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Travaux Pratiques de Pharmacognosie –Enseignement coordonné « SAM anticholinergique » 9/03/2020 1/29

Université de Montpellier Laboratoire de Pharmacognosie

ENSEIGNEMENT PRATIQUE COORDONNÉ

UE13 du DFGSP3 (Pharmacognosie)

« SAM anticholinergique » de la BELLADONE

Extraction, purification et caractérisation des alcaloïdes tropaniques

2019-2020

Enseignants : Maillard Ludovic (MCF) Morel Sylvie (MCF) Vigor Claire (MCF) Vercauteren Joseph (Pr)

Université de Montpellier

NH3C

OH CH2OH

O

(–)-hyoscyamine

HNH3C

OH CH2OH

O

(–)-scopolamine

HO

S

Introduction / Généralités


Dans le cadre de l’Enseignement Pratique Coordonné autour du thème « SAM anticholinergique », les enseignants du Laboratoire de Pharmacognosie interviennent pour la partie « chimie extractive » du projet, avec l’isolement et la caractérisation des alcaloïdes tropaniques d’Atropa belladonna L, Solanacées.

Cet enseignement prolonge et assoit les connaissances initiales de « chimie des substances naturelles » acquises au cours des Travaux Pratiques de Pharmacognosie dans le cadre de l’enseignement VASAM du DFGSP2. Cette phase d’initiation avait alors pour but de vous familiariser avec les principales classes de principes actifs du point de vue de leur extraction et de leur réactivité. Maintenant, vous allez pouvoir mettre en œuvre, au travers de la réalisation d’un projet concret, l’ensemble de vos compétences acquises : c’est la phase d’utilisation. Il s’agira pour vous de :

• Reconnaître/identifier la plante et de la drogue « source » (recherche des critères de la monographie de la Pharmacopée Européenne 10ème Éd., 01/2012:0221 corrigé 10.0),

• Isoler le totum alcaloïdique : extraction sélective des alcaloïdes d’une teinture de Atropa belladonna, Solanacées),

• Purifier la/les Substance(s) à Activité Médicamenteuse (SAM) : hyoscyamine (atropine) base,

• Réaliser un dossier analytique complet visant à établir sa conformité par rapport à la monographie de la Ph. Eur., dans le but de :

• Prendre la décision d’autoriser l’utilisation de ce « lot » dans l’étape suivante de sa transformation en médicament. Dans le cadre de cet enseignement coordonné, vous comparerez, en TP de pharmacologie, l’activité parasympatholytique sur organe isolé de votre atropine, à celle d’une autre SAM anticholinergique, d’origine synthétique, que vous avez préparée en TP de Chimie Thérapeutique …

Pour ce faire, au cours de ces 5 séances de 3 heures (regroupées pour 4 d’entre elles), vous aurez :

• À organiser la préparation d’extraits totaux qui vous permettront d’isoler à l’état de pureté suffisant de l’atropine base ;

• À réaliser des identifications ou des essais en suivant fidèlement ceux qui figurent à la monographie de la 10ème édition de la Pharmacopée Européenne. Par nécessité liée au temps imparti de ces TP, certains points de la monographie ont fait l’objet de modifications ou d’adaptations pour les rendre possibles (réalisation dans des tranches horaires « limitées » à 3h, ou moyens disponibles dans vos salles de TP).

Cette année, nos travaux pratiques gagnent en complexité et en intérêt, puisque l’enjeu

sera pour vous de déduire de vos expériences, si l’extrait (teinture) d’une drogue végétale à analyser, a fait l’objet ou non d’une falsification, avant de le valider (ou non), et de donner un avis « professionnel » sur sa possible levée de quarantaine.



Sécurité dans la salle de TP Tarbouriech Travaux Pratiques de Chimie / Pharmacognosie

• Pendant tous les travaux pratiques de Chimie / Pharmacognosie, chaque étudiant est

amené à manipuler de la verrerie, des produits chimiques qui peuvent être toxiques, inflammables…, à réaliser ou utiliser des montages complexes ou à exécuter des opérations délicates. Tous ces facteurs peuvent engendrer des risques d'accidents (brûlures, coupures, …) ou d'intoxications graves pour soi-même ou pour ses voisins. C’est pourquoi, des règles élémentaires de sécurité sont mises en place dans la salle et doivent être impérativement respectées sous peine d’exclusion temporaire des séances de travaux pratiques.

• Protection oculaire :

• Le port des LUNETTES de sécurité est OBLIGATOIRE pendant toute la durée de la séance de travaux pratiques, même lorsque vous ne manipulez pas (il y a toujours des personnes qui manipulent autour de vous).

Les verres de contact sont à éviter : des vapeurs organiques ou corrosives peuvent les endommager de façon irréversible ou s'infiltrer sous la lentille.

• Blouse : • Le port d’une BLOUSE pendant la séance est OBLIGATOIRE. Les

blouses doivent être en tissu de COTON résistant. Elles doivent être assez longues pour protéger les jambes et dotées de manches longues. Il est préférable de porter des chaussures qui recouvrent entièrement le pied.

• Cheveux :

Les cheveux longs doivent être impérativement attachés pendant les séances.

• Comportement : Il est INTERDIT de FUMER, MANGER, BOIRE, COURIR,

TÉLÉPHONER, et de lire ou d’envoyer des TEXTO dans la salle de TP.

• Étiquetage des flacons : Les flacons de produits chimiques à utiliser pendant la séance sont étiquetés.

Il est donc impératif de bien lire les étiquettes avant d’utiliser les produits chimiques. Au début de la première séance de travaux pratiques, il vous est demandé de

PRENDRE CONNAISSANCE DES REGLES DE SECURITE s’appliquant au cours des travaux pratiques de Chimie/Pharmacognosie et de vous ENGAGER A LES RESPECTER. Leur non-respect peut conduire à l’EXCLUSION temporaire des Travaux Pratiques de Chimie/Pharmacognosie.



RECOMMANDATIONS GENERALES - Lire attentivement le programme de travail. - Organiser, planifier son travail en fonction des durées et de l'enchaînement des

différentes étapes à réaliser : les séances « continues » doivent vous permettre d’acquérir un maximum d’autonomie dans cette organisation.

