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DANIEL SAVOIE

UN NOUVEAU MODÈLE POUR L’ÉTUDE MULTIFONCTIONNELLE DES KÉRATINES

La lignée cellulaire épithéliale MGT499

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en Biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade maître ès sciences (M.Sc.)

FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

DÉCEMBRE 2004 © Daniel Savoie, 2004

Résumé

Les filaments intermédiaires (FIs) constituent, avec les microtubules et les microfilaments,

le cytosquelette. Les kératines (Ks) donnent des FIs hétérodimériques et constituent la

famille la plus diversifiée des protéines FIs. Les modèles in vitro utilisés dans les analyses

du rôle des FIs K8/K18 reposent principalement sur l’utilisation de cultures primaires

d’hépatocytes, isolés de souris de type sauvage ou dépourvues de la K8 ou K18, mais ces

cellules différenciées ne peuvent être établies en lignées. Le laboratoire d’accueil possède

une lignée cellulaire MT499cl8.3 (MGT) dépourvue du gène de la K8. Par ailleurs, une

lignée clonale (MGTK8) a été établie par infection de ces cellules avec un vecteur

rétroviral contenant un ADNc de la K8 humaine. Le but de mes travaux de maîtrise a donc

été de vérifier l’utilité de ces lignées MGT et MGTK8, comme modèles d’études

fonctionnelles de la K8 dans les cellules de l’épithélium simple. La première série de

résultats, découlant de l’analyse du phénotype, montre que la lignée MGT exprime les K7,

K18 et K19 à un faible niveau, tout en étant bien sûr dépourvue en K8. Par contre, la

réexpression du gène de la K8 entraîne une augmentation des K7, K18 et K19. Au plan

fonctionnel, ces lignées ont permis de vérifier la contribution des Ks lors de la réponse

apoptotique de cellules épithéliales suite à une stimulation du récepteur Fas, à leur activité

prolifératrice à la suite de l’ajout des facteurs de croissance, ainsi qu’au degré

d’interactions intercellulaires et cellule-substrat. De plus, les cellules MGT s’étalent plus

lentement, un retard associé à une activation différentielle des voies ERK et AKT. Enfin, la

K8 agit comme un modulateur de la motilité cellulaire. Ainsi, les lignées MGT et MGTK8

constituent un modèle de choix dans toute démarche expérimentale visant à cerner le

caractère multifonctionnel de la K8.

Remerciements

Je remercie sincèrement toutes les personnes qui m’ont encadré, encouragé et soutenu au

cours de mes études de maîtrise.

Mes remerciements s’adressent à mon directeur de recherche le Dr Normand Marceau, pour

m’avoir accueilli dans son laboratoire et m’avoir donné l’opportunité de poursuivre mes

études. Je le remercie pour ses conseils scientifiques judicieux, sa disponibilité, son appui

financier et la liberté d'action qu'il m'a laissée tout au long de ce projet. Je lui sais gré de la

confiance qu’il m’a accordée. Son sens de la perfection et sa grande exigence du travail

bien fait m’ont incité à réclamer le meilleur de moi-même. Je remercie particulièrement les

Dr Anne Loranger, Dr Stéphane Gilbert et Dr Luc Galarneau pour leurs connaissances

qu’ils ont partagées avec moi et qui ont contribué à mon cheminement scientifique. Je leur

suis tout particulièrement reconnaissant pour l’aide technique précieuse, le soutien, la

disponibilité et pour la lecture critique de ce mémoire.

J’aimerais aussi remercier les autres membres du laboratoire et du Centre de Recherche de

l’Hôtel-Dieu de Québec pour leur support technique et pour les contacts humains que nous

avons pu partager.

Enfin, je tiens à associer ma famille et toutes les personnes qui me sont proches à ce travail

afin de les remercier de m’avoir accompagné toutes ces années.

Table des matières

Table des matières ................................................................................................................ IV Liste des tableaux.................................................................................................................. VI Liste des figures ................................................................................................................... VII Liste des abréviations............................................................................................................ IX 1 Introduction...........................................................................................................................1

1.1 Le cytosquelette ............................................................................................................. 1 1.2 Les filaments intermédiaires.......................................................................................... 1 1.3 Les kératines .................................................................................................................. 4

1.3.1 L’expression des kératines...................................................................................... 4 1.3.2 Modifications posttraductionnelles......................................................................... 6 1.3.3 Interactions kératines-protéines .............................................................................. 7

1.4 Les fonctions des kératines ............................................................................................ 9 1.4.1 Protection contre le stress mécanique ................................................................... 10 1.4.2 Maintien de la polarité .......................................................................................... 10 1.4.3 Protection contre les stress chimiques .................................................................. 11 1.4.4 Résistance à l’apoptose ......................................................................................... 11 1.4.5 Pathologies............................................................................................................ 12

1.5 La motilité cellulaire.................................................................................................... 13 1.5.1 L’adhésion............................................................................................................. 13 1.5.2 La migration.......................................................................................................... 16

1.6 Modèles d’études pour les kératines 8 et 18 ................................................................ 19 1.6.1 L’hépatocyte de souris .......................................................................................... 19 1.6.2 La lignée MGT...................................................................................................... 19

1.7 Aperçu des travaux ...................................................................................................... 21 2 Matériel et méthodes...........................................................................................................22

2.1 Réactifs et anticorps..................................................................................................... 22 2.2 Culture cellulaire.......................................................................................................... 23 2.3 Production de clones stables MGTK8 et MGTTK ...................................................... 24 2.4 Essai de prolifération ................................................................................................... 25 2.5 RT-PCR PyMT et 14-3-3 (7 isoformes) ...................................................................... 26 2.6 Immunobuvardage ....................................................................................................... 26 2.7 Immunofluorescence.................................................................................................... 27 2.8 Essais d’adhésion et d’étalement ................................................................................. 28

V

2.9 Migration ..................................................................................................................... 30 2.10 Incorporation de BrdU............................................................................................... 30

3 Résultats .............................................................................................................................32 3.1 Caractérisation des lignées MGT et MGTK8.............................................................. 32

3.1.1 Caractérisation du contenu en FIs par immunobuvardage et par immunofluorescence ...................................................................................................... 32 3.1.2 Expression du PyMT............................................................................................. 35 3.1.3 Expression de la desmoplakine............................................................................. 36 3.1.3 Dépistage des 7 isoformes de la protéine 14-3-3 .................................................. 37 3.1.4 Essai de prolifération ............................................................................................ 38

3.2 Fonctions des kératines dans la réponse apoptotique .................................................. 39 3.3 Implication des kératines lors de l'adhésion et de l’étalement sur vitronectine........... 40

3.3.1 Efficacité de l’adhésion sur fibronectine et vitronectine ...................................... 40 3.3.2 Capacité d’étalement sur vitronectine................................................................... 42 3.3.3 Signalisation des kinases Akt et ERK lors de l’étalement sur vitronectine.......... 44

3.4 Implication des kératines lors de la migration ............................................................. 46 4 Discussion...........................................................................................................................53 5 Bibliographie ......................................................................................................................60

Liste des tableaux

Tableau 1 : Les différents types de protéines FIs et leur distribution cellulaire......................2 Tableau 2 : Résumé des diverses mutations nulles produites, pour les Ks, chez la

souris et leurs phénotypes ......................................................................................9 Tableau 3 : Caractéristiques des différents types d’adhésion cellulaire. ...............................15

Liste des figures

Figure 1 : Schéma général de la structure d’un dimère de protéines FI. ................................3 Figure 2 : Schéma de l’assemblage séquentiel d’un FI. .........................................................3 Figure 3 : Schéma représentant les Ks 8 et 18 et leurs sérines (Ser) pouvant être

phosphorylées. .......................................................................................................7 Figure 4 : Schéma des diverses possibilités d’agencement entre les 18 sous-unités α

et les 8 sous-unités β d’intégrines. .......................................................................14 Figure 5 : Étapes résumées de la production de la lignée MGT...........................................19 Figure 6 : Schéma résumant l’essai d’adhésion et d’étalement............................................29 Figure 7 : Contenu protéique en FIs. ....................................................................................32 Figure 8 : Distributions de différentes protéines FIs. ...........................................................34 Figure 9 : Présence du PyMT détectée au niveau de l’ARNm et de la protéine. .................35 Figure 10 : Distribution de la desmoplakine. .........................................................................36 Figure 11 : Amplicons des 7 isoformes de la protéine 14-3-3. ..............................................38 Figure 12 : Courbes de croissance..........................................................................................39 Figure 13 : Activation de la kinase ERK après simulation du FasR et le contenu de la

protéine c-FLIP. ...................................................................................................40 Figure 14 : Efficacité d'adhésion des lignées MGT et MGTK8.............................................41 Figure 15 : Incorporation du BrdU.........................................................................................42 Figure 16 : Contenu en intégrines. .........................................................................................43 Figure 17 : Différence d’étalement entre les lignées MGT et MGTK8. ................................44 Figure 18 : Signalisation des protéines Akt et ERK phosphorylées et la K8

phosphorylée sur la Ser432 suite à l’adhésion des lignées MGT et MGTK8................................................................................................................45

Figure 19 : Différence d’étalement entre les lignées MGT et MGTK8 en présence de PD. .......................................................................................................................47

Figure 20 : Différence d’étalement entre les lignées MGT et MGTK8 en présence de Wortmannin. ........................................................................................................47

Figure 21 : Différence de migration entre les lignées MGT et MGTK8................................48 Figure 22 : Analyses numériques de la différence de migration entre les lignées MGT

et MGTK8............................................................................................................49 Figure 23 : Comportement de la différence de migration entre les lignées MGT et

MGTK8................................................................................................................50 Figure 24 : Analyses numériques de la différence de migration de la lignée MGTK8

en présence de PD ou de Wortmannin.................................................................51

VIII

Figure 25 : Analyses numériques de la différence de migration de la lignée MGT en présence de PD ou de Wortmannin......................................................................51

Figure 26 : Comportement de la différence de migration entre les lignées MGT et MGTK8 en présence de PD. ................................................................................52

Liste des abréviations Arg arginine Asn asparagine BPAG1 antigène de la pemphigoïde bulleuse 1 BrdU bromodéoxyurine BSA « bovine serum albumin » CDK1 « cyclin dependent kinase 1 » (cdc2) c-Flip « cellular homolog of viral FLICE inhibitory protein » Cys cystéine E jour embryonnaire EBS « epidermolysis bullosa simplex » EGF « epidermal growth factor » EGFP « enhanced green fluorescent protein » ERK1/2 « extracellular signal-regulated kinase 1 et 2 » FAK « focal-adhesion kinase » FasR récepteur Fas FBS « fetal bovine serum » FIs filaments intermédiaires FN fibronectine GAPDH glyceraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase GEFs « guanine nucleotide exchange factors » GFAP protéine fibrillaire gliale acide Gly glycine His histidine HRPO « horse radish peroxidase » IGF-1 « insulin-like growth factor-1 » Ile isoleucine ILK « integrin-linked kinase » IRES séquence d’entrée interne ribosomale JNK « c-Jun N-terminal Kinase » kDa kiloDalton Ks kératines Leu leucine Lys lysine MAPK « mitogen-activated protein kinase » MEC matrice extracellulaire MetOH méthanol MFs microfilaments MGT lignée cellulaire MT499cl8.3 MLCK « myosin light chain kinase » MLCP « myosin light chain phosphatase » MMPs métalloprotéinases de la matrice MMTV « mouse mammary tumor virus » MTs microtubules NF neurofilaments

X

PAK « p21-activated kinase » PC pachyonychia congenital PCR « polymerase chain reaction » PDGF « platelet-derived growth factor » PDK1 « 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 » PI-3,4-P2 phosphatidylinositol-3,4- bisphosphate PI3K phosphatidyle inositol 3’ phosphate kinase PIP3 phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate PIX « PAK-interacting exchange factor » PLK « paxillin–kinase linker » PyMT oncogène moyen T PyV virus polyôme Rho GTPases « guanosine triphosphate (GTP)-binding proteins » RT-PCR « reverse-transcription polymerase chain reaction » SDS-PAGE électrophorèse sur gel de polyacrylamide Ser sérine SNC/P système nerveux central/périphérique TK thymidine kinase TNF « tumor necrosis factor » tPA « tissu-type plasminogen activator » Tyr tyrosine uPA « urokinase-type plasminogen activator » Val valine VEGF « vascular endothelial growth factor » VN vitronectine WSN « white-sponge nevus »

1 Introduction

1.1 Le cytosquelette

Les filaments intermédiaires (FIs) forment, avec les microtubules (MTs) et les

microfilaments (MFs) d’actine, les différentes architectures du cytosquelette. La

classification des divers éléments du cytosquelette est basée sur le mode d’assemblage en

filaments et le diamètre de ceux-ci. En terme de diamètre, les FIs (10-15 nm) se situent entre

les MTs (25 nm) et les MFs (3-7 nm). Les MTs ont la forme de tubulures constituées de

colonnes de 13 molécules de tubulines α et β. Les MFs sont formés de polymères d'actine en

hélice-α et les FIs se polymérisent en superhélice. Sur l’échelle évolutive, les FIs sont

beaucoup plus récents comparativement aux MTs et aux MFs et, sont absents chez les

eucaryotes inférieurs. Les FIs se distinguent aussi par leur capacité à former spontanément

des filaments apolaires, sans l’aide de protéines accessoires. Les MTs, les MFs et les FIs

jouent tous un rôle dans le maintien de la forme de la cellule, l'organisation des structures

internes et la motilité. Ces éléments structuraux entretiennent aussi des fonctions distinctes,

mais qui souvent sont synergiques. Les MTs sont impliqués dans la polarisation des cellules

et les MFs contrôlent l’organisation spatiale nécessaire à la migration. Les FIs influencent

également la motilité cellulaire, un point qui est discuté en détail plus loin. Dans le présent

travail, il est question des kératines (Ks), une famille protéique qui compose les FIs, et de

l’application de leurs fonctions dans un nouveau modèle épithélial.

1.2 Les filaments intermédiaires

Plus de 67 gènes différents codent pour des protéines FIs distinctes. Les FIs sont regroupés

en cinq types majeurs (I à V) selon le degré d’homologie de leur hélice α centrale et de leur

capacité à former des filaments (Tableau 1).

2

Types Noms Distribution I Kératine (acide) Épithéliale II Kératine (basique) Épithéliale

Vimentine Mésenchymale Desmine Musculaire GFAP Astrocytaire/Gliale Périférine Neurones du SNP

III

Syncoiline Musculaire NF-L Neurones du SNC NF-M Neurones du SNC NF-H Neurones du SNC IV Α-internexine Neurones du SNC Lamine A/C Nucléaire Lamine β1 Nucléaire V Lamine β2 Nucléaire

Tableau 1 : Les différents types de protéines FIs et leur distribution cellulaire (SNC/P : système nerveux central/périphérique; NF : neuraux filaments). (Adapté de Coulombe PA et al., 2001)

Les Ks de types I et II représentent la famille la plus diversifiée des FIs. Le type III englobe

entre autres la vimentine, la desmine et la protéine fibrillaire gliale acide (GFAP). Les

neurofilaments et les lamines sont respectivement de type IV et de type V. Les MTs et les

MFs sont ubiquitaires, tandis que les différents types de FIs sont spécifiques à un ou

plusieurs types cellulaires. Alors que les Ks s’expriment exclusivement dans les épithéliums,

l’expression de la vimentine est très hétérogène et les lamines constituent la charpente de

tous les noyaux des eucaryotes. Les membres de la famille FIs ont en commun leur structure

et leur capacité à former spontanément des filaments apolaires de 10-15 nm de diamètre. Au

plan structural, les FIs sont formés d’une tige centrale, en hélice α, composée de quatre

sous-domaines (1A, 1B, 2A et 2B), reliés entre eux par les portions L1, L12 et L2 (Figure 1).

3

Figure 1 : Schéma général de la structure d’un dimère de protéines FIs. Les diverses portions de l’hélice α sont représentées (1A, 1B, 2A et 2B; L1 et L2). (Adapté de Strelkov SV et al., 2000)

Figure 2 : Schéma de l’assemblage séquentiel d’un FI.

L’hélice α est très conservée et responsable de l’homo- ou de l’hétéro-dimérisation des

protéines FIs et de leur assemblage subséquent en filaments. La tige centrale est flanquée à

ses extrémités de parties NH- et -COOH terminales globulaires, moins conservées et

4

responsables de l’hétérogénéité des différents types de protéines FIs. (Fuchs E et Weber K,

1994; Fuchs E et Cleveland DW, 1998; Erber A et al., 1998; Hermann H et Aebi U, 2000;

Coulombe PA et al., 2001). In vivo, l’unité primaire d’un FI est une sous-unité tétramérique

soluble formée des deux superhélices. Huit tétramères s’assemblent latéralement créant ainsi

l’unité primaire du filament. Ces unités primaires fibreuses s’organisent longitudinalement

pour donner des filaments insolubles avec un diamètre de 10 nm (Figure 2) (Herrmann H et

Aebi U, 2000 ).

1.3 Les kératines

Les Ks, encodées par plus de 49 gènes fonctionnels, sont des éléments structuraux majeurs

des cellules épithéliales. Chaque gène code pour une protéine unique dont la classification

est basée sur l’ordre de leur migration, dans un gel de polyacrylamide en deux dimensions.

Les gènes des Ks de type I acides (PI<6) (K9–K23; Ha1–Ha8) sont tous distribués l’un près

de l’autre, à l’exception du gène de la K18, sur le chromosome 17. Les gènes des Ks de type

II basique (PI>6) (K1–K8; Hb1–Hb6) sont regroupés sur le chromosome 12. Les protéines

d’un type s’associent obligatoirement avec l’autre type et forment, par assemblage

subséquent, des filaments hétérodimériques. Donc, pour qu’une cellule puisse produire des

filaments de Ks, elle doit exprimer au moins une kératine de type I et une de type II (Hesse

M et al., 2001). Les Ks 1 à 20 sont dites molles alors que les kératines Ha et Hb, qui forment

les cheveux et les ongles, sont dites dures (Coulombe PA et Omary MB, 2002).

1.3.1 L’expression des kératines

Le profil d'agencement et de combinaison des diverses kératines définit les différents

épithéliums simples et complexes, selon leur stade de différenciation. Cette diversité

d’expression et de couplage est indicatrice de fonctions spécialisées et complémentaires de

la part des kératines au sein des cellules.

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L'épithélium simple est la première structure reconnaissable au moment de l'embryogenèse.

