Transcription et maturation des ARN...

Transcription et maturation des ARN messagers :

Version 1.0 - 22/10/2018

I- Introduction : 2

II- La Transcription : 4

• 1. L’Initiation : 4

• 2) L’ Élongation : 6

• 3) La Terminaison : 6

III- Maturation des ARN messagers : 7

A- Formation de la coiffe en 5’ (cf poly) : 7

B- Polyadénylation en 3’ : (mise en place de la queue poly A) 8

C- Excision/épissage : 8

IV- Les séquences de régulation des gènes : 13

A- Facteur « CIS» : 13

B- Facteurs «trans» : 14

V- Régulation par les microARN : 17

1) Maturation des micro ARN : 17

2)Fonction des micro ARN : 18

La Traduction : 21

Expérience de Chapeville et Lipman : 21

Le code génétique : 22

A- Initiation de la synthèse protéique 24

B- L’élongation : (identique procaryote/eucaryote) 26

C- La terminaison : 27

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I- Introduction :

On parle de la transcription : C’est la synthèse d’ARN à partir de l’information contenue dans l’ADN génomique par une enzyme particulière : l’ARN polymérase ADN dépendante.

• Chez les Procaryotes :

- La transcription et la traduction sont directement liés. - Il n’y a pas de phénomènes de maturation, ce n’est que chez les eucaryotes. - Il n’y a qu’une seule ARN polymérase.

• Chez les Eucaryotes :

- Il existe 3 ARN polymérases.- Seule l’ARN polymérase 2 permet la transcription des ARN messagers.

Ce sont des intermédiaires indispensables qui vont véhiculer l’information génétique du noyau vers le cytoplasme. C’est dans ce dernier qu’ils vont être traduits en protéines.

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Élongation d’une chaine d’ARN (poly) :

Flèche rouge = attaque nucléophile de l’OH du groupement hydroxyle en 3’ qui attaque le phosphate en position α.

Particularités:

• Cette réaction est irréversible grâce à une pyrophosphatase qui clive le diphosphate.• La transcription ne nécessite pas d’amorce comme les ADN polymérases. • Elle agit en présence de magnésium.

Le sens de la transcription peut se définir de deux manières :

- L’ARN polymérase se déplace de 3’ vers 5’ sur le brin antisens de l’ADN.- La chaîne d’ARN naissante est synthétisée de 5’ en 3’.

Tout transcrit primaire commence en 5’ par un triphosphate.(valable chez procaryote et eucaryote)

ARN(n) + NTPARN polymérase

ADN ,Mg⎯ →⎯⎯⎯⎯ ARN(n+1) + P − P


A G

P P OH

3’

A G

P P

C

OH3’P

PP

γβ

α

P+ P

C

OH3’P

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L’unité de transcription est le segment d’ADN compris entre le site de début de la transcription situé après le promoteur (désigné par le nucléotide « +1 ») ou site d’initiation et site de fin de transcription ou terminaison.

Toute séquence d’ADN ou d’ARN messager doit être écrite de gauche à droite de 5’ vers 3’ .

• Le terme brin antisens doit être donné au brin qui est transcrit et qui sert de matrice à l’ARN polymérase.

Toute séquence d’ADN ou d’ARNm doit être écrite de gauche à droite de 5’ vers 3’

• Le terme brin sens va être donné à l’autre brin qui est toujours complémentaire (complémentarité des bases).

La transcription et la maturation des ARNm chez les eucaryotes englobent des phénomènes complexes qui sont sous le contrôle d’une régulation très fine dans le temps et selon le type de tissus (espace). Les 3 ARN polymérases eucaryotes comme leur homologue procaryote n’ont pas d’activité 3’ 5’ exonucléasique (ou correction d’épreuve). Au contraire de ce qu’on a pu avoir pour les ADN polymérases.

Les ARN messagers représentent moins de 2% de l’ARN total; ce sont eux qui codent pour les protéines cellulaires. ARN ribosomal > 80%. ARN de transfert autour de 15%.


II- La Transcription : Elle se fait en 3 étapes : Initiation, élongation et terminaison : (eucaryote + procaryote)

• 1. L’Initiation :

Elle se fait au niveau de la région promoteur qui s’étend environ chez les eucaryotes sur 110 nucléotides de la position -110 en amont du début de la transcription à -1.

Cette région comprend 3 régions ‘consensus’ qu’on va trouver systématiquement :

- La boite TATA ou TATA box :

Elle est localisée en position -25. Elle est constante (retrouvée sur tous les gènes)

La séquence reconnue est bi-caténaire (l’enzyme va reconnaitre les 2 brins), elle comprend 7 paires de base : TATAAAA (pour le brin sens) ou ATATTTT (brin antisens). Présente sur tous les gènes et correspond au signal où commence la transcription.→ C’est à son niveau (région riche en AT) que la double hélice d’ADN va s’ouvrir pour débuter la transcription. Toute mutation à ce niveau entraîne une perte d’activité promotrice importante (perte d’expression du gène).L’ordre de fixation des facteurs de transcription de l’ARN polymérase II (protéines nucléaires) est pré-ordonné et séquentiel (l’un à la suite de l’autre).

Ainsi se forme le complexe de base de l’initiation de la transcription. (cf schéma simplifié sur le poly, ci-contre les versions complètes pas à connaitre en plus, mais pour comprendre)


CAAT GC TATA

-90 -50 -25

cte noncteCombien?

! "## $## cteOùcommence?!

PROMOTEUR

-1-110

Début de la transcription

CTF SP1 TFIID

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C’est l’accumulation de protéine qui vont permettre la transcription. La boite TATA est reconnue par des facteur de transcription TF II (transcription factor of ARN polymérase II) :

- TF II D : Facteur protéique composé de la TBP (tatabox binding proteine) et TAF (transcription activating factor) - cofacteurs, bleu sur le schéma, vient se fixer sur TATA)

- TF II A se fixe en 5’ sur l’ADN.