- Recopier ou photographier les CCM que vous effectuez avant qu'elles ne s'effacent. - Tenir à jour votre cahier de manipulation qui vous servira de support à la rédaction du

compte rendu final. - A la fin des manipulations, vérifier par rapport aux listes figurant sur les paillasses que

tout le matériel mis à votre disposition est présent, propre et sec. Signaler toute casse.

COMPTE-RENDU

1. Introduction

- La drogue, composition chimique et propriétés thérapeutiques. - Propriétés physico-chimiques de la ou des SAM.

2. Contrôles de la matière première

Références Dénomination, N° de lot... Chaque binôme dispose d’un lot qui lui est propre. Ce

numéro nous sera nécessaire pour juger de vos manipulations et résultats. Pensez bien à le faire figurer dans votre compte rendu.

Examens macroscopiques et botaniques Les résultats des examens macro- et microscopiques peuvent être exprimés sous forme

de tableau (la norme en regard de l'observation). Ajouter dans tous les cas un dessin ou une photo des éléments caractéristiques de la

poudre de la drogue. Pensez également à ajouter les éléments étrangers observés notamment lorsqu’ils sont fréquents.

Essais physico-chimiques : Ccm, Vitali-Morin, dosage, éléments étrangers, perte à la dessiccation. Pour chaque essai : - Résultats (ils peuvent être exprimés de façon groupée sous forme de tableau, la norme

en regard de l'observation). - Commentaire relatif à la conformité. (Nous vous recommandons de prendre des photographies, de les imprimer et coller sur

votre compte rendu final)



Conclusion générale relative à l'acceptabilité de la drogue. Si votre lot n’est pas conforme, donner un avis sur la falsification possible de cette

drogue. 3. Préparation de la Substance Active Médicamenteuse - Principe de l'extraction. - Calcul du rendement d'extraction. - Référence d'étiquetage. NB : Là encore, une falsification de la teinture est possible. Pensez à bien noter la

référence de votre teinture figurant sur le flaconnage qui vous aura été remis et à la faire apparaître dans votre compte rendu final.

4. Contrôles de la Substance Active Médicamenteuse

Références Dénomination N° de lot : ex : ATRO A2 051012 XxYy (Abréviation du produit, série TP, date

ddmmyy, noms COMPLET du binôme). Vous vous assurez ainsi qu’il n’y ait pas d’échange de cristaux entre les binômes et de travailler de bout en bout sur la même matière première.

Essais physico-chimiques Pour chaque essai : - Description succincte du principe. - Résultats (ils peuvent être exprimés de façon groupée sous forme de tableau, la norme

en regard de l'observation). - Commentaire relatif à la conformité.

Conclusion générale relative à l'acceptabilité de la SAM. Si votre lot n’est pas conforme, donner un avis sur la falsification possible de cette SAM

Votre compte rendu est à rendre à la fin de la dernière séance de TP. Il doit être manuscrit.

Monographie de la drogue « feuille de BELLADONE »


BELLADONE Belladonnae folium Partie 1 : Monographie de la DROGUE

1. DEFINITION La drogue de belladone est constituée par les feuilles seules ou les feuilles mêlées de

sommités florifères et, parfois, fructifères, séchées d'Atropa belladonna L. Elle contient au minimum 0,30 pour cent d'alcaloïdes totaux, calculés en hyoscyamine (Mr 289,4) par rapport à la drogue desséchée à 100-105°C. Parmi ces alcaloïdes, l'hyoscyamine, nettement prépondérante (>90%), est accompagnée de faibles quantités de scopolamine (2%) et de leurs produits de déshydratation (apoatropine et aposcopolamine).

Remarque : lors de l’étape d’extraction que vous allez réaliser, le mode opératoire peut induire une

racémisation de la (-)-hyoscyamine conduisant à l’obtention d’un mélange racémique dénommé atropine ((-)-hyoscyamine + (+)-hyoscyamine = atropine). Cette SAM constituera véritablement l’objet de votre étude.

2. CARACTERES La feuille de belladone a une odeur légèrement vireuse. Elle présente les caractères

macroscopiques et microscopiques décrits dans les identifications A et B. 3. IDENTIFICATION et ESSAI Vous devez observer à l’œil nu (A) et au microscope (B) la drogue végétale afin de trouver les éléments caractéristiques présentés dans la monographie. Pour valider votre étude prenez une photo ou réalisez un dessin. A. Examen macroscopique :

Les feuilles, dont la couleur va du vert au vert-brun, un peu plus sombres à la face

supérieure, sont souvent froissées et enroulées et partiellement agglomérées dans la drogue « brute ». La feuille est pétiolée, la base du limbe est atténuée et le bord entier. Les tiges florifères sont aplaties et portent des feuilles géminées de taille inégale, à l'aisselle desquelles sont insérées des fleurs solitaires, ou parfois des fruits. Le calice est gamosépale et la corolle est campanulée. La drogue peut contenir des fruits sous forme de baies globuleuses (« cerise enragée »), dont la couleur va du vert au noir-brun, brillantes, entourées d'un calice persistant à lobes largement étalés.

NH3C

OH CH2OH

O

(–)-hyoscyamine

HNH3C

OH CH2OH

O

(–)-scopolamine

3-αHO

NH3C

OH CH2OH

O

(+)-hyoscyamine

H

atropine

S R



Atropa belladonna L (feuille séchée = drogue)

https://fr.wikipedia.org/wiki/Belladone

B. Examen microscopique : Réduisez la feuille de belladone en poudre. La poudre est vert foncé. Examinez au

microscope en utilisant de la solution de potasse alcoolique. La poudre présente les éléments suivants :

• des fragments du limbe formés de cellules épidermiques à parois sinueuses et à cuticule striée [A, C] et

• d'une partie du parenchyme palissadique sous-jacent [Aa] • associé à l'épiderme supérieur [A] ; • de nombreux stomates [Ca], plus fréquents sur l'épiderme inférieur [C], anisocytiques1

et aussi quelques anomocytiques2 ; • des poils tecteurs pluricellulaires, unisériés, à cuticule lisse [F], et • des poils sécréteurs à tête unicellulaire et à pied pluricellulaire unisérié [D] ou • à tête pluricellulaire et à pied unicellulaire [B] ; • des cellules du parenchyme parmi lesquelles des cellules arrondies, dont certaines

contiennent des microcristaux cunéiformes d'oxalate de calcium [E] ; • des vaisseaux épaissis, annelés et spiralés [K].

