Développement d'oligonucléotides antisens pour le traitement ......III Résumé Le développement...

Développement d’oligonucléotides antisens pour le traitement de la dystrophie myotonique de Steinert

Mémoire

Dominic Jauvin

Maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Dominic Jauvin, 2015

III

Résumé

Le développement d’une thérapie génique pour la dystrophie myotonique de type 1 (DM1) implique

l’utilisation d’un système de livraison musculaire efficace. L’évaluation d’oligonucléotides antisens (ASO) en

conformation gapmer nous a permis d’identifier deux ASO, un de chimie 2’-O-méthoxyéthyle et l’autre avec

des acides nucléiques bicycliques avec éthyle contraint, dont l’efficacité dans les modèles cellulaires et de

souris de la DM1 était suffisante pour réduire significativement l’ARNm étendu de la DMPK. Il fut possible

d’observer une réduction des foci nucléaires menant à une redistribution d’un régulateur d’épissage séquestré

au noyau, ainsi corrigeant des erreurs d’épissage caractéristiques de la DM1. Plus particulièrement chez la

souris DMSXL, l’injection systémique bihebdomadaire a mené à une maturation des fibres musculaires ainsi

qu’au rétablissement de la force musculaire des sujets. Ce projet est la preuve de principe in vitro et in vivo

qu’une thérapie génique par les ASO est concevable pour le traitement de la DM1.

V

Abstract

A gene therapy for myotonic dystrophy type 1 (DM1) implies an effective muscular delivery method.

The evaluation of antisenses oligonucleotides (ASO) enabled us to identify two gapmer ASOs, one with a 2’-O-

methoxyethyl chemisty and the other with a constrained ethyl bicyclic nucleic acid, whose efficacy in DM1 cell

and mouse models was sufficient to significantly reduced expanded hDMPK mRNA levels. Furthermore,

reduction in DMPK induced nuclear foci resulted in redistribution of a sequestered alternative splicing

regulator, leading to correction of mis-splicing events characteristic of DM1. In DMSXL mouse, biweekly

systemic injection of ASOs induced muscle fiber maturation and a gain in forelimb strength. This project is the

in vitro and in vivo proof of the principle that an ASO gene therapy is conceivable for treatment of DM1.

VII

Table des matières

RÉSUMÉ...................................................................................................................................................... III

ABSTRACT.................................................................................................................................................... V

TABLE DES MATIÈRES ................................................................................................................................ VII

LISTE DES TABLEAUX .................................................................................................................................. IX

LISTE DES FIGURES ...................................................................................................................................... XI

LISTE DES ABRÉVIATIONS ......................................................................................................................... XIII

REMERCIEMENTS ...................................................................................................................................... XV

AVANT-PROPOS ...................................................................................................................................... XVII

INTRODUCTION ........................................................................................................................................... 1

1. LA DYSTROPHIE MYOTONIQUE DE STEINERT ........................................................................................... 1

1.1 HISTORIQUE DE LA PATHOLOGIE ........................................................................................................................ 1

1.2. SIGNES ET SYMPTÔMES .................................................................................................................................. 2

1.2.1. Forme tardive ................................................................................................................................... 2

1.2.2. Forme adulte .................................................................................................................................... 3

1.2.3. Forme infantile ................................................................................................................................. 3

1.2.4. Forme congénitale ............................................................................................................................ 3

1.3. L’ANOMALIE GÉNÉTIQUE ................................................................................................................................ 4

1.4. DIAGNOSTIC ................................................................................................................................................ 5

1.5. MÉCANISME MOLÉCULAIRE ............................................................................................................................. 6

1.5.1. Physiopathologie de la maladie ....................................................................................................... 6 1.5.1.1. Instabilité des répétitions à trinucléotides ................................................................................................. 6

1.5.1.1.1. Mécanismes d’instabilité .................................................................................................................... 7 1.5.1.2. L’haploinsuffisance de la DMPK.................................................................................................................. 8 1.5.1.3. Haploinsuffisance des gènes adjacents à la DMPK ................................................................................... 10 1.5.1.4. Toxicité de l’ARNm : modulation de facteurs d’épissage ......................................................................... 11

1.5.1.4.1. Séquestration de MBNL .................................................................................................................... 12 1.5.1.4.2. Élévation des niveaux de la protéine CUGBP1 .................................................................................. 13

2. OUTILS MOLÉCULAIRES POUR UNE THÉRAPIE GÉNIQUE ........................................................................ 15

2.1. STRATÉGIES THÉRAPEUTIQUES POUR LA DM1 .................................................................................................. 15

2.1.1. Élimination des ARN toxiques ......................................................................................................... 15

2.1.2. Neutralisation de la toxicité des ARN ............................................................................................. 16

2.2. LES OLIGONUCLÉOTIDES ANTISENS .................................................................................................................. 18

2.2.1. Les modifications chimiques ........................................................................................................... 20 2.2.1.1. Première génération ................................................................................................................................ 21 2.2.1.2. Deuxième génération ............................................................................................................................... 22 2.2.1.3. Troisième génération ............................................................................................................................... 24

2.2.2. Pharmacocinétique des phosphorothioates ................................................................................... 26

2.2.3. Toxicologie des phosphorothioates ................................................................................................ 28

3.1. HYPOTHÈSE......................................................................................................................................... 31

3.2. OBJECTIFS ........................................................................................................................................... 31

VIII

DÉVELOPPEMENT ....................................................................................................................................... 33

4.1. RÉSUMÉ .................................................................................................................................................... 35

4.2. ABSTRACT ................................................................................................................................................. 37

4.3. INTRODUCTION ........................................................................................................................................... 39

4.4. RESULTS/DISCUSSION/CONCLUSION ............................................................................................................... 43

4.5. METHODS ................................................................................................................................................. 47

4.6. REFERENCES............................................................................................................................................... 53

4.7. FIGURE LEGENDS ........................................................................................................................................ 57

4.8. FIGURES .................................................................................................................................................... 59

4.9. SUPPLEMENTARY INFORMATION .................................................................................................................... 61

CONCLUSION .............................................................................................................................................. 69

BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................................................................... 71

IX

Liste des tableaux

TABLEAU I - HISTOLOGIE MUSCULAIRE DANS LA DYSTROPHIE MYOTONIQUE DE TYPE 1 ........................................................... 5

XI

Liste des figures

FIGURE 1 - HANS STEINERT (1875-1911) ................................................................................................................... 1

FIGURE 2 - LOCUS DU GÈNE DE LA DM1 ....................................................................................................................... 4

FIGURE 3 - LOCALISATION DES RÉPÉTITIONS EXPANSIBLES CAUSANT DES PATHOLOGIES ........................................................... 6

FIGURE 4 - STRUCTURES FORMÉES PAR LES TNR DANS LA DM1 ........................................................................................ 8

FIGURE 5 - GÈNE DE LA DMPK, SITES D'ÉPISSAGE ALTERNATIF ET DOMAINES STRUCTURAUX ................................................. 10

FIGURE 6 - COLLABORATION ENTRE MBNL1 ET CUGBP1 DANS LE CONTRÔLE DE L'ÉPISSAGE ALTERNATIF DURANT LE

DÉVELOPPEMENT .......................................................................................................................................... 14

FIGURE 7 - PERTE DE FONCTION DE MBNL1 ET GAIN DE FONCTION DE CUGBP1 ............................................................... 14

FIGURE 8 - MÉCANISME DE DÉGRADATION À LA RNASE H1 INDUIT PAR LES ASOS GAPMERS ................................................ 20

FIGURE 9 - MODIFICATIONS CHIMIQUES DES ASO ........................................................................................................ 21

FIGURE 10 - STRUCTURE D'UN GAPMER ..................................................................................................................... 23

FIGURE 11 - MODIFICATION D'OLIGONUCLÉOTIDE (S)-CET ............................................................................................ 24

FIGURE 12 - AVENIR DES ASO SUITE À UNE INJECTION SYSTÉMIQUE ................................................................................. 27

XIII

Liste des abréviations

AAV : « Adeno-associated virus » Virus adénoassocié

ADN : Acide désoxyribonucléique

ADNg : Acide désoxyribonucléique génomique

AGO2 : Argonaute 2

ALAT : Alanine aminotransférase

ARE : « AU-rich elements » Éléments riches en AU

ARNi : Acide ribonucléique interférent

ARNm : Acide ribonucléique messager

ASAT : Aspartate aminotransférase

ASO : « Antisense oligonucleotide » Oligonucléotique antisens

BNA : « Bicyclic nucleic acid » Acide nucléique bicyclique

CAG : Cytosine-adénine-guanine

CDM1 : « Congenital DM1 » Dystrophie myotonique de type 1 congénitale

CELF : « Elav-like family member » Famille des CUGBP ressemblant à Elav

cET : « 2’,4’-constrained-2’-O-ethyl » 2’-O-éthyle contraint en 2’,4’

CLCN1 : « Chloride channel 1, voltage-sensitive 1 » Canal chlore 1 voltage dépendant

CpG : Cytosine-phosphate-guanine

CPP : « Cell-penetrating peptide » Peptide d’incorporation cellulaire

CRIK : « Citron Rho-interacting kinase » Kinase citron interagissant avec Rho

CTG : Cytosine-thymine-guanine

CUG : Cytosine-uracile-guanine

CUGBP1 : « CUG binding protein 1 » Protéine 1 liant les CUG

DHPR : « Dihydropyridine receptor » Récepteur de la dihydropyridine

DM : Dystrophie myotonique

DM1 : Dystrophie myotonique de type 1

DM2 : Dystrophie myotonique de type 2

DMPK : « Dystrophia myotonica protein kinase » Protéine kinase de la dystrophie myotonique

DMWD : « Dystrophia myotonica WD-repeat containing protein » Protéine de la dystrophie

myotonique contenant des répétitions-WD

FDA : « Food and Drug Administration » Agence américaine des produits alimentaires et

médicamenteux

hDMPK : « Human Dystrophia myotonica protein kinase » Protéine kinase de la dystrophie

myotonique humaine

hnRNP H : « Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H » Protéine ribonucléaire H hétérogène

INSR: « Insulin receptor » Récepteur à insuline

LNA : « Locked nucleic acid » Acide nucléique barré

mDMPK: « Mouse Dystrophia myotonica protein kinase » Protéine kinase de la dystrophie myotonique

de souris

MBNL : « Muscleblind-like splicing regulator » Régulateur d’épissage comme muscle-aveugle

ME : 2’-O-méthyle

MEF2A : « Myocyte enhancer factor 2A » Facteur d’amplification de myocyte 2A

MOE : 2’-O-méthoxyéthyle

XIV

MRCK : « Myotonic dystrophy kinase-related CDC42-binding kinase » Kinase liant CDC42 en lien

avec une kinase impliquée dans la dystrophie myotonique

MYPT1 : « Myosin phosphatase target subunit » Phosphatase à myosine ciblant la sous-unité

PCR : « Polymerase chain reaction » Réaction en chaîne par polymérase

PKC : « Protein kinase C » Protéine kinase C

PLM : Phospholemman

PLN : Phospholamban

PMO : « Phosphorodiamidate morpholino oligomer » Oligomer morpholino phosphorodiamidate

PNA : « Peptide nucleic acid » Acide nucléique peptide

PO: Phosphodiester

PS: Phosphorothioate

PPMO : « Peptide-linked phosphorodiamidate morpholino oligomer » Oligomer morpholino

phosphorodiamidate lié à un peptide

RISC : « RNA-induced silencing complex » Complexe de sous-expression induit à l’ARN

ROCK : « Rho-activated protein kinase » Protéine kinase associée à Rho

shRNA : « Short hairpin RNA » Petit ARN en épingle

siRNA : « Short interfering RNA » Petit ARN interférant

SIX5 : « Sine oculis homeobox homolog 5 » Homologue 5 de la boîte homéotique sine oculis

SMA : « Infantile spinal muscular atrophy » Atrophie musculaire spinale infantile

SP-PCR : « Small-pool polymerase chain reaction » Réaction en chaîne par polymérase de petits

ensembles

TLR : « Toll-like receptor » Récepteurs semblables à Toll

Tm : « Melting temperature » Température de fusion

TNFα : « Tumor necrosis factor alpha » Facteur alpha de nécrose des tumeurs

TNNT2 : « Troponin T type 2 (cardiac) » Troponine T cardiaque

TNR : « Trinucleotide repeats » Répétition de trinucléotides

VSGGG : Motif d’acides aminés Valine-Sérine-Glycine-Glycine-Glycine

ZNF9 : « Zinc finger protein 9 » Protéine 9 à doigt de zinc

XV

Remerciements

La recherche exige non seulement une bonne compréhension théorique des phénomènes

biologiques mais aussi une bonne maîtrise des techniques expérimentales, de coutume transmises par les

professionnels de recherche et étudiants expérimentés. De ce fait, je souhaite remercier Jessina Chrétien et

Laurie Martineau de leur contribution à ma formation au sein de notre équipe. Avoisinant notre laboratoire,

plusieurs membres de l’équipe du Dr Jacques Tremblay, lui-même inclus, furent très accueillants et disposés à

répondre à mes nombreuses questions. Plus précisément, merci à Joël Rousseau, Cathy Gerard, Dominique

Ouellet et Pierre Chapdelaine, ce dernier soumis aux plus audacieuses de toutes mes questions.

Je me dois de souligner l’extrême patience et l’encouragement apporté par ma famille, pour qui j’ai

été absent et préoccupé lors de cette entreprise un peu plus que je ne l’aurais aimé.

Ces travaux de maîtrise sont l’accomplissement d’une idée mignardée par le Dr Jack Puymirat depuis

10 ans déjà, que plusieurs caractérisaient de futile à l’époque. Grand visionnaire, il a mon respect et mon

admiration pour son travail acharné qui lui a permis d’amener un oligonucléotide antisens en phase clinique I

pour le traitement de la dystrophie myotonique de type 1. Je tiens à le remercier pour la confiance accordée à

mon égard, pour la flexibilité dont il a fait preuve ainsi que pour son soutien dans l’accomplissement de cette

maîtrise.

Finalement, je désire dire un gros merci à toute l’équipe chez Isis Parmaceuticals pour leur travail

remarquable en vue de développer des nouveaux traitements pour de nombreuses pathologies ainsi pour que

pour le soutien financier et matériel apporté à cette étude.

XVII

Avant-propos

Constrained Ethyl Modified Antisense Compound is a Promising Tool for Gene Silencing Following

Systemic Antisense Treatment in Myotonic Dystrophy type 1

Cet article, dont je suis le premier auteur, sera soumis pour publication sous peu. J’ai conçu toutes

les figures de l’article et effectué sa rédaction sous la direction du Dr Puymirat. Ma contribution dans la section

in vitro fut les expériences d’hybridation in situ par fluorescence combinées aux immunocytofluoresces pour la

détermination d’efficacité des ASO dans les cellules, pour la redistribution de MBNL1 et pour le compte des

foci; les Northern blot; l’analyse des résultats des puces à ADN et l’analyse des résultats des évènements

d’épissage alternatif dont la plateforme de Benoit Chabot a généré les résultats bruts. Laurie Martineau a

effectué la totalité des expériences d’apoptose/nécrose in vitro ainsi que la vérification de la correction de

l’épissage de LDB3. Étant donné la taille des expériences in vivo, Jessina Chrétien, Laurie Martineau et moi

avons effectué conjointement les injections des souris, les tests de forces, la récolte de leurs tissus et

organes, les extractions d’ARN, les transcriptions réverses et les RT-qPCR. J’ai effectué les analyses des

résultats des puces d’ADN des souris traitées et Jessina a fait les immunohistofluoresces suivies des comptes

des types de fibres musculaires. Guillaume Bassez et Lucile Revillod furent responsables des FISH sur les

coupes de tissus, des comptes de foci sur celles-ci ainsi que de l’analyse de leurs résultats. Geneviève

Gourdon et Aline Lachon ont généré la lignée de souris DMSXL et ont fourni plusieurs des sujets d’étude.

Chez Isis Pharmaceuticals, Sanjay Pandey, Robert McLeod et Frank Bennett ont fait le triage initial des 3000

ASO et nous ont fourni les plus efficaces. Ils furent responsables de leur synthèse ainsi que de la sélection

des séquences et des chimies utilisées.