- TF II B vient se fixer en 3’ ce qui permet de stabiliser l’ARN polymérase II en présence d’un facteur protéique : TFII F.

- TFII F et TFII H vont se fixer sur l’ARN polymérase II.

À la différence de l’ARN polymérase des procayotes, chez les eucaryotes l’ARN polymérase II ne se fixe pas directement sur l’ADN.

On obtient ainsi le complexe de base de l’initiation de la transcription.

Il existe une à deux séquences activatrices situées plus en amont (5’) qui correspondent au signal : « combien ? »:

- La CAAT box :

La séquence CAAT ou CATBOX ou boite CAT qui est constante (on la trouve dans tous les gènes) est située autour de la région -90.

Elle permet la fixation sur la catbox d’un facteur de transcription : le CTF (catbox transcription factor) .

- La séquence GC :

- Une autre séquence consensus : GC, non constante (donc pas présente sur tous les gènes) à -50, le facteur de transcription qui s’y fixe est SP1.


• 2) L’ Élongation :

Elle se déroule globalement à vitesse constante, cependant pendant l’élongation l’ARN polymérase II marque des pauses avec même des mouvements en arrière du complexe protéique sur l’ADN. C’est en C terminal ou domaines CTD : C-terminal domain de la grande sous unité de l’ARN polymérase II. Ce CTD joue un rôle central dans le contrôle de cette phase.

En effet, dans le complexe d’initiation, le CTD est sous forme déphosphorylé, par contre durant l’élongation, il est hautement phosphorylé en Serine et en Thréonine.La kinase est l’enzyme responsable de cette phosphorylation, elle semble être le facteur TFII H.

• 3) La Terminaison :

Mal connue pour les ARN messagers et semble couplée à la traduction. Les signaux de terminaisons présents chez les procaryotes ne sont pas retrouvés chez les eucaryotes à ce jour.


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III- Maturation des ARN messagers :

Cette étape est spécifique du monde eucaryote, son rôle principal est de protéger les ARNm pendant leur transport du noyau jusqu’au cytoplasme où ils vont être traduits en fonction du code génétique.

Elle fait intervenir 3 évènements :

- Formation de la coiffe en 5’ - Formation de la queue poly A en 3’- Excision / Épissage

A- Formation de la coiffe en 5’ (cf poly) :

Cette coiffe se forme en 5’ des ARNm dans le noyau dès le début de la transcription.

La coiffe est le méthyl-7-guanylate (Me 7 G) : on a une méthylation en position 7 du guanylate.

Elle est attachée par un triphosphate au ribose de la première base et formée à la suite d’une réaction enzymatique à 3 étapes :

- Hydrolyse: Action d’une phosphohydrolase qui enlève un phosphate au triphosphate en 5’.

- Fixation de la guanine (fait intervenir le GTP) par une guanylyl transférase.

- Action d’une méthylase qui va méthyler en position 7 et permettre la mise en place de la coiffe. (forme méthyl-7-guanylate)

Cette coiffe a un double rôle :

• Elle protège la région 5’ des ARN pré messagers vis à vis des nucléases et des phosphatases et ceci en fixant des protéines spécifiques.

• Elle intervient aussi dans l’initiation de la traduction. Un facteur d’initiation eucaryote eIF4 (facteur d’initiation eucaryote n°4) qui va reconnaitre cette coiffe et permettre l’attachement de la petite sous-unité ribosomique 40s sur l’ARNm.

(Le schéma ci-dessous provient d’internet, il n’est pas à connaitre par coeur)


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B- Polyadénylation en 3’ : (mise en place de la queue poly A)

Cette polyadénylation est reliée à un signal AATAA(pour ADN). Ceci sur le gène et donc sur l’ARN messager AAUAA.

Il va être reconnu par une endonucléase qui coupe 20 nucléotides en aval.Ajout de poly A par une poly A polymérase qui ajoute environ 200 nucléotides A.

Ceci a un rôle essentiellement protecteur pendant le passage du noyau vers le cytoplasme.

(ci-dessous un autre schéma pris sur internet pour la compréhension, utilisez celui du poly pour le concours :) )

C- Excision/épissage :

La plupart des gènes qui codent pour des protéines contiennent des introns et sont dit gènes mosaïques ou morcelés.

La différence entre la taille du gène souvent bien plus grande que celle de l’ARNm cytoplasmique correspondant d’où la notion d’exons et d’introns dans un gène.


• Exons : Séquences d’ADN ou de précurseurs d’ARN présentes dans l’ARNm mature cytoplasmique.

• Introns : Parties d’ADN ou de pré-messagers qui n'apparaissent pas dans l’ARNm mature et qui vont être détruites dans le noyau. On dit qu’il y a excision des introns et épissage des exons.

Il existe une séquence consensus à la jonction exon/intron des pré-messagers.

→ C’est ainsi que tout intron commence par un GU et finit par AG (Sur le brin sens de l’ADN, on retrouve un GU et un AG).→ Ces séquences sont dites « balises » du phénomène d’épissage.

(schéma pris sur internet pour expliquer, c’est une version plus compliquée que celui du poly)

Il convient de distinguer 3 sites :

- Le site donneur d’épissage au niveau de GU

- Un site accepteur au niveau de la balise AG

- Le site de branchement qui est à environ 20 nucléotides en amont de AG et qui comprend environ 7 nucléotides dont le 1 A joue un rôle important pour former une structure en lasso transitoire.

Celle-ci se forme entre le A du site de branchement et l’extrémité GU de l’intron avec une liaison phosphodiester particulière qui va se produire entre 2’ et 5’ du GU.

Interviennent aussi des SnRNP (small nuclear ribonucleoprotein) = ensemble d’ARN et de petites protéines).

