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UMR7242 CNRS – UnistraBSC ESBS, 300 boulevard Sébastien Brant, BP 10413 F-67412 Illkirch Cedex, FranceTel . 03 68 85 47 10http://bsc.unistra.fr/

Jérôme Wagner Modifications Post Traductionnelles et Cancérogenèse UMR 7242 Biologie et Signalisation Cellulaire (BSC) E-mail [email protected]

Fidélité de la Réplication, Dommages à L’ADN, Réparation par Réversion Directe et Mutagenèse

Principale source pour les illustrations: “DNA Repair and Mutagenesis ”, 1st and 2nd Ed., E. Friedberg et al., ASM Press

Agents physiques, chimiques, d’origine endogène ou exogène

Lésions (dommages) de l’ADN

Réparation

Tolérance

Mutagenèse

Cancer Evolution

Blocage Mort cellulaire

Persistance

Réplication

Dosage des lésions: Exposition + Réparation

Dosage des mutations : Exposition + Réparation

+ Mutagenèse+Susceptibilité

II. Origines et diversité des dommages dans l ’ADN Détection des lésions

III. Mécanismes de tolérances des lésions, définitions relatives à la mutagenèse

Détection des mutations

Notion de réparation par réversion directe

I. Bases de la fidélité de la réplication

Fidélité de la réplication

La vitesse de réplication peut atteindre plus de1000 nucléotides par seconde chez la bactérie,

50 chez les humains.

Bases de la fidélité de la réplication: Appariement des bases (Watson Crick)

ΔG (correcte/incorrecte) 2-3 kcal/mol


Bases de la fidélité de la réplication: Fidélité de la polymérase

E = enzyme = polymérase P/T = primer/template = ADN amorce hybridée à la matrice n= taille de l’amorce ES = complexe ternaire = polymérase+P/T+dNTP

Pn/T Pn/T

Pn+1/T

élongation


Bases de la fidélité de la réplication: Appariement des bases (Watson Crick) Sélection géométrique au sein du site actif de la polymérase


en noir, valeurs pour un nucléotide correcten rouge, valeurs pour un nucléotide incorrect


Aspect cinétique de polymérisation

Correction des mésappariements ou «mismatch repair (MMR)

Corrige les erreurs des ADN polymérases => augmente la fidélité de la réplication au moins 100 fois

Contrôle la recombinaison homologue en empêchant l’échange de brins entre séquences divergentes

4 étapes

1: recrutement de facteurs qui reconnaissent le mésappariements 2: recherche d’un signal discriminant le brin néosynthétisé 3: dégradation de la portion d’ADN contenant la mauvaise base 4: re-synthèse de la portion d’ADN excisé

Chez l’homme, un défaut dans MMR est responsable de la maladie HNPCC: cancer colorectal sans polypose (2% des cas de cancer colorectal; env. 750 nouveaux cas par an en France)


Correction des mésappariements ou «mismatch repair (MMR) Fidélité de la réplication

Polδ Polδ

Correction des mésappariements ou «mismatch repair (MMR) chez les eucaryotes


Paul L. Modrich

Aspect quantitatif

Mécanisme Facteur de fidélité Appariement des bases (W.C.) 101-102 Fidélité de l’ADN polymérase réplicative 105- 106 (proofreading inclus)

Protéines accessoires (SSB…) 107

Correction des mésappaiements 1010

(Mismatch Repair)


1 erreur sur 1010 nucléotides incorporés

Facteurs pouvant affecter la fidélité de la réplication

Inactivation des mécanismes de réparation des mésappariements

Modification de la balance du pool des nucléotides

Inactivation de l ’activité de correction de lecture

Mutations dans le site actif de la polymérase

Lésions de l ’ADN

Modifications de bases dans le pool des nucléotides (mésappariements possibles: dA/8-oxo-dGTP substitution de base)

Contexte de séquence (séquences répétées décalage du cadre de lecture)

AAF

10-1 x 107 ATGG 5 ’