La feuille de belladone pulvérisée peut également présenter : • des vaisseaux réticulés épaissis et des fibres provenant des tiges ;

1 Stomate normalement entouré de 3 cellules annexes dont une est plus petite que les autres. 2 Stomate entouré d’un nombre variable de cellules qui ne diffèrent en aucune façon des cellules de l’épiderme en général.



• des grains de pollen subsphériques d'un diamètre de 40-50 µm, à 3 pores germinatifs, 3 sillons et une exine portant de nombreuses ponctuations [H] ;

• des fragments de corolle à épiderme papilleux [J] ou portant • de nombreux poils tecteurs ou sécréteurs des types précédemment décrits [L] ; • des fragments du tégument de la graine, jaune-brun, formés de cellules irrégulièrement

sclérifiées [G].

dessin pour l’identification de la feuille de belladone pulvérisée

1. Épiderme pilifère supérieur constitué de cellules à paroi sinueuse, et surmonté d’une cuticule finement striée,

2 et 4. Épiderme pilifère et stomatifère inférieur, constitué de cellules à paroi sinueuse, et surmonté d’une cuticule finement striée,

3. grain de pollen, 5 et 9. Section transversale de limbe,

présentant de haut en bas : cuticule striée, épiderme, mésophylle hétérogène présentant une assise de cellules palissadiques et un parenchyme lacuneux renfermant quelques cellules à sable,

6. Poil sécréteur à pied pluricellulaire unisérié et tête unicellulaire globuleuse,

7 et 11. Poil sécréteur à pied unicellulaire et tête pluricellulaire, caractéristique de la famille,

8. Vaisseau conducteur annelé et spiralé voir canaliculé,

10. Poil tecteur pluricellulaire unisérié.

C. Chromatographie :

C1. Préparation de l’extrait pour la CCM et le test de Vitali-Morin

Dans un erlen en plastique de 100 mL (surmonté de son bouchon, lors de la macération),

1g de feuilles de belladone pulvérisées est placé dans 10 mL d’acide sulfurique à 10% (p:v). L’ensemble est agité puis laissé en contact pendant 10 min avant d’être filtré. Placer un coton dans un entonnoir et filtrer directement dans l’ampoule à décanter de 100 mL. 15 mL de dichlorométhane sont ajoutés dans l’ampoule (dCHCl3 = 1,33). Adjoindre ensuite dans l’ampoule le volume d’ammoniaque concentré nécessaire à l’alcalinisation de la solution aqueuse (ajouter un volume de pipette pasteur pour obtenir le pH 10-12 de la phase aqueuse ; recommencer l’opération si nécessaire)3. Agitez avec précaution pour éviter la formation d’émulsions.4

3 Le papier pH reste sur la paillasse et ne trempe pas directement dans les solutions aqueuses. Votre spatule « plantée » dans la phase aqueuse ira recueillir la goutte nécessaire à l’observation du virage colorimétrique. 4 Nous vous recommandons d’effectuer une quinzaine de retournements d’ampoule à décanter, en dégazant à chaque fois.

Ép supPar.palis.

Poil séc. tê. pl. & pi. uni.

Sto

Ép inf

Poil t

ec. p

l. uni.

cut. l

iss. Tég. grain. jaun-brun

Poil s

éc. t

ê. u

n. &

pi.

plur

i. un

isér.

Grain pollen fragments corolle



Recueillez la phase organique dans un Erlen de 100 mL en verre et desséchez la sur du sulfate de sodium anhydre. Filtrez la (entonnoir + coton) dans un ballon de 100 mL sec.

Évaporer le solvant à l’évaporateur rotatif puis dissoudre l’extrait obtenu dans 4 gouttes de MeOH.

Cet extrait vous servira pour réaliser la CCM et le test de Vitali-Morin. Vous n’effectuerez ce test qu’après avoir validé la CCM.

C2. Chromatographie (CCM) : Opérez par chromatographie sur couche mince en utilisant des plaques de gel de silice

sur aluminium GF254 : Solution à examiner. Déposez séparément sur la plaque, à une distance de 1 cm, 3 fois de la solution à

examiner, 3 fois de la solution témoin (disponible en salle de TP, mélange d’atropine et de scopolamine). Réalisez une piste mixte en déposant 3 fois du témoin et 3 fois votre extrait au même emplacement. Développez sur un parcours de 7,5 cm environ avec un mélange ammoniaque concentrée/eau/acétone (0.3/0.7/9 ; v/v/v). Séchez la plaque sous la hotte, au sèche-cheveux, jusqu’à évaporation complète de la phase mobile, puis laissez refroidir.

Avant toute révélation à l’aide de révélateurs, observer la CCM sous lumière

ultraviolette, aux deux longueurs d’ondes 254 nm et 365 nm. Entourer les bandes, en utilisant le code suivant :

- Trait plein = extinction de la fluorescence de l’indicateur à 254 nm - Trait pointillé = fluorescence des composés excités à 365 nm

Tamponnez avec un coton imbibé de réactif de Dragendorff (solution d'iodobismuthate

de potassium), jusqu'à apparition de bandes orangées ou brunes sur fond jaune caractéristique des composés alcaloïdiques. Les bandes des chromatogrammes obtenues avec la solution à examiner sont semblables quant à leur position (hyoscyamine dans le tiers inférieur et scopolamine dans le tiers supérieur des chromatogrammes) et leur coloration à celles des chromatogrammes obtenus avec la solution témoin. De faibles bandes secondaires peuvent apparaître, en particulier au 3/4 du chromatogramme.

Toute bande supplémentaire (au Dragendorff ou à l’UV) ou toute bande révélant de façon plus intense, au regard de la CCM ci-contre, peut être le signe d’une falsification de votre drogue. Il est important de penser à les entourer correctement.