1

Introduction

1. La dystrophie myotonique de Steinert

1.1 Historique de la pathologie

En 1876, la première maladie avec myotonie fut décrite par le Dr Julius Thomsen, par sa propre

expérience et celle de sa famille avec la myotonia congenita1. Plus tard connu sous le nom de Thomsen’s

myotonia congenita, cette maladie génétique héréditaire cause de la myotonie et de l’hypertrophie musculaire,

sans toutefois être une condition progressive. La myotonie est un retard à la relaxation musculaire après

contraction, ce qui empêche le relâchement d’objets chez les personnes affectées2. Toutefois, cette condition

n’est pas une dystrophie, car aucune faiblesse musculaire n’y est associée. À la suite de la publication de la

maladie de Thomsen, une série de cas atypiques sont apparus, une myotonia congenita avec atrophie

musculaire. Deux publications en 1909, une par Steinert et l’autre par Batten et Gibb, sont les premières où

l’on associe clairement la dystrophie myotonique à une pathologie en elle-même. Étant donné la description

détaillée des travaux de Steinert sur un total de 9 patients atteint de la maladie,

on la surnomma la maladie de Steinert dans l’Europe continentale pendant un

temps, pour ensuite observer une prévalence à la dénomination : dystrophie

myotonique ou dystrophia myotonica. Le médecin allemand (Figure 13) y faisait

la description d’une condition beaucoup plus sévère et dégénérative dont les

principales caractéristiques étaient l’atrophie et la faiblesse musculaire, une

faiblesse faciale, la ptôse palpébrale et une atrophie sélective du sterno-cléido-

mastoïdien à travers les muscles du cou. Il remarqua aussi une atrophie

testiculaire chez 4 de ses patients, la première anormalité documentée à

l’extérieur du système nerveux. Grâce à l’étude approfondie d’un cas

d’autopsie, Steinert observa une fibrose extensive, des changements dégénératifs dans plusieurs muscles

squelettiques ainsi qu’une atrophie des fuseaux musculaires. Le prochain apport à la DM provient de

Greenfield en 1911 qui, par l’étude d’une famille de 13 enfants, dont 5 atteints, découvre que 3 parmi eux sont

infligés de cataractes. L’année suivante, Curschmann avance que les cataractes et la présence d’atrophie

testiculaire seraient indicatives d’un problème endocrinien généralisé et que la DM devrait dorénavant être

classifiée comme un désordre systémique généralisé. En 1918, de par l’historique médical des familles de 35

patients atteints de la DM et de cataractes, Fleischer a pu observer la récurrence des cas de cataractes et

ainsi confirmer la nature héréditaire de la DM. Il est aussi le premier à suggérer le phénomène d’anticipation

de la DM, soit la nature amplificatrice de la pathologie dans les générations subséquentes. Ce n’est qu’en

1948 que Bell et Thomasen effectuèrent des études systématiques auprès des familles d’individus affectés.

Figure 1 - Hans Steinert

(1875-1911)

2

L’étude de 6 enfants présentant un historique de symptômes datant d’aussi loin que la naissance mena Vanier

en 1960 à suggérer que certains des symptômes apparaîtraient in utero. De plus, il observe que leur condition

pathologique ne progresse pas très rapidement: il vient d’identifier la forme congénitale de la maladie. La

découverte du locus du gène causant la DM1 en 1971 fut le premier pas vers le décèlement de l’anomalie

responsable de la condition1. Ce n’est qu’en 1992, par l’identification simultanée de plusieurs équipes, que l’on

met la main sur la mutation causant la DM1, la présence d’une instabilité dans la répétition d’un trinucléotide

CTG à l’extrémité 3’ non-codante du gène de la DMPK4,5. En bref, la fin du 20e siècle fut une période

extrêmement précieuse quant à la caractérisation clinique de la maladie ainsi qu'à la découverte de sa base

moléculaire.

1.2. Signes et symptômes

La DM est plus fréquente forme de dystrophies musculaires retrouvées chez l’adulte. La prévalence

moyenne de la maladie à travers le monde, sans compter les régions à haute concentration, est de 1/10 0001.

Toutefois, certaines régions isolées pâtissent d’un héritage génétique qui augmente l’incidence des maladies

génétiques. C’est le cas de Charlevoix et du Saguenay-Lac-Saint-Jean, situés dans le nord-est du Québec, où

un effet fondateur a résulté à une prévalence unique de 1/5506. La DM1 est une maladie autosomale

dominante, ce qui implique qu’un parent atteint sur l’un de ses deux allèles aura 50% de chance de

transmettre le gène de la DMPK étendu, et ce pour chaque enfant, quel que soit le sexe. Comme pour toutes

maladies à répétition de trinucléotides, le nombre de répétitions corrèle négativement avec l’âge du début des

symptômes et positivement avec la sévérité de la maladie7.

La DM1 est un désordre multisystémique affectant les muscles squelettiques, la fonction des muscles

lisses, le système cardiorespiratoire, digestif, endocrinien, les yeux, le squelette, la peau, et le système

nerveux central1. En fonction de l’âge d’apparition des premières manifestations, la maladie peut être

classifiée d’un point de vue clinique en cinq formes: tardive, de l’adulte, de l’adulte jeune, infantile et

congénitale.

1.2.1. Forme tardive

Les premiers symptômes apparaissent après 40 ans et la plupart du temps, les signes cliniques se

limitent à des cataractes sous-capsulaires postérieures, une calvitie prématurée, de la myotonie et la

possibilité de problèmes de conduction cardiaque8. Néanmoins, une étude sur 37 patients atteints avec un âge

moyen de 55 ans révèle que 56% des individus étaient asymptomatiques9.

3

1.2.2. Forme adulte

Lorsqu’un individu est atteint de la forme adulte ou classique, on retrouve chez cette personne de 50

à 1000 répétitions CTG. Forme la plus fréquemment rencontrée, ces symptômes surgissent entre 20 à 40 ans

et réduisent la longévité entre 48 à 60 ans. L’atteinte musculaire est caractérisée par une faiblesse distale, un

facies myopathique avec ptôse palpébrale et la myotonie. Parmi les autres signes de la maladie, on retrouve

des manifestations gastro-intestinales, cardiaques, pulmonaires, endocriniennes, de la fatigue, de l’apathie, un

manque d’initiative ainsi que de la somnolence de jour. Les blocages de conduction et la tachyarythmie

pourraient être responsables de 30% des cas de mortalité, le danger majeur de la DM110. Ces symptômes

affectent sérieusement la qualité de vie des patients ainsi que celle de leur famille8. La forme adulte précoce

se différencie seulement par une apparition des symptômes entre 10 à 20 ans.

1.2.3. Forme infantile

La forme infantile débute entre 1 mois et 10 ans et se caractérise par un nombre de répétitions en

général plus important que dans les formes adultes. Il est habituellement possible de diagnostiquer cette

forme par l’existence de faiblesses musculaires touchant le visage, de la myotonie et des problèmes cognitifs8.

Parmi ceux-ci, on retrouve le déficit d’attention, l’hyperactivité, des désordres d’anxiété ainsi que des

problèmes d’apprentissage associés au retard mental11. L’évolution naturelle et progressive de la maladie

mène éventuellement vers les symptômes de la forme adulte.

1.2.4. Forme congénitale

Cette forme apparaît à la naissance et correspond à la présence de plus de 1500 répétitions CTG.

Elle se caractérise par de l’hypotonie, de la faiblesse faciale, des troubles de déglutition, des problèmes

respiratoires et est associée à un taux élevé de mortalité néonatale, 16% comparativement à 1,9% dans la

population. Lors de la grossesse, elle peut être soupçonnée par une réduction des mouvements fœtaux et la

présence de polyhydramnios, ce dernier causé par une difficulté de déglutition du fœtus. Quand les enfants

survivent, ils sont affligés d’un retard moteur et mental1. Les études cliniques ont établi que dans la majorité

des cas, la mutation responsable de la CDM1 provient de la mère. La raison de cette préférence n’est pas

connue, mais on sait qu’elle n’est pas prérogative, car il y a quelques cas répertoriés de CDM1 transmise par

le père12,13.

4

1.3. L’anomalie génétique

Vers les années 1950, des analyses génétiques quantitatives14,15 ainsi que des études familiales

systématiques16,17 n’ont fait que confirmer ce que l’on savait déjà comme étant un fait, l’origine génétique de la

DM1. Il a fallu près de 40 ans à partir du premier indice de corrélation génétique entre la DM1 et les groupes

sanguins Luthérien jusqu’à l’identification de la mutation responsable de la maladie sur le chromosome

19q13.31 (Figure 2). C’est en 1992 que le travail se termina lorsque 3 équipes mirent au grand jour la

séquence d’ADN complète du gène de la DMPK, comportant une séquence variable de trinucléotides CTG

située dans la section 3’ non-codante du gène4,5,18. Dans les populations normales, le nombre de répétitions

CTG dans le gène de la DMPK varie entre 5 à 37 dans les cellules sanguines, un polymorphisme à l’égard du

nombre de répétitions. Par contre, lorsque ce nombre est de 38 à 49, on se trouve dans la zone des

prémutations, ce qui implique que les générations futures auront possiblement plus de répétitions que la

précédente. Malheureusement, ce phénomène induira des symptômes de la DM1 lorsque ce nombre dépasse

49.

Figure 2 - Locus du gène de la DM1

Le panneau de gauche situe le locus du gène de la DM1 sur une représentation schématique du chromosome 19. Le panneau de

droite indique les gènes adjacents et les sondes utilisées pour localiser le locus du gène de la DM1. Illustration tirée de 19.

5

1.4. Diagnostic

Le diagnostic de la maladie repose essentiellement sur la notion d’hérédité et sur les signes cliniques.

Dans les cas douteux, le diagnostic repose sur le test génétique qui a supplanté la caractérisation des

biopsies musculaires (Tableau I).

Tableau I - Histologie musculaire dans la dystrophie myotonique de type 1

Caractéristiques principales:

Augmentation du nombre de noyaux centralisés

Variation dans la taille des fibres musculaires

Chaînes de noyaux

Fibres musculaires annelées

Masses sarcoplasmiques

Atrophie des fibres de type 1

Fuseaux musculaires : augmentation de la division des fibres

Caractéristiques secondaires :

Petites fibres angulaires

Fibres d’apparence « mitée »

Hypertrophie des fibres de types 2

Augmentation de la fibrose

Le diagnostic moléculaire est effectué sur un prélèvement d’ADN du patient en provenance du sang,

d’amniocytes ou de villosités choriales. La détection de la présence d’un allèle étendu du gène de la DMPK se

fait par PCR pour les allèles sous 300 répétitions CTG. Dans les cas où leur taille est supérieure,

l’amplification PCR sera impossible et aucun signal ne sera détecté. Le diagnostic est alors effectué par le

Southern Blot sur de l’ADNg digéré, ce qui permet de déterminer toutes les tailles d’allèles DM1, soit de 5 à

4000 CTG.

6

1.5. Mécanisme moléculaire

1.5.1. Physiopathologie de la maladie

1.5.1.1. Instabilité des répétitions à trinucléotides

De nombreuses maladies neurodégénératives et neuromusculaires sont causées par l’expansion de

répétitions de trinucléotides (TNR) située dans différentes régions des gènes (Figure 3). Cependant, on doit se

demander comment un sujet normal transmet une incidence de DM1 ou un statut prémutatif par l’expansion

des répétitions à ses enfants. Chez la levure comme chez l’homme, il fut démontré que les répétitions

expansibles sont stabilisées par l’occurrence d’interruption à l’intérieur de la séquence répétée en prévenant la

formation des brins glissés (Figure 4b). Pour l’instant, la théorie la plus probable est la perte de ces

interruptions stabilisantes retrouvées à travers les répétitions20. L’instabilité résultante serait responsable de

l’augmentation du nombre de répétitions lors de la transmission intergénérationnelle. Par conséquent, d’une

génération à une autre, on constate un début de plus en plus précoce des prodromes et une sévérité accrue

de la maladie, c’est le phénomène d’anticipation.

Figure 3 - Localisation des répétitions expansibles causant des pathologies

Séquence et localisation des répétitions expansibles causant des maladies humaines sur les différentes parties d’un gène générique.

BPES, blépharophimosis épicanthus inverse et ptôsis; CCD, dysplasie cléidocrânienne; CCHS, syndrome d’hypoventilation

congénitale; DM, dystrophie myotonique; DRPLA, l'atrophie dentatorubro-pallidoluysienne; EPM1, épilepsie myoclonique progressive

1; FRAXA, syndrome de l'X fragile; FRAXE, retard mental lié à l'X fragile associé au site FRAXE; FRDA, ataxie de Friedreich; FXTAS,

syndrome du tremblement et d’ataxie de l’X fragile; HD, maladie d’Huntington; HDL2, maladie de Huntington de type 2; HFG, syndrome

main-pied-génital; HPE5, holoprosencéphalie 5; ISSX, syndrome infantile des spasmes liés à l’X; MRGH, retard mental avec déficit en

hormone de croissance; OPMD, dystrophie musculaire oculopharyngée; SBMA, atrophie musculaire spinale et bulbaire; SCA, ataxie

spinocérébelleuse; SPD, synpolydactylie. Illustration tirée de 20.

7

Afin de mieux comprendre l’instabilité des répétitions dans la DM1, on a cherché comprendre la

dynamique de transmission parentale des répétitions à travers les cellules germinales. Des analyses de SP-

PCR sur des échantillons de sperme de patients atteints de la forme DM1 adulte ou prémutatif ont démontré la

présence d’allèles étendus très hétérogènes quant à leur nombre de répétitions et une fréquence de mutation

de près de 1 par gamète21. Du côté des gamètes femelles, les études démontrent une augmentation de la

longueur des répétitions 10 fois plus élevée dans les oocytes que dans les spermatozoïdes d’individus atteints

de la DM1 et ce, avec des allèles étendus de taille correspondante. C’est très probablement ce qui explique

que la majorité des incidences de CDM1 ont un héritage maternel22. La différence d’instabilité dynamique des

TNR de la DM1 entre les cellules germinales des mâles et des femelles n’est pas gouvernée uniquement par

la longueur des répétitions, mais serait influencée par des facteurs spécifiques au sexe23.

Au cours du développement, les allèles étendus de la DM1 sont victimes d’une instabilité somatique

qui n’est pas uniforme dans tous les tissus24-26. Ce mosaïcisme somatique dirigé vers l’expansion des

répétitions progresse durant la vie d’un individu21,27,28. Les expansions retrouvées dans les muscles

squelettiques21,25,26 et dans le cœur24 sont de 2 à 13 fois plus grandes que ceux des lymphocytes du sang

périphérique79, et les plus petites sont situées dans le cortex frontal et le thalamus24. Par conséquent, un

diagnostic effectué à partir d’un échantillon de sang pourrait mal refléter la concordance avec la nature et la

sévérité des symptômes éprouvés par les patients29. Au sein d’un même tissu, on retrouve aussi une

hétérogénéité des expansions des allèles étendus de la DM1, visible comme une bande diffuse ou une trace

par analyse Southern Blot ou une bande pâle par SP-PCR21,27. De plus, les études longitudinales attestent de

la relation entre la progression de l’hétérogénéité de la taille des allèles étendus vers expansions des CTG

avec le temps28. L’instabilité somatique serait par conséquent un processus continu à travers la vie avec un

biais vers l’expansion des répétitions23 et possiblement régulée différemment en fonction des tissus.

1.5.1.1.1. Mécanismes d’instabilité

La première théorie tentant d’expliquer la présence de répétitions expansibles fut celle du glissement

de l’ADN polymérase lors de la réplication de l’ADN30. Néanmoins, l’aire du séquençage à haut débit a remis

cette explication en doute, car cette théorie n’expliquait pas pourquoi une petite proportion des répétitions

dans le génome sont susceptibles à une expansion quand ce dernier est composé de 7,6% de répétitions en

tandem31. Plusieurs modèles suggèrent des mécanismes expliquant la modification du nombre de répétitions

dans la DM1 lors de la réplication de l’ADN, de la transcription, de la réparation, de la recombinaison, par des

facteurs épigénétiques, et ce, souvent par la présence de structures intrinsèques aux TNR. Par exemple, les

(CTG)n•(CAG)n successifs produisent des ânonnements de l’ADN polymérase menant à la formation d’épingle

(Figure 4a) in vitro32,33 et in vivo34 , ce qui mène à une instabilité de la longueur des TNR (contraction ou

8

expansion) lors des processus cellulaires. Les épingles de TNR peuvent aussi être formées durant la

transcription35 et lors de la réparation de l’ADN36 , ce qui entraîne la formation de structure de brins glissés37

(Figure 4b). Par conséquent, dès que l’on à la présence d’épingles sur les répétitions, il est possible qu’elles

résultent en la modification de leur nombre lors de la réplication de l’ADN.

Figure 4 - Structures formées par les TNR dans la DM1

a. Malgré la complémentarité imparfaite des paires de bases de Watson-Crick, les répétitions expansibles (CTG)n•(CAG)n permettent

la formation de structures en forme d’épingle dans la DM1. b. Le glissement des brins peut entraîner la formation de structure de brins

glissés dans les régions de répétitions. Illustration adaptée de 20.

