Thèse Eude microbiologique · Définition des bactériocines Classification des bactériocines...

Université d'Oran Es-Sénia

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie

Thèse

En vue de l'obtention du diplome de

DOCTORAT

En Microbiologie Alimentaire Et Industrielle

Présentée par

GUETARNI Hassina

Thème Effets antibactériens des bactéries lactiques isolées à partir des laits

crus Algériens sur la croissance de Helicobacter pylori

Soutenue publiquement le 05/12/ 2013 Membres du jury:

Pr.CHEKROUN Abdallah……………….Président, Université d'Oran Es-Sénia

Pr.AOUES Abdelkader………………Examinateur, Université d'Oran Es-Sénia

Pr.SLIMANI Miloud………………………….Examinateur, Université de Saida

Dr.CHERIGUENE Abdrrahim………..Examinateur, Université de Mostaganem

Dr.BEKKADA Ahmed…..……..Examinateur, Centre Universitaire de Relizane

Pr.BENSOLTANE Ahmed……..Directeur de thèse, Université d'Oran Es-Sénia

-Année Universitaire: 2012-2013-

Je dédie ce travail à

Mes chers parents

Et

Mes chers frères

Que Allah les garde et les protège

Guetarni H.

REMERCIEMENTS

Mes premiers remerciements s’adressent au Pr. BENSOLTANE Ahmed, mon

directeur de thèse, pour son soutien, ses aides précieuses, ses conseils et ses encouragements

continuels durant la période de préparation de cette thèse.

J'adresse un grand remerciement aux messieurs les membres de jury, qui ont accepté

d'évaluer ma thèse de doctorat:Président Pr. CHEKROUN Abdallah (Université d'Oran Es-

Sénia) et Examinateurs: Pr.AOUES Abdelkader (Université d'Oran Es-Sénia), Pr.

SLIMANI Miloud (Université Saida), Dr.CHERIGUENE Abdrrahim(Université de

Mostaganem) et Dr.BEKKADA Ahmed(Centre Universitaire de Relizane).

Je remercie le ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique

qui m'a fourni tous les moyens nécessaires pour réaliser ce travail.

Je remercie aussi le Recteur de l'Université Khemis Miliana: le Pr. BEZINA

Mohamed et le Doyen de la faculté des Sciences de la nature et de la vie et des sciences de

la terre: Dr. MOKABLI Aissa, qui m'ont aidé beaucoup afin de réaliser ce travail et m'ont

fourni des stages à courte durée.

Une partie de ce travail a été réalisée au niveau de laboratoire de bactériologie de

l'hôpital Cochin, Paris, dont je remercie le chef de service le Pr. POYART Claire, pour son

acceptation de faire cette partie au niveau de ce laboratoire.

Je remercie également Dr. RAYMOND Josette, pour son invitation au niveau de

laboratoire de bactériologie de l'hôpital Cochin, et avoir mis à ma disposition l'équipement

nécessaire pour isoler et caractériser des souches de H.pylori par la PCR en temps réel.

Je remercie aussi toute l'équipe de ce laboratoire, en particulier: la secrétaire

ESSOMEE MOUNE Agnès, pour son bon accueil au niveau de ce laboratoire et le

technicien CZARNA Nicolas, pour ses aides précieuses durant la période de mon stage.

J'adresse un sincère remerciement au Pr. MEGRAUD Francis pour son invitation

à des stages à courte durée que je l'aie fait durant les années 2009 et 2010 dans le centre

national de références des Campylobacters et des Helicobacters de Bordeaux.

L'étude anatomopathologique et cytologique des biopsies gastriques a été faite au

niveau de laboratoire d'analyses anatomopathologiques et cytologiques de l'hôpital de

Médéa, dont je remercie Docteur BENAYAD, pour me permettre réalisée cette partie.

L'isolement et la caractérisation des souches de H.pylori a été effectué grâce aux

aides du Dr. DJEBAILLI Mustapha, gastrœntérologue à Chlef, dont je le remercie

infiniment car il m'a autorisé d'assister des séances de l'endoscopie digestive haute et m'a

prélevé des biopsies gastriques des patients pour réaliser mon travail.

Enfin, Je salue et je remercie toutes les personnes qui m'ont aidé, sans citer leur nom.

TABLE DES MATIERES

Résumé Abstract

لخصالم Liste des publications et communications……………………………………………………i Liste des abréviations…………………………………………………………………………ii Liste des tableaux……………………………………………………………………………..iv Liste des figures………………………………………………………………………………..v

Chapitre I:

I 1. 2. 3.

II. 1. 2. 3. 4. 5.

5.1. 5.2.

6. 7.

7.1. 7.2.

8. 8.1

8.1.1. 8.1.1.1. 8.1.1.2. 8.1.1.3.

8.1.2. 8.1.2.1. 8.1.2.2.

8.1.2. 8.1.2.1. 8.1.2.2. 8.1.2.3. 8.1.2.4. 8.1.2.5.

9. 9.1. 9.2. 9.3. 9.4. 10.

10.1.

Introduction Revue bibliographique Rappel anatomique et histologique Estomac Epithélium gastrique Renouvellement tissulaire épithélial Helicobacter pylori Historique Classification Caractères morphologiques et biochimiques Réservoir Mode de transmission Transmission oro-orale Transmission féco-orale Prévalence Physiopathologie de l’infection à H. pylori Phase aiguë Phase chronique Facteurs de virulence de H.pylori Inflammation et lésions tissulaires Cytotoxine vacuolisante VacA Génétique Structure Effets physiopathologiques Ilot de pathogénicité cag et la protéine CagA Activités biologiques Inflammation Adaptation à l'environnement gastrique Flagelles et le chimiotactisme Uréase Réponse à l'acidité Lipopolysaccharide Adhésines H.pylori et pathologies associées Gastrite Ulcére gastro-duodénal Lymphome gastrique Cancer gastrique Diagnostic de l'infection à H.pylori Méthodes invasives

4 4 5 7 10 10 11 11 12 12 12 13 13 14 14 14 14 15 15 15 16 17 19 20 21 22 22 23 25 25 26 27 27 28 29 29 31 31

10.1.1. 10.1.2. 10.1.3. 10.1.4. 10.1.5.

10.2. 10.2.1. 10.2.2. 10.2.3.

11. 11.1. 11.2. 11.3. 11.4.

11.4.1. 11.4.2. 11.4.3.

III 1. 2. 3.

3.1. 3.2.

3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5. 3.2.6. 3.2.7.

4. 4.1. 4.2.

5. 5.1.

5.1.1. 5.1.2.

5.2. 6. 7.

7.1. 7.2.

8. 8.1.

8.1.1. 8.1.2. 8.1.3. 8.1.4. 8.1.5. 8.1.6.

8.2.

Endoscopie digestive haute Tests rapides à l'uréase (TRU) Culture Examen histologique Amplification génique PCR Méthodes non invasives Détection antigénique dans les selles Recherche des anticorps sériques Test respiratoire à l'urée marquée Traitement anti-H.pylori Monothérapies Bithérapies Trithérapies Facteurs d’échecs d’éradication Mauvaise observance du traitement Résistance aux antibiotiques Autres facteurs d’échec d’éradication Bactéries lactiques Généralités sur les bactéries lactiques Origine des bactéries lactiques Taxonomie et diversité et taxonomie Taxonomie des bactéries lactiques Diversité des bactéries lactiques Genre Lactobacillus Genre Lactococcus Genre Streptococcus Genre Enterococcus Genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella Genres Pediococcus et Tetragenococcus Genre Bifidobacterium Habitat Présence de bactéries lactiques à l'état libre dans l'environnement Présence de bactéries lactiques en association avec un hôte Métabolisme fermentaire Métabolisme des sucres Voie homofermentaire ou EMP Voie héterofermentaire ou PPC( pentose phosphocétolase) Métabolisme de l'azote Besoins nutritionnels Devenir des bactéries lactiques ingérées Elimination des bactéries lactiques ingérées Suivies des bactéries lactiques dans la lumière intestinales Critères de sélection de bactéries lactiques comme probiotiques Propriétés et critères de sélection des souches probiotiques Résistance à l'acidité gastrique Résistance aux sels biliaires Adhésion aux cellules épithéliales Production de substances antimicrobiennes Résistance aux antibiotiques Critères technologiques Effets des probiotiques sur la santé

31 31 31 32 32 32 32 32 32 33 33 33 34 35 35 35 35 36 36 36 36 36 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41 42 42 42 42 44 45 45 45 46 46 47 47 47 47 48 48 49 49

8.2.1. 8.2.2. 8.2.3. 8.2.4. 8.2.5. 8.2.6.

III 1. 2.

2.1. 2.1.1. 2.1.2.

2.2. 2.3. 2.4.

3. 4.

4.1. 4.2. 4.3. 4.4.

5. 6.

Chapitre II: I. II 1.

1.1. 1.2. 1.3.

1.3.1. 1.3.2. 1.3.3.

1.3.3.1. 1.3.3.2.

1.3.3.2.1. 1.3.3.2.2. 1.3.3.2.3.

1.4. 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5.

2. 2.1. 2.2.

2.2.1. 2.2.1.1. 2.2.1.2.

2.2.2.

Amélioration de la digestion de lactose Réduction du taux de cholestérol Cancérogenèse Réduction du risque de diarrhée Effets sur le système immunitaire Infection par Helicobacter pylori Bactériocines Définition des bactériocines Classification des bactériocines Classe I: les lantibiotiques Type A Type B Classe II: peptides non modifiés Classe III: protéines Classe IV: bactériocines complexe Intérêt des bactériocines Domaines d’applications des bactériocines Typage bactérien Domaine alimentaire Domaines de la médecine humaine et vétérinaire Domaine agricole Mode d'utilisation des bactériocines Mode d'action des bactériocines Matériel et Méthodes Lieu de travail Etude microbiologique Isolement et caractérisation de Helicobacter pylori Prélèvement des biopsies gastriques Test rapide à l'uréase Ensemencement et caractérisation de Helicobacter pylori Broyage des biopsies Coloration de Gram des biopsies gastriques Ensemencement des biopsies gastriques pour la recherche de Helicobacter pylori Culture Identification de H.pylori Examen macroscopique Examen microscopique Identification des caractères biochimiques PCR en temps réel ou PCR quantitative Principe Extraction de l'ADN sur automate NucliSens easyMAG Préparation de Master mix Préparation de mix Amplification de l'ADN Isolement et caractérisation des bactéries lactiques Origine et prélèvement des échantillons du lait Analyses du lait cru Tests préliminaires pH Réduction du bleu de méthylène Analyses microbiologiques

50 50 51 51 51 52 53 53 54 54 55 55 55 58 58 58 59 59 59 60 61 62 62 63 63 65 65 65 65 65 65 66 66 66 66 67 67 67 67 67 68 69 69 69 73 73 73 73 73 73 74

2.2.2.1. 2.2.2.2. 2.2.2.3.

2.3. 2.4. 2.5.

2.5.1. 2.5.2. 2.5.3. 2.5.4. 2.5.5.

2.5.5.1. 2.5.5.2. 2.5.5.3. 2.5.5.4.

2.5.6. 2.5.7.

III. 1. 2.

2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5.

2.5.1. 2.5.2.

2.6. IV 1.

1.1. 1.2. 1.3.

2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6.

3. 3.1. 3.2.

3.2.1. 3.2.2. 3.2.3.

3.3. 3.4. 3.5. 3.6.

Chapitre II:

Diluant Préparation de l'inoculum Dénombrement des microorganismes Isolement des bactéries lactiques Identification phénotypique Identification biochimique et physiologique Test de la catalase Test de l'oxydase Type fermentaire Croissance en milieux hostiles Identification au niveau de l'espèce et sous espèce par les galeries Api20 Strep Préparation de la galerie Préparation de l'inoculum Inoculation de la galerie Lecture Test d'hémolyse Pouvoir acidifiant Examen anatomopathologique et cytologique des biopsies gastriques Fixation des biopsies gastriques Etapes d'un examen ACP Macroscopie Déshydratation Inclusion Microtomie Coloration des lames Coloration à HE Coloration Giemsa Long Montage des lames Etude de l'activité antibactérienne Interaction des bactéries lactiques avec les souches d'H.pylori in vitro Préparation des précultures des souches d'Helicobacter pylori Préparation des précultures des souches de bactéries lactiques Antagonisme Détermination de l'activité bactériocinogénique Préparation de l'extrait bactériocinique Elimination de l'effet des acides organiques et de peroxyde d'hydrogène Effet de l'extrait bactériocinogénique sur H.pylori en milieu liquide Influence du pH sur l'activité des bactériocines Influence de la température sur la stabilité des bactériocines Influence des enzymes sur la stabilité des bactériocines Etude de l'activité antibactérienne in vivo Préparation des souris Analyses microbiologiques des selles de souris Prélèvement des selles Analyses bactériologiques Identification Recherche de Helicobacter pylori dans l'estomac de souris Infection des souris par Helicobacter pylori Traitement des souris infectées par Helicobacter pylori Détection bactérienne Résultats

74 74 74 83 84 85 85 86 86 86 86 87 87 87 87 90 90 91 91 92 92 92 92 94 94 94 94 94 96 96 96 96 96 99 99 99 99 100 100 100 101 101 101 101 102 103 103 103 104 104 106

I. 1.

1.1. 1.2.

1.3.

1.4

2.

2.1. 2.1.1. 2.1.2.

2.1.2.1. 2.1.2.2. 2.1.2.3. 2.1.2.4.

2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3.

II III 1. 2.

2.1. 2.2. 2.3.

3.

Etude microbiologique Isolement et caractérisation de Helicobacter pylori Test rapide à l'uréase Ensemencement des biopsies gastriques pour la recherche d'Helicobacter pylori Observation microscopique des frottis réalisés à partir des biopsies

gastriques Quantification de Helicobacter pylori dans des biopsies gastriques par la PCR temps réel Isolement et caractérisation des bactéries lactiques Analyses du lait cru Tests préliminaires Analyses microbiologiques Dénombrement des germes mésophiles totaux Dénombrement des coliformes fécaux Dénombrement des Clostridium sulfito- réducteurs Dénombrement de streptocoques fécaux et Straphylococcus aureus Isolement des bactéries lactiques Identification phénotypique Identification biochimique et physiologique Pouvoir acidifiant Examen anatomo-pathologique et cytologique des biopsies gastriques Etude de l'activité antibactérienne Interaction des bactéries lactiques avec les souches d’H.pylori in vitro Détermination de l’activité bactériocinogénique Elimination de l’effet des acides organiques et de peroxyde d’hydrogène Effet de l'extrait bactériocinogénique sur H.pylori en milieu liquide Influence du pH, température et enzymes sur les bactériocines Etude de l'activité antibactérienne in vivo Discussion Conclusion Références bibliographiques Annexes Publications Perspectives

106 106 106 107 108 109 113 113 113 114 116 118 119 120 120 120 123 128 131 137 137 142 142 144 145 150 157 182 184

RESUME

L'objectif de ce travail est de chercher des souches de bactéries lactiques qui

pourraient inhiber in vitro et in vivo la croissance d’Helicobacter pylori impliquée dans la

pathologie gastroduodénale. Pour cela, deux souches de Helicobacter pylori (Hp1 et Hp3)

sensibles à la clarithromycine, ont été isolées des biopsies prélevées par endoscopie digestive

haute par culture sur gélose au sang et caractériser par PCR en temps réel. Ces souches ont

provoqué des gastrites aigue et chronique déterminer par un examen anatomopathologique et

cytologique. 30 souches de bactéries lactiques du genre Lactococcus et Enterococcus ont été

isolées à partir des échantillons des laits crus de chèvre, vache, brebis et chamelle prélevés de

différentes régions de l'Algérie. Des interactions ont été réalisées entre des bactéries lactiques

isolées, les deux souches d’Helicobacter pylori et d'autres souches de références (TN2GF4,

J99, 26695, HPAG1) et clinique (HSA3068). La meilleure zone d'inhibition a été constatée

avec la souche TN2GF4 en présence d’Enterococcus faecium (B13) isolée du lait de chèvre

de Miliana (Zi=20mm). La recherche de la substance antagoniste a été réalisée suivant la

méthode de diffusion sur gélose et dans le bouillon après élimination de l'effet des acides

organiques (neutralisation du milieu à pH 6,5) et le peroxyde d'hydrogène (ajout du catalase).

Les substances inhibitrices produites par la souche d'Enterococcus faecium (B13) perdent

leur activité après traitement par la trypsine et la pepsine, mais retiennent cette activité

antibactérienne après traitement thermique pendant 30 minutes à 60oC, 80oC pendant 10

minutes et 100oC pendant 5 minutes. Cette protéine est stable à pH acide et basique. In vivo,

l'administration orale de la souche Enterococcus faecium (B13) réduit le nombre de H pylori

dans l’estomac des souris Balb/c prés d'un log soit 43%.

Mots clés: Lait cru, bactéries lactiques, Helicobacter pylori, PCR en temps réel,

bactériocines, inhibition, in vitro, in vivo.

ABSTRACT

The aim of this study is to find strains of lactic acid bacteria that could inhibit in

vitro and in vivo growth of Helicobacter pylori involved in gastroduodenal pathology. For

that, two strains of Helicobacter pylori (Hp1 and Hp3) sensitive to clarithromycin were

isolated from biopsies by upper gastrointestinal endoscopy after culture on blood agar and

characterized by real-time PCR. These strains have caused acute and chronic gastritis

determined by anatomic pathology and cytology examine. 30 strains of lactic acid bacteria of

Lactococcus and Enterococcus were isolated from samples of milks: raw, goat, cow, sheep

and camel, collected from different regions of Algeria. Interactions were conducted between

lactic acid bacteria isolated, the two strains of Helicobacter pylori and other references

(TN2GF4, J99, 26695, HPAG1) and clinical (HSA3068) strains. The best zone of inhibition

was observed with TN2GF4 strain in the presence of Enterococcus faecium (B13) isolated

from goat milk of Miliana (Zi = 20mm). The search for the antagonist effect was performed

according to agar and broth diffusion method after removing the effect of organic acids

(neutralization of the medium at pH 6.5) and hydrogen peroxide (addition of catalase).

Inhibitory substances produced by Enterococcus faecium (B13) lose their activity after

treatment with trypsin and pepsin, but retain the antibacterial activity after heat treatment for

30 minutes at 60oC, 10 minutes at 80oC and 5 minutes at 100oC. This substance is stable in

acidic and basic pH. In vivo, oral administration of Enterococcus faecium (B13) reduces the

number of H. pylori in the stomach of Balb / c mice near a log or 43%.

Key words: Raw milk, lactic acid bacteria, Helicobacter pylori, real-time PCR, bacteriocins,

inhibition, in vitro, in vivo.

الملخص

ذا العمل هو ع االهدف من ه ا حمض الالآتيك التي يمكن أن تمن ة لبحث عن سالالت بكتيري و جرثوم . نم

Helicobacter pylori ،ذا ام به اس 30للقي ن أجن ك م ض الالآتي ا حم ن بكتيري الالت م و Enterococcus س

Lactococcus ر الماعز، البقر واألغنام وحليب اإلبل التي تم جمعها منحليب المعزولة من عينات . مختلف أنحاء الجزائ

د لحساسة Hp3 وHelicobacetr pylori Hp1ساللتين من م عزل كالريثروميسين ق ا ت التنظير من ه خزعات تؤخذ ب

ى وي عل ه دم الحصان الهضمي العل ذه السالالت تسبب . PCR en temps réelصنفت ب ووسط زرع مضاف الي ه

ة أجريت التفاعالت بين بكتيريا حمض الالآتيك .والخلوية التهاب المعدة الحاد والمزمن تحددها دراسة الباثولوجية المعزول

ادة (TN2GF4, J99, 26695, HPAG1) مراجع وسالالت أخرى Helicobacter pyloriين وسالالت وعي

.(HSA3068) يط أفضل وحظ تثب ع ساللة ل ة من Enterococcus faecium (B13)بوجود TN2GF4 م المعزول

ب الماعز ة لحلي م 20(مليان ثلل).م ادة بح أثير عن الم ى ت د القضاء عل رق بع ار وم ي أج رها ف ة نش ب طريق وهر عق الج

ا ). الكاتالز إضافة(وفوق أآسيد الهيدروجين ) 6.5في درجة الحموضة الوسط ييد تح( األحماض المواد المثبطة التي تنتجه

ذا النشاط المضاد تفقد نشاطها Enterococcus faecium (B13)ساللة د ه بعد العالج مع التربسين وبيبسن، ولكن عق

ائق 5و 80oC في دقائق oC 60 ،10 في دقيقة 30بالحرارة لمدة للبكتيريا بعد المعالجة ذا . oC 100 في دق روتين ه الب

Enterococcus faecium (B13)عن طريق الفم من ساللة استهالك. مستقر في درجة الحموضة الحمضية واألساسية

.في المائة 43لوغاريتم واحد أو بمعدل Balb/c في معدة فئران H.pylori ، خفضت عدد

، Helicobacetr pylori ،PCR en temps réel، الآتيكلا الحليب الخام، بكتيريا حمض: الكلمات الرئيسية المجراه في,المختبر باآتيريوسين،تثبيط، في

Liste des publications et des communications

A. Publications internationales: 1. GUETARNI H., BENSOLTANE A., AICHOUR D., BENABDALLAH Z., KHOUATRIA I.R.

& KHOUATRIA N.K., 2012: In vitro and in vivo Activity of Lactococci Strains against

Helicobacter pylori. OnLine Journal of Biological Sciences. 12 (2): 38-43.

2. GUETARNI H., BENSAID A., & BENSOLTANE A., 2012: analysis of lactic acid responsible

for inhibition in-vitro of Helicobacter pylori by high performance chromatography (HPLC).

Journal of Biotechnology Letters. 3(1): 34-36.

3. GUETARNI Hassina and BENSOLTANE Ahmed, 2013: Isolation and Characterization of

Helicobacetr pylori strains from gastric biopsies of Algerian patients. OnLine Journal of

Biological Sciences. 13(2): 46-54.

B. Communications nationales:

Orales:

1. GUETARNI H. 2007: Effet, in vitro, de certaines bactéries lactiques sur Escherichia coli et

Salmonella typhi. Séminaire nationale: Université de Chlef, filière lait et produits laitiers.

2. GUETARNI H. & LAISSAOUI A., 2013: Alimentation de l'étudiant. Journée scientifique"rein et

prévention". SAPM & Université de Khemis Miliana.

Affichées:

1. LAISSAOUI A., ALLEM R., GUETARNI H., & MADANI M, 2013: Relation entre l’indice

de masse corporelle et l’adiposité. Journée scientifique"Rein et prévention". SAPM &

Université de Khemis Miliana

2. LAISSAOUI A., ALLEM R., GUETARNI H., & OUKACI F/Z, 2013: Impact du syndrome

métabolique sur le développement du diabète type 2 et de l’hypertension artérielle. Journée

scientifique"Rein et prévention". SAPM & Université de Khemis Miliana

i

LISTE DES ABREVIATIONS

µm: Micro mètre ADH : Arginine Dihydrolase AlpA: Adhesin-like Protein A AlpB: Adhesin-like Protein B AMD: Amidon Api : Analytic prophylactic index ARA: Arabinose B: Bifidobacterium BabA: Blood group antigen binding Adhesin BGT: Bouillon Glucose Tamponné C: Crypte CagA: Cytotoxin-associated gene A CagPAI: Cytotoxin-associated gene Pathogenicity Island CE: Cellule Endocrine Ch: Chorion CLO test®: Campylobacter-Like Organism test CM: Cellule à Mucus CMSD: Cellule Muqueuse Superficielle Détachée D : Dextrogyre DO : Densité Optique E.f : Enterococcus faecium ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EMP: Embden Meyerhof Parnas ESC: Esculine FC: Fibre Collagène FR: Fibre Réticulaire G.désoxy: Gélose désoxycholate GLU : Glucose GLYG: Glycogène h : Heure H.pylori: Helicobacter pylori Hem: Hémolyse HIP : Hippurate HUT test®: H.pylori Urea Tube test INRA: Institut National des Recherches Agronomiques INU: Inuline L : Leuvogyre LAC: Lactose LAP: Leucine aminopeptidase Lb: Lactobacillus Lc: Lactococcus LDC : Lysine Décarboxylase Lg: Lumière Glandulaire LPS: Lipopolysaccharide MALT: Mucosae Associated Lymphoid Tissue

ii

MAN: Mannitol MAN: Mannose min: Minute mL: Millilitre mm: Millimètre MRS: Man Rogosa Sharp Muc5ac: Mucin 5, subtypes A and C Muc6: Mucin 6 NaCl : Chlorure de sodium NIN:Ninhydrine nm : Nanomètre ODC : Ornithine Décarboxylase OMP: Outer Membrane Protein ONPG : Ortho-Nitro-Phényl-β-D- Galactopyranoside P: Polynucléaire PAL: Phosphatase Alcaline Pc: Pediococcus PCA: Plate Count Agar PCR : Polymerase Chain Reaction PEP: Phosphoénolpyruvate pH: Potentiel Hydrogène Pi: Phosphate inorganique PN: Polynucléaire Neutrophile PPC: Pentose Phosphocétolase PYRA: Pyrrolidonyl Arylamidase RAF: Raffinose RIB: Ribose SAC : Saccharose Sc: Streptococcus SFM: Serum-Free Medium SOD: Super Oxyde Dismutase SOR: Sorbitol T4SS: Type IV Secretion Systems TFF1: Trefoil Factor 1 TNF: Tumor Necrosis Factor TRE: Tréhalose TRU : Test Rapide à l’Uréase TSA: Trypticase Soja Agar TSI : Triple Sugar Iron UFC: Unité Formant Colonie URE : Urée VacA: Vacuolation Cytotoxin Vf: Viande foie Vp: Voges proskauer Zi: Zone d’inhibition α GAL: α Galactosidase β GAL: β Galactosidase β GUR: β Glucuronidase

iii

LISTE DES TABLEAUX

Page Tableau I :

Tableau II :

Tableau III :

Tableau IV :

Tableau V:

Tableau VI:

Tableau VII:

Tableau VIII:

Tableau IX:

Tableau X:

Tableau XI:

Tableau XII:

Tableau XIII:

Tableau XIV:

Tableau XV:

Pourcentage de quelques bactéries d’origine alimentaire dans l’intestin

grêle humain

Exemples de souches probiotiques dans des produits

Sexe et l'âge d'un échantillon de patients.

Tableau d’identification par galerie api 20 Strep

Souches de Helicobacter pylori

Résultats de la détection qualitative

Tm, Aire, L et l de chaque pic.

Résultats des tests de pH et la réductase des échantillons du lait cru

Résultats des analyses microbiologiques des échantillons du lait cru

Nombre moyen de colonies dénombrées (UFC/mL) dans chaque type

de lait.

Caractères physiologiques des souches de bactéries lactiques

Résultats de l'identification des bactéries lactiques obtenus par Api20

strep et le test d'hémolyse.

Résultats de l'identification des espèces de bactéries lactiques

Cytologie des coupes histologiques des biopsies gastriques.

Diamètres des zones d'inhibition (mm) des bactéries lactiques vis-à-vis

des souches d' H.pylori

46

52

65

88

97

111

112

115

117

121

125

126

127

132

138

iv

LISTE DES FIGURES

Page Fig. 1 : Fig. 2 : Fig. 3 : Fig. 4 : Fig. 5 : Fig. 6 : Fig. 7 : Fig. 8 : Fig. 9 : Fig. 10: Fig. 11: Fig. 12: Fig. 13: Fig. 14: Fig. 15: Fig. 16: Fig. 17: Fig. 18: Fig. 19: Fig. 20: Fig. 21: Fig. 22: Fig. 23: Fig. 24: Fig. 25: Fig. 26: Fig. 27: Fig. 28: Fig. 29: Fig. 30: Fig.31: Fig.32: Fig.33: Fig.34: Fig.35:

Anatomie de l’estomac Muqueuse et glandes de l'estomac Des mécanismes majeurs de régénération et restitution épithéliales La génération des différents types cellulaires à partir des cellules souches dans les glandes gastriques antrale et fundique Schéma représentatif du gène VacA Schéma représentant les différentes activités de la protéine VacA de H. pylori sur les cellules épithéliales de la barrière gastrique Représentation schématique de l'îlot de pathogénicité cag (PAI) Rôle de l'îlot cag et de la protéine CagA Structure de l'appareil flagellaire de H.pylori Structure de l'uréase de H.pylori, A: structure tertiaire; B: assemblage dodécamérique Schéma du lipopolysaccharide de H. pylori Pathologies gastriques associées à l'infection par Helicobacter pylori Evolution de l’infection à H.pylori vers les maladies gastriques en fonction de l'âge Arbre phylogénétique des principaux genres de bactéries lactiques et des genres associés, obtenu par analyse des ARNr 16S Transport et métabolisme du lactose et du galactose chez les bactéries lactiques Schéma du système protéolytique de Lactococcus lactis Lieu de réalisation de la partie expérimentale Etapes de l'extraction d'ADN dans NucliSens easyMAG® (technologie de Boom) Le thermocycleur LightCycler ® 2.0 Génération de la fluorescence par mécanisme FRET (Fluorescence Resonnance Energy Transfert) Les phases d'une courbe d'amplification d'ADN par PCR en temps réel Dénombrement des germes mésophiles aérobies totaux sur gélose PCA Recherche des streptocoques fécaux dans le lait cru (test de présemption et de confirmation Dénombrement des coliformes fécaux du lait cru sur gélose désoxycholate Dénombrement de Staphylococcus aureus du lait cru sur gélose chapman Dénombrement de Clostridium- sulfito réducteurs du lait cru sur gélose viande-foie Isolement et caractérisation des bactéries lactiques sur gélose M17 Préparation d'une galerie Api20 strep. Etapes d'un examen ACP (Anatomie Cytologique et Pathologique) Etapes de la coloration à Hématoxyline éosine Interaction des bactéries lactiques avec les souches de Helicobacter pylori in vitro. Etapes de détection d’H.pylori après dissection des souris. Test rapide à l'uréase Aspect des colonies de Helicobacter pylori sur gélose maison après incubation à 37oC pendant 7jours et sous atmosphère microaérophile. Aspect des cellules de Helicobacter pylori après culture sur gélose maison

05 07 08 09 17 19 20 21 23 24 27 28 30 37 43 44 64 68 70 72 72 78 79 80 81 82 84 89 93 95 98 105 106 107 108

v

Fig.36: Fig.37: Fig.38: Fig.39: Fig.40: Fig.41: Fig.42: Fig.43: Fig.44: Fig.45: Fig.46: Fig.47: Fig.48: Fig.49: Fig.50: Fig.51: Fig.52: Fig.53: Fig.54: Fig.55:

sous microscope optique après coloration de Gram (10X100) Observation microscopique d'un frottis préparé à partir d'une biopsie gastrique et coloré par la méthode de Gram (10X100). Courbes d'amplification qui exprime la quantité d'amplicons produits (Fluorescence (640/530) émise en fonction du nombre de cycles: témoin positif (détecte la présence des souches Wildtype) (courbe bleu), témoin négatif (H2O) (courbe vert clair), biopsie 1(courbe rouge), biopsie 2 (courbe noir), biopsie 3(courbe rose), et biopsie 4 (courbe en vert foncé)). Analyse des courbes de fusion: Fluorescence (640/530) émise en fonction de la température: témoin positif (courbe bleu), témoin négatif (courbe vert clair), biopsie 1(courbe rouge), biopsie 2 (courbe noir), biopsie 3(courbe rose), et biopsie 4 (courbe vert foncé). Les courbes de fusion : dérivées primaires donnant les Tm afin de déterminer les souches wildtype et mutantes. La courbe de fusion des souches d'H.pylori Wildtype de la biopsie 1 (courbe rouge) (Tm = 64,48) et la biopsie 3 (courbe rose) (Tm= 63,913). Résultats de dénombrement des Germes aérobies mésophiles totaux (GAMT) dans les échantillons du lait cru. Résultats de dénombrement des coliformes fécaux (CLF) dans les échantillons du lait cru. Résultats de dénombrement des Clostridium sulfito-réducteurs (CSD) dans les échantillons du lait cru. Aspect des bactéries lactiques sur gélose M17:A: Enterococcus, B: Lactococcus Observation des bactéries lactiques genre Lactococcus sous microscope optique après coloration de Gram (10X100). Observation des bactéries lactiques genre Enterococcus sous microscope optique après coloration de Gram (10X100). Répartition des souches de bactéries lactiques selon l'espèce dans les échantillons du lait cru. Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Lactococcus lactis subsp. lactis. Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Lactococcus lactis subsp cremoris. Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Enterococcus faecium. Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Lactococcus garvieae. Gastrite aigue type B oedimateuse (présence des vaisseaux sanguins) (grande flèche), infection légère à H.pylori+: arcs, bâtonnets (flèche rouge) dans la lumière glandulaire: A: HE, B:Giemsa Gastrite chronique avec atrophie glandulaire modérée (grande flèche), infection modérée à H.pylori++: arcs, bâtonnets et coccis (flèche rouge) dans la lumière glandulaire de la muqueuse gastrique: A:HE, B:Giemsa L Gastrite aigue type B oedimateuse (présence des vaisseaux sanguins) (grande flèche), infection légère à H.pylori+: arcs et bâtonnets (flèche rouge) dans la lumière glandulaire et au contact de l'épithélium gastrique (flèche rose): A: HE, B:Giemsa L Observation microscopique d'une glande pylorique à 1000 après coloration A:HE et B: Giemsa lent Activité antibactérienne des souches de Lactococcus et Enterococcus vis-à-

108 110 112 113 116 118 120 121 122 122 124 129 129 130 130 133 134 135 136 140

vi

Fig.56: Fig.57: Fig.58: Fig.59: Fig.60: Fig.61: Fig.62: Fig.63: Fig.64: Fig.65: Fig.66: Fig.67:

vis des souches d'Helicobacter pylori par la méthode de diffusion sur gélose: A: TN2GF4, B: J99, C: 26695 et D: HSA3068. Activité antibactérienne des souches de Lactococcus et Enterococcus vis-à-vis des souches de Helicobacter pylori par la méthode de diffusion sur gélose:A: HPAG1, B: Hp1, C:Hp3. Effet de l'extrait cellulaire (EC) et la fraction extracellulaire (FEC) de Enterococcus faecium (B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la méthode de diffusion sur gélose:A:TN2GF4, B: J99, C:HSA3068, D: 26695. Nombre de colonies de Helicobacter pylori obtenus après culture sur gélose Brucella. Effet de pH(4 et 8) sur l’activité bactériocinogénique de Enterococcus faecium (B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la méthode de diffusion sur gélose:A:TN2GF4, B: J99, C:HSA3086, D: 26695. Effet du traitement thermique (60°C pendant 30min, 80°C pendant 10min et 100°C pendant 5min) de la fraction extracellulaire (FEC) de E.faecium (B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la méthode de diffusion sur gélose: A: TN2GF4, B:J99, C: 26695, D: HSA3086. Effet des enzymes (Pepsine, Trypsine et α- Amylase) sur la fraction extracellulaire de E.faecium (B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la méthode de diffusion sur gélose: A: TN2GF4, B: J99, C: HSA3086, D: 26695. Les microorganismes présents chez des souris Balb/C (lot témoin) Aspect d'une biopsie gastrique prélevée de l’estomac d’une souris après coloration de Gram (10X100). Aspect d'une biopsie gastrique prélevée de l’estomac d’une souris infectée après coloration de Gram (10X100). Aspect des colonies de Helicobacter pylori isolée sur gélose au sang d'une biopsie gastrique prélevée de l’estomac d’une souris infectée après incubation à 37oC pendant 5jours sous atmosphère microaérophile. Nombre de colonies d’H pylori après traitement par Enterococcus faecium (J21 et J30). Culture de Enterococcus faecium à partir des selles des souris traité

141 143 145 147 148 149 151 152 153 154 155 156

vii

INTRODUCTION

Introduction

INTRODUCTION

L’infection à H. pylori est universellement répandue mais elle est plus élevée dans

les pays en voie de développement, dont 78 % en Algérie (Joutei et al. 2010). Cette bactérie

vient en tête des facteurs déclencheurs du cancer de l’estomac, qui vient en deuxième

position des cancers les plus répandus en Algérie. On estime que 8 personnes sur 10, en

Algérie, sont porteurs de la bactérie Helicobacter pylori, soit 90 % de la population. Le

cancer de l’estomac est plus répandu chez les personnes âgées de 50 à 60 ans dont les

hommes sont les plus touchés par cette pathologie. Les prévisions de l’Institut National de

Santé Publique font état de 45000 nouveaux cas de cancer par an, soit 120 cas pour 100.000

habitants, tandis que celui du cancer de l’appareil digestif est de 20 cas pour 100000

habitants (4000 cas/an) (Santé-Mag, 2013).