Une fois votre CCM validée (= vous avez été en capacité de l’exploiter, d’en tirer des conclusions parce qu’elle était de qualité suffisante : vous voyez correctement les bandes du mélange « Témoin », les bandes de votre extrait, vous avez noté le front de solvant…. : ex. ci-contre), vous pouvez passer à l’essai D, la réaction de Vitali-Morin.

D. Réaction de Vitali-Morin (modifiée) : test de caractérisation spécifique des

alcaloïdes tropaniques Ajoutez 0,5 mL d’acide nitrique fumant à l’extrait obtenu en C1 (au fond de votre



ballon), et déposez la solution résultante, à l’aide d’une pipette pasteur sur un verre de montre déjà placé sur un bain de sable (ATTENTION : très chaud !), jusqu’à évaporation complète. Tout doit se faire sous la hotte, en raison du dégagement de vapeurs nitreuses, rousses. Dès que la solution est entièrement évaporée, enlevez le verre de montre du bain de sable (à l’aide d’une spatule) et laissez-le revenir à température ambiante. Ajoutez ensuite 1 mL d’acétone anhydre et, goutte-à-goutte, une solution éthanolique d’hydroxyde de potassium (réactif de Vitali-Morin) à 30 g/L. Il se développe une intense coloration violette, peu persistante (soyez prêt à prendre une photo dès l’ajout de la 1ère goutte de KOH), caractéristique des alcaloïdes tropaniques.

REMARQUE : il est important, pour la réussite de la réaction colorée que les

alcaloïdes soient suffisamment purs et surtout que le milieu soit parfaitement anhydre. La qualité de la réalisation de votre extrait C1 en dépend.

E. Éléments étrangers (dans la drogue) :

Définition : Les éléments étrangers se composent, en totalité ou en partie, des : • Parties étrangères : tout élément qui provient de la plante mère, mais ne constitue pas la

drogue. • Matières étrangères : tout élément qui est étranger à la plante-mère, d’origine végétale

ou minérale.

§ Éléments étrangers spécifiques de la monographie Belladone : La feuille de belladone ne contient pas plus de 3% de tiges d'un diamètre supérieur à 5 mm. (Il s’agit bien d’un diamètre de tige et pas d’une longueur de tige !)

§ Éléments étrangers selon la monographie générale des plantes sèchées : La drogue végétale devrait être exempte de moisissures, d’insectes et d’autres

contaminations animales ou végétale. La réglementation fixe à 2% au maximum,< ce type d’éléments étrangers.

Détermination des éléments étrangers : Pesez 50 g de l’échantillon ou et répartissez en couche mince sur une feuille de papier

filtre. Les éléments étrangers sont décelés par examen à l’œil nu. Séparez les éléments étrangers, photographiez-les, pesez-les et calculez-en le pourcentage. Pensez à constituer 2 groupes, puisque 2 types d’éléments étrangers vous sont demandés. Comparer avec les données de la monographie.

Ce travail achevé, replacez les éléments étrangers extirpés de la drogue, dans la drogue initiale, mélangez bien. Le lot qui a été mis à votre disposition pour cette étude ne doit pas voir son taux d’éléments étrangers fluctuer.

F. Perte à la dessiccation : La perte à la dessiccation est la perte de masse exprimée en pourcentage (p/p) : Selon

la pharmacopée elle doit être inférieure à 10%.



Mode opératoire. Placez environ 1,000g (à peser avec précision sur balance de précision) de la substance à examiner dans un verre de montre taré. Assurez-vous de répartir de façon homogène la poudre végétale. La dessiccation de la substance se fait pendant 2h par chauffage à l’étuve à 100-105°C. Pesez à nouveau la substance et calculer la perte durant la dessiccation. Pensez à utiliser la même balance de précision.

4. Dosage Pesez avec précision (balances de précision de la salle de pesées) 10,00 g de poudre

de feuilles de belladone, placez-les dans un erlen à bouchon de 100 mL (en plastique). Imbibez la poudre d’un mélange de 5 mL d’ammoniaque concentré, 10 mL de méthanol et 30 mL d’éther diéthylique. Mélangez soigneusement.

NOTE : dès l’ajout de l’ammoniaque, bouchez hermétiquement votre erlen. Travaillez sous une hotte.

Laissez macérer pendant 2h (sous agitation lente, avec un barreau magnétique, cette

étape peut-être réalisée entre 12h et 14h).

Ajoutez dans votre erlen, 10 mL de dichlorométhane et 30 mL d’éther diéthylique, puis filtrez dans un ballon à col rodé de 250 mL au moyen d’un entonnoir muni d’un coton, en laissant au maximum le marc dans l’erlen. Lavez le marc avec 5ml de dichlorométhane et 15ml d’éther diéthylique. Filtrez sur coton, directement dans le même ballon.

Les filtrats, rassemblés dans ce ballon, sont évaporés sous pression réduite (rotavapor). Ajoutez 5 mL de dichlorométhane et 100 mL d’éther diéthylique et placer la solution

organique obtenue dans une ampoule à décanter de 250 mL (phase éthérée majoritaire, dC4H10O= 0,7). Extraire cette phase organique par un premier volume de 50 mL d’acide sulfurique 0,25 M, puis par un deuxième volume de 20 mL d’acide sulfurique 0,25 M (agitation douce par simples retournements ; ≈ 15 fois : attention aux émulsions !). Réunissez les phases aqueuses acides.

Placez cette phase acide dans une ampoule à décanter de 250 mL. Alcalinisez-la par ajout graduel d’ammoniaque concentré à l’aide d’une pipette pasteur à pH≈ 9-10 (≈ 6-7 mL). Vérifiez le pH après chaque ajout d’ammoniaque.

Ajoutez 15 mL de dichlorométhane pour extraire la phase aqueuse. Renouvelez l’extraction 2 autres fois (2x15 mL de dichlorométhane) et rassemblez les 3 phases organiques obtenues. Séchez la phase organique sur sulfate de sodium. Filtrez la solution sur coton directement dans un ballon de 250 mL (ballon et entonnoir doivent être parfaitement secs), en entraînant le moins possible de sulfate de sodium sur le coton. Lavez le sulfate de sodium par 2 fois 5 mL de dichlorométhane. Évaporez à siccité, sous pression réduite (rotavapor).

