque, une feuille d’aluminium qui servira à récolter la silice grattée.




Désorption du composé d’intérêt :

Placez la silice « grattée » (sur laquelle est adsorbée l’analyte), dans un erlen de 100 ml, additionnez 20 ml d’acétate d’éthyle, puis « soniquer » en plaçant l’erlen dans la cuve à ultrasons. Filtrez sous vide sur verre fritté, porosité 4. Le filtrat recueilli est concentré à sec dans un ballon à col rodé de 100 ml préalablement taré. Il se forme une laque sur la paroi du ballon. Il s’agit de votre rutine purifiée.

Évaluation de l’efficacité de la purification:

CCM : 3 gouttes de méthanol sont additionnées à l’extrait sec, pour sa mise en solution. L’extrait obtenu sera utilisé tel que, pour la vérification par CCM, du degré de pureté du rutoside. Déposer également le témoin de Rutoside sur la CCM. Sur une plaque de silice, vous effectuerez 3 dépôts : l’extrait de départ avant purification sur plaque, le rutoside, l’extrait purifié. La migration de la plaque s’effectuera dans les mêmes conditions que celles de la plaque préparative : eau, acide formique, acétate d'éthyle dans des proportions (1/1/8 ; v/v/v). (vous pouvez utiliser la même cuve en prenant soin de vous assurer qu’il ne reste pas trop de solvant). Examinez la CCM sous la lampe UV à 254 et 365 nm. Entourez les taches visibles. Révélez ensuite en tamponnant la plaque d’anisaldéhyde puis chauffez la plaque au « Heat Gun ».


Extraction et purification par CHROMATOGRAPHIE de SAM (TP n°6)


TP6 : Chromatographie en Phase Inverse sous Moyenne Pression (purification de l’épigallocatéchine-3O-gallate (EGCG)) Cf : Rappels sur la CHROMATOGRAPHIE : voir chapitre précédent p. 40

La Chromatographie en phase inverse sous moyenne pression

La Chromatographie en phase inverse sous moyenne pression est une chromatographie d’adsorption. Une phase stationnaire, constituée d’un matériau greffé est placée dans une colonne, de verre le plus souvent, adaptée à un travail sous moyenne pression. La difficulté ici, réside dans la préparation et le remplissage de la colonne qui doit être correctement effectué, de façon homogène afin de limiter au maximum les passages préférentiels. Pour contourner la difficulté, il est également possible d’acheter des cartouches « pré-paquées » qui, comme leur nom l’indique, sont directement prêtes à l’emploi. Lors de vos séances de TP, vous utiliserez ces fameuses cartouches pré-paquées garnies de silice C-18 (Merck LiChrolut RP-18 ; 40-63mm ; 500mg / 3ml) NB : une phase inverse est une phase normale sur laquelle des chaînes alkyles (ou autres selon la polarité recherchée) ont été greffées au niveau des groupes silanols (Si-OH). En général, la phase stationnaire est majoritairement composée de petites particules de silice sur lesquelles sont greffées des fonctions chimiques, le plus souvent de chaînes alkyles à 8 (C-8) ou 18 (C-18) atomes de carbones. Selon le taux de greffage, la résolution du support est plus ou moins grande. Cette phase est dite "inverse" car de polaire et hydrophile (sans les "greffes"), la phase devient apolaire et hydrophobe. Après avoir correctement lavé le support solide, les solutions d’analytes sont déposées au sommet de la « colonne » à chromatographier. La séparation s’effectue par migration (développement) de solutés (solutions d’analytes) dans un solvant ou un mélange de solvants appropriés (phase mobile) à travers la couche de support solide (phase stationnaire). On parle là aussi de chromatographie liquide/solide. AVANTAGES :

Technique relativement peu coûteuse, rapide à mettre en œuvre. Elle peut venir se placer en amont d’une purification par CLHP préparative. De plus, la technique, parce qu’en phase inverse, permet la régénération de la phase stationnaire et donc sa réutilisation. INCONVENIENTS :

Dépôt de l’échantillon parfois délicat, purification de quantités de produits relativement faibles (quelques mg seulement), avec des résolutions moins bonnes que celles que l’on pourrait obtenir par CLHP préparative. La technique, parce qu’en phase inverse, se limite à la purification de produits polaires. Déroulement de la séance de TP :

