PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

EFECTO DEL USO, MANEJO Y REGIÓN GEOGRÁFICA SOBRE LOS GENES

DEL CICLO DE CARBONO Y NITRÓGENO DE LA COMUNIDAD MICROBIANA

EDÁFICA EN DOS REGIONES DEL VALLE DEL CAUCA

CINDY JOHANNA NIÑO CAMACHO

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

DIRECTOR ZIV ARBELI PhD.

CODIRECTOR ALEJANDRO CARO QUINTERO PhD.

BOGOTA D.C.

COLOMBIA

2019

NOTA DE ADVERTENCIA

"La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia".

Artículo 23 de la Resolución No13 de Julio de 1946.

EFECTO DEL USO, MANEJO Y REGIÓN GEOGRÁFICA SOBRE LOS GENES DEL

CICLO DE CARBONO Y NITRÓGENO DE LA COMUNIDAD MICROBIANA

EDÁFICA EN DOS REGIONES DEL VALLE DEL CAUCA

CINDY JOHANNA NIÑO CAMACHO

APROBADO

CONCEPCIÓN PUERTA B. PhD ALBA ALICIA TRESPALACIOS Ph.D.

DECANA DIRECTORA DEL POSGRADO

FACULTAD DE CIENCIAS FACULTAD DE CIENCIAS

DEDICATORIA

Es mi deseo como sencillo gesto de agradecimiento, dedicarle mi Trabajo de Grado, a mis padres Pedro y Eudalia, mis hermanos Laura y Santiago y mi tía Martha por brindarme la confianza, consejos, oportunidad y recursos para lograrlo, por estar siempre en esos momentos difíciles.

AGRADECIMIENTOS A la Pontificia Universidad Javeriana y toda su planta de docente, a mi Director Ziv Arbeli y mi codirector Alejandro Caro por la dedicación y apoyo que ha brindado a este trabajo, por el respeto a mis sugerencias e ideas y por la dirección y el rigor que ha facilitado a las mismas, por su orientación y atención a mis consultas sobre metodología, gracias por la confianza ofrecida. Al grupo de investigación USBA y sus integrantes por recibirme, ofrecerme sus instalaciones y ayudarme en la realización de este proyecto. Gracias a mi gran amigo Julián quien siempre me ha prestado un gran apoyo moral y humano, necesarios en los momentos difíciles de este trabajo y esta profesión. Gracias a Mario Leandro y Juliana por toda su colaboración en el final de este proceso. Por, sobre todo, gracias a mis padres, a mis hermanos Laura y Santiago y a mi tía Martha, por su paciencia, comprensión y solidaridad con este proyecto.

RESUMEN

La intensificación de las actividades agrícolas y pecuarias asociada a la creciente demanda mundial de alimentos conducen a cambios en la estructura física y bioquímica de los suelos, como resultado de la adopción de monocultivos y la simplificación de las interacciones biológicas. Esto desencadena en la reducción de la biodiversidad y aumento en la emisión de gases de efecto invernadero. Una de los indicadores de degradación del suelo es la pérdida de la diversidad y de funciones de las comunidades microbianas. En la última década se han empleado como más frecuencia las técnicas de secuenciación de ADN para explorar la composición y función microbiana del suelo, como la secuenciación de marcadores moleculares para evaluar la composición taxonómica (e.g., 16S rARN) y secuenciación metagenómica por shotgun para estudiar los genes funcionales de las comunidades y su potencial funcional. No obstante, la secuenciación metagenómica shotgun del suelo es difícil debido a la mega diversidad de las comunidades microbianas del suelo que requiere de una altísima inversión económica en cuanto a secuenciación y hace imposible emplear esta técnica de forma frecuente en los estudios de suelo. En los últimos años se han desarrollado metodologías como el PICRUSt que permiten realizar predicciones funcionales de genes a partir de secuencias de 16S rARN. Estas herramientas basan sus predicciones en la presencia de genomas completos y disponibles relacionados cercanamente a los taxones identificados por el 16S rRNA. En consecuencia, estos métodos funcionan mejor en ambientes con alto número de genomas secuenciados como los estudios del microbioma del ser humano que en estudios con poca representatividad en las bases de datos como los estudios del suelo. Por lo tanto, el presente estudio pretende establecer si las herramientas de predicción como PICRUSt pueden ser utilizadas en suelo para establecer el potencial funcional de las comunidades microbianas y así establecer el efecto del uso y manejo del suelo en la composición y funciones microbianas. Para esto se comparó la predicción de genes por PICRUSt con datos de secuenciación metagenómica. Una vez establecidas que funciones poseen una alta correlación entre la predicción y el metagenoma se evaluó el efecto de distintos usos y manejos agrícolas sobre dichas funciones. Para establecer el efecto de estas prácticas en el suelo como un paso importante para diseñar mejores prácticas agrícolas a futuro. En el presente trabajo se utilizaron datos de secuenciación que fueron obtenidos en un trabajo de grado anterior. Estos datos se obtuvieron a partir de muestras de suelo colectadas en dos regiones del departamento de Valle del Cauca, Colombia, con diferentes usos y manejo del suelo: silvopastoril intensivo, pasto convencional, caña de azúcar con manejo convencional y agroecológico y bosque seco tropical. PICRUSt predijo 12111 anotaciones funcionales, mientras que el análisis metagenómico identificó solo 6188 anotaciones funcionales. La correlación de Spearman entre la abundancia de todos los genes obtenidos por PICRUSt y por secuenciación metagenómica

fue relativamente baja. Esta misma correlación para los genes relacionados con los ciclos de Nitrógeno, Carbono fue considerablemente más alta. Además, se calculó el Índice de Taxón Secuenciado Más Cercano (NSTI), que está relacionada con la incertidumbre de predicción, varían entre 0.25 y 0.05 en los diferentes sitios de muestreo. Para evaluar el efecto del uso y manejo del suelo, así como la región geográfica sobre la abundancia de genes funcionales, se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA), para mostrar el ordenamiento de las muestras en los ciclos de carbono y nitrógeno, además se realizó un análisis estadístico PERMANOVA para determinar los efectos del uso, manejo y región sobre los mismos ciclos. Asimismo, se comparó la abundancia de diferentes genes de los ciclos del nitrógeno y carbono. Se observó una agrupación de todos los genes por manejo y región en la predicción de PICRUSt. En el ciclo del nitrógeno se encontró una separación representativa por región, en el ciclo del carbono se observó una separación entre los suelos de bosques y suelos intervenidas. Las abundancias de genes relacionados con la metanógenesis fueron mayores en sistemas con manejo convencional y bajo en sistemas con manejo agroecológico con un valor P significativo de 0.016, en el metabolismo de carbohidratos valores altos en bosque y todos los sistemas de El Cerrito con valor P 0.001. En oxidación de metano no se encontraron diferencias significativas. En la fijación de carbono valores altos en Bosque y cañas y bajos en silvopastoril y Pasturas, encontrando diferencias significativas del uso del suelo con valor P 0.0186. En cuanto al ciclo del nitrógeno, la fijación de nitrógeno se encontró valores altos en los sistemas de El Cerrito y bajos en Bugalagrande, concordando con diferencias significativas en cuanto a región valor P 2e-16. En reducción asimilatoria de nitratos fue alta en bosque, seguido por altos en manejo agroecológico y bajos en manejo convencional validado por la diferencia significativa del manejo del suelo valor P 0.0034. En la nitrificación se encontró valores bajos en suelos con uso de ganadería y altos en cañas y bosque, afirmando resultados de diferencia significativa del uso del suelo valor P 0.012. Por último, en la desnitrificación los valores fueron muy variables concordando con los resultados de análisis estadísticos donde no se encontró diferencia significativa. PALABRAS CLAVES: Metagenómica, PICRUSt, agroecológico y agricultura convencional

SUMMARY The intensification of agricultural and livestock activities associated with the growing global demand for food, leads to changes in the physical and biochemical structure of soils, because of the adoption of monocultures and the simplification of biological interactions. The reduction of biodiversity and an increase in the emission of greenhouse gases. One of the indicators of soil degradation is the loss of diversity and functions of microbial communities. In the last decade, DNA sequencing techniques have been used more frequently to explore soil composition and microbial function, such as molecular marker sequencing to assess taxonomic composition (eg, 16S rRNA) and metagenomic sequencing by shotgun to study functional genes of the communities and their functional potential. However, the shotgun metagenomic sequencing of the soil is difficult due to the mega diversity of the microbial communities of the soil that requires a very high economic investment in terms of sequencing and makes it impossible to use this technique frequently in soil studies. In recent years, methodologies such as PICRUSt have been developed that allow functional predictions of genes from 16S rRNA sequences. These tools base their predictions on the presence of complete and available genomes closely related to the taxa identified by the 16S rRNA. Consequently, these methods work better in environments with a high number of sequenced genomes such as human microbiome studies than in studies with little representation in databases such as soil studies. Therefore, the present study aims to establish whether prediction tools such as PICRUSt can be used in soil to establish the functional potential of microbial communities and thus establish the effect of soil use and management on microbial composition and functions. For this, the prediction of genes by PICRUSt was compared with metagenomic sequencing data. Once established which functions have a high correlation between prediction and metagenome, the effect of different agricultural uses and management on these functions was evaluated. To establish the effect of these practices on the soil as an important step to designing better agricultural practices in the future. In the present work, sequencing data were used that were obtained in a previous grade work. These data were obtained from soil samples collected in two regions of the department of Valle del Cauca, Colombia, with different uses and soil management: intensive silvopastoral, conventional grass, sugarcane with conventional and agro-ecological management and tropical dry forest. PICRUSt predicted 12111 functional annotations, while the metagenomic analysis identified only 6188 functional annotations. Spearman's correlation between the abundance of all genes obtained by PICRUSt and by metagenomic sequencing was relatively low. This same correlation for the genes related to the nitrogen, carbon cycles was considerably higher.

