Profil génétique du bacille de la tuberculose en Tunisie: Émergence et prédominance d’un complexe clonal propre à

la population Tunisienne

Par

Helmi Mardassi

Laboratoire des MycobactériesInstitut Pasteur de Tunis

A l’échelle globale

A l’échelle d’un pays

Le génotypage peut s’appliquer à tous les niveaux

Entre individus

Les applications du génotypage sont multiples

-Épidémies (MDR)

-Infections nosocomiales

-Contamination de laboratoire

-Nouvelle infection/Réactivation

-Source d’une chaîne de transmission

-Infection simple ou multiple

-Situation globale (Nationale/régionale)

-Etude évolutive

-Évaluation des programmes nationaux de tuberculose

Marqueurs rapides

IS6110 RFLP

MIRUS

Marqueurs lents

Spoligotypage

Cartographie des délétions

La génomique et la post-génomique comparative ont grandement contribué à la compréhension des processus évolutifs des souches du

complexe tuberculosis

Cole et al., 1998 Fleishman et al., 2002 Garnier et al., 1998

Selon Brosch et al., 2002

Schéma évolutif des bacilles du complexe tuberculosis

Gagneux et al., 2006

La distribution géographique du bacille tuberculeux n’est pas aléatoire évoquant un processus adaptatif

Comment évolue le bacille de la tuberculose en Tunisie?

Evaluation de la diversité génétique

17

98 98

83

71

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2001 2002 2003 2004 2005

L’étude a porté sur des isolats de 2001 à 2005

Nature des résistances aux antituberculeux majeurs

Spacer oligotyping « spoligotyping »

Préparation de la membrane du spoligotypage

According to Barnes & Cave, 2003

IS6110 genotyping

MIRU-VNTR genotyping

Les autres marqueurs

674914301136245776626631206971

041641

402307635378

2556

2760

73062855175035225934703733216139657477681343726405325802181509104401125129542652754745463808031948

1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 421 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 67

1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 491 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 14

1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 301 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 11

1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 361 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 24

1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 571 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 76

1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 621 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 66

1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 311 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 201 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 691 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 71

1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 411 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 161 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 4

1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 401 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 23

1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 71 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 63

1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 531 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 78

1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 271 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 601 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 251 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 56

1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 731 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 6

1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 281 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 55

1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 171 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 50

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 351 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 22

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 591 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 34

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 701 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 37

1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 331 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 21

1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 611 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 39

1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 651 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 741 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 77

1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 681 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 13

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 431 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 72

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 641 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 5

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 321 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 581 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 2

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 181 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 15

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 91 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 10

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 441 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 121 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 51

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 291 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 54

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 261 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 52

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 751 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 47

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 451 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 46

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 381 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 8

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g 31 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g g g g g g 19

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1g g g g g g g g g g g g g g g 48

42

TDSP

Haarlem 3

T1

Haarlem 1

Divers

Divers

Divers

Haarlem 3

Haarlem 1T1

TDSP

Distribution à l’échelle mondiale des génotypes dominants en Tunisie

Tunisian Dominant Spoligotype Profiles (33%)

1 1 6 1 3 1 1 1 5 5 1 3 1 1 1 1 4 1 2 2 11 66

19, 22-24

2 1 1 2 1 1 2 94

Haarlem 3 Spoligotype Profiles

2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 4 1 1 1 8 1 2 43

T1 Spoligotype Profiles

2 1 1 1 1 3 1 31

Haarlem 1 Spoligotype Profiles

66

94

4331

5310

27

10

0

20

40

60

80

100

120

140

TDSP Haarlem 3 T 1 Haarlem 1

Typical vs variants

TDSP

T1

Haarlem 3

Haarlem 1

LAM9 SFamily 33 EAI

Unknown

Haarlem 3

TDSP

T1

Haarlem 1

LAM9

S Family 33Unknown

TDSP

Haarlem 3T1

Haarlem 1Family 36

M. bovisUnknown

Grand Tunis Menzel Bourguiba Zaghouan

Genotypes vs regions

Haarlem 3

TDSP

Haarlem 1

T1

LAM9

S

Unknown

Haarlem 3

TDSP

Haarlem 1

T1

LAM9Family 33

Unknown

Haarlem 3 TDSP

T1

Haarlem 1

S Family 33

TDSP

Haarlem 3T1

Haarlem 1

M. bovis EAI

<= 30 31 - 40 41 - 55 > 55

Genotypes vs Age

18

2 2 21 1 1

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Haarlem 3 Haarlem 1 T 1 TDSP LAM 9 S Family Unknown