1. Conditionnement de la cartouche 2. Dépôt de l’extrait brut au somment de la phase stationnaire; 3. Elution sous vide modéré par une phase mobile de polarité décroissante ; 4. Constitution des blocs ; 5. Evaluation du degré de pureté de l’EGCG enrichi par CCM

Afin d’illustrer cette technique de purification, vous devez:




- Pré-conditionner la cartouche de silice greffée, support de votre chromatographie ;

- Préparer un extrait enrichi en polyphénols à partir de feuilles de thé vert (Camellia sinensis (L) Kuntze, Théacées) ; (en fait, en TP, vous le recevrez)

- Procéder au dépôt de l’extrait au sommet de la cartouche et à son élution par un mélange de solvants adapté. ;

- Après contrôle du profil chromatographique par CCM, vous formerez des blocs enrichis en composés et notamment un bloc renfermant majoritairement le produit d’intérêt : EGCG.

- Evaluer le degré de pureté du composé isolé.

Camellia sinensis (L) Kuntze, Théacées La partie utilisée du thé vert est constituée par la feuille, jeune et sèche, de Camellia sinensis (L.) Kuntze (C. thea Link) et de ses variétés cultivées. Le thé vert contient au minimum 2% de caféine, calculé par rapport à la drogue desséchée. CARACTERES Le thé vert est une feuille vert foncé, son odeur est aromatique, sa saveur est astringente. Le thé vert se présente sous forme de fragments irréguliers, plus ou moins enroulés. La feuille est ovale, allongée, acuminée. À partir du quart inférieur, elle présente, sur ses bords, des dents d’une forme particulière composées d’une sorte de coussinet portant une pointe de petite taille, noirâtre, recourbée en forme de griffe. De la nervure médiane se détachent des nervures secondaires qui, à une faible distance des bords du limbe, se recourbent pour s’anastomoser en arc. Des poils tecteurs, coniques et flexueux, sont abondants à la face inférieure des feuilles. Examinée au microscope, dans une solution de KOH, le thé vert pulvérisé présente des fragments de limbe comportant l’épiderme supérieur non stomatifère, le parenchyme chlorophyllien palissadique et le parenchyme lacuneux dans lequel sont incluses de grosses sclérites, jaune vif, ramifiées et des macles d’oxalate de calcium. L’épiderme inférieur comporte des stomates entourés de 3 ou 4 cellules annexes, des poils tecteurs, unicellulaires, flexueux, à l’extrémité conique et à parois épaissies. Lors de ce TP nous ne mettrons pas à profit la richesse de cette drogue végétale en caféine, mais en tanins condensés et notamment en épigallocatéchine-3O-gallate (EGCG). L’extrait vous sera fourni par l’enseignant : Protocole à titre informatif : L’extraction par macération à chaud est réalisée comme suit : 15 g de poudre est placé dans un Erlen, auquel est additionné 600 ml de solvants, eau/méthanol (50 : 50, v/v) pour une macération à chaud de 15 min au bain-marie à 40°C. Après avoir subit une filtration sur coton directement dans un ballon à col rodé de 2 L ml, les extraits sont concentrés à sec, sous pression réduite (rotavapor), afin d’éliminer le maximum d’alcool. L’extrait majoritairement aqueux est alors placé dans une ampoule à décanter de 500 ml et extrait successivement par 2 fois 200 ml d’acétate d’éthyle. Les extraits organiques sont alors séchés sur Na2SO4, filtrés puis concentrés à sec sous pression réduite. Le résidu obtenu est repris

O

O

HO

OH

OHOH

OH

O

OHOH

OH

EGCG




dans un minimum d’eau distillée, puis filtrer sur coton/pipette pasteur (environ 15 ml – pour 8 groupes). Il s’agit de votre extrait brut. Il est important d’en garder une quantité minimale, afin de pouvoir le déposer en CCM en regard du témoin, des diverses fractions obtenues… Préparation du système chromatographique :

1. Conditionnement de la cartouche : Ce conditionnement a pour objectif de laver la phase stationnaire imprégnée d’agents conservateurs. Après avoir placé sous vide modéré le système (-20 kPa / -5 inHg, robinet ouvert lorsque la pompe à vide est suffisamment efficace), afin de permettre un écoulement

au goutte à goutte, faites traverser la phase stationnaire par 2 volumes d’eau distillée (1 volume correspondant à la capacité de remplissage complet de la cartouche soit 3 ml), 2 volumes de MeOH, puis à nouveau 2 volumes d’eau distillée. La cartouche est prête à l’emploi. Tout au long de la manipulation, Il est important de ne JAMAIS porter à sec la cartouche de silice. NB : pour qu’il y ait élution, penser à ouvrir l’embout et seulement celui-ci, portant la cartouche, en tournant (sens inverse des aiguilles d’une montre).