In addition, the Nearest Sequenced Taxon Index (NSTI), which is related to the uncertainty of prediction, was calculated varying between 0.25 and 0.05 at different sampling sites. To assess the effect of land use and management, as well as the geographic region on the abundance of functional genes, a principal coordinate analysis (PCoA) was performed, to show the ordering of the samples in the carbon and nitrogen cycles, in addition A PERMANOVA statistical analysis was performed to determine the effects of use, management, and region on the same cycles. Likewise, the abundance of different genes of the nitrogen and carbon cycles was compared. A grouping of all genes by management and region was observed in the prediction of PICRUSt. In the nitrogen cycle, a representative separation by region was found, in the carbon cycle a separation between forest soils and intervened soils was observed. The abundances of genes related to methanogenesis were higher in systems with conventional management and low in systems with agroecological management with a significant P value of 0.016, in carbohydrate metabolism high values in the forest and all El Cerrito systems with P-value 0.001. In methane oxidation, no significant differences were found. In the fixation of carbon high values in Forest and reeds and low in silvopastoral and Pastures, finding significant differences in land use with P-value 0.0186. Regarding the nitrogen cycle, nitrogen fixation was found high in El Cerrito systems and low in Bugalagrande, agreeing with significant differences in value region P 2e-16. In the assimilatory reduction of nitrates was high in the forest, followed by high in agroecological management and low in conventional management validated by the significant difference in soil management value P 0.0034. In nitrification, low values were found in soils with the use of livestock and high in reeds and forest, affirming results of significant difference in land use value P 0.012. Finally, in denitrification, the values were very variable according to the results of statistical analysis where no significant difference was found. KEYWORDS: Metagenomics, PICRUSt, agroecological and conventional

1. INTRODUCCIÓN

La agricultura convencional ha conducido a procesos de degradación del suelo, dentro de

los cuales se encuentran la pérdida de materia orgánica, erosión, inundaciones,

salinización, deslizamientos, compactación y contaminación (Acosta et al., 2010; Allison

et al., 2005; Meyer et al., 2008) Es el suelo, el requisito más esencial para la producción

de alimentos, y es así que existe gran debate sobre su uso y sostenibilidad, particularmente

en relación a la agricultura.

La sostenibilidad del suelo hace referencia a la conservación de los recursos naturales.

Dado que la población mundial va en aumento, los sistemas alternativos deben ser

altamente productivos, y de no cumplirse, esto conlleva a mayor desplazamiento de

ecosistemas naturales. Una alternativa que se ha dado para tratar de mitigar los efectos

del manejo convencional es la implementación de manejos de tipo agroecológico como

los sistemas de cultivo de caña agroecológica y silvopastoril, con la intención de

disminuir o evitar la degradación del suelo coadyuvando a la conservación de sus

características iniciales (Garrigues et al., 2012; Vallejo et al., 2010).

Los microorganismos del suelo son componentes integrales de una amplia gama de

procesos ecosistémicos, incluidos el ciclo de nutrientes, el almacenamiento de carbono

en el suelo, la producción de gases de efecto invernadero, la degradación de xenobióticos

y contaminantes, al igual que del mantenimiento de su estructura (Xue et al., 2010;

Groffman y Bohlen, 1999). A pesar de su importancia, las interacciones microbianas no

suelen ser fáciles de clasificar. Se han realizado estudios extensos sobre él cuáles y qué

tipo de microorganismos son más abundantes o diversos en suelo de acuerdo a los

cambios de factores ambientales y el uso de suelo (Lovera & Cuenca, 2007; León-

Gamboa et al., 2010; Wagg et al., 2014). Sin embargo, aún no se cuenta con el suficiente

conocimiento para elaborar modelos predictivos, ni para entender cómo el cambio en la

comunidad microbiana afecta la función del suelo.

El estudio de la influencia de la comunidad microbiana sobre el suelo, ha sido complejo

y es por tanto que se hace necesario el uso de herramientas moleculares para su análisis,

tales como análisis filogenéticos basados en 16 ARNr y secuenciación metagenómica

(Elsacker, 2011). Estos generan miles de datos, por lo que el esfuerzo para el análisis de

los datos ha conllevado su vez al uso de herramientas bioinformáticas como es el caso de

QIIME (Quantitative Insigths Into Microbial Ecology), MG RAST (Metagenomic Rapid

Annotations) (Liu, et al., 2013) y muchas más. Uno de los últimos avances

bioinformáticos que permiten utilizar información de la mayoría de bases de datos

genómicas es PICRUST (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction

of Unobserved States), este, es un programa que partir de datos de 16S ARNr, y por medio

de algoritmos busca genomas de referencia publicados en todas las bases del mundo y

predice el metagenoma de una amplia gama de muestras asociadas a diferentes ambientes.

La exactitud de la predicción depende de los genomas de referencia que estén incluidos

en las bases de datos por esto el programa ha sido usado en gran medida en muestras de

microbiomas humanos y en muestras de cultivo de suelo en donde existe una gran

variedad de genomas de referencia (Langille et al., 2013).

En Colombia, en la región del Valle del Cauca, se han establecido sistemas

agroecológicos como la caña orgánica y los sistemas silvopastoriles intensivos

(policultivos). De hecho los sistemas silvopastoriles intensivos se han desarrolladas en

Colombia y México, donde la reserva natural El Hatico (El Cerrito, Valle del Cauca) fue

unas de las fincas pioneras de establecer estos sistemas y se convirtió en un modelo con

numerosos estudios (Calle et al., 2012, 2013; Vallejo 2010, 2012; Cubillos 2016) En

donde se ha evaluado el efecto de las propiedades fisicoquímicas sobre actividades

enzimáticas al compararlo con un sistema de pastura convencional mostrando como

resultados un aumento de las actividades enzimáticas en los sistemas silvopastoril de 12

años, además se concluye que los sistemas silvopastoriles promueven la sostenibilidad

del ecosistema al mejorar la capacidad de los suelos para realizar la descomposición y

mineralización de nutrientes resultado reflejado por las actividades hidrolíticas (Vallejo

et al., 2010). En otros estudios en la misma región se ha estudiado el impacto de la

conversión de pasturas convencionales a sistemas silvopastoriles, en las comunidades

microbianas del suelo y las propiedades fisicoquímicas del suelo por medio de perfiles

FAME, indicando que la estructura y la composición de la comunidad microbiana del

suelo cambian según los sistemas de manejo del suelo (Vallejo et al., 2012). En resultados

de Cubillos et al, 2016 estudio realizado en la misma zona se encontró que las huellas

digitales de electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) del gen 16S ARNr

y el gen amoA indicaron que las comunidades de bacterias del suelo variaron entre usos

del suelo, con mayores similitudes entre bosque y silvopastoril en comparación con

pasturas convencionales. Un último estudio realizado en esta zona por Sáenz, 2014 (datos

no publicados) evaluó el efecto del uso del suelo en dos regiones del Valle del Cauca

sobre las comunidades microbianas por medio de 16S ARNr de sistemas de pastoreo y

cultivos de caña en donde encontró que la estructura y composición de las comunidades

microbianas se ve afectada por el uso del suelo más que por el manejo y la región, además

realizó un análisis metagenómico en solo 12 muestras por lo tanto estos datos no fueron

usados por la falta de réplicas.

Este trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto del uso (ganadería, caña de azúcar y

bosque seco tropical) y manejo (convencional vs agroecológico) del suelo sobre la

abundancia de genes implicados en los ciclos de carbono y nitrógeno en el Valle del

Cauca y así aportar al conocimiento para de pronto en el futuro resolver los siguientes

preguntas: ¿Cómo las diferentes prácticas y usos agrícolas modifican el potencial

funcional de los microorganismos del suelo? y como estos cambios afectan la fertilidad y

la sostenibilidad del suelo.

2. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE

2.1. Efecto de la agricultura sobre el suelo

La actividad agrícola es uno de los problemas más extendidos del siglo XXI (Vermeulen

et al., 2012). Para seguir el ritmo de la creciente población humana, el área total de tierras

cultivadas en todo el mundo ha aumentado más del 500% en las últimas cinco décadas,

con un aumento del 700% en el uso de fertilizantes (Elsacker et al., 2011). La

intensificación agrícola ha planteado una amplia gama de problemas ambientales, que

incluyen una pobre eficiencia en el uso de nutrientes, mayores emisiones de gases de

efecto invernadero, eutrofización de aguas subterráneas, degradación de la calidad del

suelo y erosión del suelo (Calle & Murgueitio, 2013).