1.5.1.2. L’haploinsuffisance de la DMPK

L’incapacité de trouver une explication unique quant à la cause des symptômes cliniques observés

dans la DM1 guide l’opinion scientifique vers la possibilité de causes multiples. Les indices pointent vers les

effets combinés d’une haploinsuffisance de la DMPK, de l’altération de l’expression des gènes adjacents et

d’un effet pathogène des expansions CUG de l’ARNm de la DMPK. Néanmoins, on observe un consensus

quant à la cause principale des symptômes de la maladie génétique en lien avec un gain de fonction toxique

des transcrits des allèles étendus de la DMPK, causant une dérégulation de l’épissage alternatif. Les autres

éléments responsables n’auraient que des rôles mineurs dans certains aspects de la maladie.

Suite à la découverte de la mutation de la DM1, on démontra que les niveaux d’ARNm et de protéine

de la DMPK étaient diminués dans les biopsies musculaires de patients atteints de la DM1 adulte38. Ceci

donna naissance à l’hypothèse d’haploinsuffisance, où une carence en DMPK induirait les effets attribués à la

9

pathologie. Toutefois, l’arrivée des modèles de souris est venue ébranler cette théorie. Les souris déficientes

en DMPK ne démontraient pas les caractéristiques multisystémiques typiques de la DM1 et ne développaient

qu’une myopathie tardive modérée39,40 et des défauts de conduction cardiaque41. Aucune myotonie de la part

de ces souris, trait généralement associé à la maladie112. Quant à la surexpression de la DMPK par des souris

transgéniques, elle provoque une cardiomyopathie hypertrophique avec disrythmie, une myopathie

myotonique et de l’hypotension, traits associés à l’atteinte musculaire de la DM139,42. La combinaison des

effets de la modulation du niveau de la DMPK indique qu’elle peut contribuer à l’atteinte cardiaque et

musculaire de la maladie, mais l’haploinsuffisance à elle-même n’explique pas la totalité des symptômes de la

DM143.

Le gène de la DMPK humaine et de la souris est très conservé44 et est constitué de 15 exons, dont

les répétitions CTG se situent dans le dernier exon45 (Figure 5a). La protéine possède une taille théorique de

60 et 70 kDa pour les deux classes d’isoformes (Figure 5b) selon des travaux effectués sur de l’ADN

complémentaire46. Toutefois, une seule isoforme fut clairement identifiée dans les tissus humains par un

assortiment d’anticorps monoclonaux de souris et donne une taille réelle de 80 kDa47, augmentation causée

par des modifications post-traductionnelles. L’épissage alternatif du transcrit primaire d’ARNm donne

naissance à 6 isoformes majeures, désignées DMPK A à F46, et dont la spécificité des substrats dépend du

type cellulaire et de leur localisation48. La présence d’une longue queue C-terminal permet l’ancrage de la

DMPK dans la membrane externe mitochondriale ou dans la membrane du réticulum endoplasmique48,49

tandis que son absence chez les isoformes E et F induit une localisation cytosolique92. La DMPK fait partie de

la famille des protéines kinases de classe AGC incluant un total de 60 protéines classées en 21 sous-familles.

C’est une protéine kinase activée par Rho (ROCK) comme la kinase citron interagissant avec Rho (CRIK) et la

kinase liant CDC42 en lien avec une kinase impliquée dans la dystrophie myotonique (MRCKα/β/γ). Son rôle

exact n’est toujours pas élucidé, mais on sait que ceux des protéines ROCK sont le contrôle de la morphologie

et de la motilité cellulaire par le cytosquelette50. De par son domaine sérine/thréonine kinase (EC 2.7.11.1), on

sait que la DMPK phosphoryle in vitro la sous-unité β de la dihydropyridine (DHPR)51, la phosphatase à

myosine ciblant la sous-unité (MYPT1)52, la phospholemman (PLM) et la phospholamban (PLN)53. Outre le

cerveau où l’apparition est plus tardive, l’ARNm de la DMPK est présent dans tous les types cellulaires

d’origine myogénique à partir des phases de différentiation initiale chez la souris39.

10

Figure 5 - Gène de la DMPK, sites d'épissage alternatif et domaines structuraux

a. Schéma du gène de la DMPK et de ses 15 exons. Les boîtes blanches représentent les exons, la boîte lignée les répétitions CTG,

les lignes noires les introns et les boîtes noires les exons activement épissés. b. Les séquences communes aux isoformes de la DMPK

sont le domaine N-terminal, le domaine sérine/thréonine kinase, le domaine C-terminal protéine kinase et le domaine d’hélices

enroulées. Les domaines variables sont le motif VSGGG et le domaine C-terminal. Illustration tirée de 43.

1.5.1.3. Haploinsuffisance des gènes adjacents à la DMPK

La structure condensée de la chromatine dans la région du gène de la DMPK fut soupçonnée

d’influencer l’expression des gènes adjacents, soit DMWD en amont et SIX5 en aval. Il fut remarqué que la

présence des répétions CTG augmente l’efficacité de formation des nucléosomes et que leur présence

pourrait réprimer la transcription dans cette région54. De plus, l’allèle étendu de la DMPK offre une résistance à

la DNase I et une inaccessibilité aux nucléases ce qui confirmerait la présence d’une chromatine condensée55.

Ceci dit, l’examen des niveaux d’expression de DMWD en lien avec la présence des répétitions donne des

résultats contradictoires, car on observa sa baisse56,57 ainsi qu’aucun effet58,59. Le cas de SIX5 est beaucoup

plus clair avec une diminution de 20-60% de son expression dans la DM156,58-60 corrélant avec l’augmentation

du nombre de répétitions57. De plus, les répétitions CTG se retrouvent dans la région promotrice du gène

SIX5, ce pourrait expliquer la diminution de sa transcription dans la DM1 si la chromatine de cette région est

anormalement condensée. Chez la drosophile, ce gène code pour un facteur de transcription critique au

développement musculaire, oculaire et testiculaire61. Un phénotype particulier chez les souris SIX5+/- est le

développent des cataractes62,63, ce qui pourrait indiquer une légère contribution de SIX5 au phénotype de la

DM1. Cependant, cette implication fut remise en question quelques années plus tard, lorsque le knockout de

11

MBNL1 chez la souris (MBNL1ΔE3/ΔE3), protéine à disponibilité réduite dans la DM1, développa des cataractes

sans affecter les niveaux de SIX564.

1.5.1.4. Toxicité de l’ARNm : modulation de facteurs d’épissage

L’anomalie quant au nombre de répétitions a mené les chercheurs à vérifier si la présence elle-même

des CUG sur l’ARNm a une implication dans la DM1. L’hybridation d’une sonde fluorescente (CTG)5 sur

l’ARNm a démontré que celui-ci est bel et bien transcrit, mais qu’il est séquestré et s’accumule au sein du

noyau sous la forme de foci65. Cette hypothèse fut testée chez la souris HSRLR, modèle comprenant 250

répétitions CTG dans la région 5’ non traduite du gène humain squelettique de l’α-actine. Le résultat fut très

encourageant, car ces souris ont développé des inclusions ribonucléaires, la myotonie, une myopathie et des

caractéristiques histologiques similaires à ceux de la DM166. Ceci démontra que l’unique présence de longues

répétitions CUG est suffisante pour induire des symptômes propres à la DM1. Par la suite, les modèles de

souris issus de la lignée DM300 (320 CTG) ont démontré le phénotype obtenu par l’incorporation d’une région

du locus humain comprenant la DMPK ainsi que les gènes adjacents, pour un total de 45 kilobases. Cette

lignée témoigne de l’instabilité des répétitions biaisées vers l’expansion, similaire à celle observée chez les

patients DM1, et a donné naissance par instabilité intergénérationnelle à des lignées contenant des allèles

étendus plus grands, comme la DMSXL avec plus de 1000 CTG. Par contre, pour une raison inconnue dans

ce modèle de souris, on observe seulement les symptômes d’une DM1 légère à l’égard de la myotonie, d’une

faiblesse musculaire et d’anomalies musculaires histologiques dans les souris âgées67. Il existe deux autres

modèles de souris transgéniques inductibles à l’expression de 960 répétitions CUG dans la région 3’ non

traduite de la DMPK qui récapitule les symptômes de la DM168,69.

Un élément qui nous a apporté une piste quant au mécanisme causal des symptômes par les

répétitions est la découverte en 1998 d’une seconde forme de DM, la dystrophie myotonique de type 2

(DM2)70. Cette variante de la maladie est causée par la répétition d’un tétranucléotide CCTG dans le gène de

la protéine 9 à doigt de zinc (ZNF9) et cause des symptômes similaires à la DM1, sauf pour l’absence d’une

forme congénitale71. La ressemblance entre ces deux pathologies et la différence des gènes impliqués

préconise un mécanisme pathologique commun, un gain de fonction toxique de l’ARNm. La présence d’une

répétition de plus de 11 CUG favorise la formation d’une structure secondaire en forme d’épingle sur l’ARNm

où les C-G sont séparés par des mésappariements de U-U72. Ces épingles d’ARNm double brin seraient

ensuite capable de liées des protéines nucléaires, séquestrant ainsi les deux parties à l’intérieur du noyau. La

soustraction de ces protéines aux mécanismes cellulaires sous un niveau critique induirait les symptômes de

la DM1. Les protéines les mieux caractérisées quant à leur implication dans la DM1 sont la protéine 1 liant les

CUG (CUGBP1) et les membres de la famille « muscleblind » (MBNL). La protéine ribonucléaire H hétérogène

12

(hnRNP H) est aussi capable de lier les répétitions lorsqu’en présence d’une branche d’épissage distale aux

répétitions, et l’abolition de son expression par ARNi règle le problème de rétention nucléaire de l’ARNm de la

DMPK73,74. On a aussi identifié des facteurs de transcription se liant aux transcrits de la DMPK étendue et par

le fait même séquestrés, qui affecte les patrons d’expression génique75. L’étau se referme sur le

fonctionnement d’un mécanisme pathologique très complexe et sa compréhension donnera certainement des

indices sur celui des autres maladies à répétitions.

1.5.1.4.1. Séquestration de MBNL

La famille des protéines MBNL (MBNL1/2/3) fut initialement identifiée grâce à leur capacité de lier les

répétitions CUG76 et est maintenant reconnue comme étant des régulateurs d’épissage alternatif. Les trois

protéines furent détectées comme colocalisant avec les foci nucléaires d’ARNm étendu de la DMPK77 et cette

localisation diminue radicalement leur abondance dans le nucléoplasme78, suggérant un mécanisme

pathologique par séquestration protéique. Un modèle de souris sans le domaine de liaison à l’ARN (exon 3) de

MBNL1 fut généré (MBNL1ΔE3/ΔE3) afin de déterminer l’implication de MBNL1 dans la DM1. Ces souris ont

développé des traits caractéristiques de la DM1, comme les anomalies d’épissage, de la myotonie et des

cataractes64. À l’inverse, la surexpression de MBNL1 par virus adénoassocié (AAV) dans les muscles

squelettiques de souris HSALR corrige la myotonie ainsi que les erreurs d’épissage alternatif79,80. Durant le

développement normal des muscles squelettiques, MBNL1 passe d’une localisation cytoplasmique à

majoritairement nucléaire81. Il est donc suggéré que plusieurs des symptômes de la DM1 pourraient être

causés par la séquestration de MBNL1 qui inverserait certains patrons d’épissage à ceux de leur

correspondance embryonnaire82. Par exemple, l’épissage de la forme embryonnaire du canal chlore 1 voltage-

dépendant (CLCN1) induit l’inclusion de l’exon 11 détecté dans la DM1. La présence de cet exon génère un

codon-stop prématuré résultant à la sous-expression de la protéine CLCN1, qui fut démontrée comme étant la

cause de la myotonie83,84. D’ailleurs, le traitement des souris HSALR par des morpholinos oligonucléotides

antisens ciblant un site d’épissage sur l’ARNm de CLCN1 rétablit l’expression normale de la protéine et

élimine les décharges myotoniques85. On observe aussi dans la DM1 un épissage anormal du récepteur à

insuline (INSR), où l’absence de l’exon 11 diminue l’activité de signalisation tyrosine kinase86, produisant ainsi

la résistance à l’insuline observée chez les patients87. La surexpression de MBNL1 dans des myoblastes DM1

fut démontrée comme suffisant pour corriger cette erreur d’épissage88. La troponine T cardiaque (TNNT2)

subit aussi un défaut d’épissage, où l’augmentation de l’inclusion de l’exon 5 pourrait contribuer aux

problèmes de conduction cardiaque89. Comme le témoignent ces résultats, on commence à établir une

corrélation entre les erreurs d’épissage alternatif causé par la séquestration de MBNL1 et les symptômes de la

DM1. Par contre, ce modèle n’explique pas encore perte de masse musculaire associée à la DM1 qui est

d’ailleurs absente chez les souris MBNL1ΔE3/ΔE364.

13

1.5.1.4.2. Élévation des niveaux de la protéine CUGBP1

CUGBP1 fut la première protéine à capter l’attention des chercheurs dans la DM1 pour sa capacité à

lier les CUG et les CCUG simple brin in vitro90. On a subséquemment découvert qu’elle ne se lie pas aux

répétitions doubles brins en plus de ne pas colocaliser avec les foci d’ARNm de la DMPK91,92. Elle a toutefois

été étudiée avec intérêt pour son niveau basal plus élevé dans les muscles89 et dans le cœur93 DM1. Les

souris transgéniques surexprimant des répétitions dans la section 3’ non traduite du gène de la DMPK ont

démontré que l’expression du transcrit muté est suffisant pour faire augmenter le niveau d’expression de

CUGBP169. Lorsque surexprimé dans les muscles et le cœur de souris, CUGPB1 provoque des erreurs

d’épissage et une mortalité néonatale94, supportant la théorie selon laquelle CUGBP1 contribuerait aux erreurs

d’épissage observées dans la DM1. Un phénotype cardiaque de la DM1 est observé dans un autre modèle de

souris lors d’une surexpression de CUGBP1 dans le cœur, en lien avec des changements fonctionnels,

moléculaires et histopathologies décrits dans les modèles de souris DM195. CUGBP1 est l’une des six

protéines de la famille des CUGBP ressemblant à Elav (CELF) dont le rôle familial est la régulation de

plusieurs processus post-transcriptionnels, comme l’épissage alternatif, l’initiation de la transcription et la

stabilisation de l’ARNm96-98. À partir de l’identification d’évènements d’épissage alternatif dans le cœur de

souris par puce d’ADN, MBNL1 et CUGBP1 furent identifiés comme des régulateurs transcriptionnels

dépendant du développement dans 24 cas d’épissage. Certains des évènements étaient modulés uniquement

par MBNL1 (5) ou par CUGBP1 (13), et tous ceux régulés par les deux protéines (6) le sont de façon

antagoniste99, comme en témoigne l’épissage de CLCN183, INSR87 et TNNT289. Durant le développement, le

niveau de MBNL1 augmente tandis que celui de CUGBP1 diminue81, ce qui supporte l’hypothèse selon

laquelle le niveau et la localisation de ceux-ci contrôle la transition de l’épissage fœtal vers adulte, situation

qui se trouve anormalement inversée dans la DM182 (Figure 6). L’implication de CUGBP1 dans la DM1 fut

associée à son rôle de substrat de la protéine kinase C (PKC), dont l’hyperphosphorylation et la stabilisation

sont dépendantes de PKC activée. L’activation de PKC par un mécanisme inconnu produirait l’augmentation

du niveau basal de CUGBP1, comme dans l’état embryonnaire100.

En résumé, le mécanisme pathologique privilégié pour la DM1 (Figure 7) est que la présence

d’épingles de répétitions CUG séquestre MBNL1, ainsi diminuant sont niveau sous un seuil fonctionnel. Par

conséquent, MBNL1 ne peut générer le patron d’expression adulte pour certains gènes. En même temps, un

mécanisme inconnu non relié à la diminution de MBNL1 produirait l’augmentation de PKC activée. À son tour,

PKC activée augmenterait le niveau basal de CUGBP1, responsable du patron embryonnaire de certains

gènes causant ainsi la résistance à l’insuline et la myotonie. Étant donné la complexité de l’épissage alternatif

combiné à la contribution de l’haploinsuffisance de la DMPK, il est probable que bien des années passeront

avant une compréhension complète des causes des symptômes de la DM1.

14

Figure 6 - Collaboration entre MBNL1 et CUGBP1 dans le contrôle de l'épissage alternatif durant le développement

La transition entre les isoformes d’épissage alternatif embryonnaire à ceux adultes implique une expression différentielle de MBNL1 et

de CUGBP1. Séquestré dans la DM1, MBNL1 ne peut favoriser l’isoforme adulte et l’on se retrouve avec des patrons d’épissages

embryonnaires causés par l’augmentation des niveaux basaux de CUGBP1 phosphorylée. Illustration tirée de 82.

Figure 7 - Perte de fonction de MBNL1 et gain de fonction de CUGBP1

La séquestration de MBNL1 par une épingle formée de répétitions CUG diminue son niveau basal dans le noyau. Par un mécanisme

inconnu, PKC est activée et phosphoryle CUGBP1 tout en augmentant son niveau de base. MBNL1 et CUGBP1 donnent ensuite

naissance à une modification de l’épissage alternatif ainsi que des effets sur la traduction et la dégradation de l’ARN. Illustration tirée

de 82.