2. Dépôt de l’extrait :

déposez en 110 µl, au sommet de la cartouche, à l’aide du pipetman de 1 ml. L’idéal est de procéder à ce dépôt sans application de vide, ie en laissant l’extrait imprégner le support solide « à son rythme » : environ 3 min « d’imprégnation » (A réaliser avec l’enseignant).

3. Elution des composés : L’élution séquentielle, sous vide modéré, des divers composés présents dans l’extrait, est rendu possible grâce à la mise en place d’un gradient d’élution. Pour se faire, la phase mobile polaire de départ est progressivement incrémentée d’un solvant de polarité moindre. Nous avons choisi de travailler avec une phase mobile eau/méthanol. La purification doit être lente pour être efficace.




Le gradient suivant vous est proposé :

3 ml d’eau distillée 100% 2 x 3ml du mélange 1 (eau/MeOH 95:5) 3 x 3ml du mélange 2 (eau/MeOH 90:10) 1 x 3ml du mélange 3 (eau/MeOH 80:20) 1 x 3ml du mélange 4 (eau/MeOH 50:50) 2 x 3ml de MeOH 100%

4. Réalisation de la CCM – Recherche de la fraction pure

Déposer sur la CCM les 8 premières fractions obtenues (4 dépôts par tube, 0,5 cm d’écart entre chaque spot, sécher au « heat gun » entre chaque dépôt pour évaporer l’eau), ainsi que le brut de votre extrait et le témoin d’EGCG pur.

Contrôle chromatographique : Chromatographie sur Couche Mince (CCM), éluée par un mélange de CH2Cl2/MeOH/AcOH (8/2/0,3 ; v/v/v). Observation sous UV (254 et 365nm) puis révélation à l’anisaldéhyde (anisaldéhyde tamponné au coton, puis plaque chauffée au décapeur thermique). En fonction du profil chromatographique, sélectionner la (ou les) fraction(s) contenant l’EGCG pur. La donner à l’enseignant pour évaporer le solvant au Speedvac®. Compte Rendu : Expliquer le principe de votre purification et analyser votre CCM. Conclure sur votre purification : a-t-elle fonctionné ? Est-elle efficace ?


Annexe : tests d’identification rapide des diverses SAM Alcaloïdiques (résumé)


Annexe sur les SAM alcaloïdiques

Mise en évidence rapide de drogues à alcaloïdes Pour faire les tests d’identification rapide des drogues à alcaloïdes, on peut préparer un extrait selon le procédé qui met en œuvre une extraction par l’eau sulfurique, directement sur la drogue :

Dans un tube à essais de 16 ml, - Introduire : • poudre végétale : 200 mg environ • dilution d'acide sulfurique à 10% : 10 ml environ

Agiter pendant 2 minutes. Filtrer sur papier filtre : "solution aqueuse acide d’AT" = filtrat. Partager le filtrat entre 4 tubes (16 ml)* :

• Dans le 1° tube, ajouter quelques gouttes de réactif de BOUCHARDAT, • Dans le 2° tube, ajouter quelques gouttes de réactif de MAYER, • Dans le 3° tube, ajouter quelques gouttes de réactif de DRAGENDORFF.

Observer les précipités caractéristiques :

* Le dernier tube servira, tel quel, pour le test de la fluorescence : positif dans le cas des alcaloïdes du Quinquina, par exemple, p. 13.

