Travail réalisé au LEM à l’Institut de Biologie Structurale Grenoble Présenté par: Elodie ...

Travail réalisé au LEM

à l’Institut de Biologie Structurale

Grenoble

Présenté par:

Elodie Crublet

sous la responsabilité de:

Hugues Lortat-Jacob

Romain Vivès

LES HÉPARANES SULFATE

Chaîne d’héparane sulfate (HS)

Core protéique

Marquage fluorescent des HS à la surface d’un tapis de 10 cellules endothéliales de poumon (*)

Stevens et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, in press (may 2007)

1 unit = 7.2 μm

[acide hexuronique (GlucA ou IdoA) et N-acétyl glucosamine] n

n = 20 à 100N-SO3

-2-O-SO3-

6-O-SO3-

3-O-SO3-

OAc-N

OHOO O

OHOHO

OH

COO-

n

Grande hétérogénéité et diversité structurale considérable

48 disaccharides différents

48² = 2304 : tétrasaccharides

483 > 105 : hexasaccharides

484 > 5.106 : octasaccharides

485 > 2.108 : décasaccharides

486 > 1010 : dodécasaccharides...

48² = 2304 : tétrasaccharides

483 > 105 : hexasaccharides

484 > 5.106 : octasaccharides

485 > 2.108 : décasaccharides

486 > 1010 : dodécasaccharides...

N-SO3-2-O-SO3

-

6-O-SO3-

3-O-SO3-

OAc-N

OHOO OO

HOHOOH

COO-

OAc-N

OO O

OHOHO

OH

COO-

OH

domaine NA domaine NS

Régions N-Sulfatées

hautement sulfatées

Régions N-Sulfatées

hautement sulfatées

Régions N-Acétylées, peu

sulfatées

Régions N-Acétylées, peu

sulfatées

Facteurs de

croissance

Cytokines

Chimiokines

Molécules

d’adhésion

Protéines de la

matrice

Enzymes

Inhibiteurs d’enzymes

Agents pathogènes

...

Prolifération

Différenciation

Migration

Adhésion

Cohésion

tissulaire

Voies

métaboliques

Coagulation

Infection

...

•Des bactéries•Des parasites•De nombreux virus

HSPG

HSPG HSPG

INFECTION EN CISFMDV, HIV, Ad-2, Ad-5, AAV…

INFECTION EN TRANS

HIV

Cellulecible

INFECTION DIRECTEHSV-1

•Adenovirus 2 et 5•Adeno-associated virus•Cytomegalovirus•Flavivirus (Dengue, Yellow fever, Hepatitis C)•Foot-and-mouth disease virus•Herpes simplex virus I et III•Human immunodeficiency virus (VIH)•Papilloma virus•Pseudorabies virus•Respiratory syncytical virus•Sindbis virus•Vaccine virus…

LE VIRUS DE L’IMMUNODÉFICIENCE

HUMAINE

33,2 millions de personnes séropositives

(2007 - ONUSIDA)

Prévalence chez l’adulte

Europe occidentale 0,3%

Afrique subsaharienne

Zimbabwe Swaziland

5%20,9%33,4%

Définition

•Agent responsable: le VIH•Attaque du système immunitaire•Lymphocytes T•Monocytes•Macrophages

•Agent responsable: le VIH•Attaque du système immunitaire•Lymphocytes T•Monocytes•Macrophages

Données épidémiologiques

Corécepteurs et tropisme viral

CD4i

CD4

gp120

gp41

Corécepteur

CD4i

CCR5 CXCR4

Virus R5 Virus X4Monocytes

MacrophagesLymphocytes T

Virus R5X4

Cellule

Source: Boehringer Ingelheim

binding to the CD4 receptor

Stephen Harrisonhttp://www.childrenshospital.org

Kwong et al., Nature, 1998Structure de gp120 en complexe avec un

fragment de CD4 et de 17b

Domaine externe

Domaine interne

Feuillet intermédiaire

LE RÔLE DES HÉPARANES SULFATE DANS L’INFECTION PAR

LE VIH

Cis infection

HS CD4

Macrophages +++ +

Lymphocyte T CD4+ + +++

Cellules épithéliales/endothélial

es +++ -

cellule CD4- (épithéliale)

Trans infection cellule CD4+

Transcytose

Barrière hématoencéphaliq

ue

(?)

(?)