- U1 sur un site donneur.- U2, U4, U6 (branchement = paire) viennent se fixer sur le site de branchement. - U5 sur un site accepteur.


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Mécanisme de l’épissage (poly) :

L’extrémité 3’ de l’exon 1 reliée à 5’ de l’exon 2:

On a intervention de 2 mécanismes de transesterification :

- Le groupement hydroxyle OH en 2’ du A attaque la liaison phosphodiester entre 1 et GU du site donneur. Il en résulte une coupure.

➔ Formation d’une structure en lasso intermédiaire et d’ une liaison particulière phospho diester 2’ 5’.

- Le OH du brin néoformé en 3’ de l’extrémité de l’exon 1 qui va attaquer à son tour la liaison phosphodiester entre la balise AG et l’exon 2 . Réunion des exons 1 et 2 et libération du lasso qui sera dégradé.(cf poly, ci dessous schéma un peu plus complet pris sur internet).

Tout ça se passe dans le noyau dans une structure particulière : le spliceosome

Spliceosome :

Particule d’épissage , structure riboprotéique de grande taille dans laquelle se réalise l’épissage (les réactions de trans-esterification) (Cf poly, ci dessous encore un autre schéma explicatif pris sur le net).


Épissage alternatif : (alpha ou beta)

À partir d’un seul gène on peut obtenir 2 ARNm matures différents selon que l’exon α ou β soit incorporé au cours de l’épissage.On dit que ces deux exons sont alternatifs.

Il y a donc un seul gène, un seul pré ARN messager qui vont conduire à 2 ARNm et 2 protéines différentes selon les tissus.

- L’épissage alternatif rend difficile la définition exon/intron. En effet, un exon épissé est considéré comme un intron dans un tissu donné et seule sa présence dans un ARNm mature permet de le définir comme un exon. Tout exon n’est pas traduit.

On peut avoir une queue poly A alternative et un promoteur alternatif.

- Parfois, il peut y avoir des mécanismes alternatifs d’expression des ARN messagers qui n’affectent pas la structure de la protéine (séquence), mais sur son niveau d’expression. C’est le cas de régions non traduites.

A partir d’un même gène on a des ARNm différents par deux cycles de polyadénylation alternatifs différents : Réaction d’une protéase sur la protéine, on obtient une hormone : la calcitonine dans la thyroïde qui correspond à l’exon 4.Dans le cerveau, le cycle Poly A1 n’est pas utilisé, donc on fait le Poly A2 (avec 6 exons), on aura une pré-hormone avec des exons 2,3 et 5 et on utilise une protéase. On aura alors l’exon 5 qui va donner une protéine totalement différente, c’est la CgRP, qui est synthétisée dans le cerveau.

- À partir d’un jeu de gène donné (30 000 gènes chez l’Homme) chez les eucaryotes : diversité créée par la combinaison. il est produit 10 fois plus de protéines que de gènes. Il peut y avoir des promoteurs alternatifs.

→ Chez l’Homme, l’épissage alternatif concerne 96% des gènes codant pour des protéines. On a à peu près autant de gènes que la mouche mais la distinction vient des phénomènes de transcription et d’épissage.

→ À partir d'un gène, on peut avoir une ou plusieurs protéines.


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Les techniques d’études :Technique de Ronoff : permet de mesurer la synthèse des ARNm , c’est une technique complexe faite par des laboratoires spécialisés. Equilibre entre synthèse et dégradation des ARNm :

On peut faire une réaction de Northern ou une RT-PCR avec une RT-transcriptase. Permet de calculer entre synthèse et dégradation de l’ARNm.

Il convertit l’ARN messager en ADN complémentaire: on fait une étape de RT ou de transcription inverse. Indispensable à faire car on utilise l’enzyme Taq polymérase qui est une ADN polymérase. Elle ne fonctionne que sur le l'ADN, donc il faut convertir notre ARN en ADN.

Étude de la demi vie des ARN messagers : Elle peut se mesurer en présence de Nothern sur lequel on ajoute de l’actinomicine D qui bloque la synthèse de l’ARNm.

Toute protéine de l’organisme est produite à partir d’un ARNm, certaines étapes sont intégrées dans des maladies : ces techniques ont donc un grand intérêt médical.

Exemple :

- Rubinstein-Tayby, malformation congénitale et retard mental. (mutation au niveau de TBP, syndrome rare).

- Amyotrophie spinale : Maladie dégénérative du motoneurone due à une diminution de l’expression réduite d’une protéine qui rentre dans l’assemblage des snRNP.


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IV- Les séquences de régulation des gènes :

Toutes les cellules de l’organisme ont les même gènes mais il est estimé que seulement 20% des gènes sont exprimés sur un temps donné T0.

L’expression génique est donc soumise à un contrôle très strict :- Dans le temps : développement- Dans l’espace: lignée cellulaire particulière

=> Elle assure l’homéostasie : équilibre physiologique qui repose sur des éléments de régulation sur des éléments CIS (gène) et TRANS (protéine agit sur gène).

Ces régulations sont sous l’influence de facteurs extérieurs.Un rôle crucial est joué par les micro ARN et à côté d’eux, les éléments de base se font au niveau transcriptionnel. Le contrôle de l’expression des gènes fait intervenir des mécanismes traductionnels, post-transcriptionnels et post-traductionnels. Ce ne sont pas tous les gènes exprimés en fonction des différents tissus.Il y a des éléments CIS et des éléments TRANS.

Les éléments CIS sont à proximité du gène qui est régulé, alors que les éléments TRANS sont situés à distance, voire sur un autre chromosome.

Régulation pré-transcriptionnelle :

A- Facteur « CIS» :

La région promotrice fait partie de ces facteurs CIS.

L’expression génique est sous le contrôle des 5’ UTR qu’on appelle aussi 5’ non traduites ou 5’ non codantes : elles sont transcrites en ARNm mais non traduites en protéines.