El uso del suelo para la agricultura conduce a la pérdida de carbono orgánico, una menor

cobertura y profundidad de las raíces, además de presión física por el pisoteo constante

del ganado, en sistemas de ganadería, lo cual, produce cambios en la estructura del suelo,

genera compactación, disminución en la estabilidad de los agregados, en la porosidad del

suelo, la aireación, la capacidad de infiltración, acelerando los procesos de erosión, y

deterioro de la calidad y fertilidad del suelo (Jangid et al.,2008).

Los sistemas agrícolas alternativos como los sistemas agroecológicos, los cuales se han

planteado para mitigar el efecto de la agricultura al cambio climático. Dado que las

prácticas agroecológicas incluyen una integración de varias herramientas, labranza

reducida, no uso de fertilizantes sintéticos ni pesticidas y diversidad de cultivos como

sistemas silvopastoril en donde se integran pastos, hierbas y árboles lo cual aporta

beneficios a los suelos mejorando el ciclo de nutrientes y las interacciones biológicas,

aumenta la fertilidad del suelo y reduce las emisiones del dióxido de carbono, óxido

nitroso y metano (Fromin et al., 2002). Estos sistemas se han acogido para tratar de

mantener la sostenibilidad ambiental y los servicios de los ecosistemas,

Dentro de algunos ejemplos de sistemas de agricultura convencional y agricultura

agroecológica se encuentran:

2.1.1. Cultivos de Caña

Los cultivos de caña convencional que utiliza el arado, fertilizantes inorgánicos,

plaguicidas y la quema de los residuos de cultivos tienen efectos negativos sobre las

reservas de carbono, los agregados del suelo, la estructura del suelo, la compactación, la

biomasa, las actividades enzimáticas, y la fertilidad (Galdos, et al., 2009). El manejo

agronómico ecológico de la caña de azúcar se diferencia en que los residuos cortados no

son quemados y se introducen al suelo junto con los residuos del bagazo como abono para

posteriores cultivos. Como consecuencia, se aumenta el contenido de carbono del suelo

y se disminuyen el uso de fertilizantes inorgánicos.

2.1.2. Sistemas Silvopastoriles

Los sistemas silvopastoriles intensivos son un ejemplo de sistemas agroecológicos.

Fueron desarrollados en Colombia y México como respuesta a problemas ambientales y

a la baja sostenibilidad de las actividades ganaderas convencionales. Estos sistemas

intensivos integran árboles y altas densidades de arbustos y hierbas, mientras que las

entradas de labranza y agroquímicos no son necesarias (Pezzopane et al., 2019; Plieninger

& Huntsinger 2018; Cubillos et al., 2012;). La introducción de árboles y arbustos para

sistemas de pastoreo aumenta la biomasa por encima y por debajo del suelo lo que

proporciona mayor entrada de material orgánico y otros nutrientes, estos además mejoran

la estructura del suelo (Pezzopane et al., 2019). Los sistemas silvopastoriles mejoran las

propiedades del suelo, reducen la necesidad de fertilizantes externos, pesticidas y riego,

a la vez contribuyen al secuestro de carbono, además de reducir al mínimo el estrés

generado por el ganado y preservar la biodiversidad del suelo (Drenovsky et. al., 2014).

2.2. Importancia de los microorganismos en el suelo

Las comunidades microbianas desempeñan un papel indispensable en los ecosistemas y

prestan una amplia gama de servicios. En los agroecosistemas, los microorganismos

modulan una serie de procesos, incluidos el ciclo de nutrientes, la descomposición de la

materia orgánica, la estabilización de agregados del suelo, las interacciones simbióticas y

patógenas con las plantas, por lo tanto, desempeñan un papel esencial en la productividad

y la sostenibilidad de los agroecosistemas (Bender et al., 2016). La actividad agrícola con

alto uso de recursos y baja diversidad de cultivos puede afectar los microorganismos

asociados con el suelo y la planta, y por consiguiente impactar los servicios de los

ecosistemas (Bender et al., 2016).

Los ciclos biogeoquímicos son las vías a través de las cuales los nutrientes y los minerales

se utilizan, reciclan o almacenan en el suelo. Varios macro y micronutrientes han sido

identificados como cruciales para la salud del suelo y las plantas; algunos de ellos son:

Nitrógeno, Fósforo, Potasio, Calcio, Magnesio y Azufre (macronutrientes), Boro, Cobre,

Hierro, Cloruro, Manganeso, Molibdeno y Zinc (micronutrientes). Estos nutrientes se

clasifican como "micro" o "macro" dependiendo de las concentraciones que se consideran

necesarias para apoyar el crecimiento de las plantas (Leff et al., 2018).

Las actividades enzimáticas del suelo pueden proporcionar una instantánea de los

procesos funcionales que ocurren en él, pero no siempre es evidente qué microorganismos

son responsables de estos procesos. Los métodos microbiológicos y filogenéticos para la

identificación de especies microbianas, por lo tanto, van de la mano con las mediciones

de la actividad enzimática y proporcionan una vista más detallada del funcionamiento del

microbioma del suelo.

2.3. Efecto del uso del suelo sobre la comunidad edáfica del suelo

El cambio en el uso de la tierra es uno de los principales trastornos ambientales a nivel

mundial, que contribuye en gran medida al cambio climático, la pérdida de servicios de

los ecosistemas y la diversidad de especies microbianas. La conversión del uso de la tierra

se ha considerado como una actividad antropogénica intensiva que altera en gran medida

el funcionamiento del ecosistema del suelo.

Las prácticas de manejo y uso del suelo pueden influir en los roles funcionales de los

microorganismos del suelo mediante la modificación de la cantidad y calidad de los

insumos de materia orgánica, por ejemplo las prácticas agrícolas intensivas contribuyen

a la pérdida de la materia orgánica del suelo, causa problemas ambientales como la

erosión del suelo, la desertificación, eutrofización lo cual altera las actividades

microbianas y, en última instancia, afecta la calidad del suelo ( Deng et al., 2018; Ghoshal,

2017).

La variación de los tipos de residuos de plantas, como hojarasca y raíces finas, la dinámica

de nutrientes (e.g., carbono orgánico y el nitrógeno) y la composición de especies de

plantas durante los cambios en los usos del suelo, son factores determinantes en la

cantidad y calidad de las entradas de sustratos al suelo. Estos factores a su vez afectan la

dinámica de la comunidad microbiana (Zhao et al., 2014).

Los estudios de metagenómica del suelo están aumentando en todo el mundo y han

ayudado a determinar la potencial función de los microorganismos en el suelo. Los

perfiles metabólicos encontrados en algunos estudios han demostrado que el tipo de

manejo agrícola afecta el metabolismo de aminoácidos y carbohidratos, lípidos e

isoprenoides en el suelo (Fierer et al., 2012).

2.4. Herramientas moleculares y bioinformáticas que ayudan a evaluar la

diversidad funcional de los microorganismos

Los métodos tradicionales para medir la actividad microbiana en el suelo involucran

estimaciones de biomasa utilizando técnicas como la fumigación-incubación, la

fumigación-extracción y la respiración inducida por sustrato o la extracción (Sparling et

al, 1981; Oades & Jenkinson 1979) Estos métodos proporcionaban información sobre la

abundancia y la actividad de comunidades microbianas en un hábitat (Taylor et al., 2002).

Pero muchos de estos métodos bioquímicos de estimación de la biodiversidad microbiana

han sido reemplazados por los moleculares. Estas técnicas se centran en clasificar

microorganismos según su contenido genómico y no propiedades fisiológicas o

bioquímicas.

La reasociación e hibridación de ADN fue uno de los primeros métodos moleculares

utilizados para la identificación de especies y sirvió como estándar para definiciones

posteriores de identidad de secuencia y delimitación de especies. Este método se basa en

que la tasa de reasociación del ADN desnaturalizado dependerá de la similitud de las

secuencias presentes. Bajo condiciones específicas, el valor de media asociación del ADN

puede usarse como un índice de diversidad (Cho & Tiedje, 2001)

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR, permitió el desarrollo de varias técnicas

moleculares para evaluar la diversidad y la función microbiana que involucraron la

clonación o amplificación de regiones específicas de ADN procariota. Una de las técnicas

más populares en esta categoría es la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante o

DGGE. El ADN extraído de muestras de suelo se une a una pinza GC de 35-40 pb y se

separa en un gel de poliacrilamida con una concentración creciente de desnaturalizantes,

esto permite que el ADN se desnaturalice y se funda en dominios específicos de secuencia

que luego migran diferencialmente a través del gel (Muyzer et al., 1993).

Otra herramienta que utiliza polimorfismos de ADN procarióticos es el polimorfismo de

longitud de fragmentos de restricción (RFLP). El ADN ribosomal amplificado por PCR

se digiere con una enzima de restricción de corte par de 4 bases. Se detectan diferentes

longitudes de fragmentos utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida de agarosa o

no desnaturalizante, y estos patrones de bandas se usan para identificar cambios en la

estructura de la comunidad bacteriana (Liu et al., 1997). Esto permite un patrón de bandas

más simple, así como una mejor resolución taxonómica, ya que cada banda etiquetada

puede considerarse como una unidad taxonómica-OTU (Tiedje et al., 1999).