15

2. Outils moléculaires pour une thérapie génique

2.1. Stratégies thérapeutiques pour la DM1

La compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation biologique donne

espoir à la correction des défauts génétiques. À cette fin, la créativité de l’homme a donné naissance à

plusieurs stratégies de traitements pour la DM1 basées sur la neutralisation/élimination des ARN toxiques. La

toxicité provoquée par l’ARNm de l’allèle étendu de la DMPK a naturellement guidé la recherche vers une

façon neutraliser et/ou de dégrader cet ARN, comme le témoigne les publications sur l’utilisation des

oligonucléotides antisens (ASO), des petits ARN interférant (siRNA) et des ribozymes à tête de marteau

autosectionnant. Par contre, deux stratégies principales sont présentement préférées: la première repose sur

l’utilisation d’oligonucléotides antisens (ASO) qui se fixent sur les répétitions ainsi prévenant la liaison de

protéines; la deuxième sur l’utilisation d’ASO qui se fixent sur l’ARN muté et induisent la dégradation des ARN

toxiques.

2.1.1. Élimination des ARN toxiques

La destruction de l’ARN de la DMPK est visiblement l’approche la plus directe employée afin de

tenter d’éliminer les effets causés par la toxicité de l’ARN. Un essai initial par Furling et al. (2003) a démontré

que les ASO avaient le pouvoir de rétablir la fusion des myoblastes DM1 portant ~ 750 répétitions CTG ainsi

que de normaliser leur incorporation du glucose par la correction du niveau d’expression de CUGBP1. L’ARN

antisens était complémentaire aux (CUG)13 et exprimé dans les cellules par un vecteur rétroviral. Cette

technique aurait préférentiellement réduit le niveau de DMPK muté de 80% par rapport à 50% pour l’allèle

normal par un mécanisme non identifié101. La localisation exclusive de l’ARNm muté au niveau du noyau a

ensuite inspiré Langlois et al. (2003) à utiliser un ribozyme à tête de marteau, aussi séquestré dans le noyau,

afin d’essayer de cibler préférentiellement l’ARNm provenant de l’allèle muté. Cette technique a permis de

réduire le nombre de foci nucléaires associé à la maladie et à corriger l’expression de l’isoforme B du

récepteur d’insuline spécifique aux muscles, une erreur d’épissage caractéristique de la DM1102. Bien

qu’encourageant, l’utilisation des ribozymes est freinée par la difficulté de prédiction de leur repliement in

vivo103 et la complexité leur design à fait en sorte qu’ils ont été délaissés par d’autres technologies plus

simples et efficaces, comme les ASO et l’interférence à l’ARN (iARN).

L’iARN implique l’utilisation de petits ARN doubles brins sous la forme de siRNA (petits ARN

interférents) ou de shRNA (petits ARN en épingles). Une fois dans le cytoplasme, Dicer reconnaît ces petits

ARN et les coupent en fragments de 21-25 nucléotides de long. Dans les deux cas, les siRNA résultants sont

16

chargés sur le complexe RISC où ce dernier utilise le brin antisens du siRNA afin de reconnaître les ARNm

parfaitement complémentaires et de les couper grâce à l’activité catalytique d’argonaute 2 (AGO2). Dans le

cas d’une complémentarité imparfaite incluant toutefois la région cible (« seed region »), l’évènement donnera

naissance à une inhibition de la traduction104. Langlois et al. (2005) ont observé que l’expression de shRNA

par des lentivirus dans des myoblastes DM1 humains portant ~ 750 répétitions CTG résultent en une

diminution significative des niveaux d’ARNm de la DMPK provenant des deux allèles, y compris l’allèle muté

séquestré dans le noyau, ce qui a des implications pour le mécanisme de l’interférence à l’ARN que l’on

croyait agir seulement dans le cytoplasme105. Toutefois, l’approche des siRNA souffre d’une grande faiblesse,

la méthode de livraison in vivo. L’utilisation de vecteurs viraux ouvre la porte à plusieurs dangers dont la

mutagénèse d’insertion et à la dérégulation de l’expression génique104. L’administration systémique par voie

parentérale est impossible à cause de la dégradation rapide des siRNA dans le sang par les nucléases. De

plus, on ne peut pas compter sur des siRNA chimiquement modifiés, car le complexe RISC ne tolère que très

peu de modifications chimiques sur le brin antisens. La prise en charge rapides des siRNA par le complexe

RISC est donc essentielle à leur survie. La prise en charge des siRNA par le complexe RISC est très sensible

aux modifications chimiques nécessaires à la survie des siRNA dans le sang et est restreinte à une

administration locale ou jumeler à des substances favorisant leur livraison106.

En 2012, Lee et al. ont effectué la démonstration que l’utilisation d’ASO de chimie 2’-O-

méthoxyéthyle (MOE) et acides nucléiques barrés (LNA) en conformation gapmer dirigés contre les répétitions

CUG était capable de détruire environ 50% de l’ARN par un mécanisme dépendant de la RNase H

lorsqu’administré par électroporation musculaire. Leur modèle était des souris inductibles à l’expression de

l’exon 15 de la DMPK contenant 960 CTG107. La même année, Wheeler et al. ont publié dans le journal Nature

que cette chimie MOE gapmer permettait, lorsqu’administré systémiquement chez la souris HSALR, une

réduction de 80% de l’ARN du transgène hACTA1-CUGexp dans les muscles des pattes arrières de souris à 25

mg/kg 2 fois par semaine. Ils ont observé une diminution du nombre de foci nucléaires, une correction de la

myopathie ainsi qu’une correction des erreurs d’épissage dépendant de MBNL1 : ATP2A1, TTN, LDB3 et

CLCN1108.

2.1.2. Neutralisation de la toxicité des ARN

La neutralisation de la toxicité causée par les répétitions peut se faire par la liaison d’ASO

chimiquement modifiés sur les répétitions CUG de l’ARNm de la DMPK, ce qui empêche l’interaction avec les

facteurs de liaisons aux CUG. À cet effet, Mulder et al. (2009) ont utilisé un ASO 2’-O-méthyl-

phosphorothioate qui a réduit de 90% le niveau d’expression du transcrit humain de la DMPK dans des

myoblastes de souris DM500. Son efficacité in vivo était entre 30% à 80% dans les souris HSALR et dans les

17

DM500. De plus, leur ASO ciblait préférentiellement l’ARNm de l’allèle muté de la DMPK dans les myoblastes

humains DM1, effet largement bénéfique pour une thérapie avec peu d’influence sur le niveau protéique de la

DMPK. Dans les DM500, ils ont obtenu la réduction par un facteur 4 du nombre de foci et la correction de 5

évènements d’erreur d’épissage, soit ATP2A1, MBNL1, TTN, CLCN1 et TNNT3109. La même année, Wheeler

et al. ont utilisé un ASO morpholino de 25 nucléotides qui a eu plusieurs effets bénéfiques lorsqu’injecté

directement dans les muscles des souris HSALR : une diminution du nombre de foci, une redistribution de

MBNL1 dans le noyau, une exportation des transcrits étendus de la DMPK dans le cytoplasme, une correction

des erreurs d’épissage dépendantes de MBNL1, un retour à la normale de la conductance transmembranaire

des ions chlores et une réduction de la myotonie110. Encore une fois dans le modèle de souris HSALR, Leger et

al. (2013) ont testé l’utilisation des ASO morpholinos de 25 nucléotides liés à un peptide (PPMO) cationique

dans le but de favoriser la biodistribution lors d’une administration par voie systémique intraveineuse. Leurs

résultats ont montré une meilleure pénétration musculaire menant à la concentration suffisante pour corriger

presque complètement les erreurs d’épissage, relarguer MBNL1 et éliminer de la myotonie111.

On a entrepris l’identification de molécules ou de substances modulaires multivalentes se liant aux

répétitions CUG et qui pourrait empêcher la liaison de MBNL1 sur ceux-ci. Pushechnikov et al. (2009) ont mis

au point un ligand perméable à la cellule dérivé du bisbenzimidazole Hoechst 3258 qui est capable de se lier

aux répétitions CUG avec beaucoup d’affinité et de spécificité, empêchant la liaison de MBNL1112. D’autres

équipes identifièrent la pentamidine et la néomycine B comme empêchant la liaison de MBNL1 aux répétitions.

Néanmoins, seulement la pentamidine corrige des erreurs d’épissage dans des cellules HeLa exprimant 960

répétitions CUG ainsi que dans les souris HSALR. Des modifications devront être apportées à la molécule pour

augmenter son affinité et sa spécificité afin de réduire la dose à administrer, car la dose efficace chez les

souris était malheureusement mortelle113. Deux publications de Childs-Disney et al. en 2012 identifient

l’approche de l’assemblage modulaire de molécules chimiques qui interagissent avec les répétitions CUG afin

d’empêcher la liaison de MBNL1. Cette stratégie leur a permis de réduire la formation de foci in vivo et de

corriger partiellement les erreurs d’épissage de ATP2A1 et CLCN1114. Wong et al. (2014) ont découvert un

inhibiteur se liant dans les failles des hélices d’ARN qui permet d’empêcher la liaison de MBNL1 sur les CUG

in vitro. Cette molécule, composée de deux triaminotriazines connectés par un bisamidinium, est perméable à

la membrane cellulaire et au noyau. Elle diminue les foci et corrige est erreurs d’épissage (INSR et TNNT2)

dans des cellules HeLa exprimant 960 répétitions CTG dans le gène de la DMPK. Cette molécule a aussi

démontré une diminution de la toxicité induite par les répétitions dans un modèle DM1 chez la drosophile115.

Ketley et al. (2014) ont développé un technique de criblage à moyen débit qui leur a permis d’identifié deux

molécules chimiques, Ro 31-8220 et la chromomycine A3, qui éliminent les foci nucléaires, redistribuent et

réduisent MBNL1 dans le noyau, normalisent CUGBP1 à son niveau basal et corrigent partiellement l’épissage

18

de INSR et ATP2A1. Le mécanisme fonctionnel de ces deux molécules n’est pas encore compris et

nécessitera une étude plus approfondie116.

Les stratégies ciblant la réduction de l’ARNm de la DMPK sont rarement spécifiques au transcrit de

l’allèle muté et pourraient avoir un impact sur les fonctions associées à la protéine. Afin de contrer ce

problème, plusieurs voies n’impliquant pas le ciblage de l’ARNm furent élaborées. La première consiste à la

modulation des niveaux protéiques de MBNL1 et CUGBP1, deux régulateurs de transcription débalancés dans

la DM1. Dans un modèle DM1 de drosophile exprimant un ARNm non-codant contenant 480 CUG, Haro et al.

(2006) ont surexprimé MBNL1, ce qui a eu pour effet de réprimer le phénotype dégénératif DM1 dans les

tissus musculaires et les yeux. Étrangement, ils ont aussi observé une réduction du nombre de foci nucléaires,

évènement non attendu pas cette stratégie en considérant notre compréhension du mécanisme pathologique

de la maladie117. L’expression virale de MBNL1 dans les souris HSALR par Kanadia et al. (2006) a bien

démontré la correction des évènements d’erreurs d’épissage associées à MBNL1 dans la DM1 (ATP2A1,

CLCN1 et TNNT3) en plus de neutraliser la myotonie79. Dans le cas de CUGBP1, le rétablissement de niveau

protéique basal par un blocage de l’activité de PKC dans un modèle de souris DM1 fut démontré comme étant

une avenue potentielle de thérapie pour la DM1118. La modulation des facteurs d’épissage n’est pas une

avenue sans danger, car l’épissage est un processus finement régulé dont la modulation grossière pourrait

entraîner des effets indésirables. L’accumulation de l’ARNm étendu de la DMPK dans le noyau laisse

présager qu’un rétablissement de l’exportation de ce transcrit dans le cytoplasme pourrait servir de traitement

pour la DM1119. Cette avenue fut légèrement explorée, mais une compréhension plus approfondie du

mécanisme d’exportation nucléaire de ce transcrit est nécessaire pour offrir une suite à cette stratégie120. La

correction des évènements d’erreurs d’épissage par saut d’exons induit par des ASO est autre stratégie

envisagée par certains chercheurs85. Cependant, étant donné le grand nombre d’erreurs à corriger, cette voie

est probablement mieux adaptée d’autre pathologie comme la dystrophie musculaire de Duchenne, où

l’excision d’un seul exon permet de rétablir le cadre de lecture normal de l’ARNm de la dystrophine menant à

une protéine fonctionnelle121,122.

2.2. Les oligonucléotides antisens

La première réalisation du potentiel des acides nucléiques comme outil de régulation post-

transcriptionnelle fut constatée lorsque Zamecnik hybrida un oligomère synthétique d’ADN de 13 bases à

l’ARN 35S du virus du sarcome de Rous, bloquant ainsi l’initiation de la traduction et par conséquent la

synthèse protéique123. La technologie résultante de cette découverte prit plusieurs années à se développer et

demande des prérequis fondamentaux. La connaissance de la fonction et de la séquence de l’ARN que l’on

veut affecter est nécessaire en vue de façonner la séquence de l’oligomère. Simple brin, l’ASO doit intégrer

19

l’organisme tout en restant intact pendant qu’il fait son chemin jusqu’à sa séquence d’ARN complémentaire

ciblée. Afin d’augmenter leur capacité d’intégrer la cellule, ils peuvent être modifiés par l’ajout de substituants

lipophiles, de ligand de récepteurs cellulaires ou de peptides d’incorporation cellulaire124. Le mécanisme par

lequel les ASO dénichent leur ARN complémentaire à travers les centaines de millions d’ARN est toujours

inconnu. Cette reconnaisse pourrait être tout à fait aléatoire par la simple diffusion de l’ASO à travers la cellule

ou encore aidée par la prise en charge par une autre molécule. Habituellement d’une longueur de 15-20

nucléotides125, les ASO ont une spécificité remarquable qui leur permet de discriminer à la base près les ARN

ciblés et de les lier avec un haut degré d’affinité126. Toutefois, en pratique, toutes les séquences ne peuvent

être sélectionnées afin de créer des ASO efficaces. Tout d’abord, la séquence doit être unique afin d’éviter les

interactions non désirées avec d’autres ARN. Ensuite, la complexité et la dynamique des structures

secondaires et tertiaires que peut prendre l’ARN ainsi que la liaison de protéine sur celui-ci font obstacle à la

reconnaissance. Des outils de prédictions structurales peuvent être utilisés pour réduire ces types

d’interactions, mais ils ne sont pas parfaits127.

Le mécanisme de dégradation de l’ARNm par les oligonucléotides le mieux documenté est celui

impliquant la RNase H1. Présente chez tous les mammifères, la RNase H1 est une endonucléase qui

reconnaît spécifiquement les duplex d’ADN/ARN. Sa fonction habituelle au sein de l’organisme est la

dégradation des amorces d’ARN synthétisé par la primase durant la réplication de l’ADN128. L’interaction entre

la RNase H1 et les oligonucléotides serait rendue possible grâce à la formation de liaisons d’hydrogène entre

l’enzyme et le squelette, et de nombreuses modifications chimiques diminuent ou abolissent ces liaisons129.

Son activité de reconnaissance non spécifique nécessite un hétéroduplexe d’un moins 4 ribonucléotides afin

de déclencher le clivage des liens phosphodiesters du brin d’ARN seulement130. Pour une application

thérapeutique, ce mécanisme est très efficace, car l’insertion d’une seule molécule d’ASO donne naissance à

plusieurs évènements de dégradation d’ARNm. À cet effet, le développement de la technologie des gapmers a

su capitaliser sur l’efficacité de la dégradation de la RNAase H1 (Figure 8).

20

Figure 8 - Mécanisme de dégradation à la RNase H1 induit par les ASOs gapmers

La liaison d’un ASO de type gapmer permet le recrutement de la RNase H1 par sa région central et induit la dégradation de l’ARNm,

libérant ainsi le gapmer pour un nouveau cycle de dégradation. Illustration adaptée de 106.

2.2.1. Les modifications chimiques

L’utilisation de molécules d’ADN ou d’ARN non modifiées à des fins thérapeutiques a fait face à

certains problèmes intrinsèques qu’il fut nécessaire de régler afin d’offrir un avenir à la technologie des ASO.