TACCGCGGACA 3 ’ 5 ’

ATGGCCTGT 5 ’ TACCGGACA 3 ’ 5 ’ 10-8

Fréquence de mutation




Notions de réparation par réversion directe


Agents endommageant d’origine endogène

Altérations spontanées des bases de l’ADN

Dommages oxydatifs

Altérations spontanées des bases de l’ADN Tautomérisation des bases

G(e) / T

A(i) / C

C(i) / A

T(e) / G

Altérations spontanées de l’ADN

Sites sensibles

hydrolyse

oxydation

méthylation Site abasique

(Apurinic/ Apyrimidic = AP site)

Dépurination OH

Formation d’une cassure simple brin à partir d’un site abasique


Demi-vie du site abasique in vivo estimé à 400h. (Réaction largement stimulée à pH alcalin et haute température)


Déamination des bases

/A(>100/24h)

/C

/A

/T

Dommages oxydatifs

Sources des Espèces Oxygénées Réactives (ROS)

Réduction de l’oxygène (mitochondrie):

Espèces Oxygénées Réactives: Anion superoxyde (°O2-), peroxyde

d’hydrogène (H2O2), radical hydroxyle (°OH), oxygène singulet (1O2), oxyde nitrique (NO°)

O2 °O2- 2 °OH 2 H2O

e-, 2 H+

H2O2

e- e- e-, 2 H+

2% échappent au processus, soit 2 1010 molécules par jour par cellule (rat)

Macrophages, peroxydation des lipides (peroxysomes), NOS et iNOS

RH2 + °OH °RH + H2O Réactions en chaîne :

Réaction de Fenton : H2O2 + Fe2+ + H+ °OH + H2O + Fe3+

°OH

Dommages oxydatifs

Compartimentalisation : Noyau/mitochondrie/peroxysome

Défenses

Séquestration des métaux de transition (Fe2+ par ferritine)

SuperOxyde Dismutase (SOD): 2 O2° + 2 H+ 2 H2O2 + O2

Catalase: 2H2O2 2 H2O + O2

Glutathion peroxydase: H2O2 + 2 GSH 2 H2O + GS-SG

Systèmes enzymatiques

Dommages oxydatifs

Lésions induites: cassures simple/double brin, pertes de bases et bases modifiées

7,8-dihydro-8-oxo-2’-désoxyguanosine (8-oxoG)

Dommages oxydatifs

Lésions induites / risque

Altérations spontanées des bases de l’ADN Aspect quantitatif

> 30 000 lésions spontanées / jour/ cellule

Ana María León-Ortiz , Jennifer Svendsen , Simon J. Boulton Metabolism of DNA secondary structures at the eukaryotic replication fork DNA Repair (2014) Volume 19, 2014, 152 - 162

Structures secondaires de l’ADN comme obstacles à la réplication

Agents endommageant d’origine exogène

Radiations ionisantes

Rayonnement UV

Agents chimiques


Radiations ionisantes (> 10 eV)

Sources et doses naturelles

Radio du thorax/mammographie: 0,2-1 mSv Paris-Tokyo: 0,1 mS

Exposition limite autorisée: public: 1 mSv/12 mois travailleur: 20 mSv/12 mois



Interaction de l’énergie de la radiation avec l’ADN

ou

Interaction de l’énergie de la radiation avec des composants cellulaires autre que l’ADN qui vont eux réagir avec la macromolécule

H2O H2O+ + e-

H2O+ + H2O+ °OH + H3O+

°OH + °OH H2O2

Radiolyse de l’eau :

Locally multiply damaged sites (LMDS) Sites localement multi-lésés


a. Altération du squelette sucre-phosphate

Perte de base Altération du sucre

Cassure simple ou double brin Altération du groupement phosphate


b. Modifications de bases (cf dommages oxydatifs)


Radiations UV

100 280 315 400

CPD (Cyclobutane Pyrimidine Dimer)

