UE 8 - De l’agent infectieux à l’hôteDate : 08/02/16 Plage horaire : 14h-16hPromo : P2 2015 -2016 Enseignant : JJHRonéoiste : CELESTIN Kevin

La cellule bactérienne Morphologies et Structures bactériennes

I. Généralités

1. Qu’est-ce qu’une bactérie 2. La place des bactéries dans le règne vivant 3. Organisation des cellules eucaryotes et procaryotes 4. Morphologies bactériennes

A. Les formesB. L’arrangement caractéristique

II.Structures cellulaires

1. Les composants obligatoires A. La membrane cytoplasmiqueB. Le cytoplasme (cytosquelette, nucléoïde, corps d’inclusions…)C. La paroi (structure, caractéristiques)

2. Les structures facultatives A. La capsule, couche mucoïde, couche SB. Pili et FimbriaeC. Les flagelles et la chimiotaxieD. La sporeE. Les plasmides

a) Conjugatifsb) De résistancec) Bactériocinesd) De virulencee) Métaboliques

III. Taxonomie

1. Taxonomie moléculaire 2. Classification médicale

A bon entendeur : il ne va pas insister sur ce point, laissant à ses collègues « l’honneur de le faire »)

NB : Ne pas oublier de ramener une blouse en coton et pas les blouses de service en TP.

I. Généralités

1. Qu’est-ce qu’une bactérie ?

Observées pour la première fois à la fin du XVIIème siècle (A. Van Leeuwenhoek : « animalcules »), ce n’est qu’au XIXème siècle qu’on découvre leur rôle dans la fermentation (L. Pasteur) et la transmission de pathologies (R. Koch, qui a donné son nom aux bacilles de Koch, agents de la tuberculose).

2. La place des bactéries dans le règne vivant

Procaryotes et eucaryotes font partis du monde du vivant, alors que les virus n’en font pas partis. Procaryote indique qu’on a à faire à des cellules n’ayant pas de noyaux clairement définis, contrairement aux eucaryotes chez lesquels on pourra retrouver des êtres unicellulaires ou pluricellulaires.

Parmi les procaryotes, on devra bien distinguer les archées (exemptés de pouvoir pathogène pour l’homme) des bactéries.

On peut comparer les ordres de grandeur des différents êtres vivants. Certains parasites (vers intestinaux) peuvent être plus grand que l’homme.

Les bactéries ont une taille de l’ordre du micromètre (de 0,1 à 10 micromètre en général), équivalente à celle des mitochondries et qui est inférieure à la taille du noyau d’une cellule eucaryote.

En dessous, on va retrouver les virus qui sont inférieur à 100 nm et en dessous on retrouvera des protéines (prions…).

Il suffit de regarder l’arbre du vivant pour comprendre que les bactéries occupent une place très importante au niveau de celui-ci. On retrouvera énormément de bactéries pathogènes ou non pour l’homme.

3. Organisation des cellules eucaryotes et procaryotes

En moyenne la taille d’une bactérie va de 0,2 à 2,5 micromètre. On peut tout de même descendre à 0,1 micromètre et monter jusqu’à 100 micromètre voir plus. La taille moyenne d’un eucaryote est comprise entre 2 et 20 micromètres.

Au niveau de la cellule bactérienne, il n’y a pas de noyau avec une bicouche lipidique qui va déterminer une structure bien particulière. Néanmoins, le matériel génétique n’est pas libre dans la cellule et va se retrouver bien localisé.

Classiquement chez les bactéries, on va retrouver un unique chromosome circulaire. Il existe cependant des bactéries avec plusieurs chromosomes et certaines bactéries peuvent avoir des chromosomes linéaires et non pas circulaires.

Tous les systèmes d’empaquetages endomembranaires n’existent pas chez les procaryotes (organites, mitochondries, lysosomes, golgi, RE).

Néanmoins eucaryotes et procaryotes possèdent tous une machinerie cellulaire et notamment des ribosomes bien qu’ils se distinguent structuralement entre procaryotes et eucaryotes.

4. Morphologie bactériennes

Les différents aspects concernant la morphologie bactérienne sont essentiels, notamment lorsqu’on veut faire du diagnostic et de l’identification bactérienne. Il y a plein d’outils possible et utilisables aujourd’hui (moléculaire…) mais, du moins en clinique, on reste encore avec des critères d’identifications relativement simples.

A. Les formes

Sphérique (coque) ou bâtonnet (bacille), on distingue principalement 2 formes.

Il existe cependant une très grande diversité d’autreformes (spiralées…).

B. L’arrangement caractéristique

Un 2ème niveau d’observation s’intéresse à comment s’organise ces différents types bactériens, ce qui va permettre de faciliter leur identification. C’est une identification en fonction de la forme et de l’arrangement caractéristique.

Coques : Cellules individuellesPaires : diplococcusChaines : Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus Amas/grappes : StaphylococcusTétrades : MicrococcusSarcina : agglomérats de 8 cellules

Ces divers arrangements sont liés au plan de division cellulaire

Bacilles : Cellules solitaires le plus souventQuelque cas de paires ou chaînes : Bacillus megaterium Rapport longueur/largeur très variableNB : coccobacilles = très courts + très large aspect de coques

Autres : Vibrions : aspect en bâtonnets incurvés en virgulesSpirilles : bactéries spiralées +/- présence de flagelles (touffes) à 1 ou 2 extrémités Spirochètes (cas particulier de spirilles) : flagelle interne dans EIM (Leptospira, Borrelia,

Treponema)Actinomycètes : forme un mycélium similaire aux champignon filamenteux.

L’observation au MO (x1000), quoi que peu détaillée, constitue la 1ère étape de l’identification (schéma ci- dessus à bien connaître).