Le couple K8/K18 y est présent avant toutes autres Ks et il s’exprime en permanence dans

l’épithélium simple tout au long de la différenciation. Lors de la différenciation de divers

épithéliums simples, les cellules peuvent acquérir les kératines 7, 19 et 20. La K7 se retrouve

au niveau de plusieurs glandes et épithéliums internes (Smith FJ et al., 2002). La K20

s’exprime dans les cellules gastro-intestinales, l’urothélium et les cellules endocrines (Moll

R et al., 1992). La K19 est une kératine avec une courte queue C-terminale (Bader BL et al.,

1986), ce qui compromet sûrement sa capacité à former des filaments (Lu X et Lane EB,

1990). Elle s’exprime dans les épithéliums simples en cours de différenciation, au niveau du

follicule pileux et des glandes mammaires (Bartek J et al., 1985; Lane EB et al., 1985;

Stasiak PC et al., 1989).

Dans le foie, les hépatocytes n’expriment que la paire K8/K18, alors que les cellules des

ductules biliaires expriment la K7, K8, K19 et K20 (Marceau N et Loranger A, 1995). Au

niveau de l’épiderme squameux stratifié de la peau, les cellules de la couche basale

expriment la paire K8/K18. La couche spineuse infrabasale de l’épithélium stratifié se

compose des K5/K14 et, lorsque qu’on remonte vers la couche spineuse suprabasale, il y un

remplacement graduel des K5/K14 par la paire K1/K10. De plus, la K2e se rajoute au niveau

de la couche granuleuse (Roop DR et al., 1987). Ces deux exemples montrent bien qu’au

sein d’un même tissu, les différentes cellules qui le composent expriment diverses paires de

Ks et ont des fonctions différentes.

Les cellules épithéliales sont des constituants spécialisés de nombreux organes. Les cellules

de l'épithélium simple forment une monocouche cellulaire très polarisée créant une barrière

sélective avec le tissu (intestins, pancréas, foie, reins et autres types de glandes) qu'elles

enveloppent. La barrière que procure l’épithélium simple permet un échange bidirectionnel

sélectif (absorption et sécrétion) entre la lumière et le tissu, alors que l’épithélium stratifié

est une barrière physique imperméable. L'épithélium simple est maintenu en place par des

jonctions cellule-cellule et cellule-substrat. Les régions apicales et basolatérales sont

séparées par les jonctions serrées, les jonctions adhérentes et les desmosomes. Ces éléments

lient les cellules de la monocouche entre elles. Les jonctions adhérentes et les desmosomes

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permettent à l’épithélium simple de maintenir une polarité et, les jonctions serrées

imperméabilisent l’espace intercellulaire et permettent d’acquérir la fonction de barrière

sélective. Les MFs et les FIs de kératines lient, respectivement, les jonctions serrées et les

desmosomes. Les desmosomes sont si caractéristiques des cellules épithéliales que leur

présence dans les tumeurs malignes peu différenciées est un marqueur de leur origine

épithéliale. Les jonctions cellule-substrat sont entretenues par les intégrines qui attachent les

cellules à la matrice extracellulaire (MEC) (Jamora C et Fuchs E, 2002). En plus d’adhérer

les cellules à la MEC, les intégrines assurent d’autres fonctions biologiques cruciales, qui

incluent la migration, la prolifération, l’embryogenèse, la survie, la cicatrisation de blessure

et le pouvoir métastatique des tumeurs (Juliano RL, 2002).

1.3.2 Modifications posttraductionnelles

La malléabilité du réseau de kératines est due, en partie, au contenu en acides aminés dont la

charge peut être modifiée. Une modification de ces acides aminés influencera la capacité des

kératines à former des filaments. Ainsi, des cycles de phosphorylation et de

déphosphorylation modulent la solubilité des kératines et d’autres FIs. Dans la cellule, une

portion minime des kératines (5 %) est sous forme soluble tétramérique. La majorité est

intégrée dans ce réseau filamenteux viscoélastique qui s’étend dans tout le cytoplasme et qui

forme la portion insoluble des kératines. Une hyperphosphorylation des kératines déplace

l’équilibre de la portion insoluble polymérisée vers l’état soluble dépolymérisé, tel qu’au

moment de la phase G2/M du cycle cellulaire (Chou C-F et Omary MB, 1993). Les sites

majeurs de la phosphorylation des K8/K18 sont des sérines (Ser) situées dans les portions

globulaires. Les Ser24, 74 et 432 sont les sites de phosphorylation connus de la K8 et les

Ser34 et 53 sont ceux de la K18 (Figure 3). D’autres modifications posttraductionnelles ont

été décrites, telles que la glycosylation et l’acétylation, mais aucun rôle ne leur est encore

connu (Omary MB, 1998). La phosphorylation des Ks se fait par des kinases, telles que p38

et la protéine « extracellular signal-regulated kinase 1 et 2 » (ERK1/2). La stimulation du

récepteur à l’« epidermal growth factor » (EGF, EGFR) active ERK1/2 qui peut

phosphoryler directement la Ser432 de la K8. (Baribault H et al., 1989; Ku NO et Omary

MB, 1997; Ku NO et al., 2002). En plus de moduler leur solubilité, la phosphorylation des

7

Ks modifie aussi leur interaction avec d’autres protéines. Lorsque la K18 est phosphorylée

sur Ser34 (et un autre site encore inconnu), elle se lie à la protéine 14-3-3 (Ku NO et al.,

1998).

Figure 3 : Schéma représentant les Ks 8 et 18 et leurs sérines (Ser) pouvant être phosphorylées.

1.3.3 Interactions kératines-protéines

Même si aucune protéine accessoire n’est nécessaire à leur polymérisation, les Ks peuvent

interagir avec plusieurs protéines. Dans les kératinocytes de l’épithélium stratifié, la

filaggrine et la trichohyaline sont deux protéines identifiées qui joueraient un rôle sur

l'organisation du réseau de FIs. La filaggrine est une petite protéine très chargée contenant

de courtes séquences répétées qui fait le pont entre la kératine et la vimentine. La

trychohyaline est une grosse molécule contenue dans les granules de trichohyalin des

kératinocytes. Lorsque les kératinocytes ont atteint un stade avancé de différenciation, par

exemple au niveau de la langue et du follicule pileux, la trychohyaline est libérée et permet

la formation de fagots parallèles de Ks (Mack JW, et al., 1993; Dale BA et al., 1978; Lee SC

et al., 1993). Une autre famille de protéines, les plakines, relie les FIs aux MFs, aux MTs

et/ou à des complexes d’adhésions.

Les plakines, incluant l’antigène de la pemphigoïde bulleuse 1 (BPAG1), la desmoplakine,

la plectine, la périplakine et l’envoplakine, forment une famille de protéines cytoplasmiques

servant de lien entre la membrane et le réseau de FIs pour maintenir l’intégrité des tissus.

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Les plakines lient les FIs via leur extrémité globulaire COOH-terminale, et sont exprimées

plus particulièrement dans les tissus épithéliaux et musculaires subissant un stress

mécanique. La desmoplakine, en forme d’haltère, est une composante essentielle du

desmosome mature. Les desmosomes sont des jonctions intercellulaires assurant une forte

cohésion mécanique entre deux cellules épithéliales. La périplakine et l’envoplakine peuvent

aussi composer le desmosome mais dans des tissus autres que l’épithélium simple (Leung

CL et al., 2002). Les hémidesmosomes sont identiques aux desmosomes à l’exception qu'ils

relient la cellule à sa MEC par l’intermédiaire des intégrines α6β4. L’isoforme BPAG1e est

une composante cytoplasmique de l’hémidesmosome des cellules épithéliales qui relie, tout

comme la desmoplakine, les FIs aux hémidesmosomes. L’absence de BPAG1e ne modifie

pas la croissance ni l’adhésion des cellules épithéliales, mais les FIs étant incapables de se

lier aux hémidesmosomes, l’intégrité ainsi que la motilité des cellules sont affectées (Guo L

et al., 1995). Finalement, la plectine, la plus versatile et ubiquitaire des protéines

connectrices, se retrouve dans les desmosomes, les hémidesmosomes et les contacts focaux

(Steinbock FA et Wiche G, 1999). La desmoplakine peut lier diverses Ks (ex : K5/K14 et

K8/K18) et la vimentine. (Stappenbeck TS et al., 1993; Kouklis PD et al., 1994; Meng JJ et

al., 1997). La BPAG1e colocalise avec les Ks (Yang Y et al., 1996; Leung CL et al., 1999).

Plusieurs protéines FIs, dont les Ks, la desmine, les neurofilaments, la GFAP et la

vimentine, interagissent avec la plectine (Foisner R et al., 1988; Wiche G et al., 1993;

Nikolic B et al., 1996; Steinbock FA et al., 2000). La plectine ne se lie pas qu’aux FIs, elle

peut aussi faire le pont entre les FIs et les MTs et/ou les MFs. Seules les plakines, plectines

et desmoplakines sont présentes dans les cellules de l’épithélium simple, telles que

l’hépatocyte, alors qu’une cellule comme le kératinocyte peut toutes les contenir.

D’autres protéines peuvent aussi se lier aux FIs, sans toutefois affecter leur organisation.

Plusieurs d’entre elles sont des protéines impliquées dans une ou plusieurs réponses

signalétiques. À part la 14-3-3, qui a déjà été nommée, les Ks peuvent se lier directement

entre elles; au récepteur du « tumor necrosis factor » (TNF) de type 2 (TNF-RII) (Caulin C,

et al., 2000), la protéine kinase C γ (Ku NO, et al., 1999), la « c-Jun N-terminal Kinase »

(JNK) (He T, et al., 2002), l’ARN polymérase II (Bruno T, et al., 1999) et les chaperones

HSP70 et HSP27 (Ku NO et al., 1999; Perng MD, et al., 1999). Il y a même de bonnes

9

évidences comme quoi les Ks peuvent interagir directement et débuter leur polymérisation

sur les MFs (Weber KL et Bement WM, 2002).

1.4 Les fonctions des kératines

L’avènement des souris mutantes pour les Ks a ouvert de nouvelles voies d’étude de leurs

fonctions. L’inactivation ciblée des gènes Ks a permis de mettre en lumière l’importance

fonctionnelle de ces protéines FIs; certaines auraient des fonctions redondantes alors que

d’autres auraient des fonctions centrales (Tableau 2) (Coulombe PA et Omary MB, 2002).

Types Gène(s)

inactivé(s) Phénotypes Commentaires

II K4b Faible lyse de la muqueuse orale

Induction compensatoire de la K6, WSN partiel

K5 Fragilité excessive de la peau et mort

Les souris survivent que quelques heures à cause du EBS

K6α Non apparent Compensé par la K6β

K6α,K6β (double)

Fragilité excessive de la muqueuse orale et mort

Les souris ne survivent moins de 10 jours, PC partielle

K8 Embryoléthale (C57Bl/6) Avortement spontané ?

Hyperplasie colorectale,

colite, faible dommage au foie (FVB/N)

Phénotype est dépendant de la lignée de souris

K10 Non apparent Compensé par la K14 I K12 Érosion de la cornée Apparenté au syndrome de Meesman’s

K14 Fragilité excessive de la peau et mort

Les souris ne survivent que 3-4 jours à cause du EBS, phénotype moins sévère que les K5 nulles

K17 Fragilité du poil et anomalie du follicule pileux

Compensé par K16/K14, PC partielle

K18 Pathologies tardives du foie Production de corps de Mallory dans le foie, fonctions différentes pour la K8 et la K18

K19 Non apparent Compensation apparente par la K18 et la K20

K18, K19 (double)

Embryoléthale (E9.5) Avortement spontané ?, la plus sévère des mutations nulles

I/II K19 et K8 Embryoléthale (E10) Avortement spontané ?, similaire aux K18/K19 nulles

Tableau 2 : Résumé des diverses mutations nulles produites, pour les Ks, chez la souris et leurs phénotypes (E, jour embryonnaire; EBS, « epidermolysis bullosa simplex »; PC, pachyonychia congenita; WSN, « white-sponge nevus »). (Adapté de Coulombe PA et Omary MB, 2002)

10

1.4.1 Protection contre le stress mécanique

Le rôle mécanique des kératines au niveau des épithéliums stratifiés est bien établi. Plusieurs

maladies affectant l’épiderme sont dues à des mutations génétiques dans les kératines dont

l’épidermolysis bullosa simplex (EBS). Cette maladie a été la première à être associée à des

mutations sur les Ks (K5 et K14). La maladie se traduit par une fragilité excessive de la peau

à tout contact physique (Bonifas JM, et al., 1991). Le stress infligé lors de la parturition des

souris déficientes pour la K5 ou la K14 est fatal. Ces souris ne vivent que quelques heures

ou quelques jours après la naissance (Lloyd C et al., 1995; Peters B et al., 2001). D’autres

modèles épithéliaux simples et complexes, provenant de souris nulles ou de cellules

contenant un dominant négatif de K, donc déficients d’un réseau de Ks intact, ont aussi

démontré une faiblesse face aux forces de cisaillement (Takahashi K et al., 1999). Par

exemple, les dommages créés par une pression de perfusion sur les hépatocytes de souris

K8-/- sont plus importants que sur leurs congénères sauvages (Loranger A et al., 1997).

Bien qu'au niveau de l'épithélium simple les kératines apportent une certaine rigidité à la

cellule épithéliale face aux stress mécaniques, ce rôle n’a pas le même caractère significatif

que celui fourni dans l’épiderme stratifié. Les rôles émergeants des Ks dans l’épithélium

simple semblent influencer la polarité des cellules, la résistance à divers stress chimiques, la

réponse cellulaire à une stimulation apoptotique et certaines pathologies.

1.4.2 Maintien de la polarité

Le maintien la polarité des cellules de l'épithélium simple est primordial à la réalisation de

leurs fonctions. Les rôles que les Ks exercent sur la polarité sont encore mal définis même si

les Ks interagissent avec des protéines donnant une polarité aux cellules, mais il est connu

qu’en l’absence de K8, certains marqueurs apicaux des cellules de l’intestin et des

hépatocytes ne sont pas présents (Ameen NA et al., 2001).

11

1.4.3 Protection contre les stress chimiques

De nos jours, les humains sont exposés à plusieurs produits chimiques et les études reliées

au phénomène sont donc pertinentes. Les Ks ont démontré leur rôle en diminuant les

dommages causés par des stress chimiques. Avec des souris exprimant une K18 humaine

(Arg89 → Cys) et des souris mutantes K8 -/-, les laboratoires des Drs. Omary et Cadrin ont

observé, dans les hépatocytes, une plus grande sensibilité face à des agents oxydatifs

(griséofulvine et acétaminophène) (Cadrin M et al., 1996; Ku N et al., 1996). De plus, la

survie des souris K8 -/- après hépatectomie partielle est inférieure à celle des souris

sauvages, sous anesthésie au phénobarbital (Loranger A et al., 1997). Des agents

anticancéreux ont aussi démontré une plus faible efficacité sur des cellules exprimant des Ks

(Bauman PA et al., 1994; Anderson JM et al., 1996).

1.4.4 Résistance à l’apoptose

Les Ks possèdent un rôle dans l’initiation et l’exécution de l’apoptose. Lors de l'apoptose,

les caspases déstabilisent précocement le réseau de K par le clivage des Ks de type I. Les

Ks 18 et 19 sont hyperphosphorylées et clivées en deux fragments stables

(K18 → 29kDa/23kDa; K19 → 28kDa/20kDa) par les caspases (Caulin C et al., 1997; Ku

NO et al., 1997). Un dernier clivage phospho-indépendant de la K18 dans la portion L1-2 se

produit avec la caspase 6 (Schutte B et al., 2004). Le morcellement et l’agrégation du réseau

de FIs de K semblent faciliter la fragmentation cellulaire.

En plus d’être une cible pour les caspases, les K8/K18 jouent aussi un rôle dans la réponse à

l’apoptose. La présence de la paire K8/K18 désensibilise la signalisation pro apoptotique des

cellules, en réponse à une stimulation du TNF-R (Caulin C et al., 2000) et du récepteur Fas

(FasR) (Gilbert S et al., 2001). Sans Ks, les hépatocytes de souris K8 -/- sont plus sensibles

à l’apoptose déclenchée par l’activation du FasR. Plusieurs éléments sont perturbés par

l’absence de K8/K18 dans l’hépatocyte, dont une plus grande accumulation du FasR à leur

12

surface (Gilbert S et al., 2001), un niveau de c-Flip insuffisant et une signalisation anti-

apoptotique diminuée (Gilbert S et al., 2004).

1.4.5 Pathologies

L’étude des fonctions des Ks chez l’humain a aussi permis de découvrir plusieurs mutations

qui semblent être associées à diverses maladies autres que celles affectant la peau. Des

mutations sur le gène de la K8 (Gly62→Cys, Ile63→Val et Lys464→Asn) sont associées à

des patients souffrant de maladies inflammatoires du système digestif (Owens DW, 2004) et

d’autres sont associées à des patients souffrant de cirrhoses cryptogéniques (Tyr54→His,

Gly62→Cys et His128→Leu) (Ku NO, 2003).

Le tissu épithélial est à l’origine d’environ 80 % des cancers humains, du fait que ce dernier

est régulièrement en contact avec des agents mutagènes, ce qui sollicite la division pour

remplacer les cellules endommagées. Les Ks 8, 18 et 19 sont exprimées dans plusieurs types

de carcinomes dont ceux du sein, de la prostate, du poumon, du côlon et des ovaires.

Certaines tumeurs peuvent même exprimer de novo ces Ks. La mort nécrotique et

apoptotique des tumeurs largue dans la circulation générale, par un mécanisme encore

inconnu, des fragments des Ks clivés par les caspases. Ces fragments servent alors de

marqueurs tumoraux et permettent d’évaluer même la progression clinique des tumeurs (van

Dalen A, 1996; Stigbrand T, 2001). Il a même été démontré que le type de fragment (K18)

largué dans la circulation pouvait distinguer entre une mort nécrotique ou apoptotique des

cellules tumorales et ainsi permettrait un meilleur suivi de l’état des traitements anti-

cancéreux (Gero K et al., 2004).