El gen 16S ARNr es quizás la herramienta más popular utilizada para la identificación

taxonómica de microorganismos en estudios ambientales, debido a una variedad de

razones. La combinación de tecnología de secuenciación rentable y la importancia

taxonómica del gen 16S ARNr son responsables de un progreso sin precedentes en el

campo de la ecología microbiana del suelo.

Actualmente se utilizan diferentes herramientas bioinformáticas para el análisis de datos

metagenómicos microbianos, los más comunes son MG-RAST o MetaGenomic Rapid

Annotation (Meyer et al., 2008), MEGAN o MEtaGenome ANalyzer (Huson et al., 2007)

QIIME o Quantitative Insights Into Microbial Ecology) (Caporaso et al., 2011). Una de

los últimos avances en herramientas bioinformáticas que permiten predecir el potencial

funcional a partir de la filogenia de los microorganismos es PICRUST, el cual predice

metagenomas a partir de 16S, de una amplia gama de muestras asociadas a diferentes

ambientes, basa sus predicciones en genomas de referencia publicados (Langille et al.,

2013). PICRUST por medio de algoritmos, predijo el metagenoma del microbioma

humano, al compararlos con los datos metagenómicos, se observó que la predicción tiene

resultados confiables (Langille et al., 2013). Además para el desarrollo de predicciones

de metagenomas del suelo, ecosistemas marinos, entre otros, en donde los genomas de

referencia son muy pocos, PICRUST desarrollo el índice de taxones secuenciado más

cercano (NSTI), el cual permite cuantificar la disponibilidad de representantes de

genomas más cercanos para cada muestra del microbioma, el NSTI suma las distancias

filogenéticas para cada organismos de la tabla OTU a su pariente más cercano con un

genoma de referencia secuenciado (Langille et al., 2013).

3. OBJETIVOS

3.1. General

Evaluar el efecto del uso (ganadería, caña de azúcar y bosque seco tropical), manejo

(convencional vs agroecológico) y la región geográfica del suelo sobre la abundancia de

genes implicados en los ciclos de carbono y nitrógeno en dos regiones del Valle del

Cauca.

3.2. Específicos

● Evaluar la exactitud de la predicción de PICRUSt del metagenoma del suelo

● Evaluar el efecto del uso (sistemas de pastoreo y cultivos de caña de azúcar) y manejo

(convencional vs agroecológico) y la región geográfica del suelo sobre la abundancia

de genes implicados en los ciclos del Nitrógeno y Carbono.

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Diseño Experimental

Las muestras fueron recolectadas en el departamento del Valle del Cauca, en los

municipios de: El Cerrito y Bugalagrande, donde se llevó a cabo dentro y alrededor de la

reserva natural “El Hatico” (N 3º 38’ 39”, W 76º 19’ 12”), y la finca agroecológica “La

Lucerna” (4º 14’ 54”, W 76º 8’ 40”) respectivamente. Estas se encuentran a una distancia

aproximada de 75 kilómetros entre sí (Figura 1).

Fig. 1. Ubicación de las dos fincas del Valle del Cauca.

La abundancia de genes implicados en los ciclos de carbono y nitrógeno fue evaluada en

cinco distintos usos del suelo: sistemas silvopastoril intensivos, pasturas convencionales,

caña de azúcar ecológica, caña de azúcar convencional y bosque seco tropical. En cada

municipio, se contó con 3 parcelas físicamente separadas (3 réplicas) de cada tratamiento

(salvo caña convencional en Bugalagrande, en donde se tomaron dos réplicas).

Adicionalmente se tomaron 3 muestras de suelo de un bosque seco tropical en El Cerrito

como referencia de suelo sin intervención agrícola esto a que existe solo un bosque en El

Cerito (y no hay uno en Bugalagrande), este fue dividido en tres franjas, para así obtener

tres muestras (Sáenz, 2014) (Figura 2).

Se describen a continuación cada uno de los tratamientos

4.1.1. Bosque Seco tropical

El bosque seco tropical de más de 80 años de edad, ocupa 14 ha en la finca “El Hatico”,

ubicada en el Municipio de El Cerrito, en donde la comunidad vegetal que predomina el

paisaje pertenece a: Anacardium escelsum, Ficus sp, Bombacopsis sp., Myrcia

popayamensis y Ceiba pentandra. Este fue dividido en tres franjas. Desde la zona sur

hasta la zona norte, para así obtener tres muestras (Sáenz, 2014).

4.1.2. Pastura con manejo convencional

Las pasturas convencionales muestreadas en los municipios de Cerrito y Bugalagrande

están compuestas de monocultivos de pastos los cuales en época de lluvia reciben

adiciones de fertilizantes del tipo NPK combinado con estiércol y se aplican herbicidas

como Picloran para controlar malezas. Las pasturas se encontraban en descanso del

pastoreo de toro de lidia (El Cerrito) y ganado lechero (Bugalagrande), las muestras

fueron tomadas fuera del dosel de los árboles presentes en el terreno en baja densidad

(Sáenz, 2014).

4.1.3. Sistemas silvopastoril intensivo (manejo agroecológico)

Los sistemas silvopastoriles tenían edades intermedias de establecimiento entre 10-12

años según estudios previos de clasificación (Vallejo et. al., 2010; Vallejo et. al., 2012).

El estrato inferior de los sistemas se compone de las poáceas: Cynodon plectostachyrus y

Paniccum maximum var tanzania y Mombasa. El nivel intermedio es un sotobosque de

arbustos de Leucaena leucocephala (10.000 por hectárea), con una distancia de 1,3 m

entre los surcos, El estrato superior se compone de árboles nativos, que han quedado

dentro de los sistemas, dentro de estos sistemas pastan de 4-7 cabezas /ha de ganado

durante tres o cuatro días, además estos sistemas tenían aproximadamente 25 días de

descanso del pastoreo lechero (Sáenz, 2014; Cubillos et al., 2012; 2016; Calle et al., 2012;

2013).

4.1.4. Caña de azúcar

En El Cerrito y en Bugalagrande se muestrearon cultivos de caña con manejo

convencional y agroecológico. El manejo agronómico ecológico de la caña de azúcar se

diferencia en gran medida del convencional por la reutilización de los residuos del bagazo

como abono para posteriores cultivos, además no se hace quema de residuos cortados.

Las submuestras fueron tomadas en las calles del cultivo; en el caso de la caña con manejo

agroecológico únicamente se tomaron en las calles que no contenían residuos de cortes

anteriores (Sáenz, 2014).

4.2. Amplificación y secuenciación de la región V4 del gen 16S ARNr, control de

calidad y filtración de las secuencias

La amplificación de la región V4 del gen 16S ARNr a las 26 muestras se realizó en un

trabajo anterior (Sáenz, 2014), usando los primers 515F y 806R (Coparaso et al., 2012).

La secuenciación se realizó con la plataforma Miseq de Illumina (2x250pb) siguiendo las

recomendaciones del protocolo de secuenciación de Coparaso et al., 2012.

Las secuencias obtenidas de estas muestras no fueron ensambladas ya que la calidad de

las secuencias del sentido Reverse fue menor de lo esperado, y no permitió ensamblaje,

fue así que solo se utilizaron las secuencias que corresponden al sentido Forward. (Sáenz,

2014).

4.3. Preparación de librerías metagenómicos

La secuenciación de ADN se realizó a 12 muestras, dos (2) réplicas de bosque seco

tropical y dos de sistemas de sistemas silvopastoril y dos de pasturas, una (1) de caña

agroecológica y caña convencional con respecto al El Cerrito, y en Bugalagrande se

tomaron una (1) réplica de todos los sistemas. (Figura 2). El ADN metagenómico se

extrajo utilizando el kit de aislamiento de ADN PowerSoil ™ (Mo Bio, EE. UU.)

siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de ADN se determinó

mediante el kit de ensayo Quant-iT dsDNA BR y un fluorómetro Qubit (Invitrogen

GmbH, Karlsruhe, Alemania). La verificación de la pureza del ADN se evaluó

espectrofotométricamente (Nano Drop 1000, ThermoFisher Scientific, EE. UU.). En

total, 1 µg de ADN por muestra se fragmentó usando la enzima Alu I durante 5 h

(Invitrogen,) dirigiéndose a fragmentos de ~ 500 pb. Las bibliotecas metagenómicas se

construyeron utilizando el kit de preparación de muestras TruSeq DNA LT (Set A,

Illumina®). Las perlas AMPure XP fueron reemplazadas por el kit de limpieza de PCR

UltraClean ™ (Mo Bio, EE. UU.). La selección del tamaño de los productos de ligadura

se realizó según las instrucciones del fabricante y dirigidas a insertos de 400-500 pb. El

kit de extracción de gel Purelink ™ Quick (Thermo Fisher) se utilizó para extraer y

purificar fragmentos de gel de agarosa. Las bibliotecas finales fueron secuenciadas por

medio de Hiseq Illumina en las instalaciones de ADN de la Universidad de Iowa, EE.

UU. La extracción de ADN y preparación de librerías fueron realizados por Johan S.