IV. Structures cellulaires Toutes les bactéries vont au moins disposer d’une paroi bactérienne (composée de peptidoglycanes), puis d’une membrane cytoplasmique entourant donc un cytoplasme contenant un nucléoïde.Effectivement, en l’absence de noyau c’est dans cet espace que s’organise le matériel génétique (ADN, ARN, protéines). Des ribosomes et des corps d’inclusion (faisant office de réserve énergétique) sont aussi retrouvés. L’ensemble de ces éléments représentant les éléments communs obligatoires.

D’autres structures comme la capsule, la couche S, ou des systèmes entraînant la formation d’une sorte de mucus, mais aussi les flagelles, vont faire parties des structures facultatives des bactéries.

Membrane cytoplasmique : barrière perméable sélective, limite mécanique de la cellule, transport des éléments nutritifs et des déchets, localisation de plusieurs processus métaboliques (respiration, photosynthèse), détection de signaux de l’environnement pour le chimiotactisme.

Espace péri-plasmique : Contient des enzymes hydrolytiques et les protéines de liaison nécessaires à la capture et la transformation nourriture.

1. Les composants obligatoires

A. La membrane cytoplasmique

Elle ressemble parfaitement à la membrane cytoplasmique d’une cellule eucaryote et est constituée :- D’une bicouche lipidique (têtes polaires, queues apolaires)- De protéines intrinsèques et extrinsèques- Sur la face externe, des sucres sont rattachés soit aux protéines soit aux lipides membranaires. Ainsi, comme chez les eucaryotes, cette membrane est asymétrique et polarisée.

Dans beaucoup d’ouvrages on indique que les bactéries, pour augmenter leur espace d’échange avec le milieu environnant sont capables de former des replis membranaires (sortes d’invaginations membranaires) qui semblent indiqués qu’à certains endroits on peut avoir des extensions associées à des fonctions bien particulières. Les dernières études semblent montrer que ce sont des artéfacts expérimentaux. En réalité, c’est lorsqu’on fixe les bactéries et qu’on essaye de les observer qu’on observe ces structures mais que naturellement elles n’existeraient pas. Toutes ces structures qu’on appelle des mésosomes, des lamelles ou des tubes qui seraient liées à des invaginations membranaires plus ou moins complexes seraient des artefacts qui n’existeraient pas en réalité.

La bicouche lipidique doit avoir une certaine fluidité. Chez les eucaryotes, cette fluidité peut être modulée en fonction de la température de l’environnement par des stérols (cholestérol). Les bactéries n’ont quasiment pas de cholestérol à quelques exceptions près. Cependant les hopanoïdes, un type particulier de stérol, vont venir jouer le même rôle de modification de la fluidité membranaire chez les bactéries.

B. Le cytoplasme (cytosquelette, nucléoïde…)

A l’intérieur de cette membrane cytoplasmique, on retrouve tout le contenu bactérien.

Protoplaste = Membrane cytoplasmique + Contenu bactérien.

Au niveau de ce protoplaste, on ne retrouve pas d’organites internes mais on va retrouver un cytosquelette, un certain nombre de corps d’inclusions, tout ce qui est nécessaire à la machinerie cellulaire (ribosomes…), un nucléoïde (structure qui va remplacer le noyau) et en fonction des bactéries, on retrouvera du matériel génétique qui est considéré comme extra-chromosomique (plasmide(s) facultatifs).

Tout cela est en suspension dans de l’eau, qui représentant 70% de la masse d’une bactérie.

Cytosquelette : Comme les eucaryotes, les bactéries possèdent des éléments du cytosquelette (microfilaments, filaments intermédiaires, microtubules) assurant les mêmes fonctions que chez les eucaryotes.- Il confère aux bactéries leur forme (coque, bacille…).- Il permet la localisation protéique au sein de sites cellulaires.- Il participe au mécanisme de division cellulaire.

Les corps d’inclusions : Ce sont des granules de matière organique ou inorganique (leur nombre est variable en fonction de l’état nutritionnel de la cellule car ce sont des structures de stockage pour la plupart)

Types d’inclusion : Organique : Glycogène, Réserve énergétiquePHB (Poly-bêta-Hydroxybutirate (C, N)

Inorganique : Granules de P, S, Fe Réserve énergétique Granules de volutines + métabolisme (P pour ADN) Vacuoles gazeuses (= flottabilité)

Fonction : Eléments de réserves essentiellement Empaquetage de molécules

Ces corps d’inclusions peuvent être inclus ou non dans une monocouche de protéines et de phospholipides pour finalement assurer la même fonction que des structures endomembranaires (rôle de membrane).

Granules de volutines : Stock de phosphate sous forme ortho-phosphaté.

Vacuole gazeuse : Permet à la bactérie sans système locomoteur de flotter et quelque part de se déplacer dans un environnement aquatique.

Le nucléoïde : Chez les procaryotes, il n’y a pas d’enveloppe nucléaire. On va avoir un nucléoïde dont la forme n’est pas définie (forme irrégulière).

Composition :- 60% ADN (empaqueté par enroulement sur lui-même, histones équivalents aux H1 et H2 trouvés chez les arquées ; donc probablement qu’ils en existent chez les bactéries)- 30% ARN- 10% de protéines (participant à l’empaquetage de l’ADN)

Génome : Un unique chromosome généralement circulaire mais pas toujoursExemple : Leptospira possède 2 chromosomes et Borrelia Burgdoferi en possède 1 linéaire.

Réplication en mode thêta à partir d’une unique origine de réplication (ORI) par chromosome.

1 à 2 copies par cellules, enchâssées dans la membrane plasmique (permettant l’éloignement de chacune des copies l’une de l’autre) et ségrégant dans chacune des cellules filles par un système de partition (une dizaines de gènes « par »).

Exemple : Lorsque E. Coli est dans des conditions optimales de croissance (nutriments…), elle est en état de division permanente. Elle se met à répliquer même lorsqu’elle est en croissance. Très souvent, on verra donc plus d’un seul chromosome dans une bactérie.