Même sans domaine transmembranaire, la K8 peut lier le plasminogène. Certaines cellules

telles que les hépatocytes, les hépatocarcinomes et plusieurs lignées cellulaires de

carcinomes mammaires peuvent exprimer la K8 à leur surface membranaire. Cette dernière,

tout comme la K18, peut lier un activateur du plasminogène, le « tissu-type plasminogen

activator » (tPA). Le tPA ainsi que l’« urokinase-type plasminogen activator » (uPA)

13

activent le plasminogène en le transformant en plasmine. L’uPA est souvent plus fortement

exprimé dans les cellules tumorales. Une fois le plasminogène clivé en plasmine, il active la

fibrinogénolyse, la dégradation des glycoprotéines de la MEC et l’activation des

métalloprotéinases de la matrice (MMPs) qui elles aussi modifient la MEC. Le remodelage

de la MEC induit la migration et l’invasion cellulaire des tissus. Cet événement a été

démontré comme étant important lors de la progression métastatique, du remodèlement

vasculaire, de la cicatrisation et de la régénération du foie (Gonias SL et al., 2001). Ainsi,

l’expression de fragments de la K8 à la surface des cellules semble augmenter la motilité de

celles-ci.

De plus, les Ks semblent moduler le phénotype cancéreux. Plusieurs tumeurs émergeant de

tissus autres que l’épithélium simple réexpriment les K8/K18. La cotransfection des K8 et

K18 dans les cellules L augmente leur caractère invasif (Chu YM et al., 1993) et leur

procure une meilleure résistance à plusieurs agents chimiothérapeutiques (Bauman PA et al.,

1994; Anderson JM et al., 1996). La coexpression de la vimentine et de la paire K8/K18,

semble aussi augmenter le potentiel métastatique des cellules cancéreuses. La cotransfection

stable de la vimentine et des Ks 8 et 18 dans des mélanomes augmente de deux à trois fois le

pouvoir invasif et migratoire des cellules (Chu YM et al., 1996).

1.5 La motilité cellulaire

La motilité cellulaire est un processus dynamique très complexe impliquant une multitude de

protéines aux fonctions diverses telles que la structure, l’adhésion, la polarisation et la

signalisation qui gouvernent des phénomènes, tels l’embryogenèse, la réparation des tissus

et la cancérogenèse.

1.5.1 L’adhésion

L’adhésion cellulaire à la MEC est maintenue uniquement par diverses protéines

transmembranaires, nommées intégrines. Les intégrines sont des récepteurs

14

hétérodimériques composés d’une sous-unité α et d’une sous-unité β. La famille des

intégrines regroupe 25 paires hétérodimériques formées d’une des 18 sous-unités α et d’une

des 8 sous-unités β. Chaque paire a une affinité différente pour un ou plusieurs ligands qui

composent la MEC. Par exemple, l’intégrine αvβ3 lie préférentiellement la vitronectine

(VN), mais elle peut aussi lier la fibronectine (FN), le facteur von Willebrand, le

fibrinogène, le collagène et la laminine, alors que l’intégrine α5β1 ne lie que la FN

(Figure 4) (van der Flier A et Sonnenberg A, 2001).

Figure 4 : Schéma des diverses possibilités d’agencement entre les 18 sousunités α et les 8 sousunités β d’intégrines. Les différents substrats associés à chaque paire sont représentés par des barres de couleurs : les séquences RGD (fibronectine, vitronectine, facteur von Willebrand, …) sont en bleu, la laminine est en rouge, le collagène est en rose et les différents récepteurs des leucocytes sont en noir. (Adapté de Hynes RO, 2002)

Suite à la liaison des intégrines à leurs ligands, elles s’agglomèrent et recrutent des protéines

telles que l’α-actinine, la vinculine, la tensine et la paxilline pour ainsi former et renforcer

les contacts focaux liant le cytosquelette aux intégrines (Sastry SK et Burridge K, 2000).

15

Trois types de contacts focaux ont été décrits et leurs caractéristiques sont résumées dans le

tableau 3.

Propriétés Complexes Focaux Adhésions Focales Adhésions Fibrillaires Localisation Bord du lamellipode Péripherie Au centre de la celluleMorphologie Ponctiforme Oblongue Fibrillaire Dimension 1 µm 2–5 µm Variable: 1–10 µmProtéines associées

Paxilline, Vinculine, Protéines p-Tyr

Intégrine αv , Paxilline, Vinculine, α-actinine, Taline, FAK, Protéines p-Tyr

Intégrine α5, Tensine

Induit par Rac Rho Rho (?) Tableau 3 : Caractéristiques des différents types d’adhésion cellulaire. (Adapté de Geiger B et al., 2001)

L’adhérence et l’agrégation des intégrines au substrat initient l’activation de multiples voies

de signalisation dépendantes des protéines kinases et des petites Rho GTPases (« guanosine

triphosphate (GTP)-binding proteins »), et modifient la synthèse des phospholipides. Ces

modifications signalétiques réglemente la réorganisation du cytosquelette, l’étalement, la

migration, la différenciation, la survie et la division cellulaire (Geiger B et al., 2001).

Parmi les voies de signalisation prenant naissance aux foyers d’adhésion, les plus étudiées

sont celles qui impliquent la « focal-adhesion kinase » (FAK) et/ou l’« integrin-linked

kinase » (ILK). La phosphorylation sur des résidus tyrosine de FAK, après

autophosphorylation des intégrines, est un événement important lors de l’activation du

complexe Ras-MAPK. L’activation de FAK entraîne, entre autres l’activation de ERK, un

important régulateur de la prolifération, de la survie et de la migration (Howe AK et al.,

2002). L’activation d’ILK influence plusieurs composantes signalétiques dont la principale

est Akt (ou PKB) (Yoganathan TN et al., 2000). FAK est aussi impliquée dans l’activation

d’Akt par sa liaison à la sous-unité p85α de la PI3K (phosphatidyle inositol 3’ phosphate

kinase).

Akt est une kinase dite pro survie qui, lorsque phosphorylée sur ses résidus Ser473 et

Thr308, réglemente en aval des composantes des voies apoptotiques et prolifératives. Akt

16

stimule la progression du cycle cellulaire alors qu’elle réglemente négativement l’apoptose

en phosphorylant des protéines pro apoptotiques, tel Bad, les facteurs de transcription

Forkhead et p27(kip1) (Franke TF, et al., 2003). Plusieurs signaux extracellulaires peuvent

activer Akt, dont plusieurs facteurs de croissance, tels que le « platelet-derived growth

factor » (PDGF) (Lymn JS, et al., 2003), le « vascular endothelial growth factor » (VEGF)

(Gerber, H.-P., et al., 1998) et l’« insulin-like growth factor-1 » (IGF-1) (Adachi M et al.,

2003), ainsi que le stress oxydatif (Blanc A et al., 2002), les forces de cisaillements

(Dimmeler S et al., 1998) et le couplage d’intégrines (Attwell S et al., 2003).

Lorsqu’un récepteur est actif, tel les intégrines couplées à la MEC, il y a activation de la

PI3K. La PI3K phosphoryle ensuite les phosphoinositides, phosphatidylinositol

3,4,5-trisphosphate (PIP3) et phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate (PI-3,4-P2), qui

recrutent et stimulent la « 3-phosphoinositide-dependent protein kinases 1 » (PDK1) (Franke

TF et al., 1997). PDK1 phosphoryle spécifiquement la Ser308 d’Akt et permet alors la

phosphorylation de la Thr473. La phosphorylation de la Thr473 lors de l’adhésion se fait par

ILK, dont l’activation est aussi dépendante de la PI3K (Franke TF et al., 2003).

L’activation des voies de signalisation peut aussi se faire indirectement par l’action des

intégrines sur les récepteurs (« Intégrine cross-talk »). Les intégrines peuvent : (1)

transactiver un récepteur; (2) coordonner l’action de deux ou plusieurs récepteurs; (3) agir

positivement ou négativement sur la stimulation d’un récepteur; (4) moduler l’expression du

récepteur et finalement; (5) moduler la compartimentalisation du récepteur (Miranti CK et

Brugge JS, 2002).

1.5.2 La migration

La migration peut être vue comme un mécanisme cyclique où une cellule doit tendre sa

membrane dans la direction de l'attractant puis s'attacher à un substrat, tandis qu’à l'opposé,

elle doit défaire les liens qui la retiennent à l'arrière, et ainsi de suite. Une cellule épithéliale

en migration est caractérisée par une perte des fibres de stress, par une augmentation du

17

réseau d’actine corticale et par des adhésions focales moins marquées. Avant de pouvoir

migrer, une cellule doit se polariser latéralement; la distribution interne est modifiée, avec

une distinction nette entre l’avant et l’arrière, le noyau étant très souvent localisé dans la

partie postérieure de la cellule. La polarisation de la cellule dépend, entre autres, des MTs.

La perturbation des MTs n’affecte pas tous les types cellulaires de la même manière.

Généralement, sans un réseau de MTs intact, les cellules vont se contracter sur elles-mêmes

et la migration sera bloquée ou sévèrement ralentie (Small JV et al., 2002). Une cellule en

processus de migration peut produire trois types d’extensions membranaires. La cellule peut

tendre un front large et/ou de longues extensions minces, appelés respectivement les

lamellipodes et les filopodes. Certaines extensions peuvent être très courtes, celles-ci sont

des microfilopodes ou « microspikes ». Ces extensions sont toutes dépendantes de la

polymérisation et de la stabilisation de l’actine. La manière dont l’actine se polymérise

définit le type d’extension. Cette polymérisation d'actine est étroitement réglementée par des

voies de signalisation qui, à leur tour, sont dépendantes de l'adhérence cellulaire et des

facteurs de croissance. Dans les lamellipodes, l’actine se distribue de manière dendritique

près de la membrane, alors qu’elle se polymérise en faisceau dans les filopodes (Ridley AJ

et al., 2003).

La famille des petites Rho GTPases joue un rôle central au niveau de l’organisation et de la

formation des lamellipodes et filopodes. Activées lors de leur liaison au GTP par des

« guanine nucleotide exchange factors » (GEFs), ces GTPases agissent sur des protéines

kinases, sur des enzymes modificatrices des lipides et sur le complexe Arp2/3. Les Rho

GTPases, Rac, Cdc42 et RhoG sont nécessaires à l’extension des lamellipodes et des

filopodes (Etienne-Manneville S et Hall A, 2002). La polymérisation de l’actine dans les

lamellipodes et les filopodes est sous le contrôle du complexe Arp2/3. L’activation du

complexe Arp2/3, par Cdc42 et Rac, se fait respectivement par l’intermédiaire des protéines

N-WASP et WAVE.

La protéine Rac est responsable de la formation des lamellipodes. Activé, le complexe

Arp2/3 se lie au bout et sur le bord du filament d’actine primaire et induit l’arborescence de

nouveaux filaments secondaires. De plus, Rac active la kinase LIM qui, à son tour,

18

phosphoryle la cofiline facilitant ainsi la dépolymérisation de l’actine. Suite à l’inactivation

de la cofiline, les filaments d’actine peuvent s’allonger. RhoG est un activateur en aval de

Rac. Cdc42 est responsable de la nucléation de filaments d’actine dans les filopodes. Cdc42

active N-WASP qui, à son tour, active le complexe Arp2/3 provoquant ainsi une

augmentation de la nucléation des filaments d’actine. La stimulation des protéines

WAVE/WASP peut aussi être réglementée par d’autres protéines telles que des kinases de la

famille Src, des protéines adaptatrices Nck et WIP et, des phosphoinositides. Grb2 est un

autre exemple de protéine qui peut se coordonner avec Cdc42 dans le but de tirer une

activation maximale de N-WASP.

La RhoA, une autre petite Rho GTPase, est responsable de la formation des contacts focaux

qui sont suivis par la formation des faisceaux d’actine contractiles, les fibres de stress. RhoA

active la kinase ROCK qui, à son tour, phosphoryle et inactive la phosphatase de la myosine

(MLCP) et active la « myosin light chain kinase » (MLCK). Cette cascade de réactions a

pour conséquence l’augmentation de la phosphorylation et de l’activation de la myosine II.

La myosine II activée interagit par la suite avec l’actine et forme les fibres de stress (Welch

MD and Mullins RD, 2002; Ridley AJ et al., 2003; Stradal TE et al., 2004). Donc, pour

induire la migration, il doit y avoir un effet activateur sur Cdc42 et Rac, ainsi qu’un effet

inhibiteur sur RhoA, produisant alors l’ancrage des cellules, en éliminant les fibres de stress

et favorisant la formation des filopodes et lamellipodes.

La « p21-activated kinase » (PAK) est une kinase dont l’activité est stimulée par la liaison

de Rac et de Cdc42 actifs. PAK est un important régulateur de la motilité, de signaux de

mort versus de survie, et de la progression du cycle cellulaire. Elle est, en effet, importante

lors de l’adhésion pour l’activation de la kinase ERK. L’activation de la kinase ERK par

FAK et par PAK est indubitablement reliée, car FAK interagit directement avec la paxilline,

qui interagit, par l’intermédiaire de la « paxillin–kinase linker » (PLK) et de la

« PAK-interacting exchange factor » (PIX), avec PAK (Bokoch GM, 2003). La

transactivation du récepteur à l’EGF par les intégrines peut aussi activer la kinase ERK

(Moro L et al., 1998).

19

1.6 Modèles d’études pour les kératines 8 et 18

1.6.1 L’hépatocyte de souris

Les hépatocytes sont des cellules épithéliales simples contenant seulement les K8 et K18

comme FIs cytoplasmiques. Dans le laboratoire d’accueil, la majorité des travaux sont

effectués avec des cultures primaires d’hépatocytes provenant de souris dépourvues de la K8

ou de la K18 obtenue après recombinaison homologue. La perte de l’une ou l’autre des

kératines donne lieu à des hépatocytes sans FIs car, sans son partenaire, la kératine restante

est dégradée par ubiquitination. L’hépatocyte est donc un modèle de choix pour évaluer la

contribution des protéines FIs K8 et K18, tant au niveau de la résistance à diverses formes

de stress (mécaniques et toxiques) qu’au niveau de l’apoptose. Le laboratoire d’accueil a

aussi en sa possession une lignée cellulaire MGT (« mammary gland tumor »), qui a été

produite à partir des souris K8 -/-.

1.6.2 La lignée MGT

La lignée cellulaire MGT (MT499 cl8.3) a été gracieusement fournie par la Dr Hélène

Baribault. Cette lignée a été produite à partir de cultures primaires d’adénomes mammaires

spontanément immortalisés, provenant de souris issues du croisement entre des souris

mutantes pour la K8 (-/-) et des souris transgéniques avec l’oncogène moyen T (PyMT)

(Figure 5).

Figure 5 : Étapes résumées de la production de la lignée MGT. Des souris FVB/N mutantes pour la K8 (-/-) et des souris FVB/W transgéniques (MT#648), portant le PyMT, du virus polyôme (PyV) sous le contrôle du promoteur MMTV (« mouse mammary tumor virus ») ont été accouplées pour donner le croisement servant à la production des cultures primaires d’adénomes de glandes mammaires. La lignée MGT a été isolée des clones spontanément immortalisés.

20

Voici une brève description des résultats obtenus par ce laboratoire sur les souris qui ont

servi à la production de la lignée MGT. Premièrement, ils ont démontrés que les souris

hétérozygotes pour le PyMT (PyMT +/-) et homozygotes pour la K8 (K8 -/-) développent

plus rapidement des tumeurs mammaires par rapport aux souris PyMT +/-, K8 +/+ ou

K8 +/-. Ils n’ont observé aucune différence notable dans l’apparition et la dans croissance de

métastases pulmonaires. L’immunofluorescence sur les adénocarcinomes mammaires et les

foyers métastatiques a montré un marquage intense et homogène pour les K8, K18 et K19

chez les souris contrôles PyMT +/-. La K7 était présente seulement dans quelques cellules et

n’avait pas un marquage homogène. En absence de K8, l’intensité de l’immunofluorescence

des K18 et K19 était beaucoup plus faible et moins présente dans le cytoplasme et, la K7

avait toujours un marquage épars (Baribault H et al., 1997). Les clones et sous-clones MGT

ont été produits à partir de tumeurs mammaires provenant des souris femelles PyMT +/- et

K8 -/-.

Les travaux préliminaires du Dr. Baribault et son équipe sur la lignée MGT nous ont été

communiqués personnellement. Les cultures primaires des adénomes mammaires des souris

K8 +/+ et K8 +/- avaient les Ks 7, 8, 18 et 19, alors que ceux K8 -/- avaient les Ks 7, 18 et

19. Au cours de la production des lignées cellulaires MGT, celles-ci ont perdu l’expression

des Ks 7 et 19. Les nouvelles lignées étaient dépourvues de réseau kératinien mais pas de

FIs, car la vimentine était toujours présente. L’expression du PyMT avait aussi été perdue

chez certaines lignées. L’efficacité d’ensemencement et la croissance cellulaire semblaient

identiques entre les cellules déficientes pour la K8 et celles dont la K8 avait été réintroduite

par transfection (MGT-K8). Les auteurs des lignées MGT et MGT-K8 ont aussi évalué

l’apoptose, par condensation nucléaire et par fragmentation de l’ADN. Dans un premier

temps, ils ont vérifié l’apoptose des cellules en suspension (anoïkis). Après 12 heures en

suspension, les cellules MGT se sont avérées plus sensibles que les cellules MGT-K8 à

l’anoïkis. Ensuite, ils ont soumis les lignées MGT et MGT-K8 à divers agents pro

apoptotiques tels que la cyclohexomide, l’étoposide et la danomycine. Seules les cellules

MGT-K8 étaient plus résistantes aux effets apoptotiques de la cyclohexomide. Dans une

chambre de Boyden modifiée, ils ont aussi observé une capacité invasive réduite de la part

des MGT-K8 sur des membranes enduites de lamine/collagène de type IV/gélatine.

21

1.7 Aperçu des travaux

Les hépatocytes de souris sauvages et mutantes pour K8 ou K18 sont couramment utilisés

comme modèle d’étude multifonctionnelle des Ks dans des cellules différenciées en culture

primaire. Par contre, jusqu’à présent aucune lignée cellulaire dépourvue en Ks n’est

disponible. Mes travaux de maîtrise portent sur des analyses phénotypiques et fonctionnelles

des lignées MGT et MGTK8, entre autres, le contenu en protéines FIs et la réponse à une

stimulation prolifératrice ou apoptotique. Suivent des analyses sur leur motilité. Les travaux

font appel à des méthodes éprouvées de biologie cellulaire, de biochimie et de biologie

moléculaire.

2 Matériel et méthodes

2.1 Réactifs et anticorps

Les réactifs utilisés sont les suivants : le PD 98059 (Sigma-Aldrich, P215), la Wortmannin

(Sigma-Aldrich, W1628), le FBS (Winset, #80150), la BSA fraction V (ICN Biomedicals,

#194771), le bromodéoxyurine (BrdU) (Sigma-Aldrich, B5002), le désoxyfluoroïdine

(Sigma-Aldrich, F0503), la FN (purification modifiée de Engvall E et Ruoslahti E, 1977)

et, la phalloïdine TR (Molecular Probes, T-7471).