Sáenz (datos aún no publicados).

Fig. 2. Diseño de muestreo en El Cerrito y Buga la Grande en el Valle del Cauca para

análisis de PICRUSt, en cuadro rojo diseño de muestreo para análisis metagenomas.

4.4. Procesamiento de las secuencias de secuenciación metagenómica y

secuenciación de la región V4 del gen 16S ARNr

Las secuencias obtenidas por secuenciación metagenómica fueron anotadas en el servidor

de análisis metagenómicos MG-RAST siguiendo el flujo de análisis del programa para

obtener al final una anotación de la abundancia relativa de genes asociadas a funciones

de diferentes subsistemas de las 12 muestras evaluadas

Las secuencias obtenidas por secuenciación de la región V4 del gen 16S ARNr, fueron

agrupados en OTUS con secuencias con un 97% de similitud, y los OTUS con una

frecuencia menor de 50 considerando todas las muestras fueron descartados ya que

pueden representar errores intrínsecos de la secuenciación. Las tablas OTUs fueron re

muestreadas a una profundidad de 10000 secuencias por muestra con la finalidad de

normalizar el número de secuencias para todas las muestras. Estas fueron tomadas como

la entrada de la herramienta bioinformática PICRUSt y analizadas siguiendo el flujo

metodológico del programa: normalización, obtención del índice NSTI (Nearest

Sequenced Taxon Index) y la anotación mediante la base de datos KEGG se realizó una

predicción de las anotaciones funcionales.

4.5. Análisis de los datos

Para evaluar los datos de predicción de genes de PICRUSt se realizó un análisis de

correlación de Spearman usando el paquete estadístico R-studio versión 1.1.463 de los

datos obtenidos por secuenciación metagenómica y los datos predichos por PICRUSt.

Como la profundidad de secuenciación de los datos de PICRUSt y la secuenciación

metagenómica no era la misma se hizo una normalización, en el caso de MG-RAST se

obtiene el número de genes asignado a funciones, mientras que en PICRUSt se obtiene

una predicción del número de funciones, por lo tanto para comparar las dos

aproximaciones de las diferentes muestras, se normalizaron a la librería de menor tamaño

en nuestro caso (1000000), seguido de esto como en PICRUSt se obtuvieron mayor

número de lecturas, lo cual ve reflejado en que el número de anotaciones funcionales fue

mayor (12111) en comparación con las anotaciones funcionales obtenidas por medio de

MG-RAST (6188), se realizó una aleatorización por número de lecturas del total de

anotaciones funcionales obtenidas por PICRUSt para obtener al final el mismo número

de lecturas que en MG-RAST. Además, para observar el ordenamiento de todas las

anotaciones funcionales en todas las muestras tanto por PICRUSt como por secuenciación

metagenómica se realizó un análisis de coordenadas principales (PcoA) en donde se

visualizó el ordenamiento de las diferentes muestras obtenidas de PICRUSt y MG-RAST

mediante el programa STAMP.

Para identificar el efecto del uso del suelo (sistemas de pastoreo y cultivos de caña de

azúcar) y manejo (convencional vs agroecológico) sobre la abundancia de anotaciones

funcionales implicadas en el ciclo del Nitrógeno y el ciclo del Carbono obtenidos del total

de anotaciones funcionales de PICRUSt se realizó un Análisis de Coordenadas

Principales (PcoA) para así visualizar el ordenamiento de los diferentes usos y manejos

del suelo y su relación con las anotaciones funcionales englobadas en el ciclo del N y C,

además para identificar si existían diferencias significativas entre el uso, manejo y región

y las abundancias de anotaciones funcionales involucradas en los ciclos anteriores se

realizó un PERMANOVA de tres factores ya que los datos obtenidos no cumplieron

supuestos de normalidad y homogeneidad. Adicionalmente se realizó un análisis de

medias de cada sistema en el paquete estadístico R studio versión 1.1.463.

5. RESULTADOS

5.1. Comparación de la Predicción de genes obtenidos por PICRUSt y

Secuenciación Metagenómica.

Análisis del índice NSTI (índice de taxones secuenciados más cercanos) de las

anotaciones funcionales obtenidas por medio de PICRUSt

Se calculó el índice de taxones secuenciados más cercados (NSTI por su sigla en inglés)

para evaluar la incertidumbre de las predicciones metagenómicas del programa PICRUSt.

Este índice que es la suma de las distancias filogenéticas para cada organismo en la tabla

OTU a su pariente más cercano con un genoma de referencia secuenciado, medido en

términos de sustituciones por sitio en el gen 16S ARNr y ponderando por la frecuencia

de ese organismo en la tabla OTU (valores bajos del índice NSTI significan mejor

predicción). En la figura 3, se observan valores altos en las pasturas de Bugalagrande y

El Cerrito y Bosque de Cerrito (0.2-0.25), y los valores más bajos en las cañas y sistemas

silvopastoriles de los dos Municipios (0.05-0.13).

Fig. 3. Índice NSTI determinado para cada uno de los sitios de muestreo.

0,25

0,10,13

0,07 0,050,08

0,1

0,2 0,21

00,050,10,150,20,250,3

Cerrito

Bosque

Caña C

. Bugala

grande

Caña C

. Cerr

ito

Caña A

. Bugala

grande

Caña A

. Cerr

ito

Silvopas

toril…

Silvopas

toril Cerr

ito

Pastura

Bugalagran

de

Pastura

Cerrito

Valo

res

NST

I

5.2. Anotaciones funcionales obtenidas en PICRUSt y secuenciación

metagenómica

En base de las secuencias del amplicón del gen 16S ARNr, PICRUSt predijo 12111

anotaciones funcionales específicas (Nivel 3, ejemplo: nitrogenasa), involucradas en 181

anotaciones generales (Nivel 1, ejemplo: metabolismo Nitrógeno). Por otro lado,

mediante secuenciación metagenómica y realizando anotación de dichas secuencias por

MG-RAST, se obtuvieron 28 anotaciones generales (Nivel 1) y 6188 anotaciones

específicas (Nivel 3). Todas las anotaciones se obtuvieron mediante la base de datos de

KEGG. Las anotaciones generales que se encontraron tanto en PICRUSt como por

secuenciación metagenómica se describen en la figura 4. De manera general se observan

valores similares de la abundancia de genes entre sistemas tanto de PICRUSt como de

secuenciación metagenómica, con algunas excepciones como el metabolismo de carbono,

nitrógeno, aminoácidos.

Figura 4. Análisis de abundancias de genes encontrados por medio de anotación nivel 1

obtenidas mediante la base de datos KEGG tanto por secuenciación metagenómica (M)

como por PICRUSt (P) en los cinco sitios de muestreo. (A). Aminoácidos y derivados,

Carbohidratos, Metabolismo Nitrógeno, Metabolismo Proteínas, Metabolismo Carbono

Metabolismo RNA, Transporte de Membrana y Metabolismo Fósforo PICRUSt. (B)

Metabolismo de Aromáticos, División celular y ciclo celular, Metabolismo Fósforo,

Motilidad y quimiotaxis, Metabolismo DNA, Ácidos grasos, lípidos e Isopropenoides,

Fotosíntesis, Metabolismo Potasio y Azufre

5.3. Correlación entre las anotaciones funcionales por secuenciación metagenómica y

PICRUSt

Se evaluó la similitud entre las anotaciones generales (nivel 3) obtenidas por

secuenciación metagenómica y la por las predicciones de PICRUSt. Para eso, se realizó

un análisis de correlación de Spearman entre la abundancia de funciones obtenidas por

PICRUSt y por secuenciación metagenómica tanto de la misma muestra (donde se

esperaba encontrar alta correlación), como de muestras distintas (donde se esperaba

menor correlación). En el análisis de todas las funciones, los valores de R fueron

relativamente bajos, tanto en comparaciones de la misma muestra (R = 0,31 - 0,5) así

como entre diferentes muestras (R = 0.2 – 0.58) (Fig. 5A). Los valores de correlación más

altos en la misma muestra se obtuvieron para las anotaciones funcionales del ciclo de

nitrógeno (R=0,79) a excepción de una réplica de pastura con manejo convencional del

El Cerrito superando los valores entre distintas muestras (Fig. 5B). Los valores R de

correlación de spearman de funciones del ciclo del carbono en la misma muestra

estuvieron entre (0,7-0,8), con 3 excepciones de menor valores (0.53, 0.61 y 0.67). Salvo

estas excepciones, los valores de R de la misma muestra fueron mayores que los valores

entre muestras distintas. (Fig. 5C). Por último, los valores de spearman obtenidos para el

ciclo del Fósforo fueron los más bajos entre 0,282 y 0,609 (Fig. 5D). Por este motivo se

decidió no analizar las funciones englobadas en el ciclo del Fósforo sino solo las

funcionales englobadas en el ciclo del Carbono y Nitrógeno obtenidas por PICRUSt.