Helicobacter pylori est la seule bactérie connue capable de résister aux conditions

extrêmement acides de l’estomac humain et d’infecter la paroi de cet organe en provoquant

la maladie ulcéreuse gastroduodénale. Elle correspond à une destruction localisée de la

muqueuse gastrique ou duodénale résultant d'un déséquilibre entre des facteurs d'agression

(sécrétion acide, Helicobacter pylori et médicaments) et de défense-réparation (barrière

mucus-bicarbonates, prolifération épithéliale, flux sanguin muqueux, sécrétion de

prostaglandines). Le mécanisme physiopathologique qui aboutit à la formation de l'ulcère

est complexe, et fait intervenir de nombreux médiateurs de l'inflammation, et des facteurs

environnementaux sur un terrain génétique particulier (Bouarioua et al. 2007).

L'éradication de H. pylori est difficile car les antibiotiques utilisés doivent parvenir

dans le mucus gastrique et y atteindre une concentration bactéricide malgré le milieu acide

qui diminue leur activité. En outre, H. pylori a une capacité élevée de variation génomique,

responsable de l'émergence fréquente de résistances sous la pression de sélection des

antibiotiques. Ces contraintes expliquent que les traitements d'éradication doivent associer

deux antibiotiques et un traitement antisécrétoire à forte posologie pour élever le pH

intragastrique (Conférence de consensus, 1999).

1

Introduction

L’utilisation des antibiotiques pour le traitement de l’infection à H pylori n’étant

pas toujours efficace, et a de nombreux effets secondaires y compris la stimulation de la

résistance des agents pathogènes. C’est pour cela que l’application alternative de probiotique

est mise en place (Felley et Michetti , 2003).

Au cours des dernières années, les maladies humaines et les bactéries probiotiques,

sont devenues des domaines interdépendants. Les probiotiques ont été recommandés comme

agents biothérapeutiques alternatives contre les infections gastro-intestinales. Ils ont des

applications à valeur commerciale, plusieurs formes sont disponibles: gélules ou dans des

produits alimentaires fonctionnels tels que le yaourt, jus de fruits fermentés et les saucisses.

Les bactéries probiotiques ont été documentés comme étant efficace dans les applications

biothérapeutiques contre les agents pathogènes gastro-intestinaux. Cette alternative

application thérapeutique de probiotiques pour protéger contre les infections gastro-

intestinales peut être d'une grande importance pour l'usage médicinal dans l'avenir

(Thirabunyanon , 2011).

Les bactéries lactiques, font partie des bactéries probiotiques, sont utilisées depuis

des siècles pour la fermentation et bioconservation des aliments, cependant le développement

de nouvelles technologies de biologie moléculaire ouvre une perspective d’utilisation de ces

bactéries comme agents biothérapeutiques (Heymann et Heulevin ,2006). Ces microorganismes produisent de nombreux métabolites aux propriétés

antimicrobiennes tels que les acides organiques, le peroxyde d'hydrogène et les bactériocines

(Dortu et Thonart, 2009). Ces peptides présentent un intérêt dans la capacité d'inhiber la

croissance des germes pathogènes (Delves-Broughton, 1990). Les effets bénéfiques

potentiels des bactéries lactiques suscitent un intérêt croissant, certains sont maintenant bien

établis tels que l’amélioration de la digestion du lactose et le traitement des désordres

diarrhéiques (Draouault et Corthier ,2001).

2

Introduction

Dans ce contexte que s'inscrit notre étude dont les objectifs sont les suivants:

1. Isolement des souches de H.pylori à partir des biopsies gastriques;

2. Caractérisation phénotypique, biochimique et moléculaire des souches d'H.pylori isolées;

3. Isolement et caractérisation des souches de bactéries lactiques à activité

bactériocinogénique à partir du lait cru de vache, chèvre, brebis et chamelle;

4. Examen anatomopathologique et cytologique des biopsies gastriques prélevées par

endoscopie digestive haute;

5. Recherche des espèces des bactéries lactiques à activité antibactérienne in vitro vis-à-vis

Helicobacter pylori et caractérisation des bactériocines extraites à partir de la bactérie

lactique qui a montré un pouvoir inhibiteur important in vitro;

6. Déterminer l'effet probiotique in vivo.

3

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

Revue bibliographique

I. Rappel anatomique et histologique:

1. Estomac:

L’estomac est un segment dilaté du tube digestif en forme de poche, situé entre

l’oesophage et le duodenum. Chez l’adulte, il mesure 20 cm de long et se trouve en rapport

avec le foie, la rate, le pancréas, le diaphragme et les intestins. L’estomac permet d’assurer

une partie de la digestion par des fonctions mécaniques et chimiques. Il présente deux

sphincters : le sphincter oesophagien situe au niveau du cardia permettant la jonction avec

l’oesophage et le sphincter pylorique situe au niveau du pylore permettant la sortie vers le

duodenum (Figure 1) (Sherwood, 2006). Il présente deux courbures: la petite courbure est

courte, siège sur la face postérieure de l’estomac, et elle est la continuation vers le bas de la

paroi postérieure de l’oesophage. Juste avant le sphincter pylorique, elle s’incurve vers la

droite et le haut pour réaliser la forme de J. Là où l’oesophage rejoint l’estomac, la région

antérieure forme un angle aigu vers le haut puis s’incurve vers le bas, formant la grande

courbure, qui se dirige ensuite vers le sphincter pylorique. Grace à sa musculature, l’estomac

malaxe les aliments et les transforme en substance semi-fluide constituée d’aliments

partiellement digérés, d’eau, de diverses enzymes de digestion et d’acide chlorhydrique

(HCl), le chyme. Celui-ci est éjecté dans le duodenum par relachement du pylore. Le pylore

a pour fonction essentielle la formation d’un reservoir assurant la continence gastrique.

L’estomac est composé de 3 régions : le fundus, le corps et l’antre qui se distinguent par une

composition cellulaire et fonctionnelle différentes (Helander, 1981).

Sur le plan histologique, la paroi interne de l’estomac est constituée de différentes

couches :

La muqueuse : c’est la première couche en contact avec le bol alimentaire. Elle est

constituée par l’épithélium et la lamina propria ainsi que d’une fine couche de muscle lisse la

séparant de la sous-muqueuse. Elle est recouverte de mucus.

La sous-muqueuse : constituée d’une couche de tissu conjonctif fibreux et vascularisé

assurant l’irrigation des cellules gastriques.

La couche musculaire: constituée de 3 couches de fibres:

- La couche musculaire oblique interne est responsable du mouvement de brassage

mécanique des aliments. Cette couche est specifique à l’estomac et n’est présentée dans

aucun autre organe du système digestif. La paroi musculaire interne de l’antre est plus

épaisse que celle du fundus assurant des contractions plus forcées.

4


- La couche musculaire circulaire qui est également plus forte au niveau de l’antre. Cette

couche est concentrique à l’axe longitudinal de l’estomac.

- La couche musculaire longitudinale externe

La sereuse : elle est composée de plusieurs couches de tissu conjonctif en continuite avec le

péritoine qui recouvre la totalité de la paroi externe de l’estomac.

Fig. 1: Anatomie de l’estomac (Sherwood, 2006; Kierszenbaum, 2006).

2. Epithélium gastrique:

Les glandes gastriques sont identifiées en fonction de leur localisation et sont

enchassées dans l’épithélium cylindrique sous forme d’invaginations tubulaires ou cryptes

gastriques. Les unités antrales et fundiques sont trés différentes sur le plan histologique. Les

glandes fundiques constituent entre 70% et 80% du total des glandes présentes dans

l’estomac et sont les plus complexes. Elles comprennent 5 types majeurs de cellules

épithéliales matures (Figure 2) : les cellules à mucus (ou mucocytes), les cellules pariétales,

5


les cellules principales, les cellules endocrines et les cellules regéneratrices. Les glandes

pyloriques, situées au niveau du pylore, ne présentent que 15% des glandes gastriques et sont

essentiellement constituées de cellules endocrines, de cellules à mucus et de cellules

regénratrices.

Cellules à mucus (ou mucocytes) : ces cellules sécretent un mucus riche en glycoprotéines :

les mucines. Le mucus joue un rôle dans la lubrification et la protection de la muqueuse

contre l’autodigestion en formant un film protecteur neutralisant l’acidité et empechant la

pepsine d’entrer en contact direct avec la paroi gastrique (Allen and Flemstrom, 2005). Les

mucines joueraient egalement un rôle dans la défense antimicrobienne contre le pathogène

gastrique Helicobacter pylori (Kawakubo et al. 2004; Fukuda et al. 2006).

Cellules pariétales: qui produisent du HCl nécessaire à la conversion du pepsinogène en

pepsine, à l’absorption du fer et à maintenir l’environnement gastrique suffisamment acide

pour assurer la dénaturation et digestion des protéines issues de l’alimentation. Le HCl limite

également le developpement de microorganismes au niveau gastrique et joue un rôle dans

l’équilibre des populations cellulaires. Les cellules pariétales produisent également une

protéine particulière : le facteur intrinséque, qui se lie sous forme de complexe à la vitamine

B12 et qui est indispensable à son absorption intestinale (Sherwood, 2006).

Cellules principales: qui secrètent deux molécules nécessaires à la digestion gastrique, le

pepsinogène, précurseur de la pepsine et une lipase gastrique. Le pepsinogène est une

proenzyme denuée d’activité protéolytique et convertie en pepsine en présence d’acide. La

pepsine est une protéase digestive assurant la dégradation des protéines en acides aminès

(Dunn, 2001). La lipase est impliquée dans la dégradation des lipides en acides gras

(Canaan et al. 1999).

Cellules endocrines: principalement situées au niveau de l’antre, responsables de la

sécrétion de gastrine, d’histamine, de somatostatine ainsi que d’autres hormones qui

régulent les différents processus associés à la digestion (Sherwood, 2006).

Cellules regénératrices (ou cellules souches): présentes au niveau des glandes antrales et

fundiques, sont impliquées dans les processus de réparation tissulaire, de regénération et

auto-renouvellement de l’épithélium gastrique. Certains peptides et neuropeptides gastriques,

en plus de leur rôle régulateur des fonctions gastriques, possèdent des propriétes de facteurs

de croissance et interviennent dans le processus de renouvellement des cellules épithéliales.

C’est le cas de la gastrine qui possède un effet prolifératif et de la somatostatine qui

possède un effet antiproliferatif (Sherwood, 2006).

6


Fig. 2: Muqueuse et glandes de l'estomac (Hoffman, 2008).

3. Renouvellement tissulaire épithélial :

L’épithélium gastrique assure plusieurs fonctions physiologiques lui permettant de

maintenir son intégrité fonctionnelle : la production de mucus et de peptides antimicrobiens,

la régulation des reponses immunitaires et inflammatoires, la regénération (auto-

renouvellement) et la réparation tissulaire. Le maintien de l’intégrite tissulaire épithéliale est

assuré par deux processus complémentaires (Figure 3) :

La regénération continue: qui se fait via la prolifération et la différenciation des cellules

souches progénitrices. Ce processus est responsable de l’auto-renouvellement de la

muqueuse épithéliale et dure tout au long de la vie adulte. La regénération tissulaire à partir

des cellules souches somatiques multipotentes est un mécanisme proéminant au niveau des

muqueuses épithéliales (Alison et al. 2006; Blanpain et al. 2007). La différenciation des

cellules souches progénitrices peut être dérégulée suite à certaines infections chroniques

entrainant éventuellement des transformations néoplasiques malignes et des tumeurs.

7


La réparation tissulaire (restitution): qui permet la restitution rapide des lesions

superficielles de la muqueuse. La re-épithélialisation se fait par migration des cellules

avoisinantes vers le site de la lésion. Ce processus commence quelques minutes aprés la

lésion (Silen and Ito, 1985; Hoffmann, 2005). L’auto-renouvellement tissulaire de

l’épithélium gastrique (antre et fundus) se fait par la prolifération et la différenciation de

cellules souches somatiques multipotentes adultes présentes dans une zone germinative

(isthme) à l’interieur de chaque glande gastrique (Gordon and Hermiston, 1994; Karam,

1999). Les cellules souches somatiques multipotentes sont entourées par les fibroblastes

subépithéliaux auxquels elles adhèrent fortement (Figure 4) (Powell et al. 1999; Powell et

al. 2005; Andoh et al. 2007). Les fibroblastes subépithéliaux secrètent une multitude de

facteurs de croissance en particulier le Hepatocyte Growth Factor (HGF), le transforming

growth factor β1 (TGF-β1) ainsi que des protéines morphogénetiques osseuses, des

métalloprotéinases matricielles (MMPs), des inhibiteurs de métalloprotéinases (TIMPs) et du

collagène de types I, III et IV (Wagner, 2007; Hoffmann, 2008)

Fig. 3: Deux mécanismes majeurs de regénération et restitution épithéliales (Hoffman,

2008).

8


La division des cellules souches peut être symétrique permettant la génération de

deux cellules-filles souches ou asymétrique permettant de générer une cellule souche et une

cellule plus différenciée (Morrison and Kimble, 2006). A partir de l’isthme, les cellules

souches somatiques migrent d’une manière bidirectionnelle pour se différencier via des

mécanismes de maturation assez complexes en mucocytes, en cellules pariétales, principales

ou endocrines (Kierszenbaum, 2006; Quante and Wang , 2009)

Fig. 4: La génération des différents types cellulaires dans les glandes gastriques antrale et

fundique (Hoffmann, 2008)

9


I. Helicobacter pylori:

1. Historique :

En 1875 des scientifiques allemands constatèrent la présence d’une bactérie

hélicoïdale dans des estomacs humains. Ils abandonnèrent les recherches car ils n’arrivèrent

pas à la cultiver. Il fallut attendre jusqu’à 1982 pour que deux chercheurs australiens J.Robin

Warren et Barry J Marshall au cours des recherches consistant aient pu isoler et cultiver des

organismes à partir d’estomacs humains (Kidd et Modlin, 1998).

Ils pensèrent à réaliser les cultures de biopsies gastriques sur gélose chocolat en

atmosphère microaérophile. Un temps d’incubation de 2 à 3 jours ne leur permit tout d’abord

pas d’obtenir de culture. En avril 1982, des milieux de culture avaient été oubliés dans

l'étuve, la culture s'avéra positive au bout de 5 jours, indiquant la nécessité d'un temps de

culture plus long pour isoler la bactérie. Elle fut alors assimilée au genre Campylobacter sur

la base de sa morphologie spiralée et de la présence de flagelles engainés. Dans leur

publication originelle, R.Warren et B. Marshall postulèrent que la plupart des ulcères

gastriques étaient causés par cette bactérie, et non par le stress ou la nourriture épicée,

comme on le pensait auparavant. Cette découverte leur valut le prix Nobel en 2005 de

physiologie et de médecine.

La communauté médicale tarda à reconnaître la responsabilité de cette bactérie dans

la genèse des ulcères gastro-duodénaux, pensant qu'aucune bactérie ne pouvait survivre dans

l'environnement acide de l'estomac. Il a fallu que B. Marshall absorbe une culture de

H.pylori et développe une gastrite qu’il traita avec des antibiotiques, pour convaincre la

communauté médicale. Coghlan et al. (1987) puis Marshall et al. (1988) confirmèrent

l’importance de l’éradication de la bactérie pour prévenir les récidives d’ulcère.

En 1994, l' Institut Nationale de la Santé affirmait que la plupart des ulcères

gastriques récurrents étaient causés par H. pylori et recommandait l’adjonction

d’antibiotiques. En effet, avant que ne soit reconnu le rôle de H. pylori, les ulcères gastriques

étaient traités par des antiacides qui n’évitaient pas les rechutes. Le subsalicylate de bismuth

était largement utilisé mais bien que vraisemblablement bactéricide, il fut abandonné en

raison de sa toxicité neurologique. En 1994, H. pylori a été classée parmi les agents

carcinogènes de classe I par l’Organisation Mondiale de la Santé. Elle fut initialement

10


nommée Campylobacter pyloridis, puis Campylobacter pylori (après correction

grammaticale latine). Sur la base de la séquence de l’acide ribonucléique (ARN) 16S, de la

composition en acide gras et de la morphologie des flagelles, cette bactérie a été renommée

en 1989 Helicobacter pylori, représentant ainsi le chef de file d’un nouveau genre bactérien

Helicobacter (Goodwin et al. 1989).

2. Classification :

Le genre Helicobacter tire son nom de la forme hélicoïdale, et le nom pylori vient

du latin« pylorus »faisant référence à l’ouverture circulaire pylore (Dominique, 2008). Ce

genre appartient à la famille des Helicobacteriaceae (Campylobacterales, division epsilon de

la classe des Proteobacteria), comprenant aussi les genres Flexispira, Sulfuricurvum,

Sulfurimonas, Thiovulum et Wolinella (Euzéby, 2008).

En 2008, le genre Helicobacter regroupe 31 espèces différentes ayant un statut dans

la nomenclature bactérienne, mais de nombreuses autres espèces n'ont pas encore été

validement publiées où sont placées dans la catégorie Candidatus : "Helicobacter colifelis",

"Helicobacter muricola", "Helicobacter suncus", "Helicobacter westmeadii", "Helicobacter

winghamensis", "Candidatus Helicobacter bovis", "Candidatus Helicobacter heilmannii",

"Helicobacter-like organisms" (Euzéby, 2008).

D'autres espèces d'Helicobacter constituées d’espèces entéro-hépatiques sont

retrouvées dans le tractus intestinal et le foie des mammifères et des oiseaux. Elles peuvent

occasionner des inflammations ou des affections malignes chez des individus présentant un

déficit immunitaire. Les principales espèces retrouvées chez l’homme sont : H. canadensis,

H. canis, H. cinaedi, H. fennelliae, H.pullorum, H. rappini et H. winghamensis (Jay et

Schauer, 2001, Laharie et al. 2009).

3. Caractères morphologiques et biochimiques :

H. pylori est une bactérie pathogène, ne colonise que la muqueuse gastrique et

n’infecte pas le duodénum s’il n’y pas de métaplasie gastrique. Elle est du genre

Helicobacter et sa définition se résume en trois mots : helico (du grec hélikoïde, qui veut dire

spiralée); bacter (bâtonnet) ; pylori (désigne le pylore). Ce qui donne un bâtonnet spiralé du

pylore (Bigard, 2004).

11


H.pylori apparaît comme une bactérie mobile, incurvée ou spiralée, à Gram négatif,

de 2 à 4 µm de longueur et de 0.5 à 1 µm de largeur (Denis et al. 2007). Toutes les souches

de H.pylori ne réduisent pas les nitrates, mais produisent une oxydase, une catalase, une

uréase très active, une phosphatase alcaline, une gamma-glutamyl transférase, une leucine

aminopeptidase et une ADNase (Matysiak, 1998 ; Skoulobris et al. 2000). La culture de

H.pylori requiert une atmosphère humide et microaérophile (5-6% O2, 8-10% CO2, 80-85%

N2). C’est une bactérie exigeante, nécessitant la présence de 5 à 10% du sang (mouton ou

cheval) ainsi que de compléments vitaminiques (Vincent et Leclerc, 1991; Skoulobris et al.

2000).

4. Réservoir :

Le seul réservoir identifié est la muqueuse gastrique, y compris dans ses

localisations ectopiques comme l’œsophage ou le diverticule de Meckel. En dehors de

l’estomac, H. pylori a pu exceptionnellement être isolée par culture des selles, de la salive et

de la plaque dentaire. L’eau et l’alimentation pourraient être des réservoirs occasionnels

puisqu’ une survie de la bactérie a pu être obtenue après contamination artificielle de ces

milieux (Vincent et Leclerc, 1991 ; Megraud et Broutet, 2000).

5. Mode de transmission :

5.1. Transmission oro-orale:

L’infection gastrique à H pylori s’accompagne d’une excrétion dans le milieu

extérieur de bactéries conservant leur viabilité. L’hypothèse de la contamination à partir de la

salive s’appuie sur plusieurs arguments : c’est le mode prédominant de transmission des

Helicobacters chez l’animal et chez l’homme, le visage de l’enfant en contact étroit avec

celui des adultes qui l’entourent, est hautement exposé à leurs projections salivaires

(Giacomo, 1994). Des cas de coïnfection mère-enfant (même souche hébergée par les deux)

ont été décrits, ainsi qu’un risque accru d’infection lorsque la mère mastique préalablement

les aliments, qu’elle va donner à son enfant (Vincent, 1994). La mise en évidence de

H. pylori au niveau de la plaque dentaire et la détection du génome bactérien dans la salive,

sont aussi en faveur d’une transmission oro-orale (Remot et al. 1994).

12


5.2. Transmission féco-orale:

L’isolement de H pylori dans des selles de sujets africains, oriente plutôt vers une

transmission de type féco-orale (Remot et al. 1994). La transmission féco-orale se fait par

exposition particulière de l’enfant, qui porte facilement ses doigts à la bouche après la

manipulation d’objets souillés (Vincent, 1994).

6. Prévalence:

L’infection à H.pylori est l’infection bacterienne la plus répandue dans le monde

(50 % de la population) mais il existe de grandes disparites géographiques. En effet, sa

prevalence est > 90 % en Asie, Amerique latine et pays en voie de developpement, de 50 à

70 % en Europe de l’Est et de 30 % environ dans les pays occidentaux (Biomnis, 2012).

De très nombreuses études épidémiologiques ont été effectuées sur des populations

asymptomatiques. Ces différents travaux, ont tous permis de démontrer le caractère

ubiquitaire de l’infection à H. pylori, mais la prévalence varie en fonction du pays, l’âge,

l’origine éthnique, des conditions socio-économiques, la promiscuité et l’hygiène (Faucher,

1994 ; Sobhani, 2004).

Dans les pays développés, 22% de la population est infectée à l’âge de 20 ans et

66% à l’âge de 60 ans (Malaty, 2007). L’incidence de l’infection est nettement inférieure

durant l’enfance puisque seulement 10% des enfants de 10 ans sont atteints (Gasbarrini et

al. 1995). Dans les pays en voie de développement, l’incidence de l’infection est supérieure

durant l’enfance puisque 70% à 80% des enfants de 10 ans sont atteints (Adler-Shohet et al.

1996 ; Guisset et al. 1997).

Dans une étude menée entre 2003 et 2004, les chercheurs de CHU de Hussein-Dey

ont dévoilé une extrême fréquence de l’infection chronique par H.pylori dans la population

générale. Sur un échantillon de 400 enfants et de 431 adultes, il a été retrouvé une prévalence

moyenne de 37% chez l’enfant (56% à 16 ans) et de 86% chez l’adulte (96% pour les adultes

de plus de 50 ans). Selon les conclusions de ces travaux, en Algérie la séroprévalence est très

élevée, acquise très tôt dans l’enfance (Guechi, 2008).

13


7. Physiopathologie de l’infection à H. pylori:

7.1. Phase aiguë :

Elle apparaît après ingestion, pénétration et déplacement de H.pylori dans le mucus

grâce aux flagelles. L’activité uréasique de H.pylori permet sa survie en milieu acide en

alcalinisant le milieu ambiant grâce à la production d'ammoniac. 20% des bactéries adhèrent

aux cellules épithéliales par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques. H. pylori provoque une

diminution de la couche de mucus, fragilisant ainsi la muqueuse et lèse l'épithélium en

produisant des cytotoxines ou des enzymes protéolytiques induisant l'altération des jonctions

intercellulaires. Cette phase est caractérisée par une inflammation aiguë avec présence de

polynucléaires. L'IL-8 sécrétée par les cellules épithéliales en réponse à l'infection par

H.pylori permet le recrutement des polynucléaires neutrophiles qui, en phagocytant les

bactéries, vont libérer des substances toxiques entretenant les lésions. Cette phase est de

courte durée. L'infection aiguë s'accompagne d'une séroconversion avec la présence très

transitoire d'IgM, suivie d'une réponse IgG qui perdure alors tout le temps de l'infection

(Skouloubris et Labigne, 1999; Sobhani et al. 2000; Lamarque et al. 2003).

7.2. Phase chronique:

En absence d'éradication, une phase chronique survient. Elle est caractérisée par une

inflammation chronique active et une réponse immunitaire spécifique. Les polynucléaires

persistent mais l'infiltrat inflammatoire est alors plutôt constitué de cellules mononucléées :

macrophages et lymphocytes T. La présence de follicules lymphoïdes est fréquente et plus

importante chez l'enfant. La stimulation immunitaire, qui entretient la réaction de la

muqueuse, semble dûe à la libération par H.pylori de nombreux facteurs immunogènes

(Skouloubris et Labigne, 1999; Sobhani et al. 2000; Lamarque et al. 2003).

8. Facteurs de virulence de H.pylori:

H. pylori est particulièrement bien adapté à la colonisation de la muqueuse gastrique

grâce à de nombreux facteurs bactériens tels qu’une uréase et des flagelles. D’autres facteurs

sont responsables d’une inflammation locale au site de colonisation tels que le

lipopolysaccharide (LPS), des adhésines, un appareil de sécrétion de type IV (T4SS) et une

cytotoxine VacA. L’intervention de ces différents facteurs bactériens amène à

l’affaiblissement de la barrière épithéliale et à des lésions gastriques apparentes lors de

14


l’observation par endoscopie de l’estomac. H. pylori entraîne l’apparition de gastrites qui

peuvent être chroniques et asymptomatiques ou évoluer vers des pathologies plus graves.

8.1. Inflammation et lésions tissulaires:

8.1.1. Cytotoxine vacuolisante VacA:

VacA est un facteur de virulence majeur chez H. pylori. La protéine VacA a la

particularité d’être une cytotoxine multifonctionnelle, incluant entre autres une vacuolisation

cellulaire, la formation de canaux membranaires, la perturbation des fonctions

endosomales/lysosomales, l’apoptose et un effet immunosuppresseur. La capacité de la

toxine à former des pores anioniques est une caractéristique importante de son mécanisme

d’action (Isomoto et al. 2010).

8.1.1.1. Génétique:

Bien que toutes les souches de H. pylori n’aient pas toutes une activité cytotoxique,

elles possèdent toutes le gène vacA codant pour une cytotoxine vacuolisante VacA. Le gène

vacA est sujet à un polymorphisme au niveau de (Rhead et al. 2007):

- la région « s » codant pour la séquence signal de la protéine (allèle s1 fonctionnel,

subdivisé en s1a, s1b, s1c et l’allèle non fonctionnel s2),

- la région « i » (allèles i1 et i2),

- la région « m » située au milieu du gène (allèles m1 et m2 subdivisés en m2a et m2b)

Les souches s1/m1 sont i1, s2/m2 sont i2 et s1/m2 peuvent être i1 ou i2 (Rhead et

al. 2007; Basso et al. 2008), les souches de type s1/i1/m1-ou-m2 induisent en général un

haut niveau de vacuolization tandis que les souches s1/i2/m2 induisent peu de vacuolisation,

et les souches s2/i2-ou-i1/m1- ou-m2 sont dépourvues d’effet cytotoxique (Rhead et al.

2007).

15


8.1.1.2. Structure:

Le gène vacA code pour une protéine précurseur de 140 kDa qui est maturée en une

toxine d'environ 88 kDa après les clivages suivants (Figure 5) (Cover et Blaser, 1992;

Schmitt et Haas, 1994):

- lors de sa traversée de la membrane interne via le système de sécrétion de type II

(Sec-dépendant), une séquence signal de 33 acides aminés en N-terminal est clivée,

- lors de sa traversée de la membrane externe, la partie C-terminale de 33 kDa de la

protéine reste attachée à la membrane externe permettant l'export et la sécrétion de la

toxine mature par un mécanisme de type auto-transport,

- la protéine mature peut subir un clivage au niveau d'une boucle sensible à la

protéolyse entre le fragment N-terminal de 33 kDa (p33) et le fragment C terminal de

55 kDa (p55), les deux fragments restant physiquement associés.

Le domaine p33 présente une activité de formation de pores nécessaire pour la

vacuolisation (Busler et al. 2006), tandis que le domaine p55 est responsable de la liaison à

la cellule cible (Reyrat et al. 1999). La toxine est libérée dans le milieu extracellulaire ou

peut être retenue à la surface bactérienne (Telford et al. 1994).

Les monomères de VacA peuvent s'agencer en une structure de plus de 900 kDa

dite "en fleur", de 6 à 7 pétales constitués chacun par l'association des deux polypeptides de

33 et 55 kDa (monomère de 88 kDa) (Lupetti et al. 1996; Reyrat et al. 1999). La forme

oligomérique de VacA présente une faible activité sauf lorsqu'elle est exposée à pH acide ou

alcalin, pH auxquels la protéine se monomérise (Cover et al. 1997). La toxine de H. pylori

possède donc des propriétés remarquables qui pourraient lui permettre d'optimiser dans le

milieu gastrique son action délétère vis-à-vis de l'épithélium.

16


Fig. 5: Schéma représentatif du gène VacA (Kim et Blank, 2012)

8.1.1.3. Effets physiopathologiques:

Vacuolisation des cellules eucaryotes:

Il a été observé que des surnageants de culture de H. pylori étaient capables

d’induire in vitro la formation de larges vacuoles intracellulaires dans des cellules, activité

qui a été attribuée ultérieurement à la protéine VacA (Figure6) (Leunk et al. 1988).