Influence du contexte de séquence


Radiations UV


Radiations UV

Photoproduit Pyrimidine-Pyrimidone (6-4) en moyenne 3 fois moins nombreux que les CPDs

Principaux photoproduits dimériques

Principaux photoproduits monomériques


Radiations UV


Agents chimiques

Agents Alkylants (MMS, MNU, MNNG) Agents de pontage (Azote Moutarde, cis-Platine)

Intercalants (Psoralène)

Agents chimiques nécessitant une activation métabolique

Amines aromatiques (AAF) PHA (Hydrocarbures Polycycliques Aromatiques; B(a)P)

Aflatoxines


Agents alkylants

Centres nucléophiles des bases


Agents alkylants


Agents de pontage : le cis-Platine


Intercalants

UVA

Photosensibilisation


Déformation de l’hélice d’ADN par un pontage par le psoralène

46.5 ° “Unwinding“



For the cigarettes, mean values of BaP ranged from 3.36 ng to 28.39 ng per cigarette (Kaiserman MJ, Rickert WS, Am J Public Health. 1992 Jul;82(7):1023-6)

Dommages à l’ADN et structure de la chromatine

Selon l’état de la chromatine, et la position de la « cible », celle-ci est plus ou moins

vulnérable à la formation de lésions

Dommages à l’ADN et structure de la chromatine

Copyright ©2005 by the National Academy of Sciences

Besaratinia, Ahmad et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 10058-10063

Quantifying CPDs in the genome by immuno-dot blot assay

Détection des Dommages à l’ADN

Détection de lésions UV par dosage immunochimique


Détection de ponts inter-brins


Méthodes électrophorétiques (détection des cassures de chaînes)


Principe de l’essai comète (Single Cell Gel electrophoresis, SCG)

Densité et taille de la queue proportionnelle à la quantité

de dommages


Les dommages oxydatifs (8-oxoG) générés par des radiations ionisantes sont mises en évidence par un traitement enzymatique supplémentaire (ici glycosylase Fpg)

Exemple d’un essai comète

HPLC–MS/MS elution profile of the enzymatic digest of DNA of human keratinocytes that have been exposed either to UVB radiation (left panel) or successively to UVB and UVA radiations (right panel).


Méthodes chromatographiques (détection des bases ou nucléotides modifiés)

ADN dNMPs Nucléases

Chromatographie liquide haute perf. (HPLC) + Spectrométrie de masse (MS)

Mais que fait la cellule ?

« Réverse » le dommage: restaure l’ADN sans excision

Enlève le dommage: Base Excision Repair (BER) et Nucleotide Excision Repair (NER) (implique l’incision de l’ADN et re-synthèse) Recombinaison

Tolère le dommage: Synthèse Translésionnelle (TLS; potentiellement mutagène) Contourne le dommage (mécanismes type recombinaison)

Réparation de l’ADN

D ’après Hoiejmakers Nature (2001)

Réparation par Excision de base

(BER)

Réparation par Excision de nucléotide

(NER)

Réparation par Recombinaison (HR, NHEJ)

Réparation de Mesappariement

(Mismatch Repair)

Réversion Réversion

Paul L. ModrichAziz SancarTomas Lindhal

Photo-réactivation enzymatique: Pyrimidine Dimer-DNA Photolyases and (6-4) Photoproduct - DNA Photolyases

Réparation par réversion directe

Activité ubiquitaire mais non démontrée chez les mammifères placentaires

(Photolyase)

Pyrimidine Dimer-DNA Photolyases


Needs light and co-factors

FADH: 1,5-dihydroflavin adenine dinucleotide

MTHF: (5,10-methenyltetrahydrofolyl)polyglutamate

reduced


Réversion des bases méthylées

La réponse adaptative

N-METHYL-N'-NITRO-N-NITROSOGUANIDINE


Réversion des bases méthyléesProtéines impliquées

O6-methylguanine, O4-methylthymine: Ada (O6-AGT I) , O6-AGT II; O6-MGT

Enzymes« suicide »

