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遺伝子導入試薬

MultiFectam

2

Outline

• 遺伝子導入試薬MultiFectamについて

• 基礎データ

• 他社製品との比較

• 初代培養細胞への遺伝子導入

• siRNAの導入

• 特徴

3

遺伝子発現メカニズム

分解

Cell

H+

H+

H+Cl-

H+

H+

H+

H+

Cl-

Cl-

核

H2O

H2O

MultiFectam-DNA複合体

エンドサイトーシス

浸透圧上昇エンドソーム破裂

エンドソーム

リソソーム

pH低下

H+、Cl-流入によりエンドソーム内イオン濃度上昇

プロトンスポンジ効果

プロトンスポンジ効果と膜融合能の相乗効果によるエンドソームからの効果的な脱出

＋

＋

＋＋ ＋ ＋

＋

＋

＋＋＋＋

−

− −＋

膜融合

遺伝子発現

DNA MultiFectam

4

原理とプロトコル

MultiFectamの透過型電子顕微鏡写真

0

10

20

30

40

50

0.1 1 10 100 1000 10000

Inte

nsity (%

)

Size (d.nm)

0

200000

400000

600000

800000

-200 -100 0 100 200

Inte

nsity

(kcps)

Zeta Potential (mV)

lot A

lot B

Size distribution by intensity

Zeta potemtial distribution

検出器機：Zetasizer Nano : ZS90

(MALVERN CO., LTD)

141nm

164nm

49.2

46.5

プロトコル：

リポソーム形成

凍結乾燥製品

再水和溶液

d.w.

DNAとの複合体形成 細胞への添加

DNA溶液

r.t. 30min

＋

＋

＋＋ ＋ ＋

＋

＋

＋＋＋＋

MultiFectam

製品

原理： 本製品は、プラスミドDNAを様々な哺乳動物由来の培養細胞中へ効果的に導入できるトランスフェクション試薬です。本試薬は、ポリアミドアミンデンドロンを極性基とするカチオン性脂質からなり、静電気的相互作用によりDNA

と複合体を形成します。この複合体は、エンドサイトーシスにより細胞内のエンドソームに取り込まれます。その後、複合体は、ポリアミドアミンデンドロンにより誘起されるプロトンスポンジ効果およびエンドソーム膜との疎水的相互作用により、効率よくエンドソームから細胞質へと放出される為、高い遺伝子発現効率が得られます。

5

細胞への導入効率

400倍観察

200倍観察

+

MultiFectam＋ NBD DNA-Alexa Fluor 546

48 hr後、観察

MultiFectam-DNA

複合体形成細胞への添加

明視野 NBD標識MultiFectam DNA-Alexa Fluor 546HeLa-S3

6

様々な細胞株での遺伝子発現（GFP）A549

CHOBalb3T3

HeLa-S3

COS 7

U2OS SKOV3100倍観察：COS7, K562, Jurkat,

Balb3T3

200倍観察：その他

K562浮遊系

Jurkat

7

他社製品との比較C

OS

7H

eL

a-S

3

MultiFectam 競合品 A 競合品 B

COS7: 100倍 HeLa-S3 : 200 倍K562 : 100倍

48hr後GFP発現

K5

62

0

0.5

1

1.5

2

1 2 3

DL-U2

LTX

HD

COS7 HeLa-S3 K562

ルシフェラーゼ活性測定

競合品Ａの活性値を１とした（それぞれの推奨プロトコルに従った）

毒性評価 (WST-8)