L’utilisation de la protéine purifiée et activée par l’acidité permet d’induire la vacuolisation

en présence de bases faibles, telle que le chlorure d’ammonium (Cover et Blaser, 1992).

VacA est capable d’agir dans la cellule eucaryote sous forme d’oligomères ou de

monomères. L’administration intragastrique chez la souris d’une dose massive de la protéine

VacA purifiée permet d’observer des dommages de la muqueuse gastrique ainsi qu’une

inflammation (Cover et Blanke, 2005).

17


La toxine VacA forme des pores dans des bi-couches lipidiques et sur des

membranes plasmiques: des monomères de VacA, activés à pH acide et insérés dans une bi-

couche lipidique, se réassocient au niveau membranaire pour former un pore hexamérique

impliqué dans un transport d'anions (Iwamoto et al. 1999; Szabo et al. 1999).

Après endocytose des pores de surface, ils sont traités au niveau des compartiments

endosomaux tardifs, qui subissent un gonflement osmotique pour devenir de larges vacuoles

(Papini et al. 1994). Les vacuoles induites par VacA portent les marqueurs des endosomes

tardifs et des lysosomes et ne sont pas létales pour les cellules. Cependant, la protéine VacA

engendre des dégâts au niveau du compartiment endosomal tardif (Cover et Blanke, 2005):

– dégradation du facteur de croissance épidermique (EGF pour epidermal growth

factor).

– inhibition de la maturation de la procathepsine D.

– inhibition de la présentation d’antigènes.

Induction de l’apoptose:

La protéine VacA engendre d’autres phénomènes cytotoxiques tels que l’induction

de l’apoptose. Lorsque des cellules en culture sont traitées avec la protéine VacA purifiée, il

a été observé une réduction du potentiel transmembranaire mitochondrial et la libération de

cytochrome c (Kimura et al. 1999; Willhite et al. 2003; Willhite et Blanke, 2004). Ces

deux effets sont caractéristiques d’un affaiblissement de la perméabilité membranaire

mitochondriale et suggèrent l’initiation d’une mort cellulaire.

Action immunosuppressive:

Elle est suggérée par :

- une altération dans la maturation du phagosome, mais la survie de H. pylori ne

semble pas modifiée que le gène vacA soit exprimé ou non (Zheng et Jones, 2003).

- une altération de la capacité à présenter les antigènes par les lymphocytes B

(Molinari et al. 1998).

- une inhibition de la prolifération et de la maturation des lymphocytes T (Gebert et al.

2003; Sundrud et al. 2004; Torres et al. 2007) et B (Torres et al.2007).

18


Fig. 6: Schéma représentant les différentes activités de la protéine VacA de H. pylori sur les

cellules épithéliales de la barrière gastrique (Chaput et Boneca, 2006)

8.1.2. Ilot de pathogénicité cag et la protéine CagA:

Les souches de H. pylori ont été classées en deux catégories: celles qui possèdent un

îlot de pathogénicité cag (cag PAI) complet et fonctionnel et celles qui en sont totalement ou

partiellement dépourvues (Figure 7) (Covacci et al. 1999).

Le cag PAI est une région génomique de 40 kb contenant une trentaine de gènes. Le

cag PAI est inséré dans le gène chromosomique glr codant la glutamate racémase et présente

les caractéristiques d'un îlot de pathogénicité (Censini et al. 1996):

- une grande taille (environ 40 kb, 31 gènes putatifs),

- contenu en GC de 35 % différent de celui du reste du génome (39 %),

- la présence de séquences répétées de 31 paires de base aux extrémités,

- une presence variable de séquences d’insertion,

- des homologues à certains facteurs de virulence,

- une instabilité génétique. 19


Fig. 7: Représentation schématique de l'îlot de pathogénicité cag (PAI) (Occhialini et

Megraud, 2002).

8.1.2.1. Activités biologiques:

Le T4SS (appareil de sécrétion de type IV) de H. pylori, en contact étroit avec les

cellules épithéliales est impliqué dans plusieurs processus majeurs (Figure 8):

- un phénomène d’élongation cellulaire également appelé phénotype colibri, de par les

extensions cellulaires que l’on peut observer lors d’une infection de cellules épithéliales in

vitro avec une souche de H. pylori, résultat d’une augmentation de la mobilité et de

l’élongation cellulaire;

- une activité pro-inflammatoire, pro-apoptotique et mitogène,

- une perturbation des jonctions serrées et adhérentielles, et de la polarité cellulaire (Backert

et Selbach, 2008).

20


8.1.2.2. Inflammation:

H. pylori induit une infection chronique de la muqueuse gastrique qui conduit à un

état inflammatoire chronique. Le cag PAI induit la synthèse par les cellules épithéliales

gastriques d’IL8, une puissante cytokine pro-inflammatoire. H. pylori induit chez l’homme

une forte réponse immunitaire cellulaire et humorale. La réponse humorale semble inefficace

pour entraîner une guérison de l’infection (Ferrero et al. 1998).

En revanche, la réponse cellulaire joue un rôle majeur dans l’élimination de H.

pylori et dans la pathogenèse chez l’animal. La réponse cellulaire prédominante chez

l’homme induite par H. pylori est une réponse de type Th1 et est associée à la libération de

cytokines pro-inflammatoires (Interferon-gamma (IFN-γ), IL12, IL18, TNFalpha) ainsi qu’à

une activation des macrophages (D'Elios et al. 1997; Ernst et Gold, 2000), contribuant aux

dommages tissulaires. D’autres cytokines jouent également un rôle important, l’IL17, l’IL21

et l’IL23 dans le fin équilibre entre protection et lésions cellulaires liées à H.pylori (Luzza et

al. 2000; Amedei et al. 2006; Cooper, 2009).

Fig. 8: Rôle de l'îlot cag et de la protéine CagA (Megraud, 2008). 21


8.1.2. Adaptation à l’environnement gastrique:

Les cellules épithéliales gastriques secrètent le mucus qui forme une couche épaisse

de protection (100 µm) pour la muqueuse gastrique vis-à-vis de l'acidité gastrique. Il est

produit par les cellules cardiales, pyloriques et fundiques. Lors de son entrée dans l’estomac,

H. pylori est confronté à l’acidité extrême de la lumière gastrique qu’il fuit rapidement à

l’aide de puissants flagelles, vers le mucus. L’analyse du transcriptome à pH acide montre

une augmentation de l’expression de certains gènes impliqués dans la mobilité et le

chimiotactisme (Bury-Mone et al. 2004). Le pH à la surface de la barrière est de 1.5 alors

qu'il est de 7 en zone profonde au contact des cellules. Ce gradient de pH permettrait à la

bactérie de s’orienter dans la couche de mucus et d’atteindre son site de colonization

(Schreiber et al. 2004).

La répartition de H. pylori dans l'habitat gastrique est la suivante: une infime

proportion des bactéries se situe dans la lumière, 20 % à la surface de l'épithélium et environ

80 % dans le mucus dans une zone d’acidité modérée (pH 4.5-6) (Schreiber et al.1999;

Schreiber et al. 2000).

8.1.2.1. Flagelles et le chimiotactisme:

La mobilité de H. pylori est un facteur indispensable à la colonisation de la

muqueuse gastrique par la bactérie (Figure 9). Des mutants aflagellés de H. pylori trouvés

chez des porcelets sont incapables de persister dans la muqueuse gastrique mais génèrent une

réponse immunitaire témoignant de leur survie transitoire dans l'estomac (Eaton et al. 1992).

H. pylori possède 5 à 7 flagelles polaires engainés de 3 µm de long et une

morphologie spiralée qui lui permettent, lors de son ingestion, d'abréger son séjour dans le

suc gastrique, de pénétrer dans la couche de mucus et de s'y mouvoir. La mobilité de H.

pylori dans le mucus gastrique est assurée par la machinerie flagellaire dont la fonctionnalité

requiert l'expression d'une quarantaine de gènes identifiés dans le génome de H. pylori

(Tomb et al. 1997).

L'appareil flagellaire se décompose en trois éléments:

- Un corps basal qui sert d'ancrage à la membrane bactérienne et porte les constituants

du moteur flagellaire et certains éléments de chimiotactisme,

22


- Le crochet (constitué par la polymérisation de la protéine FlgE) qui relie le corps

basal aux filaments flagellaires,

- Les filaments flagellaires de H. pylori sont constitués par la polymérisation de deux

sous-unités d'environ 53 kDa : la flagelline majeure FlaA (codée par flaA) et la

flagelline mineure FlaB (codée par flaB), retrouvées uniquement à la base du filament

(Kostrzynska et al. 1991).

L’analyse du transcriptome à pH acide montre une augmentation de l’expression de

certains gènes impliqués dans la mobilité et le chimiotactisme (Merrell et al.2003; Wen et

al. 2003; Bury-Mone et al. 2004), suggérant la nécessité pour la bactérie de fuir rapidement

l’acidité extrême pour un environnement plus favorable.

Fig. 9: Structure de l'appareil flagellaire de H.pylori (Lertsethtakarn et al. 2011)

8.1.2.2. Uréase:

H. pylori exprime une métalloenzyme à nickel de localisation cytoplasmique,

l’uréase, produite en quantité abondante (6 à 10 % des protéines totales) (Figure 10). Elle

hydrolyse l'urée présente dans l'environnement gastrique en permettant la production

d'ammoniac et de dioxyde de carbone. L’ammoniac produit par l’uréase capte un proton pour

former l’ammonium, ce qui permet à la bactérie de maintenir son pH intracellulaire proche

23


de la neutralité. La production d’ammonium participerait également à l’endommagement de

la barrière épithéliale gastrique afin de récupérer des nutriments et des ions essentiels (Smoot

et al. 1990).

L'uréase est codée par un opéron bicistronique comprenant les gènes de structures

de l'apoenzyme (ureA et ureB) et cinq gènes (ureIEFGH) dont les produits participent à

l'activation de l'apoenzyme par incorporation des ions nickel. Des données de

cristallographie montrent que l'uréase de H. pylori forme un complexe dodécamérique

[(UreAUreB)3]4 contenant 12 sous-unités catalytiques (UreB) fixant chacune 2 ions de

nickel (24 ions/molécule) et formant un complexe sphérique extrêmement compact,

conférant à l'enzyme une résistance à l'acidité (Ha et al. 2001).

Une des caractéristiques uniques de l'opéron uréasique de H. pylori est liée à la

présence du gène ureI codant une protéine membranaire qui forme au niveau de la membrane

cytoplasmique un pore à urée qui s'ouvre à pH acide permettant le transport efficace de l'urée

et donc une adaptation rapide à un environnement acide (Weeks et al. 2000). L'uréase et la

protéine ureI sont essentiels pour la colonisation de la muqueuse gastrique de différents

modèles animaux (Bury-Mone et al. 2001; Mollenhauer-Rektorschek et al. 2002).

Fig. 10: Structure de l'uréase de H.pylori, A: structure tertiaire; B: assemblage

dodécamérique (Ha et al. 2001).

B A

24


8.1.2.3. Réponse à l’acidité:

L’influence du pH acide sur la transcription des gènes a été étudiée en détail par des

analyses de transcriptome (Merrell et al. 2003; Wen et al. 2003; Pflock et al. 2006). La

réponse à l’acidité est caractérisée par la mise en oeuvre de mécanismes de protection (De

Reuse et Bereswill, 2007):

- augmentation de l’expression de certains gènes impliqués dans la mobilité et le

chimiotactisme,

- maintien de son pH intracellulaire par l’augmentation de la transcription de gènes

codant pour des enzymes générant l’ammoniac, l’uréase (UreA) et les amidases

aliphatiques (AmiE et AmiF),

- diminution de la transcription de gènes codant pour des protéines transmembranaires

telles que des transporteurs, perméases ou des protéines de la membrane externe

(OMP pour « outer membrane protein ») entraînant une diminution des influx

transmembranaires (protons, ions sodiques),

- protection contre l’accumulation d’ions métalliques, principalement le nickel et le fer

(à pH acide, leur solubilité est augmentée. L’expression des protéines impliquées dans

le stockage est augmentée et l’expression des protéines impliquées dans l’import de

nickel, NixA, et du fer, FecA, est diminuée),

- augmentation de l’expression de la protéine VacA et de l’adhésine SabA à pH neutre,

ce qui optimiserait leurs actions à proximité de la cellule gastrique.

Par rapport à d’autres bactéries, H. pylori possède un nombre restreint de

régulateurs transcriptionnels (Tomb et al. 1997; Alm et al. 1999). Au moins, trois

régulateurs transcriptionnels ont été identifiés comme impliqués dans la réponse adaptative à

l’acidité : NikR, Fur et ArsRS (De Reuse et Bereswill, 2007). Ces protéines agissant sur des

catégories fonctionnelles de gènes très diverses. Les protéines NikR et Fur sont deux

métallorégulateurs sensibles respectivement à la concentration intracellulaire en nickel et en

fer.

8.1.2.4. Lipopolysaccharide:

Le LPS est un constituant de la paroi qui est ancré dans la membrane externe par sa

partie lipidique, appelée lipide A. A ce lipide est greffé une partie centrale courte composée

de sucres. Cette partie centrale fait elle-même le lien entre le lipide A et de longues chaînes

25


glucosidiques formant l’antigène O. Il a été observé que jusqu’à 85 % des souches de H.

pylori sont porteuses d’antigènes Lewis qui correspondent à l’antigène O (Simoons-Smit et

al. 1996; Wirth et al. 1996).

Une particularité unique est la présence au niveau de l'antigène O de motifs

antigéniques de type Lewis, Lex, Ley dans 80 à 90 % des souches ou plus rarement Lea, Leb,

Lec ou Lex-sialylé. Les antigènes Lewis sont normalement présents des cellules épithéliales

de la muqueuse gastrique. La synthèse des antigènes Lewis est sous la dépendance de trois

fucosyl-transférases, FutA, FutB et FutC, leur expression peut-être modulé par un

mécanisme de variation de phase, créant une population microbienne avec des profils de

glycosylation du LPS très divers. De fait, il a été proposé que le LPS de H. pylori puisse

jouer un rôle dans l’échappement de la bactérie au système immunitaire (Figure 11) (Moran

et Prendergast, 2001).

Il a été constaté que le LPS de H. pylori est peu immunogène, car les patients

infectés par la bactérie ne presentent pas ou très peu d’anticorps dirigés contre ce constituant.

De plus, le lipide A de H. pylori montre une composition en acide gras inhabituelle (Moran

et al. 1997).

8.1.2.5. Adhésines:

H. pylori a de nombreux moyens d’adhésion à la muqueuse gastrique, ce qui la

protégé du péristaltisme et de la desquamation de la muqueuse gastrique. Au regard des sept

genomes séquencés (Thiberge et al. 2010), 46 OMPs ont été prédites. Cette catégorie de

OMPs regroupe plusieurs adhésines dont un petit nombre a été caractérisé : AlpA, AlpB,

BabA, BabB, HopZ, HopQ, SabA. Les adhésines BabA (blood group antigen-binding

adhesin) et SabA (sialic acid-binding adhesin) lient respectivement, les antigènes Lewis du

type b (Leb) et les antigènes Lewis portant un acide sialique (sialyl-Lex).

Une augmentation de sialyl-Lex était corrélée à une persistance de la colonisation

de l’estomac de jeunes souris infectées de façon précoce (Yang et al. 2008). Le locus sabA a

une expression soumise à une variation de phase. Ce système permet à la bactérie d’échapper

à la réponse immunitaire de l’hôte, expliquant sa persistance et son adaptation à l’hôte

(Goodwin et al. 2008).

26


Fig.11: Schéma du lipopolysaccharide de H. pylori(Chaput et Boneca, 2006)

9. H pylori et pathologie associées :

Suite à une infection par H. pylori, les principales étapes (nommées « cascade de

Correa ») d'un processus de cancérisation sont: la gastrite chronique active, l'atrophie

gastrique, la métaplasie intestinale, la dysplasie et le cancer gastrique (Figures 12 et 13)

(Correa, 1995 ; Kuipers, 1999; Peek et Blaser, 2002).

9.1. Gastrite :

L’H pylori demeurant à la surface de l’épithélium gastrique, déclenche une réaction

inflammatoire caractérisée par une infiltration de lymphocytes, de plasmocytes et de

macrophages. En effet, la bactérie en interaction avec la cellule épithéliale entraîne la

production d’interleukines, celles-ci provoquent le recrutement des polynucléaires. De plus

l’H.pylori activerait directement ou par le biais d’une endotoxine, le macrophage qui induit à

son tour la production de nombreuses cytokines et le T. N .F (Tumor Necrosis Factor). Ces

différentes réactions déclenchées par la colonisation de l’estomac par l’H pylori, aboutissent

à la gastrite (De Dorwin, 1994 ; Dobrilla et Benvutti, 1995).

27


L’évolution de la gastrite à H pylori est influencée par de nombreux facteurs, la

variabilité de la localisation lésionnelle et la sévérité de l’inflammation expliquent la

diversité des conséquences lésionnelles (atrophie, métaplasie) ou fonctionnelles (anomalie de

la sécrétion acide), ainsi que la diversité des pathologies: ulcère gastrique ou duodénal,

lymphome et adénocarcinome gastrique (Amrani et Allouch, 1995).

9.2. Ulcère gastro-duodénale :

C’est une maladie plurifactorielle où H pylori occupe une place prépondérante

puisqu’il est associé dans 90% des cas à un ulcère duodénal et dans 70% à un ulcère

gastrique (CNHIM, 2001). La maladie ulcéreuse gastroduodénale résulte d’un déséquilibre

entre les facteurs d’agression et les facteurs de défense au niveau de la muqueuse. Il est

généralement admis que dans l’ulcère duodénal le facteur dominant est l’agression

chlorhydro-peptique alors que dans l’ulcère gastrique c’est l’altération de la muqueuse

gastrique (Pascal et Christiane, 2007). L’infection chronique par H pylori s’accompagne

d’une augmentation modérée de la gastrine basale. En plus, il existe chez les patients infectés

et porteurs d’un ulcère duodénal une diminution de la sécrétion des bicarbonates, ce qui

concourt à l’acidification du duodénum (Sobhani, 1994).

Fig. 12: Pathologies gastriques associées à l'infection par Helicobacter pylori (Sobhani,

2003)

8

28


9.3. Lymphome gastrique :

L’H. pylori entraîne une prolifération lympho-épithéliale de la muqueuse gastrique,

celle-ci étant normalement dépourvue de follicule lymphoïde et évoque la phase d’initiation

du lymphome gastrique de type M.A.L.T (Mucosae Associated Lymphoid Tissue) à cellule B

de bas grade de malignité (Faik et Raiss, 1998). La cytologie normale de l’estomac est

dépourvue de tissu lymphoïde associé aux muqueuses. Tous les lymphomes primitifs gastro-

intestinaux sont issus du MALT digestif. Parmi ceux-ci, le lymphome gastrique de type

MALT est le plus fréquent : Il représente 3 % des tumeurs malignes gastriques (Zucca et al,

1988). Il s’agit d’une prolifération lymphomateuse de l’épithélium et du chorion de type

monoclonal. Ondistingue 2 types cliniques:

- Lymphome à grandes cellules (haut grade) caractérisé par une tumeur volumineuse et

ulcérée.

- Lymphome à petites cellules (bas grade) caractérisé par une réaction inflammatoire

lymphoplasmocytaire, une formation de nodules lymphoïdes et la prolifération d’un clone

cellulaire. Ce sont des lymphomes de faible degré de malignité, d'évolution indolente,

généralement localisés et pouvant se transformer en lymphome de haut degré de malignité

lorsqu'apparaît un ou plusieurs contingents de grandes cellules.

Le pronostic du lymphome gastrique du MALT à faible degré de malignité a été

sensiblement amélioré depuis la découverte de l’implication de H. pylori en 1991

(Wotherspoon et al, 1991). En effet, une éradication précoce fait régresser le processus

tumoral (Wotherspoon et al, 1993). Elle est sans effet sur les formes à haut degré de

malignité résultant de l’acquisition d’altérations génétiques supplémentaires.

9.4. Cancer gastrique :

L’infection à H. pylori provoque une gastrite qui, après plusieurs années d’évolution

chronique, peut aboutir dans certains cas au cancer. H. pylori semble altérer les propriétés

physiques et chimiques du mucus gastrique, le rendant plus sensible aux facteurs

carcinogènes. Un régime alimentaire riche en sel et pauvre en acide ascorbique de l’hôte

influence le processus carcinogène. La hausse du pH favoriserait ainsi une prolifération de la

flore bactérienne intestinale douée d’une activité nitrate réductase, qui métabolise les nitrates

en produisant de la nitrosamine, substance cancérigène. Une muqueuse de type intestinal

remplace progressivement la muqueuse gastrique, c’est la métaplasie gastrique. Le cancer

29


qui va ainsi se développer est plutôt de type intestinal : c’est la forme la plus fréquente des

cancers gastriques (Sobhani, 2004). Selon leur localisation, on distingue 2 types

d’adenocarninomes gastrique :

- L’adénocarcinome du cardia se développe indépendamment de l’infection par H. pylori et

serait favorisé par le reflux gastro oesophagien. Son incidence reste stable ou en légère

augmentation.

- L’adénocarcinome de l’estomac distal lié à la gastrite atrophique induite par H. pylori. Son

incidence diminue nettement. Le cancer de type intestinal, de loin la forme la plus fréquente,

est associé à des lésions de métaplasie intestinale sur la muqueuse adjacente à la tumeur,

contrairement au cancer de type diffus (forme plus rare de cancer gastrique).

Fig. 13: Evolution de l’infection à H pylori vers les maladies gastriques en fonction de l'âge

(Mégraud, 2003).

30


10. Diagnostic de l’infection à H pylori :

Les techniques de diagnostic d’une infection à H pylori comprennent les méthodes

microbiologiques, anatomopathologiques, immunologiques, et celles basées sur la mise en

évidence de l’activité uréasique bactérienne. Ces méthodes sont soit invasives nécessitant

une endoscopie avec biopsie, soit non invasives (Korwin et Lozniewski, 2000).

10.1. Méthodes invasives :

10.1.1. Endoscopie digestive haute: Elle consiste à prélever des fragments biopsiques de

la muqueuse antrale ou fundique et à rechercher les bactéries dans ces prélèvements

(ANAES, 2001).

10.1.2. Tests rapides à l’uréase (TRU): Ces tests consistent à mettre en évidence

l’activité uréasique de H. pylori en déposant la biopsie gastrique dans un milieu liquide (tests

« maison », CU test®), semi-solide (CLO test®, HUT test®, etc.) ou sur une membrane

(Pyloritek®) contenant de l’urée et un indicateur de pH. En présence de H. pylori, la

dégradation de l’urée en ammoniaque provoque l’alcalinisation du milieu et donc le

changement de couleur de l’indicateur de pH (Korwin et Lozniewski, 2000). Ce test a une

sensibilité de 80% et une spécificité de 95% (Lamarque, 2000). La sensibilité du TRU est

diminuée en cas de faible densité bactérienne intra gastrique (inférieur à 1000 et 10000

bactéries) ce qui explique qu’il ne peut être utilisé pour le contrôle d’éradication d’H pylori

(Monteiro et Megraud, 1999).

10.1.3. Culture : C’est la méthode de diagnostic la plus spécifique. Elle est la technique de

référence pour affirmer la présence de H. pylori. La culture de cette bactérie à partir des

biopsies gastriques exige un acheminement rapide vers un laboratoire de bactériologie

(moins de 24h) dans un milieu de transport adapté (Biagi, 2002). La culture est réalisée en

pratique courante sur des milieux solides non sélectifs et sélectifs contenant des antibiotiques

pour inhiber les bactéries de la flore buccale. Ces milieux sont incubés à 37 °C 3 à 7 jours,

même jusqu’à 12 jours en atmosphère microaérophile (Korwin et Lozniewski, 2000).

31


10.1.4. Examen histologique : Le prélèvement biopsique se fait dans la région antrale à 2

/3 cm du pylore au cours d’une fibroscopie. Les biopsies sont immédiatement fixées dans le

liquide de Bouin ou du formol (Faik, 2000) et colorés par HE (hématoxyline-éosine), le

Giemsa modifiée, le warthin-starry et le cresyl violet. L’examen histologique des biopsies

permet de détecter H.pylori à la surface de la muqueuse gastrique et de typer la gastrite à H

pylori (Stanghellini et Barbara, 2001).

10.1.5. Amplification génique PCR : L’amplification génique par la Polymerase Chain

Reaction (PCR) permet la détection de séquences d’ADN spécifiques de H. pylori dans des

prélèvements gastriques (biopsies, suc, mucus) ou autres (salive, plaque dentaire, selles)

(Korwin et Lozniewski, 2000).Cette méthode est connue pour sa rapidité, sa sensibilité et sa

possibilité de mettre en évidence toutes les formes de H pylori, y compris les formes

coccoїdes non cultivables ou les bactéries mortes (Razafimahefa et al. 2012).

10.2. Méthodes non invasives :

10.2.1. Détection antigénique dans les selles : Un test ELISA appelé Premier Platinum

HpSA (Meridian Diagnostics) a été développé. Il utilise des anticorps polyclonaux anti-Hp

adsorbés sur les cupules d’une microplaque afin de capturer les antigènes de Hp présents

dans un échantillon de selles diluées (Vaira et al. 1999).

10.2.2. Recherche des anticorps sériques : La réponse humorale à l’infection par H.

pylori est caractérisée par la production d’anticorps spécifiques (principalement

immunoglobulines (IgG, IgA, IgM), qui peuvent être détectés dans le sang, le plus souvent

par des méthodes ELISA (Korwin et Lozniewski, 2000).

D’autres techniques que l’ELISA peuvent être utilisées, telle que la technique d’immuno-

blot, l’agglutination par test au latex et la réaction de dot-blot sur papier filtre (Dominique et

De korwin, 2003).

10.2.3. Test respiratoire à l’urée marquée: Cette méthode consiste à mettre en évidence

l’activité uréasique de la bactérie en faisant ingérer au patient de l’urée marquée au 13C. Dans

l’estomac en présence de l'uréase il se produit de bicarbonates et d'ammonium. Sous

l’influence de l’acidité gastrique, les bicarbonates sont transformés en gaz carbonique

absorbé puis transporté aux poumons et expiré (SFED, 2003). La détection du 13CO2 dans

l’air expiré est réalisée par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse,

32


par spectrométrie laser ou infrarouge (Korwin et Lozniewski, 2000). Le patient doit être à

jeun, et absorber une solution d’acide citrique (Helikit®) ou de jus d’orange (Helicobacter

test infai®) avec l’urée marquée au 13C principalement afin de retarder la vidange gastrique

et allonger les temps de contact entre l’uréase bactérienne et l’urée 13C (Biomnis, 2008).

11. Traitement anti-Helicobacter pylori:

11.1. Monothérapies:

Les monothérapies proposées comme premier model thérapeutique, testant des

molécules auxquels Helicobacter pylori était sensible in vitro, telles que: amoxicilline;

tétracycline; nitro-imédazolé, clarithromycine et des sels de bismuth (Cayla, 1998).

En fait, malgré la sensibilité de Helicobacter pylori aux nombreux composés in

vitro, avec des concentrations minimales d'inhibition (CMI) inférieures à 1 mg/L, ces

différentes monothérapies sont inéfficases in vivo, un taux d'éradication de Helicobacter

pylori est obtenu de 20 à 40 %. Il est probable que les conditions d'action de ces molécules in

vivo soient profondement modifiées par la localisation de cette bactérie au sein de la couche

du mucus, entourée par un milieu acide formant ainsi une niche écologique protégée d'accés

difficile (Cayla, 1998).

11.2. Bithérapies:

La difficulté rencontré dans l'éradication de la bactérie par de simples

monothérapies et dans la moindre d'éfficacité des antibiotiques en milieu acide oriente les

shémas thérapeutiques vers l'utilisation des combinaisons thérapeutiques de deux

médicaments associant antisécrétoire et antibiotique. Parmi celles-ci, deux ont été

principalemnt testées:

- IPP+ amoxicilline;

- IPP+ clarithromycine.

33


D'après les différentes combinaisons étudiées, le schéma optimal obtenu ossociant

un ihibiteur de la pompe à proton à double dose en une prise unique, et la clarithromycine

500 mg (2 fois par jour pendant 2 semaines) (Cayla, 1998). Cependant les effets secondaires

(40%) ainsi que l'efficacité modeste ont limité son utilisation (Olson et al. 1995).

Notant aussi que l'association de la ranitidine-bismuth citrate (RBC) et

monoantibiotique a permis d'obtenir des taux d'éradication relativement comparables à ceux

des bithérapies IPP-antibiotique (Lamouliatte, 1997).

Les bithérapies associant un antisécrétoire et un antibiotique ne permettaient

d'obtenir que des taux d'éradication maximum autour de 60%, paraissent donc nettement

insuffisante pour être utilisées en première intention.

11.3. Trithérapies:

La Conférence de Consensus, (1995) avait recommandé une trithérapie d'une

durée de 7 jours associant un IPP à double dose et deux antibiotiques : IPP-amoxicilline-

clarithromycine ou IPP-métronidazole-clarithromycine. Un troisième schéma associant IPP-

amoxicilline-métronidazole avait été proposé en alternative, en cas d'intolérance ou de forte

prévalence de résistance à la clarithromycine. Les taux d'éradication espérés sur la base des

résultats publiés étaient supérieurs à 90 %. L'association IPP-amoxicilline-clarithromycine

pendant 7 jours est la trithérapie la plus utilisée en France. Les taux d'éradication avec ce

schéma sont de 56 à 84 % en France. Ils sont inférieurs à ceux observés en Europe du Nord

et aux Etats-Unis (82 à 88 %). La même discordance est observée avec l'association IPP-

clarithromycine-métronidazole puisque le taux d'éradication avec ce schéma est de 61 à 70 %

en France et de 61 à 95 % dans les études internationales. L'association IPP-amoxicilline-

métronidazole donne des résultats inférieurs aux autres associations. Ces résultats conduisent

à s'interroger sur les raisons des résultats globalement inférieurs à ceux espérés, sur les

divergences entre les taux d'éradication observés en France et dans les autres pays, et sur les

modifications éventuelles des schémas thérapeutiques qui pourraient être proposées pour

améliorer les résultats.

34


11.4. Facteurs d’échecs d’éradication:

Les principales causes d'échec de traitement sont la résistance aux antibiotiques et la

non observance du traitement.

11.4.1. Mauvaise observance du traitement:

Reliée à la lourdeur des thérapies et aux effets secondaires des antibiotiques, la

mauvaise observance semble être une importante cause d’échec de traitement. Graham et al.

(1992) avaient démontré que le taux d’éradication était de 96% pour les patients ayant pris

plus de 60% des médicaments prescrits et 69% pour les patients qui étaient moins assidus.

11.4.2. Résistance aux antibiotiques:

Des cas de résistance de H. pylori ont été décrits pour tous les antibiotiques

proposés pour l’éradication (Vakil et Mégraud, 2007). Le taux de résistance aux

antibiotiques est beaucoup plus élevé en cas d’échec d’éradication (Duck et al. 2004 ;

Koletzko et al. 2006; Agudo el al. 2010) et est proportionnel au nombre de tentatives

infructueuses (Miendje Deyi et al. 2011).

La résistance aux antibiotiques conduit à un échec d’éradication global de 55 à

70% pour la clarithromycine et de 25 à 37% pour le métronidazole (Van der Wouden et al.

1999; Dore et al. 2000; Fischs et al. 2004; Mégraud, 2004). La résistance aux

fluoroquinolones a été associée à une diminution de 66,7% du taux d'éradication (Nishizawa

et al, 2009).

11.4.3. Autres facteurs d’échec d’éradication :

• Durée du traitement (Malfertheiner et al. 2007).

• Tabagisme: le fait de fumer pourrait réduire de moitié l’efficacité d’un traitement

d’éradication (Camargo et al. 2007).

• Nature et posologie des antibiotiques: les autres macrolides sont moins efficaces que

clarithromycine (Calabrese et al. 2000 ; Laurent et al. 2001)

• Age des patients: les données sont fort variables. On note généralement plus de

difficultés d’éradication chez les patients de moins de 50 ans.

35


II. Bactéries lactiques

1. Généralités sur les bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont décrites pour la première fois par Orla Jenson au début

de vingtième siècle. Elles sont des microorganismes utiles à l’homme lui participant à

l’élaboration de nombreux produits alimentaires fermentés. Elles jouent plusieurs rôles

relatifs aux caractéristiques organoleptiques, nutritionnelles et sanitaires de l’aliment (Pilet

et al. 1998). Elles sont considérées comme non pathogènes et se voient attribuer le

qualificatif anglo-saxon d’organismes GRAS (GENERALLY REGARDED AS SAFE)

(Drouault et Corthier, 2001).

Les bactéries lactiques sont des bactéries immobiles et non sporulantes, à Gram

positif qui peuvent avoir des formes en bâtonnets ou en coques. Leur ADN présente un

pourcentage de G + C compris entre 30 et 60% (Stiles et Holzapfel, 1997).