Tout d’abord, l’introduction d’ASO dans l’organisme induit très rapidement leur dégradation par les nucléases

associées aux mécanismes de défense microbienne128, avant même de s’être rendues à leur cible. Ensuite,

leur pharmacocinétique en fait une mauvaise stratégie systémique parce qu’ils sont rapidement filtrés du sang

par les reins. Finalement, un système utilisant l’ADN pour cibler de l’ARN est victime d’une affinité inférieure à

celle de l’ARN pour l’ARN. Pour ces raisons, les modifications chimiques des oligonucléotides furent explorées

au niveau du squelette de phosphate, des hétérocycles, des sucres et ainsi que des stratégies de conjugaison

afin de pallier à ces différents problèmes. Concrètement, les objectifs de ces modifications sont l’amélioration

de la biostabilité, de l’affinité, de l’absorption cellulaire et de la distribution tissulaire des ASO131 tout en évitant

au maximum la toxicité. Les efforts de synthèse ont donné naissance à trois générations de modifications

chimiques (Figure 9).

21

Figure 9 - Modifications chimiques des ASO

La première génération d’ASO est caractérisée par la présence d’une modification chimique au niveau du squelette de phosphate où

les liens phosphodiesters entre les acides nucléiques sont remplacés par des liens phosphorothioates (PS). La seconde génération

provient de modifications 2’-alkyle sur le furanose et la troisième génération de modification provient généralement de modification de

l’anneau de furanose. Illustration adaptée de 132.

2.2.1.1. Première génération

La première modification significative des ASO fut au niveau du squelette de phosphate, élément

donnant la charge négative communément attribuée aux acides nucléiques. Les squelettes d’oligonucléotides

contenant des liens phosphorothioates (PS) entre les nucléotides sont une des premières modifications

chimiques efficaces effectuées. C’est la substitution d’un atome d’oxygène, ne participant pas à la liaison du

phosphate entre deux nucléotides, par un atome de soufre qui différencie ce squelette des oligonucléotides

normaux (Figure 9). Cette modification conserve la charge négative du squelette et confère aux ASO les

22

propriétés qui leur permettent d’être des prétendants efficaces pour la livraison systémique133. L’augmentation

de la stabilité face à la dégradation des nucléases apportée par les PS donne le temps aux ASO administrés

par voie systémique de se rendre à leur cible avant d’être dégradés. Par exemple, la demi-vie d’un oligomère

de 27 nucléotides (27-mer) PS injecté par voies systémiques dans le rat est de 15-25 minutes dans le sang et

de 20-40 heures pour l’élimination corporelle134. L’assimilation dans les tissus est facilitée par la

pharmacocinétique des PS qui augmente les interactions de liaisons des ASO aux protéines du plasma135. De

plus, les PS permettent de conserver la capacité d’association avec la RNase H1, mécanisme critique à la

dégradation des ARN ciblés136. La formation d’hétéroduplexe ARNm-ASO PS a néanmoins un désavantage,

une diminution de la température de fusion (Tm) de 0,5°C par nucléotides modifiés qui se traduit par une

diminution de l’affinité de liaison137. Même si les attributs conférés par les liens PS ne sont pas optimaux pour

toutes les propriétés, leur combinaison à d’autres chimies est responsable d’une efficacité sans équivalent133

et qui justifie l’usage de cette modification de première génération comme un élément de base dans la

majorité des ASO138. Fomivirsen, un ASO de 21-mer dont l’unique modification chimique est la présence de

liaisons PS, est un médicament antiviral contre le cytomégalovirus retinitis, le premier antisens approuvé par

l’agence américaine des produits alimentaires et médicamenteux (FDA) en 1998139. De nombreux autres ASO

PS ont donné naissance à des études de phase clinique pour le traitement des désordres inflammatoires140,

de l’asthme141 et du cancer142-146. Constamment à avant-garde dans la recherche de nouvelles chimies d’ASO

plus efficace, on a été jusqu’à remplacer l’atome phosphore du lien phosphodiester par des groupes

amides147,148, hydroxylamines149 et acétals150,151, mais aucune des modifications n’a su démontrer une

amélioration par rapport au squelette de PS136.

2.2.1.2. Deuxième génération

Parmi toutes les modifications chimiques des nucléotides, la modification des furanoses en 2’ est

celle qui a offert l’apport le plus important quant à l’utilisation d’ASO à des fins de traitements thérapeutiques.

Cette modification de deuxième génération est caractérisée par l’introduction d’un groupe 2’-O-alkyle sur le

furanose (Figure 9). Elle a pour but d’augmenter l’efficacité des ASO par l’amélioration de la résistance aux

nucléases, de l’affinité de liaison à l’ARN et par la modification de l’interaction des oligonucléotides avec les

protéines152. La présence de certains substituants électronégatifs sur les furanoses en 2’ induit une

pseudorotation du cycle de la conformation 2’-endo, typique à l’ADN-B, vers 3’-endo, conformation attribuée à

celle de l’ARN. Semblable à celle de la géométrie de forme A des duplex d’ARN, cette nouvelle conformation

serait associée à l’augmentation de la stabilité d’hybridation à l’ARN observée, donc de l’affinité, comme le

démontre l’augmentation des Tm131. De plus, la modification des furanoses en 2’ par un groupement

augmente la proximité entre elle et le phosphate en 3’, ce qui augmente l’encombrement stérique et par

conséquent confère une résistance aux nucléases à la majorité des sucres nucléotidiques modifiés en 2’. Cet

23

effet est aussi réfléchi vers la capacité de recrutement de la RNase H1, car toutes les modifications des sucres

en 2’ provoquent une bonne réduction jusqu’à l’inhibition de leur l’interaction. La stratégie des gapmers a tout

de même su outrepasser cette limitation et permet l’utilisation de cette modification pour un usage des ASO

impliquant la dégradation à la RNase H1. Protégé de la dégradation des nucléases aux extrémités par

l’encombrement stérique des nucléotides modifiés en 2’, les gapmers sont capables de recruter la RNase H1 à

l’aide d’une région centrale constituée de nucléotides d’ADN dénudés de modification (Figure 10). À l'aide de

cette technique pragmatique, on est capable de profiter de l’augmentation de l’affinité apportée par cette

modification chimique sans perdre l'accès au mécanisme de dégradation.

Figure 10 - Structure d'un gapmer

Structure en gapmer de Mipomersen, un médicament antisens approuvé par la FDA et développé par Isis Pharmaceuticals. a. Aux

extrémités, des nucléotides chimiquement modifiés sur les sucres en 2’ protègent l’ASO contre la dégradation des nucléases. Une

région centrale de nucléotides d’ADN conventionnel permet le recrutement de la RNase H1. b. L’encombrement stérique provoqué aux

extrémités de l’ASO par la chimie MOE est bien visible sur cette représentation structurale tridimensionnelle. Illustration adaptée d’une

affiche Isis Pharmaceuticals disponible en ligne.

Dans cette classe, les ASO gapmers 2’-O-méthyl (OMe) PS et MOE-PS sont très bien caractérisés.

Quelques ASO OMe150,151 et plusieurs MOE140,153,154 se sont rendus ou sont encore étudiés dans des phases

cliniques. Mipomersen est le deuxième et dernier des rares ASO sur le marché qui a passé les phases

cliniques I/II/II et est présentement approuvé par la FDA155. C’est un MOE-PS avec une très forte affinité (Tm

+2°C/modification comparativement à l’ADN) dont la pharmacocinétique unique est très bien caractérisée. En

plus de la conformation C3’-endo adoptée par le sucre, la molécule prend une orientation gauche qui permet

la capture de molécules d’eau et la formation d’une coquille hydratée incluant les phosphates adjacents. Cette

augmentation supplémentaire de la rigidité expliquerait la résistance exceptionnelle aux nucléases156 et a

donné naissance à l’évaluation de plusieurs médicaments en phases cliniques136.

24

2.2.1.3. Troisième génération

La troisième et dernière génération d’ASO fut développée dans le désir d’augmenter encore plus leur

affinité, leur résistance aux nucléases, leur biostabilité et leur pharmacocinétique. Leurs caractéristiques

principales sont la modification de l’anneau de furanose et/ou du squelette de phosphate des oligonucléotides

et les chimies les plus étudiées sont les LNA, les oligomers morpholinos phosphoroamidates (PMO) et les

acides nucléiques peptides (PNA) (Figure 9).

Les LNA157 furent créés par l’addition d’un second cycle reliant les carbones 2’ et 4’ du furanose des

acides nucléiques, d’où leur second nom d’acide nucléique bicyclique 2’-4’ (BNA)158. Cette contrainte 2’-4’

augmente dramatiquement les propriétés d’hybridation à l’ARN et améliore la résistance aux nucléases159,

mais on doit les utiliser en gapmer pour recruter le mécanisme de la RNase H1160. Lorsque bien conçus, les

ASO à base de LNA offrent la meilleure puissance des modifications des sucres en 2’, mais sont

malheureusement assujetties à une augmentation de la toxicité hépatique in vivo161. Le raccourcissement de

leur longueur a tout de même permis de réduire la toxicité162 et de mener à des essais cliniques pour cette

chimie163,164. Pour contrer cet obstacle, plusieurs analogues furent générés et ont permis de découvrir le 2’-O-

éthyle contraint en 2’,4’ (cET)162 (Figure 11). Cette chimie moins toxique que les LNA est une des dernières

générations d’ASO breveté par Isis Pharmaceuticals. La présence d’un médicament en phase clinique (ISIS-

STAT3Rx, Phase II) atteste de l’efficacité de cette chimie, ainsi que plusieurs phases précliniques : ISIS-FVIIRx,

ISIS-ARRx et ISIS-DMPKRx140

dont certains résultats seront présentés dans ce mémoire.

Figure 11 - Modification d'oligonucléotide (S)-cET

Évolution de la modification chimique du LNA en acides nucléiques 2’-O-éthyle contraint en 2’,4’ (S-cET) caractérisées par l’ajout d’un

groupement méthyle (Me) sur le second cycle du sucre. Illustration adaptée de165.

La structure des PMO se distingue par le remplacement du lien phosphodiester entre les nucléotides

par des liens phosphorodiamidates et le remplacement du cycle furanose par un anneau morpholino166 (Figure

9). Cette configuration confère une charge neutre aux morpholinos oligonucléotides et empêche leur utilisation

25

par le mécanisme de dégradation à la RNase H1, ce qui les restreint à une utilisation par le mécanisme d’arrêt

de la traduction par encombrement stérique. Elle offre aussi une bonne résistance à la dégradation par les

nucléases dans les fluides biologiques. Dans un cadre thérapeutique, la faible perméabilité des cellules de

mammifères à leur égard exige leur conjugaison à des peptides d’incorporation cellulaires167 (PPMO) ou à

l’attachement de petites séquences simple brin d’acides nucléiques anioniques168 afin d’augmenter leur niveau

d’incorporation. L’efficacité des PMO in vivo169 leur a permis de se rendre aux études cliniques chez l’homme,

comme dans le cas du traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne (Phase II)170, où le problème de

faible pénétration cellulaire est contré par une porosité musculaire induite par les dommages tissulaires

causés par la dystrophie171.

Les PNA sont une alternative radicale aux oligonucléotides, car le squelette sucre phosphate est

émulé par un peptide (Figure 9) et permet de conserver les associations de pairage de bases de Watson-

Crick. Leur composition particulière leur décerne une biostabilité élevée dans les fluides biologiques attribuée

à une résistance aux nucléases et aux peptidases. Ils sont neutres et incapables de recruter la RNase H1 ce

qui limite leur utilisation au mécanisme d’arrêt de la traduction protéique. Une pénétration membranaire

médiocre, restreignant leur usage à l’utilisation d’agent transfectant in vitro, a mené à leur conjugaison à de

petits peptides172-174 et à l’incorporation d’acides aminés chargés dans leur squelette175 afin d’augmenter la

distribution tissulaire.

26

2.2.2. Pharmacocinétique des phosphorothioates

La caractéristique multisystémique de la DM1 exige une technique d’administration produisant une

distribution systémique. Pour sa facilité d’utilisation par les patients, la voie orale est une stratégie vers

laquelle on aimerait se tourner. Toutefois, les propriétés chimiques inhérentes aux ASO rendent difficile

l’absorption gastro-intestinale. Pour cette raison, la majorité des programmes de recherche se concentrent sur

les voies d’administration par injection parentérale (perfusion intraveineuse ou injection sous-cutanée), parce

qu’elle permet la distribution tissulaire et une biodisponibilité adéquate des oligonucléotides chimiquement

modifiés171. En général, la pharmacocinétique des ASO est principalement dictée par la chimie de leur

squelette et l’influence de celui-ci sur la stabilité biologique ainsi que sur la liaison aux protéines du plasma

sanguin176. Par exemple, les chimies produisant des ASO neutres, comme les morpholinos et les PNA, nuisent

à l’interaction avec les protéines du plasma et ils sont rapidement filtrés hors du sang177. À l’inverse, la

modification du squelette par des PS favorise les interactions ce qui permet leur transfert dans les tissus de

manière efficace171.

Suite à une injection parentérale, plus de 90% des ASO PS se retrouvent liés à des protéines du

plasma sanguin (majoritairement à l’albumine). Leur demi-vie de distribution est de 1-2 heures, menant à une

détection de moins de 1% d’ASO PS en circulation dans le sang 12 heures après l’administration. L’absorption

dans les tissus est d’autant plus confirmée par une excrétion de moins de 5% dans l’urine et les selles durant

la première journée178. La distribution des ASO PS chez la souris ne se fait pas de manière uniforme, car l’on

retrouve une accumulation dans les reins, le foie, la rate179. L’accumulation dans les reins est principalement

due à son action de filtration du sang où il élimine les ASO libres dans le fluide sanguin par leur excrétion dans

l’urine. Par conséquent, les ASO possédant une bonne capacité de liaison aux protéines du plasma passent

inaperçus et leur distribution et accumulation dans l’organisme en est ainsi favorisée. Le reste de l’élimination

des oligonucléotides se fait par les nucléases qui les métabolisent ou les macrophages qui les phagocytent.

Dans le cas des ASO PS, la modification du squelette de phosphate ralentit leur digestion, sans toutefois

empêcher celle des exonucléases, et ce, à partir des deux extrémités178.

27

Figure 12 - Avenir des ASO suite à une injection systémique

Une fois dans le sang, un ASO peut être dégradé par les nucléases, filtré par les reins et excrété dans l’urine ou encore être la cible

d’un macrophage. Leur accumulation dans le foie les reins et la moelle osseuse serait causée en partie par une accumulation de

macrophages ayant phagocyté des ASO. Pour se rendre à leurs cibles, ils doivent être en mesure de passer à travers la paroi

vasculaire jusqu’à l’interstitium et passer à travers les membranes cellulaires et nucléaires. Illustration tirée de 180.

L’ajout d’une modification chimique partielle ou complète MOE à celle du squelette PS ne change pas

significativement la pharmacocinétique des ASO dans le plasma par rapport aux ASO PS. Le jumelage aux

protéines sanguines est toujours au-dessus de 90%, quoique moins prononcé que pour les ASO PS, avec une

l’excrétion sous 10% après les 24 premières heures. Déterminée avec beaucoup de précision, la

biodistribution des ASO MOE-PS est semblable à celle des ASO PS avec une accumulation dans les reins, le

foie, la rate, les ganglions lymphatiques, le corps cellulaire des adipocytes et dans la moelle osseuse181. La

barrière hématoencéphalique n’est pas traversée par les ASO suite à une administration systémique, d’où le

besoin d’injections dans le fluide cérébrospinal pour atteindre le cerveau182. La modification MOE à elle seule,

comme pour les LNA, ne permet pas une aussi bonne liaison aux protéines du plasma et les ASO sont

rapidement éliminés dans l’urine171. Par conséquent, la biodistribution se trouve considérablement diminuée et

justifie la nécessité de jumeler à cette chimie celle des PS. L’avantage de l’ajout du MOE est un gain de

28

stabilité face à la dégradation des nucléases, maintenant presque nulle183, qui se traduit par une prolongation

de la résidence dans l’organisme comme le témoigne la demi-vie de 1 mois176. Les exonucléases n’ont

pratiquement plus d’effet sur les ASO MOE et ce sont les endonucléases qui sont les principaux responsables

de leur dégradation, générant de petits fragments de nucléotides détectables dans l’urine184. Cette

combinaison de chimies ne permet pas non plus le passage au cerveau ou la distribution efficace aux muscles

squelettiques, au cœur et aux poumons. À l’exception du cerveau, la chimie cET pourrait aider à cette

problématique, car on a pu observer une augmentation de son efficacité dans plusieurs tissus par rapport au

MOE. Il est toutefois possible que ce soit dû à une meilleure affinité envers les cibles et non à une

augmentation de la pénétration tissulaire165, car leur biodistribution est semblable à celle des MOE185.

Néanmoins, bien d’autres modifications chimiques ont été ciblées par les compagnies pharmaceutiques et

l’avenir nous dira si l’on peut encore améliorer la pharmacocinétique des ASO.

2.2.3. Toxicologie des phosphorothioates

Comme pour tous les médicaments, la toxicité des ASO est caractérisée par un effet dose dépendant.