Ce schéma illustre la réplication en mode thêta. Elle se fait onc toujours à partir d’une origine de réplication (ORI). Une fois cette dernière dupliquée, elle reste étroitement liée à la membrane et grâce aux mouvements du cytosquelette, les 2 chromosomes fils se séparent. Un septum (protéines se forme alors et permet la séparation des 2 cellules filles.

C. La paroi bactérienne

La paroi : Couche rigide située à l’extérieure de la membrane plasmique (à l’origine de la coloration de GRAM).

Qu’on soit chez les GRAM+ ou les GRAM-, une des fonctions de la paroi est qu’elle va constituer une couche rigide au-delà de la membrane cytoplasmique qui va permettre de protéger la bactérie contre le choc osmotique et participer également à lui conférer sa forme. La paroi contribue aussi au pouvoir pathogène.

Au-delà de la membrane plasmique (MP), la paroi est beaucoup plus épaisse chez les GRAM+ que chez les GRAM-.

Au-delà de la MP chez les GRAM+, il y a un espace péri-plasmique (P) et à l’extérieur, une succession de couches épaisses de peptidoglycanes.

Au-delà de la MP chez les GRAM-, il y a un espace péri-plasmique (P), puis une seconde membrane (OM) qu’on appelle la membrane externe. Au-dessous de la MP, on retrouve 1 ou 2 couches de peptidoglycanes.

C’est un aspect très important en termes d’identification bactérienne car toutes les bactéries n’ont pas une paroi formée de la même façon. Elle va conférer des propriétés différentes aux bactéries et une notamment qui est la coloration de GRAM. Les GRAM+ retiennent le colorant alors que les GRAM- ne le retiennent pas.

GRAM + : Membrane cytoplasmique avec des protéines membranaires + couche épaisse de peptidoglycanes et notamment au sein de ces peptidoglycanes de l’acide lipotéichoïque, structures lipidiques, permettant de relier cette couche épaisse de peptidoglycanes à la couche externe de la MP.

GRAM - : Membrane interne cytoplasmique + espace périplasmique (avec 1 à 2 couches de peptidoglycanes) et une membrane externe souvent riche en protéines car elle doit pouvoir permettre les échanges avec le milieu extérieur (on y retrouvera des pores ; toutes les molécules de plus de 200 nm vont devoir passer par des transports actifs). Souvent chez les GRAM-, on retrouvera des lipopolysaccharides (LPS) enchâssés au niveau de la couche externe de la membrane externe.

Structure de la paroi

1 couche épaisse et homogène de peptidoglycanes (muréine) de 20-80 nm d’épaisseur se trouvant juste à l’extérieur de la membrane plasmique

1 couche de peptidoglycanes (muréine) de 2-7nm d’épaisseur

+1 membrane externe de 7-8nm d’épaisseur

En termes de terminologie, pour bien préciser les choses :

La paroi = Peptidoglycane +/- Membrane externe (si gram -)

L’enveloppe = Ensemble des structures à l’extérieur de la MP= Paroi + Périplasme (contenu de l’espace périplasmique) + Capsule.

Structure de la paroi : Coloration de GRAM (automatisée aujourd’hui)

Après avoir vu les caractéristiques des parois des bactéries GRAM+ ou GRAM-, il faut aborder le principe de cette coloration GRAM qui est à la base de nombreux diagnostics.

Protocole : Les bactéries sont colorées au violet de gentiane (ou au cristal violet) qui traverse l’enveloppe et colore le cytoplasme. Puis elles sont plongées dans du lugol (mordançage) qui se fixe au niveau de toutes les structures protéiques présentes dans la cellule, ce qui permet de maintenir la coloration.

Les bactéries sont soumises à l’action décolorante de l’alcool qui traverse très bien les bicouches lipidiques. Les GRAM+ ayant une paroi plus épaisse et plus imperméable à l’alcool ne se décolorent pas. (Il ne faut pas dépasser un temps limite car l’alcool pénètrerait aussi dans les GRAM +)

Afin de mieux visualiser les bactéries décolorées (GRAM-), on procède à une contre coloration à l’aide de fuchsine ou de safranine.

Les bactéries GRAM + apparaissent violettes et les bactéries GRAM- se recolorent en rosé/orange.

Structure de la paroi : Le peptidoglycane (= couche de muréine)

C’est un enchainement alterné de sucres (N-acétyle-Glucosamine « NAG » et acide N-acétyle-Muramique « NAM ») associés à des tétrapetides (L-alanine, D-glycine, D-Glu, L-Lysine, D- alanine, DAP) constitués d’acides aminés L et D alternés, reliés entre eux par pontage direct ou par des liaisons esters inter-peptides.

Il assure rigidité et protection des bactéries (limite le passage des antibiotiques)

Il est aussi la cible d’antibiotiques et du lysozyme (ciblant les acides aminés. L non dégradés par les peptidases)

Caractéristiques des parois : Récapitulatif

(Echange + compliqué avec milieu extérieur) (Protéines de la membrane externe) (Présence de la membrane externe)

Il faut noter que l’acide téichoïque est présent en grande quantité chez les GRAM+, alors qu’il est quasiment absent chez les GRAM- On l’utilise donc en tant que facteur de détection.

Parmi les composés importants qu’on retrouve chez la plus grande partie des bactéries GRAM-, on peut citer le lipopolysaccharide (LPS) qui est une structure ancrée à la membrane externe se divisant en 3 parties :

1) Le lipide A (partie lipidique du LPS) permet l’enchâssement dans la couche lipidique de la membrane externe. Il est cytotoxique. Ainsi, quand une bactérie GRAM- meurt et qu’une grande quantité de LPS est répandu, on peut avoir un effet toxique sur les cellules (endotoxine, attention au traitement antibiotique tardif pouvant libérer cette toxine en grande quantité en tuant beaucoup de bactéries et causer des dommages).