Bouc

hard

at

May

er

Drag

endo

rff


Annexe : tests d’identification rapide des diverses SAM Polyphénoliques (résumé)


Annexe sur les SAM polyphénoliques

Les dimères « procyanidoliques » (les 8 exemples possibles) :

Procyanidines dimères à liaison C4-C8 issues de la (+)-catéchine et la (-)-épicatéchine

Procyanidines dimères à liaison C4-C6 issues de la (+)-catéchine et la (-)-épicatéchine

Identification rapide de drogues à polyphénols méthode générale de détection des polyphénols (réaction au FeCl3) Pour mettre en évidence rapidement des polyphénols dans une drogue, procéder de la manière suivante :

Préparer un extrait polyphénolique : - Dans un tube à essais de 16 ml, introduire 200 mg environ de poudre végétale. - Ajouter un mélange d'eau distillée 2 ml et d’acétone 6 ml. - Placer au bain marie (60°C max), pendant 5 min environ, en agitant de temps en temps. Éviter une trop forte évaporation de l’acétone. - Filtrer sur papier filtre. - Recueillir le filtrat dans un tube à essais de 16 ml. Au filtrat, ajouter 1 ou 2 gouttes de perchlorure ferrique (FeCl3) à 10%. Observer le précipité noir-vert intense.

O

OH

O

OH

HO

OHHO

OH

OH

OH

OH

O

OH

O

OH

HO

OHHO

OH

OH

OH

OH

O

OH

O

OH

HO

OHHO

OH

OH

OH

OH

O

OH

O

OH

HO

OHHO

OH

OH

OH

OH

B1

E

B2 B3 B4

B

A C

D F

OH OH OH OH

48

O OH

OH

OHOH

HO

O

OH

HO

OHHO

OHO OH

OH

OH

OH

HO

O

OH

HO

OHOH

OH O OH

OH

OHOH

HOO

OH

HO

OHOH

OHO OH

OH

OHOH

HOO

HO

HO

OHOH

OH46

B5 B6 B7 B8


Annexe : tests d’identification rapide des diverses SAM Polyphénoliques (résumé)


Confirmation rapide de la nature "PROCYANIDOLIQUE" (tanins condensés) de polyphénols : réaction de Bate-Smith

Pour une mise en évidence rapide de tanins condensés dans une poudre de plante inconnue, il est possible d’opérer comme suit : - Dans un tube à essais de 16 ml, introduire :

• poudre végétale : 100 à 200 mg • réactif au butanol chlorhydrique : 3 à 4 ml

- Porter au bain-marie "bouillant" (90°C min.), pendant 5-10 minutes. Il se développe une intense coloration rouge caractéristique du cyanidol (voir schéma réactionnel p. 17), favorisée par agitation (oxydation à l’air).

Confirmation rapide de la nature "FLAVONOÏDIQUE" de polyphénols : réaction de la "cyanidine »

Pour caractériser rapidement des polyphénols de type flavonoïdique dans une drogue inconnue, procéder de la manière suivante : A - PRÉPARATION D’UN EXTRAIT ALCOOLIQUE (FILTRAT : ALCOOLAT) Dans un tube à essais de 16 ml, introduire : Poudre de drogue à analyser : 300 mg environ Éthanol : 5 ml environ - Porter au bain-marie à 65°C, pendant 10 minutes. - Filtrer à chaud l’alcoolat sur papier-filtre plissé dans 1 tube à essais de 16 ml. B – REACTION DE LA "CYANIDINE" : Dans le tube à essais où se trouve le filtrat alcoolique, ajouter :

- eau distillée : 1 ml - acide chlorhydrique concentré 1 ml - rognure de magnésium 1

Tenir le tube avec une pince en bois, plongé dans un bécher (250 ml) rempli d’eau froide, afin d’éviter l’élévation de température. La coloration qui se développe lentement, est caractéristique du flavonoïde majoritaire, selon le tableau ci-dessous :

quand la réaction s’emballe !

Mg° + HCl ® hydrogène naissant, réducteur à • Rouge cerise : flavonols • Orange : flavones • Rouge violacé : flavanones Avec les chalcones : négatif

+ H+

+ Mg°

réaction non

contrôlée


Annexe : tests d’identification rapide des diverses SAM Saponosidiques (résumé)


Annexe sur les SAM saponosidiques

Les saponosides sont des hétérosides dont la génine, lipophile, porte plusieurs résidus sucrés), en nombre parfois important, et dont certains sont des acides uroniques à polaires = hydrophiles.