Además, se realizó un diagrama de barras donde se muestran las abundancias de genes

agrupados en los ciclos de carbono y nitrógeno obtenidos mediante secuenciación

metagenómica y PICRUSt, esto para evidenciar la veracidad de los datos obtenidos por

medio de las metodologías. En general, las abundancias de genes del ciclo de carbono y

del nitrógeno fueron similares entre PICRUSt y secuenciación metagenómica (Fig. 6 y

7), con excepción en las funciones agrupadas en la nitrificación en donde se obtuvieron

valores mayores en los sistemas silvopastoril y pastura de El Cerrito por medio de

PICRUSt y menores por secuenciación metagenómica y valores menores en caña

agroecológica de Bugalagrande en PICRUSt y mayores en secuenciación metagenómica

(Fig. 6C)

Fig.5. Análisis de correlación de las anotaciones funcionales obtenidos en PICRUSt y

Secuenciación metagenómica A. Funciones totales B. Ciclo del Nitrógeno C Ciclo del

Carbono D Ciclo del Fosforo.

Fig. 6. Análisis de abundancia de genes obtenidos por secuenciación metagenómica y

PICRUSt agrupados por funciones de A. Fijación de Nitrógeno B. Reducción asimilatoria

de Nitratos C. Nitrificación D. Desnitrificación.

Fig. 7. Análisis de abundancia de genes obtenidos por secuenciación metagenómica y

PICRUSt agrupados por funciones de A. Fijación de Carbono B. Oxidación de metano C.

Metanógenesis D. Metabolismo de Carbohidratos.

5.4. Análisis de coordenadas principales de los genes funcionales obtenidos por

Metagenoma y PICRUSt

Para determinar el efecto del uso y manejo del suelo, así como la región geográfica sobre

las anotaciones funcionales de la comunidad microbiana edáfica se realizó un análisis de

coordenadas principales tanto con los datos metagenómicos, así como con las

predicciones de PICRUSt. En el análisis de los datos metagenómicos las dos principales

coordenadas explican 34.2% (coordenada 1) y 18.6% (coordenada 2) del total de la

varianza de anotaciones funcionales de los diferentes usos y manejos del suelo. Se

observó una agrupación menor por manejo del suelo. Los sistemas agroecológicos se

separan de los convencionales a excepción de una pastura de El Cerrito (Figura 8A). En

cuanto al análisis de PICRUSt las dos principales coordenadas explican 71.3%%

(coordenada 1) y 14.8% (coordenada 2) del total de la varianza de anotaciones funcionales

de los diferentes usos y manejos del suelo. Se observa una separación por el uso del suelo

y por región (Figura 8B).

Fig. 9. Análisis de coordenadas principales de todos los genes funcionales de los sistemas

de Bugalagrande y El Cerrito por: A. Secuenciación metagenómica B. PICRUSt

5.5. Análisis de coordenadas principales de las anotaciones funcionales obtenidas

por PICRUSt involucrados en el ciclo del Carbono y Nitrógeno

En el ciclo del Carbono se observan tres grupos: el primero es de suelo del Bosque, el

segundo es una leve separación por manejo del suelo y el tercero es el que contiene los

sistemas silvopastoriles de Bugalagrande con una réplica de pastura convencional de

Bugalagrande y una de caña con manejo convencional y de El Cerrito. En cuanto al ciclo

del Nitrógeno se observa una separación representativa por región, están separados los

sistemas de Bugalagrande y El Cerrito, además se observa separación leve de subgrupos

en la región de EL Cerrito por uso del suelo y en Bugalagrande por manejo del suelo y

una separación de Bosque.

Figura 10. Análisis de coordenadas principales de genes funcionales agrupados por: A.

Ciclo del Carbono B) Ciclo del Nitrógeno.

5.6. Análisis de PERMANOVA de los genes funcionales correspondientes al

ciclo del Carbono.

En los resultados de predicción de anotaciones funcionales obtenidas por PICRUSt se

encontraron diferentes funciones biológicas implicadas en el ciclo del Carbono como: la

metanogénesis, oxidación de metano, fijación de carbono y metabolismo de carbohidratos

(Anexos 1-2-3).

Para evaluar el efecto del uso y manejo del suelo, y región geográfica sobre las funciones

biológicas edáficas encontradas en el ciclo del Carbono se realizó un análisis de

PERMANOVA factorial de interacción entre las tres variables independientes (Manejo,

Uso y Región) para cada una de las diferentes funciones biológicas encontradas. La

abundancia de genes relacionados con metanogénesis es mayor en sistemas con manejo

convencional como Caña y Pasturas de Bugalagrande y bajos para los mismos sistemas

en El Cerrito y valores bajos para todos los sistemas con manejo agroecológico

independientemente de las regiones, concordando con esto se encontró diferencia

significativa entre la interacción del manejo y la región con un Valor P significativos

0,016 y 0,005 (Figura 11C).

En los resultados de metabolismo de carbohidratos se encontraron valores altos para los

sistemas de El Cerrito incluyendo Bosque y bajos para todos los sistemas de

Bugalagrande, concordando con los resultados de diferencia estadística de la región con

valor P de 0,001 (Figura 11B). En cuanto la oxidación de metano (metanotrofos) se

observan valores bajos en las cañas Agroecológicas tanto de Bugalagrande y Cerrito y

altos en las cañas convencionales, en cuanto a los valores de los sistemas de pasturas y

silvopastoril los resultados son muy variables, en los análisis estadísticos no se

encontraron diferencias significativas (Figura 11D). En la fijación de carbono el valor

más alto se muestra en Bosque seguido por valores altos en los sistemas de uso de cañas

y bajos en los de ganadería (pastura y silvopastoril) independiente de la región y el manejo

del suelo, validando estos resultados se encontró diferencia significativa en el uso del

suelo con un valor P significativo 0,0186 (Figura 11A).

Figura 11. Análisis de abundancias de genes agrupados por funciones de: A. Fijación de

Carbono. B. Metabolismo de carbohidratos C. Metanógenesis D. Metanotrofos.

5.7. Análisis de las anotaciones funcionales correspondientes al ciclo del

Nitrógeno.

Tomando los resultados obtenidos en PICRUSt se dividió el ciclo del Nitrógeno en cuatro

partes con base en la anotación de KEGG (desnitrificación, fijación de nitrógeno,

nitrificación y reducción de nitrato vía asimilatoria) para evaluar si existen diferencia

significativa del uso y manejo del suelo sobre las funciones relacionadas con el ciclo del

Nitrógeno se realizó un análisis de PERMANOVA de interacción entre las tres variables

independientes (Manejo-Uso-Región) para cada una de las diferentes funciones

biológicas.

En la fijación de Nitrógeno el valor mayor se encontró en Bosque seguido por valores

altos de las medias en todos los sistemas de El Cerrito y bajos en Bugalagrande,

concordando con la diferencia altamente significativa (P = 2e-16) que se encontró en

cuanto a la región (Figura 12A). Los resultados de reducción asimilatoria de nitratos fue

más alta en bosque seguidos por manejo agroecológico y bajos en manejo convencional

validando los resultados de diferencia significativa del manejo del suelo valor P 0,0034

(Figura 12D). En la nitrificación se encontró valores bajos en suelos de uso ganadería

(pasturas y silvopastoril) y altos en cañas y bosque lo cual afirma los resultados de los

análisis estadísticos de diferencia significativa del uso del suelo (P=0,012) (Figura 12C).

Por último, la desnitrificación de manera general los resultados fueron muy variables los

valores más altos fueron en caña agroecológica de El Cerrito y Silvopastoril de Buga la

grande, los valores más bajos fueron en caña convencional, pastura de El Cerrito y

bosque, concordando con los resultados de análisis estadísticos donde no se encontró

diferencia Figura 12B).

Fig. 12. Análisis de abundancias de genes agrupados por funciones de: A. Fijación de

nitrógeno B. Desnitrificación C. Nitrificación D. Reducción de Nitratos vía asimilatoria

6. DISCUSIÓN

6.1. Comparación Predicción de genes obtenidos por PICRUSt y Secuenciación

Metagenómica.

En este estudio se analizaron anotaciones funcionales correspondientes a cinco sistemas:

caña agroecológica, caña convencional, silvopastoril, pastura y bosque de dos regiones:

El Cerrito y Bugalagrande. Las anotaciones obtenidas fueron asignadas funcionalmente

mediante la base de datos KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), se

obtuvieron por secuenciación metagenómica en solo 12 muestras y en PICRUSt se

realizaron en todas las muestras por triplicado. En secuenciación metagenómica se

encontraron 6188 anotaciones funcionales y en PICRUSt el cual es un programa

bioinformático que permite predecir genes funcionales a partir de la secuencia del gen

16S ARNr se obtuvieron 12111 anotaciones funcionales. Este diferencia se puede atribuir

a la mayor profundidad que permite la secuenciación de un gen marcador (16S ARNr) en

comparación de la secuenciación de toda el metagenoma, lo cual muestra una ventaja del

programa, permitiendo un incremento del casi el 100% de las anotaciones funcionales

Además como PICRUSt es un programa de predicción se evaluó el índice NSTI el cual

representa la suma de las distancias filogenéticas de cada organismo en la tabla OTU a su

pariente más cercano con un genoma de referencia secuenciado, medido en términos de

sustituciones por sitio en el gen 16S ARNr y ponderado por las frecuencias de ese

organismo en la tabla OTU (Langille et al., 2013). En nuestro estudio se encontraron

valores entre 0.25 y 0.01 que corresponden a rangos similares encontrados en otros

estudios como el de Langille et al., 2013 donde evaluaron 12 muestras de suelo

encontrando valores similares a los de este estudio, concluyendo que los datos se

encuentran en una predicción media según los rangos de Langille et al., 2013. En otros

estudios donde se han analizado muestras de suelo, pero en cultivos de enriquecimiento

se han obtenido valores entre (0.18-0.03) donde 0.18 corresponde a la muestra original

de suelo y bajó a 0.03 después de que la muestra fue enriquecida., Debido a lo anterior en

donde el programa PICRUSt se ha usado muy pocas veces en muestras de suelo y que los

resultados de este estudio estuvieron dentro de un rango medio de predicción se decidió

hacer un análisis adicional de correlación de Spearman entre los datos de secuenciación

metagenómica y PICRUSt, análisis que se ha realizado en muy pocos estudios de suelo

donde se ha usado PICRUSt.