Les anticorps utilisés sont les suivants et, l’organisme dans lequel l’anticorps a été produit

est souligné: chez le lapin, anti-p44/42 MAPK (#9202) et anti-Akt polyclonal (#9272) de

chez Cell Signaling Technology, anti-Flip CT polyclonal (Upstate, #06-864), anti-intégrine

β1 humaine (Transduction Laboratories, I4170) et, anti-14-3-3 ε, ζ humaine est une

gracieuseté du Dr. Alastair Aitken (Londres, Grande-Bretagne); chez le rat, les anticorps

monoclonaux anti-K8 (TROMA-I), K18 (TROMA-II) et K19 (TROMA-III) reconnaissants

les Ks de souris (Dr. R. Kemler, Freiburg, Allemagne), l’anti-moyen-T (PyMT) (C1) (Dr.

Hans Türler) et anti BrdU (Sera lab, MAS 2506); monoclonaux de souris,

anti-phospo-p44/42 mitogen-activated protein kinase (MAPK) (Thr202/Tyr204) E10

(#9106) et anti-phospho-Akt (Ser473) (#9271) de chez Cell Signaling Technology,

anti-14-3-3 σ humaine (Upstate Biothecnology, #05-632), anti-K7 de souris (ICN

pharmaceuticals, #10522), anti-vimentine de souris (Royal, I. et al., 1996), anti-K8

humaine (ab-4, TS1) (NeoMarkers, #MS-997), anti-desmoplakine I et II (MAB1699),

anti-intégrine α5 humaine (MAB1956Z) et anti-intégrine α2 humaine (MAB1950) produit

par Chemicon international, anti-intégrine αv humaine (BD Bioscience, #611012),

anti-intégrine β1 humaine (Transduction Laboratories, #I41720) et

l’anti-glyceraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase (GAPDH) (RDI, RDI-TRK5G4-6C5); et

finalement, les deuxièmes anticorps, anti-IgG de lapin de chèvre couplé au « Horse Radish

Peroxidase » (HRPO), de souris et de rat (Jackson ImmunoReasearch Laboratory,

23

111-035-144, 115-035-044, 112-035-003); anti-rat de poulet couplé à l’ALEXA 488 et

anti-souris de chèvre couplé à l’ALEXA 488 (Molecular Probes, A-21470 et A-11001).

2.2 Culture cellulaire

MGT

La lignée MGT est cultivée dans un milieu DMEM high-glucose (Gibco, #12800-017)

additionné de 10 % FBS, 0,5 µg/ml d’insuline (Sigma-Aldrich, I6634), 40 ng/ml de

dexamethasone, 0,1 mM de β-mercaptoéthanol, 3,5 µg/ml de gentamycine (Sigma-Aldrich,

G1264) et 2 mM de L-glutamine (Sigma-Aldrich, G3126), à pH 7,4 (milieu MGT complet).

À l’occasion, les cellules sont lavées avec du tampon HEPES à pH 7,5 (65 mM NaCl,

6,7 mM KCl, 8,3 mM N-2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethanesulfonic acide). Avant

d’atteindre la confluence, les cellules sont divisées (1:6) avec un traitement à la trypsine

pour MGT [0,25 % trypsine (Winset, #25-054-CI), 0,4 % EDTA, 0,8 % NaCl, 0,2 g/l

glucose dans une solution de PBS (1,37 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 6,51 mM Na2HPO4,

1,47 mM KH2PO4, 0,9 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,4)]. Les cultures sont maintenues

dans une atmosphère 5 % CO2 à une température de 37°C.

T51B MT3

La lignée cellulaire T51B MT3 est un transfectant stable provenant de la transfection du

PyMT dans la lignée T51B (Royal I et al., 1992). La lignée T51B origine d’une culture

primaire d’hépatocytes de rat Fisher. La culture de la lignée se fait dans un milieu α-MEM

(Gibco, #12000-022), supplémenté de 10 % FBS inactivé (30 minutes à 56°C) et de

100 unités/ml de pénicilline/streptomycine (Winset, #30-002-CI). Au besoin, les cellules

sont divisées (1:4) avec de la trypsine à pH 7,8 (1 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 7,7 mM

Na2HPO4, 1,2 mM NaH2PO4, 2,7 mM KCl, 0,05 % trypsine). Les cultures sont maintenues

dans une atmosphère 5 % CO2 à une température de 37°C.

24

Hépatocytes

Les hépatocytes sont isolés de souris de 21 jours, comme décrit auparavant, par perfusion à

la collagénase (Loranger A et al., 1997). Les hépatocytes sont étalés à une densité de

1,8×105 cellules/cm2 sur FN (2 µg/cm2), en présence de milieu d’attachement à pH 7,4

(DMEM/F12 additionné de 5 µg/l d’acide sélénique, 5 mg/l d’insuline, 5 mg/l de

transferrine, 100 µg/ml de streptomycine et de 100 U/ml pénicilline). Après une période

d’adhésion de 3 heures, le milieu est remplacé par du milieu de maintien à pH 7,4 (milieu

d’attachement additionné de 10-7 M dexaméthasone et de 20 ng/ml d’EGF). Lorsque

l’expérience demande un milieu d’apoptose (milieu de maintien sans l’EGF et sans

l’insuline), celui-ci remplace le milieu de maintien 24 heures après la mise en culture. Les

cultures sont maintenues dans une atmosphère 5 % CO2 à une température de 37°C.

2.3 Production de clones stables MGTK8 et MGTTK

Le laboratoire d’accueil a lui aussi produit une lignée MGT exprimant stablement la K8,

que nous avons nommé MGTK8, par infection de l’ADNc de la K8. Une lignée MGTTK a

aussi été produite comme contrôle négatif. L’ADNc de la K8 humaine ou de la thymidine

kinase (TK) est transféré dans les cellules MGT à l’aide du vecteur rétroviral murin de

Moloney dérivé de MFGb2. Le plasmide pGFP3 contenant le gène de la TK du virus de

l’Herpès, suivi d’une séquence d’entrée interne ribosomale (IRES) et de l’ADNc de

l’« enhanced green fluorescent protein » (EGFP) a été fourni par le Dr. Manuel Caruso

(Université Laval, Québec, Canada). La construction du plasmide pK8GFP a demandé de

remplacer par réaction de polymérisation en chaîne (PCR, « polymerase chain reaction ») le

gène de la TK flanqué des sites de restrictions NcoI et BamHI par l’ADNc de la K8

humaine. L’IRES contenue dans ce vecteur permet de produire deux protéines distinctes,

soit la K8 humaine et la EGFP (Martinez-Salas E, 1999; Qiao J et al., 2000). Pour générer

les virus recombinants TK et K8, les cellules d’empaquetage GPE-86 sont cotransfectées

respectivement avec les vecteurs puro et pGFP3 ou pK8GFP, à l’aide d’une précipitation au

calcium phosphate. Après 10 jours de sélection à la puromycine à 2 µg/ml, les clones

25

résistants sont sélectionnés et le surnageant, contenant les particules virales, est récolté et

conservé à -80°C. Le titre, déterminé avec des cellules NIH 3T3 positives pour la EGFP,

donna 3×106 et 1×107 particules virales/ml respectivement, pour les vecteurs rétroviraux

TK et K8. L’infection des cellules MGT se fait de la manière suivante, sur des cellules en

phase exponentielle de croissance, donc 24 heures après un passage. La suspension de

rétrovirus est diluée dans le milieu de culture additionné de polybrène (4 µg/ml). La

quantité de milieu doit correspondre au volume minimal pour recouvrir complètement les

cellules et contenir 10 × plus de particules virales que de cellules. Les cellules sont remuées

à toutes les 15 minutes durant la première heure et ensuite, le milieu de culture est ajouté.

Le lendemain, les cellules sont lavées et laissées en culture afin de permettre la

prolifération et l’expression du transgène. Deux jours après l’infection, les cellules sont

triées selon la présence ou l’absence de la fluorescence, avec un cytofluoromètre

(Beckman-Coulter). Par la suite, les cellules triées pour la EGFP, toujours en suspension,

sont diluées de manière à ce qu’une seule cellule soit présente par puits dans une plaque de

96 puits. Une fois les cellules adhérées, chaque puits est vérifié par microscopie en

épifluorescence, pour la présence d’un seul clone fluorescent et un suivi est fait jusqu'à

l’atteinte de la confluence. Le clone MGTK8 ou MGTTK d’un puits a alors été trypsinisé

pour permettre son amplification. Lorsque l’expansion est suffisante, les différents clones

K8 ou TK positifs sont conservés dans le milieu de congélation (10 % DMSO dans FBS) à

-80°C.

2.4 Essai de prolifération

Les lignées MGT et MGTK8 sont ensemencées à très faible densité (5×103 cellules/ml),

dans le milieu MGT complet, dans un plat de culture dont la surface ventrale est quadrillée

(3×4). Les comptes de prolifération sont faits à l’aide d’un microscope inversé en contraste

de phase (TE-2000 (Nikon)). Une image est prise à 200× de grossissement dans chaque

coin inférieur gauche de chaque carré du quadrillé. Donc, pour chaque temps, 12 images

sont acquises et le nombre de cellules dans chaque champ est compté manuellement. Puis,

le nombre de cellules est évalué à plusieurs temps (4, 19, 26, 41, 50 et 71 heures) sur une

période de 4 jours.

26

2.5 RT-PCR PyMT et 14-3-3 (7 isoformes)

L’ARN total est isolé avec le TRIzol® (Invitrogen, #15596-026) et les « reverse-

transcription polymerase chain reaction(s) » (RT-PCR) sont réalisés à l’aide du kit

« SuperScriptTM One-Step RT-PCR with Platinum® Taq » (Invitrogen, #10928-042) selon

les indications du manufacturier. L’ADNc est synthétisé et amplifié avec les amorces

suivants: PyMT, 5’-CCA GCG GTT CTG CAG AAT GCC-3’ et 3’-CCA TTG GCA TGT

ACT CCT CCT C-5’; Actine, 5’-GTG GGC CGC CCT AGG CAC CAG-3’ et 5’-CTC

TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC-5’; 14-3-3β, 5’-CCA GCA GGC TTA CCA AGA

AG-3’ et 3’-GAC GTC CAC AGG GTG AGA TT-5’; 14-3-3γ, 5’-GGC CAT GAA GAA

CGT GAC-3’ et 3’-GTA GGC CTT CTC AGA CGA CTC-5’; 14-3-3ε, GTG ATT GGA

GCC AGA AGA GC-3’ et 3’-CCT GTG GTA GTC CCC TTT CA-5’; 14-3-3ζ 5’-CGT

TGT AGG AGC CCG TAG GTC-3’ et 3’-AAC CTC GGC CAA GTA ACG GTA-5’;

14-3-3η, 5’-CGG TGA CAG AGC TGA ATG AA-3’ et 3’-GGA ACT TGT CAA GCA

GAG CC-5’; 14-3-3σ, 5’-GCC GAA CGG TAT GAA GAC AT-3’ et 3’-CGC TTC TTG

TCA TCG CCA GTG-5’; 14-3-3τ, 5’-TGA AGT AGC TTG TGG CGA TG-3’ et 3’-TGT

ATC AAG CTC TGC GAT GG-5’. Les réactions de RT-PCR se déroulent dans les

conditions suivantes dans un appareil Biometra® : synthèse de l’ADNc (1 cycle à 50°C

durant 30 minutes, 94°C pour 2 minutes); amplification de l’ADNc (25 cycles à 94°C

durant 30 secondes, 55°C pour 1 minute, 72°C pendant 40 secondes). Les produits de PCR

sont alors analysés sur gel d’agarose 2 % contenant du bromure d’éthidium. Les produits de

RT-PCR des 7 isoformes de la 14-3-3 ont été séquencés par la compagnie Sigma-Genosys.

2.6 Immunobuvardage

La concentration des protéines est déterminée selon une méthode de Lowry modifiée

(Lowry OH et al., 1951). La séparation des protéines (7,5 µg/puits) se fait par

électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) 10 % (375 mM Tris pH 8,8, 10 %

acrylamide:bisacrylamide (28:2), 0,1 % SDS, APS et TEMED) à 110 volts durant

1,5 heures dans le tampon de migration (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1 % SDS). Le

27

transfert des protéines se fait une sur membrane de PVDF préalablement traitée au MetOH

100 % et équilibrée dans le tampon de transfert (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,01 %

SDS, 20 % MetOH). Le transfert se déroule à 110 volts pour une période 30 minutes, dans

le tampon de transfert refroidi. La membrane de PVDF est séchée puis réhydratée avec du

MetOH 100 % et lavée à trois reprises (3 minutes) avec le TBS-T (10 mM Tris pH 7,5,

100 mM NaCl, 0,1 % Tween-20). S’en suit la saturation de sites non spécifiques avec une

solution de TBS-T contenant 5 % de lait en poudre, suivie de l’hybridation avec le premier

anticorps à 4°C pendant 18 heures, sous légère agitation. L’anticorps primaire est dilué à la

concentration de travail dans une solution de TBS-T contenant l’agent bloquant approprié.

Cette première incubation terminée, la membrane est lavée à trois reprises (15 minutes)

avec le TBS-T. L’hybridation du deuxième anticorps, conjuguée à la HRPO, diluée 1/5000,

se fait dans la solution de TBS-T, 5 % lait en poudre, pour une période d’une heure à 21°C.

De nouveau, une fois l’incubation complétée, la membrane est lavée à trois reprises

(15 minutes) avec le TBS-T. La révélation se fait avec un réactif chemiluminescent qui

produit un signal lumineux, pouvant être détecté avec un film photographique (Pierce,

#34093). Les réactifs commerciaux utilisés pour la révélation sont SuperSignal West Pico

Kit (Pierce, #34080) et Sigma (Sigma-Aldrich, CPS-1-60), selon la sensibilité nécessaire

pour visualiser l’autoradiogramme. L’évaluation des niveaux d’expression protéiques s’est

fait à l’aide du logiciel Scion Image Beta 4.0.2 (Scion Corp.).

2.7 Immunofluorescence

L’observation de cellules fixées se fait avec un microscope confocal BIORAD MCR-1024

équipé d’un laser krypton/argon avec un microscope inversé avec épi fluorescence

Diaphot-TMD de Nikon et d’un microscope inversé TE-2000 avec épi fluorescence de

Nikon. Avant de procéder à la fixation, les cellules sont lavées deux fois avec du PBS.

Diverses fixations sont nécessaires, selon le type et la localisation de la protéine. Après les

fixations, et entre chaque hybridation, les cellules sont lavées à deux reprises avec du PBS.

Les Ks et la vimentine demandent une fixation au MetOH à -21°C durant 10 minutes et un

blocage de 30 minutes à 21°C avec du PBS 2,5 % BSA (albumine de sérum bovin). Pour la

desmoplakine, les cellules sont fixées de la façon suivante : MetOH à -20°C pendant

28

4 minutes, suivi de MetOH:acétone (3:7) à -20°C pendant 2 minutes, puis d’un blocage

avec du PBS 2,5 % BSA à 21°C pendant 30 minutes. Pour l’actine, elle demande

premièrement une fixation pendant 10 minutes avec la paraformaldéhyde 2 % dans du PBS

et, deuxièmement avec MetOH:acétone (3:7) à -20°C pendant 10 minutes. Les anticorps

primaires et la phalloïdine sont dilués (d) dans le PBS (K7 d : 1/10, TROMA I (K8) d : 1/1,

TROMA II (K18) d : 1/1, TROMA III (K19) d : 1/1, desmoplakine d : 1/100, phalloïdine

d : 1/40) et hybridés une nuit à 4°C. L’anticorps secondaire (d : 1/100) couplé au

fluorophore désiré est hybridé une heure à 21°C à la noirceur. L’échantillon est alors monté

entre le plastique et une lamelle #1 dans du milieu de montage [50 % tampon glycine

(0,2 M glycine, 0,18 mM NaOH, 0,29 M NaCl, 0,015 mM NaN3, pH 8,6) et 50 % glycérol

(INC Biomedicals, #800687)] et scellé avec un vernis à ongle transparent.

2.8 Essais d’adhésion et d’étalement

Les plats de culture sont prétraités avec la FN ou la VN. La VN est fournie directement par

le FBS. Dans le FBS se retrouvent la FN et la VN comme éléments de la MEC, mais la VN

s’y retrouve en plus grande quantité. L’adhésion des cellules attribuable à la VN est de 8 à

16 × plus grand que celui attribué à la FN, en utilisant le FBS pour créer une MEC

(Hayman EG et al., 1985). Dans un tampon carbonate (Na2CO3) 0,1 M, la FN humaine est

diluée à 1 µg/cm2 et le FBS à 20 %. Les plats de cultures sont gardés à 4°C pendant la nuit.

Les cellules sont aussi préparées la nuit précédant l’expérience. Le milieu MGT complet est

remplacé, après un lavage à l’HEPES, par du milieu MGT sans FBS. Le lendemain, les

plats de culture prétraités, avec soit la FN ou le FBS et sont lavés abondamment avec du

tampon HEPES. Ensuite, ils sont incubés une heure à 21°C avec du milieu MGT complet

sans FBS, additionné de 1 % BSA. Le milieu MGT complet sans FBS, additionné de 1 %

BSA, est préparé le jour même de l’expérience. Pendant ce temps, les lignées MGT et/ou

MGTK8 sont lavées à l’HEPES et traitées 2 minutes avec la trypsine MGT et, suspendues

dans du milieu MGT complet sans FBS additionné de 1 mg/ml d’anti-trypsine de soya

(Type-II) (Sigma-Aldrich, T9128), pour éviter l’utilisation du FBS comme inhibiteur de

trypsine. Deux fois le volume d’anti-trypsine fraîchement préparé doit être utilisé pour

inhiber complètement un volume de trypsine MGT. Le dénombrement de cellules

29

s’effectue à ce moment de façon à ce qu’il y ait, par la suite, 100 000 cellules/cm2, dans les

plats de culture. La quantité nécessaire de cellules est centrifugée 5 minutes à 1000 rpm et

ensuite suspendue dans le milieu MGT complet contenant 1 % BSA. Les inhibiteurs, s’il y

a lieu, sont ajoutés à ce moment (Wortmannin [final 0,1 µM] et PD [final 50 µM]). Pendant

45 minutes dans l’incubateur, les cellules sont légèrement agitées sur une plaque agitatrice

rotative. Suite à cette incubation, pour diminuer toute activité kinase, les cellules sont

déposées dans les plats de culture dont on a préalablement enlevé le milieu MGT complet

sans FBS, 1 % BSA (Figure 6).