La mise en évidence des saponosides dans une drogue végétale, est basée sur l’observation de leur pouvoir aphrogène, c'est-à-dire la possibilité qu’ont leurs solutions aqueuses de mousser par agitation.

Mise en évidence rapide de SAPONOSIDES dans les drogues Pour identifier rapidement une drogue à saponosides, il suffit de mettre en évidence leur pouvoir aphrogène en observant la mousse très fine qui se forme après une simple agitation énergique (pendant 15 secondes) de cette poudre en présence d’eau sulfurique à 10% (voir conditions de recherche des alcaloïdes, p. 49) et sa persistance au moins 10 min.

Confirmation de la RICHESSE EN SAPONOSIDES :

mesure de « l’indice de mousse » Afin de garantir que la drogue est conforme (qu’elle n’a pas déjà fait l’objet d’une extraction), la teneur en saponosides doit être évaluée par la mesure de "l’INDICE DE MOUSSE" à partir d’un extrait, selon le procédé décrit pour la poudre de polygala, p. 28, par exemple.

OH

O

OH

OHO

O

O

OOCOOH

OOH

OOHO

HOOH

OH

O

HOOH

OH

HO

escine

tiglateacétate

OOH

ginsénoside Rb-1

OOCH2OH

HOOH

OOCH2OH

HOOH

OH

O

HOOH

HO

OOCH2OH

HOOH

OH


Annexe : tests d’identification rapide des diverses SAM anthracénosidiques (résumé)


Annexe sur les SAM anthracénosidiques

BOURDAINE, Frangula alnus Miller ou Rhamnus frangula L., RHAMNACÉES.

La bourdaine est un arbuste, voir un petit arbre de 5 à 6 m de haut, non épineux, à feuilles alternes, entières, elliptiques, triangulaires au sommet, à nervures secondaires parallèles et incurvées au bord du limbe. Les fleurs, petites, disposées en cymes axillaires à l’aisselle des feuilles, sont peu apparentes, d’un blanc rosé. Les fruits sont des drupes rouges puis noires à maturité.

La drogue (Ph. Eur., 9ème Éd., 04/2011:0025), récoltée au moment de la floraison, est constituée par l’écorce desséchée de la tige et des branches qui se présente sous forme de fragments cintrés, presque plats ou enroulés, minces (0,5 à 2 mm d’épaisseur) et de longueur et largeur variable. La surface externe, d’un brun-gris ou brun foncé, est ridée longitudinalement et recouverte de nombreuses lenticelles grisâtres, étirées transversalement. La face interne, d’un brun orangé à brun-rouge, est lisse et striée finement en longueur ; elle se colore en rouge par addition d’alcalis. La cassure est courte, mais fibreuse au niveau de la face interne.

Ne doit être utilisée qu’après un an de stockage, au moins (à oxydation des frangularosides et glucofrangularosides).

Les anthracénosides de la Bourdaine (drogue sèche, 3 à 8%) : des monomères : glucofrangulosides anthraquinones (majoritaires)

des dimères : homodianthrones hétérodianthrones

Les glucofrangulosides et les hétérosides dianthroniques se forment par oxydation chimique ou enzymatique au cours du stockage prolongé ou par vieillissement accéléré (traitement thermique). Les glucofrangulines peuvent aussi être partiellement décomposées en frangulines, en 8-O-glucoside d’émodol, voire en émodol. La drogue renferme également des quantités moins importantes de physcion et chrysophanol sous formes libre et monoglucosylée.

O O OH

OCH3

R

Rha-O Api-O

OR

CH3O

OHO

R= Glc : glucofranguloside A glucofranguloside BR= H : franguloside A franguloside B

HO

OR-O OH

CH3CH3

OHR-O O

HHH H

OR-O OH

CH3CH3

OHR-O O

HOHO PALMIDINES

émodol

chrysophanolémodol

émodol

O O OH

CH3

R

Api-ORha-O

OR

CH3

OHO

R= Glc : glucofrangularoside A glucofrangularoside BR= H : frangularoside A frangularoside B