2) Une structure polysaccharidique centrale qui est plus ou moins variable

3) La chaine externe, appelée chaine latérale O (peptide O, antigène O) va être variable en fonction des bactéries GRAM- et peut déclencher la réponse des cellules immunitaires libérant des médiateurs de l’inflammation (cytokines). Lors de décharges importantes d’un foyer lésionnel dans le sang, beaucoup de GRAM- arrivent d’un coup, activant fortement le système immunitaire et libérant ainsi des cellules pro-inflammatoires. Des phénomènes de vasodilatation disséminées vont avoir lieu, conduisant au choc septique. Elle peut participer (en se détachant de la bactérie) à la formation des biofilms.

Les LPS protègent les bactéries des sels biliaires, antibiotiques, substances toxiques et permettent de filtrer les grosses molécules (tamis moléculaire ; les molécules >600-700nm de passent pas).

Biofilms : Débris issus des bactéries au sein desquelles elles vont pouvoir se développer formant un maillage filtrant les échanges entre les bactéries en communauté et le milieu extérieur (passage des cellules du système immunitaire, des antibiotiques…) problème en clinique (Exemple : prothèse de hanche qu’il va falloir changer si présence de biofilms car les antibiotiques ne sont plus efficaces).

2. Les structures facultatives

Jusqu’à maintenant, nous avons vu les structures communes à l'ensemble des bactéries. Nous allons nous intéresser ici aux structures facultatives, ce qui ne veut pas dire pour autant qu'elles ne sont pas importantes. On peut retrouver ces composants chez certains types de bactéries ou uniquement à certains stades de développement de la bactérie.

Ce sont différentes structures qui vont conférer un pouvoir pathogène aux bactéries :

Rq : La différence entre pili et Fimbriae réside surtoutdans leur fonction.

A. La capsule, couche mucoïde, couche S (différences mineures entre ces 3 appellations)

Ce sont des couches supplémentaires à l’extérieur de la paroi (peptidoglycanes +/- membrane externe) cellulaire.Capsule : Bien organisée et homogèneCouche mucoïde : DiffuseCouche S : Régulièrement structurée en forme de pavement régulier de protéines et glycoprotéines.

Rôles :- Résistance à la phagocytose (exemple : Staphylococcus Pneumoniae) facteur de virulenceLes bactéries survivent à l’intérieur des corps d’endocytose et des phagosomes (macrophage, PNN)

- Repousse les substances hydrophobes toxiques (exemple : détergents comme la Javel) Filtration des échanges avec l’extérieur augmente car il y a plus de couches

- Protection contre la dessiccation (Riche en eau)

- Attachement aux surfaces solides

- Facilite la mobilité bactérienne par formation d’un mucus qui avec le LPS facilite la formation du biofilm.

Les constituants de la capsule sont recherchés comme marqueurs diagnostiques de l’infection.

B. Pili et Fimbriae

Globalement en MO, avec un bon grossissement et une bonne coloration, on va observer des poils.

Il existe des poils particuliers qu’on appelle le ou les pili sexuels qui vont participer à la sexualité bactérienne. C’est-à-dire la capacité d’échanger du matériel génétique par un mécanisme qu’on appelle la conjugaison qui est un mode de transfert horizontal de gêne, les bactéries n’étant pas des organismes sexués.

Il existe aussi des poils particuliers qu’on appelle des fimbriaes, qui jouent un rôle dans l’adhésion des bactéries (notamment pathogènes) à leur hôte.

Fimbriaes et pili sexuels sont composés de piline. Cette composition et notamment sa signature antigénique est variable d’une bactérie à l’autre et conditionne l’adhésion des bactéries (notamment ces fimbriaes ; leur composition fait que ces bactéries vont avoir une affinité pour certains tissus (pulmonaire, rénaux…).

Toutes les bactéries vont avoir une affinité pour des tissus distincts en fonction des fimbriaes qu’ils portent. Cela peut être un critère pour distinguer différents types bactériens.

La différence de diamètre en pili et fimbriae n’est pas si importante car le matériel génétique ne passe pas à travers le pili sexuel. En fait, c’est simplement un appendice qui attache les 2 cellules bactériennes et qui les rapprochent. Puis d’autres mécanismes vont permettre de faire l’échange. Néanmoins, il est indispensable pour assurer la conjugaison. Les échanges par pili peuvent concerner plusieurs bactéries (jusqu’à 10 !).

C. Les flagelles et la chimiotaxie

Flagelles : Appendices locomoteurs, souvent de grande taille (diamètre : 20nm /15-20μm longueur) qui s’étendent à l’extérieur de la membrane cytoplasmique, visibles par coloration.

Le filament est extrêmement long, rigide et est constitué de flagelline. Il est raccroché à la structure motrice grâce à un crochet (segment intermédiaire) qui est courbe.

ANNEAUX/PLATEAUX GRAM- GRAM+NOMBRE 4 2

EXTERNE 2 : 1 lié à la membrane externe Absent (L)

1 lié au peptidoglycanes (P)INTERNE 2 dont 1 lié à la membrane 2 : 1 lié à la membrane externe

plasmique (S et M) 1 lié au peptidoglycane

Il existe des bactéries sans flagelles et en fonction des bactéries, on peut les retrouver à différentes positions.

NOMBRE DE FLAGELLES

POSITION BACTERIE SCHEMA

1 Monotriche

1 Extrémité Monotriche polaire

2 1/Extrémité Amphitriches

PLUSIEURS (TOUFFES)

1 ou 2 extrémités

Lophotriches

PLUSIEURSSur toute la surface

Peritriche

NB : Spirochètes = présence de flagelles péri-plasmiques (dans l’EIM, GRAM-) formant un filament axial tortillement

Flagelles et chimiotaxie : Fonctionnement des flagelles

Mouvement de rotation : Au niveau du corps basal, induit par un gradient de Na+ ou de H+ (pas d’ATP). 270 tr/s chez E. Coli ; 1100 tr/s chez Vibrio Olginolyticus 20-90 μm/sLa vitesse de déplacement est grande rapportée à la dimension de la bactérie.