On peut classifier ces effets selon deux catégories, soit causés par l’hybridation des ASO ou par un effet

indépendant de l’hybridation. La toxicité induite par l’hybridation peut être causée par une hybridation

exagérée aux séquences cibles, produisant un effet pharmacologique trop puissant, ou à des séquences

d’ARN non souhaitées. Néanmoins, c’est un facteur que l’on peut moduler grâce aux outils bio-informatiques

qui permettent de contrôler les problèmes d’hybridations par la sélection de séquences avec un maximum de

3 mésappariements par rapport à la cible, car un niveau plus élevé induit une perte d’activité majeure des

ASO. La sélection des séquences ciblées doit tout de même être validée et caractérisée dans des modèles

précliniques afin d’éviter les effets causés par une hybridation non-désirée136.

Généralement, on observe un lien entre la toxicité et à la classe de modification chimique attribuée à

un ASO186. La nature de la chimie est responsable des effets de toxicité indépendants de l’hybridation et est

souvent provoquée par des interactions entre les ASO et des protéines, les effets aptamériques. Ils peuvent

être causés par la séquence comme dans le cas des récepteurs semblables à Toll (TLR) ou indépendants de

séquences136. Les études des ASO PS ont démontré que TLR-9, un récepteur de reconnaissance des

pathogènes, est malencontreusement activé par les dinucléotides CpG des ASO de cette classe et déclenche

une réponse immunitaire inné187. Une méthylation sur la cytidine est par conséquent nécessaire sur ces

séquences afin de contrer cet effet de reconnaissance de motif. D’autres effets répertoriés des ASO PS

incluent la prolongation du temps d’activation de la thromboplastine partielle, l’activation d’un chemin de

signalisation alternatif du complément et une réaction au site d’injection chez la plupart des patients en phase

clinique171. Des patients ont aussi présenté de la fièvre, des frissons, des maux de tête et dans certains cas

29

une réduction du compte des plaquettes188. Le foie est un organe à surveiller lors du traitement par les ASO,

car il est fréquemment victime de dommages causés par une réponse pro-inflammatoire ou induite par

l’apoptose causée par l’accumulation des ASO. Le dommage engendré à cet organe est mesuré par

l’augmentation du niveau de transaminases alanines et aspartates aminotransférases (ALAT et ASAT) dans le

sang. Étant donné que les effets sont dose dépendant et qu’ils apparaissent à des doses élevées, l’ajustement

de la dose et l’administration progressive des ASO permettent de gérer adéquatement les effets

toxiques189,190. De plus, l’amélioration de l’efficacité des nouvelles générations d’ASO permet de réduire les

doses administrées et la concentration locale, réduisant par conséquent les effets néfastes. D’ailleurs, ce fut

démontré chez les ASO MOE-PS189 et cET-PS162 chez la souris et le singe, où ces deux chimies très bien

tolérées ont des profils de toxicité similaire191.

31

3.1. Hypothèse

L’utilisation des ASO est limitée par leur faible pénétration dans le muscle suite à des injections

systémiques. De ce fait, nous avons fait l’hypothèse que la chimie, la séquence et la longueur sont non

seulement importants pour l’efficacité des ASO, mais des facteurs majeurs pour l’augmentation de la

pénétration musculaire. Suite au criblage d’une librairie de milliers d’ASO contre l’ARN de la DMPK, on a fait

l’hypothèse que nous serions capables d’identifier le meilleur ASO parmi les dix plus actifs et qu’il serait

capable de cibler la DMPK dans le muscle suite à des injections systémiques.

3.2. Objectifs

1. Démontrer que les ASO actifs sont capables de réduire les niveaux d’ARN mutés et d’améliorer le

phénotype dans des modèles in vitro et in vivo.

2. Identifier un ASO actif et non toxique qui ouvrirait la porte à un premier essai clinique chez l’homme.

33

Développement

Constrained Ethyl Modified Antisense Compound is a

Promising Tool for Gene Silencing Following Systemic

Antisense Treatment in Myotonic Dystrophy type 1

Dominic Jauvin1, Jessina Chrétien1, Sanjay K. Pandey2, Laurie Martineau1, Lucile Revillod3, Guillaume

Bassez3, Benoit Chabot4, Aline Lachon5, A. Robert McLeod2, Geneviève Gourdon5, C. Frank Bennett2 and

Puymirat Jack1*

1Unit of Human Genetics, CHUQ/CHUL, 2705 Bd Laurier, Québec, G1V4G2, Canada. 2Isis Pharmaceuticals

Inc, 2855 Gazelle Court, Carlsbad, CA 92010, USA. 3Neuromuscular Reference Center, Henri Mondor

Hospital, INSERM U955, Créteil, France. 4Department of microbiology and infectiology, Faculty of medicine,

CHU Sherbrooke, Quebec, Canada. 5INSERM U781, InstitutImagine, 75015 Paris, France.

*Correspondence: Jack Puymirat, Unit of Human Genetics, CHUQ/CHUL, 2705 Bd Laurier, Québec,

G1V4G2, Canada, Tel. 418-654-2186, Fax 418-654-2207, E-mail : [email protected]

35

4.1. Résumé

Les oligonucléotides antisens (ASO) offrent des possibilités thérapeutiques pour une grande

variété de maladies humaines. Toutefois, malgré l’amélioration de leurs chimies et de leur technologie,

l’administration systémique des ASO est limitée par une pénétration intracellulaire insuffisante afin d’obtenir

un excès d’ASO suffisant, par rapport à l’ARN ciblé, pour avoir une activité biologique soutenue. Cette

étude décrit une stratégie générale basée sur le triage d’un ensemble d’ASO de différentes longueurs,

séquences et modifications chimiques afin d’identifier ceux qui sont les plus actifs en vue d’une

administration par injection systémique. Nous avons appliqué cette stratégie pour le design d’ASO pour la

dystrophie myotonique de type 1 (DM1), chez laquelle l’expansion de répétitions CUG dans les transcrits du

gène de la DMPK séquestre ceux-ci dans le noyau, provoquant ainsi un gain de fonction toxique de

l’ARNm. Par conséquent, cette pathologie fournit un système adéquat pour l’utilisation thérapeutique

d’ASO. À partir de 3000 candidats, nous avons identifié deux ASO gapmers, un avec des modifications 2’-

O-méthoxyéthyle (MOE) et l’autre avec des acides nucléiques bicycliques avec éthyle contraint (cET) aux

extrémités des ASO afin de maximiser leur biostabilité, et une région centrale de 10 nucléotides non

modifiés afin de supporter l’activité de la RNase H. Dans les cellules satellites humaines DM1, les deux

ASO induisent une disparition dose-dépendante des foci nucléaires, une redistribution de MBNL1, une

réduction jusqu’à 90% des transcrits mutés et une correction d’évènements d’erreurs d’épissage. Dans un

modèle transgénique de souris DM1, l’administration systémique d’ASO cause une réduction significative

des niveaux de transcrits mutés dans différents muscles squelettiques et dans le cœur, corrige des

évènements d’erreurs d’épissage de pré-ARN, des caractéristiques histologiques et augmente la force

musculaire. Ces résultats démontrent une stratégie générale pour le design d’ASO à des fins de

développement thérapeutique. De plus, cette étude démontre la preuve de principe in vitro et in vivo d’une

thérapie génique pour le traitement de la DM1 par les ASO et ouvre la porte à une étude clinique de phase

I.

37

4.2. Abstract

Antisense oligonucleotides (ASO) provide therapeutic opportunities for a wide variety of human

diseases. However, despite improvement in chemistry and design, systemic administration of ASOs is

limited by an insufficient level of intra-cellular delivery, in order to obtain a significant excess of ASOs over

the RNA target and remains to achieve a high and sustained level of biological activity. Here we described

a general strategy based on the screening of a large collection of ASOs with different lengths, sequences

and chemistries to identify the most active ASOs following systemic injection. We applied this strategy for

the design of ASOs in myotonic dystrophy type 1 (DM1), in which, expanded CUG (CUGexp) repeat mutant

transcripts are retained in the nucleus inducing a toxic gain-of-function effect, making it an appropriate target

for therapeutic ASOs. From 3,000 candidates, we identified two gapmers ASOs, one with 2'-O-

methoxyethyl (MOE) modification and the other with constrained ethyl bicyclic nucleic acid (cET) motif at

both ends to maximize biostability and a central gap of 10 unmodified nucleotides to support RNase H

activity. In human DM1 muscle satellite cells, both ASOs induced a dose-dependent disappearance of

nuclear foci, redistribution of MBNL1, reduction up to 90% in mutant transcripts and correction of mis-

spliced. In a transgenic mouse model of DM1, systemic administration of ASOs caused a knockdown of

CUGexp RNA in different skeletal muscles and heart, correcting mis-spliced pre-RNAs, histological features

and increase muscle strength as determined by the grip test. These results provide a general strategy to

design ASO for therapeutic development. In addition, this study demonstrates the in vitro and in vivo proof

of the principal of an ASO gene therapy for DM1 and open the route for a phase I clinical trial.

39

4.3. Introduction

Antisense technology provides a new platform for the treatment of a wide variety of diseases

including cardiovascular, neuromuscular, metabolic, cancer, viral diseases and inflammatory disorders.

However, despite of numerous clinical trial reports, there is only two approved antisense therapy.

Fomivirsen was the first approved antisense drug for the treatment of CMV retinis by intravitral injection1

and, Kynamro recently became the first antisense drug approved by the United States Food and Drug

Administration for systemic injection in human. Most trials of systemically administrated ASOs have failed in

their phase III, mostly because of their insufficient efficiency and/or toxicity.

A major challenge in use of ASOs as therapeutics is to achieve a sufficient level of intra-cellular

delivery after systemic injection, in order to obtain a significant excess of ASOs over the RNA target and

remains to achieve a high and sustained level of biological activity. Natural ASO with phosphodiester (PO)

backbone are susceptible to degradation by nuclease, indicating that oligonucleotides must be modified to

create with sufficient biostability to generate an effect2. The first generation of chemically modified ASOs

was phosphorothioate (PS) ASOs, which offers increase nuclease resistance and improves tissue

distribution. Their clinical application is, however, limited by their poor affinity towards their targets3-8. The

second generation represents ASOs modified not only to the backbone but also on the ribose9. Among

these modifications, the 2'-O-methyl (OMe) and 2'-O-methoxyethyl (MOE) ASOs are well tolerated and have

higher stability, resulting in lower doses and decreased toxicity10. More recently, constrained ethyl (cET)

modified ASOs were shown to be more efficacious that MOE ASOs in different tissues following systemic

injection11,12. All these modifications, however, impede RNase H activation and these ASOs cannot be used

for gene silencing by RNA degradation. Thereby, the design of chimeric ASOs (Gapmer), which contains

internal PS ASOs flanked by nuclease resistant oligonucleotide, induce RNase H activation and renders

these new generations of ASOs potent agents for RNA degradations13. The third generation represents

oligonucleotides with a variety of modification in the ribose ring and/or the phosphate backbone2. These

oligonucleotides include locked nucleic acid (LNA) and phosphorodiamidate morpholino oligonucleotides

(PMO or morpholinos)14. These modifications also impede RNase H activation and are used for correction of

aberrant splicing through exon skipping, which needs that, the target RNA to be kept intact.

Besides chemical modifications, another approach to increase ASO delivery into skeletal muscles

is to conjugate ASOs to peptides (for review see15,16). Conjugation of ASOs to positively charged, arginine-

rich (Arg-rich) cell-penetrating peptides (CPPs) enhances significantly the activity of both PNA and PMO in

cellular and animal models17-20 (for review see21,22). More recently, it was shown that a series of transduction

peptides (Pip5) as PMO conjugates strongly enhanced ASO delivery after systemic injection. One of the

40

lead peptide-PMO conjugates, Pip5e-PMO, showed highly efficient exon skipping and dystrophin production

in mdx mice with complete correction of the aberrant DMD transcripts in heart, leading to more than 50% of

the normal level of dystrophin in heart. In addition, excess of 80% dystrophin-positive fibers were detected in

all skeletal muscle groups, except the diaphragm where levels were slightly lower23. Pip5e, however, cannot

be easily conjugated covalently with negatively charged ASOs, such as OMe gapmers or LNA/DNA

gapmers used to induce RNA cleavage. Hence, a noncovalent strategy has been recently developed to

deliver anionic RNase H competent ASOs using carriers that form stable nano-sized particles with

negatively charged ASOs. Such nanoparticles have been proven extremely potent for transfections of

various types of cells in vitro24 as well as in vivo25. The use of CPP-oligonucleotides by systemic injection

will require overcoming several hurdles. To interact with cell membrane, CPP must bear positive charges

and often include hydrophobic residues. These properties that enable CPPs to penetrate a wide variety of

cells are also responsible for their nonspecific interaction with serum proteins or tissues15.

Finally, the length and sequence of ASOs also seems to play a role for skeletal muscle delivery by

systemic administration. It was indeed shown that the length of PS-modified gapmer ASOs can modulate

ASO pharmacology and pharmacokinetic properties in animals11. In addition, sequence location on mRNA,

base composition and sequence have been shown as important factors in ASOs specificity and potency.

The presence of secondary structures on mRNA has been shown to hinder target recognition and effect

potency of the selected ASO sequences26. Different base composition affects melting temperature (Tm) of

ASOs, where reduced target affinity is linked to lower Tm27. ASO sequences need to be unique to their

target in order to avoid undesired affects and also absent of self-complementary or palindromic sequence to

avert folding into secondary structures28.

These data together indicate that the length, sequence and chemistry of ASOs are major

parameters to take into account to improve tissue delivery and reduce toxicity. This suggests a protocol for

the design of ASO targeting a specific RNA based on the screening of a library of ASOs with different

lengths, sequences and chemistries to identify the most active ASOs.

To test this idea, we used primary human DM1 muscle satellite cells and a transgenic mouse

model (DMSXL) of myotonic dystrophy type 1 (DM1), a dominant hereditary muscular dystrophy caused by

the expansion of a CTG trinucleotide repeats in the 3'-untranslated region of the human dystrophia

myotonica-protein kinase (DMPK). DMSXL mice express the human mutant DMPK gene in different

tissues, including skeletal muscle29. In both, the CUG expanded transcripts are retained in the nucleus and

form foci, along with splicing factors in the muscleblind-like (MBNL) protein family. MBNL sequestration

leads to mis-regulated alternative splicing30-32. Molecular features of DM1-associated RNA toxicity in DMSXL

41

mice (such as foci accumulation and mild mis-splicing), were associated with high mortality, growth

retardation, and muscle defects (abnormal histopathology, reduced muscle strength, and lower motor

performances). Two therapeutic ASO strategies have been developed for DM133. The first used steric

blocking PMO ASO that compete with MBNL proteins for CUG binding, but this approach is limited by the

poor skeletal muscle delivery of PMO ASOs after systemic injection and also by the fact that it not clear

whether all manifestations of the disease are caused only by sequestration of MBNL proteins. The second

strategy used ASO-inducing RNA cleavage to eliminate toxic RNAs and the proof-of-the-concept has been

demonstrated in a mouse model of DM134.

43

4.4. Results/Discussion/Conclusion

We screened 3,000 candidate ASOs with different lengths and directed against different regions of

the DMPK transcripts, including intronic sequences (Sanjay submitted). The ASOs had a MOE, cET or a

combination of both chemical modifications at both ends to maximize biostability and a central gap of 10

unmodified nucleotides to support RNase H activity. We identified ASOs showing a strong knockdown of

hDMPK mutant transcripts in human DM1 satellite muscle cells and in heterozygous DMSXL mice after

systemic injection. The two best ASOs were further studied in a blind study in vitro in human muscle satellite

cells and in vivo in homozygous DMSXL mice. The first ASO had a MOE modification (20 mers ASO

445569) and the other a cET modification (16 mers ASO 486178).

Quantification of nuclear foci identified by FISH revealed a dose-dependent disappearance of foci

(data not shown) in myotubes with a maximum effect >90% of foci disappearance at 20 nM for ASOs

486178-cET and 445569-MOE (Fig. 1b). In addition, Northern blot analysis confirmed a 90% reduction of

mutant transcripts with both ASOs (Fig. 1c-d). Because both ASO were not specific for the mutant

transcripts, reduction was also observed for the normal DMPK transcript. Redistribution of MBNL1 also

occurred after treatment with both ASOs indicating that CUGexp repeats are effectively degraded after

cleavage events 5' or 3' of the repeat tract, at the ASOs targeted site (Fig. 1a).