• la Rhubarbe de Chine (officinale), Rheum palmatum L., POLYGONACÉES, La rhubarbe officinale ou Rhubarbe de Chine (Rheum officinale Baillon ou Rheum palmatum L., POLYGONACÉES) est une plante herbacée, vivace par un rhizome volumineux pouvant atteindre jusqu’à 2 m de « diamètre ». Les feuilles possèdent de longs pétioles charnus et un limbe large plus ou moins palmatilobé, parcouru à la face inférieure, par des nervures saillantes, rougeâtres. Dans le bourgeon, les jeunes feuilles sont protégées par une gaine foliacée blanchâtre (l’ochréa), qui se déchire au printemps. Les petites fleurs, de type 6, blanches à rouge pourpre, sont disposées en large panicule. La drogue (Ph. Eur., 9ème Éd., 01/2008:0257, corrigé 6.0) est constituée par les organes souterrains entiers ou coupés, séchés de Rheum palmatum L. ou de Rheum officinale Baillon ou de leurs hybrides. Les anthracénosides de la Rhubarbe de Chine drogue sèche : Le rhizome renferme 8 à 10% de PA : glucosides d’anthraquinones (3/4) + hétérodianthrones (1/4). Les constituants majoritaires (60-80%) sont des O-hétérosides d’anthraquinones : glucosides de l’émodol, du physcion, de l’aloé-émodol, du chrysophanol.

Ils sont accompagnés de O,C-diglucosides de monomères (rhéinosides A-B et C-D) et dimères (sennosides A-D, en particulier). La teneur en formes oxydées est maximale l’été et presque nulle l’hiver.

Pour être conforme, la drogue (les organes souterrains entiers ou coupés, séchés de Rheum palmatum L. ou de Rheum officinale Baillon ou des hybrides des deux espèces ou d’un mélange) doit contenir au minimum 2,2% en poids de dérivés hydroxyanthracéniques, exprimés en rhéine, calculé par rapport à la drogue desséchée.

• la rhubarbe des jardins = le Rhapontic, Rheum rhaponticum L., R. rhabarbarum L., R x hydridum Murray (R. cultorum), POLYGONACÉES. Le rhapontic, ou rhubarbe des jardins, utilisée à des fins ornementales et pour ses pétioles comestibles, est considéré comme étant une falsification de la rhubarbe de Chine. Le rhapontic n’est guère utilisé qu’en pharmacie vétérinaire (bien que classé officiellement dans la catégorie des laxatifs stimulants ; Note explicative, 1998).

La distinction entre la rhubarbe et le rhapontic par examen macroscopique et microscopique est malaisée. Ainsi, toute falsification de la drogue rhubarbe par du rhapontic se fondera sur une évaluation de la composition chimique de l’extrait de poudre de plante à évaluer.

En effet, le rhapontic, outre le fait qu’il renferme, bien qu’en quantité moindre, des dérivés anthracéniques, présente des quantités plus importantes de dérivés stilbénoïques, en particulier le rhaponticoside ou rhaponticide, un composé fluorescent, pratiquement absent chez les rhubarbes officinales. Il est cependant à noter que la seule observation en CCM pour comparer les différentes espèces, reste délicate. En effet, la racine de rhubarbe officinale renferme aussi quelques dérivés stilbéniques susceptibles de laisser apparaître une faible fluorescence. Aussi, la Pharmacopée Européenne 9ème édition, préconise-t-elle une recherche spécifique du rhaponticoside.

O

OR O

CH3

OH

chrysophanolO

OR O

CH2OH

OH

aloe-émodolO

OR

HO

O

CH3

OH

émodolO

OR

H3CO

O

CH3

OH

physcion

O O

COOH

OH

rhéinosides

HO

OH

OH

OH

O

HO

OH

OH

OH

O

rhéine

sennosides C et D

aloé-émodol

GlcO

GlcO O OH

COOHCH2OH

OHO

H H

rhéine

sennosides A et B

rhéine

OO OH

COOHCOOH

Glc

GlcO OHO

HH

OH

O-Glc

OHH3CO rhaponticoside




Identification rapide de drogues à anthracénosides (réaction de Bornträger) L’identification rapide des drogues à anthracénosides, nécessite la préparation d'un extrait sur lequel une réaction de BORNTRÄGER peut être pratiquée directement, selon le procédé suivant : Dans un tube à essais de 16 ml, introduire :

• poudre de la drogue : 200 mg environ • acide sulfurique à 10% : 5 ml environ

Porter au bain-marie bouillant à 95°C pendant 3 minutes. À CE STADE, UTILISER ce tube, pour le CONTRÔLE DE FLUORESCENCE SOUS UV (voir p. 36), pour détecter une éventuelle falsification par du RHAPONTIC.