2. Origine des bactéries lactiques:

Les bactéries lactiques ont été retrouvées dans des sédiments datant de 2,75

milliards d’années bien avant l’apparition d’oxygène dans l’atmosphère, ce qui pourrait

expliquer leur caractère anaérobie. De plus, des études sur la phylogénie bactérienne

mentionnent leur apparition avant celle des cyanobactéries (Quiberoni et al. 2001).

3. Taxonomie et diversité:

3.1. Taxonomie des bactéries lactiques:

Depuis la description du Bacterium lactis (actuellement Lactococcus lactis), la

taxonomie des bactéries lactiques est en évolution permanente. Le nombre de nouvelles

espèces a augmenté énormément au cours de ces dix dernières années. Les réorganisations

effectuées ont contribué à fusionner des espèces en une seule, ou identifier une espèce

comme un nouveau genre (Pot, 2008). La classification des bactéries lactiques peut se faire

selon des critères phylogénétiques par l’utilisation des méthodes moléculaires. Cependant, la

caractérisation phénotypique /biochimique classique demeure pratique dans l’identification

préliminaire des microorganismes. Certaines caractéristiques phénotypiques sont utilisées

pour identifier les espèces à l'intérieur des genres comme la capacité à : fermenter les

hydrates de carbone, tolérer différentes concentrations en bile, produire des polysaccharides

extracellulaires, exiger des facteurs de croissance, produire de l’acétoïne et synthétiser

certaines enzymes. La composition en G+C de l’ADN et la composition en acides gras, sont

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également d'autres critères qui peuvent être étudiés pour l'identification des espèces lactiques

(Vandamme, 1996 ; Stiles et Holzopfel, 1997 ; Ho et al. 2007).

La morphologie est considérée comme la caractéristique clé pour décrire et

classifier les genres des bactéries lactiques. De ce fait, les bactéries lactiques peuvent être

divisées arbitrairement en bacilles et coques. Le genre Weissella, récemment décrit, est le

seul genre qui comporte à la fois des bacilles et des coques (Collins et al. 1993 ). A ce

groupe de bactéries lactiques, appartient plusieurs genres comme Aerococcus,

Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus,

Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Stiles et

Holzapfel, 1997 ; Pot, 2008). Le genre Bifidobacterium est actuellement considéré par

plusieurs auteurs comme genre de bactéries lactiques, bien qu’il se distingue par un

pourcentage en G+C de 55%, largement supérieur à celui des autres genres et par une voie

métabolique de fermentation des sucres particulière. Les études phylogénétiques basées sur

l’analyse des séquences des ARN ribosomiques ont confirmé l’appartenance de ces différents

genres à un même groupe qui inclut également Propionibacterium (Figure14) (Stiles et

Holzopfel, 1997 ; Pilet et al. 2005).

Fig. 14 : Arbre phylogénétique des principaux genres de bactéries lactiques et des genres

associés, obtenu par analyse des ARNr 16S (Stiles et Holzapfel, 1997).

37


3.2. Diversité des bactéries lactiques:

3.2.1. Genre Lactobacillus:

Le Lactobacillus est le genre principal de la famille des Lactobacillaceae, il

contient de nombreuses espèces qui sont des agents de fermentation lactique intervenant dans

de nombreuses industries ou qui sont rencontrées comme contaminants. Il s’agit de bacilles

longs et fins, parfois incurvés, souvent groupés en chaînes, immobiles, asporulés, dépourvus

de la catalase et se développent à un optimum de température situé entre 30 et 40°C. Les

lactobacilles ont des exigences nutritionnelles très complexes en acides aminés, en vitamines,

en acides gras, en nucléotides, en glucides et en minéraux (Khalid et Marth, 1990 ; Leclerc

et al. 1994).

Le genre Lactobacillus a été subdivisé par Orla-Jensen en trois groupes et cette

classification est encore utilisée en milieu industriel (Tamime, 2002 ; Guiraud et Rosec,

2004) :

Groupe I « Thermobacterium » : comprend les lactobacilles homofermentaires thermophiles

qui se développent à 45°C mais pas à 15°C. Les espèces les plus fréquentes dans le lait et

produits laitiers sont Lb. helveticus, Lb. delbrueckii, Lb. acidophilus.

Groupe II « Streptobacterium » : regroupe les lactobacilles homofermentaires mésophiles et

peuvent être occasionnellement hétérofermentaires en fonction du substrat. Les espèces les

plus fréquentes dans l’alimentation sont Lb. casei, Lb. curvatus, Lb. sake et Lb. plantarum.

Groupe III « Betabacterium » : ce sont des lactobacilles hétérofermentaires. Il comporte les

espèces Lb. fermentum, Lb. brevis et Lb. sanfransisco.

3.2.2. Genre Lactococcus:

Le genre Lactococcus (streptocoque du groupe N) représente les streptocoques dits

« lactiques », car ils sont associés à de nombreuses fermentations alimentaires et ne

possèdent aucun caractère pathogène. Les produits végétaux constituent leur réservoir

principal, mais ils sont largement présents dans le lait et les produits laitiers (Pilet et al.

2005). Les lactocoques se présentent sous forme de coques en paire ou en chaînes de

longueur variable. Ce sont des bactéries anaérobies facultatives homofermentaires ne

produisant que de l’acide lactique L(+), seul Lactococcus lactis subsp. lactis biovar.

diacetylactis produit le diacétyle. Leur température optimale de croissance est proche de

30°C, capable de se développer à 10°C mais pas à 45°C. Quelques espèces produisent des

38


exopolysaccharides et des bactériocines. Elles sont capables de se développer à 3% de bleu

de méthylène et d’hydrolyser l’arginine (Tamime, 2002). Actuellement, le genre

Lactococcus comprend cinq espèces, Lactococcus lactis est l’espèce la plus connue avec ses

trois sous-espèces : Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris et Lc. lactis

subsp.hordniae (Pot et al. 1996 ; Pot, 2008).

3.2.3. Genre Streptococcus:

Le genre Streptococcus est généralement divisé en trois groupes : pyogène (la plus

part des espèces pathogènes et hémolytiques), oral (tel que St. salivarius, St. bovis) et les

autres streptocoques (Scheilfer, 1987). La seule espèce de streptocoques utilisée en

technologie alimentaire est Streptococcus thermophilus qui a été inclue dans le groupe des «

autres streptocoques », mais ensuite transféré au groupe des streptocoques oraux à cause de

leur degré d’homologie avec l’ADN de Streptococcus salivarius (Stiles et Holzapfel, 1997).

Streptococcus thermophilus se différencie par son habitat (lait et produits laitiers) et son

caractère non pathogène. La résistance à la température, la capacité de croitre à 52°C et le

nombre limité des hydrates de carbones permettent de distinguer St. thermophilus de la

plupart des autres streptocoques (Haddie, 1986 ; Pilet et al. 2005).

3.2.4. Genre Enterococcus:

Les entérocoques sont des coques homofermentaires, généralement différenciés par

la fermentation de l’arabinose, ils croissent entre 10°C et 45°C, leur aptitude à croitre en

présence de 6,5% de NaCl, et à pH 9 (Tamime, 2002 ; Ho et al. 2007).

3.2.5. Genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella:

Ils ressemblent les coques lenticulaires en paires ou en chainettes mésophiles, qui

possèdent un caractère hétérofermentaire marqué, avec production d’acide lactique (isomère

D), de CO2 et d’éthanol. Les caractéristiques telles que l’hydrolyse de l’esculine, la

formation de dextrane, les conditions de croissance, la capacité à croître à différents pH et

température, l’assimilation de citrate et/ou malate permettent la différenciation entre les

genres Leuconostoc et Weissella (Pilet et al. 1998 ; Ho et al. 2007).

Actuellement, le genre Leuconostoc comprend quatorze espèces, ils sont également

anaérobies facultatifs et exigeants au point de vue nutritionnel et leur croissance est toujours

39


lente. Le développement des leuconostoc entraîne souvent l’apparition d’une viscosité dans

le milieu grâce à la production des exopolysaccharides. Les leuconostoc principalement Ln.

mesenteroides ssp.cremoris et Ln. lactis sont utilisés en association avec les lactocoques dans

l’industrie laitière pour produire en plus de l’acide lactique et le CO2, des substances

aromatiques telles que le diacétyle et l’acétoïne à partir des citrates du lait (Hassan et

Frank, 2001 ; Guiraud, 2003 ; Ogier et al. 2008). Une espèce Leuconostoc oenos isolée de

vins a été classée dans un nouveau genre, Oenococcus oeni et certaines espèces de

lactobacilles hétérofermentaires ont été groupées avec Leuconostoc paramesenteroides dans

le nouveau genre Weissella (Stiles et Holzapfel, 1997).

3.2.6. Genres Pediococcus et Tetragenococcus:

Les Pediococcus sont des coques homofermentaires dont la particularité est le

regroupement en tétrade. Ils sont mésophiles, le plus souvent incapable d’utiliser le lactose,

et leur développement nécessite la présence de divers facteurs de croissance. Certaines

espèces se distinguent par leur capacité à se développer à des teneurs en sels très élevées,

comme Pediococcus halophilus, renommé Tetragenococcus halophilus et Tetragenococcus

muriaticus qui tolère jusqu’à 18% de NaCl (Pilet et al. 2005). Les espèces de

Tetragenococcus ont un rôle crucial dans la fabrication des produits alimentaires à

concentration élevée en sel comme les sauces de soja, alors que les pediocoques sont parfois

utilisés comme levains lactiques pour les charcuteries (Guiraud et Rosec, 2004 ;

Tosukhowong et al. 2005).

3.2.7. Genre Bifidobacterium:

Le genre Bifidobacterium est considéré comme faisant partie du groupe des bactéries

lactiques grâce à la similarité de ses propriétés physiologiques et biochimiques et à sa

présence dans le même habitat écologique, tel que le tube gastro-intestinal. Ces

microorganismes sont phylogénétiquement sans rapport avec ces dernières. Ils sont

davantage liés au phylum Actinobacteria (anciennement Actinomycètes) des bactéries Gram

positif dont l’ADN est à haut pourcentage de G +C. Les bifidobactéries se caractérisent par

leur forme très irrégulière souvent en forme V mais pouvant être coccoïdes, la présence d'une

enzyme, la fructose-6-phosphate phosphocétolase, celle-ci leur permet de fermenter les

hexoses en produisant de l'acide acétique et de l'acide lactique. Leur température de

croissance varie de 36°C à 43°C (Axelsson et al. 2004 ; Pilet et al. 2005 ; Ho et al. 2007).

40


4. Habitat:

Les bactéries lactiques sont présentes à l’état libre dans l’environnement ou vivent

en association avec un hôte, tel que l’Homme ou l’animal, dans un écosystème bactérien

comme le tractus gastro-intestinal ou génital des mammifères (Klein et al. 1998).

4.1. Présence des bactéries à l’état libre dans l’environnement:

Dans l’environnement, les bactéries lactiques sont souvent retrouvées dans le lait et

ses dérivés (lait fermenté, fromages, …). Les différentes espèces de

Lactobacillus,Lactococcus lactis (Lc. lactis) et/ ou Lc. garvieae, les plus rencontrées dans le

lait et le fromage, sont communément utilisées comme ferments (« starter culture ») par

l’industrie agroalimentaire pour la production de produits laitiers. Aussi, les bactéries

lactiques sont à l’origine de la fermentation utilisée pour la préparation de boissons à partir

de plantes (boza, cidre, …). Parmi elles, on distingue des espèces appartenant aux genres

Lactobacillus et Leuconostoc (Gálvez et al. 2011). Acidotolérantes, les bactéries lactiques

sont capables de survivre dans des milieux très acides en raison de leur production d’acide

lactique (Gálvez et al. 2011).

4.2. Présence des bactéries lactiques en association avec un hôte:

Les bactéries lactiques peuvent vivre en symbiose entre elles et avec un hôte. Le

tractus gastrointestinal des mammifères est colonisé par des bactéries lactiques telles que

Bifidobacterium, Lactobacillus, Leuconostoc, et Weisseilla. Par ailleurs, l’appareil génital

chez la femme est principalement colonisé par des bactéries lactiques, telles que

Lactobacillus, auxquelles il apporte des nutriments comme le glycogène. En acidifiant le

milieu, ces bactéries apportent une protection contre des pathogènes responsables

d’infections vaginales comme Trichomonas vaginalis (Björkroth et Holzapfel, 2006, Ruiz

et al. 2009).

41


5. Métabolisme fermentaire:

5.1. Métabolisme des sucres:

Les bactéries lactiques utilisent principalement l’une des deux voies majeures du

métabolisme des sucres (Figure 15) (De Roissart et Luquet, 1994) :

5.1.1. Voie homofermentaire ou EMP :

Ils convertissent presque quantativement le glucose en acide lactique (90 à 95%).

Une des enzymes clé de la glycolyse est le fructose 1-6 diphosphate aldolase, cette enzyme

est présente dans toutes les espèces homofermentaires (Streptocoque, Enterocoque,

Lactocoque, Pediocoque et Lactobacille). C’est une enzyme qui transforme le fructose

biphosphate en triose phosphate. Les bactéries homolactiques contiennent habituellement

une forte concentration en fructose diphosphate (FDP). Cette molécule importante pour la

régulation sert d’activateur de la synthèse des enzymes terminales de la voie glycolytique

(pyruvate kinase et lactate déshydrogénase). En dehors du glucose, les bactéries

homolactiques ont la capacité de fermenter d’autres mono ou disaccharides. Ces molécules

pénètrent dans la cellule par l’intermédiaire de système phosphotransférase ou sous forme

libre par l’intermédiaire d’un système perméase mais la voie de l’EMP est la voie principale

de dégradation des dérivés phosphoryles.

Glucose + 2Pi + 2ADP 2Lactate + 2ATP.

5.1.2. Voie hétérofermentaire ou PPC (pentose phosphocétolase) :

Les bactéries lactiques appartenant à cette classe sont les leuconostocs et certains

lactobacilles. Elles sont également dépourvues d’un système phosphotransférase PEP pour le

glucose. Avec ces bactéries le glucose est accumulé par l’intermédiaire d’un transport actif

puis est phosphorylé par une glucokinase ATP dépendante. Le glucose 6p est transformé en

acide 6p gluconique puis décarboxylé en 5p avec libération de CO2. Ce pentose phosphate

est métabolisé en triose phosphate et en acétyl-P. Enfin l’acétyl-P est réduit en éthanol et le

triose phosphate est métabolisé en acide lactique par les dernières réactions de la voie EMP:

Glucose + Pi + ADP Lactate + ATP + CO2 + éthanol.

42


43


5.2. Métabolisme azoté:

De fait de leurs nombreuses auxotrophies pour les acides aminés, la croissance des

bactéries lactiques repose sur leur système protéolytique. Ces systèmes comportent des

protéases intracellulaires, des systèmes de transport spécifiques pour les peptides et une

multitude de peptidases intracellulaires. Les systèmes protéiques des lactocoques et des

lactobacilles sont remarquablement similaires, en ce qui concerne leurs composants et leurs

modes d’action (Law et Haandrikman, 1997 ; Savijoki et al. 2006). Les études du système

protéolytique ont été menées essentiellement pour le genre Lactococcus et ont permis

l’établissement d’un modèle de la protéolyse en trois étapes (Figure 16): la première étape

fait intervenir une protéase ancrée à la surface bactérienne, appelée protéase de paroi (ou

PrtP). Les peptides sont pris en charge par deux systèmes de transport des oligopeptides

(Opp et Opt) pour traverser l’enveloppe bactérienne. Des di et tripeptides peuvent aussi être

transportés par deux autres systèmes (DtpT et Opt). Les acides aminés sont transportés par

des systèmes de transport spécifiques. Enfin, dans le cytoplasme bactérien un éventail de

peptidases concourent à achever l’hydrolyse des peptides en acides aminés (Savijoki et al.

2006 ; Atlan et al. 2008 ; Picon et al. 2010). Le catabolisme des acides aminés est une voie

majeure de formation de molécules aromatiques (alcool, aldéhydes, acides organiques, …),

comme il peut être une source d’énergie pour certaines bactéries lactiques en cas de

limitation en nutriments (Williams et al. 2001).

Fig. 16 : Schéma du système protéolytique de Lactococcus lactis (Atlan et al. 2008).

44


6. Besoins nutritionnels :

Les bactéries lactiques ont une faible aptitude biosynthétique et sont en principe

incapables d’assimiler directement les principaux précurseurs de leur environnement. Elles

requirent non seulement des substrats complexes carbonés, azotés mais aussi des facteurs de

croissance comme les vitamines et les oligoéléments dont le rôle des coenzymes est plus

important (Lenoir et al. 1992).

→ Vitamines : jouent un rôle primordial dans le métabolisme cellulaire. Les bactéries

lactiques sont incapables de synthétiser des vitamines d’où l’importance d’un apport exogène

en vitamines au milieu de culture (Desmazaud et De Roissart, 1994).

→ Ions : ont une fonction de cofacteur pour de nombreuses enzymes, en effet le fer est un

élément important puisqu’il y a des affinités pour un grand nombre de molécules chelatrices.

Il augmente la croissance et la production d’acide lactique pour les lactocoques ainsi le

calcium et magnésium exercent un effet crucial dans le métabolisme énergétique, le sodium

exerce un effet sélectif sur différentes espèces des bactéries lactiques (Boyaval, 1989).

7. Devenir des bactéries lactiques ingérées :

L’étude de la survie des bactéries lactiques dans le tractus gastro-intestinal est

importante pour une meilleure connaissance du devenir des bactéries lactiques ingérées avec

l’aliment et une meilleure compréhension de l’action des probiotiques chez l’homme et

l’animal. Il est probable que pour exercer un effet probiotique significatif, les bactéries

doivent arriver vivantes et en nombre suffisant dans l’intestin (Drouault et Corthier, 2001).

Deux techniques peuvent être utilisées : la collection des selles et l’intubation intestinale

(Marteau et al. 1992 ; Rambaud et al. 1993).

7.1. Elimination des bactéries lactiques ingérées :

Les bactéries ingérées sont généralement excrétées dans les selles pendant quelques

jours après leur ingestion à la même vitesse qu’un marqueur de transit (Bouhnik et al. 1992).

Le pourcentage de survie des bactéries dans les selles après consommation varie de 1à 5%

excepté pour Bifidobacterium et Lb.plantarum atteignent environ 25 à 30% de survie par

contre la survie dans les selles des bactéries lactiques du yaourt Sc.thermophilus et

Lb.bulgaricus est très faible avec des quantités inférieurs au seuil de détection (Drouault et

Corthier, 2001).

45


7.2. Survies des bactéries lactiques dans la lumière intestinale :

L’intubation intestinale est la meilleure technique pour obtenir des échantillons

humains ou animaux à partir des différents segments du tractus gastro-intestinal dont laquelle

on détermine non seulement les concentrations en bactéries mais également leur débit dans

un compartiment bien précis du tractus digestif, à ce jour un petit nombre de bactéries

lactiques ont été étudiés leur survie dans l’intestin grêle (Tableau I).

Tableau I: Pourcentage de quelques bactéries d’origine alimentaire dans l’intestin grêle

humain

Bactéries lactiques Taux de survie Site de

récupération

Source

Lb.plantarum

NCIMB 8826

Lb.fermentum kld

Lc.lactis mg 1363

7

0.5

1

Iléon

Iléon

Iléon

Vesa et al. 2000

B.bifidum

Lb.acidophilus

Bifidobacterium sp

37.5

1.5

23.5

Iléon

Iléon

Iléon

Marteau et al. 1992

Lb.bulgaricus

Sc.thermophilus

> 1

> 1

Duodénum

Duodénum

Pochart et al. 1989

8. Critères de sélection des bactéries lactiques comme probiotiques :

Les probiotiques sont généralement définis en tant que microorganismes vivants

exerçant une action bénéfique sur la santé de l’hôte qui les ingère en améliorant l’équilibre

de la flore intestinale (Fuller, 1989). Les probiotiques doivent répondre à certains exigences

avant d’être à même de produire un effet bénéfique :

46


8.1. Propriétés et critères de sélection des souches probiotiques:

Les probiotiques présentent des propriétés qui sont variables selon l’espèce ou la

souche microbienne. Il est nécessaire de connaître le genre et l’espèce de la souche utilisée

car les effets probiotiques sont spécifiques à la souche microbienne. La non pathogénicité

des souches est un critère très important, les souches ayant le statut GRAS (Generally

Regarded As Safe) sont d'ailleurs à favoriser. Toutefois, le critère de viabilité ou de survie

demeure essentiel dans la sélection des probiotiques qui doivent parvenir vivantes au site de

leur action, à savoir l’intestin, et donc résister aux différents mécanismes de défense de

l’hôte. Les bactéries étant administrées par voie orale, il faut qu’elles franchissent les

obstacles majeurs du transit digestif : le pH acide, les sels biliaires, les enzymes

pancréatiques…etc (Percival, 1997 ; Lamoureux, 2000 ; Millette et al. 2008).

8.1.1. Résistance à l'acidité gastrique:

La survie des bactéries dans le suc gastrique dépend de leur capacité à tolérer les

bas pH. Le temps de passage peut être d’une heure à quatre heures selon l'individu et son

régime. Par conséquent, quelques auteurs proposent que les souches probiotiques doivent

résister à un pH de 2.5 dans un milieu de culture pendant quatre heures (Ammor et Mayo,

2007).

8.1.2. Résistance aux sels biliaires:

Dans l'intestin grêle, la tolérance aux sels biliaires est un facteur important qui

contribue à la survie des probiotiques. Les bactéries qui survivent aux conditions acides de

l'estomac doivent alors faireface à l’action détergente des sels biliaires libérés dans le

duodénum après ingestion des repas gras. Les bactéries peuvent réduire l’effet émulsifiant

des sels biliaires en les hydrolysant avec des hydrolases, de ce fait diminuant leur solubilité

(Ammor et Mayo, 2007 ; Gu et al. 2008).

8.1.3. Adhésion aux cellules épithéliales:

La capacité d’adhésion à la couche intestinale est un critère de sélection

recommandé pour le choix des probiotiques, parce que c'est une condition pour la

colonisation des entrailles. L'adhérence constitue le premier mécanisme de défense contre

l’invasion des bactéries pathogènes. Elle est basée sur la réalisation d’un ensemble de tests in

vitro puis in vivo en utilisant des cellules d’origine animale et/ou humaine (Palomares et al.

2007 ; Reyes-Gavilan et al. 2011). 47


En plus du pouvoir d’adhésion aux cellules épithéliales de l'intestin, les probiotiques

peuvent se fixer au mucus qui recouvre les enthérocytes ou aux divers microorganismes que

l'on retrouve dans le tractus gastro-intestinal (Lamoureux, 2000).

8.1.4. Production de substances antimicrobiennes:

Les bactéries lactiques synthétisent des molécules à action

bactéricide/bactériostatique comme les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène, le

dioxyde de carbone, le diacétyle et les bactériocines. Ces mécanismes antimicrobiens ont été

exploités pour améliorer la préservation des aliments (Titiek et al. 1996 ; Labioui et al.

2005).

8.1.5. Résistance aux antibiotiques:

Les bactéries lactiques sont naturellement résistantes à beaucoup d’antibiotiques

grâce à leur structure et physiologie. Les travaux de Temmerman et al. (2003) ont montré

que 68.4% des probiotiques isolés ont une résistance à un antibiotique ou plus. Des souches

de Lactobacillus ont été trouvées résistantes à la kanamycine (81%), à la tétracycline

(29.5%), à l’érythromycine (12%) et au chloramphénicol (8.5%). 38% des isolats de

Enterococcus faecium ont été trouvés résistants à la vanomycine.

Dans la pluspart des cas la résistance n’est pas transmissible, cependant, il est

possible que le plasmide codant pour la résistance aux antibiotiques soit transféré à d’autre

espèces et genre. C'est une raison significative pour choisir des souches manquantes du

potentiel de transfert de résistance (Denohue, 2004).

Les autorités européennes ont récemment conclu que quelques bactéries utilisées

pour la production d’aliment pourraient poser un risque à la santé humaine et animale en

raison d'héberger des souches avec les gènes de résistance transmissibles. Par conséquent,

avant de lancer une culture probiotique, il est important de vérifier que les souches

bactériennes impliquées ne comportent pas de gènes transmissibles de résistance aux

antibiotiques (Ammor et Mayo, 2007).

48


8.1.6. Critères technologiques:

En plus de l’innocuité et des propriétés fonctionnelles, des critères technologiques

sont également pris en considération dans la sélection des souches probiotiques. Selon

Saarela et al. (2000), ces critères sont :

- Bonnes propriétés sensorielles ;

- Résistance aux phages;

- Viabilité durant le traitement technologique ;

- Stabilité dans le produit et durant le stockage.

8.2. Effets des probiotiques sur la santé:

Les probiotiques sont des microorganismes vivants, qui lorsqu'ils sont ingérés en

quantité suffisante, exercent un effet bénéfique sur la santé de l'hôte (FAO/OMS, 2001).

Consommés depuis des centaines d’années, les produits laitiers ont toujours été considérés

comme source de santé et de longévité, dans le Caucase et au Moyen-Orient. Ce n’est qu’à

partir du XXe siècle, qu’Elie Metchnikoff évoqua une éventuelle relation entre la longévité

de certaines populations et leur consommation de grandes quantités de lait fermenté. Plus

tard, il isola deux espèces bactériennes Streptococcus salivarius subsp. thermophilus et Lb.

delbrueckii subsp. bulgaricus auxquelles il attribua les bienfaits de « longue vie ». Ce n’est

qu’en 1954, que le terme « probiotique » a été pour la première fois introduit dans la

littérature par Ferdinand Vergin. Les produits à base de laits fermentés sont considérés

depuis de nombreuses années comme bénéfiques pour la santé humaine. Certaines espèces

bactériennes ont le pouvoir d’améliorer la valeur nutritionnelle des aliments et les conditions

générales de santé de l’homme en prévenant et en contrôlant les infections intestinales et

diverses maladies comme le cancer, l’intolérance au lactose, la constipation,etc…(Gournier-

Château et al. 1994). De nombreux microorganismes sont considérés comme probiotiques,

parmi eux des bactéries lactiques telles que Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium

breve,Bifidobacterium longum, Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb. casei, et Streptococcus

thermophilus (Str. thermophilus). Lb. bulgaricus et Str. thermophilus sont les premières

souches bactériennes qui ont été utilisées pour la fabrication de yaourt (Tableau II).

49


D’autre part, des levures comme S.boulardii et S. cerevisiae, communément

utilisées dans la fabrication du pain, de la bière et du kéfir, sont également reconnues pour

leurs propriétés probiotiques. S. boulardii a été isolée pour la première fois à partir de fruits

de litchis et de mangoustans par le scientifique Français Henri Boulard en 1923. Il a été

démontré, plus tard, que S. boulardii permet la restauration de la flore du gros intestin après

des diarrhées causées par Vibrio cholerae (Dias et al. 1995).

8.2.1. Amélioration de la digestion de lactose:

Il est bien établi que le yaourt a des effets positifs sur le mal digestion du lactose

dans le cas de déficiences primaires et secondaire en lactase (Drouault et Corthier, 2001).

Ce disaccharide, présent exclusivement dans le lait et ses dérivés. Chez les personnes

souffrant d’intolérance au lactose, un déclin de la production de cette enzyme est observé au-

delà de la petite enfance. La deuxième cause d’intolérance (intolérance secondaire) est

représentée par les maladies dont la conséquence est une réduction de la surface de

digestion-absorption intestinale ou une accélération du transit jéjunal, comme les résections

intestinales, les gastro-entérites, la maladie cœliaque ou les gastrectomies. Plusieurs études

ont montré que le β-galactosidase participe à la digestion du lactose dans l’intestin (Marteau

et al. 1990; Marteau et al. 2001). Il a été démontré que les bactéries qui survivaient dans

l’intestin gardent une activité métabolique suffisante pour hydrolyser le lactose (Drouault et

al. 1999), et que celles dont la membrane est facilement lyser par des acides biliaires

libéraient leur lactase dans l’intestin (Marteau et al. 1990).

8.2.2. Réduction du taux de cholestérol :

Plusieurs études ont montré que la consommation de yaourt ou de lait fermenté

contenant des probiotiques entraîne une diminution du taux de cholestérol dans le sang, et

par conséquent la réduction des risques d’hypercholestérolémie responsable des maladies

coronariens (Dilmi Bouras, 2006). Modler et al. (1990) ont montré que les bactéries

lactiques produisant de l’hydroxyméthylglutarate, qui inhibe l’enzyme

l’hydroxyméthylglutaryl-réductase intervenant dans la synthèse du cholestérol.

L’administration de laits fermentés contenant une grande quantité de Bifidobacterium

(109UFC/g) à des patients ayant un taux de cholestérol élevé permet de diminuer la quantité

de cholestérol de 3à 1,5g/l (Gournier- Château et al. 1994).

50


8.2.3. Cancérogenèse:

D'après Rowland et al. (1998); Naito et al. (2007): La flore colique pourrait être

impliquée dans la cancérogenèse. Cet effet serait médité par des enzymes bactériennes qui

activent des procarcinogènes en carcinogènes. Des expériences menées avec des modèles

animaux et chez l’homme ont montré que plusieurs bactéries probiotiques pouvaient

diminuer les taux d’enzymes responsables de l’activation de certaines procarcinogénes tels

que la β- glucuronidase, la β-galactosidase, l’azoréductase, ou encore la nitroréductase.

8.2.4. Réduction du risque de diarrhée:

Les souches probiotiques Lb. acidophilus et Lb. casei, qu'on retrouve entre autres

dans le lait fermenté Bio-K+®, ont fait l'objet d'études montrant leur efficacité contre la

diarrhée associée à la prise d'antibiotiques en milieu hospitalier (Kelleher et al. 2002;

Penner et al. 2005a). Plusieurs types des diarrhées sont dus à des infections microbiennes.

Des effets protecteurs de souches probiotiques contre certaines infections intestinales ont été

observés sur des modèles animaux. Les mécanismes potentiellement impliqués incluent la

production d’acide, de peroxyde d’hydrogène, d’autres substances antimicrobiennes telles

que les bactériocines, la compétition pour de nutriments ou des récepteurs d’adhésion, des

actions antitoxines et de la stimulation du système immunitaire (Gill, 2003). Plusieurs

études randomisées contrôlées sur l’homme ont montré l’efficacité des souches probiotiques

pour prévenir ou atténuer les perturbations digestives liées à la prise d’antibiotiques

(Gremonini et al. 2002 ; Fooks and Gibson, 2002 ; Hickson et al. 2007).

8.2.5. Effets sur le système immunitaire :

Des études ont montré que l'ajout des probiotiques compact certaines effets de

l’affaiblissement du système immunitaire et en particulier renforce l’activité des cellules

naturelles (Gill et al. 2001). En outre, l’interaction d’adhésion des probiotiques à la surface

mucosale facilité le contact avec le médiateur local du tissu lymphoïde. L’association de ce

dernier à l’intestin déclenche l’immunisation de tout le système et la stabilisation de la

fonction barrière du mucus (Salminen et Salminen, 1997). Ce système fonctionne en

provoquant une augmentation de la production des IgA, IgG, IgM, cytokines anti-

inflammatoires, interleukines et interférones (Attouri et Lemonier, 1997).

51


8.2.6. Infection par Helicobacter pylori:

Selon Reid et al. (2003b), Helicobacter pylori est une bactérie impliquée dans la

survenue et les récidives des gastrites et ulcères gastro-duodénaux. Des travaux réalisés in

vitro et in vivo indiquent que les bactéries lactiques peuvent inhiber la croissance de

Helicobacter pylori et diminuer l’activité uréasique nécessaire pour que l’agent pathogène

reste dans le milieu acide de l’estomac (FAO/OMS, 2001).

Tableau II: Exemples de souches probiotiques dans des produits (WGO, 2008).

52


III. Bactériocines

1. Définition des bactériocines:

Les bactériocines sont définies comme des molécules sécrétées par les bactéries, de

nature protéique ou peptidiques et douées d'une activité antagoniste vis-à-vis des souches

phylogénétiquement proches des souches productrices. Leur synthèse par voie ribosomique,

les différencie des antibiotiques de nature peptidique provenant de l'assemblage enzymatique

d'acides aminés libres (Cenatiempo et al. 1996). Deux grands groupes de bactériocines

peuvent être distingués avec, d'une part, les bactériocines produites par des bactéries à Gram

négatif, et d'autre part, celles produites par les bactéries à Gram positif et notamment les

bactériocines de bactéries lactiques.

La découverte des bactériocines remonte à 1925 quand GRATIA appela "colicines"

des substances antibactériennes sécrétées par E. coli. Des substances semblables sécrétées

par des bactéries à Gram positif ont été découvertes. Elles ont été appelées « bactériocines ».

II a été rapporté pour la première fois par Rogers en 1928, qu'une substance antimicrobienne

produite par Lactococcus lactis subsp. lactis avait une activité inhibitrice sur Lactobacillus

delbruckii subsp. bulgaricus.