In previous experiments using a RT-PCR platform, we have identified mis-spliced RNAs in these

cultures (Chabot submitted). Hence, reduction in CUGexp RNA would be expected to improve mis-spliced

events and of those, RBFOX1 and TTN are consistently corrected by both ASOs (Fig. 1e). Microarrays were

performed in aged-matched normal muscle satellite cells treated with both ASOs to examine toxicity. A

similar effect was felt on a few apoptosis genes (ACTN3, BCL2L2 and SIVA1 are downregulated and NRG1

is upregulated) and only 486178-cET induces a reduction of PHLDA3 and PRF1 expression. Inflammation

genes were less effected with only one commonly upregulated gene (NFKBIZ) and 2 upreagulated only by

ASO 486178-cET (Fig. 1f). No significant changes were observed in genes involved in cell proliferation. To

further confirm lack of mortality induced by ASO toxicity, an apoptosis/necrosis assay was performed and

showed no significant mortality over a 2 day period indicating that these ASOs were well tolerated. Fives

genes common to both ASOs were altered by more than twofold, 36 genes were 486178-cET specific and 3

were 445569-MOE specific (Supp. Table 1).

We then tested these 2 ASOs in homozygous DMSXL mice by subcutaneous injection of 25 mg/kg

(486178-cET) and 50 mg/kg (445569-MOE) biweekly during 4 weeks and once a week during the next 5

weeks. During this time, no increase in DMSXL mice mortality rate induced by ASOs was noted. After 9

44

weeks of administration (18 injections), ASOs reduced the number of nuclear foci by 70% and 40% in the

quadriceps, for ASO 486178-cET and 455569-MOE respectively. Furthermore, RT-qPCR confirmed these

numbers with an average of 66% and 41% reduction in human mutant DM1 transcripts in 6 skeletal muscles

(tibialis anterior, soleus, quadriceps, latissimus dorsi, triceps and diaphragm). Only 486178-cET had effect

in the heart with a 31% decrease in mutant transcript and no significant decrease was observed in the brain.

These data indicate that the 486178-cET is more efficient than the 4455569-MOE to target mutant

transcripts in skeletal muscle after systemic injection.

Reduction of CUGexp RNA would also be expected to increase the DMSXL mice muscle strength.

We previously showed that these mice have a 30% reduction in forelimb strength compare to age-matched

wild-type mice using the grip test29. During the 2 months period, homozygous DMSXL mice lost 5,9 g in

force whereas treatment with ASO 486178-cET significantly increased by 2,6 g muscle strength. A partial

improvement of 0,5 g was seen with the ASO 455569-MOE but was not significant when compared to

DMSXL average force variation. As in previous experiments with these mice, the correlation between mice

strength phenotype and specific force was not possible29 (Fig. 2d). The improvement of muscle strength by

ASO 486178-cET treated mice was also confirmed by the qualitative coat hanger test (see video).

Studies on rat soleus muscle development revealed an early muscle fiber distribution with mixed

fibers type 1/2a (2c) that transitions to type 1 after a few months of life35. Four months old DMSXL mice

have been reported to have a higher proportion of fibers 1/2a than age-matched wild-type mice29 and it may

be linked to delayed muscle fiber differentiation found in congenital DM1 (CDM1)36. This prompted us to

investigate the possibility of reversing the persistent fiber immaturity profile with ASOs. Immunostaining of

soleus muscle fibers which express both myosin heavy chain (MHC) 1 and 2a in 7 months old homozygous

DMSXL revealed 2,7% of fibers type 1/2a, whereas only 0,85% of these fibers can be observed in age-

matched wild-type mice. Treatment of DMSXL mice with ASO 486178-cET restores 95% of the normal

profile of fibers type 1/2a in DMSXL mice (Fig 2e).

A growing number of splicing defects were described in human DM1 tissues as well as in other

DM1 mouse models37. However, splicing defects in DMSXL mice remained mild and variable from one

mouse to another. This could be attributed to the fact that these mice display several features of the

congenital form of the disease, such as high neonatal mortality and growth retardation, for which there is no

clear evidence of a spliceopathy mechanism. The mis-spliced event observed in most mice was the Ldb3

exon 11 in the heart29. We then examined whether reduction in CUGexp RNA restores Ldb3 exon 11 mis-

spliced event and found that ASO 486178-cET treatment of DMSXL mice restore correct splicing of Ldb3 to

wild-type levels (Fig. 2f).

45

Microarray data performed on ASO 486178-cET treated DMSXL mice provided a good opportunity

to examine effect of this ASO on inflammation, necrosis, cell death and apoptosis genes expression. We

found that 8 genes were downregulated (RETNLA, TPM3, IBSP, ATP2A2, MEG3, NNAT, GM9840, and

PEG3) and 2 were upregulated (HP and IGHM). In total, only 16 genes were affected by a twofold change

(Supp. Table 2). Among those was the DMPK gene, indicating a 65% reduction in expression, which

correlates perfectly with mRNA levels measured by RT-qPCR.

Because the ASO 486178-cET sequence also targets the endogenous mouse DMPK transcripts,

we next analyzed the effect of this ASO in wild-type mice by subcutaneous injection. After 9 weeks of

administration, there was a significant decrease in endogenous DMPK mRNAs (Supp. Fig. 5). However, no

significant changes in muscle strength or on mis-spliced RNA were detectable from short-term treatment

(data not shown). These results indicate that the decrease in endogenous DMPK mRNAs by the ASO

486178-cET had no consequence on the phenotype, which is in good agreement with data showing that

knockout of the DMPK gene in transgenic mice induce only a late onset of a progressive myopathy38.

Moreover, the residual DMPK mRNA levels might by sufficient to abolish these effects.

The screening of a large collection of ASOs with different lengths, sequences and chemistries is

therefore a suitable approach to identify ASOs with a high affinity and low toxicity, at least for skeletal

muscle. Our data also demonstrate that cET-modified ASOs are well tolerated and have a high efficiency,

resulting in the use of lower doses. No new toxicities were found to be associated with cET-ASOs use,

which is in good agreement with a previous report showing that toxicity profile of cET ASOs in mice and

monkey is very similar to MOE ASOs39. Questions left to be answered are the optimal doses to be used for

maximum effectiveness and also the frequency of systemic administration necessary to have a constant

effect. Delivered systemically, biostable ASOs have been reported to be detectable and active a year after

the last injection in mice with a residual 50% reduction in targeted mRNA34. Also, the incapacity of ASOs to

effectively cross the blood-brain barrier after systemic administration suggest that other delivery methods

will have to be considered for the treatment of DM1 cognitive impairments. To this end, intraventricular

administration in mice could potentially resolve this issue and will need further investigation. In humain,

intrathecal administration of ASO ISIS-SMNRx in patients with infantile spinal muscular atrophy (SMA)

cleared a phase II human study40, showing the potential for this approach in DM1. In parallel to this study,

full toxicity evaluation of ASO 486178-cET was conducted in cynomolgus monkey by Isis Pharmaceuticals

and provided sufficient basis to launch phase I clinical evaluation of ISIS-DMPKRx as of the 9th of june 2014.

Finally, we present the first preclinical evaluation of a gene therapy for DM1, based on elimination of toxic

RNAs. New generations of gapmer ASO chemistries opens new avenues for the development of gene

therapies based on gene silencing such as DM1 and disease caused by toxic RNAs.

47

4.5. Methods

Antisense oligonucleotides

ASOs were synthesized by Isis Pharmaceuticals, as previously described41. All ASOs from this

study were gapmers with phosphorothioate as the intersubunit linkage. The design included a central gap

region of 10 PS modified nucleotides with either a MOE modification or S-constrained-ethyl (cET) motif at

both ends, or a combination of both. Identification of active ASOs was performed as described previously

(Sanjay submitted). Selected ASOs for further study were ISIS-445569-MOE, a 20 mers sequence 5’-

CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC-3’ (conformation 5-10-5) and ISIS-486178-cET, a 16 mers sequence 5’-

ACAATAAATACCGAGG-3’ (conformation 3-10-3).

Cell cultures and transfection

Human fetal normal (HFN) and congenital fetal DM1 (DM3200) myoblasts, previously described42,

were grown in MB-1 medium (Hyclone) supplemented with BSA (0,5 mg/ml), insulin (5 µg/ml) and

dexamethasone (0,4 µg/ml). Cells were transfected at 80% confluence with ASOs ranging from 1 nM to 1

µM using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen), according the manufacturer's instructions. Differentiation

into myotubes was accomplished by switching cultures to differentiation medium (DMEM high glucose

supplemented with 2% fetal bovine serum, 10 µg/ml insulin and 100 µg/ml apo-transferrin) 24h after

transfection and analysis was done 2 days later. Apoptosis and necrosis assays were carried out in

proliferating HFN cells using an Annexin V-FITC Apoptosis Kit (PromoKine) as per manufacturer instructions

and quantified by flow cytometry on a BD FACSCanto II (BD Biosciences).

Northern blot analysis

RNA was prepared by pelleting 10 million cells and lysing them into 2 mL of proteinase K solution

(500 µg/mL proteinase K; 200 mM NaCl; 200 mM Tris-HCL pH 7,5; 1,5 mM MgCl2; 2% SDS) for 30 minutes

at 55˚C. mRNA was then isolated with 60 mg of oligo(dT) (Sigma) using microcentrifuge spin columns

(Ambion). Concentrated mRNA was quantified with absorbance at 260 nm on a NanoDrop 2000c (Thermo

Scientific) and the quality was verified on an agarose gel by residual 28S/18S contamination. 3 µg of mRNA

was separated on 1% agarose gels containing MOPS and 0,62 M formaldehyde, transferred to Immobilon-

NY+ nylon membrane (Millipore) by downward alkaline blotting and hybridized with human DMPK or

GAPDH 32P-labelled oligonucleotide probes. Probes were generated by random priming (NEBlot Kit – NEB)

of 100 ng of DMPK cDNA fragment (Bgl II-Sac I) or GAPDH cDNA PCR amplified fragments (Primers :

Forward 5’-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3’; Reverse 5’-TTCACACCCATGACGAACAT-3’). Overnight

48

hybridization was conducted at 65˚C in hybridization buffer (1X SSPE; 2X Denhart’s; 10% dextran sulfate;

1% SDS; 100 µg/mL salmon sperm DNA; probe 1 Mcpm/mL). Three 10 minutes washes where done at

65°C using 2X SSC/0,1% SDS for the first wash and 0,2X SSC/0,1%SDS for the last two. Relative

quantification of mRNA levels of autoradiograms was determined by densitometry with ImageJ 1.47v.

Immunocytochemistry - Fluorescent in situ hybridization (FISH)

Cells grown on gelatine coted coverslips were fixed with pre-chilled 50% acetone/50% methanol for

5 minutes at -20˚C. After 3% BSA blocking, coverslips were incubated at 37˚C for 1 hour with MB1a43 (MDA

Monoclonal Antibody Resource) mouse monoclonal IgG1 antibody against MBNL1 (¼ in 1X PBS/3% BSA).

Secondary antibody Alexa Fluor 488 goat α-mouse IgG (H+L) (Molecular Probes) was used at 4 µg/mL

followed by a 1 hour incubation at 37˚C. Cells sense ribonuclear inclusions were detected with a 5’-Cy3-

labelled (CAG)5 PNA probe (PNA Bio). Immunostaining was followed by a 4% PFA fixation and incubated

for 20 h at 37˚C in hybridization buffer (4 µg/µL E. coli tRNA; 5% dextran sulfate; 0,2% BSA; 2X SSC; 50%

formamide; 2 mM vanadyl ribonucleoside complex; 1 ng/µL PNA probe). The coverslips were washed twice

in 2X SSC/50% formamide for 30 min at 37˚C, stained with 5 µM DRAQ5 for nucleus visualization, mounted

on slides with Fluoromount (Sigma) and sealed with generic clear nail polish. Cells were examined under a

FluoView 300 confocal microscope (Olympus) using argon-ion 488 nm, HeNe 543 nm and HeNe 633 nm

lasers. Filter used were BA510IF + BA530RIF (Green), 605BP (Red) and BA660IF (Far-red) with a PlanApo

60X/1,4 oil ∞/0,17 objective. Quantifcation of FISH was performed using imageJ 1.47 software.

Quadriceps sense ribonuclear inclusions were detected on 10 µm thick transverse serial sections

with a 5’-Cy3-labelled (CAG)5 PNA probe (PNA Bio). Thawed cross sections were fixed in 4% buffered

formol (Microm Microtech) during 20 minutes, permeabilized in 1X PBS/2% acetone for 5 minutes, followed

by a 7 hours incubation at 44˚C with probe in RiboHybe reagent (VENTANA). After a 7 hour incubation at

44°C, nuclei were counterstained with Hoechst 14533 (Sigma) and slides were mounted with

VECTASHIELD H-1000 (Vector) mounting medium. Slide observations were performed using LSM 510

Meta confocal microscope (Zeiss) and detection of ribonuclear inclusions was performed using Discovery

Automaton (Roche) as previously described44. At least four transverse levels of every quadriceps specimen

were studied. Each cryosection was randomly subdivided into three areas to assess nuclear foci containing

cells to reach observation of >100 cells in each cryosection. Three quadriceps from different homozygous

DMSXL mice were used for control and 6 per treated condition. Image processing and analysis was

performed using ImageJ 1.41 software.

49

Experimental mice

All animal experiments were approved by the Institutional Animal Care and Use committees at the

CRCHU de Quebec and Isis Pharmaceuticals. DMSXL mice carry a 45-kb human genomic fragment that

includes the mutant DMPK gene with 1000-1600 CTG repeats. The homozygous DMSXL mice display

several features of DM1 such as high neonatal mortality, growth delay, mis-spliced preRNAs, decrease in

muscle strength and histological changes29.

Subcutaneous injection of ASOs

All ASOs were dissolved in phosphate buffered saline (PBS). Doses of 25 mg/kg (486178-cET) or

50 mg/kg (445569-MOE) were injected subcutaneously, twice a week in the interscapular region for 4 weeks

and then once a week for an additional 5 weeks. The selected doses were chosen based on dose-response

experiments in heterozygous DMSXL mice. Injection volumes ranged from 50-250 µl.

Real-time qPCR Assay

Total RNA was purified from liquid nitrogen flash frozen mice tibialis anterior, soleus, triceps,

quadriceps, latissimus dorsi, diaphragm, heart and brain. Isolation process started by a gross

homogenization of 25 mg of tissue in proteinase K solution (10 mM Tris-Cl pH 7,5; 10 mM EDTA; 2% SDS;

500 mM NaCl; 1,5 mM MgCl2; 500 µg/mL proteinase K) followed by complete homogenization with a

TissueLyser LT (Qiagen) using a ball bearing. After a 30 minutes incubation at 55˚C, standard QIAzol

(Qiagen) extraction protocol for tissues was performed along with RNA quantification on a NanoDrop 2000c

(Thermo Scientific) and finally, RNA integrity was verified on 2100 Bioanalyzer (Agilent). cDNA were then

produced using Quantitect Reverse Transcription (Qiagen) on 200 ng of RNA and qRT– PCR was used to

determine mRNA levels for hDMPK (Forward 5’-CCTATCGTTGGTTCGCAAAGT-3’; Reverse 5’-

CAAAAGCAAATTTCCCGAGTAA-3’) and mDMPK mRNA (Forward 5’-TTGTCCCCGAGGAAGCTCAG-3’;

Reverse 5’-TCGGAGACCCTCCCAATCAA-3’), with mHPRT1 (Forward 5’-

GTTGGATACAGGCCAGACTTTGT-3’; Reverse 5’-CACAGGACTAGAACACCTGC-3’), mRPL13A (Forward

5’-CCCTCCACCCTATGACAAGA-3’; Reverse 5’-CTGCCTGTTTCCGTAACCTC-3’) and mTBP (Forward 5’-

GCCTTCCACCTTATGCTCAG -3’; Reverse 5’-GCTACTGCCTGCTGTTGTTG-3’) RNAs as normalization

control, on an LightCycler 480 II (Roche) using SYBR Green I Master hot start reaction mix. At least 10

homozygous DMSXL mice were used per condition.

50

RT-PCR analysis of alternative splicing

Design of primer sets and targets for RBFOX1 and TTN mis-spliced event were previously

described (Chabot submitted). RBFOX1 forward primer sequence 5’-

TAGATGTTGAAATTATTTTTAATGAGCGAGG-3’ and reverse 5’-CATTTGTATAAGGGTTGACGGTCTTT-

3’; TTN forward primer 5’-AGGCCAAAAATTTCCGTGGC-3’ and reverse 5’-

AGGCTACTGTTAGAACTTTGCCT-3’. Total RNA was extracted using TRIzol and quantified using a 2100

Bioanalyzer (Agilent Inc. Santa Clara, CA, USA). A total of 2 μg of RNA was reverse transcribed using a mix

of random hexamers and oligo(dT) and the Omniscript reverse transcriptase (Qiagen, Germantown, MD,

USA) in a final volume of 20 μl. Twenty ng of cDNA were amplified with 0,2 U/10 μl of HotStarTaq DNA

Polymerase (Qiagen) in the buffer provided by the manufacturer and in the presence of the specific primers

(IDT) for each splicing unit (at concentrations ranging from 0.3 to 0.6 μM) and dNTPs. Targeted ASE

reactions were carried out in the GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

A first cycle of 15 minutes at 95˚C was followed by 35 cycles of 30 seconds at 94˚C, 30 seconds at 55˚C

and 1 minute at 72˚C. Thermocycling was concluded with an extension step of 10 minutes at 72˚C.