Bobardt et al., Immunity, 2003Saphire et al., J. Virol., 2001Argyris et al., J. Virol., 2003Bobardt et al., J. Virol., 2004

Seuls les virus X4 fixent l’héparine

Baba et al., Antimicrob Agents Chemother, 1988

DEPUIS : composés polyanioniques testés pour inhiber le VIH

résultats mitigés

Fin des années 80: l’héparine inhibe le VIH, in vitro

-1000

100200300400500600700800

0 200 400 600 800

Time (s)

Res

pon

se (

RU

)

-1000

100200300400500600700800

0 200 400 600 800

Res

pon

se (R

U)

Time (s)

virus X4 (MN) virus R5 (JRFL)

Héparine Héparine

Lortat-Jacob et al., Virologie, 2005Vivès et al., J. Biol. Chem, 2005

Moulard et al., J. Virol., 2000

gp120 interagit avec les HS via sa boucle V3

Expériences de destruction des HS cellulairesRoderiquez et al., J. Virol., 1995

Virus R5

Virus X4

Boucle V3 basique (< +5)

Boucle V3 très basique (+7 à +10)

Moulard et al., J. Virol., 2000

gp120gp120 + CD4

Boucle V3Boucle V3

CD4i, site de fixation aux corécepteurs

CD4i, site de fixation aux corécepteurs

gp120

Lys 121

Arg 419

Lys 421

Lys 432

0

20

40

60

80

100

0 500 1000 1500

Temps (s)

gp120/CD4

gp120

X4

R5

Moulard et al., J. Virol., 2000Vivès et al., J. Biol. Chem, 2005

CD4i

HS

Les HS pourraient inhiber l’interaction

gp120/corécepteur

Approfondir les connaissances sur

l’interaction gp120/HS

Confirmer le rôle de CD4i dans l’interaction et

déterminer les résidus impliqués

Production et purification de gp120 et de ses formes mutées

Caractérisation fonctionnelle de gp120

Développement et optimisation d’une méthode d’identification des domaines protéiques

d’interaction avec l’héparine

•BIAcore•Tests cellulaires (chimiotaxie)•BIAcore•Tests cellulaires (chimiotaxie)

Etude du site CD4i de gp120 par mutagénèse dirigée


•Principe•Exemple de résultats: la chimiokine RANTES•Optimisation: élimination du support solide•Application à gp120


•Cellules d’insectes

Cellules S2 de drosophiles

Technologie « Baculovirus »

Optimisations

110 –Sf9

110 –

110 –

Sf21

HF

24h 48h 72h 96h 120h

Type cellulaire

Type cellulaire

Production en mini fermenteur (1L)infection de cellules Sf21 pendant 72h25 à 30 mg/L

130 –100 – 72 – 55 – 130 –

100 – 72 –

st 0h 24h 48h 72h 96h

Séquence signal

Séquence signal

melittine

egt

Echangeuse d’ions

Affinité

Exclusion

Rendements

SP sépharoseSP sépharose

Lentil lectineLentil lectine

600

mAU

400

200

0

0 10 20 30 40 50 60 mL

180 –130 –100 – 72 – 55 – 43 – 34 –

10 12 14 16 18 20 22 24

65 70 75 80 85 mL

mAU

350

300

250

200

150

100

50

0

10 11 12 13 14 15 16 7 18180 –130 –100 – 72 – 55 – 43 –

mAU 200 150 100 50 0

0 5 10 15 20 mL

Superdex 200

180 –130 –100 – 72 – 55 – 43 –

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Superdex 200Superdex 200

1 à 2 mg de protéine purifiée/L





•BIAcore•Tests cellulaires (chimiotaxie)•BIAcore•Tests cellulaires (chimiotaxie)


BIAcore

ass diss

eq

Res

pons

e (R

U)

CD4

gp120

200 nM

100 nM

50 nM

gp120 interagit avec CD4.Cette interaction induit l’exposition du site de fixation aux corécepteurs (CD4i)

gp120 interagit avec CD4.Cette interaction induit l’exposition du site de fixation aux corécepteurs (CD4i)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 100 200 300 400

Temps (s)

Rép

onse

(RU

)

gp120 wt 50nM

gp120 wt/CD4 50/50nM

17bgp120

gp120+CD4

Kd: 8 nM

YCD417b

17b: anticorps anti-CD4i

Chimiotaxie

gp120 n’induit pas les voies de signalisation en aval de CXCR4

gp120 n’induit pas les voies de signalisation en aval de CXCR4

Insert TranswellChambre supérieureMembrane poreuseChambre inférieure

Cellules CXCR4+

SDF-1 ou gp120/CD4

Cell. mammifères Cell. d’insectes

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0,3 3 2 20 200 2 20 200 (nM)