Si le temps vous manque vous pourrez finir le dosage à la prochaine séance. Dans ce cas, conservez le totum alcaloïdique, sous cette forme (à sec).

Dissolvez le résidu obtenu dans 3 mL de dichlorométhane. Ajoutez précisément (utilisez la pipette jaugée 2 traits de 10 mL) 20 mL d’acide sulfurique à 0,01 M (Attention à la concentration !). Eliminez le dichlorométhane au bain marie à 65°C.

Dosez l’excès d’acide par la solution d’hydroxyde de sodium 0,02 M (il s’agit d’un « dosage en retour ») :



schéma illustrant le dosage « en retour »

Une fois le dichlorométhane entièrement évaporé, ajoutez une pointe de spatule de rouge de méthyle (indicateur coloré : rouge si pH < 4,4 < orange > jaune si pH > 6,2) dans le ballon de 250 mL renfermant la solution de votre extrait (coloration rose en milieu acide). Remplissez précisément la burette graduée avec la solution de NaOH à 0,02 M (après l’avoir rincée avec cette même solution). Ajoutez goutte à goutte la solution de soude dans votre extrait acide jusqu’au changement de couleur de l’indicateur coloré (jaune en milieu alcalin).

virage de la phase aqueuse, lors du dosage « en retour »

Calculez la teneur en pour cent en alcaloïdes totaux, exprimée en hyoscyamine, à l'aide de l'expression, figurant dans la monographie de la Pharmacopée :

dans laquelle : d = perte à la dessiccation, exprimée en pour cent, n = nombre de millilitres d'hydroxyde de sodium 0,02 M utilisés, m = masse de la prise d'essai, en grammes.

Quantité d'acide H2SO4 0,01 M(20 ml)

Quantité d'alcaloïdes base qui neutralisent une partie d'H2SO4

Quantité de soude 0,02M qui neutralisent l'excès d'H2SO4Point de virage du rouge de méthyle

alcaloïdes totauxexcès d'acide

quantité de soude nécessaire (= n ml)

virage

pH acide pH basique

57,88 x (20 - n)

(100 - d) x m



La valeur de 57,88 de cette formule, est liée au poids moléculaire de l’atropine (289,4). Il faut 2 moles de cette base monovalente pour neutraliser chaque mole de l’acide divalent (H2SO4) utilisé en excès (289,4 x 2 = 578,8 g/Mole). Comme on part de 10 g (de prise d’essai) et non pas de 100, cela correspond à 57,88 g (pour l’exprimer en %age).

CONCLUSION GENERALE RELATIVE À L’ACCEPTABILITÉ

DE LA MATIÈRE PREMIÈRE

Conformité de la matière première ? Donner votre avis sur sa possible « levée de quarantaine » …

Vous avez un doute sur la conformité de votre drogue végétale, vous suspectez une

falsification de celle-ci : Il vous est possible de déterminer par une diagnose rapide (grâce aux tests suivants,

déjà utilisés en TP de VASAM-Gnosie, DGFSP2), la nature des SAM responsables de cette falsification :

• saponosides (falsification par le Marron d’Inde, la Saponaire, …), • anthracénosides (falsification par le Séné, la Bourdaine, …), • autres alcaloïdes (falsification par le Quinquina, le Datura (plus riche en scopolamine), …).

• Test d’identification rapide des saponosides5

Pour identifier rapidement une drogue riche en saponosides, il suffit de mettre en

évidence leur pouvoir aphrogène en observant la mousse très fine qui se forme après une simple agitation énergique (pendant 15 secondes) de la poudre de votre drogue, en présence d’eau et sa persistance au moins 3 min.

Dans un tube à essais, introduire : • poudre de la drogue : 200 mg environ • eau : 5 mL environ Agiter. Observez (pensez à prendre une photo) et concluez.

Réponse positive

(après 3 min) Réponse négative

(après 3 min)

5 La Belladone renferme une faible portion de saponosides



• Test d’identification des anthracénosides (réaction de Bornträger) Dans un tube à essais, introduire : • poudre de la drogue : 200 mg environ • acide sulfurique à 10% : 5 mL environ • eau oxygénée (H2O2) à 30 vol. : 1 mL environ

Porter au bain-marie bouillant (95°C) pendant 15 minutes. Filtrer à chaud sur papier-filtre dans un tube à essais.

Laisser refroidir le filtrat en passant le tube sous l’eau froide. Ajouter un égal volume) d’éther éthylique (environ 3 mL). Agiter DOUCEMENT, par retournement du tube. Attention à ne pas former

d’émulsions. Décanter l’éther (phase supérieure) et le prélever à l’aide d’une pipette Pasteur. Le placer dans un autre tube et ajouter un égal volume de lessive de NaOH à 50

g/l. Agiter énergiquement. En présence d’anthraquinone, la phase aqueuse (inférieure) se colore en rouge

pourpre, la phase organique, initialement colorée en jaune citron , se décolore totalement. Les anthraquinones, sous forme de sels (dianions), ne sont plus solubles en phase organique. Ils migrent en phase aqueuse et la colorent en rouge. Observez (pensez à prendre une photo) et concluez

Réponse positive

(falsification par une drogue à anthracénosides) Réponse négative

Extraction de la SAM Atropine base


Préparation de l’atropine base Partie 2 : Extraction de la SAM

Vous devez isoler l’atropine base à partir d’un extrait hydro-alcoolique de la drogue

d’Atropa belladonna L., préalablement concentré (100 mL à 30 mL). Il vous faudra déterminer si cet extrait hydro-alcoolique a été ou non falsifié par un composé étranger.