Visualization and analysis of amplified products were done using the LabChip HT™ DNA assay on a Caliper

LC-90 automated microfluidic station (Caliper, Hopkinton, MA, USA).

Transcriptome analysis by microarrays

RNA was isolated from HFN cells transfected at 125nM with both ASOs, using QIAzol (Qiagen)

and experiment/microarray were done in duplicates. DNA microarray analyses were carried out with

Affymetrix Human Gene 1.0 ST arrays according to the Affymetrix standard protocol. RNA from DMSXL

mice treated with 486178-cET was isolated from quadriceps using the proteinase K method. Six mice per

condition were separated into two pooled groups for analysis. DNA microarray analyses were carried out

with Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST arrays according to the Affymetrix standard protocol. Quantity of total

RNA was measured using a NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington,

DE, USA). Optical density values at 260/280 were consistently above 1.9. The total RNA quality was

assayed on an Agilent BioAnalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Briefly, total RNA (200

ng per sample) was labeled using the Affymetrix GeneChip® WT cDNA Synthesis and Amplification Kit

protocol, and hybridized to the arrays as described by the manufacturer (Affymetrix, Santa Clara, CA). The

cDNA hybridization cocktail was incubated overnight at 45°C while rotating in a hybridization oven. After 16

h of hybridization, the cocktail was removed and the arrays were washed and stained in an Affymetrix

GeneChip fluidics station 450, according to the Affymetrix-recommended protocol. The arrays were scanned

using the Affymetrix GCS 3000 7G and the Gene-Chip Operating Software (Affymetrix, Santa Clara, CA), to

51

produce the intensity files. The background subtraction and normalization of probe set intensities was

performed using the method of Robust Multiarray Analysis (RMA) described previously45. For Affymetrix

Human Gene 1.0 ST arrays, differentially expressed genes were identified by comparison of gene

expression intensity using a moderated t-test and a Bayes smoothing approach developed for a low number

of replicates46. To correct for the effect of multiple testing, the false discovery rate, was estimated from p

values derived from the moderated t-test statistics47. The analysis was performed using the affylmGUI

Graphical User Interface for the Limma microarray package48 and gene ontology analysis by GO enrichment

functionality of Partek Genomics Suite software. For Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST arrays, The CHP files

were imported and analyzed with the Transcriptome Analysis Console Software (Affymetrix, Santa Clara,

CA). Microarray analyses were performed by the CHU de Québec Research Center (CHUL) Gene

Expression Platform, Quebec, Canada.

Muscle fiber morphometry

Frozen transverse 10 µm serial sections of muscles were air-fixed on slides for 15 minutes and

incubated 1 hour in blocking solution (10% goat serum; 2% BSA; 1X PBS) at room temperature. Sections

were then incubated consecutively for 1 h each at 37˚C with 2 mouse monoclonal antibodies with different

isotypes directed against myosin heavy chain type 1 (BA-D5 at 0,52 µg/mL; IgG2b; DSHB ) and type 2a

(SC-71 at 0,98 µg/mL; IgG1; DSHB). Secondary antibodies were 2,5 µg/mL Cy3 rabbit anti-mouse IgG1

(Novus Biologicals) and 5 µg/mL Alexa Fluor 350 goat anti-mouse IgG2b (Molecular Probes). Slides were

mounted with Fluoromount (Sigma), fixed with generic clear nail polish and images were acquired with an

Eclipse TE300 (Nikon) microscope. Counts of muscle fibers positive for type 1 and 2a MHC were performed

using ImageJ 1.47v software.

Grip test

Mice grip strength was assessed using a Chatillon grip strength digital dynamometer (Columbus

Instruments) using a previously described protocol49. Briefly, while the mouse is suspended by the tail, the

forelimbs are placed on a grid and the mouse is gently pulled horizontally by the tail. Maximal strength

before release was recorded five times and the mean of the 3 strongest measurements were used as

forelimb grip strength.

52

Statistical analysis

All statistical analyses were performed using Microsoft Excel using one-tailed Student’s t-test with unequal

variance with a significance level set at 0,05 for foci reduction and DMPK RNA reduction. Two-tailed

Student’s t-test was used for mis-splicing correction and mice grip test.

Acknowledgements

We acknowledge the Bioimaging platform of the Infectious Disease Research Centre, funded by equipment

and infrastructure grants from the Canada Foundation for Innovation (CFI).

53

4.6. References

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57

4.7. Figure Legends

Figure 1- In vitro evaluation of 2’-O-methoxyethyl and 2’-4’ constraint ethyl ASOs in DM3200 cell

model of DM1.

a. ASOs targets on exon 15 of the hDMPK mRNA transcript variant 1 (Accession: NM_001081563 dated 07-07-2012). b. FISH

quantification of foci per nucleus reduction by ASOs treatment in DM3200 myoblast (n = 6 myotubes for each conditions, totals >

100 nuclei). c. Northern blot shows the presence of the normal and expanded hDMPK mRNA in DM3200 cells and the exclusivity of

the normal hDMPK mRNA in normal cells (HFN). Transfection of DM3200 cells with ASOs 486178-cET and 445569-MOE at 20 nM

greatly reduced normal and expanded hDMPK mRNA. d. Quantification of the reduction of DMPK mRNA from northern blot

autoradiograms (n = 2) e. Correction of percent splicing index of RBFOX1 and TTN, mis-spliced events characteristic of DM1. f.

Apoptosis and inflammation genes affected by a 1,5X fold change in normal cells (HFN) transfected at 250 nMwith ASOs 486178-

cET and 445569-MOE determined by microarray (n=2). Genes in black are downregulated by treatment and whites are upregulated.

* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Figure 2 – Systemic administration of 2’-O-methoxyethyl and 2’-4’ constraint ethyl ASOs in DMSXL

mouse model of DM1.

a. FISH quantification of foci per nucleus reduction by ASOs treatment in DMSXL mouse quadriceps (DMSXL n = 3; treated DMSXL

n = 9 per ASO; multiple sections throughout the muscle for each mice). b. hDMPK mRNA in transgenic DMSXL mice treated with

ASOs 486178-cET (25 mg/kg) and 445569-MOE (50 mg/kg) (DMSXL n = 11, 486178-cET n = 17 and 445569-MOE n = 7). Effect

was felt in skeletal muscles and heart, but not in the brain. c. Changes in mouse forelimb strength after treatment with by ASOs (WT

n = 24, DMSXL n = 15, 486178-cET n = 15 and 445569-MOE n = 7) d. Changes in mouse forelimb specific force after treatment by

ASOs (n = like previous in c) e. Reversal of DMSXL mouse quadriceps muscle fibers type 1/2a to WT proportions after treatment

with ASO 486178-cET. f. Correction of LBD3 exon 11 mis-splicing after treatment by ASO 486178-cET (WT n = 3, DMSXL n = 6,

486178-cET n = 4). g. Inflammation, necrosis, cell death and apoptosis genes affected by a 1,5X fold change in DMSXL mice

treated with ASOs 486178-cET as determined by microarray (n=6). Genes in black are downregulated by treatment and whites are

upregulated. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

59

4.8. Figures

Figure 1

60

Figure 2

61

4.9. Supplementary Information

Supplementary Figure 1 – Foci reduction by ASOs

FISH on DM3200 myoblasts transfected with ASOs. a. DM3200 shows a great abundance of nuclear retained

DMPK mRNA. b.c. Transfection with ASOs greatly reduces de presence of nuclear foci. Scale bar = 20 µm.

62

Supplementary Figure 2 – Redistribution of MBNL1 after treatment with ASOs.

MBNL1 immunostaining combined with FISH in myoblast. a. HFN myoblasts do not contain DMPK induced foci and MBNL1 is

homogeneously distributed inside nuclei and cytoplasm. b. DM3200 myoblasts shows sequestration of MBNL1 with nuclear foci and

loss of soluble MBNL1. c.d. ASOs transfected in DM3200 myoblasts induces degradation of expanded DMPK mRNA, which enables

MBNL1 redistribution throughout the nuclei. Scale bar = 20 µm.

63

Supplementary Figure 3 – Necrosis and apoptosis assays on HFN cells treated by ASOs.

a. b. No significant effect of ASOs on necrosis and apoptosis were measured 48 hours after treatment (n =2).

Supplementary Figure 4 - Foci reduction in DMSXL mouse quadriceps.

FISH on transverse section of DMSXL mouse quadriceps. Systemic injection of ASOs produces high enough intracellular levels in

muscle to reduce the presence of nuclear foci. cET chemistry of ASO 486178 shows a stronger effect than MOE ASO 445569 at half

the dose. White arrows are pointing the red foci. Scale bar = 20 µm.

64

Supplementary Figure 5 – Systemic administration of ASO 486178-cET in wild-type mice.

ASO 486178-cET sequence targets not only the hDMPK mRNA but also the mDMPK mRNA as shown by systemic injection (25 mg/kg)

in wild-type mice. Effect was felt in skeletal muscles, heart and brain (WT n = 7, treated WT n = 8). * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

65

Supplementary table 1

Significantly affected genes with a 2X fold change in HFN cells by 486178-cET ASO.

Gene Probe set

#

Ratio cET vs control

P-value cET vs control

GO molecular function

VTRNA1-1 8108627 2,91 3,75E-03 ---

ENST00000365378† 8050350 2,51 1,48E-03 ---

KITLG 7965322 2,30 3,86E-03 Cytokine activity

TYMS 8019842 2,22 7,16E-04 Nucleotide binding

RAB27B 8021301 2,14 7,48E-04 GTPase activity

ENST00000365072† 7965150 2,13 3,26E-05 ---

BMPR1B 8096511 2,11 2,50E-02 ---

KRTAP1-5 8019588 2,11 2,07E-03 ---

WDR63 7902660 2,08 6,05E-03 Protein binding

NOV 8148049 2,07 3,23E-03 Insulin-like growth factor binding

ENST00000363245† 8014704 2,07 2,01E-02 ---

PSTPIP2 8023043 2,06 3,34E-03 ---

LOC644714 8086538 2,06 1,03E-02 ---

CLCA2 7902702 2,05 7,51E-05 Chloride channel activity

ENST00000517021† 7996260 2,04 6,68E-03 ---

SPATA18 8095021 2,03 1,83E-04 Protein binding

IFI30 8026971 2,03 6,03E-04 Oxidoreductase activity

OLAH 7926334 2,01 2,49E-03 Hydrolase activity

DSG2 8020779 2,00 1,48E-03 Metal ion binding

DNAJB9 8135480 2,00 1,49E-03 Misfolded protein binding

TFPI2 8141016 2,00 2,93E-04 Extracellular matrix structural constituent

AHNAK2 7981514 0,50 5,25E-04 ---

ITM2C 8048995 0,50 2,65E-05 Beta-amyloid binding

ENST00000479754† 7947892 0,50 4,73E-02 ---

TMEM119 7966122 0,49 1,55E-04 Protein binding

ENST00000489584† 7992893 0,49 3,21E-02 ---

ATP2A1 7994463 0,49 9,86E-06 Calcium ion, ATP and protein binding

APOOL 8168580 0,49 5,16E-04 ---

HOXC9 7955865 0,47 3,09E-03 Sequence-specific DNA binding

MIR145 8109159 0,46 3,38E-03 ---

NEFM 8145361 0,46 2,63E-03 Structural constituent of cytoskeleton

TSR2 8167790 0,46 7,90E-04 Protein binding

PBX2 8083221 0,45 4,98E-05 DNA binding

PBX2 8125360 0,45 8,96E-04 Chromatin binding

FOXO4 8168205 0,44 1,24E-03 Nucleic acid binding transcription factor activity

66

MIR410 7976856 0,42 5,91E-03 ---

PYGM 7949124 0,41 8,65E-05 Glycogen phosphorylase activity

NES 7921088 0,37 2,07E-04 Structural molecule activity

MIR503 8175261 0,37 1,68E-05 ---

DMPK 8037657 0,35 2,88E-05 ---

MIR1-1 8063921 0,32 3,94E-04 ---

AK124536‡ 8144569 0,29 4,08E-02 ---

† Ensembl # ‡ GenBank #

67

Supplementary table 2 Significantly affected genes with a 2X fold change in DMSXL mice treated with 486178-cET ASO.

Gene Transcript

ID

Ratio cET vs control

P-value cET vs control

GO molecular function

--- 17338615 2,46 2,61E-02 ---

Odf3l2 17242644 2,14 2,20E-02 ---

Actr3b 17435505 2,10 2,29E-02 Nucleotide, actin and ATP binding

--- 17472630 2,07 2,66E-02 ---

Meg3 17543104 0,49 1,38E-02 ---

Nnat 17393764 0,48 1,18E-02 ---

Atp2a2

17452405

0,43

7,58E-03

Calcium-transporting ATPase activity, nucleotide, metal ion, ATP and protein binding

Tnni1 17217625 0,42 4,17E-02 Actin and metal ion binding

Tpm3 17399583 0,42 1,72E-02 Actin binding

Xist 17543785 0,40 9,59E-03 ---

Tnnt1 17485772 0,34 2,44E-02 Tropomyosin and troponin T binding

Ibsp 17439815 0,27 9,56E-03 ---

Dmpk 17474454 0,27 5,99E-04 Nucleotide binding, protein kinase activity.

Tnnc1 17298379 0,27 1,02E-02 Calcium ion, troponin T and actin filament binding

Myh7

17306577

0,22

1,30E-02

Microfilament motor activity, structural constituent of muscle, calmodulin binding and actin-dependent ATPase activity

Mmp13

17514482

0,18

4,91E-02

Metalloendopeptidase activity, metal ion binding And low-density lipoprotein particle receptor binding

69

Conclusion

En conclusion, les travaux effectués lors de cette maîtrise ont indirectement permis de valider que la

séquence, la longueur et la chimie des ASO sont des facteurs importants quant à leur l’efficacité chez les

souris DMSXL. De plus, il fut possible d’identifier un ASO ciblant la DMPK dans les muscles squelettiques et

bien toléré chez la souris. La caractéristique multisystémique de la DM1 implique toutefois la nécessité d’une

efficacité à plus large spectre. Bien qu’un effet fut ressenti au niveau du cœur, l’administration systémique de

l’ASO 486178-cET n’a pas su générer un effet significatif au niveau du cerveau, démonstration nous laissant

suggérer qu’un ASO n’est pas nécessairement optimal pour cibler tous les organes. Dans ce scénario, la

technique de criblage pourrait servir à identifier des ASO fonctionnels dans les différents organes du corps et

par conséquent, permettre l’utilisation d’un cocktail d’ASO afin d’obtenir un effet uniforme à travers

l’organisme.

Les études antérieures avec les ASO ont démontré une faible pénétration de la barrière

hématoencéphalique suite à une administration systémique192,193, indiquant qu’une stratégie différente au

niveau du cerveau pourrait être nécessaire afin d’y traiter les désordres cognitifs associés à la DM1. Parmi les

nouvelles technologies élaborées pour augmenter la distribution des ASO au cerveau, les vecteurs à

nanoparticules194,195 sont activement étudiés pour leur potentiel en tant que transporteur de molécules

thérapeutiques. La conjugaison de CPP aux ASO est aussi une stratégie envisagée dans le but de diriger les

antisens vers le cerveau et les chercheurs tentent d’identifier des peptides efficaces pour ce type de

transport196,197. Néanmoins, il est difficile de prévoir quand ces technologies seront disponibles, si elles le sont

un jour. À court terme, une solution efficace à la livraison encéphalique est l’administration intrathécale.

D’ailleurs, cette technique a déjà fait ses preuves pour le traitement de l’atrophie musculaire spinale infantile

(SMA) où l’ASO ISIS-SMNRx a complété avec succès une étude clinique de phase II198. Il serait possible de

tester son application dans la DM1 par l’administration intraventriculaire de l’ASO 486178-cET chez la souris

DMSXL.

Les autres questions à résoudre pour compléter l’évaluation de l’ASO 486178-cET sont la

détermination de la dose optimale et la fréquence de traitement nécessaire afin d’obtenir un effet continu. Une

étude toxicologique complète de cet ASO chez le singe cynomolgus fut effectuée en parallèle par Isis

Pharmaceuticals et a donné des résultats suffisant pour le déclenchement d’une évaluation en phase clinique I

sous le nom d’ISIS-DMPKRx le 9 juin 2014140. Finalement, les travaux présentés dans ce mémoire sont les

premiers résultats précliniques d’une thérapie génique pour le traitement de la DM1 basée sur l’élimination de

l’ARNm toxique. En somme, les nouvelles générations de modifications chimiques d’ASO gapmers ouvrent les

portes au développement de thérapies géniques basées sur la sous-expression d’ARNm.

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