Sens horaire ou antihoraire : Détermine le sens de rotation et d’avancement de la bactérie (avance/recule) Spirochètes : filament axial tortillement et déplacement tant bien que mal.

Chimiotaxie : Orientation du déplacement contrôlée par des chimiorécepteurs localisés dans la membrane plasmique ou dans le périplasme s’effectuant par succession de courses/culbutes.

Substance attractives = Eléments nutritifs (sucres, acides aminés…) Substances répulsives = Substances nuisibles, déchets bactériens… Signaux environnementaux (T°, O2, P° osmotique, lumière…)

Le déplacement des bactéries s’effectue par des alternances de courses et de culbutes en fonction du gradient de substances attractives/répulsives (= chimiotactisme)

- Course : Flagelles en faisceau déplacement en ligne droite ou courbe durant quelques secondes (Les flagelles tournent toutes dans le même sens)

- Culbute : Dispersion des flagelles arrêt + culbute réorientation aléatoire de la bactérie. (Arrêt simultané de tous les flagelles)

Gradient de substrat nulle déplacement au hasard (fréquence course/culbute aléatoire)Gradient de substance attractive course + longue / culbute - fréquente déplacement vers les côtés les plus élevésGradient de substance répulsives Fréquence de culbute diminue lorsque la bactérie s’éloigne du répulsif

Les bactéries peuvent alors se rapprocher ou s’éloigner d’une région particulière.

D. Les spores (ou endospores)

Endospore = spore = structure de multiplication végétative extrêmement résistante qui se développent dans les cellules de quelques genres bactériens (surtout GRAM+, exemple : Bacillus, Clostridium).

C’est une structure de survie. Les bactéries capables de sporulation ne vont le faire qu’à un stade particulier de leur croissance, dans des conditions bien particulières.

Résistance à : Chaleur (120°), UV, Rayon γ, Désinfectant chimique, Dessiccation, Temps (DLUO = 100 000 ans)

Elimination très difficile : Problématique si spores dans un bloc opératoire/service (fumigation) Si contamination de petits matériel, c’est plus simple : Pression, autoclavage

Rq : On a été capable de remettre en bourgeonnement des spores estimées à plus de 100000 ans.

Pourquoi les spores sont-elles aussi résistantes ?A l’extérieur on a une enveloppe extrêmement mince (l’exosporium) suivie en dessous d’une tunique +/- épaisse, constituée essentiellement de protéines. Puis on retrouve surtout un épais cortex (50% du poids de la spore) principalement constitué de peptidoglycanes, raison pour laquelle on va surtout retrouver la sporulation chez les GRAM+.

Sous le cortex, on a la membrane plasmique et à l’intérieur, les constituants bactériens (nucléoïde, ribosomes…) complètement déshydratés et enrichis d’ions calciques, de protéines particulières associées à l’ADN (protéines sasp). Associé notamment aux ribosomes, on retrouvera l’acide dipiconilic

Tout cela permet de rendre la structure extrêmement résistante.

Développement de la sporulation (7 phases)

Milieu nutritif pauvre/densité bactérienne suffisante (107-108 bac/ml) division cellulaire pour produire les spores. (Seul un dixième des bactéries vont faire de la sporulation)

Le début de la sporulation se passe comme si elle voulait rentrer en division : Réplication du génome bactérien (les 2 génomes sont alors enchâssés aux pôles de la membrane cytoplasmique).

Au lieu que le septum se mette en place pour séparer les 2 bactéries, on va avoir une réorganisation avec la formation d’un filament axial de matériel nucléaire de façon à assurer une division cellulaire inéquitable.

On va avoir à ce moment-là une invagination membranaire qui va isoler une partie de l’ADN venant former une préspore (ce qui va devenir la préspore occupe le moins d’espace cytoplasme beaucoup moins complexe).

L’autre cellule se sacrifie. Son matériel génétique se dégradera et sa membrane viendra entourer celle de la préspore.

Tout une machinerie va ensuite se mettre en place pour permettre le développement du cortex.

Entre la membrane cytoplasmique de la préspore et celle de l’autre cellule, on va avoir une accumulation de calcium, d’acide dipiconilic et tout cela va venir former la tunique et l’exosporium. A ce moment-là, la bicouche lipidique venant de l’autre cellule va tout simplement être éliminée.

Tout cela va se déshydrater et on a une structure de multiplication végétative, une structure de conservation qui se met en place. C’est un mécanisme relativement long (10h pour Bacillus Megaterium) alors qu’une division chez E. Coli prendra 20 minutes voire 1 heure.

Cette structure végétative peut revenir à la vie par un processus en 3 phases qui nécessite notamment de réactiver cette endospore et qui se produit lorsqu’elle va se retrouver dans un milieu notamment réhydraté, permettant de la réactiver, de détruire la tunique, l’exosporium…

On rentre ensuite dans une phase de germination (l’activité enzymatique, métabolique de la cellule se remet en place) et on parle d’émergence à partir du moment où cette spore recommence à synthétiser de nouveaux composés par elle-même.

Formation d’un filament axial de matériel nucléaire

1) Invagination de la membrane Isolement d’une partie de l’ADN (= septum de la préspore)

2) Préspore s’entoure d’une seconde enveloppe

3) Formation du cortex (accumulation de calcium et d’acide dipiconilic entre les 2 membranes)

4) Formation de la tunique

5) Endospore à maturité

6) Destruct° du sporange (cellule mère) par des enzymes lytiques Libération de la spore

(Retour à l’état végétatif en 3 phases (activation, germination, émergence)).