N1-methyladenine, N3-methylcytosine : AlkB; ABH1, ABH2, ABH3


Réversion des bases méthyléesProtéines impliquées


Ligase + cofacteurs (NAD/ATP, Mg2+)

Ligation des cassures simple brin

Spécifique des cassures possédant une extrémité 3’OH et 5’P (cassure “propre”)


Conclusions

Le produit d’un seul gène est requis: économie de l’informationgénétique. Le cas des O6-AGTs/MGT est énergétiquement coûteux

Cinétiquement avantageux car à priori plus rapide qu’un mécanismeen plusieurs étapes (BER, NER)

Mécanismes fidèles car hautement spécifiques et ne nécessitant pasde synthèse d’ADN post-excision




Notions de réparation par réversion directe


Définitions relatives à la mutagenèse

Mutagenèse spontanée

Mutagenèse induite (Mécanismes de tolérances des lésions, Synthèse Translésionnelle)

Méthodes d’analyses

Quelques définitions:

Mutation: Changement, génétiquement transmissible, dans le génome d’un organisme ≠ lésion !

Génotype: Ensemble de l’information génétique portée par le génome d’un organisme On ne précise en général que les variations par rapport au génotype “sauvage“

Phénotype: Ensemble des caractéristiques observables d’un organisme (manifestation phénotypique d’une mutation)

Mutant: Un organisme qui contient une ou plusieurs mutations dans son génome par extension, on parle aussi de séquence mutante, de protéine mutante

Mutagène: Toute substance qui provoque une augmentation de la fréquence d’apparition de mutations

Mutagenèse: Le processus par lequel les mutations sont générées Mutagenèse spontanée: qui a lieu en absence de traitement exogène Mutagenèse induite: qui a lieu suite à un traitement exogène

Mutation conditionnelle: phénotype exprimé uniquement dans certaines conditions (exemples: mutation thermo-sensible, tissu/organe spécifique)

Mutation auxotrophe: qui cause un défaut dans la synthèse d’un métabolite essentiel

Mutation létale: qui rend l’organisme non viable

Les différentes classes de mutations

Mutations ponctuelles:

n’affectent qu’une ou quelques paires de bases: Substitutions de bases Décalage du cadre de lecture

Mutations impliquant des réarrangements plus importants:

Mutations à l ’échelle chromosomique

Les différentes classes de mutations

Impliquent des mécanismes de recombinaison intra ou inter-chromosomique

A:T T:A

C:G G:C

TRANSITIONS

A:T T:A

C:G G:C

TRANSVERSIONS

Mutations ponctuelles: Substitutions de bases

Pu Pu Py Py Transitions =

Pu Py Py Pu Transversions =

Mutations ponctuelles: Décalage du cadre de lecture (Frameshift)

= insertion ou délétion de (3n ± 1) nucléotide(s)

ADN : 5’ GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GAT 3’

ARN : 5’ GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU 3’

Protéine : Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp 3’

GC A

ARN : 5’ GCU GCU GCU GCG CUG CUG CUG CUG 3’

ARN : 5’ GCU GCU GCU GCU CUG CUG CUG AU 3’

ARN : 5’ GCU GCU GCU GCU GCU GAC UGC UGA 3’

Protéine : Ala Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu 3’

Protéine : Ala Ala Ala Ala Leu Leu Leu 3’

Protéine : Ala Ala Ala Ala Ala Asp Cys STOP 3’

Mutations ponctuelles: Mutagenèse par glissement

glissement mésappariement

+ réalignement

dislocation

frameshift frameshift substitution

Importance du contexte de séquence. Les séquences homopolymériques, type GGGGGGG, sont très susceptibles à la mutagenèse par décalage du cadre de lecture.