Elles n’interviennent que sur le niveau d’expression des gènes : on a des régions régulatrices d’amont et d’aval.Les régions régulatrices d’amont sont en avant du promoteur.

Sur l’ARNm mature, elles sont entre la coiffe et 5’ UTR, on a identifié les régions consensus : - Les enhancers (facteur nucléaire autour) se localisent en amont de la région régulatrice

et peuvent être à distance du gène sur le brin d’ADN linéaire mais elles restent proches du fait du repliement et de la compaction de l’ADN. Elles agissent dans les 2 orientations sur le brin d’ADN. Ce sont des séquences activatrices.

- Les silencers, à l’opposé, qui éteignent la transcription : ils recrutent des protéines qui bloquent l’expression du gène.

- Les insulateurs permettant l’isolement du gène.


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→ Ces 3 éléments se trouvent dans les séquences régulatrices du gène.

• Il existe des régions régulatrices d’aval appelées 3’ UTR.

Région transcrite mais non traduite. Elles agissent sur la stabilité des ARNm et ainsi influence fortement la demi vie des ARNm. Changer la région 3’ change la stabilité. → L’association CIS et TRANS assure la régulation de l’expression génétique.

B- Facteurs «trans» :

Ce sont des protéines nucléaires qui viennent se fixer sur les régions CIS. C’est cette association entre la protéine et sa cible qui assure la régulation de l’expression génique.

Dans ces protéines nucléaires, on retrouve des motifs nucléaires bien identifiés.

On a 2 types de motifs :

- Les motifs de liaisons à l’ADN - Les motifs d’activation à la transcription.Ces facteurs sont sous l’influence de signaux extérieurs qui permettent d’assurer l’homéostasie et donc l’équilibre :

- Les signaux membranaires (avec intervention de seconds messagers cytoplasmiques)

- Les facteurs de croissance stéroidiens qui agissent directement sur le gène


Encore un schéma internet.

Pour les allergiques à l’anglais désolé mais les

bons schémas sont rarement en français...

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On considère 4 motifs de liaisons à l’ADN :

- Hélice tour hélice qu’on retrouve au cours du développement (ex : facteurs de transcription = protéine)

- Doigt de zinc : peut être répété plusieurs fois donc on peut avoir plusieurs doigts

- Glissière à leucine : succession de leucines qui permet la liaison

- Hélice loop hélice (HLH) : Hélice boucle Hélice : devant ces structures, on retrouve des régions riches en AA basiques en amont = bHLH (basique hélice loop hélice) Exemple : protéine « myc » et cela peut donner naissance à la création de lymphomes de burkitt. Transcription de myc peut être altérée en pathologie (cancer)BHLH est une protéine qui participe à la prolifération de la cellule.

Ces facteurs de transcription ont une propriété commune : ils agissent en dimère donc à 2 protéines, on peut avoir des homodimères et des hétérodimères.

Remodelage de la chromatine : (si on déroule l’ADN, il mesure 3m c’est pour cela qu’il peut être compacté)

L’ADN va être très compacté dans la cellule et sa structure suit la vie de la cellule ; on distingue au niveau de la chromatine :

- L’Hétérochromatine : l’ADN va être très compacté, hyper compacté, les gènes ne sont pas exprimés: centromère

- L’Euchromatine : l’ADN est déroulé, nucléosomes séparés et permet l’expression des gènes et la transcription.

Le code des histones :

Ce sont des protéines de structure qui entourent l’ADN, on parle de code des histones.

Ces histones permettent le modelage de la chromatine et modifie l’accessibilité de l’ADN aux protéines du complexe transcriptionnel.

On peut avoir un équilibre pour l’acétylation des histones sur les lysines, ce qui permet l’expression de gènes, on passe de fibres de 10nm à 30nm.

(COCH3) permet le déroulement des chromatines et et permet de neutraliser la charge positive de la partie N-terminale des histones (surtout H3 et H4). Plus on acétyle, plus on transcrit.L’acétylation des histones permet l’expression du gène. Méthylation des histones : histone methyl transférase apporte un groupement méthyl et permet le blocage de l’expression de gènes. Plus il y a méthylation, plus il y a compaction. La compaction des nucléosomes entraîne donc l’absence de leurexpression.


L'acétylation de H3 et H4 permet l’expression de gène.La méthylation de H4 entraine l’inhibition de l’expression du gène. → Donc on parle de code des histones avec les phénomènes d’acétylation et de méthylation. (un autre schéma internet)

La régulation épigénétique :

Essentiellement dans le rôle de méthylation de l’ADN qui influence l’expression des gènes.

Cette méthylation se fait sur les cytosines des ilots CPG des promoteurs.

Quand il y a méthylation il n’y a pas d’expression de gènes donc plus c’est méthylé, moins c’est exprimé.

Lorsque ce promoteur est non méthylé il y a donc expression des gènes.

Cancer du pancréas : un gène sera non exprimé dans 90% des cas car il y a une hyperméthylation de ce gène dans sa région promotrice

L’empreinte parentale:

L’expression des gènes est soumise à l'empreinte parentale : chaque gène est unique dans le génome et comporte 2 allèles : un du père et l’autre de la mère.

Les gènes soumis à l’empreinte parentale : seul celui du père ou de la mère sera exprimé. Ils sont peu nombreux de l’ordre de 80 gènes chez les mammifères (Femme XX / Homme XY) qui sont soumis à l’empreinte parentale.

Par ailleurs, chez la femme un des 2 X ne va pas être exprimé, au hasard (inactif).Chez l'homme ou la femme on a qu’un seul X qui est exprimé.

Mécanisme peu connu :

Chaque étape de la maturation des ARN est sous contrôle donc on a mise en place de la coiffe ainsi que des phénomènes d’épissages et épissages alternatifs et de polyadénylation.