E. Les plasmides (intervenant dans mécanisme de multi-résistance)

Plasmides : petites molécules d’ADN double brins circulaires (quelque cas de plasmides linéaires très rares) facultatifs indépendants du chromosome bactérien (non enchâssés dans la membrane). Cette structure facultative peut poser problème en clinique. Il est considéré comme extra-chromosomique. Les bactéries n’ont pas besoin de plasmides pour assurer leur fonction, néanmoins, les plasmides vont pouvoir conférer de nouvelles propriétés aux bactéries dans lesquelles elles vont se retrouver.

Caractéristiques : Réplication autonome en mode Thêta ou Rolling Circle (système du tapis roulant).

Une coupure va être faite au niveau de l’un des monobrins de l’ADN double brin du plasmide et une AND polymérase va venir re-synthétisé le brin parental. Une sorte de filament va donc se mettre en place à partir de l’ORI. Le plasmide va être répliqué de façon continu, formant une grosse pelote d’ADN.

Nombre de copies variable : Unique (1 par cellule)Multiple le + souvent (nombre de copies faible <20/élevé jusqu’à plusieurs

centaines)

Généralement, il n’y a pas de système de partition lorsque la bactérie possédant des plasmides va se diviser, ces derniers vont se répartir de façon totalement aléatoire.Exemple : S’il y a peu de plasmides dans une bactérie, une des bactéries filles peut ne pas avoir de plasmide.

Les plasmides sont transférables horizontalement par conjugaison ou transformation Responsables des transferts de résistance (antibiotiques, insecticide…)

Particularités des plasmides : Certains de ces plasmides sont porteurs de gènes, et notamment de gènes de résistance (antibiotiques, insecticides…). On va essayer de classer ces plasmides en fonction des propriétés qu’ils confèrent.

Classification des plasmides : Conjugatifs / De résistance / Bactériocines / De virulence / Métabolique C’est un point important à retenir car lorsqu’on veut faire de la transformation bactérienne par conjugaison, il est important de reconnaître les particularités de chacun de ces mécanismes.

a) Les plasmides conjugatifs

Ils posent beaucoup de problèmes car ils peuvent conférer certaines résistances. Ils renferment les gènes codant notamment pour les pili sexuels. En effet, la formation de ces pili est gouvernée par la présence d'un plasmide dans le cytoplasme ou dans le génome cellulaire lorsqu'il a été intégré.

Les gènes portés par les plasmides conjugatifs, via la production de protéines qui vont coder pour les pili sexuels, vont permettre d'assurer le transfert de copies de ces plasmides conjugatifs vers d'autres cellules durant le mécanisme de conjugaison.

Une particularité du fonctionnement : Les plasmides conjugatifs vont porter des gènes dits facteurs de fertilité, d’où l'appellation plasmide F ou facteur F. Ils vont coder pour toute la machinerie nécessaire à la formation des pili sexuels et ont un mode de fonctionnement particulier, qui permet le transfert du facteur F d'une bactérie vers une autre, avec un sens de fonctionnement unique (c’est-à-dire que le pili sexuel ne va s'établir qu'entre une bactérie F+ possédant déjà un plasmide fertile et une bactérie F- n'en possédant pas). Si deux bactéries possèdent le facteur de fertilité, il n'y aura pas de conjugaison bactérienne.

Une propriété supplémentaire dans le cas de plasmide dits intégratif, ce plasmide va posséder des séquences d'insertion pour qu'il puisse s'intégrer au chromosome/génome de la bactérie hôte, mais ce n'est pas systématique.

Si le plasmide ne s’intègre pas dans le génome, il peut à nouveau faire de la conjugaison avec une autre bactérie, mais dans le cas particulier ou il intègre le chromosome de la bactérie hôte, s’il établit une connexion avec une autre cellule, il va pouvoir transférer une partie du plasmide mais aussi le chromosome

bactérien. Tout cela va contribuer à brasser du matériel génétique et permettre de faire évoluer les génomes bactériens.

Exemple : Plasmide du facteur de fertilité (Plasmide F ou facteur F)- Permet la formation des pili sexuels- Permet le transfert di facteur F d’une bactérie F+ vers une bactérie F-- Renferme des séquences d’insertion dans le chromosome de la bactérie hôte

b) Les plasmides de résistance (plasmide R ou facteur R)

Ils ressemblent beaucoup au plasmide F. La particularité est qu’ils confèrent une résistance (antibiotiques, pesticides…) car au sein de ce plasmide on va retrouver un ou plusieurs gènes (1 à 8 gènes R) qui codent pour des enzymes capables de détruire/modifier/inactiver des antibiotiques, pesticides…

Particularités : La différences majeure entre les plasmides R et les plasmide F c’est qu’ils ne sont pas intégratifs. Ils portent toutes les informations nécessaires à la conjugaison bactérienne (établissement du pili sexuel, transfert de matériel plasmidique d’une bactérie à l’autre), par contre le matériel qui est transféré ne s’intègre jamais au chromosome de la cellule receveuse.

Néanmoins ces plasmides R posent vraiment un problème en santé publique à l’origine des mécanismes de multi-résistances. Une bactérie portant un plasmide R à un antibiotique pourra le transmettre à des bactéries qui ne l’ont pas, sachant que ce transfert peut s’effectuer entre bactéries d’espèce, de famille et de genre totalement différents.

Bien évidemment, il n’y a pas de position, c’est-à-dire que si une bactérie possède dans son cytoplasme plusieurs plasmide différents avec des gènes de résistances à différents antibiotiques, elle peut les transférer simultanément.