Mutations ponctuelles: Substitutions de bases : conséquences

AAA AAG Lys Lys Silencieuse

AAA ATA Lys Ile Faux sens

AAA TAA Lys STOP Non sens

Gain de fonction

Perte de fonction

Perte de fonction

Fonction inchangée

Fonction inchangée

ADN Protéine

Réversion


Mécanisme Facteur de fidélité Appariement des bases (W.C.) 101-102 Fidélité de l’ADN polymérase réplicative 105- 106

Protéines accessoires (SSB…) 107

Correction des mésappaiements 1010

(Mismatch Repair)

Erreurs de réplication

1 erreur sur 1010 nucléotides incorporés

Mutations


Mutations générées par des répétitions directes

5’ …AGTCGTCAGTACGCCGTACCTGAATTTT…TTTTTTAGTACGCCGTAC… 3’

Formation de structures secondaires (Hairpin)

Maladies à triplets: découlent de l’instabilité de séquences répétées (type microsatellite)

X fragile (CGG)n 6< n <53 : normal 60< n <230: malade

5’ AGTCGTCAGTA TAC… 3’

TG

G

C

CCC

AAC

C

G

GC

T

G

..........

......

Délétions, Extensions

Mutagenèse induite (par des lésions)

anneau de processivité

Les lésions peuvent provoquer un blocage de la fourche de

réplication

Mort cellulaire

Levée du blocage =

Tolérance

Les mécanismes de tolérance des lésions Régression de

fourche

« Réparation » par recombinaison

Evitement de la lésion

Fidèle

Mutagène

Synthèse translésionnelle

(TLS)

M

Méthodes d’analyses

In vivo : spectres de mutagenèse

potentiel mutagène et génotoxique, génétique de la mutagenèse

utilisation d’ADN mono-modifiés

In vitro : extension d’amorces (analyse fine des mécanismes moléculaires de la mutagenèse)

Animal entier bactérie Cellules humaines en culture

Méthodes d ’analyse de la mutagenèse

Principes généraux

Exposition aux mutagènes

Méthodes d ’analyse de la mutagenèse

Principes généraux

ADN cible : l’apparition d’une mutation permet la sélection du mutantExemples : lacI (seuls les mutants poussent en présence d’un analogue du galactose)

lacZ (sélection phénotypique sur milieu indicateur)rif (seuls les mutants poussent en présence de l’antibiotique Rifampicine)HPRT (seuls les mutants poussent en présence de l’analogue 6-thio-guanine)

Modification : Exposition in vitro ou in vivo à l’agent mutagène; notion de doses; activation métabolique potentiellement requise

Réplication : in vitro ou in vivo; choix de l'hôte (fond génétique)

Analyse: détermination du spectre de mutagenèse, du pouvoir mutagène et potentiellement toxique de l’agent testé, étude génétique

Mutagenèse en avant : on ne sélectionne pas, à priori, de type particulier de mutations

Mutagenèse par réversion : seules les mutations d’un type donné sont observées

Points chauds de mutagenèse (Hot spot)

Exemples de spectres de mutagenèse en avant déterminés dans E. coli (cible=lacI)

“Signature“ de l’agent mutagène

Exemples de cibles pour l’étude de la mutagenèse par tests de réversion (Claire Cupples and Jeffrey Miller)

Maladies associées à des gènes de réparation

Syndrome Type de voie de instabilité Types de réparation affectée génétique cancers associés

Xeroderma NER (± TCR) Mutations Cancer de Pigmentosum « classique » ponctuelles la peau (UV)

Ataxia Réparation de Aberrations telangiectasia (AT) cassure double-brin chromosomiques Lymphomes Syndrome de Nijmegen Recombinaison Aberrations Lymphomes

homologue (?) chromosomiques BRCA1/BRCA2 RH Aberrations Cancer du

chromosomiques sein et ovaire Syndrome de Werner RH / TLS Aberrations variés

chromosomiques Syndrome de Bloom Réparation de Aberrations Leucémies

cassure double-brin chromosomiques Lymphomes HNPCC Réparation des Mutations Cancer

mesappariements ponctuelles colorectal

Xeroderma Synthèse Mutations Cancer de Pigmentosum variant translésionnelle (TLS) ponctuelles la peau (UV)

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