FIN DU COURS 19/10/18


Schéma pris sur internet pour la compréhension, à ne pas apprendre

par coeur

V- Régulation par les microARN :

Elles sont de découverte récente. Mis en évidence la première fois dans les plantes (pétunia) dans les années 1990. (sur le poly, les tâches blanches des fleurs sont dues aux miARN qui empêchent l'expression d'un gène de couleur foncée) Bon à savoir : Le prof nous dit de façon joviale que quand on verra des pétunias il faudra penser à lui !

Un seul micro-ARN peut contrôler plusieurs centaines de gènes. En 2001, un seul gène était connu chez l’Homme. Aujourd’hui par l’informatique on estime qu’il y a 1800 microARN. 1 seul microARN peut contrôler une centaine de gènes.Présents de partout dans le génome, partie codante et non codante. Soit isolés, soit groupés en clusters.

1) Maturation des micro ARN :

Structures assez petites : 21 à 23 nucléotides.

- Ils sont synthétisés par l’ARN polymérase II (enzyme qui intervient dans la formation de l’ARNm).

- Ils subissent la même maturation, une coiffe en 5’ et une queue poly A en 3’. - Ils sont dit non codants car non traduits, ils ne donnent pas naissance à des protéines. Les pri-miARN sont des transcrits primaires (boucle de 70 nucléotides) codés par l’ARN polymérase II. Ils sont les précurseurs des pré-miARN.

Dans le noyau, ils vont être coupés par les nucléases : exemple de la protéine Dorsha qui coupe les pri-miARN en pré-miARN. Les pré-miARN vont connaitre une maturation dans le cytoplasme grâce à des enzymes et à des endonucléases : DICER.

Permet de dissocier une boucle et donc d’obtenir deux simples brins séparés : - Un brin est appelé brin guide (microARN mature) qui s’associe à RISC (complexe protéique)- L’autre brin est appelé brin passager, il va être dégradé.

On finit avec un monobrin d’ARN.(schéma internet).


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2)Fonction des micro ARN :

Les Micro ARN vont bloquer l’expression des protéines par 2 mécanismes post-transcriptionnels :

- Soit il y a une complémentarité parfaite entre la région 3’ UTR ARNm et le miARN. Il y alors destruction de l’ARNm au niveau de sa région 3’ UTR. La spécificité est assurée par la séquence du micro ARN.La coupure de l’ARNm est réalisée par le complexe protéique RISC.

- La complémentarité est imparfaite, à ce moment là, c’est la traduction (la synthèse protéique) qui va être bloquée.

L’importance des micros ARN est grandissante, ils interviennent aussi dans le développement tissulaire telles que les cellules souches mais aussi au niveau de la peau, durant l’hématopoïèse ou durant l’implantation des poils ou des cheveux. (présence de sourcils et de cheveux due aux miARN). Ils contrôlent aussi les enzymes de méthylation (donc l’expression) et donc indirectement les phénomènes épigénétiques.Mécanisme ARN interférence pour la complémentarité parfaite.

Régulation traductionnelle : (exemple du fer)

Il s’agit d’une régulation en feedback. En excès d’une protéine, il y a inhibition de sa synthèse. (Exemple : protéines de transport du fer (mécanisme complexe), si trop de fer, on arrête de les synthétiser…).

Régulation traductionnelle : (dosage dans le sang)

- La ferritine permet de stocker le fer, si la quantité de fer augmente on arrête de les stocker.

- La transferrine permet de transporter le fer, si la quantité de fer augmente elle augmente aussi.

Régulation post-traductionnelles :

→ De nombreuses protéines sont synthétisées sous forme inactive et doivent subir une modification post-traductionnelle pour être en configuration active.

Par exemple :

- Clivage enzymatique

- Modification de la protéine :

- Glycosylation- Acétylation- Phosphorylation


Deux exemples :

- Exemple de l’hémoglobine (transporte l’oxygène entre les poumons et les tissus, elle existe sous forme de tétramère): Le gène de l’Hb est partout mais n’est exprimé que pendant la lignée rouge (GR + leurs précurseurs). On appelle aussi les GR « les sacs à hémoglobine »

L’expression des gènes de l’HB (tétramères 4 sous unités-protéiques) est régulée au cours du temps. On a 3 Hb au cours du temps:

- L’Hb embryonnaire (3-4 premiers mois de la vie foetale)- L’Hb foetale (tout le reste de la grossesse)- L’Hb adulte (après naissance) : l’hémoglobine HBA1C (hémoglobine glyquée) qui

permet de mesurer le sucre dans le sang pendant 3 mois (reflet de la glycémie).

- Exemple des gènes des immunoglobulines (sécrétées par les lymphocytes B) et du récepteur T (G blancs) et des lymphocytes. Ils sont là partout dans nos cellules mais ne sont exprimés que dans les cellules qui donnent des lymphocytes, on parle de tissu lymphoïde.

Ils font partie de la lignée lymphoïde donc lymphocytes et précurseurs.

Ils doivent subir un réarrangement génique pour pouvoir s’exprimer. On retrouve un phénomène d’exclusion allélique : seule une chaine lourde est exprimée à la surface de nos lymphocytes. On représente les Ig comme des « y ». La chaine lourde va se retrouver associée à une chaine légère λ ou κ.

Techniques d’étude :

On peut étudier les promoteurs et régions régulatrices d’amont :

- On peut utiliser des transferts de gènes : on parle de transfection :

On peut étudier les facteurs CIS ou TRANS.

• Le test à la luciférase permet d’étudier les promoteurs et les facteurs CIS et TRANS (facteurs protéiques qui vont se fixer sur la région du promoteur)

Instable : pas incorporé au génome et stable incorporé dans le génome. Les stables peuvent se faire au hasard ou par recombinaison homologue.- On peut utiliser les techniques de transfert de gènes, qui peuvent se faire dans la cellule ou dans l’organisme ainsi que chez les animaux ou les plantes. On cherche a remplacer le gène défectueux par un gène fonctionnel. ➔ Dans la cellule on va parler de transfection (introduire un gène dans une cellule)Ou alors transfert de gènes dans l’organisme (animaux ou plante) : on obtient des organismes transgéniques (OGM ou l'exemple de Dolly).