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3

DL-U2

LTX

HD

Relative activity

生存率（％）

COS7 HeLa-S3 K562

MultiFectam

競合品A

競合品B

MultiFectam

競合品A

競合品B

8

NHDF-ad (正常ヒト皮膚繊維芽細胞)へのDNA、MultiFectamの導入効率

+

DNA-Alexa Fluor 546

48 hr後、観察

MultiFectam-DNA

複合体形成細胞への添加

明視野 NBD標識MultiFectam DNA-Alexa Fluor 546

400倍観察

200倍観察

MultiFectam＋ NBD

9

他社製品との比較（活性： NHDF-ad細胞 ）

MultiFectam 0.2ug 競合品A 0.2ug 競合品B 0.2ug 競合品C 1ug

100倍

GFP発現

48hr後

Lu

cife

rase

activity

×1

04R

LU

/mg p

rote

in

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4 5

0.2ug

0.5ug

MultiFectam 試薬X 競合品Ａ 競合品Ｂ 競合品C

ルシフェラーゼ活性測定

GFP発現

10

他社製品との比較（毒性評価：NHDF-ad細胞）

トランスフェクションから48hr後、WST-8により測定未添加を100%とした

NP= 4 8 4 80

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

1 2 3 4 5

0.2ug

0.5ug

1.0ug

未添加 MultiFectam 競合品C 競合品B 競合品A

11

複数回トランスフェクション （NHDF-ad細胞）[ 非ウイルス性ベクターを用いて、iPS細胞を作製する際に行われる ]

MultiFectam 競合品A

100倍

競合品B 競合品C

0.5ug

1.0ug

0.2ug

1.0ug

0.5ug

1.0ug

0.5ug

1.0ug

トランスフェクション トランスフェクション トランスフェクション

1day 3day 5day 7day

解析(GFP発現、細胞毒性)

7day

DNA=

DNA=

GFP発現

12

複数回トランスフェクション (NHDF-ad細胞)

010

2030

4050

6070

8090

100110

1 2 3 4 5

0.2ug

0.5ug

1.0ug

未添加 MultiFectam 競合品A 競合品B 競合品C

7day

トランスフェクション トランスフェクション トランスフェクション

1day 3day 5day 7day

解析(GFP発現、細胞毒性)

細胞毒性（WST-8)

13

siRNA導入メカニズム

分解

Cell

H+

H+

H+Cl-

H+

H+

H+

H+

Cl-

Cl-

核

H2O

H2O

MultiFectam-siRNA 複合体

エンドサイトーシス

浸透圧上昇エンドソーム破裂

エンドソーム

リソソーム

pH低下

H+、Cl-流入によりエンドソーム内イオン濃度上昇

プロトンスポンジ効果

プロトンスポンジ効果と膜融合能の相乗効果によるエンドソームからの効果的な脱出

＋

＋

＋＋ ＋ ＋

＋

＋

＋＋＋＋

−

− − ＋

siRNAの細胞質への放出

RNAi

siRNA MultiFectam

14

他社製品との比較（ルシフェラーゼ活性）

細胞：ルシフェラーゼ定常発現細胞（HeLa-S3）siRNA：ルシフェラーゼsiRNA 20pmol / 24well

未添加の細胞の活性を100%とした

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5未添加 MultiFectam 競合品E 競合品F 競合品G

15

他社製品との比較（ＧＦＰ発現）

未添加 MultiFectam 競合品E 競合品G

( GFP siRNA 20pmol/48well plate, LNCap細胞(GFP-luc+定常発現株), 48hr後)

×200

16

他社製品との比較（細胞毒性）

WST-8により、細胞毒性を評価した未処理の細胞を100%とするHeLa-S3,LNCap細胞について評価を行った

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5

HeLa-S3

LNCap

未添加 MultiFectam 競合品E 競合品F 競合品G

17

ノックダウン効果の経時的データ（持続性）

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5

細胞：ルシフェラーゼ定常発現細胞（HeLa-S3）siRNA：ルシフェラーゼsiRNA 20pmol / 24well未処理の細胞の活性を100%とした

0 24 48 96 120 hr

18

MultiFectamの特徴

１） 新規メカニズム

プロトンスポンジ効果＋膜融合による効率的なエンドソームからの脱出

２） 血清・抗生物質存在下でも導入可能

３） 生物由来成分を含まない（非ウイルス系ベクター）

４） 操作が簡便

高い発現効率

株化細胞 ： COS7, HeLa-S3, A549, U2OS, SKOV3, CHO, Balb3T3, K562, Jurkat

初代培養細胞 ： NHDF-ad

・ 多くの細胞種で、高い発現効率を有することを確認浮遊細胞、正常細胞でも高い発現効率

・ 他社製品と比べ、同等以上の発現効率

低毒性

・発現効率が高い条件において、80%以上の細胞生存率

siRNA にも使用可能

・他社製品と同等のノックダウン効果を有する