Ensuite, il existe plusieurs variantes. Selon la nature des anthracénosides majoritaires, il est ou non nécessaire de procéder, en plus de l’hydrolyse, à une oxydation. Dans le cas général, sur une drogue inconnue, on ajoute :

• eau oxygénée (H2O2) à 30 vol. : 1 ml environ Porter au bain-marie bouillant (95°C) pendant 10 minutes. Filtrer à chaud sur papier-filtre dans un tube à essais.

Laisser refroidir le filtrat. Ajouter un égal volume (3 à 4 ml) d’éther éthylique. Agiter DOUCEMENT, par retournement du tube. S’il ne se forme pas d’émulsions

vous pouvez agiter plus énergiquement afin de bien extraire les anthraquinones.

Décanter l’éther (phase supérieure) et le prélever à l’aide d’une pipette Pasteur. Le placer dans un autre tube et ajouter un égal volume de lessive de NaOH à 50 g/l. Agiter énergiquement.

La phase aqueuse (inférieure) se colore en rouge pourpre (émodol dianion), la phase organique, initialement colorée en jaune citron (anthraquinones), se décolore totalement. Les anthraquinones, sous forme de sels (dianions), ne sont plus solubles que dans l’eau et la colorent en rouge.

* NOTE : il faut savoir que cette oxydation peut masquer une éventuelle falsification par du rhapontic, par exemple, qui est décelée par la fluorescence due à un polyphénol (rhaponticoside), que l’oxydation détruit en grande partie. C’est pourquoi il est recommandé de faire une telle recherche, avant l’étape d’oxydation.

S’assurer que le tube lui-même n’est pas autofluorescent (choisir pour ce test, un tube qui, encore vide, ne montre aucune fluorescence sous UV à 365 nm).

TP de VASAM-Pharmacognosie : Initiation aux voies d’accès et à la reconnaissance des grandes classes de Substances Actives Médicamenteuses d’origine végétale Tableau récapitulatif des éléments de DIAGNOSE CHIMIOTAXONOMIQUE

Travaux pratiques de VASAM-Pharmacognosie – DFGSP2 édition 2019 56

TABLEAU RÉCAPITULATIF d’aide à la DIAGNOSE des principaux TYPES de SAM Les n° de page sont les chiffres qui figurent dans chaque case après les croix indiquant l’intensité « relative » de la réponse de la drogue au test considéré comme diagnostique du type de SAM.

SAM réactifs généraux

(Mayer, Dragendorff, Bouchardat)

réaction au FeCl3

réaction de Bate-Smith

réaction de la cyanidine

Pouvoir aphrogène

réaction de Bornträger

Fluorescence bleue à 365 nm CCM

Alca

loïd

ique

s quinoléiques (type Quinquina) +++++ 49 OUI 13 13

Autres +++ 49 Pas inhibée par HCl, si QUIN.

Polyp

héno

lique

s Tanins condensés - 49 ++++ 50 +++++ 51 - 25 - 55 20

Flavonoïdes - 49 ++++ 50 ± 51 +++51 - 25 - 55 -

Autres - 49 +++ 50 - 51 - 51 - 25 - 55 -

Sapo

n-os

idiq

ues

triterpéniques

(type polygala) - 49 ++++ 25 - 55 27

Anth

racé

-no

sidiq

ues NON falsifiée

(type rhubarbe de Chine) - 49 ++++ 55 NON 37

falsifiée - 49 ++ 55 OUI 36 37

codes : : Cette case doit obligatoirement être positive : Cette case peut être positive ou négative (non diagnostique) : Cette case doit obligatoirement être négative