- On a des techniques globales : on peut utiliser des profils qui nous permettent d’étudier plusieurs gènes à la fois.


Il peut s’agir de :

- Puces à ADN qui permettent d’étudier les profils d’expression des gènes- Profils de méthylation, - Profils de microARN - De profils protéiques

Intérêt médical :

Toute protéine est codée par un gène. La régulation des gènes marche par un système combinatoire qui permet une régulation fine. Si ce phénomène est altéré, il conduit à des phénomènes pathologiques majeurs :

- Dans les pathologies de l’hémoglobine on peut avoir une Thalassémie (défaut expression gène α et β de l’hémoglobine) qui sont fréquentes en Méditerranée.

Elles peuvent être mortelles dans leur forme majeure si elles intéressent les deux allèles (mais elles sont aussi mineures si elles intéressent un seul des deux allèles, pas de stress…)

- Cancer : On cherche à utiliser des profils d’expression par l’utilisation des puces à ADN afin d’améliorer le pronostic. Ces cancers vont modifier les microARN. Il y a des cancers du sein avec un très bon pronostic, et d’autres avec des mauvais pronostics.

Les profils d’expression des gènes modifiés sont alors très perturbés: Exemples : cancers, diabète : étudiés par puce à ADN, qui perturbe l’expression des gènes.

- MicroARN : recherche sur le plan diagnostic et thérapeutique: c’est un agent médicament → On parle de Thérapie moléculaire = manipulation du réseau d’expression.

- La thérapie génique est le fait d’essayer de remplacer un gène défectueux qui ne s’exprime plus par un gène normal. (Celle-ci existe depuis des années mais reste aujourd’hui limitée).

- La thérapie moléculaire : vise à manipuler cette transcription notamment les microARN .

On peut étudier ces modèles d’expression très fin chez les animaux (plus facile que chez l’Homme); comme par exemple la drosophile (mouche), les zébrafish (poisson), et sur les nématodes (petit vers), ou sur des rats (rongeurs), voire sur des mammifères (porc et singe).

On peut faire 2 remarques :

- Il est classique de considérer que les gènes importants sont ceux qui sont conservés au cours de l’évolution des espèces (certains mêmes gènes sont présents chez les nématodes et chez l’Homme).

- Les gènes importants sont ceux conservés au cours de l’évolution. Ex : BCL2 qui joue un rôle dans l’apoptose, il a été introduit dans un nématode

- La pression de sélection porte sur les exons.


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La Traduction :

La biosynthèse des protéines est un mécanisme complexe qui se déroule chez les eucaryotes dans le cytoplasme. En effet, la traduction est réalisée au niveau des ribosomes qu’on trouve dans le cytoplasme. Elle met en jeu plusieurs centaines de macromolécules. On retrouve les ARNm, les ARNt et les ribosomes qui sont des structures ribonucléoprotéiques (ARN + protéines) + d’autres enzymes et protéines.

La synthèse de la protéine fait intervenir le code génétique (Langage universel) :

Elle permet le transfert de l’information génétique contenue dans l’ADN et transcrite en ARN puis en succession d’acides aminés grâce au code génétique utilisé dans tout le monde vivant.La traduction est la cible principale des antibiotiques.Les AA doivent être activés sous forme d’aminoacyl ARN de transfert pour rentrer dans la synthèse protéique

Trois étapes : Initiation, Élongation, Terminaison.

Expérience de Chapeville et Lipman :

L’information est portée par l’ARNm et va être reconnue par l’ARNt et non l’acide aminé par complémentarité des bases.

Dans cette expérience, la cystéine marquée au carbone 14 est fixée sur son ARNt spécifique et est donc la cystéine-ARNt, elle est activée sur son ARNt.

On a une réduction chimique: la cystéine va être réduite en alanine radioactive. On a formation d’un hybride radioactif avec une alanine radioactive combinée avec l’ARNt spécifique de la cystéine.


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�

En système acellulaire l’alanine est incorporée dans une chaîne peptidique à la place de la cystéine.

L’AA n’intervient pas dans la reconnaissance codon-anticodon.

C’est donc bien la preuve que l’acide aminé ne reconnait pas l’information génétique mais que c’est l’ARNt.

L’ARNt joue un rôle d’adaptateur de l’acide aminé. La reconnaissance entre l’ARNm et l’ARNt se fait par complémentarité des bases entre le codon sur l’ARNm et l’anticodon sur l’ARNt. L’ARNm et l’ARNt placent leurs séquences de manière antiparallèle.

• Code à 3 lettres : reconnaissance par un triplet de bases (codon sur ARNm) Les ARNm et ARNt placent leur séquence de manière anti-parallèle. Quand on parle de la première base du codon, c’est la dernière base de l’anticodon. ARNm : codons ARNt : anticodons

Le code génétique :

Il est fondamental et comprend 4 propriétés fondamentales

• Il est universel (utilisé par tous les organismes vivants, à très peu d’exceptions comme les mitochondries dans lesquelles on utilise pas le code génétique)

• Non chevauchant : On a 4 puissance 3 possibilités = 64 possibilités. - 61 qui codent pour les 20 acides aminés. - 3 ne codent pas pour les AA : ce sont les codons STOP (arrêtent la synthèse

protéique). Voir tableau page 202 du poly. • Dégénéré : plusieurs codons peuvent spécifier pour un même Acide Aminé

• Jamais ambigu : un même codon ne correspond jamais à 2 acides aminés différents. Un codon —> un AA.

➔ Cette dégénérescence n’est pas due au hasard :

- Ce sont les acides aminés les plus abondants dans les protéines qui ont un nombre élevé de codons.