Figure 6 : Schéma résumant l’essai d’adhésion et d’étalement. (ON, « over night » ou durant une nuit; FN, fibronectine; VN, vitronectine; BSA, albumine de sérum bovin)

Aux temps appropriés (0, 30 minutes, 1, 2, 4 et 6 heures après l’ensemencement), les

cellules subissent deux lavages au PBS avant d’être fixées ou lysées. Pour les

dénombrements de cellules adhérées/étalées, les cellules sont fixées avec une solution de

PBS et paraformaldéhyde 3,7 % pour une période de 10 minutes à 21°C. Par microscopie

en contraste de phase (200×), 6 images des cellules fixées aux divers temps, sont acquises.

L’analyse d’image consiste au dénombrement des cellules étalées par rapport au nombre

total de cellules. Nous considérons une cellule étalée comme n’étant pas ronde ayant un

plus fort contraste. Pour l’analyse biochimique des protéines, les cellules sont lysées avec

100µl/1×106 cellules de tampon d’échantillon 2× [4× Tris-HCL/SDS pH 6,8 (TrisHCl

0,5 M, SDS 0,4 %), glycérol 20 %, SDS 4 %, β-mercaptoéthanol 2 %, bleu de bromophénol

30

0,001 %] à 95°C. Par la suite, elles sont homogénéisées par trois passages dans une aiguille

27G et conservées à -80°C.

2.9 Migration

La migration est évaluée par la capacité des cellules à recouvrir une blessure faite dans la

monocouche confluente, communément nommée le « scratch test ». Les MGT et MGTK8

sont ensemencées à 2,5×105 cellules/cm2 dans les conditions normales de culture. Après

24 heures, à l’aide d’un cône de prélèvement stérile de 200 µl, quelques brèches sont faites

dans la monocouche avec l’extrémité pointue du cône de prélèvement, en faisant des

va-et-vient sur la surface du plat de culture. Les cellules sont alors lavées avec de l’HEPES

et réincubées dans leur milieu respectif, avec ou sans inhibiteurs. Si l’expérience demande

l’ajout des inhibiteurs PD (50 µM) ou Wortmannin (0,1 µM), les cellules sont mises en

présence du produit une heure avant de faire la brèche. L’acquisition d’images séquentielles

se fait sur un champ, dans lequel le bord franc d’une blessure est percevable,

immédiatement après avoir fait la brèche. Les images en contraste de phase (200×) sont

acquises à toutes les 10 minutes sur une période de 16 heures, dans un environnement

contrôlé, c-à-d à 37°C dans une atmosphère 5 % CO2. Les images séquentielles sont

évaluées à l’aide des logiciels ImageJ 1.28u (NIH) et Metamorph (Universal Imaging

Corp.), et la surface relative parcourue par les cellules est en µm2/h. Les cellules sont aussi

fixées pour l’observation en immunofluorescence.

2.10 Incorporation de BrdU

Deux plats de culture sont additionnés de BrdU à 10 µM et désoxyfluoroïdine à 5 µM

22 heures après avoir déposé les cellules sur VN. Après une période de deux heures, les

cellules sont lavées deux fois au PBS et fixées 10 minutes à l’éthanol 100 % à -20°C. Suite

à la fixation et deux lavages au PBS, les cellules subissent un traitement au HCl 4 N

pendant 20 minutes et un lavage double au PBS. Par la suite, elles sont incubées une heure

à 21°C dans une solution PBS 2 % BSA et 0,5 % Tween-20. Puis, elles sont mises en

31

présence de l’anticorps anti-BrdU (Sera-Lab), d : 1/10 dans cette même solution pendant

une heure. Une fois l’incubation complétée, les cellules sont de nouveau lavées deux fois

au PBS et mises en présence, une heure, du deuxième anticorps anti rat conjugué

Alexa-488 d : 1/100. Seule les cellules qui auront dupliqué leur ADN lors de la phase S du

cycle cellulaire auront incorporé le BrdU, un homologue de la thymine. Afin de visualiser

l’incorporation, les cellules sont observées en épifluorescence après deux lavages aux PBS.

Cinq champs différents sont acquis dans chaque plat de culture. Pour déterminer le nombre

total de cellules, le même champ est acquis en contraste de phase.

3 Résultats

3.1 Caractérisation des lignées MGT et MGTK8

3.1.1 Caractérisation du contenu en FIs par immunobuvardage et par

immunofluorescence

Les premières analyses sur les lignées MGT et MGTK8 ont porté sur le contenue en Ks

afin de confirmer la présence et l’absence de la K8 respectivement dans les cellules MGT et

MGTK8. L’analyse du contenu en protéines pour les divers FIs, par immunobuvardage, a

permis de déterminer la présence des K18, K19, K7 et de la vimentine, mais aucune K8,

dans la lignée MGT. Lorsque la K8 est réexprimée, par introduction rétrovirale de la K8

humaine, dans les cellules MGTK8 les niveaux d’expression protéiques des K18, K19 et

K7 augmentent en moyenne de 50 %, alors que l’expression de la vimentine ne varie pas.

L’immunobuvardage de l’actine confirme que la même quantité de protéines est déposée

dans les puits des gels d’acrylamide (Figure 7).

Figure 7 : Contenu protéique en FIs. Immunobuvardages pour la K8, la K18, la K19, la K7, la vimentine (Vim) et l’actine (Ac) dans les lignées MGTK8 (K) et MGT (M).

33

La présence ou l’absence des K8, K18, K19 et K7 a aussi été confirmée par

immunofluorescence indirecte par microscopie confocale. Les immunofluorescences ont

été réalisées sur une monocouche de cellules à confluence et les observations sont

effectuées dans le plan focal du noyau. Dans les cellules MGT, il y a une faible expression

de K18, K19 et K7, sans aucune expression de la K8. Le marquage de la K8 confirme sa

production suite à la réintroduction de l’ADNc de la K8 humaine dans les MGTK8. De

plus, il est possible d’observer une augmentation de l’expression de la K18 et de la K19,

alors que l’expression de la K7 augmente peu. Les niveaux d’expression des K8, K18 et

K19 dans les MGTK8 semblent égaux et leur distribution est concentrée sous la membrane

cytoplasmique. Dans les cellules MGT, les K18 et K19 présentent une distribution fine sous

la membrane. Lorsque les cellules MGT sont observées dans le plan focal du noyau,

l’expression de la K7 semble inexistante. Par contre, lorsque les images sont prises à la

surface supérieure de la monocouche (encadrés de la Figure 8), la K7 apparaît. La

distribution de la K7 dans les deux lignées est concentrée aux jonctions intercellulaires et

quelques filaments très fins traversant la membrane sont observables. Les filaments se

traduisent plus exactement par un alignement en pointillé de la K7. Dans les MGTK8,

toujours à la surface supérieure de la membrane, les K8, K18 et K19 forment des réseaux

filamenteux typiquement observables dans une cellule de l’épithélium simple. Le même

phénomène est observé dans la lignée MGT pour les K18 et K19. Cependant, les réseaux

formés sont beaucoup plus fins, plus dilués, et tout comme la K7, ils se concentrent aux

jonctions intercellulaires. La vimentine s’exprime de manière égale dans les deux lignées.

L’immunofluorescence directe de l’actine montre que la monocouche produite par les deux

lignées affiche une morphologie en pavée typique des épithéliums simples en monocouche

(Figure 8).

34

Figure 8 : Distributions de différentes protéines FIs. Immunofluorescences indirectes pour les FIs de la K8, de la K18, de la K19, de la K7, de la vimentine (Vim) et l’immunofluorescence directe de l’actine (Ac) dans les lignées MGTK8 (K) et MGT (M) par microscopie confocale (400×). Les encadrés sont des images acquises à la surface supérieure de la monocouche (620×).

35

3.1.2 Expression du PyMT

Les cellules MGT, fournies par le Dr. Baribault, sont issues de cultures primaires

d’adénomes de glandes mammaires spontanément immortalisées, provenant de souris

issues du croisement entre des souris FVB/N K8 -/- et des souris FVB/W transgéniques,

portant le gène du PyMT, sous le contrôle du promoteur MMTV. Cependant, l’expression

du PyMT du PyV semblait disparue de certains clones générés par ce laboratoire. Afin de

vérifier la présence ou l’absence du PyMT, dans le clone utilisé dans la présente étude, une

analyse par RT-PCR a été effectuée car il est connu que les Ks peuvent agir sur certaines

voies de signalisation et que ces mêmes voies (connu ou inconnu) pourraient être

influencées par le PyMT. Les résultats obtenus avec des oligonucléotides spécifiques pour

le PyMT montrent la présence du transcrit de PyMT dans les lignées MGTK8 et MGT

(Figure 9A). La présence du PyMT a été confirmée au niveau protéique par

immunobuvardage du PyMT dans les extrais protéiques des lignées MGTK8 et MGT

(Figure 9B). La lignée T51B MT3, dans laquelle le PyMT s’exprime de façon stable,

confirme la présence du PyMT (Figure 9A et B) et la lignée T51B a servi de contrôle

négatif.

Figure 9 : Présence du PyMT détectée au niveau de l’ARNm et de la protéine. (A) Photographie du gel d’agarose des amplicons produits par RT-PCR, correspondant au moyen T du polyôme (PyMT) dans les lignées MGTK8 (K), MGT (M), T51B MT3 (+) et T51B (-). L’actine (Ac) est amplifiée comme contrôle positif pour la réaction de RT-PCR. (B) Autoradiogramme de l’immunobuvardage pour la protéine du PyMT dans les lignées MGTK8 (K), MGT (M), T51B MT3 (+) et T51B (-).

36

3.1.3 Expression de la desmoplakine

Des données préliminaires, produites par le laboratoire d’accueil sur la déposition de la

desmoplakine dans le desmosome, indiquent que celle-ci semble être réduite et

désorganisée dans la culture primaire d’hépatocytes des souris dépourvues de FIs (K8 -/- et

K18 -/-). Afin de vérifier si le même phénomène se produit avec la lignée MGT, des

observations de la desmoplakine en immunofluorescence indirecte ont été effectuées par

microscopie confocale en utilisant un anticorps reconnaissant la desmoplakine I et II. En

observant la monocouche d’hépatocytes, il est possible de voir que la desmoplakine est

distribuée en pointillés aux contours des membranes dans les hépatocytes sauvages. Dans

les hépatocytes K8 -/- et K18 -/-, la déposition de la desmoplakine est beaucoup moins

définie (résultat pour les hépatocytes K18 -/- non présenté). L’observation des lignées MGT

et MGTK8 ne laisse voir aucune différence dans la disposition de la desmoplakine au

pourtour des cellules (Figure 10).

Figure 10 : Distribution de la desmoplakine. Immunofluorescences indirectes par microscopie confocale (600×) de la desmoplakine I et II dans les hépatocytes sauvages et K8 -/-, et dans les cellules MGTK8 et MGT. (Les images de la desmoplakine dans les hépatocytes ont été produites par le Dr. A. Loranger.)

37

3.1.3 Dépistage des 7 isoformes de la protéine 14-3-3

Les protéines 14-3-3 forment une famille ubiquitaire très conservée composée de

7 isoformes, sans activité enzymatique, formant obligatoirement des homodimères ou des

hétérodimères. Ces dimères peuvent se lier à plus de 60 protéines différentes. Ceux-ci

s’adhèrent plus ou moins fortement lorsque certaines séquences d’acides aminés (motifs)

spécifiques sont phosphorylés sur résidus Ser ou Thr. Les protéines 14-3-3 peuvent

s’associer à des protéines impliquées au niveau du cycle cellulaire, à des protéines des

voies de signalisation, à des protéines de la réponse aux stress (dont l’apoptose), à des

facteurs de transcription, à des récepteurs et aux FIs (vimentine, Tau et K18). Les liaisons à

la 14-3-3 peuvent influencer : (1) les interactions entre les protéines, (2) la localisation

cytoplasmique ou nucléaire des protéines, (3) la distance entre deux protéines, (4)

l’activation ou l’inhibition de leur activité catalytique et (5) la déphosphorylation et/ou la

protéolyse (Bridges D et Moorhead GBG, 2004).

Puisque la K18 peut interagir avec la 14-3-3, il faut se demander quelle est la fonction de

cette interaction. Cette interaction influence la polymérisation des Ks et modifie le cycle

cellulaire (Liao J et Omary MB, 1996; Ku NO et al., 2002), mais jusqu’à présent aucun rôle

spécifique ne lui a été donné.

Il a été démontré que les 14-3-3 η, ε et ζ peuvent interagir avec la K18, mais l’interaction

avec les autres isoformes de la 14-3-3 n’a pas été vérifiée. Étant donné qu’il semble que les

diverses possibilités d’agencement homo- et hétéro-dimériques entre les 7 isoformes de la

14-3-3 entretiennent des fonctions et des interactions distinctes il est donc primordial de

déterminer quels isoformes sont présents dans le modèle d’étude avant d’entreprendre des

études pour élucider les fonctions de l’interaction K18 et 14-3-3. Dû à la disponibilité

limitée d’anticorps commerciaux spécifiques aux différentes isoformes de la 14-3-3, la

méthode du RT-PCR a été privilégiée. La présence des transcrits des 7 isoformes de la

14-3-3 est confirmée dans les lignées MGT et MGTK8 (Figure 11). Les amplicons produits

ont aussi été séquencés afin de vérifier les résultats obtenus sur gel d’agarose. Le même

38

résultat est obtenu avec les hépatocytes de souris sauvages et K8-/- (résultats non

présentés).

Figure 11 : Amplicons des 7 isoformes de

la protéine 14-3-3. Photographie sur gel

des amplicons produits par RT-PCR des 7

isoformes de la 14-3-3 à partir de

l’ARNm des lignées MGT et MGTK8.

3.1.4 Essai de prolifération

L’interaction entre la K18 et la 14-3-3 peut influencer le cycle cellulaire. Afin de vérifier si

l’augmentation quantitative de la K18 a une influence sur la prolifération des cellules

MGTK8 par rapport aux cellules MGT, un essai de prolifération a été réalisé. Lors de la

phase G2/M du cycle cellulaire, les Ks se retrouvent hyperphosphorylées et la K18 peut

alors se lier à la 14-3-3 (Liao J et Omary MB, 1996). Aussi, lors de la phase G2/M, la

14-3-3 peut lier les Cdc25B et C, ce qui empêche Cdc25 d’activer la cyclineB/cdc2 et ainsi

interfère avec la transition G2/M (Forrest A et Gabrielli B, 2001). La kinase cdc2 [ou

« cyclin dependent kinase » (CDK1)] peut phosphoryler la K18 sur la Ser34, ce qui

constitue une étape essentielle pour l’interaction entre la 14-3-3 et la K18 (Ku NO et al.,

1998). Donc, avec une plus grande quantité de K18, la 14-3-3 peut être moins disponible

pour lier la Cdc25 lors de la phase G2/M du cycle cellulaire. De plus, cdc25 peut

phosphoryler la Ser34 de la K18 et ainsi faciliter la transition G2/M. Les résultats de l’essai

de prolifération montrent que lors de la phase exponentielle, les cellules MGTK8

prolifèrent plus rapidement. Le temps de génération équivaut au temps nécessaire pour

qu’une une population puisse doubler, et il se mesure à l’aide de la pente du logarithmique

MG

TK

8 M

GT

39

de la croissance relative (nt/n0). Le temps de génération de la lignée MGT est de

18,5 heures alors que celui de la lignée MGTK8 est de 14,4 heures (Figure 12). Ceci

correspond à un dédoublement 1,28 × plus rapide.

y = 0.0162x - 0.3637R2 = 0.9981

y = 0.0208x - 0.4666R2 = 0.9949

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

20 30 40 50 60 70Temps (Heures)

Log

de la

cro

issa

nce

rela

tive

MGT MGTK8

Figure 12 : Courbes de croissance. Croissance relative en fonction du temps des lignées MGT et MGTK8. Temps de génération des MGTK8 : 14,4 heures; des MGT : 18,5 heures. [y=mx+b, équation de la droite (obtenue par régression linéaire); R2, cœfficient de restriction]

3.2 Fonctions des kératines dans la réponse apoptotique

Il a récemment été démontré dans le laboratoire d’accueil, qu’une déficience en FIs dans les

hépatocytes des souris sensibiliserait ceux-ci, par rapport aux hépatocytes sauvages, à

l’apoptose menée par le FasR. De plus, cette différence peut être expliquée, entre autres,

par une activation différentielle de la voie de signalisation de ERK induite par la

stimulation du FasR accompagnée par une déficience de la protéine c-Flip dans les

hépatocytes K8-/- (Gilbert S et al., 2004). Ces mêmes résultats ont été obtenus pour lignées

MGT et MGTK8. Après stimulation du FasR par 0,5 µg/ml de Jo2, il y a une activation très

rapide et transitoire de ERK1/2, qui est plus intense dans la lignée MGTK8. De plus, par

40

immunobuvardage, la présence de la protéine c-Flip est non détectable dans le modèle

cellulaire de l’épithélium simple, la lignée MGT. Fait intéressant, la réintroduction de la K8

humaine dans les cellules MGT ramène l’expression de cette protéine (Figure 13).

Figure 13 : Activation de la kinase ERK après simulation du FasR et le contenu de la protéine c-FLIP. Immunobuvardages pour (A) les protéines phosphorylées ERK1/2 suite à une stimulation des hépatocytes (Hép) sauvages (K) et K8 -/- (-) et des MGT (-) et MGTK8 (K) par Jo2 (0,5 µg/ml) dans le temps et (B) la protéine c-Flip.