La nature protéique de cette substance a été identifiée par Hirch en 1951 qui

l'appela nisine. "n" désigne les streptocoques de groupe N selon la classification de

Lancefield (1993) "is" est l'abréviation de « Inhibitory Substances » et "ine" désigne une

bactériocine (De Vuyst et Vandamme ,1994).

La production d'une bactériocine peut être considérée comme une façon d'éliminer

des bactéries envahissantes qui font compétition à la bactérie productrice pour les nutriments.

Le spectre d'activité d'une bactériocine se définit comme étant la diversité des bactéries

sensibles à l'action bactéricide ou bactériostatique du peptide. On a d'abord attribué aux

bactériocines un spectre d'activité limité aux bactéries taxinomiquement proches de la

bactérie productrice. Certaines bactériocines possèdent un large spectre d'activité qui inclut

des bactéries éloignées au point de vue phylogénétique (Lachance, 2000). Des critères ont

été établis pour définir les bactériocines :

53


• Ce sont des protéines ayant une activité bactéricide et pas seulement

bactériostatique ;

• Elles ont des sites de liaisons spécifiques dans la membrane des bactéries cibles ;

• Leur synthèse est associée à la synthèse d'une protéine d'immunité qui évite de

provoquer la mort de la cellule excrétrice (Troupel, 2009).

2. Classification des bactériocines:

Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont réparties en quatre

classes reposant sur les structures et les mécanismes d’action (Klaenhammer, 1993). Cette

classification a été modifiée actuellement par l’ajout de sous-classes (Nes et al. 1996 ; Diep

et al. 1996) :

2.1. Classe I : Les lantibiotiques :

Les lantibiotiques sont des petits peptides de taille inférieure à 5 kDa, stables à la

chaleur (Dortu et Thonart, 2009) ; hydrophobes qui agissent au niveau de la membrane et

contiennent des acides aminés non usuels (Klaenhammer ,1993).

La structure des lantibiotiques varie essentiellement en fonction de la localisation de

ponts établis entre les acides aminés modifiés ce qui permet de distinguer les types A

(lantibiotiques linéaires) et B (lantibiotiques globulaires) (Moriss et al. 2005).

Les lantibiotiques sont des peptides antimicrobiens synthétisés par voie ribosomique

et subissant des modifications post-traductionnelles importantes. Ils se distinguent des autres

bactériocines, par la présence de résidus lanthionine et 3’-méthyllanthionine. La lanthionine

et la 3’-méthyllanthionine, résultent respectivement de la formation d’un pont thioéther entre

une cystéine libre et un acide aminé déshydraté, la didéhydroalanine (Dha) et la 2, 3-

didéhydrobutyrine (Dhb). La Dha et la Dhb sont respectivement formées par déshydratation

de la sérine et de la thréonine.

54


2.1.1. Type A:

Le type A rassemble les lantibiotiques linéaires et cationiques structurés en hélice

alpha-amphiphile et de masse moléculaire < 4 kDa. Ces peptides présentent des similitudes

d’arrangement de leurs ponts « lantionine ». Ces bactériocines sont synthétisées par les

genres Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, et également par des Bacillus. Les

bactériocines les plus étudiés de cette classe sont la nisine produite par Lc lactis,

l’épidermine produite par Staphylococcus epidermis et la subtiline produite par Bacillus

subtilis (Mc Auliffe et al. 2001). Les lantibiotiques de type A puissent être subdivisés en

deux sous groupes (I et II) en fonction des parties Leaders des peptides (Moriss et al. 2005):

Type A I : Le leader peptide est hydrophile, possède une grande proportion d’acides aminés

chargés avec une région très conservé et a une nette charge négative ou légèrement positive

(ex : nisine A).

Type A II: Le leader peptide est chargé négativement (ex : lacticine 481)

2.1.2. Type B:

Molécules globulaires de masse moléculaire varie de 1.8 à 2.1 kDa (ex :

mersacidine) (Chen et Hoover, 2003), plus rigides que les peptides de type A et ayant une

charge globalement nulle ou négative. Ces molécules agissant en inhibant certaines enzymes

comme celles intervenant dans la biosynthèse de la paroi cellulaire. Cette sous-classe de

lantibiotiques regroupe les duramicines et leurs variants naturelles (l’ancovinine et la

cinnamycine), la mersacidine, l’actagardine et la mutacine A (Moriss et al. 2005).

2.2. Classe II: Peptides non modifiés :

Ce Sont des peptides de taille inférieure à 10 kDa, stables à la chaleur, ne contenant

pas d’acides aminés modifiés (Dortu et Thonart, 2009). Elle correspond à une plus grande

variété de structures, ce qui nécessite la création de plusieurs sous groupes (Chen et Hoover,

2003).

55


La classe II forme un groupe relativement hétérogène de peptides de masses

moléculaires < 10 kDa. Contrairement aux lantibiotiques, les bactériocines de classe II ne

présentent pas de modifications post-traductionnelles. La classe II peut être subdivisée en:

Sous-classe IIa : Bactériocines anti-listeria « pediocin-like » (ex : pédiocinePA-Les

bactériocines de classe IIa sont aussi communément appelées bactériocines « pediocin-like »

en référence à la pédiocine, une des premières bactériocines de la classe Iia caractérisées.

Ces bactériocines sont produites, pour la plupart, par des bactéries lactiques et représentent le

groupe de bactériocines de classe II le mieux étudié (Fimland et al. 2005; Drider et al.

2006).

Les bactériocines de classe IIa ont suscité beaucoup d’intérêt en raison de leur

production par des bactéries isolées de l’alimentation et ce, combiné à une activité

antimicrobienne dirigée contre des pathogènes majeurs responsables d’infections, tels que

Li.monocytogenes. De façon générale, les bactériocines « pediocin-like » présentent un

spectre d’activité étroit limité aux bactéries à Gram positif. Depuis la découverte de

nombreuses bactériocines pendant les années 90, telles que la curvacine A (Tichaczek et al.

1993) sakacine A (Axelsson et Holck, 1995), la leucocine A (Hastings et al. 1991), la

mésentéricine Y105 (Héchard et al. 1992; Fleury et al. 1996), la pédiocine PA-

1(Henderson et al. 1992) et la sakacine P (Tichaczek et al. 1994; Hühne et al. 1996), de

nombreuses nouvelles bactériocines ont été découvertes et sont régulièrement découvertes,

comme la mundticine L (Feng et al. 2009) et l’avicine A (Birri et al. 2010). Les

bactériocines de classe IIa sont des peptides antimicrobiens cationiques et partiellement

amphipathiques et/ ou hydrophobes de masse moléculaire inférieure à 5500 Da. Elles sont

constituées de 37 à 49 acides aminés.

Sous-classe IIb :

Les bactériocines, communément appelées « two-peptides », sont formées de deux

peptides différents, α et β, dont l’activité antimicrobienne optimale nécessite la présence des

deux peptides complémentaires, le plus souvent en quantité équimolaire (Garneau et al.

2002; Nissen-Meyer et al. 2009).

56


Dans certains cas, ces peptides peuvent être actifs individuellement comme c’est le

cas de la lactacine F (Allison et al. 1994) et des plantaricines EF et JK(Anderssen et al.

1998). Depuis l’identification de la lactococcine G chez Lb. lactis (Nissen-Meyer et al.

1992), environ 15 bactériocines de la même classe ont été isolées et caractérisées. Ces

bactériocines possèdent une taille très variable allant de 25 résidus (plantaricine J, PlnJ) à 62

résidus (thermophiline A, ThmA). Comme les autres bactériocines de classe II, les

bactériocines de classe IIb possèdent un spectre d’activité incluant de nombreux genres de

bactéries à Gram positif pathogènes telles que Bacillus, Clostridium, Listeria,

Staphylococcus et Streptococcus ou commensales comme Lactobacillus, Lactococcus et

Pediococcus (Garneau et al. 2002).

Toutes les bactériocines de classe IIb agissent en perméabilisant la membrane

cytoplasmique de la bactérie cible, provoquant des mouvements d’influx et d’efflux d’ions

et de petites molécules et conduisant à la mort de la bactérie. Les bactériocines de classe IIb

sont actives à faible concentration contrairement à d’autres bactériocines (Oppegård et al.

2007b).

Sous-classe IIc :

Les bactériocines circulaires se carctérisent par la présence d’un cycle liant d’une

façon covalente leurs extrémités N- et C-terminales. La structure circulaire est responsable de

la protection de ces bactériocines à l’égard de la protéolyse, en raison de l’absence de site de

clivage aux exopeptidases (Maqueda et al. 2008), et joue un rôle important dans

l’augmentation de l’activité antimicrobienne dûe à une stabilité accrue de la molécule. Par

ailleurs, le terme circulaire a été associé à ces bactériocines pour les distinguer des peptides

cycliques comme les polymixines, la cyclosporine A et la gramicidine S synthétisées par la

voie des peptide-synthétases appellées NRPS (nonribosomal peptides synthetase) (Koglin et

Walsh, 2009). Les bactériocines circulaires agissent par la perméabilisation de la membrane

cytoplasmique et la perturbation de la force protomotrice membranaire de la bactérie cible

aboutissant à la mort cellulaire.

57


Huit bactériocines circulaires ont été caractérisées à ce jour, parmi lesquelles cinq

sont produites par des bactéries lactiques (carnocycline A, gasséricine A/ reutéricine 6,

entérocine AS-48, lactocycline Q, ubérolysine), tandis que la butyrivibriocine AR10 et la

circularine A sont produites respectivement par Clostridium beijerinckii (Cl. beijerinckii) et

Butyrivibrio fibrisolvens (By. fibrisolvens) (Kawulka et al. 2003).

La structure circulaire ainsi que l’oligomérisation confèrent à ces bactériocines une

activité biologique décuplée en apportant une stabilité thermodynamique et une intégrité à

leur structure protéique ainsi qu’une protection contre des protéases (Maqueda et al. 2008).

2.3. Classe III: protéines :

Ces protéines de taille supérieure à 30 kDa sont sensibles à la chaleur. La structure

et le mode d’action de ces bactériocines diffèrent complètement des autres bactériocines

produites par les bactéries lactiques. Cette classe ne contient que quatre bactériocines (Nilsen

et al. 2003 ; Papagianmi, 2003 ; Nigutova et al. 2007).

- l’helveticin J produite par Lactobacillus helveticus A.

- l’enterolysin A produite par Enterococcus faecium.

- la zoocin A produite par Spreptococcus zooepidemicus.

- la millericin B produite par Streptococcus milleri.

2.4. Classe IV: bactériocines complexes :

Les bactériocines de classe IV étaient définies comme des protéines associées à une

composante non protéique, lipidiques et/ou oligosaccharidiques, nécessaire à leur activités

biologiques la plantaricines S, par exemple possède une activité antibactérienne sensible à

des enzymes lipolytiques et glycolytiques (Jiménez-Diaz et al. 1993).

3. Intérêts des bactériocines:

Dans leur grande majorité, les bactériocines peptidiques de bactéries lactiques sont

thermorésistantes (120°C pendant 10 minutes), stables dans des zones de pH de 3 à 8 et

sensibles à l’action d’enzymes protéolytiques. De plus, contrairement à certains autres

peptides antimicrobiens d’invertébrés et vertébrés, elles ne montrent pas d’activité

hémolytique vis- à-vis des cellules eucaryotes (Nes et Holo, 2000).

58


Parmi les applications réelles ou envisagées pour les bactériocines de bactéries

lactiques, on peut citer l’utilisation de ferments producteurs de bactériocines dans l’industrie

laitière (Cleveland et al. 2001). La fixation des bactériocines sur des polymères pour

l’emballage d’aliments pourrait aussi être un mode de conservation des aliments (Sebti et al.

2002).

Différentes bactériocines trouvent des applications dans les domaines, médicaux et

vétérinaires. Par exemple, la nisine a fait l’objet d’un brevet (Blackburn et Projan, 1994)

quant à son utilisation dans la prévention et le traitement d’ulcère causé par Helicobacter

pylori .Elle est, de plus, connue pour être un agent thérapeutique potentiel des mastites

bovines, et est déjà utilisée comme agent prophylactique. Différentes études ont été réalisées

sur l’utilisation de la nisine en solution buccale. Elle a démontré une action préventive contre

la plaque dentaire et les inflammations gingivales chez le chien (Howell et al. 1993).

4. Domaines d’applications des bactériocines:

4.1. Typage bactérien:

Le pouvoir des bactériocines à inhiber certaines souches de la même espèce

productrice et parfois des souches des autres espèces a été largement utilisé pour

l’identification d’espèces de différents genres bactériens. La plupart des méthodes sont

basées sur l’inhibition d’une souche dite indicatrice ou sensible aux bactériocines. Cette

méthode a été utilisée avec succès pour certaines bactéries Gram-négatif, telles que

Pseudomonas aeruginosa (Pitt et Gaston, 1995). L’utilisation des bactériocines a permis

aussi à Merino et al. 2000 de différencier les souches de Shigella.

4.2. Domaine alimentaire:

L’utilisation des bactériocines dans le domaine alimentaire est avantageuse non

seulement à cause de leur large spectre d’activité, mais aussi parce qu’elles sont non

toxiques, facilement dégradables par les enzymes digestives et ne compromettent pas la prise

des médicaments (Ryan et al. 1998). Du fait qu’elles sont des substances naturelles, l’emploi

des bactériocines permettrait d’avoir des produits plus sains et réduirait l’utilisation des

agents chimiques de conservation (Harlander, 1993 ; Galvarez et al. 2007). Ces dernières

années, l’application des bactériocines dans la technologie a gagné une grande attention. En

effet, plusieurs bactériocines montrent des effets synergiques ou addititionnels lorsqu’elles

sont utilisées en combinaison avec d’autres agents antimicrobiens, incluant des conservateurs

59


chimiques, des composés phénoliques naturels (Grande et al. 2007), et même d’autres

protéines antimicrobiennes. L’utilisation combinée de bactériocines différentes, peut être

aussi une approche attirante pour éviter le développement de souches résistantes (Galvarez

et al. 2007).

La combinaison de bactériocines avec des traitements physiques, comme le

traitement à haute pression ou dans un champ électrique, offre une conservation plus efficace

des produits alimentaires, fournissant ainsi une barrière complémentaire aux formes les plus

résistantes comme les endospores bactériennes (Galvarez et al. 2007).

La nisine est utilisée comme additif dans les aliments en conserves, notamment dans

les produits laitiers, les soupes et les poudings à base de céréales (Eckner et al. 1992). Par

ailleurs, Rayman et al. 1981 ont démontré que l’interaction synergique entre la nisine et les

nitrites contre les spores de Clostridium botilinum permettrait de réduire l’emploi de ces

substances cancérigènes. A ce jour, plus de 45 pays ont approuvé l’utilisation de la nisine

comme agent de conservation, ce qui fait de la nisine la bactériocine la plus utilisée à travers

le monde (Riley et Wertz, 2002). Tout comme la nisine, l’utilisation de la pédiocine dans la

conservation des viandes, des salades et du fromage a été brevetée en Europe (Chen et al.

1997a).

4.3. Domaines de la médecine humaine et vétérinaire:

L’utilisation des bactériocines n’est pas restreinte au domaine alimentaire, plusieurs

études ont démontré que l’utilisation répandue des antibiotiques pour traiter et prévenir les

infections, engendrait de sérieux problèmes de toxicité et de résistance. Par leurs

caractéristiques mentionnées précédemment, les bactériocines ont été énormément

appréciées comme étant des agents de thérapie naturelle, alternative aux antibiotiques,

puisque l’effet inhibiteur des bactériocines pourrait réduire les effets nocifs engendrés par

l’antibiothérapie. Quelques lantibiotiques sont utilisables dans les applications médicales

pour l’espèce humaine et animale. L’épidermine produite par Staphylococcus epidermidis est

active contre Propionibacterium acnes, qui cause l’acné (Allgaier et al. 1986).

60


Ce lantibiotique est utilisé dans la thérapie pour remplacer l’usage habituel de

l’érythromycine et de la vitamine A. Cette application montre plusieurs avantages tels que

l’absence de résistance aux lantibiotiques et leur faible coût de production par rapport aux

antibiotiques. La nisine, quant à elle, peut être utilisée dans le traitement des ulcères

gastriques vu sa stabilité aux pHs acides et son activité contre Helicobacter pylori (De Vuyst

et Vandamme, 1993). Trois autres bactériocines produites par Lactobacillus johnsonii LA1,

Lactobacillus casei YIT 9029 et Lactobacillus amylovorus DCE 471 montrent une activité

inhibitrice contre l’agent pathogène gastrique humain Helicobacter pylori qui cause des

ulcères gastriques (Avonts et De Vuyst, 2001).

Cinnamycine produite par différentes souches de Streptomyces spp est impliqué

dans l’immunité humaine (prolifération des leucocytes) et la régulation de la pression du

sang avec l’intervention de phospholipase A2 et l’enzyme de conservation de l’angiotensine.

De plus, ce groupe peut être impliqué aussi dans la protection contre le virus Herpes simplex

(Marki et Franson, 1986). Une « bacteriocin-like inhbitory substance » (BLIS) anti –

Streptococcus pyogenes produite par Streptococcus salivarius est appliquée dans la

préservation de la pharyngite streptococcique (Tagg, 2004).

4.4. Domaine agricole:

La protection des plantes contre les microorganismes phytopathogènes ainsi que la

préservation des semences, sont les objets de l’exploitation des bactériocines en agriculture.

Dans ce cas, les substances antibactériennes et substances antifongiques seront associées afin

de lutter contre les ravageurs phytopathogènes (Paik et al. 1997).

5. Mode d’utilisation des bactériocines:

Les bactériocines peuvent être utilisées dans les aliments selon trois procédés:

‐ inoculation de la souche productrice de bactériocine dans le produit : si la bactérie

lactique est naturellement présente dans le produit alors dans ce cas elle se développe

normalement et produit la substance inhibitrice au cours de sa phase exponentielle de

croissance. Si au contraire, il faut implanter la souche productrice, le succès de

l’opération dépend de la capacité de la souche à se développer et à produire la

bactériocine dans un environnement nouveau. Les conditions de culture (température,

pH, aw, exigences nutritionnelles dans l’aliment) peuvent ne pas convenir au

développement du microorganisme souhaité.

61


- utilisation d’une préparation semi-purifiée de bactériocine : le plus souvent, il s’agit du

milieu de culture fermenté débarrassé des cellules bactériennes ;

- utilisation de la bactériocine pure : dans ce cas, la bactériocine n’est pas accompagnée de

substances nuisibles au procédé de fabrication ou à l’obtention du produit souhaité

(ASEPT,1999).

6. Mode d’action des bactériocines:

Le mode d’action le plus connu et le plus répondu chez les bactériocines des

bactéries lactiques implique une action visant la fonction de la barrière de la membrane, mais

il existe des exceptions à ce mode général. Les bactériocines de classe II représentent le cas

typique de bactériocine agissant sur la membrane cytoplasmique des cellules sensibles par la

formation des petits pores membranaires (Chatterjee et al. 2005). Deux modes d'action des

bactériocines ont été étudiés:

a. Les molécules de bactériocine se fixe à la surface de la membrane et quand la

concentration locale est élevée, l’orientation de la molécule change et elles sont

insérées dans la membrane causant la déstabilisation de la structure de la bicouche et

la formation des pores. ceci résulte en un flux d’ions, d’acides aminés et d’ATP vers

l’extérieur de la cellule, avec comme conséquence la mort de la cellule par annulation

de toute les réactions énergie dépendantes a concentrations proches de la concentration

minimale inhibitrice. Les bactériocines tuent les bactéries beaucoup plus rapidement

que les antibiotiques conventionnels (Chatterjee et al. 2005).

b. Certaines lantibiotiques comme par exemple la nisine un mode d’action double : d’une

part elles s’attachant au lipide II, le principal transporteur des unités de peptidoglycane

du cytoplasme à la paroi cellulaire ce que empêche la synthèse correcte de la paroi

cellulaire, causant la mort de la cellule ; d’autre part elles utilisent le lipide II comme

point d’ancrage pour initie le processus d’insertion dans la membrane et la formation

des pores provoquant la mort rapide de la cellule. Les bactériocines à deux peptides,

comme par exemple la lactacine 3147, peuvent avoir cette activité double partagée

entre les deux peptides (Brotz et al. 1998 ; Breukink et al. 1999 ; Weidmann et al.

2001).

62

PARTIE EXPERIMENTALE

MATERIEL & METHODES

Matériel & Méthodes

I. Lieu de travail:

Le présent travail a été soutenu par le Laboratoire Biotoxicologie Expérimentale,

Biodépollution et Phytoremédiation et le Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et

Industrielle de l'Université Es-Senia, d'Oran. Les parties de ce travail ont été réalisées au

niveau de:

1. Laboratoire de bactériologie de l'hôpital Cochin, Paris:

a. Isolement et identification phénotypique et biochimique des souches

d'H.pylori à partir des biopsies gastriques prélevées par endoscopie digestive

haute au niveau d'une clinique dirigée par le gastroentérologue Mustapha

DJEBAILI à Chlef;

b. Caractérisation dans les biopsies gastriques des souches d'H.pylori et

détermination de leur sensibilité au clarithromycine par PCR en temps réel.

2. Centre national de référence des Campylobacters et des Helicobacters de Bordeaux:

- Caractérisation par PCR des îlots de pathogénicité CagA et VacA des souches de

H.pylori.

3. L'Université de Khemis Miliana:

a. Isolement et caractérisation des bactéries lactiques à partir des échantillons du

lait cru de vache, chèvre, brebis et chamelle;

b. Etude in vitro de l'effet antibactérien des bactéries lactiques vis-à-vis des

souches de H.pylori et caractérisation des bactériocines responsables de

l'inhibition;

c. Etude in vivo de l'effet antibactérien de la bactérie lactique qui a donné un net

effet inhibiteur in vitro.

4. Laboratoire de l'anatomie pathologique et de cytologie de l'hôpital Mohammed

Boudiaf de Médéa:

a. Préparation des coupes histologiques à partir des biopsies gastriques prélevées

par endoscopie digestive haute;

b. Coloration des coupes à Hématoxyline éosine;

c. Coloration des coupes par Giemsa Lent.

63


II. Etude microbiologique:

1. Isolement et caractérisation de Helicobacter pylori:

1.1 Prélèvement des biopsies gastriques:

Des patients (n=100) ayant subi une endoscopie digestive haute afin de prélever des

biopsies gastriques de l'antre, au niveau de la clinique dirigée par le gastroentérologue

DJEBAILLI Mustapha à Chlef dont l'âge et le sexe d'un échantillon de patients sont

présentés dans le Tableau III. Un fragment biopsique est mis dans le bouillon urée-indole

pour détecter la présence de l'uréase et un fragment dans le formol à 4% pour l'examen

anatomo-pathologique et cytologique. Pour l'isolement de H.pylori deux fragments sont mis

dans de l'eau physiologique.

Tableau III: Sexe et l'âge d'un échantillon de patients.

Patient 1 2 3 4 5 6

Sexe Homme Homme Femme Femme Femme Femme

Age (ans) 19 43 64 35 62 59

1.2. Test rapide à l'uréase:

Un fragment est mis dans un tube contenant de l’urée indole pour détecter l’activité

uréasique qui montre la présence de la bactérie dans la biopsie (Cassel-Beraud et al. 1996).

Le résultat positif est interprété par le changement de la couleur de l’urée- indole de l’orange

au rose ou rouge après incubation à 37oC pendant 24h.

1.3. Ensemencement et caractérisation de Helicobacter pylori:

Cette partie a pour but d’isoler et caractériser des souches de Helicobacter pylori,

responsable de la maladie ulcéreuse à partir des biopsies gastriques. Les étapes de

l'ensemencement des souches de H.pylori ont été mentionnées par la Société française de

microbiologie, (2010).

1.3.1. Broyage des biopsies :

Le broyage permet la dispersion des bactéries et leur libération des cellules à

mucus, dont 3 microtubes PCR de 1,5mL sont étiquetés : un est rempli par 0,25 mL du

broyat, un est vide (pour la PCR) et l'autre contient le reste du broyat. Ensuite 1mL de 65


bouillon viande foie glucosé (Bio-Rad) est mis dans le broyeur (Wheaton ou Kontes) et les

biopsies sont broyées. Il faut contenir une solution homogène, sans amas cellulaires. Ceci

afin d'accroître les chances de culture et d'éviter l'obstruction des embouts lors de l'étape de

l'extraction d'ADN.

1.3.2. Coloration de Gram des biopsies gastriques:

La coloration de Gram est un test essentiel et obligatoire réalisé au sein du

laboratoire de microbiologie. C’est une étape préliminaire utilisée pour différencier les

bactéries Gram positif des bactéries Gram négatif. Les biopsies sont étalées en frottis sur une

lame en verre (s'assurer que du mucus a bien été déposé sur la lame) et colorées par la

méthode de Gram dans un automate Slaide Stainer-Cytocentrifuge(Wescor). La technologie

par pulvérisation de Wescor permet un gain de temps, une standardisation et garantit la

fiabilité des résultats. Cette méthode permet de mettre en évidence H.pylori à la surface de

l'épithélium de la muqueuse des biopsies gastriques.

1.3.3. Ensemencement des biopsies gastriques pour la recherche d'Helicobacter pylori:

1.3.3.1. Culture :

Deux types de gélose ont été utilisées : gélose pylori(Biomérieux, France) et gélose

maison (Annexe) pour la culture de Helicobacter pylori, dont 4 gouttes de broyat sont

déposées à la surface des deux géloses. Ensuite, les géloses sont mises dans le sachet Genbag

anaer (Biomérieux, France) (deux boites de Pétri par sachet) en présence d'un sachet

générateur d'atmosphère microaérophile (Genbag microaer, Biomérieux). D'après Zine-

Charaf, (2007) H.pylori est microaérophile; elle a besoin d'oxygène en pourcentage

nettement moins élevé que dans l'air pour vivre et se développer (soit 3 à 5% d'oxygène). En

notant sur le sachet Genbag la date d'ouverture du sachet (7 jours après la date

d'ensemencement). Enfin, le sachet est mis à incuber dans l'étuve à 37oC (Telewig CCH01-

009-00-R05-291-333).

1.3.3.2. Identification de H.pylori :

D'après Cassel-Béraud et al. (1996), l’identification d’H. pylori a été basée sur ses

caractères morphologiques, son examen microscopique et sur ses caractères biochimiques

essentiels : uréase très intense, présence d’une oxydase et d’une catalase.

66


1.3.3.2.1. Examen macroscopique:

Après culture sur milieu gélosé additionné au sang, des petites colonies rondes,

bombées et luisantes apparaissent exprimant la croissance de Helicobacter pylori sur ce

milieu.

1.3.3.2.2. Examen microscopique :

Un frottis est préparé à partir des colonies suspectes, en fixant sur une plaque

chauffante une goutte de la suspension bactérienne déposé sur une lame en verre; ensuite on

colore par la méthode de Gram dans l'automate Slaide Stainer-Cytocentrifuge(Wescor).

L'observation à l'immersion au microscope optique montre des bactéries plus grosses et plus

droites que sur le frottis de l’examen direct.

1.3.3.2.3. Identification des caractères biochimiques :

Oxydase: À l'aide d'une pipette Pasteur, prélever des colonies et les déposer sur un disque

oxydase imprégné d'eau. Un virage coloré rapide au violet indique une réaction positive.

Catalase: Pour détecter la présence de cet enzyme, on dépose une goutte d'eau oxygénée à

30 volumes sur une lame. A l'aide d'une pipette Pasteur, quelques colonies sont prélevées et

déposées dans la goutte d'eau oxygénée. L'apparition des bulles indique une réaction

positive.

Uréase: À l'aide d'une pipette Pasteur, quelques colonies sont prélevées et déposées dans une

goutte de milieu urée-indole. Un virage coloré rapide au rose fuchsia indique une réaction

positive.

1.4. PCR temps réel ou PCR Quantitative:

1.4.1. Principe:

La PCR quantitative en temps réel repose sur la possibilité de suivre au cours du

temps le processus de PCR à l’aide de la fluorescence. Les données de fluorescence sont

collectées à chaque cycle de la PCR et représentent la quantité de produits amplifiés à cet

instant (Elyse, 2002). Dans notre travail, on utilise la PCR en temps réel pour détecter à la

fois H. pylori dans les biopsies gastriques et sa sensibilité à la clarithromycine. Cet

antibiotique fait en effet partie du traitement de première de l'infection à H. pylori et le

succès du traitement est en partie dépendant de la sensibilité de la bactérie. Selon Ménard et

al. (2002) la résistance de la clarithromycine, la principale cause de l'échec du traitement

Helicobacter pylori, est attribuée à des mutations ponctuelles dans la région

peptidyltransférase de codage dans le domaine V de l'ARNr 23S.

67


1.4.2. Extraction de l'AND sur automate NucliSens easyMAG®:

Pour l'extraction de l'ADN de H.pylori à partir des broyats des biopsies gastriques,

on utilise un automate NucliSens easyMAG® (00982, Biomérieux, France). L’appareil

NucliSens easyMAG® procède à l’extraction des acides nucléiques en provenance

d’échantillons biologiques. La méthode d’extraction des acides nucléiques, basée sur la

technologie de Boom utilise des particules de silice magnétique. La silice, composé chimique

de dioxyde de silicium, est capable de fixer les acides nucléiques. Cette propriété est

importante pour le bon fonctionnement de cette plateforme automatisée. Selon les

instructions du fabricant, l'automate va distribuer le tampon de lyse (ref. 280134, NucliSens

easyMAG®) dans les cupules (navettes). Après, sous une hôte laminaire, les navettes

(cupules) sont remplies avec 0,25 mL de broyat déjà mis dans un microtube (homogénéiser à

l'aide de pipette stérile). L'extraction de l'ADN est lancer pendant 40 min, dont après 10 min

au minimum de la lyse, 50 µL de silice Magnétique (MagSIL)(ref.280133, Biomérieux) a été

distribué et homogénéisé à l'aide d'une pipette multicanaux (Biohit). L'extraction se fait en

trois étapes (Figure 18):

A. Après la lyse des échantillons, tous les acides nucléiques sont capturés par les particules

de silice magnétique.

B. Le système d’aimantation de NucliSens easyMAG® permet le lavage dynamique puis la

fixation de la silice magnétique, pour purifier les acides nucléiques. Ensuite 110 µl de

solution d’élution sont ajoutée. L'étape de chauffage à 60oC libère les acides nucléiques fixés

sur la silice.

C. Lors de l'étape finale, la silice magnétique est séparée de l'éluat par le système

d’aimantation.

Fig.18: Etapes de l'extraction d'ADN dans NucliSens easyMAG® (technologie de Boom)

(Guide d'utilisateur, Roche).

68


1.4.3. Préparation de Master Mix:

Pour la préparation de Master Mix, on pipette 10 µL du tube contenant LightCycler

Fast-Start Enzyme dans le tube de LightCycler FastStart Reaction Mix SYBR Green I. Le

LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I obtenu (Roche Diagnostics-Applied

Science) contient Fast Start Taq DNA polymérase, tampon de réaction, colorant de Syber

Green et mélange de DNTP.

1.4.4. Préparation de Mix:

Dans une boite Light Cycler Centrifuge Adapters 1909312(Roche, Germany) on

place des tubes spéciales pour la préparation de Mix. On utilise pour sa préparation des

amorces sens HPYS (41-6018-3/4 ;Eurofins mwg/Operon), 5'-AGG-TTA-AGA-GGA-TGC-

GTC-AGT-C-3', nucléotides 1931-1952) et anti-sens HPYAS (41-6018-4/4; Eurofins

mwg/Operon), 5'-CGC-ATG-ATA-TTC-CCA-TTA-GCA-GT-3', nucléotides 2197- 2175).

Le produit amplifié a été détecté avec deux sondes: la sonde de détection HP-LCR (41-

6018-1/4 ;Eurofins mwg/operon), marqué en 5' avec LC-Red 640 et phosphorylée en 3' ( 5'-

GGC-AAG-ACG-GAA-AGA-CC-3', nucléotides 2504 à 2520), et la sonde d'ancrage HP-

FLU (24-66592/2; Eurofins mwg/Operon ) marqué à la fluorescéine en 3' (24-66592/2, 5'-

TGT-AGT-GGA-GGT-GAA-AAT-TCC-TCC-TAC-CC-3'; nucléotides 2473-2501).

Pour chaque échantillon à étudier, le mix doit contenir 8,4 µL de H2O, 1µL de

HPY-S(10µM), 1µL de HP-LCR(10µM), 1µL de HP-FLU(10µM), 1µL de HPY-AS(10µM),

2 µL de master mix et 1,6 de MgCl2 (25 mM). Dans ce type de PCR on utilise deux témoins

positifs: Quinet pour détecter les souches Wildtype et Alves pour les souches ayant une

mutation A2143G, et du H2O pour le contrôle négatif. Après on ajoute 4µL d'ADN extrait à

16 µL de Mix préparé, et la PCR se lance.