% m

igra

tio

n

SDF-1 gp120 LAI/CD4 (200 nM)

gp120 HXBc2 (labo)/CD4 (200 nM)

Héparine

Vivès RR. et al., J. Biol.Chem., 2004

Crublet E. and Vivès RR., New developments in therapeutic glycomics, 2006

Séquençage N-terminal

Principe de la méthode des

« billes »

Domaines basiques

PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS

“méthode des billes”


Digestion à la thermolysineRANTES (9-68)~300nM

Fragment 3LG4/5 de la laminine-5, protéine matricielle

Glycoprotéine d’enveloppe gC du virus de la pseudo rage

PrincipeBUTS - s’affranchir du support billes - choisir des oligosaccharides de taille et de structure définies

BUTS - s’affranchir du support billes - choisir des oligosaccharides de taille et de structure définies

Héparine ou oligosaccharide

B

Purification des complexes peptides/héparine sur une résine de DEAE

MRVKEKYQHLWRWGWRWGTMLLGMLMICSATEKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEVVLVNVTENFNMWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCTDLKNDTNTNSSSGRMIMEKGEIKNCSFNISTS IRGKVQKEYAFFYKLDIIPIDNDTTSYKLTSCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGF AILKCNNKTFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRSVNFTDNAKTIIVQLNTSVEINCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNNTLKQIASKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQIINMWQKVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNSNNESEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQ REKR

MRVKEKYQHLWRWGWRWGTMLLGMLMICSATEKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEVVLVNVTENFNMWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCTDLKNDTNTNSSSGRMIMEKGEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFFYKLDIIPIDNDTTSYKLTSCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGFAILKCNNKTFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRSVNFTDNAKTIIVQLNTSVEINCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNNTLKQIASKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQIINMWQKVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNSNNESEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR

V3

•Rôle dans le clivage de gp160 en gp120 et gp41.

•Interaction C-ter/héparine nécessaire au clivage

C-ter•proche du site CD4i

•réarrangements structuraux sous l’influence de CD4, aboutissant à l’exposition de CD4i

V3V1/V2

C

CD4i

V1/V2•Site d’interaction avec les HS déjà caractérisé (Arg298)

•Impliquée dans le choix du corécepteur

V3

KIEPLGVAPTKAKRRVVQREKRXXXXX

gp41gp120

Site de clivage (Furine)

•Participation à l’attachement du virus aux HS des cellules (virus Sindbis)C-ter

Lys 121

Arg 419

Lys 421

Lys 432

180 –130 – 100 –

wt 121 419 421 432 2M 3M 4M

2M: R419S-K421S3M: K121S-R419S-K421S4M: K121S-R419S-K421S-K432S

Héparine

RésiduParticipation à l’interaction

avec l’héparine

K121 -

R419 +++

K421 +++

K432 +++

17b

Y

RésiduParticipation à l’interaction

avec l’héparine

K121 -

R419 +++

K421 +++

K432 ++

o Identification des domaines d’interaction de gp120 avec l’héparine

boucle V3 (K305)

Site CD4i (R419, K421et K432)

Deux autres domaines

•V1/V2 (K168)•C-ter (K499)

o Mise au point d’une méthode permettant d’identifier les domaines d’une protéine interagissant avec l’héparine

Détection simple et rapide de domaines d’interaction

Nombreuses protéines testées: RANTES, gp120, gC, laminine, Adam12, prp, AT-III…

o Développement de systèmes de production et purification

Baculovirus: système optimisé pour la production de gp120

Purification en trois étapes: protéine pure à 90-95%

CD4

HS

CD4CD4

CD4i

o Caractérisation structurale et fonctionnelle des domaines V1/V2 et C-ter

o Développement d’un inhibiteur de l’entrée virale, dérivé des HS

o Etude de l’interaction gp120/corécepteurs

o Etude du rôle physiologique des HS dans l’infection des cellules cibles

Existence de cluster corécepteurs/HS?Infectiosité de virus mutés sur CD4i?

o Etude des motifs saccharidiques de l’interaction gp120/sucre

LES GAGOPHILES

oHuguesoRomain

oRabiaoPascaloStéphaneoCédric

LE LEM CANAL HISTORIQUE

oJP Andrieu

oEvelyne GOUToIsabelle BALLYoEt tous les autres…

INSTITUT PASTEUR, PARIS

oF. Arenzana-SeisdedosoP. Rueda QuerooF. Baleux

UNIVERSITY OF OXFORD

oQ. Sattentau

MES AMIS ET MA FAMILLE…

CERMAV, GRENOBLE

oA. Imberty

ANRS

Sidaction

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