3.3 Implication des kératines lors de l’adhésion et de l’étalement

sur vitronectine

3.3.1 Efficacité de l’adhésion sur fibronectine et vitronectine

L’efficacité d’adhésion correspond à la proportion de cellules pouvant s’adhérer sur un

substrat donné. Elle a tout d’abord été évaluée sur une matrice de FN humaine purifiée du

plasma. Le même substrat est utilisé pour les hépatocytes de souris en culture primaire et la

plupart des cellules de l’épithélium simple. Dans les conditions d’adhésion n’impliquant

aucun sérum ni facteur de croissance, les cellules ne peuvent s’adhérer sur la FN, tout

comme dans les conditions contrôles d’adhésion sans matrice ajoutée. En effet, en présence

de la BSA, les intégrines sont agglutinées par la BSA et, si l’affinité pour le substrat n’est

pas assez forte, alors les cellules ne pourront pas s’adhérer. Donc, en absence de substrat ou

en présence de FN, aucune des deux lignées ne peut s’adhérer après une heure, et après

41

24°heures, très peu de cellules MTK8 sont adhérées. La VN est une autre matrice

privilégiée par les cellules de l’épithélium simple. Sur VN, plus de 95 % des cellules sont

adhérées après une heure et l’efficacité d’adhésion de la lignée MGT est peu supérieure à

celle de la lignée MGTK8. Après 24 heures sur VN, les populations adhérées des lignées

MGT et MGTK8 ont pratiquement doublé et celle de la lignée MGTK8 dépasse celle sans

K8 (Figure 14). Puisque la quasi totalité des cellules est adhérée à une heure, il est

judicieux d’expliquer pourquoi une augmentation des populations est observée après

24°heures. Ceci semble s’expliquer par le fait que les deux lignées ont subi des mitoses. En

effet, ce résultat a été confirmé avec l’incorporation du BrdU. Les cellules répliquant leur

ADN ont été identifiées par immunofluorescence indirecte des noyaux ayant incorporé du

BrdU. Près du tiers des cellules MGT et MGTK8, 24 heures après avoir été placées en

culture, sont dans la phase S du cycle cellulaire (Figure 15).

0

100

200

300

400

500

600

1 24Temps (Heures)

Nom

bre

moy

en d

e ce

llule

s pa

r ch

amp

(200

X)

MGT BSA 1% MGTK8 BSA 1%

MGT FN MGTK8 FN

MGT VN MGTK8 VN

Figure 14 : Efficacité d’adhésion des lignées MGT et MGTK8. Nombres de cellules par champs (200×) s’adhérant aux diverses matrices en fonction du temps (BSA : « bovin serum albumin »; FN : fibronectine; VN : vitronectine).

42

Figure 15 : Incorporation du BrdU. Pourcentage de noyaux ayant incorporés le BrdU, sur une période de 2 heures, 22 heures après l’adhésion sur VN. (MT = MGT et K8 = MGTK8)

29%32%

0%

25%

50%

MT K8

Afin d’expliquer l’incapacité des lignées MGT et MGK8 à s’adhérer sur la FN, les

intégrines exprimées par les MGT et MGTK8 ont été investiguées par immunobuvardage.

Si les cellules ne possèdent pas la capacité de s’adhérer sur la FN, l’explication la plus

probable est qu’elles ne possèdent pas les intégrines α et/ou β, permettant la liaison à la FN.

Par immunobuvardage, à l’aide d’anticorps spécifiques, il a été confirmé que les lignées

MGT et MGTK8 possèdent les intégrines β1 et αv, et qu’elles sont déficientes pour les

intégrines α2 et α5 (Figure 16).

3.3.2 Capacité d’étalement sur vitronectine

En suspension, les cellules sont rondes et suite à l’adhésion, les cellules s’étalent sur la

matrice. L’étalement dépend des signaux provenant des intégrines contrôlant les éléments

impliqués dans la motilité cellulaire. La vitesse d’étalement a été évaluée à des temps

donnés sur une période de 6 heures, à l’aide du nombre de cellules étalées en relation au

nombre total de cellules, en fonction du temps. Chaque cellule observée par microscopie en

contraste de phase a été classée dans une des deux catégories suivantes. (1) Cellules

adhérées : cellules rondes fixées à la matrice de VN ne présentant aucune protubérance. (2)

Cellules étalées : toute cellule ayant débuté ou terminé le processus d’étalement sur la VN.

Il est évident que l’ajout de la K8 dans la lignée MGT augmente la vitesse d’étalement

(Figure 17 A). L’allure des courbes d’étalement des deux lignées est très similaire. Il y a

43

d’abord une phase aigue d’étalement jusqu’à une heure et par la suite, la vitesse

d’étalement diminue et demeure constante. Lors de cette dernière phase, il y a en moyenne

deux fois plus de cellules MGTK8 que de cellules MGT étalées (Figure 17 B).

Figure 16 : Contenu en intégrines. Immunobuvardages pour les intégrines β1, α2, α5 et αv dans les cellules MGT (M), les MGTK8 (K) et les hépatocytes de souris sauvages (+).

44

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 1 2 3 4 5 6 7

Temps (heures)

% d

e ce

llule

s ét

alée

s

MGTMGTK8

Figure 17 : Différence d’étalement entre les lignées MGT et MGTK8. (A) Images en contraste de phase des lignées MGTK8 et MGT s’étalant sur VN au temps 6h. (B) Pourcentage de cellules étalées en fonction du temps des lignées MGT (□) et MGTK8 (○) sur une matrice de VN.

3.3.3 Signalisation des kinases Akt et ERK lors de l’étalement sur

vitronectine

La différence observée lors de l’étalement se traduit aussi dans l’activation des signaux de

transduction suite à l’activation des intégrines, après leur liaison au substrat VN. Des

extraits protéiques ont été préparés au moment de l’étalement des cellules. Ces extraits ont

A

B

MGT MGTK8

45

été analysés par immunobuvardage pour les protéines Akt et ERK phosphorylées, ainsi que

la K8 phosphorylée sur la Ser432 (Figure 18) et sur la Ser74. Il y a une activation de

ERK1/2 à partir de 30 minutes et qui s’étend jusqu’à 6 heures lors de l’étalement des

lignées MGT et MGTK8. Cette activation est plus intense dans la lignée MGTK8 et elle est

maximale à 4 heures. Le même phénomène s’observe avec l’activation de la protéine Akt.

Cependant, la différence d’activation de Akt est plus marquée et plus rapide dans la lignée

MGTK8. L’étalement conduit aussi à la phophorylation de la K8 sur la Ser432, mais non

sur la Ser74 (résultat non présenté). Dans les cellules MGTK8, la phosphorylation de la

Ser432 de la K8 est rapide et continue jusqu’à 6 heures. Cette phosphorylation semble être

dépendante de l’activation de ERK, car la présence de PD, un inhibiteur spécifique de

MEK, atténue l’activation de ERK1/2 dans les lignées MGT et MGTK8 et perturbe la

phosphorylation de la Ser432 de la K8 dans la lignée MGTK8.

Figure 18 : Signalisation des protéines Akt et ERK phosphorylées et la K8 phosphorylée sur la Ser432 suite à l’adhésion des lignées MGT et MGTK8. Immunobuvardages pour les protéines phosphorylées ERK1/2, Akt et K8 (Ser432) en fonction du temps lors de l’étalement des lignées MGTK8 (K) et MGT (M) sur matrice de VN en absence (-) ou en présence (+) de PD (50µM). L’immunobuvardage de la GAPDH nous montre une quantité égale de protéines déposées dans les puits des gels d’acrylamides.

46

Puisque l’activation de ERK est différentielle lors de l’étalement et que son inhibition peut

affecter la motilité cellulaire, il y a lieu de tester, à l’aide de PD, l’effet de l’activation de

ERK sur l’étalement. Les résultats montrent que l’inhibition de l’activation de ERK n’a

cependant pas d’effet sur l’étalement des deux lignées (Figure 19). La kinase Akt, elle aussi

s’active de manière différentielle dans les deux lignées lors de l’étalement, mais seule la

lignée MGT est affectée par la présence de la Wortmannin, un inhibiteur spécifique de la

PI3K, qui est un activateur en aval de Akt (Figure 20). En présence de l’inhibiteur, les

cellules MGT s’étalent significativement plus rapidement, sans pour autant atteindre la

vitesse d’étalement des cellules MGTK8.

3.4 Implication des kératines lors de la migration

Puisque la présence de la K8 modifie l’étalement, il est d’intérêt de savoir si la migration de

la lignée MGT peut elle aussi être perturbée par la présence de la K8. La méthode du

« scratch test » montre que la lignée MGTK8 peut combler plus rapidement le vide produit

par la brèche dans la monocouche cellulaire. Ce résultat est visualisé par l’obtention

d’images séquentielles prises dans le temps sur une période de 14 heures dans une portion

ayant subi la blessure (Figure 21).

47

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 1 2 3 4 5 6 7

Temps (heures)

% d

e ce

llule

s ét

alée

s

MGT + PD

MGTK8 + PD

MGT

MGTK8

Figure 19 : Différence d’étalement entre les lignées MGT et MGTK8 en présence de PD. Pourcentage de cellules étalées en fonction du temps pour les lignées MGT (□) et MGTK8 (○) sur une matrice de VN en présence ou en absence de PD (50 µM).

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 1 2 3 4 5 6 7

Temps (heures)

% d

e ce

llule

s ét

alée

s

MGT + Wort

MGTK8 + Wort

MGT

MGTK8

Figure 20 : Différence d’étalement entre les lignées MGT et MGTK8 en présence de Wortmannin. Pourcentage de cellules étalées en fonction du temps pour les lignées MGT (□) et MGTK8 (○) sur une matrice de VN en présence ou en absence de Wortmannin (Wort) (0,1 µM).

48

Figure 21 : Différence de migration entre les lignées MGT et MGTK8. Montage des images séquentielles en contraste de phase (200×), prises à toutes les 2 heures (h), de l’envahissement de la brèche par les lignées MGT et MGTK8.

Afin de déterminer la vitesse d’envahissement, les images séquentielles ont été analysées

numériquement à l’aide de logiciels d’analyse d’images. La figure 22 montre, sur une

période de 14 heures, une vitesse d’envahissement relativement constante chez les lignées

MGT et MGTK8. La vitesse d’envahissement des cellules MGTK8 est par contre 1,8 ×

plus grande que celle des cellules MGT. Sur une période d’une heure, les cellules MGT

couvrent en moyenne 44 µm2 et les cellules MGTK8 couvrent en moyenne 80 µm2.

(Figure 22). Après 24 heures, grâce à l’observation de l’actine en épifluorescence

(Figure 23), la différence d’envahissement entre les deux lignées est mise en évidence. Les

cellules MGT ont très peu bougé et seules les cellules sur le bord de la brèche se sont mues,

tandis que la population plus à l’intérieur est demeurée sur place et compacte. Au contraire,

la majorité des cellules MGTK8 ont suivi le front de migration, et les cellules se sont bien

49

étalées. Le grossissement montre une différence de la densité des cellules à pareille

confluence, le nombre de cellules MGT par unité de surface est toujours plus grand que

celui des cellules MGTK8.

y = 44,205xR2 = 0,9917

y = 79,175xR2 = 0,9899

0

200

400

600

800

1000

1200

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Temps (Heures)

Surf

ace

enva

hie

(um

2)

MGT

MGTK8

Figure 22 : Analyses numériques de la différence de migration entre les lignées MGT et MGTK8. Moyenne de la surface envahie en µm2 en fonction du temps par les lignées MGT (●) et MGTK8 (○) (trois expériences distinctes). (y=mx, équation de la droite; R2, coefficient de restriction)

L’activation de la PI3K et de ERK1/2 se produit aussi lors de la migration et leur inhibition

la perturbe (Howe AK et al., 2002; Welch HC et al., 2003; Qian Y et al., 2004). Étant

donné que l’inhibiteur Wortmannin a un effet sur l’étalement des cellules MGT et que la

majorité des protéines impliquées lors de l’étalement sont aussi impliquées lors de la

migration, l’effet de cet inhibiteur et celui de l’inhibiteur PD ont été vérifiés. L’inhibition

de l’action de la PI3K par la Wortmannin a peu d’effet sur la migration des deux lignées.

Les vitesses d’envahissement des lignées MGTK8 et MGT ont diminué respectivement de

9,4 % (Figure 24) et de 10,7 % (Figure 25). Par contre, l’inhibition de l’activation de

ERK1/2 par PD a une influence marquée et différentielle sur la migration des deux types de

cellules. Les vitesses d’envahissement de lignées MGTK8 et MGT ont diminué

respectivement de 65,2 % (Figure 24) et de 95,0 % (Figure 25).

50

L’inhibition de la migration par la présence de PD se reflète d’après la fluorescence de

l’actine dans les lignées MGTK8 et MGT. En effet, 24 heures après avoir débuté le

« scratch test » en présence de 50 µM de PD, il y a une forte inhibition de la migration des

cellules MGTK8 et MGT, ce qui est illustré par les images du bas de la figure 26. Les

images du haut montrent la migration normale (C; contrôle) des cellules MGT et MGTK8.

Figure 23 : Comportement de la différence de migration entre les lignées MGT et MGTK8. Fluorescence directe de l’actine dans les lignées MGT et MGTK8 24 heures après avoir fait une brèche sur la monocouche cellulaire (200×). Les lignes pointillées représentent approximativement la frontière de la brèche.

MGT MGTK8

51

y = 79,175x

y = 71,74x

y = 27,572x

0

200

400

600

800

1000

1200

0 5 10 15Temps (Heures)

Surf

ace

enva

hie

(um

2)MGTK8

MGTK8+Wort

MGTK8+PD

Figure 24 : Analyses numériques de la différence de migration de la lignée MGTK8 en présence de PD ou de Wortmannin. Surface envahie en µm2 en fonction du temps par la lignée MGTK8 en absence ou en présence des inhibiteurs Wortmannin (Wort) (0,1 µM) et PD (50 µM). (y=mx., équation de la droite; R2, coefficient de restriction)

y = 44,205x

y = 39,491x

y = 2,2321x

0

100

200

300

400

500

600

700

0 5 10 15Temps (Heures)

Surf

ace

enva

hie

(um

2)

MGT

MGT + Wort

MGT+PD

Figure 25 : Analyses numériques de la différence de migration de la lignée MGT en présence de PD ou de Wortmannin. Surface envahie en µm2 en fonction du temps par la lignée MGT en absence ou en présence des inhibiteurs Wortmannin (Wort) (0,1 µM) et PD (50 µM). (y=mx., équation de la droite; R2, coefficient de restriction)

52

Figen 24 hLescelllign

P

MGTK8 MGT
C
ure 26 : Comportement de la différence de migration entre les lignées MGT et MGTK8 présence de PD. Fluorescence directe de l’actine dans la lignée MGTK8 et MGT eures après avoir fait une brèche sur la monocouche cellulaire (200× de grossissement).

images du haut reflètent la migration des cellules dans les conditions contrôles (C) et es du bas, des cellules traitées avec 50 µM de PD sur la même période de temps. Les es pointillées représentent approximativement l’endroit de la brèche.

D

53

4 Discussion

Les résultats du contenu en protéines FIs montrent que la lignée cellulaire MGT expriment

la K8 et la vimentine, de même que les Ks 7, 18 et 19 à un faible niveau. La présence de

ces Ks dans la lignée MGT concorde avec les données préliminaires obtenues dans les

cultures primaires des adénomes mammaires provenant des souris issues du croisement

entre les souris hétérozygotes pour le PyMT et les souris privées de la K8 (Baribault H et

al., 1997). Les descriptions fournies par Dr Baribault concernant la distribution et les

niveaux d’expression de ces trois Ks dans les adénomes mammaires in situ et en culture

primaire, semblent indiquer que ces deux déterminants sont comparables à ceux retrouvés

dans la lignée MGT. Cette lignée demeure donc un modèle représentatif de l’adénome

mammaire. Le profil d’expression en K7, K18 et K19 annonce aussi que les adénomes

mammaires proviennent bien de glandes mammaires, car le profil d’expression est le même

que pour ce tissu. Il a aussi été remarqué par immunofluorescences sur des

adénocarcinomes mammaires et des foyers métastatiques, que l’expression des K18 et K19

est plus faible que dans leurs contreparties exprimant la K8. Ainsi, lorsque la l’ADNc de la

K8 humaine est réintroduite dans les cellules MGT (lignée MGTK8), l’expression des trois

autres Ks augmente, mais pas la vimentine. De plus, les immunofluorescences montrent

que cette réexpression de K8 accroît l’intensité des marquages des K18 et K19. Cependant,

l’augmentation en immunobuvardage pour la K7 ne correspond pas avec celle par

immunofluorescence. L’augmentation de la K7 en immunofluorescence est moins

ostensible, car l’expression n’est pas constante sur une monocouche à confluence, et cette

expression est exclusivement concentrée en petits points aux jonctions intercellulaires. Afin

de quantifier l’expression de la K7 en immunofluorescence, l’utilisation du cytofluorimètre

offre un outil de choix. Il est aussi à noter que non seulement les niveaux d’expression des

K18 et K19 diffèrent entre les deux lignées, mais leur distribution intracellulaire est aussi

différente. Alors que la lignée MGTK8 exhibe un réseau kératinien tout a fait typique des

cellules de l’épithélium simple, les Ks des cellules MGT se retrouvent concentrées à la

membrane, offrant ainsi un arrangement fibrillaire pouvant ressembler vaguement à un

réseau. Ceci peut s’expliquer par le fait que les K18 et K19, de type I, ne peuvent s’associer

54

à la ou les Ks de type II nécessaires à leur polymérisation et distribution normale. Dans les

épithéliums simples, les seules Ks de type II exprimées sont les K7 et K8. Dans la lignée

MGT, la K8 n’est pas présente et la localisation de la K7 ne correspond pas à celle des K18

et K19. Ceci est surprenant car la K7 peut former avec la K18 et/ou la K19 des filaments

comme dans les cellules des ductules biliaires qui expriment la K7, K8, K19 et K20

(Marceau N et Loranger A, 1995). Puisqu’une K de type I ne peut en principe subsister

sans un partenaire de type II, une autre K de type II compensatoire, n’ayant pas été

identifiée, peut être présente. Il se peut aussi que la présence de la K19 interfère dans la

polymérisation des autres Ks, car elle peut agir comme dominant négatif (Lu X et Lane EB,

1990). L’hyperphosphorylation des Ks influence aussi la solubilité et la distribution du

réseau à l’intérieur de la cellule (Liao J et al., 1995), mais aucun de mes résultats n’indique

une telle possibilité. Puisque les Ks dans la lignée MGT sont toutes concentrées à la

proximité de la membrane, il est aussi possible qu’elles puissent être stabilisées

individuellement, par des protéines membranaires accessoires. De cette façon, les K18 et

K19 dans les cellules MGT, peuvent suivre un alignement de protéines membranaires et

donner l’impression de former des filaments. Par ailleurs, la ou les protéines accessoires

peuvent être des protéines impliquées dans les interactions intercellulaires, puisque les Ks

s’y concentrent. Si la question se pose pour la K18 et la K19, elle se pose aussi pour la K7

qui possède une distribution différente de celle de la K18 et de la K19. Il est possible que la

K7 soit associée à une protéine différente de celles s’associant aux Ks de type I. Si le cas

présent est confirmé, alors la lignée MGT fournit un modèle approprié pour l’étude des

interactions entre les Ks et les protéines associées aux FIs. La lignée MGT ne semble donc

pas présenter un réseau de Ks fonctionnel alors que sa consoeur, exprimant la K8, ne

diffère que par son réseau organisé de Ks représentatif de l’épithélium simple. Ensemble,

elles fournissent un excellent modèle d’étude de l’organisation et de l’expression des Ks.