1.4.5. Amplification de l'ADN:

Avant de procéder à l'amplification de l'ADN, les microtubes préalablement

préparés sont centrifugés afin d'éliminer toutes bulles d'air. Les microtubes sont mis dans le

thermocycleur Light Cycler 2,0(Roche, Germany). Les appareils de la version Light-Cycler

2.0 contient Jusqu'à 32 tubes capillaires, en verre, d'une contenance de 20 µl, sont

69


portés sur un "carrousel" (Figure 19), tournant dans une chambre obscure de forme

circulaire. Les paliers de température sont effectués par le biais d'un courant d'air chaud.

L'appareil est capable d'élever ou de baisser sa température de chambre de 20°C par

seconde. Il y a une lampe d'excitation diffusant une lumière de 530 nm, 640 nm et 710 nm de

longueur d'onde et un intégrateur capable de récupérer le signal correspondant à la lumière

d'émission de la fluorescence générée à 5 longueurs d'onde différentes. Ensuite le logiciel

permet de faire de la quantification de façon absolue ou de façon relative (Guide

d'utilisateur, Roche). Dans notre travail la fluorescence a été mesurée dans le domaine

530/640nm.

Les étapes de base de la détection de l'ADN au cours de PCR en temps réel sur le

système LightCycler sont les suivantes: une préincubation à 95oC/10min consiste à une

1. Le LightCycler ® consiste en une chambre cylindrique où l'air, ce qui n'a pratiquement pas de masse, est chauffée par un serpentin de chauffage. Le PCR se produit dans des capillaires en verre qui peut contenir un volume allant jusqu'à 20 pi. Cette grande surface par rapport au volume permet des cycles très rapides. 2. L'unité de détection se compose d'une source lumineuse LED bleue et trois voies de détection qui mesurent la lumière émise à trois longueurs d'onde différentes (530 nm, 640 nm et 710 nm).

Fig.19: Le thermocycleur LightCycler ® 2.0 (Roche Diagnostics GmbH, Germany)

70


activation de l'ADN polymérase FastStart et dénaturation de l'ADN double brins (50cycles

avec un taux de température de transition 20 ° C / s). Elle s’effectue à une température de

95°C pendant 0 S, dite température de dénaturation. À cette température, l’ADN matriciel est

dénaturé dont les liaisons hydrogène ne peuvent pas se maintenir à cette température et les

ADN doubles brins se dénaturent en ADN simple brin (ADN monocaténaires).

La deuxième période s’effectue à une température de 60°C pendant 10s dite

température d’hybridation des amorces. Pour l'hybridation, les deux sondes utilisées dans ce

travail vont augmenter la spécificité. Une des sondes (HP-FLU) porte à son extrémité 3’ une

fluorescéine qui émet une lumière verte lorsqu’elle est excitée par l’appareil. Son spectre

d’émission recouvre le spectre d’excitation d’un fluorophore accepteur situé à l’extrémité 5’

de la seconde sonde (HP-LCR), marqué en 5' avec LC-Red 640 et phosphorylée en 3'. Celle-

ci est bloquée en 3’ pour éviter toute extension à partir de son extrémité. L’excitation du fluo

donneur (la fluorescéine) est transmise par FRET (Fluorescence Resonnance Energy

Transfert) au fluo accepteur qui émet une lumière rouge. Les deux sondes vont s’hybridées «

tête-bêche » sur leur séquence cible au cours de l’étape d'hybridation. Les sondes

d’hybridation présentent des spécificités élevées. Puisqu’elles ne sont pas hydrolysées durant

la PCR, la fluorescence est réversible et va permettre de générer des courbes de fusion. La

diminution de la température permet aux liaisons hydrogène de se reformer et donc aux brins

complémentaires de s’hybrider (Figure 20).

La troisième période s’effectue à une température de 72°C pendant 17s, dite

température d’élongation. À cette température, la FastStart polymérase Taq ADN se lie aux

ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en utilisant les dNTP présents dans

le mélange réactionnel. Après amplification une étape de fusion a été réalisée: dénaturation à

95 ° C pendant 0 s, refroidissement à 45 ° C pendant 30 s (avec une vitesse de transition de

température de 20 ° C / s), et une augmentation lente de la température à 85 ° C à une vitesse

de 0,1 ° C / s, avec acquisition continue de déclin de fluorescence.

Les courbes d'amplification d'ADN contiennent trois phases:

- Phase d'initiation (bruit de fond) : dans cette phase la quantité de fragment amplifié est

insuffisante pour générer un signal fluorescent supérieur au bruit de fond.

- Phase exponentielle : La quantité de fragment amplifié génère un signal fluorescent

supérieur au seuil de détection de l’appareil, puis le nombre de produits amplifiés double à

71


chaque cycle. Plus il y a de matrice à amplifier au départ de la réaction PCR, moins élevé

sera le nombre de cycle requis pour atteindre un point où le signal d’émission de

fluorescence sera statistiquement et significativement plus élevé que le bruit de fond. Ce

point est défini comme étant le cycle seuil (Threshold cycle, Ct ou Cp) et apparaîtra toujours

au cours de la phase exponentielle d’amplification. La valeur du Ct peut être traduite en un

résultat quantitatif

- Phase de plateau (ou de saturation) : certains composants de la réaction deviennent

limitants. Le système ne permet plus une amplification exponentielle (figure 21).

Fig. 20: génération de la fluorescence par le mécanisme FRET (Fluorescence Resonnance Energy Transfert) (Cartron, 2013)

Fig. 21: Le suivi en temps réel d’une réaction PCR. La cinétique de la réaction PCR met en jeu en trois

phases : une phase d’initiation, une phase exponentielle et une phase plateau (Tse et Capeau, 2003)

72


2. Isolement et caractérisation des bactéries lactiques :

2.1. Origine et prélèvement des échantillons de laits:

Des échantillons de laits crus ont été prélevés en mois de Février de l'an 2010, des

différentes espèces caprines (Arabia), bovines (vaches laitières de race Pie-noire et Brebis) et

camelines (Camelus dromedaries), de trois régions de l'Algérie: Ain Defla (Ain Defla

Commune et Miliana), Biskra et Tamanrasset.

Le prélèvement du lait a été fait le matin au moment de la traite manuelle. Pour

chaque échantillon, 100 à 150 mL de lait étaient recueillis de la mamelle de l'animal après

avoir bien lavé le pis et éliminé les 2 ou 3 premiers jets de lait. Les échantillons de lait sont

conservés à + 4 °C dans des flacons stériles en verre et transportés à l’obscurité jusqu’au

laboratoire durant les cinq heures qui précèdent les analyses.

2.2. Analyses du lait cru:

2.2.1. Tests préliminaires:

2.2.1.1. pH:

Le pH du lait cru donne une première idée sur le stade d’évolution du lait et sur la

nature des germes que nous pouvons éventuellement y rencontrer. Le pH est mesuré à 20°C à

l’aide d’un pH-mètre (HANNA), en plongeant une électrode dans un bêcher contenant 100

mL du lait. La valeur de pH est lue directement sur l'appareil (Sboui et al. 2009).

2.2.1.2. Réduction du bleu de méthylène:

Le test de la réductase au bleu de méthylène représente une méthode indirecte

simple pour surveiller la charge microbienne du lait cru (Guiraud, 2003). Il s’agit de mettre

dans des tubes à essai stériles l’échantillon du lait cru, ajouter de bleu de méthylène à (1%),

mélanger, et incuber à 37° C. La durée de sa décoloration permet de quantifier

approximativement la population microbienne du lait et par conséquent d’estimer sa qualité

microbiologique (Berrens et Luquet, 1987):

- Si la durée de la décoloration est supérieure à 5h, l'échantillon est de

bonne qualité microbiologique (100000 à 200000 germe/mL);

73


- La qualité microbiologique du lait est de bonne à passable (200000 à 2

millions germes/mL), si la durée de la décoloration du bleu de méthylène

s'estime entre 2 et 4h;

- Si le lait décolore le bleu de méthylène dans moins de deux heures, il

contient une charge microbienne allant de 2 à 10 millions de germes/mL.

Sa qualité est inssufisante.

2.2.2. Analyses microbiologiques (Beerens et Luquet, 1987):

2.2.2.1. Diluant:

La nature de diluant est importante. Il faut choisir un liquide assurant une parfaite

dispersion des bactéries et qui ne soit pas inhibiteur pour elles. Dans ce travail, nous avons

utilisé la solution de tryptone–sel (TSE), dont sa préparation consiste de dissoudre 1g de

Tryptone (Difco) et 8,5 g de chlorure de calcium dans 1000 mL d'eau distillée. Après

dissolution, le pH est ajusté à 7,0. On répartit en flacons ou en tubes et on autoclave à 121 oC.

2.2.2.2. Préparation de l’inoculum:

Le lait cru a été dans une première étape homogénéisé et dilué pour obtenir la prise

d’essai destinée a être inoculée dans les différents milieux de culture. En raison de la grande

variabilité des bactéries et de leur nombre, un dénombrement nécessite des dilutions de la

prise d'essai. La dilution du lait nécessite de préparer une suspension mère à partir de

laquelle les dilutions seront ensuite préparées. La suspension mère du lait est une suspension

obtenue après qu’un volume de 1mL du lait ait été mélangé avec une quantité neuf fois égale

de diluant. La suspension ainsi préparée est appelée suspension mère et constitue une

première dilution. Les dilutions décimales sont des suspensions obtenues en mélangeant un

volume de 1mL de la suspension mère ainsi préparée et homogénéisée avec un volume neuf

fois égal de diluant, et en répétant cette opération sur chaque dilution ainsi préparée, jusqu’à

obtention d’une gamme de dilutions décimales appropriée pour l'inoculation des milieux de

culture.

2.2.2.3. Dénombrement des microorganismes:

Les analyses microbiologiques ont été commencées immédiatement après la

préparation des dilutions. Deux groupes de microorganismes ont été recherchés:

74


- Les germes potentiellement pathogènes pour le consommateur : les anaérobies sulfito-

réducteurs et Staphylococcus aureus.

- Les germes tests d’hygiène générale :

• Des germes capables d’altérer la qualité marchande de l’aliment : Il s’agit habituellement

du dénombrement des micro-organismes aérobies mésophiles totaux.

• Les témoins de contamination fécale : l’analyse de la flore fécale permet de refléter que le

lait n'est pas traité dans des conditions normales d’hygiène. Toutefois les coliformes fécaux

thermotolérants et les streptocoques fécaux sont recherchés.

Dénombrement des germes mésophiles aérobies totaux (GMAT):

Afin d’apprécier la pollution microbienne du produit et de prévoir son altération

probable, il est important de compter les germes mésophiles totaux présents. Ce

dénombrement se fait en général à 30◦C. Cette méthode consiste à (Figure 22):

- Transférer en double 1mL des dilutions décimales dans des boites de Pétri stériles;

- Dans chaque boite de Pétri, 15 mL de la gélose PCA (Gélose pour dénombrement) (Plate

Count Agar) (Institut Pasteur d'Algérie) a été coulée;

- L’inoculum a été soigneusement mélangé au milieu de culture qui a été laissé pour se

solidifier en posant les boites de Pétri sur une surface horizontale;

- Après solidification complète, 4mL d’une gélose blanche a été coulé à la surface du milieu

ensemencé;

- Après solidification de la nouvelle couche, les boites ainsi préparées sont retournées et

incubées à l’étuve réglée à 30◦C pendant 72 heures;

- Retenir pour le comptage, les boites de Pétri contenant un nombre de colonies compris

entre 10 et 300. Calculer le nombre de microorganismes par mL de lait à l'aide de la formule

suivante:

Nombre/mL =

Dénombrement des coliformes fécaux:

Le dénombrement des coliformes fécaux permet la mise en évidence d'une

population fécale et donc la possibilité d'une contamination par les entérobactéries

Nombre total de colonies comptées

Volume ensemencé de l'échantillon

75


pathogènes. Pour cela, on prélève deux fois 1mL de chaque dilution décimale et on les

transfère dans deux boites de Pétri stériles. Dans chaque boite 15mL de la Gélose

désoxycholaté à 1‰ (Institut Pasteur d'Algérie) refroidie à 45◦C ont été coulés. L’inoculum a

été soigneusement mélangé au milieu de culture qui a été laissé pour se solidifier en posant

les boites de Pétri sur une surface horizontale. Après solidification complète, 5mL d’une

gélose blanche a été coulé à la surface du milieu ensemencé. Les boites seront incubées à 44°C,

pendant 24 à 48 h. Après la période d’incubation, les colonies caractéristiques (colonies

violacées d’un diamètre supérieur ou égal à 0,5mm et parfois entourées d'une zone rougeâtre

due à la précipitation de la bile) ont été comptées (Figure 23).

Recherche des streptocoques fécaux:

Les streptocoques du groupe D sont constamment rencontrés dans les matières

fécales et ont naturellement été choisie comme témoin de contamination fécale dans certains

aliments crus. Leur recherche utilise un milieu de présomption de Roth (Institut Pasteur

d'Algérie) et un autre de confirmation de l'Eva Litsky (Institut Pasteur d'Algérie) en cas

d'obtention d'un résultat positif dans le premier test (Figure 24).

A. Test de présomption:

- Préparer une série de tubes contenant le milieu sélectif de Rothe à raison de trois tubes par

dilution.

- A partir des dilutions décimales 10-1 à 10-3, porter aseptiquement 1 mL dans chacun des

trois tubes correspondant à une dilution donnée. Bien mélanger le milieu et l’inoculum.

- Incuber à 37°C pendant 24 à 48 heures.

- Les tubes présentant un trouble microbien sont considérés comme positifs.

B. Test de confirmation:

- Chaque tube de Rothe trouvé positif lors du test de présomption fera l’objet

d’un repiquage à l’aide d’une öse bouclée dans un tube de milieu Eva Lytski.

- Bien mélanger le milieu et l’inoculum.

- Incuber à 37°C pendant 24 h.

- L’apparition d’un trouble homogène et d’une pastille violette au fond des tubes signe la

présence de streptocoques fécaux.

76


Dénombrement de Clostridium sulfito- réducteurs :

Le but de cette recherche est de dénombrer les Clostridium sulfito-réducteurs

capables de produire des toxines et de sporuler et survivre au cours des processus de

conservation des aliments (Figure 25):

- Au moment de l'emploi faire fondre un flacon de la gélose Viande Foie, la refroidir

dans un bain d'eau à 45◦C puis ajouter une ampoule d'Alun de Fer et une ampoule de

sulfite de sodium.

- Les tubes contenant les dilutions décimales seront soumis d'abord à un chauffage à

80◦C pendant 8 à 10minutes, puis un refroidissement immédiat sous l'eau de robinet

pour but d'éliminer les formes végétatives et garder uniquement les formes sporulées;

- A partir de ces dilutions, porter aseptiquement 1mL de chaque dilution en double

dans deux tubes à essai, puis ajouter environ 15mL de la gélose Viande Foie (Institut

Pasteur d'Algérie) prête à l'emploi, dans chaque tube;

- Après solidification, ces tubes seront incubés à 37◦C pendant 48h;

- La première lecture doit se faire à 16h, car d'une part les colonies de Clostridium

sulfito-réducteurs sont envahissantes et on se trouverait en face d'un tube

complètement noir auquel cas l'interprétation devient impossible et l'analyse est

refaite;

- Il faut absolument repérer toutes colonies noires ayant poussé en masse et d'un

diamètre supérieur à 0,5mm;

Dans le cas ou il n'y a pas de colonies caractéristiques, réincuber les tubes et

effectuer une deuxième lecture au bout de 24h à 48h.

Dénombrement de Staphylococcus aureus:

Ce type de recherche permet de savoir si le produit présent un risque pour la santé

du consommateur, car les Staphylococcus aureus sont producteurs d'une entérotoxine de

nature protéique. Un enrichissement et une revivification ont été réalisés par introduction de

1mL des dilutions décimales dans 9 mL de l’eau peptonnée et incubation à 37oC pendant 1

heure. Un mL de l’échantillon ainsi préparé a été transféré dans deux boites de Pétri stériles.

Dans chaque boite de Pétri 15 mL de la gélose Chapman (Institut Pasteur d'Algérie) refroidie

à 45oC a été coulée. L’inoculum a été soigneusement mélangé au milieu de culture qui a été

laissé pour se solidifier en posant les boites de Pétri 77


sur une surface horizontale. Après solidification, les boites ainsi préparées sont

retournées et incubées à l’étuve réglée à 37oC pendant 24 à 48 heures. Après la période

d’incubation, les colonies caractéristiques (colonies noires, convexes, brillantes d’un

diamètre compris entre 0,5mm et 2mm, avec un lisère blanc opaque, entoure d’une auréole

claire) ont été comptées (Figure 26).

Fig. 22: Dénombrement des germes mésophiles aérobies totaux sur gélose PCA.

Incubation à 30 oC/72 h

PCA PCA PCA

1 mL 1 mL

1 mL 1 mL 1 mL

1 mL

Lait cru

9 ml TSE 10-1 10-2 10-3

78


Fig. 23: Recherche des streptocoques fécaux dans le lait cru (test de présemption et de

confirmation).

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL 1 mL 1 mL

Lait cru

9 ml TSE

Rothe

Incubation à 37 oC/ 24 à 48h

Resultat négatif Resultat positif

Eva Litsky

Incubation à 37 oC/ 24 h

10-210-1 10-3

79


Fig. 24: Dénombrement des coliformes fécaux du lait cru sur gélose désoxycholate.

1 mL

1 mL 1 mL 1 mL

1 mL 1 mL

G.désoxy.à 1‰ G.désoxy.à 1‰

G.désoxy.à 1‰ G.désoxy.à 1‰

G.désoxy.à 1‰

G.désoxy.à 1‰

Incubation à 37oC/24 à 48h

Incubation à 44oC/24 à 48h

Lait cru

9 mL TSE

9 mL TSE 10-310-210-1

80


Fig. 25: Dénombrement de Staphylococcus aureus du lait cru sur gélose chapman.

Lait cru

9 mL TSE

1 mL

1 mL 1 mL

10-210-1 10-39 mL TSE

9 mL Eau

peptonnée

1 mL 1 mL 1 mL

Incubation à 37 oC/ 1 h

Chapman Chapman Chapman

1 mL 1 mL 1 mL

Incubation à 37 oC/ 24 à 48 h

81


Fig.26 : Dénombrement de Clostridium- sulfito réducteurs du lait cru sur gélose viande-foie.

Lait cru

9 mL TSE

1 mL

1 mL 1 mL

10-2 10-39 mL TSE

Chauffage à 80◦C pendant 8 à 10minutes

Refroidissement

1 mL 1 mL 1 mL

Vf Vf Vf

Incubation à 37◦C/ 48h

10-1

82


2.3. Isolement des bactéries lactiques:

Les genres étudiés sont mis en évidence sur le milieu M17 commercial (Institut

Pasteur d'Algérie), milieu complexe et riche, a été utilisé pour la plupart des précultures et

cultures (Terzaghi and Sandine, 1975). Afin d'éviter tout problème de précipitation du

sucre au cours de la stérilisation, le milieu M17 est reconstitué, stérilisé, puis une solution

stérile de lactose (200 g.L-1) rajoutée avant la culture. Dans cette étude, le milieu M17 est

employé pour la recherche surtout des souches de Lactococcus et Enterococcus.

A partir de chaque type de lait, des dilutions décimales jusqu'à 10-6 sont réalisées :

- Repartir stérilement 9mL de diluant dans une série de tubes ;

- Agiter la solution mère pour assurer une répartition homogène des microorganismes;

- Prélever 1mL de la suspension de bactéries lactiques et transférer dans le tube n° 1 ; on

obtient ainsi la dilution 10-1 ;

- Après agitation, prélever 1mL de la dilution 10-1 et transférer dans le tube n° 2 pour obtenir

la dilution 10-2 et ainsi de suite jusqu'à l’obtention de différentes dilutions (10-3, 10- 4,10-5,

10-6).

A partir de la dernière dilution, des boites de Pétri contenant de la gélose M17 sont

ensemencées en surface par les dilutions 10-4, 10-5 et 10-6. L'incubation des boites de Pétri se

fait à 30 °C et à 45°C pendant 24h à 48h. Le nombre de colonies par souches est évalué en

UFC (unité formant colonie) par millilitre d’échantillon de lait analysé. Une colonie bien

distincte a été prélevée aseptiquement et mise dans le bouillon M17 et incubée à 37°C

pendant 24h. Plusieurs repiquages ont été faits pour obtenir une souche pure. Les souches

pures ont été conservées dans le bouillon M17 et mises au congélateur à –20°C en attendant

leur identification (Figure 27). 83


Fig.27: Isolement et caractérisation des bactéries lactiques sur gélose M17.

10-410-3 10-5 10-610-210-1

1 mL

M17 M17 M17

Lait cru

9 mL TSE

9 mL TSE

1 mL 1 mL 1 mL

M17 M17 M17

Incubation à 30 ◦C/ 72h

Incubation à 45 ◦C/ 72h

5 mL M17

M17 Identification:

- Catalase - Oxydase - Type fermentaire - Pouvoir acidifiant - Croissance en milieux

hostiles: NaCl, température et pH

- Api 20 Strep

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

84


2.4. Identification phénotypique:

Afin de déterminer les caractères culturaux des bactéries lactiques isolées (couleur,

disposition, forme et aspect), les colonies obtenues sont observées à la loupe binoculaire.

L'examen de la forme unitaire des cellules ainsi que leur mode d'enchaînement est effectué

au microscope optique (ZEISS) après fixation d'un frottis et la coloration de Gram, qui ce fait

en 3 étapes (OIV, 2013):

- Dans un premier temps, les cellules sont colorées avec du violet de gentiane pendant deux

minutes. Ce colorant présente des affinités avec les composants du cytoplasme ; par

conséquent les cellules se colorent en bleu-violet quelle que soit le type de paroi. Après

rinçage à l’eau déminéralisée, une solution d’iode-ioduree (lugol) est étalée sur les cellules

pour fixer la couleur. Après 30 secondes, les cellules sont à nouveau rincées à l’eau

déminéralisée.

- Dans un deuxième temps, une décoloration est réalisée par rinçage avec de l’éthanol à 95%

(15 s). Les bactéries à Gram négatif sont décolorées car leur paroi laisse passer l’alcool et

permet le rinçage du violet de gentiane. Au contraire, la paroi riche en peptidoglycanes des

bactéries à Gram positif ne laissent pas passer l’alcool et par conséquent, ces cellules ne sont

pas décolorées : le cytoplasme des bactéries à Gram positif reste violet.

- Pour terminer, une recoloration à la fuschine est réalisée (10 s). Cette étape permet de

recolorer les cellules en rouge. La teinte bleu-violet des cellules à Gram positif n’est pas

affectée par la couleur rouge de la fuschine car le spectre du violet de gentiane absorbe dans

le même domaine de longueur d’onde que la fuschine. Les bactéries à Gram négatif seront,

quant à elles, colorées en rouge et pourront être observées au microscope optique.

2.5. Identification biochimique et physiologique:

2.5.1. Test de la catalase:

La catalase est une enzyme produite en abondance par les bactéries ayant un

métabolisme respiratoire qui détruit le peroxyde d’hydrogène et libère de l’oxygène (Vézina

et Lacroix, 2000).

Cette activité a été réalisée selon le protocole expérimental décrit par Prescott et al.

(2003). La technique consiste à prélever une partie de colonie et à l’émulsionner dans une

goutte d’eau oxygénée (30V). Le dégagement de bulles de gaz signifie qu’il y’a production

de la catalase.

85


2.5.2. Test de l’oxydase:

Le test de l’oxydase est basé sur la production bactérienne d’une enzyme oxydase

intracellulaire en présence d’oxygène atmosphérique et de cytochrome C (Vézina et

Lacroix, 2000).

Pour déterminer l'activité oxydase une colonie prélevée est mise dans une goutte de

réactif oxydase (Biomérieux, France). Le développement d'une couleur violette signifie que

le test est positif et que l'isolat possède l'enzyme oxydase (Kovacs et al. 1995).

2.5.3. Type fermentaire:

Ce test permet de classer les bactéries lactiques en homo ou hétéro-fermentaire. Les

souches sont cultivées dans des tubes contenant de bouillon nutritif avec addition de glucose

liquide, plus une cloche de Durham. Après, recouvrir les tubes avec l’huile de vaseline puis

incuber à 37°C pendant 48 heures. La présence ou l’absence du gaz dans la cloche indique le

type fermentaire (Coppola et al. 1997).

2.5.4. Croissance en milieux hostiles:

a. En présence de NaCl: Le bouillon M17 est additionné de 2 %, 4% et 6.5 % de NaCl puis

reparti en tubes et ensemencé par les bactéries lactiques (Badis et al. 2005). La présence de

trouble indique une croissance bactérienne.

b. pH 4 ,5 et 6,5: Le pH du milieu M17 est ajusté à 4,5 et 6 ,5 à l’aide d’une solution de

HCl puis le milieu est ensemencé par les différentes souches et incubé à 37°C pendant 2 à

3 jours (Badis et al. 2005). La présence de trouble indique une croissance bactérienne.

c. Thermorésistance : Les tubes contenant le bouillon M17 sont ensemencés par les

bactéries lactiques et incubés à 65oC pendant 30 minutes puis refroidis et incubés à 37oC

pendant 24h (Guiraud, 2003). La présence de trouble indique une croissance bactérienne.

2.5.5. Identification au niveau de l'espèce ou sous espèce par les galeries Api20 Strep:

Les bactéries lactiques isolées sont identifiées au niveau de l'espèce ou de sous

espèce en établissant leurs profiles fermentaires à l'aide du microsystème d'identification Api

20 Strep (Biomérieux, France). Api 20 Strep est un système standardisé associant 20 tests

biochimiques qui présentent un grand pouvoir discriminant. Il permet de faire un diagnostic

de groupe ou d'espèce pour la plupart des streptocoques et entérocoques (Figure 28).

86


La galerie Api 20 comporte 20 microtubes contenant des substrats sous forme

déshydratée. Les tests sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les

milieux. Les réactions produites pendant la période d’incubation se traduisent par des virages

colorés spontanés ou révélés par l’addition de réactifs. La lecture de ces réactions se fait à

l’aide du tableau de lecture, en comparant aussi les profiles obtenus avec les données de la

littérature (Biomérieux, France).

2.5.5.1. Préparation de la galerie:

La préparation de la galerie consiste à répartir de l’eau dans les alvéoles de boite

d’incubation pour créer une atmosphère humide. Ensuite, on dépose stérilement la galerie

dans la boite d’incubation.

2.5.5.2. Préparation de l’inoculum :

Une suspension bactérienne très dense : opacité supérieure à 4 de McFarland, est

préparée dans une ampoule de Suspension Medium ou dans un tube d’eau distillée stérile.

2.5.5.3. Inoculation de galerie :

Dans la première moitié de la galerie (tests VP à ADH) répartit la suspension

bactérienne en évitant la formation de bulles:

-Pour les tests VP à LAP environ 100µl dans chaque cupule.

-Pour le test ADH remplir uniquement le tube.

Dans la deuxième moitié de la galerie (tests RIB à GLYG), on met 0,5mL dans une

ampoule Api20 Strep Medium. Ensuite, cette suspension est repartit dans les tubes

uniquement. Une huile de paraffine est mise dans les cupules d’ADH à GLYG. Après, la

boite d’incubation est fermée et incubée à 37°C pendant 24heures. La lecture de la galerie

doit se faire en se référant au tableau de lecture (Tableau IV).

2.5.5.4. Lecture:

Après 4 heures d'incubation, on ajoute les réactifs :

-test VP: 1goutte de VP1 et VP2;

-test HIP: 2 gouttes de NIN;

- tests PYRA, αGAL,βGUR, βGAL, PAL, LAP: 1goutte de ZYM A et ZYMB.

On attend 10 minutes avant de lire toutes les réactions en se référant au Tableau de

Lecture. 87


Tableau IV: Tableau d’identification par galerie api 20 Strep(BioMérieux, France).

88


Fig. 28: Préparation d'une galerie Api20 strep(Guide d'utilisateur, Biomérieux).

89


2.5.6. Test d'hémolyse:

Ce test constitue le 21ème test de la galerie Api20 strep. Il permet de terminer si la

bactérie a un pouvoir hémolytique dans un milieu gélose additionné au sang par la présence

d'une enzyme hémolytique. Dans cette partie, une gélose nutritive fondue est additionnée au

sang de cheval après refroidissement. Des boites de Pétri ont été coulées par la gélose et

solidifiées sur paillasse. Une goutte de bouillon contenant la culture de la bactérie lactique a

été ensemencée par strie sur la surface de la gélose au sang.

Après incubation à 37oC pendant 24h, l'hémolyse des érythrocytes du sang de

cheval s'exprime par la présence d'un halo d'hémolyse autour des colonies.

2.5.7. Pouvoir acidifiant :

La mesure de l’activité acidifiante consiste à suivre d’une part l’évolution du pH des

différentes cultures en fonction du temps et d’autre part à doser simultanément l’acidité

totale par la soude. On commence par la préparation de lait écrémé à 10% dans des flacons

de capacité 250mL. Après stérilisation et refroidissement à la température d’ensemencement,

chaque flacon est ensemencé par une culture lactique (V/ 100V). Après incubation à 37°C, à

un intervalle du temps 2h, 6h et 24h; 10mL du lait est prélevé puis titrer par la soude Dornic

(N/9) en présence de 5 gouttes de phénolphtaléine, jusqu’au virage de la couleur au rose pâle

persistant au moins 10 secondes (Larpent, 1997).

L’acidité est déterminée par la formule :

Acidité (°D) = V NaOH x 10

Où :

V NaOH: Volume de NaOH utilisé pour titrer l’acide lactique contenu dans les 10mL de lait.

La mesure de pH est faite directement par le pH-mètre, en plongeant l’électrode

dans le volume du lait. Le pH a été déterminé à chaque fois qu’on procède au dosage de

l’acide lactique.

90


III. Examen anatomo-pathologique et cytologique des biopsies gastriques :

1. Fixation des biopsies gastriques:

Pour détecter H.pylori une biopsie gastrique prélevée des patients par endoscopie

digestive haute est mise dans le formol à 4% pour l'examen anatomo-pathologique et

cytologique.

Le but de la fixation est de conserver et immobiliser les structures des constituants

tissulaires/cellulaires. En effet, le prélèvement des tissus provoque leur mort: les cellules

déversent leurs enzymes, ce qui provoque une autodigestion du tissu. La fixation prévient

l’autolyse cellulaire (Lullmann-Rauch, 2008).

De plus, à l'air ambiant, les prélèvements peuvent être contaminés par des bactéries,

ce qui entraîne une putréfaction des tissus post-mortem. Le principe de la fixation repose sur

le fait que le formol réagit avec les groupements aminés des protéines. Elle permet à la

technique histologique et les colorations ultérieures (Lullmann-Rauch, 2008).

L’anatomie pathologique officiellement dénommée anatomie et cytologie

pathologiques (ACP) ou Pathologie, est une spécialité médicale indispensable dans la chaîne

des soins. Elle est axée sur le diagnostic des lésions à partir de leur aspect morphologique.

C'est un examen diagnostique, basé sur l’observation morphologique, notamment au

microscope (AFAQAP, 2009).

Elle s’appuie sur des bases fondamentales d’anatomie normale, d’histologie et de

cytologie pour identifier des anomalies morphologiques macroscopiques et microscopiques

et sur des techniques d’histochimie, d’immunologie, de cytogénétique et de biologie

moléculaire pour identifier des anomalies moléculaires dans les cellules ou les tissus

(AFAQAP, 2009).

91


2. Etapes d'un examen ACP:

2.1. Macroscopie:

Sous hotte d'influx laminaire (Gelaire, Biohazard), les biopsies sont décrites,

mesurées, étudiés en totalité (incluant total) et mises dans des cassettes. La technique

consiste à préparer les biopsies, à les traiter et à les rendre observables au microscope par

création de préparations colorées sur des lames de verre (Figure 29) (AFAQAP, 2009).

2.2. Déshydratation :

Cette étape consiste à préparer les tissus à l'inclusion en paraffine. Elle est réalisée

dans un automate type Leica (Tp/1020). L’intérêt de la déshydratation est d’éliminer le

fixateur. On passe les tissus dans des bains de formol pendant 1h et d'alcool de degré

croissant (50°/1h, 60°/1h, 70°/1h, 80°/1h, 96°/1h30, 96°/1h30). L'alcool est ensuite remplacé

par un solvant miscible à la paraffine : il s'agit de xylène (deux bains de xylène pendant

1h30). Enfin, trois bains de paraffine sont réalisés pendant 1h30.

Ces substances éliminent l’éthanol. Au fur et à mesure de leur infiltration par le

solvant, les tissus ont tendance à s'éclaircir : cette étape est donc parfois appelée

éclaircissement ou clarification (Lullmann-Rauch, 2008).