- Les codons différents qui spécifient (codent) pour un même acide aminé sont dits codons synonymes.

• Seulement deux acides aminés sont codés par un seul codon: - Codon AUG pour la méthionine - UGG pour le tryptophane.

Cys − ARNt

cys

cys+ARNt+ATP+E! "## $##réductionchimique⎯ →⎯⎯⎯⎯⎯ Ala − ARN

hybride% &# '#


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La plupart des codons synonymes ne diffèrent que par la 3ème base en 3’ du codon.

Cette inosine est une nucléoside dont la base est l’hypoxanthine. Elle est capable de s’apparier à 3 bases différentes: le U, C et A (pas le G).

Deux règles fondamentales du code génétique:

1. Reconnaissance stricte sur les 2 premières bases du codon. (A avec T et C avec G).

Les deux premières bases du codon s’apparient de façon classique. La reconnaissance est précise. Les codons qui diffèrent par les deux premières bases vont être reconnus par des ARNt différents.

2. La flexibilité de la reconnaissance porte sur la 3ème base du codon = c’est la 1ère base de l’anticodon (car antiparallèles) qui détermine si l’ARNt va lire 1, 2 ou 3 bases.

L’hypoxanthine est la base de l’inosine (retrouvée uniquement dans les ARNt) :- Le U peut reconnaitre le A ou le G - Le G peut reconnaitre le C ou le U - Le I (inosine) peut reconnaitre le U ou le C ou le A (pas le G)

Cette flexibilité permet une synthèse protéique plus rapide.

Le cadre de lecture : enchainement de triplet de codons sur l’ARNmIl est dit ouvert quand il y a un enchainement de triplet qui ne renferme pas de codons stop à partir du codon start.

Mécanismes de la traduction : Activation des AA : 2 étapes :

Pour être incorporé, l’AA doit être activé. L’activation de l’acide aminé se fait en 2 étapes grâce à des aminoacyl ARNt synthétase. Chacune de ces enzymes est capable de fixer un AA donné sur un ARN de transfert spécifique.

Une fois l’AA activé, il peut rentrer dans la synthèse protéique, où on va retrouver les 2 phases :

• 1ère étape : Formation d’un aminoacyl adénylate lié à la synthétase grâce à l’énergie de l’ATP. Production d’AMP.

• 2ème étape : Transfert de l’acide aminé depuis l’enzyme sur l’ARN de transfert (ARNt) pour former l’aminoacyl ARNt avec libération de l’AMP et de 2 phosphates.

Le bilan énergétique définitif est donc la consommation de deux liaisons riches en énergies pour activer chaque acide aminé.


L’anti codon : sur ARNt, on peut y trouver l’inosine = l'hypoxanthine est la base de

l'inosine

L’inosine est capable de s’associer au U, au C ou au A (flexibilité).

Spécificité des ARNt synthétases : Il existe au moins une ARNt synthétase pour chaque acide aminé donc au moins 20 enzymes différentes. Ce sont ces enzymes qui assurent la spécificité de la biosynthèse protéique avec la reconnaissance du bon acide aminé et du bon ARNt : on parle de double spécificité.

Bilan énergétique : Il faut deux liaisons riches en énergie.

Ces enzymes, les synthétases, sont considérées comme enzymes à 2 substrats : - Au niveau du site 1, l’enzyme reconnait l’acide aminé sur la base de son poids et de sa

charge. D’où le terme de double tamisage. (uniquement sur le site 1 qui fixe l’AA). - Le site 2 permet la reconnaissance du bon ARN de transfert.

On distingue 5 domaines fonctionnels dans une AA-ARNt-synthétase :

- Reconnaissance de l’acide aminé

- Reconnaissance de l’ARNt

- Élimination des acides aminés fixés par erreur

- Fixation de l’ATP et l’activation de l’AA

- Fixation de l’acide aminé activé sur l’ARNt.

A- Initiation de la synthèse protéique

• Chez les eucaryotes : (poly) :

Elle nécessite 5 éléments :

- Un acide aminé initiateur : La Méthionine (pour eucaryotes) qui fait intervenir un ARNt d’initiation (spécifique de l’initiation). La méthionine initiatrice va être clivée après synthèse protéique (=traduction).

- L’ARNt est différent dans l’initiation et dans l’élongation.

- Les ribosomes avec la petite sous-unité 40S et la grande 60S (provenants du ribosome 80S) (S pour vitesse de sédimentation)

- L’ARNm

- Facteurs protéiques d’initiation : eIF (eucaryote initiation factor)

- Energie apportée sous forme ATP

La formation du complexe méthionine-ARNt d’initiation consomme 2 liaisons riches en énergie apportées par l’ATP. (ATP donne AMP + P-P)


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Étape préliminaire :

Dissociation du ribosome : On passe du global 80S pour obtenir les sous-unités 60S et 40S (S est la vitesse de sédimentation).Formation d’un complexe entre la méthionine-ARNt d’initiation associé à de l’énergie provenant du GTP et associé à un facteur protéique eIF2.

1) Étape 1 :

Formation d’un complexe entre 40S et la méthionine sur son ARNt d’initiation au niveau de la coiffe. La coiffe est reconnue par l’eIF2.

2) Étape 2 :

On déplace le complexe de la coiffe à AUG : codon initiation, code pour la méthionine. On a formation d’un complexe définitif de la traduction avec ATP, déplacement petite sous-unité de la coiffe au codon AUG (start : Met).

3) Étape 3 :

En présence du facteur eIF5 : formation complexe initiation: Fixation de la grande sous unité du ribosome sur l’ARNt.

On peut y distinguer deux sites A et P. Dans P on a la méthionine et l’ARNt. Le A reste libre. (schéma internet)


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• Chez les procaryotes : AA initiateur : la formyl méthionine.