Las anotaciones funcionales de PICRUST y MG-RAST en su mayoría se encuentran

relacionadas con el mantenimiento de la función y la estructura celular y, por lo tanto, las

realizan todas las especies de la comunidad microbiana (Hariharan, 2015). De especial

interés, sin embargo, son ciertas funciones relacionadas con la salud y productividad del

suelo como: el metabolismo del nitrógeno, carbono y fósforo. En cuanto a la abundancia

de anotaciones funcionales relacionadas con el metabolismo del nitrógeno y carbono

fueron altos en bosques y pasturas tanto en la predicción de PICRUSt como en la

secuenciación metagenómica, lo cual corresponde con estudios anteriores en donde el

nitrógeno y carbono suelen ser altos en los sistemas de praderas y bosques (Ratnayake et

al., 2011)

El análisis comparativo que agrupan todas las funciones generales obtenidas por

PICRUSt y secuenciación metagenómica estuvieron entre (R=0.31 - 0,5), al compararlo

con otros estudios como el de (Millares et al., 2015) donde se correlacionan estos dos

métodos con muestras de microbiomas humanos los resultados son (0,7-0,8), esto debido

a que existen más genomas de referencia (Figura 5). Los ciclos de Carbono (0,56-0,8) y

Nitrógeno (0,56-0,8) presentaron valores más altos en comparación con los valores

obtenidos de la correlación de todas las anotaciones funcionales. Además, los resultados

arrojados en los diagramas de barras de las anotaciones funcionales agrupados en los

mismos ciclos son muy similares en PICRUSt y secuenciación metagenómica

permitiendo sugerir que los datos obtenidos por predicción de PICRUSt de estos dos

ciclos son confiables para ser usados en este estudio (Figuras 11 y 12). En comparación

con los resultados del ciclo del fosforo donde la correlación fue muy baja y por esto se

decidió no usarlos en este estudio. Con estos resultados se podría plantear que el programa

predice mejores grupos de funciones de ciclos biogeoquímicos que se han estudiado más

a fondo y por lo tanto van a existir más enzimas predichas en las bases de datos en donde

PICRUSt se basa para hacer las predicciones.

Debido a lo anterior se decidió usar solo los genes funcionales agrupados en los ciclos

del carbono y del nitrógeno obtenidos por PICRUSt y además por la falta de réplicas en

secuenciación metagenómica no se tomaron los datos para los siguientes análisis.

En conclusión se puede inferir que el programa PICRUSt proporciona una buena

clasificación de la asignación funcional cuando se cuenta con una gran base de datos de

genomas de referencia, ya que en los estudios del microbioma humano el programa

realiza una buena predicción, caso contrario en nuestro caso en donde los genomas de

referencia en suelos son muy pocos, por esto otros tipos de análisis estadísticos como los

de correlación permiten verificar la confiabilidad de los datos, siendo este el primer

estudio en muestras de suelo en donde se hace este tipo de análisis para poder confirmar

la veracidad de la predicción. Sin embargo, las nuevas tecnologías y los avances en

herramientas bioinformáticas, como las lecturas de secuenciación más largas, las

evoluciones en las bases de datos de anotación, las herramientas para predecir mejor las

estructuras de genes y operones, y las herramientas que interrogan los datos a nivel de

polimorfismo de un solo nucleótido serán esenciales para proporcionar anotaciones

funcionales más detalladas y precisas (Xue et al., 2014).

La abundancia y presencia de anotaciones funcionales involucradas en el ciclo del

nitrógeno está relacionado con el estudio preliminar de Sáenz, 2014 donde determinó la

abundancia y diversidad de microorganismos y encontró géneros como: Bradyrhizobium

y Heliobacterium, los cuales, aunque no son los únicos que realizan fijación de nitrógeno

en el estudio de Sáenz 2014 se encontraron dentro de los más abundantes. contribuyentes

en la fijación de nitrógeno y expresan genes nif (nifK, nifH y nifD) que codifican la

proteína nitrogenasa determinante en la salud y productividad del suelo (Jones &

Bradford 2001; Hariharan, 2015) otros como Pseudomonas y Bacillus los cuales fueron

abundantes en el estudio de Sáenz, 2014 que están involucrados en la desnitrificación

conversión de nitrato en nitrógeno a partir de la expresión de genes como: norB, norC y

nirK, los cuales son usados como marcadores genéticos para las principales enzimas de

la desnitrificación como la nitrato reductasa, nitrito reductasa y óxido nitroso (Wertz et

al., 2012), y por último las especies Nitrospira y Nitrococcus encontradas en el estudio

anterior de Sáenz, 2014 y en secuenciación metagenómica productores del gen amo

principal catalizador de la oxidación de amoniaco (nitrificación) cuentan con el potencial

de oxidar tanto los compuestos de nitrógeno orgánicos como inorgánicos (Hariharan,

2015; 2017; Francis et al., 2003; Dionisi et al., 2002; Purkhold et al., 2000; Rotthauwe et

al., 1997). Así mismo la abundancia de genes relacionados con el metabolismo del

carbono también correlacionado con el estudio preliminar de Sáenz, 2014 en donde

encontró Proteobacteria y Acidobacteria los cuales son los más abundantes y se

encuentran asociados a la fijación de carbono (Hariharan, 2015). Otra parte importante

involucrada en el ciclo del carbono es el metabolismo del metano estrechamente

relacionado con los gases de efecto invernadero y el cambio climático, del cual se

encontraron anotaciones funcionales en este estudio correspondiente a estudios

preliminares de (Sáenz, 2014) en donde encontraron géneros de metanogénicas y

metanótrofas como Methanococcus y Methanobacterium. El proceso de oxidación del

metano convierte el metano en formaldehido y se lleva a cabo por metanotrofos. Los

metanotrofos a menudo se clasifican como Tipo I (generalmente Gammaproteobacteria,

utilizan la vía de RuMP para la asimilación del carbono) y Tipo II (Alfaproteobacteria,

usan la serina para la misma función), dos grupos encontrados en el estudio preliminar de

Sáenz, 2014. La metanol deshidrogenasa es una enzima importante involucrada en la

oxidación del metano, y las subunidades 1 y 2 de la metanol deshidrogenasa asociada al

citocromo c fueron predichas por PICRUSt y secuenciación metagenómica, mdh1 y mdh2

está conectada a familia metanotrofía como Bradyrhizobiaceae (Fitriyanto et al., 2011).

Otro conjunto importante de genes involucrados en la oxidación del metano son los genes

pmo, como: pmoA, pmoB y pmoC estos genes codifican para las subunidades A, B y C

de la metano monooxigenasa asignados a Methanococcus y otros miembros como

Methanobacterium.. Todas las anteriores familias encontradas en el estudio preliminar de

Sáenz, 2014. La metanogénesis es el proceso de formación de metano. El gen mtrH (que

expresa la subunidad H de la tetrahidrometanopterina S-metiltransferasa encontrada en

este estudio), esta enzima ayuda en la producción de metano a partir de acetato y está

vinculada exclusivamente a Methylococcus (Pester et al., 2010).

6.2. Efecto del uso del suelo (sistemas de pastoreo y cultivos de caña de azúcar) y

manejo (convencional vs agroecológico) y la región sobre la abundancia de

genes implicados en el ciclo del Nitrógeno

El nitrógeno es uno de los principales factores que limita la producción de los cultivos,

es un componente importante de las proteínas y los aminoácidos y por lo tanto es un

nutriente esencial para todos los organismos. El nitrógeno existe en varios estados de

oxidación y formas químicas, los cambios en las diferentes transformaciones suelen ser

catalizadas por microorganismos. La identificación de los genes involucrados en este

ciclo y su abundancia en cualquier muestra de suelo es clave para estimar el potencial

funcional de los microorganismos en los suelos.