Les RÉACTIFS


RÉACTIFS RÉACTIFS POUR DROGUES À ALCALOÏDES (QUINQUINA) Réactif de MAYER Chlorure mercurique .................................. 1,35 g Iodure Potassium ............................................ 5 g Eau distillée ................................................. 30 ml Agiter jusqu'à dissolution puis ajouter : Eau distillée ...................................... q.s.p 100 ml Réactif de BOUCHARDAT Iode.................................................................. 2 g Iodure Potassium ............................................ 2 g Eau distillée ...................................... q.s.p 100 ml Réactif de DRAGENDORFF Solution concentrée (test "alcaloïdes") Sous nitrate basique de bismuth ............... 0,85 g Iodure potassium ............................................ 8 g Acide acétique glacial ................................. 10 ml Eau distillée ................................................. 70 ml Chauffer et filtrer sur verre fritté, si nécessaire. Solution diluée (révélateur CCM) Solution concentrée ...................................... 1 ml Acide acétique glacial ................................... 2 ml Eau distillée ................................................. 10 ml Témoin pour chromatographie du QUINQUINA Quinine .................................................... 12.5 mg Quinidine ................................................... 2.5 mg Cinchonine ................................................. 10 mg Cinchonidine .............................................. 10 mg Méthanol........................................................ 5 ml Révélateurs pour chromatographie du QUINQUINA Réactif au P.T.S. Acide p. toluène sulfonique ............................ 5 g Éthanol ............................................ q.s.p 100 ml Réactif à l'iodoplatinate Acide hexachloroplatinique...................... 0,15 ml Eau ........................................................... 8,95 ml Solution IK à 5 p 100 (p/v) ............................ 5 ml A conserver à + 4°C. RÉACTIFS POUR DROGUES A POLYPHENOLS (TANINS CATÉCHIQUES, FLAVONOÏDES) CHLORURE DE SODIUM cristallisé Réactif au BUTANOL CHLORHYDRIQUE Butan-1-ol .................................................... 40 ml Acide chlorhydrique concentré ................... 10 ml

SULFATE DE SODIUM anhydre Témoin pour chromatographie des TANINS CONDENSÉS Catéchine ..................................................... 5 mg Méthanol.............................................. q.s.p. 1 ml

Révélateur pour chromatographie des TANINS CONDENSÉS Réactif à l’anisaldéhyde sulfurique p-Anisaldéhyde .......................................... 0,5 ml Acide acétique glacial ..................................10 ml Méthanol ......................................................85 ml Acide sulfurique concentré ............................5 ml (stabilité limitée : inutilisable si « rose-violet ») A conserver à + 4°C. MAGNÉSIUM en rognures (réactif à « la cyanidine ») RÉACTIFS POUR DROGUES À SAPONOSIDES (POLYGALA) Solution de CHLORURE FERRIQUE à 10 p 100 Chlorure ferrique cristallisé ............................. 1 g Eau distillée ........................................ q.s.p 10 ml MAGNÉSIUM en rognures (réactif à « la cyanidine ») Réactif au BUTANOL CHLORHYDRIQUE Butan-1-ol.....................................................40 ml Acide chlorhydrique concentré ....................10 ml Témoin pour chromatographie de Polygala tenuifolia Willd. Escine......................................................... 25 mg Éthanol 70 p 100 ...................................q.s.p 5 ml Révélateur pour chromatographie de P tenuifolia Réactif à l’anisaldéhyde sulfurique p-Anisaldéhyde .......................................... 0,5 ml Acide acétique glacial ..................................10 ml Méthanol ......................................................85 ml Acide sulfurique concentré ............................5 ml (stabilité limitée : inutilisable si « rouge-violet ») RÉACTIFS POUR DROGUES À ANTHRACÉNOSIDES (BOURDAINE, RHUBARBE DE CHINE, …) ACIDE SULFURIQUE A 10 p 100 EAU OXYGÉNÉE 30 volumes Solution de CHLORURE FERRIQUE à 10 p 100 Chlorure ferrique cristallisé ............................. 1 g Eau distillée ........................................ q.s.p 10 ml Témoin pour chromatographie des AGLYCONES ANTHRAQUINONIQUES Chrysophanol ............................................... 5 mg Émodol ......................................................... 5 mg Aloé-émodol ................................................. 5 mg Rhéine .......................................................... 5 mg Méthanol ........................................... q.s.p. 20 ml Révélateur pour chromatographie des AGLUCONES ANTHRAQUINONIQUES DES RHUBARBES Réactif de Bornträger Potasse en pastilles ...................................... 30 g Ethanol .................................................. q.s.p. 1 L Réactif au BUTANOL CHLORHYDRIQUE Butan-1-ol.....................................................40 ml Acide chlorhydrique concentré ....................10 ml SULFATE DE SODIUM anhydre

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