Extraction de l’atropine base. L’extrait hydro-alcoolique a été concentré par nos soins : l’alcool est

éliminé en premier. Placez 30 mL de ce concentré aqueux dans l’ampoule à

décanter de 250 mL (noter la référence de cet extrait), ajoutez-y 40 mL de dichlorométhane. Alcalinisez la phase aqueuse (supérieure !) par ajout graduel d’ammoniaque concentré pour obtenir un pH de 8-9 (≈ 10 gouttes de pipette pasteur seront nécessaires : pensez à contrôler le pH de la phase aqueuse après chaque ajout de 5 gouttes). Le pH basique atteint, vous pouvez commencer à extraire délicatement par simples retournements (≈ 15 fois). Soutirez la phase organique. Extrayez à nouveau la phase aqueuse par 40 mL de dichlorométhane. Rassemblez les phases organiques.

Vérifiez que l’extraction est totale (absence d’atropine dans la phase

aqueuse sur « Couche Mince » : Déposez la phase aqueuse et la phase organique à l’aide d’un

capillaire sur un petit morceau de CM et tamponnez le « spot » à l’aide du réactif de Dragendorff. Il n’est pas nécessaire de faire migrer les spots. L’absence de coloration orange confirme l’absence d’atropine en phase aqueuse qui a donc été « épuisée ». Si vous constatiez la persistance d’atropine dans la phase aqueuse (coloration orange présente, comme sur la photo), vous pouvez procéder à une nouvelle extraction de votre phase aqueuse par 40 mL supplémentaires de dichlorométhane, mais après avoir vérifié de nouveau le pH de votre solution. Répétez l’opération, si nécessaire.

Rassemblez les phases organiques et placez-les dans l’ampoule à décanter. Extrayez par

40 mL d’acide sulfurique 0,25 M. Répétez l’extraction par 20 mL d’acide sulfurique à 0,25 M. Vérifiiez par CCM l’absence d’atropine dans la phase organique.

Réunissez les phases aqueuses acides, riches en alcaloïdes, et placez-les à nouveau dans l’ampoule à décanter. Ajoutez y 30 mL de dichlorométhane. Les deux phases en présence, alcalinisez la phase aqueuse par ajout d’ammoniaque concentré jusqu’à atteindre pH ≈ 9-10 (vérifiez le pH après chaque ajout d’ammoniaque, 0.5 mL par 0.5 mL). Quand le pH est basique, vous pouvez commencer l’extraction liquide/liquide. Répétez l’extraction 2 fois (2x30 mL de dichlorométhane). Vérifiez par CCM l’absence d’atropine dans la phase aqueuse. Rassemblez les 3 phases organiques dans un erlen transparent en verre (propre et sec) et séchez-les par ajout de sulfate de sodium anhydre. Filtrez votre solution sur coton dans un ballon de 250ml, propre et sec (vous pouvez rincer le sulfate de sodium par du CH2Cl2, si la quantité utilisée est importante), et évaporez à sec, sous pression réduite.

Extraction de la SAM Atropine base


Ajoutez 3 mL d’éther diéthylique au résidu obtenu. Vérifiez que le résidu est bien dissous. Prélevez la totalité de la solution très rapidement (avant que l’atropine ne cristallise), à l’aide d’une pipette pasteur, et placez-la dans un pilulier en verre ambré préalablement taré, et correctement renseigné (ATRO., Série TP, Date, noms complets du binôme). Rincez à nouveau votre ballon avec 2 mL d’éther diéthylique et transvasez dans le même pilulier. Laissez évaporer l’éther jusqu’à la prochaine séance.

Une fois l’éther totalement évaporé, placez votre pilulier à l’étuve à 60°C pour sécher

la poudre d’atropine pendant 10 min. Pesez votre pilulier, puis grattez les parois du pilulier afin de récupérer votre poudre d’atropine base. Conserver votre SAM pour réaliser la monographie de la SAM « atropine base ».

Calculez la teneur en % d’atropine de votre teinture-mère.

Monographie de la SAM Atropine base


Atropine base Partie 3 : Monographie de la SAM

DÉFINITION

(2RS)-3-Hydroxy-2-phénylpropanoate de (1R,3R,5S)-8-méthyl-8-azabicyclo [3.2.1] oct-3-yle. Teneur : 99,0 pour cent à 101,0 pour cent (substance desséchée).

CARACTÈRES

Aspect : poudre cristalline, blanche ou sensiblement blanche, ou cristaux incolores. Solubilité : très peu soluble dans l’eau, facilement soluble dans l’éthanol à 96 pour cent et dans le dichlorométhane.

IDENTIFICATION & ESSAI A Point de Fusion.

Dans un capillaire à point de fusion, placez quelques cristaux et insérez le tube dans le dispositif. Observez la température de fusion ou de décomposition. Comparez à celle de l’atropine base SCR qui est de 115 °C à 119 °C. (décomposition). Concluez.

B Étude CCM : vérification de la pureté Opérez par chromatographie sur couche mince en utilisant une plaque recouverte de gel

de silice GR. Solution à examiner. Dans un tube à essai, quelques cristaux sont re-solubilisés dans un

minimum d’éthanol. Solution témoin : disponible en salle de TP = solutions d’atropine et de scopolamine. Déposez séparément sur la plaque 3 fois de chaque solution. Développez le chromatogramme sur un parcours de 7,5 cm avec un mélange

ammoniaque concentrée / eau / acétone (0.3/0.7/9 ; v/v/v). En préparer 10 mL. Séchez la plaque sous la hotte, au sèche-cheveux, le temps nécessaire à l’évaporation

complète de la phase mobile. Laissez refroidir. Avant toute révélation à l’aide de révélateurs « colorés », observez la CCM sous

lumière ultraviolette, aux deux longueurs d’onde 254 nm et 365 nm. Entourez les bandes, en utilisant le code suivant :

- Trait plein = extinction de la fluorescence de l’indicateur à 254 nm - Trait pointillé = fluorescence des composés excités à 365 nm

Pulvérisez la solution diluée d'iodobismuthate de potassium (réactif de Dragendroff)

jusqu'à l'apparition des taches. La(es) bande(s) des chromatogrammes obtenus avec la solution à examiner sont semblables quant à leur position et leur coloration à celles des chromatogrammes obtenus avec la solution témoin. Concluez sur la pureté de votre SAM.