-1ère étape : Activation de la méthionine par la synthétase (Met-ARNt)

-2ème étape : formylation en CHO de la méthionine par une transformylase (permet de produire le groupement formyl CHO). (CHO à la place H). NH2 ➔ NH-CHOLes procaryotes peuvent utiliser deux séquences : AUG et GUG

Le codon initiateur peut être précédé par une séquence en amont : la séquence de Shine Delgarno (procaryote) de 4 à 9 nucléotides est riche en purine (en amont) qui permet de fixer la petite sous-unité chez les procaryotes par un ARNr 16s (faisant elle-même partie de la petite sous-unité 30 S) dans sa région 3’

Initiation procaryote :

• Étape préliminaire : les ribosomes se dissocient

• Étape 1 : formation complexe binaire entre 30S et IF (facteur protéique)

• Étape 2 : complexe ternaire: arrivée ARNm (complexe avec avec la petite sous-unité, ARNm et l’ARNt)

• Étape 3 : consommation de GTP. Arrivée de la grande sous unité donne le complexe ternaire d’initiation définitif. Met sur P / A libre. (70s-ARNm-ARNt).

B- L’élongation : (identique procaryote/eucaryote)

L’élongation nécessite 3 facteurs :

- Des aminoacyl ARNt- Du GTP qui apporte l’énergie.- Des facteurs d’élongations (EF: Elongation Factor)

L’élongation se fait en 3 étapes :

1) Fixation de l’aa-ARNt sur le site A grâce à un facteur protéique important : EF1α (apporte GTP) qui permet cette réaction en présence de GTP. Contrôle l’entrée de l’acide aminé activé au site A. (1 liaison riche en énergie apportée par le GTP)

2) La peptidisation : Cette réaction est réalisée dans une enzyme présente dans la grande sous unité ribosomique : la peptidyl-transférase.

La méthionine d’initiation (ou chaine peptidique naissante) est transférée du site P au site A par une attaque nucléophile.L’ARNt va être désacylé (il perd son AA) et quitte le site P et la méthionine est transférée sur le site A. Le GTP n’intervient PAS.


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3) Translocation : L’ARNt désacylé quitte le site P.Le peptidyl-ARNt passe du site A au site P par l’action d’une translocase (EF2). L’ ARNm va se déplacer d’un codon.

Dans la diphtérie, la toxine bactérienne peut être mortelle chez les personnes non immunisées. Elle va bloquer la translocase donc l’EF2, donc pas de translocation possible. Elle va inhiber la synthèse protéique au niveau de la translocase donc la personne peut mourir.

Bilan de fixation de chaque acide aminé :

Au total, au cours de l’élongation, le bilan énergétique de l’entrée de chaque AA est de 4 liaisons riches en énergie :

- 2 consommées au cours de l’activation de l’acide aminé- 1 pour la fixation sur le site A du complexe aa-ARNt- 1 pour la translocation

C- La terminaison :

UAG, UAA et UGA : Codons de terminaisons. Aucun ARNt ne possède l’anticodon correspondant. Il y a arrêt de la synthèse protéique.

Ils vont être reconnus par des facteurs de terminaisons (eRF= eucaryote releasing factor) qui nécessitent de l’énergie sous forme de GTP.

Les facteurs protéiques sont eRF.Elles ont pour effet de modifier la peptidyl transférase qui intervient au cours de l’élongation et qui va acquérir une activité hydrolase.

La chaine peptidique va être relâchée et l’ARNt désacylé quitte le ribosome. Donc on a arrêt de la synthèse protéique


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(schéma internet hors concours, pour la compréhension)

1) Intérêt médical sur les antibiotiques et mutations :

Inhibition de la traduction et effet des antibiotiques :

Les antibiotiques sont des dérivés de bactéries de type streptomyces, qui attaquent les protéines bactériennes et peuvent avoir des effets toxiques chez l’hommes. On fait des résistances bactériennes si on prend trop d’antibiotiques. Les antiobiotiques bloquent la traduction des procaryotes.La synthèse protéique est proche entre eucaryotes et procaryotes. Donc ils sont efficaces mais peuvent avoir des répercussions néfastes.

Exemples :

- La streptomycine qui empêche la fixation correcte de l’ARNt d’initiation (bloque l’initiation)

- La gentamicine et la néomycine empêchent l’étape d’élongation.

- La tétracycline inhibe l’élongation.

- L’érythromycine : elle bloque la terminaison. Antibiotique que l’on prend pour le mal de gorge.

- Le chloramphénicol inhibe l’élongation et la terminaison. Il peut être utilisé dans les maladies graves.


2) Les mutations :

Les mutations dans les maladies génétiques : du fait de la flexibilité de reconnaissance elles sont le plus souvent sur la 3ème base du codon, souvent elles ne changent pas l’acide aminé et on parle alors de mutation silencieuse :

- Les codons synonymes

Mais aussi :

- Les mutations faux-sens où l’on change l’acide aminé à la place d’un autre

- Les non-sens qui introduisent un codon stop à la place d’un AA (on a une protéine tronquée).

Réponses aux questions 2017 :

- TFII D est composé de TBP et TAF- ouais c’est tout

Réponses aux questions 2018 :

- Le promoteur est il transcrit : non, elle commence en +1- Pour l’acétyation des histones : sur H3 et H4 l’acétylation permet l’expression des gènes.

À l’inverse la méthylation des histone réduit l’expression des gènes- Les liaisons phosphodiester : entre deux AA généralement c’est entre 3’ et 5’. Pour le

site de branchement dans l’intron elle est 2’ 5’ : elle est particulière- Pour les introns : ils commencent par GU sur l’ARNprémessager et GT sur le brin

codant. Le facteur intervenant est eIF4. - Boîte TATA : trois régions consensus : la TATA box la boîte GC et la CAAT box. La seule

inconstante est la boîte GC.


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Transcription et maturation des ARN...

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