Les bactéries peuvent accumuler des résistances au fur et à mesure et c’est dans ce cas-là qu’on arrive avec des BMR et une difficulté à traiter les patients car ils ont des bactéries qui ont accumulés tout un ensemble de plasmide de résistance.

c) Les bactériocines

Un peu plus intéressant pour nous car ces plasmides codent des protéines qui sont capables d’agresser d’autres bactéries (les bactéries en communauté sont en compétition les unes avec les autres). Les bactéries qui vont posséder ce type de plasmide vont pouvoir par exemple :

- Former des pores dans la membrane cytoplasmique des autres bactéries

- S’attaquer à leur acide nucléique (ADN, ARN)

- Hydrolyser le peptidoglycane de la paroi (il ne lui reste plus que la membrane cytoplasmique et la bactérie est extrêmement sensible à la pression osmotique (elle implose ou elle explose, de toute façon elle meurt)).

Particularité : Ces bactériocines agissent sur des souches bactériennes qui sont étroitement apparentée. Leur spectre d’action est quand même relativement limité, mais généralement elles sont dirigées contre des bactéries qui évoluent dans les mêmes milieux et les mêmes environnements.

Exemple : Le plasmide Col qu’on retrouve chez E. Coli et qui va agir sur les entérobactéries.

Naturellement, les bactéries utilisent cette stratégie de défense contre les autres bactéries et notamment, c’est ce qui permet d’éviter l’implantation des bactéries pathogènes au niveau de nos tissus.

d) Les plasmides de virulence

Ils vont produire un facteur conférant une pathogénicitéExemple : E. Coli + plasmide de virulence entéro-toxinogène diarrhée.

e) Les plasmides métaboliques

Il confère à la bactérie des capacités supplémentaires (options qu’elles n’avaient pas au départ) qui vont leur permettre par exemple de dégrader différents métabolites :

- Information génétique permettant la dégradation de composés aromatiques- Assimilation du lactose- Fixation de l’azote- …

Cela peut conférer un avantage sélectif aux bactéries.

V. Taxonomie

Définition d’une espèce : Ernst Mayr (1942) : « Les espèces sont des groupes de populations naturelles, effectivement ou potentiellement interfécondes, qui sont génétiquement isolées d’autres groupes similaires ».

Puisqu’on à faire a des espèces bactériennes qui ne sont pas sexuées, comment on fait pour savoir si une bactérie appartient à une famille, un genre ou un espèce bien particulière ? Ça a été longtemps très problématique.

Différentes classifications :- Taxonomie phénotypique (Cohn 1872 années 1960)

Selon un nombre réduit de caractères morphologiques, biochimiques, +/- sporulation… Coques ? Bacilles ? Colonies blanches ? vertes ?

- Taxonomie numérique : Plus de 100 caractères différents

- Taxonomie moléculaire : Hybridations ADN/ADNSéquences ADNr : 5S, 16S et 23S

Aujourd’hui, on a un peu abandonné la taxonomie phénotypique et numérique et on est passé à une taxonomie moléculaire. On s’attache à savoir quel est le niveau d’homologie en terme de séquence entre le matériel génétique de chaque bactérie. On passe notamment par des techniques d’hybridation ADN/ADN. On a trouvé notamment une séquence intéressante pour faire les comparaisons en utilisant l’ADNr 16s (énormément utilisée pour faire cette classification).

Qu’est-ce qu’une espèce bactérienne ?

1. Taxonomie moléculaire

Qu’est-ce qu’une espèce bactérienne ? Aucun consensus

Hybridation ADN/ADN : 2 espèces sont différentes si < 70% d’hybridation entre 2 souches (hétéroduplex) Séquences ADNr : 5S, 16S et 23S) : 2 espèces sont différentes si ADNr 16S entre 2 souche < 99% d’identité (ou 99.5%...)

Ça s’est démocratisé car les méthodes de séquençage sont devenues peu couteuse et on peut le faire rapidement.

2. Classification bactériologique médicale

Les 5 groupes entourés sont les principaux groupes concernant l’Homme avec une importance notamment en pathologie humaine.

Dans tous les laboratoires, pour faire de l’identification bactérienne, on ne dispose pas de séquenceur et ni d’outils classique pour faire de l’hybridation. En bactériologie médicale on reste sur des critères relativement simples.

Physiologie : On cultive des bactéries en milieu liquide dans des tubes et on regarde à quel niveau elles poussent (au contact avec l’air, au fond du tube…)

Coloration de GRAM : ça prend 5 minutes

De plus en plus, de nouveaux outils apparaissent. Aujourd’hui, on utilise beaucoup les techniques de l’HPLC, de la CPG couplé à la RMN pour pouvoir faire de l’identification. Ce sont des techniques sont en train de sus-planter depuis 2/3 ans les techniques habituelles. Avant on avait énormément de personnels (coloration, frottis…), maintenant les échantillons sont placés dans un tube et on les passe dans un appareil et le résultat sort dans les minutes qui suivent.

L’identification bactérienne est en pleine évolution et les technologies évoluent très vite (voir cours de Jaffar-Bandjee)

En terme de formation, cela nous pose des problèmes car ce type d’appareil coute chère et il est difficile de nous faire faire de la pratique. En TP ça reste intéressant d’étudier et de visualiser les bactéries suivant les anciennes méthodes.

Aujourd’hui, on regarde des lames que dans des cas exceptionnels.

Question étudiant : Quel est le but d’avoir un flagelle interne ?Réponse : Mieux vaut avoir un flagelle interne que pas de flagelle du tout.

Question étudiant : Vous parlez de signature antigénique et de signature au niveau de l’adhésion (Fimbriae). C’est spécifique à chaque famille de bactérie ou à chaque bactérie en elle-même ?Réponse : Cela se situe plus au niveau de la famille bactérienne bien que même au sein d’une même famille, on peut obtenir des variations qui vont faire que l’affinité est différente. Il n’y a pas de généralités mais c’est vrai que l’affinité se situe plus au niveau de la famille bactérienne.

Question étudiant : Une bactérie va faire une seule spore ? Réponse : Oui

Question étudiant : Pour il n’y a pas de système de partition ?Réponse : IL faut éviter de donner une raison (comme d’habitude), néanmoins, les plasmides ont une particularité ; c’est qu’ils sont transférables horizontalement par les mécanismes de conjugaison (pili sexuel, les bactéries se rapprochent) et les plasmides vont porter toute une machinerie qui vont notamment permettre leur transfert d’une bactérie à un autre.