2.3. Inclusion :

Une fois totalement imprégné, le tissu est placé dans de la paraffine fondue (portée

à 56/58°C); la chaleur provoque l'évaporation du solvant et sa dissolution dans la paraffine:

les espaces ainsi libérés sont remplis par la paraffine. Puis la paraffine est placée dans de

petits moules, à température ambiante, ce qui provoque son durcissement et donc la

rigidification des biopsies. On procède alors au démoulage : on obtient des biopsies inclus

dans un bloc de paraffine (Lullmann-Rauch, 2008).

92


Fig. 29: Etapes d'un examen ACP (Anatomie Cytologique et Pathologique) (AFAQAP,

2009)

Fixation des biopsies gastriques dans 4% du formol

Macroscopie

Déshydratation (Leica Tp/1020).

Inclusion (paraffine fondue)

Microtomie (Leica RM 2125 RTS)

Coloration des lames (HE, Giemsa L)

Montage des lames

Observation sous microscope optique

93


2.4. Microtomie:

On isole ensuite des coupes dans le bloc de paraffine. On utilise pour cela un

microtome type Leica (RM 2125 RTS), qui fait avancer le bloc sur un rasoir : le bloc avance

d'environ 2 à 3 µm à chaque fois (les coupes mesurent environ 5 µm). L'ensemble des

tranches va former un ruban dans lequel on retrouve des coupes sériées des biopsies. Les

rubans sont déposés sur des lames contenant de l'eau distillée. Ces lames vont été séchées sur

une plaque chauffante pendant 1h, et étuvées après à 80oC pendant 10mn afin d'éliminer la

paraffine (Lullmann-Rauch, 2008).

2.5. Coloration des lames :

2.5.1. Coloration à HE:

C'est une coloration alliant une laque nucléaire (Hématoxyline basique) et un

colorant cytoplasmique (Erythrosine acide). Pour que l'on puisse utiliser une coloration, la

paraffine doit être éliminée. On procède donc au déparaffinage dans un automate Sakura

(Japan), qui consiste à passer les lames dans trois bains de xylène (2min) afin de dissoudre la

paraffine. Ensuite, on procède à la coloration qui consiste à faire passer les lames dans des

bains d'alcool, de colorants, d'HCl et d'eau (Figure 30).

2.5.2. Coloration Giemsa Long:

C'est une coloration de Giemsa peu différenciée afin de mieux visualiser

Helicobacter pylori(coloration en bleu foncé). Les lames sont déparaffinées et rincées à l'eau

distillée. Ensuite, elles sont colorées par le Giemsa lent dilué à 20 % dans l'eau distillée à pH

7 pendant 1 h à température du laboratoire. Après rinçage à l'eau distillée (pH7), on procède

à un passage dans 3 bains successifs d'alcool à concentration croissante pendant 1 à 2

minutes/bain et dans un bain de xylène (Zine-Charaf, 2007).

2.6. Montage des lames:

Les lames sont montées pour préserver les colorations. Les lames sont déshydratées

grâce à des bains en xylène. Ensuite, des lamelles de verre sont colées par-dessus (grâce à

des résines synthétiques) afin de préserver les préparations. Les lames ainsi montées peuvent

être conservées pendant plusieurs dizaines voire plusieurs centaines d'années (Lullmann-

Rauch, 2008). 94


Xylène Xylène Xylène

Alcool 96o

Alcool 96o

Alcool 96o

2mn 2mn 2mn

3mn 3mn 3mn

Eau distillée 3mn

Hématoxyline de Harris

Eosine orange G

Eau courante

HCl

Alcool 96o

Carbonate de lithium

Eau distillée

6mn

3mn

30s

3mn

3mn

3mn

12mn

Eau courante 3mn

Alcool 96o Alcool 96o

Xylène Xylène Xylène

2mn 2mn 2mn

3mn 3mn

Fig. 30: Etapes de la coloration à Hématoxyline éosine 95


IV. Etude de l'activité antibactérienne:

1. Interaction des bactéries lactiques avec les souches d’H.pylori in vitro:

1.1. Préparation des précultures des souches d'Helicobacter pylori:

Les souches pathogènes utilisées dans ce travail sont des souches d'H.pylori

proviennent du centre national de référence des Campylobacters et des Helicobacters de

Bordeaux, transportées dans le milieu BIO-RAD (souches de référence : 26695 ; J99 ;

TN2GF4 et HPAG1, souche clinique : HSA3068) (Tableau V) et les souches d'H.pylori

isolées sur gélose pylori et maison au niveau de laboratoire de bactériologie de l'hôpital

Cochin. Une portion de ces milieux a été dispersée dans quelques millilitres de bouillon

Brucella (Annexe). Ensuite, on ensemence la gélose Brucella additionnée à 10% du sang de

cheval par une goutte de ce bouillon. On incube à 37oC pendant 03 jours et sous atmosphère

microaérophile. Après 03 jours d'incubation, les colonies translucides de couleur grisâtre

seront identifiées en vérifiant:le Gram; l'activité oxydase; l'activité catalase et l'uréase. Pour

étudier l'effet antibactérien des bactéries lactiques, les souches H.pylori repiquées sont

ensemencées dans 5mL de bouillon Brucella et incubées à 37oC pendant 24h et sous

atmosphère microaérophile.

1.2. Préparation des précultures des souches de bactéries lactiques:

Pour déterminer le pouvoir antibactérien, les souches de bactéries lactiques isolées

et purifiées sont ensemencées dans 05 mL de bouillon M17 et incubées à 37oC pendant 24h.

1.3. Antagonisme:

Les bactéries lactiques sont douées des propriétés antibactériennes qui dépendent de

plusieurs critères: le pH, le milieu de croissance et la production de substances

antibactériennes comme les bactériocines, les acides organique et le peroxyde d'hydrogène

(Huttunen et al. 1995). Notre travail s'intéresse sur l'étude du pouvoir antibactérien des

précultures des bactéries lactiques testées suivant la méthode de disques (Tadess et al.

2004). Les boites de Pétri contenant milieu Muller Hinton (Institut Pasteur d'Algérie), sont

inoculées par un mL de précultures d’H.pylori (107 CFU/ mL). Après un séchage de 30

minutes à 37°C, des disques de 6mm de diamètre imprégnés par 50µl de bouillon des

bactéries lactiques, sont déposés à la surface de la gélose, avec trois

96


répétitions pour chaque souche de bactérie lactique. Les boites de Pétri ainsi préparées sont

préincubées dans des conditions réfrigérées pendant 2 à 4 heures à 4°C afin de permettre la

diffusion de l’agent inhibiteur qui sera suivie par l’incubation pendant 24 heures à 37°C

(Figure 31). La lecture se fait par la mesure du diamètre en mm des zones d’inhibition

formées autour des disques (Zi). Une inhibition est considérée positive, si le diamètre est

supérieur à 2mm (Thompson et al. 1996). La mesure du diamètre de Zi est effectuée selon la

formule suivante: Zi en (mm)= diamètre de la zone d’inhibition obtenue (mm)- diamètre de

disque (6mm).

Tableau V: souches de Helicobacter pylori

Souches 26695 J99 TN2GF4 HPAG1 HSA3068

Etest - Metronidasol - Amoxicyline - Clarithromycine

S S S

S R R

S R R

S S S

S S S

Disc ATB - Rifampicine - Tetracycline - Levofloxacyne

S S S

S S S

S S R

S S S

S S S

Alleles ATCC700824 ATCC700392 / / /

pathologies Ulcère Gastrite Ulcère Gastrite Chronique Atrophique

/

Infection souris Non Oui ? ? ?

CagPAI + + + + /

CagA3’ + + + + /

TPM P1+ P1+ P1- P1+ /

CagE + + + + /

CagI + + + + /

VirD4/VirB11 + + + + /

Vac slmLil slmLil slmLil slmLil /

BabA BabA2 BabA1 BabA2 BabA2 /

Ice A2 A1 A1A2 A1 /

SabA off off / / /

PMID / / / 2,00E+07 /

S: sensible, R: résistant, /: non réalisée , ?: incertaine , +: présence 97


Fig.31: interaction des bactéries lactiques avec les souches de Helicobacter pylori in vitro.

Incubation à 37 oC/24h

5mL Brucella

5 mL M17

1 mL

Hp BL

Disques stériles

imbibés par 50

µl de BL

MH

Séchage à 37 oC/30 min

Incubation à 2-4 oC/4h

Incubation à 37 oC/24h

Lecture

98


2. Détermination de l’activité bactériocinogénique 2.1. Préparation de l’extrait bactériocinique :

Un volume de 100 mL de préculture de bactérie lactique qui a donné la meilleure

zone d’inhibition est centrifugé pendant 20 minutes à 10 000 tours / min et à +4°C. Le

surnageant, représentant la fraction extracellulaire est filtré sur une membrane de l’acétate de

cellulose (0,45µm) puis conservé à+4°C, le culot est lavé deux fois avec de l’eau distillée,

séché puis additionné de méthanol selon un rapport de volume de 2/3. Le Méthanol est utilisé

pour l’extraction éventuelle de la bactériocine. Le mélange est centrifugé pendant 20 minutes

à 10 000 tours / min et à +4°C. Le surnageant obtenue est l'extrait cellulaire. L'effet

inhibiteur du surnageant (fraction extracellulaire) et culot (extrait cellulaire) vis-à-vis les

souches d’H .pylori a été déterminé par la méthode de diffusion sur gélose et avec trois

répétitions (Labioui et al. 2005).

2.2. Elimination de l’effet des acides organiques et de peroxyde d’hydrogène :

Les bactéries lactiques peuvent produire des substances inhibitrices différentes des

bactériocines. Pour éliminer l’effet des acides organiques, notamment des acides lactique et

acétique, le surnageant a été neutralisé à pH 6,5 par une solution de NaOH (0,1 N). Afin

d’éliminer le peroxyde d’hydrogène accumulé dans le milieu de culture, le surnageant a aussi

été traité par une catalase (5mg/1mL, Institut pasteur d’Algérie) à 30°C pendant 2h avant de

procéder au test d’inhibition (Elmoualdi et al. 2008). L’inhibition a été réalisée sur le

surnageant (fraction extracellulaire) et sur le culot (extrait cellulaire) avec les souches d’H

.pylori suivant la méthode de diffusion sur gélose et avec trois répétitions.

2.3. Effet de l'extrait bactériocinogénique sur H.pylori en milieu liquide:

Cette partie s'intéresse à étudier l'effet de l'extrait bactériocinogénique de la bactérie

lactique qui a montré un net effet inhibiteur de H.pylori sur milieu gélosé. Le surnageant a

été neutralisé à pH 6,5 par une solution de NaOH (0,1 N) et traité par une catalase

(5mg/1mL, Institut pasteur d’Algérie) à 30°C pendant 2h afin d'éliminer les acides

organiques et H2O2 présentent dans le milieu. Pour réaliser le test d'inhibition en milieu

liquide, on a suivi le protocole établi par Lin et al. (2011) et Guetarni et al. (2012), dont

250 µL du surnageant de la bactérie lactique a été ensemencé avec 250µL de 99


préculture de H.pylori (107 CFU /mL) et incubé à 37oC pendant 126h. Après chaque 18h, une

culture de Helicobacter pylori a été faite sur gélose Brucella additionné à 10% du sang de

cheval et incubé à 37 oC sous atmosphère microaérophile. Le dénombrement des colonies de

Helicobacter pylori a été fait sur gélose au sang.

2.4. Influence du pH sur l'activité des bactériocines:

La stabilité de la substance antagoniste aux pH acide et basique a été étudiée en

ajustant le pH du surnageant aux valeurs désirées (pH4 et pH8) par l’ajout de tampons

préparés à ces valeurs et à double concentration. Ensuite l’activité inhibitrice du surnageant

vis-à-vis les souches d’H.pylori est testée par la méthode de diffusion sur gélose

(Achemchem et al. 2004).

2.5. Influence de la température sur la stabilité des bactériocines:

Pour la détermination de la thermostabilité des substances inhibitrices, en traitant le

surnageant de la bactérie lactique à 60oC pendant 30 minutes, à 80oC pendant 10 minutes et à

100oC pendant 05 minutes. Après refroidissement, l’activité de la bactériocine est testée par

la méthode de diffusion sur gélose (Achemchem et al. 2004).

2.6. Influence des enzymes sur la stabilité des bactériocines:

La nature de la bactériocine est déterminée sous l’action des enzymes suivantes :

Pepsine (Merck 2000UI/g), Trypsine (Merck from bovine pancreas 40 UI/mg) et α amylase

(Merck 20 à 160 UI/g) (Achemchem et al. 2004). L'alpha-amylase brise les liens α (1-4)

glycosidiques à l'intérieur des chaînes de l'amylose et de l'amylopectine pour ultimement

donner des molécules de maltose. La pepsine est une endoprotéase qui hydrolyse les liaisons

peptidiques dans lesquelles un acide aminé aromatique (Tyr, Trp, Phe) engage sa fonction

amine. La trypsine est une endoprotéase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans

lesquelles un acide aminé basique (Lys ou Arg) engage sa fonction acide (Garrett et

Grisham, 2000). Le surnageant, doté d’activité inhibitrice, de la bactérie productrice est

additionné de la pepsine, de la trypsine et de l’ α amylase à une concentration final de 1

mg/mL. Le mélange est incubé à 37oC pendant 2h. L’activité de la bactériocine est testée par

la méthode de diffusion sur gélose (Achemchem et al. 2004).

100


3. Etude de l'activité antibactérienne in vivo:

La bactérie lactique qui a donné une meilleure zone d'inhibition in vitro fait l'objet

d'une étude in vivo pour déterminer son effet probiotique sur Helicobacter pylori.

3.1. Préparation des souris:

Des souris Balb/c, holoxéniques, femelles âgées de deux mois provenant de l'institut

Pasteur d'Algérie sont logées dans des cages en bois bien aérées mesurant 9177 cm3. Les

souris sont nourries avec des grains de blé deux fois par jour et ont eu de l’eau à volonté.

L’hygiène des souris consiste à changer la litière (sciure de bois) deux fois par semaine ainsi

les abreuvoirs doit être nettoyer quotidiennement.

Ces souris sont reparties en 3 lots:

Lot 1 : c'est un lot témoin contenant 12 souris holoxéniques qui n'ont subit aucun

traitement;

Lot 2 : un lot de 12 souris infectées par la souche H.pylori qui a montré la grande

sensibilité vers les bactéries lactiques étudiées.

Lot 3 : un lot de 12 souris infectées par H.pylori et traité par la bactérie lactique qui a

engendré l'inhibition de ce pathogène.

3.2. Analyse microbiologique des selles de souris:

Les souris holoxéniques hébergent dans leur tractus digestif un microbiote inconnu

par l’expérimentateur, alors des analyses des selles sont faites pour déterminer le moins des

germes occupés par l’intestin (surtout les bactéries pathogènes) et contrôler la présence

surtout de la bactérie lactique à étudier (Doumandji et Neche, 2008).

3.2.1. Prélèvement des selles:

L’analyse des selles est effectuée pour la moitié du groupe témoin. Les selles sont

prélevées avant administration de bactérie lactique ou de H pylori. Les selles fraîches sont

recueillies dans des pots stériles en plastique.

101


3.2.2. Analyses bactériologique: Les germes recherchés sont :

E. coli : des boites de Pétri contenant la gélose désoxycholate sont ensemencées en surface

par l’écouvillon, puis incuber à 44°C pendant 24h.

Salmonella : à partir des échantillons des selles, porter aseptiquement 1mL dans un tube

contenant 9 mL de bouillon d’enrichissement (Sélénite cystéine), puis incuber à 37°C

pendant 24h. Seront présumés positifs, les tubes ayant un trouble microbien. Les tubes

positifs feront l’objet d’une confirmation par isolement sur gélose Héktoen. Les boites seront

incubées à 37°C pendant 24h.

Shigella : à partir des échantillons des selles on ensemence en surface les boites de Pétri

contenant de la gélose Héktoen, puis incuber à 37°C pendant 24h.

Staphylococcus :

- Enrichissement sur milieu de Giolitti Cantonii

On ajoute 15 mL d’une solution de tellurite de potassium dans un flacon contenant le milieu

de Giolitti Cantonii. Le milieu est alors prêt à l’emploi.

A partir des selles porter aseptiquement 1 mL dans un tube à vis stérile. Ajouter par la suite

environ 5 mL du milieu d’enrichissement, puis incuber à 37°C pendant 24h.

Seront présumés positifs, les tubes ayant virés au noir.

-Isolement sur gélose Chapman

Des boites de Pétri contenant milieu Chapman seront ensemencées à partir des tubes positifs,

puis incubées à 37°C pendant 24h à 48h.

Streptococcus : couler les boites de Pétri avec la gélose Columbia au sang, puis ensemencer

en surface et incuber à 37°C pendant 24h.

Enterococcus : à partir des échantillons des selles, ensemencer les boites de Pétri contenant

la gélose M17. Ensuite incuber à 37°C pendant 48h.

Lactobacilles : à partir des échantillons des selles ensemencer en surface par l’écouvillon, les

boites de Pétri contenant la gélose MRS. Ensuite incuber à 37°C pendant 48h.

Lactococcus : à partir des échantillons des selles ensemencer en surface par l’écouvillon, les

boites de Pétri contenant la gélose M17. Ensuite incuber à 37°C pendant 48h.

Clostridium : à partir des échantillons des selles, porter aseptiquement 1mL dans un tube à

vis stérile. Ce tube serait soumis à un chauffage à 80°C pendant 10 minutes, puis à un 102


refroidissement immédiat sous l’eau de robinet, dans le but d’éliminer les formes végétatives

et de garder uniquement les formes sporulées. Après on ajoute 15 mL de gélose viande foie

additionnée à l’alun de fer et sulfite de sodium. Pour créer l’atmosphère anaérobie on prend

un coton stérile et on met dans l’alcool puis on allume le coton dans l’ouverture de tube.

Laisser solidifier sur paillasse pendant 30 minutes. Puis incuber à 37°C pendant 24h.

Levures et moisissures : à partir des échantillons des selles ensemencer en surface les boites

de Pétri contenant la gélose Sabouraud. Ensuite incuber à 22°C pendant 5 jours.

3.2.3. Identification:

L'identification des bactéries isolées a été faite par des galeries biochimiques

contenant les milieux (Institut Pasteur d'Algérie) et les tests suivants: Catalase, Oxydase,

Citrate-Simmons, Mannitol-mobilité, TSI (Triple Sugar Iron), LDC (Lysine décarboxylase),

ODC (Ornithine décarboxylase), ADH (Arginine déshydrogénase), ONPG (Ortho-Nitro-

Phenyl-Galactopyranozide) et Urée-indole.

3.3. Recherche de Helicobacter pylori dans l'estomac de souris:

L’euthanasie d'une souris est réalisée par inhalation du formol. L’estomac est

prélevé dans des conditions d’asepsies maximales sous hotte à flux laminaire puis ouvert

dans le sens longitudinal. Un fragment biopsique a été prélevé du pylore et broyé dans 1 mL

de bouillon Brucella. Deux dilutions successives au 1/10ème et au 1/100ème sont effectuées

puis 100 µl de chaque suspension est étalée sur gélose Brucella additionnée de 10% du sang

de cheval et incubé à 37oC pendant 3 à 5 jours et sous une atmosphère microaérophile

(Figure 32).

3.4. Infection des souris par H. pylori :

Les souris des lots 2 et 3 ont été inoculées par voie orale d’une suspension d’H

pylori préparée à partir d’une culture fraîche, incubée à 37 oC pendant 24h et sous une

atmosphère microaérophile. La dose infectante de H.pylori a été déterminée par une lecture

réalisée à l'aide de spectromètre UV/visible (λ= 590nm), dont la quantité à inoculer est fixée

à 0,5 mL (109 CFU/mL≈0.6DO). Selon Sgouras et al. (2004), H.pylori est administrée trois

fois pendant une semaine, avec un intervalle de 2 jours entre les inoculations à l’aide d’une

sonde de gavage reliée à une seringue 103


3.5. Traitement des souris infectées par H.pylori :

Après trois semaines post infection, un groupe de souris infecté par H.pylori (6

souris) est traité pendant sept jours avec 1mL de lait ensemencé avec 107 CFU/mL≈0.1 DO

de la bactérie lactique qui a donné un net effet inhibiteur in vitro (Coconnier et al. 1998).

3.6. Détection bactérienne :

Dans les 3ème et 4ème semaines, six souris des lots 2 et 3 et une souris du lot témoin

ont été tuées et aseptiquement disséqués. L’estomac de chaque souris a été enlevé et la

présence de H pylori a été détectée après un dénombrement effectué sur une culture d’une

biopsie gastrique, par la coloration de Gram, test à l’urée, test de catalase et de l’oxydase.

Ainsi que les selles des souris traitées ont été recueillies et analysées pour déterminer la

présence de la bactérie lactique administrée par voie orale (Sgouras et al. 2004).

Test à l’urée : un fragment de biopsie gastrique est mis dans un tube contenant de l’urée

indole et incuber à 37°C pendant 18h à 24h, le résultat positif est interprété par le

changement de couleur de l’orange au rose.

Coloration de Gram: un fragment de biopsie gastrique est écrasé à l’aide de deux lames en

fixant à la flamme ; ensuite coloré par la méthode de Gram.

Isolement sur gélose :

- A partir de la partie terminale de l’estomac (pylore) prélever un fragment gastrique et

écraser dans 2 mL de bouillon BGT pour permettre la dispersion des bactéries.

-Prendre 1mL de broyat et mettre dans 9 mL d’eau physiologique. Réaliser des

dilutions décimales successives jusqu’à 10-2;

-A partir de la dernière dilution ensemencer 1mL dans une boite de Pétri contenant

gélose Columbia additionnée à 10% de sang de cheval.

-Incuber à 37°C pendant 3 à 5 jours sous une atmosphère microaérophile.

L’espèce Helicobacter pylori est déterminée par la coloration de Gram, test à

l’urée, de l’oxydase et de la catalase.

104


Dissection des souris

Coupure de l’estomac

Culture sur gélose Columbia au sang Test à l’uréase

Coloration de Gram d'une biopsie gastrique

Fig. 32 : Etapes de détection d’H.pylori après dissection des souris. 105

RESULTATS

Résultats

I. Eude microbiologique: 1. Isolement et caractérisation de Helicobacter pylori:

1.1. Test rapide à l'uréase:

Le test à l’uréase est basé sur la production abondante d’uréase par H .pylori .

des biopsies gastriques prélevées par endoscopie digestive haute sont mises dans un

milieu contenant l’urée. Les résultats montrent un virage au rose du mileu contenant les

biopsies gastriques(Figure 33).

Fig. 33: Test rapide à l'uréase

1.2. Ensemencement des biopsies gastriques pour la recherche d'Helicobacter pylori:

Des broyats des biopsies prélevées d'un échantillon de patients sont ensemencés

sur deux milieux : gélose pylo et gélose maison. Après 7 jours d’incubation à 37oC sous

une atmosphère microaérophile, de fines colonies, transparentes à grisâtres et luisantes,

apparaissent dans les boites contenant la gélose maison ; ces caractères culturaux

correspondent à Helicobacter pylori. Les colonies sont étalées sur la gélose maison et

remise à incuber afin d'obtenir une nappe bactérienne sur la gélose (Figure 34).

106

Résultats

Cette gélose est constituée à base de milieu Müller Hinton et deux antibiotiques:

Amphotéricine et Vancomycine. La croissance de H.pylori indique que la gélose de

Müller Hinton constitue un milieu de base pour la fabrication de gélose au sang. La

croissance de H.pylori montre que ce milieu contient les éléments nécessaires pour sa

prolifération. Ainsi l'ajout du sang de cheval au milieu Müller Hinton est appropriée pour

cultiver cette bactérie.

L'examen microscopique d'un frottis préparé à partir des colonies suspectes en

fixant la goutte de la suspension bactérienne à la flamme; ensuite le frottis est coloré par la

méthode de Gram a permis d'observer des cellules fines de couleur rose prouvant leur

appartenance aux Gram négatif. Ces cellules prennent beaucoup plus la forme de bacille.

Ce sont les caractères morphologiques des cellules H.pylori sous microscope optique

(Figure 35). Deux souches de H.pylori isolées sur gélose Maison, ont montré la présence

d'une uréase très active, une oxydase et une catalase.

Fig. 34: Aspect des colonies de Helicobacter pylori sur gélose maison après incubation à 37oC

pendant 7jours et sous atmosphère microaérophile.

107

Résultats

Fig.35: Aspect de cellules de Helicobacter pylori après culture sur gélose maison sous

microscope optique après coloration de Gram (10X100)

1.3. Observation microscopique des frottis réalisés à partir des biopsies gastriques:

Des frottis réalisés à partir des biopsies gastriques sont colorés par la méthode de

Gram dans un appareil de Slaide Stainer-Cytocentrifuge (Wescor). L'observation

microscopique à l'immersion montre la présence des bactéries incurvées à Gram négatif

dans les biopsies gastriques. Ces bactéries sont Helicobacter pylori (Figure 36).

Fig. 36: Observation microscopique d'un frottis préparé à partir d'une biopsie gastrique et

coloré par la méthode de Gram (10X100).

Helicobacter pylori

108

Résultats

1.4. Quantification de Helicobacter pylori dans des biopsies gastriques par la PCR en

temps réel:

Afin de rechercher H.pylori dans les biopsies gastriques et de déterminer sa

sensibilité au clarithromycine, une PCR en temps réel a été réalisée. Cette PCR repose sur

la possibilité de suivre au cours du temps le processus de PCR à l’aide de la fluorescence.

Les données de fluorescence à chaque cycle de la PCR sont collectées et exprimées par

des courbes à l'aide du logiciel Light Cycler Software Version 4.0.5.415 (Roche).

Les étapes de base de la détection de l'ADN au cours de PCR en temps réel sur le

système LightCycler consiste à une dénaturation de l'ADN double brins (50cycles avec

une température de transition 20 ° C / s). Elle s’effectue à une température de 95°C

pendant 0 S, dite température de dénaturation. La deuxième période s’effectue à une

température de 60°C pendant 10 s dite température d’hybridation des amorces.

La troisième période s’effectue pendant 17s à 72°C, dite température

d’élongation. À cette température, la FastStart polymérase Taq ADN se lie aux ADN

monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en utilisant les dNTP présents dans le

mélange réactionnel. Après amplification de l'ADN une étape de fusion a été réalisée, elle

consiste à : une dénaturation à 95 ° C pendant 0 s, un refroidissement à 45 ° C pendant 30

s (avec une température de transition de 20 ° C / s), et enfin une montée lente de la

température à 85 ° C à une vitesse de 0,1 ° C / s, avec acquisition continue de déclin de

fluorescence.

La figure 37 montre des courbes d'amplification d'ADN, ces courbes expriment

la fluorescence émise en fonction du nombre de cycles, dont on obtient trois courbes

d'amplification (courbe en bleu pour le témoin positif utilisé pour déterminer la présence

des souches d'H.pylori sensibles au clarithromycine "Wildtype"), courbe en rouge indique

la présence d'H.pylori dans la biopsie 1 et courbe en rose indique aussi la présence de

H.pylori dans la biopsie 3). Nous avons remarqué la présence de trois phases pour chaque

courbe d'amplification:

- une phase où la quantité du fragment amplifié est insuffisante pour générer un signal

fluorescent, c'est la phase de bruit de fond.

109

Résultats

- une phase dont un signal fluorescent a été détecté. Ce signale exprime une phase

exponentiel. Au début de la réaction PCR il y a plus de matrice à amplifier pour cela nous

avons enregistré un nombre faible de cycles pour atteindre un point où le signal

d’émission de fluorescence sera plus élevé que le bruit de fond. Ce point est le cycle seuil

(Threshold cycle, Ct ou Cp). La détection qualitative à 640 nm montre que le témoin

positif donne un nombre de cycle (CP) égale à 35,67, les biopsies 1 et 3 leur CP varie de

39,29 et 38, 95, respectivement (Tableau VI).

- une troisième phase a été constatée dans les courbes d'amplification d'ADN est exprimée

par une diminution du nombre de certains composants de la réaction, c'est la phase

plateau.

Fig. 37: Courbes d'amplification qui exprime la quantité d'amplicons produits (Fluorescence

(640/530) émise en fonction du nombre de cycles: témoin positif (détecte la présence des souches

Wildtype) (courbe bleu), témoin négatif (H2O) (courbe vert clair), biopsie 1(courbe rouge),

biopsie 2 (courbe noir), biopsie 3(courbe rose), et biopsie 4 (courbe vert foncé)).

1: phase initiale 2: phase exponentielle 3: phase plateau

110

Résultats

Tableau VI: Résultats de la détection qualitative

Position Nom Type Résultats

CP Score

1 Témoin

positif

Contrôle

Positif

35,67 5,00

2 Témoin

négatif

Contrôle

Négatif

-2,91

3 Biopsie 1 inconnu 39,29 5,00

4 Biopsie 2 inconnu -5,00

5 Biopsie 3 inconnu 38,95 5,00

6 Biopsie 4 inconnu -3,99

Pour prouver que le seul produit désiré a été amplifié par PCR, on effectue une

analyse des courbes de fusion (Figure 38 et 39). Chaque pic de fusion représente une

température caractéristique (Tm) d'un produit d'ADN. Les facteurs les plus importants qui

déterminent le Tm d'ADN double brin sont la longueur de GC contenu dans ce fragment.

Selon le tableau VII, le témoin positif utilisé dans cette étude donne un Tm égale à 55,96.

Par comparaison avec les Tm des courbes d'amplification d'ADN des souches

d'H.pylori, la biopsie 1 donne un Tm égale à 64,48 et la biopsie 3 un Tm égale à 63,91.

On conclus que les souches de H.pylori sont sensibles au clarithromycine. Les résultats

obtenus montrent la présence de H.pylori dans deux biopsies gastriques prélevés des

patients. Ce ci exprime la possibilité de traiter H.pylori par la clarithromycine qui

représente un intérêt clinique dans le traitement de H.pylori .

111

Résultats

Tableau VII: Tm, Aire, L et l de chaque pic.

Position Nom de l'échantillon Pic

Tm Aire Largeur Longueur

1 Témoin positif 55,96 0,32 1,40 0,07

2 Témoin négatif

3 Biopsie 1 64,48 0,03 1,39 0,00

4 Biopsie 2

5 Biopsie 3 63,91 0,13 1,49 0,04

6 Biopsie 4

Fig. 38: Analyse des courbes de fusion: Fluorescence (640/530) émise en fonction de la température:

témoin positif (courbe bleu), témoin négatif (courbe vert clair), biopsie 1(courbe rouge), biopsie 2

(courbe noir), biopsie 3(courbe rose), et biopsie 4 (courbe vert foncé).

112

Résultats

2. Isolement et caractérisation des bactéries lactiques:

2.1. Analyses du lait cru:

Des échantillons du lait cru de vache, chèvre et brebis prélevés de Miliana et de

Ain Defla; et d'autres échantillons du lait de chamelle prélevés de Biskra et Tamanrasset

(au nombre de trois échantillons pour chaque type de lait et pour chaque région), ayant

subi des analyses afin de prendre une idée sur la qualité du lait cru prélevé avant d'entamer

l'isolement des bactéries lactiques.

2.1.1. Tests préliminaires:

Les mesures de pH du lait cru qui ont été faites dés l'arrivée des échantillons au

laboratoire permettent de savoir le stade d’évolution du lait au cours de la traite, du

Fig. 39: Les courbes de fusion : dérivées primaires donnant les Tm afin de déterminer les souches

wildtype et mutantes. La courbe de fusion des souches d'H.pylori Wildtype de la biopsie 1 (courbe

rouge) (Tm = 64,48) et la biopsie 3 (courbe rose) (Tm= 63,913).

113

Résultats

transport, du stockage,…etc. Le test de la réductase réalisé sur les échantillons du lait cru

après ajout du bleu de méthylène à 1% et incubation à 37 oC indique la charge

microbienne du lait. Les résultats de ces deux tests sont présentés dans le tableau VIII. Les

valeurs moyennes du pH des échantillons du lait varient entre 6,42 et 6, 62, dont nous

avons enregistré un pH moyen acide de 6,42 avec les échantillons du lait de chamelle

prélevés de Tamanrasset (E19, E20 et E21). D'autre part, les échantillons E10, E11 et E12

prélevés du lait cru de vache de Ain Defla ont donné un pH moyen de 6,68 par apport au

autres types de lait (Tableau VIII).

Le test de la réductase indique que 9 échantillons sur 24 décolorent le bleu de

méthylène en moins de deux heures, qui sont présentés par :

Trois échantillons du lait de chèvre : E1, E4 et E5;

Deux échantillons du lait de vache: E10 et E11;

Deux échantillons du lait de Brebis: E13 et E16;

Deux échantillons du lait de chamelle: E19 et E24.

2.1.2. Analyses microbiologiques:

Le lait cru peut contenir une grande variabilité des germes, un dénombrement de

ces derniers nécessite la préparation des dilutions décimales des échantillons du lait cru

prélevés. Ces dilutions servent à l'inoculation des milieux de culture appropriés.