C Réaction de Vitali-Morin : Placez quelques cristaux (3 mg maximum) de votre SAM atropine base dans un verre

de montre, ajoutez 0,2 mL (≈5 gouttes) d'acide nitrique fumant et évaporez au bain de sable à siccité. Une fois l’extrait totalement sec, enlevez le verre de montre du bain de sable et laissez-le revenir à température ambiante. Dissolvez le résidu dans 0,5 mL d'acétone anhydre (qualité HPLC), puis ajoutez 3 gouttes d'une solution alcoolique d'hydroxyde de potassium. Au moment de l’ajout de la 1ère goutte, pensez à prendre une photographie de coloration obtenue. Elle peut être fugace. Concluez.

D Spectre IR de la SAM Examinez l'atropine base par spectrophotométrie d'absorption dans l'infrarouge, en

comparant le spectre obtenu avec celui de l’atropine base SCR (Substance Chimique de Référence).

Utilisation du spectromètre Infra Rouge : il s’agit d’un spectromètre qui fonctionne en

mode « ATR » (= Attenuated Total Reflexion), pour lequel il n’est pas besoin de préparer de « pastilles » de KBr ou NaCl, et par transformée de Fourier de l’interférogramme obtenu.

Mesure Commencez par nettoyer le diamant avec de l'éthanol, puis suivez les instructions

figurant à côté de l’appareil. En résumé : Pensez à entrer le nom sous lequel s'enregistrera le spectre : (ATROP, date "ddmmyy", groupe TP, noms

binôme) dans le dossier « c:\pel_data\spectra\TPGnosie... déjà créé pour les Travaux Pratiques. Cliquez sur « start ». Une page s’ouvre qui possède une jauge de mesure de la force de pression de

l’échantillon sur le diamant. Déposez l’échantillon (environ 3 à 4 mg de cristaux, c’est un ordre de grandeur), pour couvrir la fenêtre en cristal de diamant de la platine du spectrophotomètre IR-FT.

Compresser les cristaux jusqu’à la valeur idéale : ajuster la pression exercée sur l'échantillon (Force gauge), par la rotation douce du bouton du vernier, solidaire d’un embout plat, placé à l'extrémité de la presse. La pression doit rester dans le vert : ne pas dépasser 149). Lorsqu'elle est correcte, lancez la mesure en appuyant sur "SCAN" : 4 balayages (= interférogrammes) sont additionnés. Le calcul du spectre est obtenu par transformation de Fourier automatique.

La mesure faite, vous pourrez récupérer vos cristaux. Bien nettoyer le diamant après utilisation avec le solvant adéquat.

Traitement du spectre et enregistrement au format PDF Il y a la possibilité de:

- régler l'échelle (View puis Format view) - faire figurer la valeur des pics (View puis labels peaks) - ajouter manuellement un pic non pris en compte (cf Fiche explicative de l'appareil) - enregistrer et superposer le spectre de votre SAM Atropine isolée, à celui de l’Atropine

de référence.

Imprimez le spectre qui devra faire partie du dossier analytique de la SAM : File à Print à OK

La fréquence des bandes d’absorption est donnée en nombre d’ondes par cm (cm-1).



Elles doivent correspondre (être superposables) à celles de l’atropine base SCR (ci-dessous).

La comparaison de la région des « fingerprint », notamment, ne doit pratiquement pas varier. Concluez.

Spectre IR Atropine Base (SCR)

A l’issue de ces 4 premiers tests (A à D), une fois l’ensemble des

conclusions obtenues, vous pourrez engager s’il le faut le reste de votre SAM pour préparer une solution de concentration connue (entre 25 et 50 mg / 10 mL) pour la mesure du pouvoir rotatoire et du spectre UV.

E Angle de rotation optique (pouvoir rotatoire) :

Il s’agit de calculer la valeur de « l’angle de déviation spécifique » du plan de polarisation d’une lumière, de longueur d’onde connue, par une substance chirale, dans un solvant donné, sur un trajet "l", à une température et à une concentration c données, en mesurant la rotation (a observé) de la solution.

§ La longueur d’onde standard est celle de la raie "D" du sodium = 589 nm, § la température est de 20°C, § c = 1 quand la concentration est de 1 g/mL, § et l = 1, quand le trajet optique est de 1 dm.

Cette valeur a permet alors, de calculer la rotation spécifique ([a]D) de la solution en utilisant la formule donnée par la Loi de BIOT :

La rotation spécifique ([a]D) de votre atropine dépend donc :

Fingerprint)Fonc ons)

[α] =t°CD l . c

α observé rotation spécifique rotation mesurée



§ de l’a observé en degrés d'angle, § de la concentration réelle "c" de la solution en substance chirale (en g/mL), § du trajet optique en dm, donc, ici, la longueur du tube polarimétrique = 0,5 dm.

Dissolvez entre 25 et 50 mg d'atropine base (pesez précisément) dans de l’éthanol et complétez à 10 mL avec le même solvant (à « S rot »*).

Mesurez l’angle a de rotation (observé) et calculez la rotation spécifique de votre SAM, en tenant compte de la concentration réelle et de la longueur du tube polarimétrique. L'atropine base SCR, en solution éthanolique, a un pouvoir rotatoire nul :

Concluez quant à la pureté chimique et/ou optique de l’atropine.

*NE PAS JETER VOTRE SOLUTION « S rot », elle vous servira pour la mesure du spectre UV-visible.

F Spectre UV-Visible : atropine base.

Préparer la solution : La solution "S rot" peut être trop concentrée pour mesurer le spectre UV-Visible, il est possible qu’une ou plusieurs dilutions soi(en)t nécessaire(s). À partir de "S rot", préparez des solutions d’atropine base diluée au 1/20ème, 1/400ème et au 1/8000ème dans de l’éthanol. Calculez la concentration. Commencez par analyser la solution la plus diluée, garder les autres jusqu’à la fin de l’analyse, elles vous serviront peut-être.

Conseil : placez 1 mL de "S rot" dans une fiole jaugée de 20 mL et complétez au trait de jauge par l’éthanol. Procédez ensuite à une dilution en cascade (en utilisant une autre fiole jaugée de 20 mL). Bien agiter à chaque fois.