La présence du PyMT a été détectée tant au niveau de l’ARNm que de la protéine dans les

deux lignées, MGT et MGTK8. Le PyMT pousse la cellule à la division cellulaire en

stimulant certaines voies de signalisation impliquées dans la prolifération. Toutefois,

l’expression du PyMT, similaire dans les deux lignées, ne semble pas porter ombrage aux

recherches à caractère fonctionnel.

55

La déposition erronée de la desmoplakine dans les hépatocytes déficients en Ks ne semble

pas uniquement due à la perte de la K8, de la K18 ou de l’absence de réseau de Ks, mais

bien de l’absence totale de Ks. Dans les lignées MGTK8 et MGT, la déposition de la

desmoplakine est normale et identique et, ces lignées présentent soit un réseau de Ks

incluant la K8, la K7, la K18 et la K19 ou aucun réseau complet, mais elles expriment tout

de même les K7, K18 et K19. Donc, la mise en place de la desmoplakine ne serait pas

influencée par la présence d’un réseau de Ks, ni par l’absence de la K8 et ni par la présence

de la K7. La K7 ne semble cependant pas influencer sa déposition, car les protéines de la

desmoplakine et de la K7 ne colocalisent pas dans le desmosome. La desmoplakine

s’exprime dans toutes les cellules MGT et MGTK8 confluentes alors que la K7 ne se

retrouve pas. Les lignées MGT et MGTK8 peuvent ainsi être des outils précieux dans

l’étude de la desmoplakine et de sa relation avec les Ks, car l’un a un réseau de Ks alors

que l’autre n’en a pas.

Les transcrits des 7 isoformes de la protéine 14-3-3 sont présents dans les lignées MGT et

MGTK8, les hépatocytes de souris sauvages ainsi que dans les hépatocytes de souris

dépourvus de la K8 (résultats non présentés dans hépatocytes). Certaines variations ont été

détectées dans la quantité d’ARNm des différentes protéines de la 14-3-3 entre les deux

lignées, toutefois, des analyses quantitatives par PCR en temps réel devront être réalisées

pour confirmer ces variations. Cependant, la présence des transcrits ne confirme pas leur

présence au niveau protéique. Lors de mes travaux, les anticorps spécifiques à chacune des

isoformes n’étaient pas disponibles. Toutefois, par immunobuvardage, la présence égale

des isoformes ε, ζ, et σ ont été confirmées dans les deux lignées (résultats non illustrés) et il

est donc concevable que toutes les isoformes y soit présentes. Conséquemment, nos deux

modèles d’études, les hépatocytes et les lignées MGT et MGTK8, sont comparables sur ce

point et les études sur l’interaction entre les Ks et la 14-3-3 pourront se poursuivre par

l’utilisation des deux modèles.

Les cellules MGTK8 prolifèrent 1,28× plus rapidement que les cellules MGT. La

modification du temps de génération, suite à la réintroduction de la K8 humaine dans les

MGT, peut être due à une augmentation des interactions entre la K18 et la 14-3-3 déjà

56

décrite dans la littérature (Liao J et Omary MB, 1996; Ku NO et al., 2002). Lors de la

transition G2/M du cycle cellulaire, les protéines 14-3-3 séquestreraient la Cdc25 et

empêcheraient l’activation subséquente de la cyclineB/cdc2. L’activation de la

cyclineB/cdc2 est l’étape centrale et nécessaire à la transition de la phase G2 du cycle

cellulaire vers la mitose. L’hyperphosphorylation cumulative des Ks durant la progression

du cycle cellulaire permet la liaison entre la 14-3-3 et la K18. Cette interaction peut ainsi

entraver la liaison 14-3-3/Cdc25 et faciliter la transition G2/M par l’activation de la

cycline B. Dans ce contexte, les deux lignées peuvent être très utiles.

Un rôle de protection et de modulation de la signalisation a été établi pour la K8 dans la

réponse apoptotique des hépatocytes de souris. Malgré le fait que les lignées MGT et

MGTK8 n’aboutissent pas à une fin apoptotique suite à la stimulation du FasR, les voies de

signalisation engendrées par l’activation du FasR stimulent analogiquement la voie de

signalisation ERK dans les deux modèles d’études, les hépatocytes et les lignées. La

protéine anti-apoptotique c-FLIP est grandement diminuée dans les hépatocytes de souris

K8-/-. Cette même baisse est retrouvée dans la lignée MGT. Ceci indique donc un lien

précis entre la K8 et la protéine c-FLIP, car dans les cellules MGT se retrouvent les Ks 7,

18 et 19. De plus, des difficultés ont été rencontrées lors de la tentative de restauration du

contenu en c-FLIP dans les hépatocytes K8-/- par réintroduction de la K8 suite à son

infection ou sa transfection. Ce n’est qu’avec la lignée MGTK8 qu’il est possible d’établir

une réexpression stable la protéine c-FLIP, démontrant ainsi que l’expression stable [et non

transitoire (résultat non illustré)] de la K8 est indispensable pour l’expression de c-FLIP.

Une fois de plus, les lignées MGT et MGTK8 parviennent à montrer leur utilité dans la

conquête des fonctions associées aux Ks. C’est ainsi que le rôle de protection apporté par

les Ks a été appuyé par l’utilisation des lignées MGT et MGTK8

Il est surprenant de constater qu’une cellule de l’épithélium simple ne puisse pas adhérer à

une matrice de FN, alors qu’elle le peut sur la VN. Habituellement, la FN est la matrice

privilégiée par les cellules de l’épithélium simple et la VN est un substrat secondaire. Au

temps 24 heures, les cellules MGTK8 plus que les cellules MGT sont adhérées sur la BSA

et sur la FN. De plus, les cellules MGTK8 ont formé plus aisément de petits sphéroïdes

57

(observations non illustrées) qui ont probablement produit leur propre matrice. Ce qui peut

expliquer leur plus grand nombre sur la BSA et sur la FN. La formation de sphéroïdes est

indicatrice d’interactions intercellulaires différentes entre les lignées MGT et MGTK8.

L’efficacité d’adhésion des cellules MGT est un peu plus grande par rapport au MGTK8 et

le nombre plus élevé de cellules MGTK8 adhérées à la matrice de VN après 24 heures est

probablement dû à une prolifération plus rapide de ces dernières. Les deux lignées

expriment les mêmes intégrines, ce qui ne peut pas expliquer la différence d’efficacité de

l’adhésion. Une explication possible de cette dissimilitude serait que l’agglomération des

intégrines à la surface des cellules se fait de manière différente. Les forces qui retiennent la

cellule au substrat sont plus importantes lorsque les intégrines sont agglomérées. Les deux

lignées possèdent les intégrines αv et β1 alors qu’elles n’ont pas les intégrines α2 et α5. Ce

profil d’expression peut fort être en accord avec le fait que les deux lignées ne peuvent pas

adhérer à la FN car ce sont les paires d’intégrines α2β1 et α5β1 qui sont responsables de la

reconnaissance préférentielle la FN et nos deux lignées en sont dépourvues. La paire αvβ1

peut aussi reconnaître la FN mais son substrat privilégié demeure la VN. Toutefois, aucune

liaison à la FN n’est obtenue suggérant que l’intégrine αv doit avoir un autre partenaire. La

seule paire d’intégrines incluant l’intégrine αv pouvant lier la VN et non la FN est la paire

complémentée par l’intégrine β5. Sa présence demeure à être confirmée.

Sur la VN, les cellules MGTK8 s’étalent deux fois plus rapidement que les cellules MGT,

et la surface occupée lors de l’étalement des cellules MGTK8 est aussi plus grande

(Figure 17 A). Il peut donc être supposé que certains éléments qui modifient et qui

contrôlent l’étalement sont plus efficaces dans la lignée MGTK8 ou sont déficients dans la

lignée MGT.

Une très forte activation des kinases Akt et ERK accompagne l’étalement des cellules

MGTK8. L’activation de Akt et de ERK se produit aussi dans la lignée MGT, cependant

elle est beaucoup plus faible. L’activation dans les cellules MGT est considérée très forte,

car elle est plus puissante que lors de la stimulation avec de l’EGF (observation non

illustrée). La différence d’activation de ces deux kinases devrait être relative à la capacité

d’étalement des cellules. Cette affirmation doit être reconsidérée, mais elle ne supporte pas

58

la différence entre l’activation des deux kinases et l’allure des courbes d’étalement, tant au

niveau de la puissance qu’au niveau de la cinétique. Il y a toujours un facteur de deux qui

différencie nos lignées dans leur vitesse d’étalement relative, alors que l’activation des

deux kinases est toujours plus grande qu’un facteur de deux dans la lignée MGTK8 par

rapport à la lignée MGT. La voie de survie induisant l’activation de la protéine Akt dans la

lignée MGKT8 est plus soutenue et varie peu dans le temps. Cela laisse penser qu’il est

probable que les cellules MGTK8 peuvent résister plus facilement à différents stress. Donc,

il semble que l’activation de Akt ne soit pas reliée à la vitesse d’étalement, mais seulement

au fait que les cellules sont adhérées au substrat. La protéine Akt ne tient aucun rôle connu

dans la motilité cellulaire. Par contre, un de ses activateurs présente la propriété de modifier

la motilité. Une inhibition de l’activité de la PI3K avec la Wortmannin modifie seulement

la vitesse d’étalement de la lignée MGT et pas celle de la lignée MGTK8. Ainsi, l’absence

de la K8 dans les cellules MGT peut être responsable d’une modification de la signalisation

contrôlant l’étalement impliquant la PI3K. Cependant, il y a lieu de s’attendre à ce que

l’inhibition de la PI3K réduise l’étalement car il est connu qu’elle peut stimuler des

éléments favorisant la motilité (Qian Y et al., 2004). L’activation de la kinase ERK laisse

croire qu’elle est relative à la vitesse de migration car son activation est graduelle, tout

comme l’étalement des deux lignées. Contrairement à l’inhibition de l’activation de Akt,

l’inhibition de l’activation de ERK par le PD ne modifie aucunement l’étalement des deux

lignées. Donc, l’activation de ERK lors de l’étalement n’est pas nécessaire pour

l’entretenir. Cependant, ERK joue bel et bien un rôle dans la phosphorylation de la K8 lors

de l’étalement. Il a été démontré que la Ser432 de la K8 pouvait être phosphorylée

directement par ERK après la stimulation du EGFR (Baribault H et al., 1989; Ku NO et

Omary MB, 1997; Ku NO et al., 2002). Ici, il est montré pour la première fois que la

phosphorylation de la Ser432 de la K8 par la kinase ERK se fait, non seulement en amont

du EGFR, mais aussi sous le contrôle des intégrines. Peu importe si l’activation provient

directement des intégrines ou indirectement via la transactivation du EGFR par les

intégrines. Ainsi, la présence de la K8 dans les cellules MGTK8 modifie l’activité de

kinases induites suite à l’activation des intégrines liées à la VN.

59

Les résultats démontrent que la K8 peut influencer la migration des cellules en culture en

monocouche puisque la présence de la K8 humaine dans les cellules MGTK8 augmente la

vitesse d’envahissement d’un facteur d’environ deux par rapport aux cellules MGT. Ce

résultat concorde avec ceux obtenus par Chu YM et al. démontrant que la cotransfection de

la K8, de la K18 (Chu YM et al., 1993) et de la vimentine (Chu YM et al., 1996) pouvait

augmenter la motilité des cellules cancéreuses. La vimentine et la K18 s’expriment a priori

dans les cellules MGT et l’infection de la K8 dans ces cellules donne un nouveau modèle

complémentaire à ceux utilisés par Chu YM et al..

Lors de la migration, l’action de la PI3K semble peu modifier la motilité des lignées MGT

et MGTK8. Par contre, l’effet inhibiteur de PD influence fortement la migration, et cet effet

est plus important dans les cellules MGT. Selon ce modèle d’étude, l’activation de la kinase

ERK entretient une fonction primordiale lors de la migration. Il y a lieu d’évaluer

l’activation de la kinase ERK lors de la migration. Cependant, si elle est aussi forte qu’au

cours de l’étalement, où l’effet inhibiteur de PD n’est pas complet, alors il peut être

supposé que les différences d’activation de la protéine ERK peuvent expliquer la différence

rencontrée lors de l’inhibition de la migration en présence de PD.

En résumé, les lignées MGT et MGTK8 sont maintenant acceptées dans le laboratoire

d’accueil comme modèle approprié pour l’étude fonctionnelle des Ks autant dans l’étude

des interactions cellule-cellule, de la réponse apoptotique que dans les interactions

protéine-protéine entre les Ks et des protéines accessoires. Finalement, il est démontré

également ici que la K8 est impliqué dans les processus d’étalement et de migration

cellulaire et cela par l’influence qu’a la K8 sur certaines voies de signalisation.

60

5 Bibliographie Adachi M, Katsumura KR, Fujii K, Kobayashi S, Aoki H, Matsuzaki M. Proteasome-

dependent decrease in Akt by growth factors in vascular smooth muscle cell. 2003. FEBS Letters. 554:77-80.

Ameen NA, Figueroa Y, Salas PJ. Anomalous apical plasma membrane phenotype in CK8-deficient mice indicates a novel role for intermediate filaments in the polarization of simple epithelia. 2001. J Cell Sci. 114:563-575.

Anderson JM, Heindl LM, Bauman PA, Ludi CW, Dalton WS, Cress AE. Cytokeratin expression results in a drug-resistant phenotype to six different chemotherapeutic agents. 1996. Clin Cancer Res. 2(1):97-105.

Attwell S, Mills J, Troussard A, Wu C, Dedhar S. Integration of cell attachment, cytoskeletal localization, and signaling by integrin-linked kinase (ILK), CH-ILKBP, and the tumor suppressor PTEN. 2003. Mol Biol Cell. 14:4813-25.

Bader BL, Magin TM, Hatzfeld M, Franke WW. Amino acid sequence and gene organization of cytokeratin no. 19, an exceptional tail-less intermediate filament protein. 1996. EMBO J. 5:1865-75.

Baribault H, Blouin R, Bourgon L, Marceau N. Epidermal growth factor-induced selective phosphorylation of cultured rat hepatocyte 55-kD cytokeratin before filament reorganization and DNA synthesis. 1989. J Cell Biol. 109:1665-76.

Baribault H, Wilson-Heiner M, Muller W, Penner J, Bakhiet N. Functional analysis of Mouse Keratin 8 in polyoma middle T-induced mammary gland tumors. 1997 Trangenic Reaserch. 6:359-67.

Bartek J, Taylor-Papadimitriou J, Miller N, Millis R. Patterns of expression of keratin 19 as detected with monoclonal antibodies in human breast tissues and tumours. 1985. Int J Cancer. 36:299-306.

Bauman PA, Dalton WS, Anderson JM, Cress AE. Expression of cytokeratin confers multiple drug resistance. 1994. PNAS. 91(12):5311-4.

Blanc A, Pandey NR, Srivastava AK. Synchronous activation of ERK 1/2, p38mapk and PKB/Akt signaling by H2O2 in vascular smooth muscle cells: Potential involvement in vascular disease (Review). 2002. International Journal of Molecular Medicine. 11:229-34.

Bokoch GM. Biology of the p21-activated kinases. 2003. Annu Rev Biochem. 72:743-81. Bonifas JM, Rothman AL, Epstein EH. Epidermolysis bullosa simplex: evidence in two

families for keratin gene abnormalities. 1991. Science. 254:1202-5. Bridges D, Moorhead GBG. 14-3-3 Proteins: A Number of Functions for a Numbered

Protein. 2004. Science STKE. 242:re10. Bruno T, Corbi N, Di Padova M, De Angelis R, Floridi A, Passananti C, Fanciulli M. The

RNA polymerase II core subunit 11 interacts with keratin 19, a component of the intermediate filament proteins. 1999. FEBS Letters. 453:273-7.

Cadrin M, Marceau N, Baribault H. Griseofulvin hepatotoxicity-related effects in keratin 8 deficient FVB/N mice. 1996. Mol Biol Cell. 6S:2171.

61

Caulin C, Salvesen GS, Oshima RG. Caspase cleavage of keratin 18 and reorganization of intermediate filaments during epithelial cell apoptosis. 1997. J Cell Biol. 138:1379-94.

Caulin C, Ware CF, Magin TM, Oshima RG. Keratin-dependent, epithelial resistance to tumor necrosis factor-induced apoptosis. 2000. J Cell Biol. 149:17-22.

Chou CF, Omary MB. Mitotic-arrest associated enhancement of O-linked glycosylation and phosphorylation of human keratins 8 and 18. 1993. J Biol Chem. 268:4465-72.

Chu YW, Runyan RB, Oshima RG, Hendrix MJ. Expression of complete keratin filaments in mouse L cells augments cell migration and invasion. 1993. PNAS. 190(9):4261-5.

Chu YW, Seftor EA, Romer LH, Hendrix MJ. Experimental coexpression of vimentin and keratin intermediate filaments in human melanoma cells augments motility. 1996. Am J Pathol. 148(1):63-9

Coulombe PA, Ma L, Yamada S, Wawersik M. Intermediate filaments at a glance. 2001. J Cell Sci. 14:4345-7.

Coulombe PA, Omary MB. ‘‘Hard’’ and ‘‘soft’’ principles defining the structure, function and regulation of keratin intermediate filaments. 2002. Current Opinion in Cell Biology. 14:110-22.

Dale BA, Holbrook KA, Steinert PM. Assembly of stratum corneum basic protein and keratin filaments in macrofibrils. 1978. Nature. 276:729-31.

Dimmeler S, Assmus B, Hermann C, Haendeler J, Zeiher AM. Fluid shear stress stimulates phosphorylation of Akt in human endothelial cells: involvement in suppression of apoptosis. 1998. Circ Res. 83:334-41.

Engvall E, Ruoslahti E. Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen. 1977. Int J Cancer. 20(1):1-5.

Erber A, Riemer D, Bovenschulte M, Weber K. Molecular phylogeny of metazoan intermediate filament proteins. 1998. J Mol Evol. 47:751-62.

Etienne-Manneville S, Hall A. Rho GTPases in cell biology. 2002. Nature. 420(6916):629-35.