Question étudiant : Sens unique de transfert de F+ vers F- ; Comment une bactérie fait pour savoir qui possède ou pas le plasmide F ?Réponse : Une bactérie va commencer à mettre en place ce pili sexuel qui va lui permettre d’aller « senser » les autres bactéries. Les mécanismes ne sont pas encore super bien décrits. Ce que la connexion ne se fait pas si une bactérie fertile est en contact avec une autre bactérie fertile.

Question étudiant : Le plasmide R ne s’intègre jamais dans le génome de la bactérie ?Réponse : Ces plasmides ne s’intègrent pas au génome, mais reste au niveau plasmidique. Dans le cytoplasme, on peut avoir 10 plasmides avec chacun portant un gène de résistance à un antibiotique bien particulier sans nécessité de s’intégrer au génome. Tout ça bien évidemment s’exprime dans la cellule.

Question étudiant : Quel est la différence entre chimiotactisme et chimiotaxie ?Réponse : Le chimiotactisme, c’est la réponse finalement de la bactérie vis-à-vis de son environnement. La chimiotaxie, c’est l’effet de l’environnement sur la bactérie.

Mais c’est la même chose : c’est une réponse de la bactérie à un environnement qui lui est favorable ou non.

Question années antérieures : Par quoi est défini une cellule ?Réponse : Une cellule est définie par la capacité d’un micro-organisme à échanger avec son milieu extérieur, de se nourrir indépendamment d’un autre organisme vivant. Donc un virus libre dans l’environnement est considéré comme « mort » car il a besoin d’être assisté par des cellules eucaryotes ou procaryotes pour se développer ou se multiplier. Les cellules eucaryotes et procaryotes sont vraiment considérées comme des « individus » qui peuvent vivre, se développer, se multiplier par leurs propres moyens.

Question années antérieures : Certaines bactéries ont également besoin d’être assistées non ?Réponse : Cela dépend effectivement, la limite entre organisme vivant et organisme non vivant peut devenir assez floue. On a ainsi récemment découvert des virus qui ont acquis un certain nombre de gènes venant de bactéries. Dans un milieu adapté, ces virus n’ont même pas besoin d’infecter une cellule. On a d’un autre côté, des bactéries tellement simplifiées qu’elles ont des difficultés à se développer seules. Certains virus ont donc des génomes plus développés que certaines bactéries, ce qui fait de ces virus carrément des cellules.Les mini-virus ont une taille supérieure aux plus petites bactéries et possèdent toute la machinerie d’une cellule normale, leur permettant de se développer seuls.

Question années antérieures : Est-ce que ça veut dire que les bactéries Gram+ sont plus résistantes ? Réponse : C'est très difficile à dire, effectivement les Gram+ résistent davantage aux agressions externes, au vu de leur peptidoglycanes plus épais. Mais cela n'est pas toujours évident. !

Question années antérieures : A quoi sert la paroi bactérienne ?Réponse : Avec le cytosquelette, la paroi bactérienne va donner à la cellule sa forme. Si on supprime la paroi bactérienne, on sensibilise énormément la bactérie et elle prendra alors une forme sphérique (on aura l’impression de voir des coques). Mais en leur retirant leur paroi, on les sensibilise davantage aussi à la pression osmotique. La membrane cytoplasmique ne suffit en général pas à maintenir l’intégrité de la cellule. Celle-ci va alors soit imploser, soit exploser car la pression du milieu environnant sera soit trop forte, soit top faible. Donc pour détruire des bactéries, il suffit de détruire leur paroi et c’est ce que fait pas mal d’antibiotiques. Du coup, certaines bactéries axent leur pouvoir pathogène sur cette paroi. Ils auront alors des parois qui vont résister à certaines enzymes ou à certains antibiotiques, leur conférant un pouvoir pathogène.

Question années antérieures : La coloration a donc un rapport avec l’épaisseur de la couche de peptidoglycanes ?Réponse : Effectivement, c’est surtout l’épaisseur de la couche de peptidoglycanes qui empêche le violet de gentiane de sortir moins rapidement.

Réponse à une question d’élève : La spore n’est pas toxique, elle peut revenir à la vie après avoir résisté aux agents classiques de nettoyage.

Question années antérieures : Le transfert est-il possible entre 2 bactéries porteuses du facteur F dont une possède un facteur de résistance (plasmide R) ?Réponse : Oui, le plasmide qui a mis en place le pili sexuel peut transférer d’autres plasmides que lui. Il peut permettre à un plasmide qui possède le facteur de résistance, sans le mécanisme de conjugaison bactérienne, de transférer ce facteur de résistance.

Question années antérieures : Est-ce qu’une bactérie F– peut donner ses plasmides à une bactérie F+ ? L’échange peut-il se faire dans les 2 sens ?Réponse : Dans tous les cas une bactérie F- ne peut pas transférer de facteur de fertilité a une bactérie F+. Mais si on a une bactérie F- mais qui est R+, elle peut très bien transférer son plasmide de résistance à une bactérie qui est F+ mais qui est R-. Les échanges peuvent se faire dans les 2 sens.

Question années antérieures : Est-ce que tous ces tests (sucres, anaérobie/aérobie…) ne peuvent être faussés par les plasmides ?

Réponse : Généralement des tests complémentaires sont réclamés si un nouveau caractère apparait. Par exemple, si on sait qu’Escherichia Coli utilise tel sucre à la base (car on a des souches pures sans plasmides), alors si elle utilise autre chose, on fait ces tests complémentaires pour vérifier qu’il ne s’agisse pas d’une nouvelle espèce, ou pour savoir si c’est vraiment lié à un plasmide.