Genotypes vs MDR

0.025% MDR

Haarlem 3 est responsable d’une épidémie MDR très sévère

2001 2002 2003 2004 2005

2

13

54

5

224325160415 225323151323 223323150314 223325151313 224315192414 224325160414 224325182415 225325151323 124224181313 124426171328 224326121312 223326161324 224315172324 124426153232 221325182334 223326182434 224325152434 224325172334 124326151223 223325162314 224313182414 224323192414 224323192424 225313152323 124326112327 224325151414 224325181414

223323192424 234225161323 223325182424 124326143212 224225162323 224314142324 224325161314 224325162424 223325182324

124324152222 225323152313 223325151323 223325191313 115225111312 124326111323 124326173312 224313181425 224323181425 224323182414 224323182424 224323182424 224325152325 224325161323 224325191315 122326153227 123316142435 123326153326 123326153332 124324191317 124325152424 124325172213 124325172235 124325182324 124325182334 124326113322 124326143322 124326143322 124326152324 124326153222 124326153323 124326153324 124326153426 125315172224 133325153335 222326173324 223325153334 224225183424 224313143323 224323153232 224323180423 224325152322 224325152335 224325152424 224325152424 224325152434 224325152434 224325153323 224325162324 224325163427 224325172223 224325172224 224325172324 224325172324 224325172324 224325172415 224325172424 224325172425 224325172434 224325183424 224326113423 224326153222 224326153232 224326153322 224326153326 224326153423 224326153423 224326153436 224326183422 225313143423 225323143313 225323143323 225323143423 225325152323 225325172425 323325153323 324325172334 334325153324 225325152324

TDSP ne semble pas être associé à des épidémies ou des chaînes de transmission

T1

Haarlem 3

Haarlem 1

TDSP

Relations phylogénétiques entre les 3 familles majeures de M. tuberculosis sévissant en Tunisie

Exploration du lien phylogénétique entre les génotypes dominants au moyen

de la localisation du lieu d’insertion de l’élément mobile IS6110

PCR Transformation of E.coli

Plasmid Minipreparation

Fingerprinting PCR

Sequencing of amplicons

Location of multiple IS6110 transposition sites

Mycobacterial genome

HincII digestion

ligation in pBluescript vector

Genomic plasmid library

IS2 IS1

HincIIHincII HincIIHincII

5’ 3’IS6110

T7 T7IS2 IS1

IS2 T3 IS1 T3

pBluscript vector pBluscript vector

pBluscript vectorpBluscript vector

Cartographie des lieux d’insertion IS6110 par le biais de la GL-PCR

M 1 2 3 4 M 1 2 3 4

A

Control vector MTB14323

B

M 1 2 3 4

MDR-TB Outbreak isolate

Résultat de la GL-PCR

IS6110

Rv0171 mce1c

Localisation de IS6110, MTB14323

Rv0403c mmpS1 Rv0794c : Rv0795c Rv1755 plcD

Rv2017 : Rv2018 PE23 (Rv2328) Rv2336 Rv2352c PPE38

Rv2813 : Rv2816c Rv2819c

A B

IS6110 RFLP

GL-PCR (T7+IS1+IS2)

GL-PCR (T3+IS1+IS2)

1 2 3 4 5 61 2 3 4 5

Intérêt de la GL-PCR dans l’épidémiologie moléculaire de la tuberculose

Établissement d’un lien phylogénétique entre le clone dominant TDSP et les souches de la famille Haarlem

Lieux d’Insertion (à la base près) de l’élément IS6110

Conclusion

• La tuberculose en Tunisie est associée à des souches modernes de M. tuberculosis

• Quatre génotypes dominent l’épidémiologie de la tuberculose en Tunisie

• Le génotype le plus dominant contient une signature spoligotypique unique au monde suggérant un cas extrême d’adaptabilité à la population endogène

Les prochaines avenues de recherche

• Quelles sont les bases moléculaires à l’origine d’une telle adaptabilité?

• Le complexe clonal TDSP partage t-il des mécanismes avec les autres génotypes majeurs?

• La pression vaccinale par le BCG et/ou la pratique DOTS a t-elle conduit à cette situation épidémiologique particulière?