Foisner R, Leichtfried FE, Herrmann H, Small JV, Lawson D, Wiche G. Cytoskeleton-associated plectin: in situ localization, in vitro reconstitution, and binding to immobilized intermediate filament proteins. 1988. J Cell Biol. 106:723-33.

Franke TF, Hornik CP, Segev L, Shostak GA, Sugimoto C. PI3K/Akt and apoptosis: Size matters. 2003. Oncogene. 22:8983-98.

Franke TF, Kaplan DR, Cantley LC, Toker A. Direct regulation of the Akt proto-oncogene product by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. 1997. Science, 275:665-8.

Fuchs E, Cleveland DW. A structural scaffolding of intermediate filaments in health and disease. 1998. Science. 279:514-9.

Fuchs E, Weber K. Intermediate filaments: structure, dynamics, function, and disease. 1994. Annu Rev Biochem. 63:345-82.

Geiger B, Bershadsky A, Pankov R, Yamada KM. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix-cytoskeleton crosstalk. 2001. Nat Rev Mol Cell Biol. 2:793-805.

62

Gerber HP, McMurtrey A, Kowalski J, Yan M, Keyt BA, Dixit V, Ferrara N. Vascular Endothelial Growth Factor Regulates Endothelial Cell Survival through the Phosphatidylinositol 3'-Kinase/Akt Signal Transduction Pathway. Requirement for Flk-1/KDR Activation. 1998. J Biol Chem. 273(46):30336-43.

Gilbert S, Loranger A, Daigle N, Marceau N. Simple epithelium keratins 8 and 18 provide resistance to Fas-mediated apoptosis. The protection occurs through a receptor-targeting modulation. 2001. J Cell Biol. 154:763-73.

Gilbert S, Loranger A, Marceau N. Keratin Modulate c-Flip/Extracellular Signal-Regulated Kinase 1 and 2 Antiapoptotic Signaling in Simple Epithelial Cells. 2004. MCB. 16:7072-81.

Gonias SL, Hembrough TA, Sankovic M. Cytokeratin 8 functions as a major plasminogen receptor in epithelial and carcinoma cells. 2001. Frontiers in Bioscience. 6;1326-34.

Guo L, Degenstein L, Dowling J, Yu QC, Wollmann R, Perman B, Fuchs E. Gene targeting of BPAG1: abnormalities in mechanical strength and cell migration in stratified epithelia and neurologic degeneration. 1995. Cell. 81:233-43.

Hayman EG, Pierschbacher MD, Suzuki S, Rouslahti E. Vitronectin - A Major Cell Attachment-promoting Protein in Fetal Bovin Serum. 1985. Exp Cell Res. 160:245-58.

He T, Stepulak A, Holmstrom TH, Eriksson J. The IF Protein K 8 Is a Novel Cytoplasmic Substrate for c-Jun N-terminal Kinase. 2002. J Biol Chem. 277(13):10767-74.

Herrmann H, Aebi U. Intermediate filaments and their associates: multi-talented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics. 2000. Curr Opin Cell Biol. 12:79-90.

Hesse M, Magin TM, Weber K. Genes for intermediate filament proteins and the draft sequence of the human genome: novel keratin genes and a surprisingly high number of pseudogenes related to keratin genes 8 and 18. 2001. J Cell Sci. 114:2569-75.

Howe AK, Aplin AE, Juliano RL. Anchorage-dependent ERK signaling-mechanisms and consequences. 2002. Curr Opin Genet Dev. 12:30-5.

Hynes RO. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. 2002. Cell. 110:673-87. Ichaso N, Dilworth SM. Cell transformation by the middle T-antigen of polyoma virus.

2001. Oncogene. 20:7908-16. Inada H, Izawa I, Nishizawa M, Fujita E, Kiyono T, Takahashi T, Momoi T, Inagaki M.

Keratin attenuates tumor necrosis factor-induced cytotoxicity through association with TRADD. 2001. J Cell Biol. 155:415-26.

Jamora C, Fuchs E. Intercellular adhesion, signaling and the cytoskeleton. 2002. Nat Cell Biol. 4:E101-8.

Juliano RL. Signal transduction by cell adhesion receptors and the cytoskeleton: functions of integrins, cadherins, selectins, and immunoglobulin-superfamily members. 2002. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42:283-323.

Kouklis PD, Hutton E, Fuchs E. Making a connection: direct binding between keratin intermediate filaments and desmosomal proteins. 1994. J Cell Biol. 127:1049-60.

Kramer G, Erdal H, Mertens HJMM, Nap M, Mauermann J, Steiner G, Marberger M, Bivén K, Shoshan MC, Linder S. Differentiation between Cell Death Modes Using

63

Measurements of Different Soluble Forms of Extracellular Cytokeratin 18. 2004. Cancer Res. 64:1751-6.

Ku NO, Azhar S, Omary MB. Keratin 8 phosphorylation by p38 kinase regulates cellular keratin filament reorganization: modulation by keratin 1-like disease causing mutation. 2002. JBC. 277:10775-82.

Ku NO, Darling JM, Krams SM, Esquivel CO, Keeffe EB, Sibley RK, Lee YM, Wright TL, Omary MB. Keratin 8 and 18 mutations are risk factors for developing liver disease of multiple etiologies. 2003. PNAS. 100(10):6063-8.

Ku NO, Liao J, Omary MB. Apoptosis Generates Stable Fragments of Human Type I Keratins. 1997. J Biol Chem. 272(52):33197-203.

Ku NO, Liao J, Omary MB. Phosphorylation of human keratin 18 serine 33 regulates binding to 14-3-3 proteins. 1998. EMBO J. 17(7):1892-906.

Ku NO, Michie S, Resurreccion EZ, Broome RL, Omary MB. Keratin binding to 14-3-3 proteins modulates keratin filaments and hepatocyte mitotic progression. 2002. PNAS. 99(7):4373-8.

Ku NO, Omary MB. Phosphorylation of human K8 in vivo at conserved head domain serine 23 and at epidermal growth factor-stimulated tail domain serine 431. 1997. Am J Physiol. 277:34826-35.

Ku NO, Zhou X, Toivola DM, Omary MB. The cytoskeleton of digestive epithelia in health and disease. 1999. Am J Physiol. 277:G1108-G1137

Lane EB, Bartek J, Purkis PE, Leigh IM. Keratin antigens in differentiating skin. 1985. Ann N Y Acad Sci. 455:241-58.

Lee SC, Kim IG, Marekov LN, O'Keefe EJ, Parry DA, Steinert PM. The structure of human trichohyalin. Potential multiple roles as a functional EF-hand-like calcium-binding protein, a cornified cell envelope precursor, and an intermediate filamentassociated (cross-linking) protein. 1993. J Boil Chem. 268:12164-76.

Leung CL, Green KJ, Liem RKH. Plakins: a family of versatile cytolinker proteins. 2002. TRENDS in Cell Biology. 12(1):37-45.

Leung CL, Sun D, Liem RK. The intermediate filament protein peripherin is the specific interaction partner of mouse BPAG1-n (dystonin) in neurons. 1999. J Cell Biol. 144:435-46.

Liao J, Lowthert LA, Ku NO, Fernandez R, Omary MB. Dynamics of human keratin 18 phosphorylation: polarized distribution of phosphorylated keratins in simple epithelial tissues. 1995. J Cell Biol. 131(5):1291-301.

Liao J, Omary MB. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. 1996. J Cell Biol. 133(2):345-57.

Lloyd C, Yu QC, Cheng J, Turksen K, Degenstein L, Hutton E, Fuchs E. The basal keratin network of stratified squamous epithelia: defining K15 function in the absence of K14. 1995. J Cell Biol. 129:1329-44.

Loranger A, Duclos S, Grenier A, Price J, Wilson-Heiner M, Baribault H, Marceau N. Simple epithelium keratins are required for maintenance of hepatocyte integrity. 1997. Am J Pathol. 151(6):1673-83.

Lowry OH et al.. 1951. J Biol Chem. 193:265-75.

64

Lu X, Lane EB. Retrovirus-mediated transgenic keratin expression in cultured fibroblasts: specific domain functions in keratin stabilization and filament formation. 1990. Cell. 62:681-96.

Lymn JS, Gallagher KL, Clunn GF, Fexby SE, Patel MK, Hughes AD. PDGF stimulates DNA synthesis in human vascular smooth muscle cells via a novel Wortmannin-insensitive phosphatidylinositol 3-kinase. 2003. FEBS Letters. 555(3):591-6.

Mack JW, Steven AC, Steinert PM. The mechanism of interaction of filaggrin with intermediate filaments. The ionic zipper hypothesis. 1993. J Mol Biol. 232:50-66.

Marceau N, Loranger A, Cytokeratin expression, fibrillar organization, and subtle function in liver cells. 1995. Biochem Cell Biol. 73:619-25.

Markowitz D, Goff S, Bank A. A safe packaging line for gene transfer: separating viral genes on two different plasmids. 1988. J Virol. 62:1120-4.

Martinez-Quiles N, Ho H-YH, Kirschner MW, Ramesh N, Geha RS. Erk/Src Phosphorylation of Cortactin Acts as a Switch On-Switch Off Mechanism That Controls Its Ability To Activate N-WASP. 2004. Moll Cell Biol. 24(12):5269-80.

Martinez-Salas E. Internal ribosome entry site biology and its use in expression vectors. Curr Opin Biotechnol. 1999. 10(5):458-64

Meng JJ, Bornslaeger EA, Green KJ, Steinert PM, Ip W. Two-hybrid analysis reveals fundamental differences in direct interactions between desmoplakin and cell type-specific intermediate filaments. 1997. J Biol Chem. 272:21495-503.

Miranti CK, Brugge JS. Sensing the environment: a historical perspective on integrin signal transduction. 2002. Nat. Cell Biol. 4:83-90.

Moll R, Lowe A, Laufer J, Franke WW. Cytokeratin 20 in human carcinomas. A new histodiagnostic marker detected by monoclonal antibodies. 1992. Am J Pathol. 140:427-47.

Moro L, Venturino M, Bozzo C, Silengo L, Altruda F, Beguinot L, Tarone G, Defilippi P. Integrins induce activation of EGF receptor: role in MAP kinase induction and adhesion-dependent cell survival. 1998. EMBO J. 17:6622-32.

Nikolic B, McNulty E, Mir B, Wiche G. Basic amino acid residue cluster within nuclear targeting sequence motif is essential for cytoplasmic plectin-vimentin network junctions. 1996. J Cell Biol. 134:1455-67.

Omary MB, Ku NO, Liao J, Price D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro. 1998. Subcell Biochem. 31:105-40.

Owens DW, Wilson NJ, Hill AJ, Rugg EL, Porter RM, Hutcheson AM, Quinlan RA, van Heel D, Parkes M, Jewell DP, Campbell SS, Ghosh S, Satsangi J, Lane EB. Human keratin 8 mutations that disturb filament assembly observed in inflammatory bowel disease patients. 2004. J Cell Sci. 117(10):1989-99.

Perng MD, Cairns L, van den IJssel P, Prescott A, Hutcheson AM, Quinlan RA. Intermediate filament interactions can be altered by HSP27 and alphaB-crystallin. 1999. J Cell Sci. 112:2099-112.

Peters B, Kirfel J, Bussow H, Vidal M, Magin TM. Complete cytolysis and neonatal lethality in keratin 5 knockout mice reveal its fundamental role in skin integrity and in epidermolysis bullosa simplex. 2001. Mol Biol Cell. 12:1775-89.

65

Qian Y, Corum L, Meng Q, Blenis J, Zheng JZ, Shi X, Flynn DC, Jiang BH. PI3K induced actin filament remodeling through Akt and p70S6K1: implication of essential role in cell migration. 2004. Am J Physiol Cell Physiol. 286(1):C153-63.

Qiao J, Black ME, Caruso M. Enhanced ganciclovir killing and bystander effect of human tumor cells transduced with a retroviral vector carrying a herpes simplex virus thymidine kinase gene mutant. 2000. Hum Gene Ther. 11:1569-76.

Quinlan RA, Hatzfeld M, Franke WW, Lustig A, Schulthess T, Engel J. Characterization of dimer subunits of intermediate filament proteins. 1986. J Mol Biol. 192:337-49.

Ridley AJ, Schwartz MA, Burridge K, Firtel RA, Ginsberg MH, Borisy G, Parsons JT, Horwitz AR. Cell migration: integrating signals from front to back. 2003. Science. 302(5651):1704-9.

Roop DR, Huitfeldt H, Kilkenny A, Yuspa SH. Regulated expression of differentiation-associated keratins in cultured epidermal cells detected by monospecific antibodies to unique peptides of mouse epidermal keratins. 1987. Differentiation. 35(2):143-50.

Royal I, Gourdeau H, Blouin R, Marceau N. Down-Regulation of Cytokeratin 14 mRNA in Polyoma Virus Middle T-Transformed Rat liver Epithelial Cells. 1992. Cell Growth and Differentiation. 3:589-96.

Royal I, Raptis L, Druker BJ, Marceau N. Down-regulation of cytokeratin 14 gene expression by the polyoma virus middle T antigen is dependent on c-Src association but independent of full transformation in rat liver nonparenchymal epithelial cells. 1996. Cell Growth and Differentiation. 7:737-43.

Sastry SK, Burridge K. Focal adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. 2000. Exp Cell Res. 261:25-36.

Schutte B, Henfling M, Kölgen W, Bouman M, Meex M, Leers MPG, Nap M, Björklund V, Björklund P, Björklund B, Lane EB, Omary MB, Jörnvall H, Ramaekers FCS. Keratin 8/18 breakdown and reorganization during apoptosis. 2004. Exp Cell Res. 2004. 297(1):11-26.

Small JV, Geiger B, Kaverina I, Bershadsky A. How do microtubules guide migrating cells?. 2002. Nature Reviews Mol. Cell. Bio. 3:957-64.

Smith FJ, Porter RM, Corden LD, Lunny DP, Lane EB, McLean WH. Cloning of human, murine, and marsupial keratin 7 and a survey of K7 expression in the mouse. 2002. Biochem Biophys Res Commun. 297:818-27.

Stappenbeck TS, Bornslaeger EA, Corcoran CM, Luu HH, Virata ML, Green KJ. Functional analysis of desmoplakin domains: specification of the interaction with keratin versus vimentin intermediate filament networks. 1993. J Cell Biol. 123:691-705.

Stasiak PC, Purkis PE, Leigh IM, Lane EB. Keratin 19: predicted amino acid sequence and broad tissue distribution suggest it evolved from keratinocyte keratins. 1989. J Invest Dermatol. 92:707-16.

Steinbock FA, Nikolic B, Coulombe PA, Fuchs E, Traub P, Wiche G. Dose-dependent linkage, assembly inhibition and disassembly of vimentin and cytokeratin 5/14 filaments through plectin’s intermediate filament-binding domain. 2000. J Cell Sci. 113:483-91.

Steinbock FA, Wiche G. Plectin: a cytolinker by design. 1999. Biol Chem. 380:151-8.

66

Stigbrand T. The versatility of cytokeratins as tumor markers. 2001. Tumour Biol. 22:1-3. Stradal TE, Rottner K, Disanza A, Confalonieri S, Innocenti M, Scita G. Regulation of

actin dynamics by WASP and WAVE family proteins. 2004. Trends Cell Biol. 14(6):303-11.

Strelkov SV, Herrmann H, Geisler N, Wedig T, Zimbelmann R, Aebi U, Burkhard P. Conserved segments 1A and 2B of the intermediate filament dimer: their atomic structures and role in filament assembly. 2002. EMBO J. 21(6):1255-66.

Takahashi K, Coulombe PA, Miyachi Y. Using transgenic models to study the pathogenesis of keratin-based inherited skin diseases. 1999. J Dermatol Sci. 21(2):73-95.

van Dalen A. Significance of cytokeratin markers TPA, TPA (cyk), TPS and CYFRA 1 in metastatic disease. 1996. Anticancer Res. 16:2345-9.

van der Flier A. Sonnenberg A. Function and interactions of integrins. 2001. Cell Tissue Res. 305:285-98.

Weber KL, Bement WM. F-actin serves as a template for cytokeratin organization in cell free extracts. 2002. J Cell Sci. 115:1373-82.

Welch HC, Coadwell WJ, Stephens LR, Hawkins PT. Phosphoinositide 3-kinase-dependent activation of Rac. 2003. FEBS Letters. 546(1):93-7.

Welch MD, Mullins RD. Cell control of actin nucleation. 2002. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18:247-88.

Wiche G, Gromov D. Donovan A, Castanon MJ, Fuchs E. Expression of plectin mutant cDNA in cultured cells indicates a role of COOH-terminal domain in intermediate filament association. 1993. J Cell Biol. 121:607-19.

Yang Y, Dowling J, Yu QC, Kouklis P, Cleveland DW and Fuchs E. An essential cytoskeletal linker protein connecting actin microfilaments to intermediate filaments. 1996. Cell 86:655-65.

Yoganathan TN, Costello P, Chen X, Jabali M, Yan J, Leung D, Zhang Z, Yee A, Dedhar S, Sanghera J. Integrin-linked kinase (ILK): a ‘‘hot’’ therapeutic target. 2000. Biochem. Pharmacol. 60: 1115-9.

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Annexe

Tôt durant le cycle lytique du PyV, une région de l’ADN viral exprime deux protéines, les

antigènes-T petits ou « small » (SyMT) et grands « large » (LyMT). Seuls le PyV murin et

celui de hamster produisent le troisième antigène-T, le PyMT. Les antigènes-T enclenchent

le cycle cellulaire de la cellule infectée, permettant ainsi au virus de profiter de

l’environnement réplicatif de la cellule pour multiplier son propre ADN. Parfois, l’infection

n’est pas fatale mais les antigènes-T sont toujours produits et la cellule est transformée. Le

PyMT a le plus grand pouvoir transformant des trois. Chez l’animal, lorsque ceux-ci

s’expriment, il y a formation de tumeurs. Majoritairement, les tumeurs sont d’origine

épithéliale provenant, par exemple, du tissu mammaire. Lorsque le PyMT est produit dans

la cellule, l’oncoprotéine s’ancre à la membrane cytoplasmique, puis recrute et active des

TKs de la famille Src. Lorsque phosphorylé, sur résidu tyrosine, le PyMT lie des protéines

avec des domaines PTB et SH2 dont ShcA, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) et

phospholipase Cγ-1 (PLCγ-1), et lie aussi Hsc70 et 14-3-3. (Natalia Ichaso et Stephen M

Dilworth, 2001).

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