Mesurez le spectre UV-Visible entre 220 et 800 nm de la solution la plus diluée. Imprimez le spectre (ce spectre devra faire partie du dossier analytique de la SAM).

Concluez.

CONCLUSION GENERALE RELATIVE À L’ACCEPTABILITÉ DE LA SAM Conformité de l’atropine base obtenue ?

Donnez un avis de professionnel sur la « levée de quarantaine » de la SAM Atropine…

[α] =20°C589 nm

0,0° ± 0,05°



« Etude de l’atropine base de référence » Spectre de Masse de la SAM Le spectre est mesuré par un spectromètre utilisant un mode d’ionisation par

« électrospray » (à pression atmosphérique) en mode « infusion ». Une telle technique donne donc des ions « pseudomoléculaires » : m/z = [M+H+]+ (= M+1), en mode positif ou [M-H+]- (= M-1), en mode négatif.

Spectre de masse ESI mode positif de l’atropine base

Dans quel mode ce spectre de masse a-t-il été acquis ? Pourquoi avoir choisi ce mode ?

A quel ion pseudomoléculaire, la masse observée correspond-t-elle ? Spectres de RMN Les spectres du 1H et du13C sont mesurés par un spectromètre de RMN ayant un champ

magnétique de 11,74 Tesla, fonctionnant donc à 500 MHz pour l’observation du proton et à 125,7 MHz pour celle du carbone 13.

ANALYSEZ LES SPECTRES

ATTRIBUEZ LES SIGNAUX aux 1H et aux 13C de la SAM Atropine, sur chaque spectre



RMN du 1H de la SAM : spectre du standard de référence.

zoom

Observez le spectre : les valeurs les plus importantes à analyser sont les déplacements

chimiques (en ppm du champ = 500 MHz) et les intensités relatives des signaux. L’analyse des multiplicités (doublets, triplets, quadruplets et toutes leurs combinaisons) parce que complexe dans le cas de cette substance ne sera pas à effectuer. Annoter votre spectre en respectant la numérotation des carbones du composé. Justifier chacune de vos propositions par une phrase, directement sur le spectre ou dans votre compte rendu.

NH3C H

O

O

OH81 2

5

6

7

4

3

9 10

11

12

1314

15

1617

NH3C H

O

O

OH81 2

5

6

7

4

3

9 10

11

12

1314

15

1617



RMN du 13C de la SAM : spectre de l’Atropine standard de référence.

zoom

Observez le spectre : les valeurs les plus importantes à analyser sont les déplacements chimiques (d, en ppm du champ = 125,7 MHz), et la phase du signal, laquelle dépend du nombre de protons portés par le carbone considéré :

• (positive : nombre pair de protons = zéro (C#) ou deux (CH2) ; • négative : nombre impair de protons = un (CH) ou trois (CH3). Annotez votre spectre en respectant la numérotation des carbones du composé. Justifiez

chacune de vos propositions par une phrase, directement sur le spectre ou dans votre compte rendu.

NH3C H

O

O

OH81 2

5

6

7

4

3

9 10

11

12

1314

15

1617

Annexes


ANNEXES

Annexes

Travaux Pratiques de Pharmacognosie – 3° année 25

Figure 1 : stomate anomocytique et cellules épidermiques à paroi sinueuse et cuticule striée

Figure 2 : parenchyme renfermant des cellules arrondies à microcristaux d’oxalate de calcium (cellules à sable), surmonté de cellules épidermiques à paroi sinueuse

Annexes


Figure 3 : vaisseau conducteur spiralé localisé dans le parenchyme

Figures 4 et 5 : poil sécréteur à tête pluricellulaire et pied unicellulaire

Annexes


Figure 4 et 5 : poil sécréteur à tête pluricellulaire et pied unicellulaire

Figure 6 : poil sécréteur à tête unicellulaire et pied pluricellulaire unisérié

Annexes


Figure 7 : poil tecteur pluricellulaire unisérié (fragments)

Figure 8 et 9 : pollen subsphérique, présentant 3 pores germinatifs

Figure 10 : fragment de semence (facultatif)

Annexes


Définitions de la Pharmacopée Européenne

Détermination de la perte à la dessiccation La perte à la dessiccation est la perte de masse exprimée en pourcentage m/m. Ph. Eur. 10ème Éd., 2.2.31 : « La perte à la dessiccation est la différence entre la masse

de l'échantillon avant dessiccation et la masse de l'échantillon après dessiccation ; elle est exprimée en pourcentage, la mention m/m étant sous-entendue ».

Mode opératoire. Placez la quantité prescrite de la substance à examiner dans un flacon à tare, desséché lui-même au préalable dans les conditions précisées pour la substance à examiner. La dessiccation de la substance se fait jusqu’à masse constante ou pendant la durée prescrite à l’aide d’un des procédés décrits ci-dessous. Si la température de dessiccation est indiquée par une seule valeur plutôt qu’un intervalle, la dessiccation est effectuée à la température prescrite ± 2°C.

• Dans un dessiccateur : la dessiccation est effectuée en présence de pentoxyde de diphosphore (P2O5), à la pression atmosphérique, à température ambiante ;

• Sous vide : la dessiccation est effectuée en présence de pentoxyde de diphosphore, sous une pression comprise entre 1,5 kPa et 2,5 kPa, à température ambiante ;

• Sous vide avec indication d’un intervalle de température : la dessiccation est effectuée, en présence de pentoxyde de diphosphore, sous une pression comprise entre 1,5 kPa et 2,5 kPa et dans un intervalle de température prescrit dans la monographie ;

• A l’étuve avec indication d’un intervalle de température : la dessiccation est effectuée à l’étuve dans l’intervalle de température prescrit dans la monographie ;

• Sous vide poussé : la dessiccation est effectuée en présence de pentoxyde de diphosphore sous une pression inférieure à 0,1 kPa, à la température prescrite dans la monographie.

Si d’autres conditions sont prescrites, le procédé à utiliser est intégralement décrit dans la monographie.

Université de Montpellier Laboratoire de Pharmacognosiejpm2001.free.fr/gnosie/Poly TP 3eme A...

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