La actividad de fijación de nitrógeno (conversión de di nitrógeno atmosférico en

amoníaco). La fijación biológica de nitrógeno es la fuente natural más grande de

nitrógeno para la mayoría de los ecosistemas terrestres, en este proceso los

microorganismos diazotrofos simbióticos y de vida libre reducen el gas di nitrógeno

atmosférico a formas reactivas y biológicamente disponibles (Keeler et al., 2009). La

nitrogenasa está muy extendida en bacterias y arqueas, y les proporciona una ventaja

competitiva en entornos que carecen de nitrógeno disponible. Existen tres tipos de

nitrogenasas: hierro-hierro (FeFe), vanadio-hierro (VFe) y molibdeno-hierro (MoFe)

(Lloyd et al., 2009; Soon & Arshad, 2005). La fijación de nitrógeno suele ser más alta

en los Bosques ya que estos se caracterizan por poseer zonas hotpots que van la van a

incrementar, lo cual se obtuvo en este estudio donde la fijación de nitrógeno fue más alta

en el Bosque esto debido posiblemente a que microorganismos como los diazótrofos de

vida libre que son la forma más dominante de bacterias fijadoras de nitrógeno suelen estar

en alta abundancia en los bosques (Hoorman et al., 2010). Otro factor que puede influir

en el aumento de fijación de nitrógeno en el bosque es la no presencia de fertilizantes

agrícolas los cuales pueden disminuir la fijación de nitrógeno (Barberán et al., 2012; Soon

& Arshad, 2005). Por último, se observó un efecto significativo de la región sobre la

fijación de nitrógeno esto debido posiblemente a la alteración de factores

medioambientales como: la deficiencia o toxicidad de fósforo y la acidez del suelo, donde

en el estudio anterior de Sáenz, 2014 se observó que el fósforo se encuentra en menor

cantidad en Bugalagrande y el pH es bajo en la misma zona.

El proceso de reducción de nitrato puede ser asimilatorio o desasimilatorio. La

desasimilación solo se lleva a cabo en ambientes anaeróbicos. El proceso de asimilación

fue más común en estos sistemas. El manejo tuvo un efecto sobre la actividad de la

reducción de nitrato asimilatoria, el cual fue más alto en todos los sistemas agroecológicos

y el Bosque concordando con estudios anteriores como Selbie et al. 2015; GBowles et al.,

2014 quienes sugieren que el uso de fertilizantes tipo NPK usados en la actividad agrícola

aumentan el contenido de amonio lo cual disminuye la reducción asimilatoria de nitrato,

lo cual podría aumentar el nitrato y este no es del todo asimilable por los microorganismos

provocando así una lixiviación del nitrato (Piotrowska & Wilczewski, 2014), además

concuerda con lo reportado por Sáenz, 2014 el cual encontró que los fertilizantes usados

en estos sistemas aumentan el contenido de amonio.

El proceso de nitrificación (amoníaco a nitrito y posteriormente el nitrito se oxida a

nitrato). Este proceso clave juega un papel importante en la regulación de la

disponibilidad de nitrógeno y la pérdida de nitrógeno en los ecosistemas terrestres puede

causar la lixiviación de nitrato a las aguas subterráneas y producir N2O directamente. La

nitrificación en los suelos se divide en nitrificación autótrofa y heterótrofa. La primera es

llevada a cabo por bacterias quimio autotróficas que oxidan el amonio y la segunda por

ciertas bacterias con el potencial de oxidar tanto compuestos orgánicos como inorgánicos

(Kuypers et al., 2018; Hariharan, 2015). La nitrificación desempeña un papel clave en

determinar cuánto y qué formas de Nitrógeno inorgánico del suelo están disponibles para

las plantas. El aumento del proceso de nitrificación aumenta las pérdidas de Nitrógeno de

los ecosistemas a través de la lixiviación de nitratos y la emisión de óxido de nitrógeno

(Assémien et al., 2017). Se encontraron valores menores en los sistemas silvopastoril y

pasturas y bajos en sistemas de cañas agroecológicas y convencionales resultados

contradictorios se encontraron en el estudio anterior de Cubillos et al., 2016 en donde se

encuentra que la nitrificación es más alta en los sistemas de pasturas. Los altos valores

presentados en las cañas puede deberse correlacionarse con los valores altos de amoniaco

en estos sistemas resultados reportados por Sáenz, 2014, además la aplicación de

fertilizantes inorgánicos y los altos niveles de amonio aumentan la producción de

nitrificación (Groenigen et al., 2005; Pajares et al., 2016; Paungfoo-Lonhienne et al.,

2017; Coskun et al., 2017).

La desnitrificación es un proceso de respiración esencialmente anaeróbico, en el que el

nitrógeno principalmente en forma de NO3- el cual se utiliza como aceptor de electrones

en la oxidación de carbono (Hofstra & Bouwman, 2005; Clough et al., 2017). En la

desnitrificación se pueden generar “hots spots” los cuales son puntos de actividad

microbiana que se producen como resultado de la heterogeneidad de las condiciones del

suelo y posiblemente pueden determinar los estados de oxigenación determinando así el

proceso de desnitrificación, debido a esto es probable no encontrar efecto ni de la región,

manejo y uso del suelo, lo cual se obtuvo en este estudio en donde no se encontró

diferencia significativa (Hofstra & Bouwman, 2005), esto concuerda con este estudio en

donde las tres variables (región, manejo y uso) influyeron en la desnitrificación. Los tipos

de cultivos y abonos, los tipos de fertilizantes, la tasa de aplicación de nitrógeno, método

y tiempo de aplicación influye en el período de disponibilidad de nitrógeno y la forma en

el que el nitrógeno se vuelve disponible es determinante en la desnitrificación (Hofstra &

Bouwman, 2005). La entrada de nitrógeno a partir de residuos orgánicos de los cultivos

varía entre tipos de cultivos y como resultado de esta gestión los factores relacionados

van a influir significativamente en la desnitrificación (Hofstra & Bouwman, 2005; Selbie

et al., 2015).

6.3. Efecto del uso del suelo (sistemas de pastoreo y cultivos de caña de azúcar) y

manejo (convencional vs agroecológico) sobre la abundancia de genes

implicadas en el ciclo del Carbono.

El carbono es el mayor componente en la célula y el elemento químico clave en los

compuestos de naturaleza orgánica, elemento que circula entre los océanos, la atmósfera,

el suelo y el subsuelo, instancias que conforman los depósitos, reservorios o almacenes

de carbono. El paso entre los depósitos ocurre mediante procesos de orden químico, físico

y biológico. El intercambio de carbono entre el reservorio terrestre y el atmosférico es el

resultado de procesos naturales como la fotosíntesis y la respiración, así como de la

emisión de gases de origen antrópico. Los microorganismos del suelo se consideran

actualmente como una de las estrategias más prometedoras para mejorar la disponibilidad

y el almacenamiento de carbono en el suelo, por lo que es importante evaluar los genes

que intervienen en el ciclo del carbono (Hariharan, 2015).

El ciclo del carbono se inicia con la fijación del dióxido de carbono atmosférico, la cual

se ha atribuido principalmente a microorganismos quimiolitotróficos que sintetizan el

carbono atmosférico dióxido de carbono en material orgánico. Los microorganismos del

suelo esencialmente transfieren entre compartimentos ambientales para cumplir su

función fundamental: la supervivencia a través de la reproducción. En este estudio se

encontró un efecto del uso del suelo, esto debido posiblemente a que la disponibilidad de

otros elementos clave como el nitrógeno y fósforo son esenciales para la fijación de

carbono, concordando con resultados donde en los sistemas de pastoreo y bosque se

encontraron valores más altos de fósforo total y nitrógeno total que en los sistemas de

cañas reportado en el estudio de Sáenz, 2014 (Orellana et al. 2012; Sperling et al., 2017;

Ratnayake, Seneviratne & Kulasooriya, 2011).

El intercambio de metano en el suelo con la atmósfera está regulado por arqueas

productoras de metano es decir metanógenos y bacterias oxidantes de metano (MOB), es

decir metanotrofos. Los metanotrofos son bacterias Gram negativas que utilizan el

metano como fuente de carbono y energía y pueden oxidar hasta el 90% del metano

producido por los metanógenos (Zhang et al., 2018). La metanogénesis fue alta en caña

convencional y pastura debido posiblemente a la adición de nitrógeno inorgánico en el

suelo, lo cual aumenta la deposición de nitrógeno y la escorrentía lo cual a su vez aumenta

producción de metano y disminuye la oxidación de metano la cual fue baja en estos

mismos sistemas (Zou et al., 2005; Liu et al., 2015), además la adición de estiércol puede

aumentar las emisiones de metano, aumentando a su vez el nitrógeno y fósforo en suelo

que contribuyen al aumento de la metanogénesis (Cai et al., 2016).

7. CONCLUSIONES

● La exactitud de la predicción de PICRUSt varía en distintos genes funcionales.

Por ejemplo, la predicción de genes asociados a los ciclos de nitrógeno y carbono

fue relativamente exacta, mientras que la exactitud de la predicción de los genes

agrupados en ciclo del fósforo fue relativamente baja.

● Las abundancias de los diferentes genes asociados con el ciclo de nitrógeno están

afectadas principalmente por la región.

● Las abundancias de los diferentes genes asociados con el ciclo de carbono están

determinados por sistemas intervenidos vs. el bosque.

● Diferentes genes están afectados por diferentes factores. Por ejemplo, la fijación

de nitrógeno está afectado principalmente por la región mientras que los genes

asociados con la nitrificación están afectados principalmente por el uso de suelo.

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