Les analyses microbiologiques effectuées ont pour but de rechercher:

- les germes potentiellement pathogènes pour le consommateur (les anaérobies sulfito-

réducteurs et Staphylococcus aureus).

- les germes tests d’hygiène générale (les germes aérobies mésophiles totaux "flore totale"

"GAMT", les coliformes fécaux et les streptocoques fécaux).

114

Résultats

Tableau VIII: Résultats des tests de pH et la réductase des échantillons du lait cru.

Test N° échantillons

pH pH moyen Réductase

E1 M Ch 6,55

6,57

<2h

E2 M Ch 6,60 >5h

E3 M Ch 6,57 =3h

E4 AD Ch 6 ,48

6,52

<2h

E5 AD Ch 6,50 <2h

E6 AD Ch 6,60 >5h

E7 M V 6,60

6,62

> 5h

E8 M V 6,63 >5h

E9 M V 6,65 > 5h

E10 AD V 6,68

6,68

<2h

E11 AD V 6,64 <2h

E12 AD V 6,72 >5h

E13 M B 6,50

6,61

< 2h

E14 M B 6,52 > 5h

E15 M B 6,82 >5h

E16 AD B 6,75

6,66

<2h

E17 AD B 6,60 >5h

E18 AD B 6,65 > 5h

E19 T Cm 6,40

6,42

<2h

E20 T Cm 6,45 =4h

E21 T Cm 6,42 >5 h

E22 Bs Cm 6,47

6,5

>5h

E23 Bs Cm 6,50 >5h

E24 Bs Cm 6,55 <2h

E: échantillon; M: Miliana;AD: Ain Defla;T: Tamanrasset, Bs: Biskra; Ch:Chèvre, V: Vache, B:Brebis;

Cm:Chamelle

115

Résultats

2.1.2.1. Dénombrement des germes mésophiles totaux:

La flore totale ou les germes aérobies mésophiles totaux "GAMT" englobe les

microorganismes pathogènes d'une part, divers microorganismes d'altération d'autre part.

Le dénombrement de cette flore se fait après ensemencement des dilutions décimales sur

gélose PCA et incubation à 30oC pendant 72h. Après la durée d'incubation, des colonies

apparaissent sur la gélose PCA. Un comptage des colonies a été effectué, dont les

échantillons E1, E4, E5, E10, E11, E13, E16, E19 et E24 ont présenté un nombre

supérieur à celui lancé par la législation Algérienne qui est 105 germes/ mL, dont

l'échantillon E11 prélevé du lait cru de vache de la région de Ain Defla contient un taux

de 107 germes aérobies mésophiles totaux. Les résultats de dénombrement des germes

mésophiles totaux sont représentés par le tableau IX et la Figure 40.

GAMT: Germes Aérobies Mésophiles Totaux, E: Echantillon, Nbr: Nombre

Fig.40: Résultats de dénombrement des Germes aérobies mésophiles totaux (GAMT)

dans les échantillons du lait cru.

107

9x106

8x106

7x106

6x106

5x106

4x106

3x106

2x106

106

116

Résultats

Tableau IX: Résultats des analyses microbiologiques des échantillons du lait cru.

Analyse

microbiologique

GAMT CSD SF Staphyl.a CLF

Norme (JORA, 1998) 105 50 0/0,1ml Abs 103

Miliana Ch E1 106 30 Abs Abs 101

E2 105 00 Abs Abs 00

E3 2x104 00 Abs Abs 00

V E7 104 10 Abs Abs 00

E8 7x104 00 Abs Abs 00

E9 2x104 00 Abs Abs 00

B E13 9x106 10 Abs Abs 100

E14 8x104 00 Abs Abs 00

E15 105 00 Abs Abs 00

A.Defla Ch E4 5x105 00 Abs Abs 220

E5 106 00 Abs Abs 150

E6 7x104 00 Abs Abs 00

V E10 2x106 40 Abs Abs 320

E11 107 35 Abs Abs 118

E12 104 00 Abs Abs 00

B E16 7x105 00 Abs Abs 250

E17 2x104 00 Abs Abs 00

E18 5x104 00 Abs Abs 00

Tamanrasset Cm E19 9x105 25 Abs Abs 160

E20 104 00 Abs Abs 00

E21 4x104 00 Abs Abs 00

Biskra Cm E22 9x104 00 Abs Abs 00

E23 105 00 Abs Abs 00

E24 2x106 00 Abs Abs 100

E: échantillon, Ch: Chèvre; V: Vache; B: Brebis; Cm: Chamelle, Abs: absence

GAMT: germes aérobies mésophiles totaux, CSD: Clostridium sulfito-réducteurs, SF: streptocoques fécaux,

Staphyl.a: Staphylococcus aureus, CLF: Coliformes fécaux

117

Résultats

2.1.2.2. Dénombrement des coliformes fécaux:

Le dénombrement des coliformes dans le lait permet la mise en évidence d'une

pollution fécale et donc la possibilité d'une contamination par les entérobactéries

pathogènes. Les coliformes fécaux sont thermotolérants, l'espèce la plus recherchée est

Escherichia coli. Le dénombrement de ce pathogène a été réalisé après 24 à 48h

d'incubation à 44 oC sur gélose désoxycholaté à 0,1%. Des colonies violacées d’un

diamètre supérieur ou égal à 0,5mm et parfois entourées d'une zone rougeâtre due à la

précipitation de la bile ont été comptées. Parmi 24 échantillons, 9 contiennent des

coliformes fécaux, dont nous avons enregistré un taux le plus élevé de 320 germes/mL

avec l'échantillon E10 prélevé du lait de vache de Ain Defla. D'après les résultats obtenus,

tous les échantillons du lait cru présentent un taux moins de 103 germes /mL fixé par la

législation Algérienne (Figure 41).

CF:coliformes fécaux, E:Echantillon, Nbr: Nombre

Fig. 41: Résultats de dénombrement des coliformes fécaux (CLF) dans les échantillons

(E) du lait cru.

118

Résultats

2.1.2.3. Dénombrement des Clostridium sulfito- réducteurs:

Les clostridiums sulfito-réducteurs sont dénombrés sur gélose viande foie après

traitement thermique des dilutions décimales à 80 oC pendant 8 à 10 minutes. Après 24 à

48 h, des colonies noires caractéristiques des clostridiums sulfito-réducteurs apparaissent

dans 6 échantillons du lait cru, dont nous avons enregistré un taux plus élevé de 40 germes

/mL pour l'échantillon E10 prélevé du lait cru de vache de Ain Defla, des taux moyens de

35, 30 et 25 germes /mL ont été trouvés dans les échantillons E11, E1 et E19,

respectivement.

Alors les échantillons E7 et E13 prélevés du lait cru de vache et de brebis de la

région de Miliana contiennent que 10 clostridiums sulfito-réducteurs (Figure 42).

CSR: Clostridium sulfito-réducteurs, E: Echantillon, Nbr: Nombre

Fig.42: Résultats de dénombrement des Clostridium sulfito-réducteurs (CSD) dans les

échantillons du lait cru.

119

Résultats

2.1.2.4. Dénombrement de streptocoques fécaux et Straphylococcus aureus:

La recherche de ces germes dans les 24 échantillons du lait cru de vache, chèvre,

brebis et chamelle montre une absence totale de Staphylococcus aureus et streptocoques

fécaux. Notant que, Staphylococcus aureus et streptocoques fécaux leur absence dans les

échantillons du lait cru témoignent que le produit ne présent pas un risque pour la santé du

consommateur.

2.2. Isolement des bactéries lactiques:

Les analyses microbiologiques des échantillons du lait cru prélevés ont montré

que 15 échantillons sur 24 sont de bonne qualité microbiologique, ce qui nous a permis de

procéder à un isolement des bactéries lactiques. Après une préparation d'une gamme de

dilutions décimales, 1 mL des dernières dilutions (10-4, 10-5 et 10-6) a été ensemencé sur

gélose M17 afin d'isoler des souches de Lactococcus et Enterococcus a activité

bactériocinogénique. L'incubation des boites de Pétri se fait à 30 °C pour les bactéries

mésophiles et à 45°C pour les bactéries thermophiles, pendant 48h à 72h.

2.2.1. Identification phénotypique:

Après la durée d'incubation, des colonies rondes, blanchâtres et bien visibles

(Figure 43) apparaissent sur gélose M17. Le nombre de colonies par souche est évalué en

UFC (unité formant colonie) par millilitre d’échantillon de lait analysé.

Les résultats du dénombrement des bactéries lactiques sont rassemblés dans le

Tableau X. Le nombre moyen de colonies le plus important a obtenu avec le lait de vache

prélevé de Miliana (7x107 UFC/mL) et lait de vache prélevé de Ain Defla (6,8x107

UFC/mL).

D'autres nombres moyens de colonies moins importants sont obtenus avec les

autres types du lait.

120

Résultats

Tableau X: Nombre moyen de colonies dénombrées (UFC/mL) dans chaque type de

lait.

Miliana Ain Defla Biskra Tamanrasset

Lait de vache 7x107 UFC/mL 6,8x107

UFC/mL

/ /

Lait de chèvre 6,5x107

UFC/mL

6x107 UFC/mL / /

Lait de brebis 5,9x106

UFC/mL

5,3x106

UFC/mL

/ /

Lait de

chamelle

/ / 6,5x107

UFC/mL

5,8x107

UFC/mL

A B

Fig.43: Aspect des bactéries lactiques après culture sur gélose M17. A: Enterococcus, B:

Lactococcus

121

Résultats

L'examen microscopique des frottis préparés à partir des colonies des bactéries

lactiques isolées et repiquées plusieurs fois jusqu'à leur purification a montré que ces

bactéries retiennent le violet de gentiane ce ci indique qu'elles ont un Gram dit positif.

L'ensemble des bactéries lactiques isolées apparaît sous microscope optique en forme de

coques (coccis) qui se regroupent soit en paires ou en courtes chaînes (Figures 44 et 45).

Fig. 44:Observation des bactéries lactiques genre Lactococcus sous microscope optique après

coloration de Gram (10X100).

Fig.45: Observation des bactéries lactiques genre Enterococcus sous microscope optique

après coloration de Gram (10X100).

122

Résultats

2.2.2. Identification biochimique et physiologique:

L'identification biochimique a montré que les bactéries lactiques isolées n'ont pas

d'oxydase et dénuées de catalase. Ces bactéries lactiques sont testées pour leur type

fermentaire sur bouillon nutritif additionné de glucose et de la cloche de Durham. Sous

anaérobiose, toutes les bactéries lactiques sont des homofermentaires car aucun

dégagement gazeux n'a été observé sur l'ensemble des tubes de bouillon nutritif incubés à

37°C pendant 48 heures.

Dans les conditions hostiles, toutes les souches isolées poussent à 37 °C. Les

espèces présentent une certaine variabilité de croissance vis-à-vis des conditions hostiles:

pH, NaCl et température (Tableau XI).

Les résultas de la galerie API 20 strep relatifs aux tests biochimiques sont

représentés au niveau du Tableau XII.

Il s'agirait des espèces de Lactococcus lactis subsp. lactis, de Lactococcus lactis

subsp. cremoris, de Lactococcus garvieae et de Enterococcus faecium (Tableau XIII)

(Figure 46), dont:

L'espèce Lactococcus lactis subsp. lactis présente 36,66% de l'ensemble des espèces

bactériennes identifiées;

L'espèce Lactococcus lactis subsp. cremoris présente 30%;

L'espèce Lactococcus garvieae présente 13,33%;

L'espèce Enterococcus faecium présente 20%.

Toutes les souches:

produisent d'acétoine (Vp +);

hydrolysent l'esculine;

fermentent les sucres suivants: Ribose, Mannose, Lactose et Tréhalose;

sont dépourvues de β-glucuronidase, de phosphatase alcaline et le pouvoir

hémolytique.

ne fermentent pas le glycogène.

Les caractères biochimiques obtenus montrent que toutes les bactéries lactiques

produisent de l'acétoine et hydrolysent l'esculine qui présente un intérêt technologique.

Ces bactéries sont dépourvues du pouvoir pathogène, ce ci s'exprime par l'absence de la

phosphatase alcaline et le caractère hémolytique.

123

Résultats

L'espèce Lactococcus lactis subsp. lactis est présentée par les souches B01, B03,

B06, B07, B08 et B09(isolées à partir du lait de vache), les souches B12 et B15(isolées de

lait de chèvre), les souches B21, B26 et B29 (isolées du lait de chamelle et brebis). Toutes

ces souches croissent en présence de 4% de NaCl et à pH 6,5.

Pour l'espèce Lactococcus lactis subsp. cremoris neuf souches ont été identifiées:

une isolée de lait de vache(B04), deux de lait de chèvre(B14 et B16), quatre de lait de

chamelle (B20, B22, B24 et B25), deux de lait de brebis (B28 et B30). Toutes ces souches

croissent en présence de 2% de NaCl et à pH 6,5. Des souches de Lactococcus garvieae

ont été isolées de lait de vache (B02 et B11) et de lait de chamelle (B18 et B23). Ces

souches supportent un milieu acide (pH 4,5) et 4% de NaCl.

Six souches de Enterococcus faecium ont été trouvées dans tous les échantillons

du lait: deux dans le lait de vache (B05 et B10), deux dans le lait de chèvre (B13 et B17),

une dans le lait de chamelle (B19) et une dans le lait de brebis (B27). Les souches de

Enterococcus faecium croissent à 45 °C, en présence d'une concentration de 6,5% de NaCl

et à pH 6,5. Elles sont aussi thermorésistantes (65°C).

Pour l'espèce Ec.faecium isolée de lait cru est la seule espèce du genre

Enterococcus trouvée dans les échantillons prélevés. Ces résultats supposent que les

conditions de la traite et de stockage des laits sont défavorables aux espèces d'origine

fécale.

Fig.46: Répartition des souches de bactéries lactiques selon l'espèce dans les

échantillons du lait cru.

124

Résultats

Tableau XI: caractères physiologiques des souches de bactéries lactiques.

Type

de lait

Origine

De la

collection

Croissance à

Température NaCl pH

37oC 45 oC 65oC

2% 4% 6,5% 4,5 6,5

B01 V M + - - - + - - +

B02 V M + - - - + - + -

B03 V M + - - - + - - +

B04 V M + - - + - - - +

B05 V M + + + - - + - +

B06 V M + - - - + - - +

B07 V M + - - - + - - +

B08 V AD + - - - + - - +

B09 V AD + - - - + - - +

B10 V AD + + + - - + - +

B11 V AD + - - - + - + -

B12 Ch M + - - - + - - +

B13 Ch M + + + - - + - +

B14 Ch M + - - + - - - +

B15 Ch M + - - - + - - +

B16 Ch AD + - - + - - - +

B17 Ch AD + + + - - + - +

B18 Cm T + - - - + - + -

B19 Cm T + + + - - + - +

B20 Cm T + - - + - - - +

B21 Cm T + - - - + - - +

B22 Cm T + - - + - - - +

B23 Cm Bs + - - - + - + -

B24 Cm Bs + - - + - - - +

B25 Cm Bs + - - + - - - +

B26 B M + - - - + - - +

B27 B M + + + - - + - +

B28 B M + - - + - - - +

B29 B AD + - - - + - - +

B30 B AD + - - + - - - +

V: Vache Ch: Chèvre Cm: Chamelle B: Brebis M: Miliana AD: Ain Defla Bs: Biskra T: Tamenrasset

(+): Réaction positive (-): Réaction négative

125

Résultats

Tableau XII: Résultats de l’identification des bactéries lactiques obtenus par Api20strep et le test d'hémolyse Vp: Voges-Proskauer, HIP: Hippurate, ESC: Esculine, PYR: pyrrolidonyl arylamidase , α GAL: α galactosidase, βGUR: β Glucuronidase, LAP: leucine amiopeptidase, ADH: Arginine dihydrolase, RIB: Ribose, ARA:

Arabinose, MAN: Mannose, SOR: Sorbitol, LAC: Lactose, TRE: Tréhalose, INU: Inuline, RAF: Raffinose, AMD: Amidon, Glyg: Glycogène, Hem: Hémolyse, βGAL : β-galactosidase; PAL: Phosphatase alcaline,

B01 B02 B03 B04 B05 B06 B07 B08 B09 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30 Vp + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

HIP + - + + + + + + + + - + + + + + + - + + + + - + + + + + + +

ESC + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

PYRA + - + + + + + + + + - + + + + + + - + + + + - + + + + + + +

α

GAL - + - + + - - - - + + - + + - + + + + + - + + + + - + + - +

βGUR - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

βGAL + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

PAL - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

LAP + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

ADH + - + + + + + + + + - + + + + + + - + + + + - + + + + + + +

RIB + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

ARA - + - + + - - - - + + - + + - + + + + + - + + + + - + + - +

MAN + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

SOR - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

LAC + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

TRE + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

INU - - - + + - - - - + - - + + - + + - + + - + - + + - + + - +

RAF - + - - - - - - - - + - - - - - - + - - - - + - - - - - - -

AMD + - + + + + + + + + - + + + + + + - + + + + - + + + + + + +

Glyg - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

HEM - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

126

Résultats

Tableau XIII: Résultats de l'identification des espèces de bactéries lactiques

Lait de vache Miliana

Lactococcus lactis subsp. lactis (B01) Lactococcus garvieae (B02)

Lactococcus lactis subsp. lactis (B03)

Lactococcus lactis subsp. cremoris (B04)

Enterococcus faecium (B05)



Ain Defla




Lactococcus garvieae (B11)

Lait de chèvre Miliana

Lactococcus lactis subsp.lactis (B12)




Ain Defla



Lait de

chamelle

Tamenrasset






Biskra




Lait de brebis Miliana




Ain Defla



127

Résultats

2.2.3. Pouvoir acidifiant :

La mesure de l’activité acidifiante consiste à suivre d’une part l’évolution du pH

des différentes cultures en fonction du temps et d’autre part à doser simultanément

l’acidité totale par la soude. Après incubation à 37°C, à un intervalle du temps qui varie

de 2h jusqu'à 24h; 10mL du lait est prélevé puis titrer par la soude Dornic (N/9) en

présence de 5 gouttes de phénolptaléine, jusqu’au virage de la couleur au rose pâle

persistant au moins 10 secondes. La mesure de pH est faite directement par le pH-mètre,

en plongeant l’électrode dans le volume du lait.

Le pH a été déterminé à chaque fois qu’on procède au dosage de l’acide lactique,

dont au temps t=0h, toutes les bactéries lactiques secrètent une quantité d'acide estimée à

13 oD. Le meilleur pouvoir acidifiant a été enregistré au bout de 24 h avec les deux

souches de Lactococcus lactis subsp. cremoris :B30 et B28 avec une quantité d'acide

estimée à 45 oD et 40 oD, respectivement. Une quantité de 35 oD a été trouvée en présence

des souches: Lactococcus lactis subsp. lactis (B03), Lactococcus lactis subsp. cremoris

(B04), Lactococcus lactis subsp. lactis (B06), Lactococcus lactis subsp. lactis (B09),

Lactococcus lactis subsp. cremoris (B20), Lactococcus garvieae(B23) et Lactococcus

lactis subsp. lactis (B29). D'autres souches de Lactococcus ont sécrété une quantité

d'acide lactique estimée à 30 oD: Lactococcus garvieae(B02), Lactococcus lactis subsp.

lactis (B07), Lactococcus garvieae (B11), Lactococcus lactis subsp.lactis(B12),

Lactococcus lactis subsp. cremoris (B16), Lactococcus garvieae (B18), Lactococcus

lactis subsp. cremoris (B24). Alors que les autres souches ont montré un faible pouvoir

acidifiant avec une quantité d'acide lactique qui varie de 20 oD à 25 oD (Figures 47, 48,

49, 50).

128

Résultats

Fig. 48 : Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Lactococcus lactis subsp cremoris.

Fig. 47 : Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Lactococcus lactis subsp. lactis.

05

10

15

20

25

3035

40

45

Acidité (D)

0h 2h 4h 6h 24h

Temps (h)

B04B14B16B20B22B24B25B28B30

0

5

10

15

20

25

30

35

Acidité (D)

0h 2h 4h 6h 24h

Temps(h)

B01B03B06B07B08B09B12B15B21B26B29

129

Résultats

Fig. 50 : Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de

Lactococcus garvieae.

Fig. 49 : Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Enterococcus faecium.

0

5

10

15

20

25

Acidité (D)

0h 2h 4h 6h 24h

Temps (h)

B05B10B13B17B19B27

0

5

10

15

20

25

30

35

Acidité (D)

0h 2h 4h 6h 24h

Temps (h)

B02B11B18B23

130

Résultats

II. Examen anatomo-pathologique et cytologique des biopsies gastriques :

Des coupes histologiques ont été préparées à partir des biopsies gastriques

prélevées des patients ayant subi une endoscopie digestive haute. Les tissus sont colorés

par l'Hématoxyline-Éosine et Giemsa Lent. L’analyse anatomo-pathologique et

cytologique permet conjointement le dépistage de la gastrite et la recherche de

complications, telles qu’atrophie, métaplasie, lymphome ou cancer. L'observation

microscopique a montré la présence de bactéries incurvées à la surface de l'épithélium

gastrique ou dans la lumière des glandes pyloriques des patients (Figures 51, 52, 53 et

54). Par l'Hématoxyline-Éosine on peut observer les noyaux des cellules colorés en bleu-

noir, le cytoplasme et la matrice extracellulaire en rose. Alors que, le Giemsa colore le

cytoplasme des neutrophiles, des monocytes, des lymphocytes et la chromatine des

noyaux.

Sur le plan histologique, la muqueuse gastrique est constituée d'une simple

couche d'épithélium glandulaire et d'un tissu conjonctif lâche, appelé chorion (Lamina

propria), entourant les glandes pyloriques. Dans le chorion les fibres réticulaires et

collagènes prédominent alors que les fibres élastiques sont rares. Les glandes pyloriques

ont une lumière plus large et sont très ramifiées. Leurs cryptes ou fovéoles, sont plus

profondes et s'étendent sur la moitié de l'épaisseur de la muqueuse. La présence de

Helicobacter pylori a provoqué une gastrite aiguée œdimateuse avec une activité

inflammatoire légère exprimée par la présence dans le chorion d'un nombre limité des

polynucléaires neutrophiles (coloration Giemsa L x1000) chez un homme âgé de 19 ans et

une femme de 64ans (Figure 51 et 53). L'observation microscopique d'une lame préparée

à partir d'une biopsie gastrique d'un homme âgé de 43 ans a révélé une gastrite chronique

suite à l'effet infectieux de Helicobacter pylori (Figure 52). Cette gastrite s'exprime par

un infiltrat dense surtout en surface, d'un foyer de Polynucléaires neutrophiles dans le

chorion et l'épithélium gastrique. On peut aussi observé une atrophie des glandes

pyloriques. L'infection à H.pylori (arcs et bâtonnets) dans ce cas était modérée dans la

lumière glandulaire et au contact de l'épithélium gastrique. L'observation microscopique

de H.pylori était positive chez trois patients. Ce ci peut être due au suivi du traitement

médical (antibiotiques+ IPP) par les patients avant d'entamer l'examen

anatomopathologique qui va fausser les résultats. Au grossissement 100, on peut très bien

131

Résultats

visualiser la glande pylorique qui est constituée de plusieurs cellules, dont chacune a une

forme et une fonction particulière (Figure 54). Les différentes caractéristiques

cytologiques sont présentées par le tableau XIV.

Tableau XIV: cytologie des coupes histologiques des biopsies gastriques.

Coloration Grossissement Observation

Hématoxyline-éosine

40 Artérioles, glandes, cryptes

100 Epithélium simple, glandes avec lumière, chorion, cryptes,

artérioles

400 Artérioles plus visibles, Chorion, fibres collagènes et

réticulaires, Cellules à mucus, Cellules muqueuses

superficielles, H.pylori (arcs, bâtonnets)

1000 Fibres de collagènes et réticulaires bien visibles, cellules

endocrines, Cellules à mucus, Noyau bien visible, Cellules

muqueuses superficielles, H.pylori (spirale, incurvé).

Giemsa lent

40 Artérioles, glandes, cryptes, Atrophie glandulaire, Lumière

glandulaire.

100 Epithélium simple, glandes avec lumière, chorion, crypte

400 Artérioles plus visibles, Chorion, fibres collagènes et

réticulaires, Polynucléaires, Cellules à mucus, Cellules

muqueuses superficielles, H.pylori(arcs, bâtonnets, coccoides)

1000 Chromatine des noyaux, fibres de collagènes et réticulaires

bien visibles, chorion, lumière glandulaire, Cellules

muqueuses superficielles, Cellues à mucus, Cellules

endocrines, Noyau bien visible, Polynucléaires neutrophiles,

H.pylori (coccoide, spirale, incurvé).

132

A (10X4) (10X10) (10X40)

B (10X4) (10X10) (10X40)

C: Crypte, Ch: Chorion, CE:Cellule Endocrine, P: Polynucléaire, CMS: Cellule Muqueuse Superficielle, CM: Cellule à Mucus, N: Noyau Fig.51: Gastrite aigue type B oedimateuse (présence des vaisseaux sanguins) (grande flèche), infection légère à H.pylori+: arcs, bâtonnets (flèche rouge) dans la lumière glandulaire: A: HE, B:Giemsa L

C

P

CMS

LG

LG

Ch

Ch

CE

CM

CM

CE

CMS

C

N

N

Ch

LG

LG

LG

133

A (10X4) (10X10) (10X40)

B (10X4) (10X10) (10X40)

C: Crypte, Ch: Chorion, CE: Cellule Endocrine, P: Polynucléaire, CM: Cellule à Mucus, CMS: Cellule Muqueuse Superficielle Détachée, P: Polynucléaire, N: Noyau, Fc: Fibre Collagène, FR: Fibre Réticulaire Fig. 52: Gastrite chronique avec atrophie glandulaire modérée (grande flèche), infection modérée à H.pylori++: arcs, bâtonnets et coccis (flèche rouge) dans la lumière glandulaire de la muqueuse gastrique: A:HE, B:Giemsa L

P

Ch

C

CM

P CMS

LG

Ch

Ch

Ch FC FR

CE

CM

CE

CM

N

N

CMS

Ch

134

CP

A (10X4) (10X10) (10X40)

B (10X4) (10X10) (10X40)

C: Crypte , Ch: Chorion, CM: Cellule Muqueuse, CMS: Cellule Muqueuse Superficielle, CE: Cellule Endocrine, N: Noyau, FC: Fibre collagène, Fr: Fibre Réticulaire Fig. 53: Gastrite aigue type B oedimateuse (présence des vaisseaux sanguins) (grande flèche), infection légère à H.pylori+: arcs et bâtonnets (flèche rouge) dans la lumière glandulaire et au contact de l'épithélium gastrique (flèche rose): A: HE, B:Giemsa L

Ch

C

FC

CE

CM

P

CM

CE

N

N

CMS

CMS

Fr

135

Résultats

C:Crypte, Ch: Chorion, CMS: Cellule Muqueuse Superficielle, CM: Cellule à Mucus, CE: Cellule Endocrine, Chr: Chromatine, N:Noyau, HP: H.pylori, Lg: Lumière Glandulaire, PN: Polynucléaire Neutrophile, Fr: Fibre Réticulaire, Fc: Fibre Collagène. Fig.54: Observation microscopique d'une glande pylorique à 1000 après coloration A:HE et B: Giemsa Lent

C

CMS

CM

CE

HP

Ch HP

Lg

CE

PN

Fr Fc

Chr

N

N

Ch

CM

Chr

136

Résultats

III. Etude de l'activité antibactérienne: 1. Interaction des bactéries lactiques avec les souches d’H.pylori in vitro:

Des précultures des bactéries lactiques isolées et caractérisées à partir du lait cru

sont testées pour leur pouvoir antibactérien vis-à-vis des souches de Helicobacter pylori

suivant la méthode de disques.

Les souches de Helicobacter pylori utilisées dans cet étude proviennent du centre

national de référence des Campylobacters et des Helicobacters de Bordeaux (souches de

références: 26695 ; J99 ; TN2GF4 et HPAG1, souche clinique : HSA3068). D'autres

souches de H.pylori ont été isolées au niveau de laboratoire de bactériologie de l'hôpital

Cochin à Paris, à partir des biopsies gastriques prélevées des patients par endoscopie

digestive haute.

Après 24 h d'incubation des boites de Pétri contenant les bactéries lactiques et les

souches d'H.pylori, des zones claires autour des disques ont été observées. La lecture se

fait par la mesure du diamètre en mm des zones d’inhibition formées autour des disques

(Zi). On prend en considération les zones qui mesurent plus de 2 mm de diamètre. La

mesure du diamètre de Zi est effectuée selon la formule suivante :

Zi en (mm)= diamètre de la zone d’inhibition obtenue (mm)- diamètre de disque (6mm).

L’interaction in vitro des bactéries lactiques avec les souches de H.pylori a

montré que 14 souches de bactéries lactiques sur 30 ont un effet inhibiteur (Tableau XV).

D’après les résultats obtenus, il en ressort que les deux souches E.faecium (B13)

et Lc. lactis subsp. lactis (B01) sont à l’origine des zones d’inhibition importantes dont les

diamètres enregistrés sont 20mm et 18mm avec la souche TN2GF4; 16mm et 13mm avec

la souche HSA3068, 15mm et 11mm avec la souche 26695, 15mm et 13 mm avec la

souche J99. Pour la souche HPAG1 la meilleure zone d'inhibition a été trouvée avec la

bactérie Enterococcus faecium (B19) (diamètre=7mm).

137

Résultats

Tableau XV: Diamètres des zones d'inhibition (mm) des bactéries lactiques vis-à-vis

des souches d' H.pylori Diamètre des zones d'inhibition (mm)

TN2GF4

J99

26695

HPAG1

HSA3068

Hp1

Hp3

B01 18 13 11 00 13 03 03

B02 00 00 00 00 00 00 00

B03 00 00 00 00 00 00 00

B04 00 00 00 00 00 09 07

B05 00 00 00 00 00 00 00

B06 00 00 00 00 00 00 00

B07 10 06 05 00 04 03 03

B08 00 00 00 00 00 00 00

B09 00 00 00 00 00 00 00

B10 00 00 00 00 00 10 08

B11 00 00 00 00 00 00 00

B12 08 00 00 00 00 04 03

B13 20 15 15 00 16 04 03

B14 04 04 03 00 00 00 00

B15 00 00 00 00 00 00 00

B16 00 00 00 00 00 00 00

B17 06 06 05 00 03 00 00

B18 00 04 00 00 00 00 00

B19 00 06 00 07 00 05 03

B20 00 00 00 00 00 00 00

B21 00 00 00 00 00 00 00

B22 03 00 00 00 00 00 00

B23 00 00 00 00 00 00 00

B24 00 00 00 00 00 00 00

B25 08 07 07 00 06 03 00

B26 05 00 00 05 00 03 03

B27 00 00 00 00 00 00 00

B28 00 00 00 00 00 00 00

B29 03 00 00 04 00 04 00

B30 00 00 00 00 00 00 00

138

Résultats

Avec la souche Hp1, 10 zones d'inhibition ont été enregistrées avec les souches

E.faecium(B10), Lactococcus lactis subsp.cremoris(B04), Enterococcus faecium (B19),

Lactococcus lactis subsp. lactis (B12), Enterococcus faecium(B13), Lactococcus lactis

subsp. lactis B29, Lactococcus lactis subsp. lactis (B01), Lactococcus lactis subsp. lactis

(B07), Lactococcus lactis subsp.cremoris (B25), Lactococcus lactis subsp. lactis (B26)

dont les diamètres sont 10mm, 09 mm, 5mm,4mm,4mm, 4mm, 3mm, 3mm, 3mm et 3mm,

respectivement. Alors, la souche Hp3 a donné des zones d'inhibition avec 08 bactéries

lactiques sur 30, dont les diamètres varient de 8mm à 3 mm (Figure 55 et 56).

Les résultats de l’inhibition des souches d’ H.pylori (TN2GF4, HPAG1, J99,

26695, HSA3068, Hp1 et Hp3) montrent que les bactéries lactiques ne présentent pas le

même spectre d’action; elles expriment des variations plus ou moins importantes qui

dépendent en premier lieu de la souche cible d’H.pylori et en second lieu de la souche

indicatrice de bactérie lactique. Les meilleures zones d’inhibition ont été enregistrées avec

les souches E.faecium (B13) et Lactococcus lactis subsp. lactis (B01), dont la souche

E.faecium (B13) a montré un faible pouvoir acidifiant avec la sécrétion d'une quantité

d'acide lactique égale à 19oD au bout de 24h. Ce ci indique que l'inhibition est due soit à

l'acide lactique malgré que la souche B13 secrète une faible quantité, soit aux d'autres

substances de nature différente de l'acide lactique.

D'après les caractères des souches de H.pylori, la souche de référence TN2GF4

est résistante vers les antibiotiques Amoxicilline, Clarithromycine et Levofloxacine mais

elle est sensible vers les deux souches B13 et B01. Ainsi, la souche J99 a montré une

sensibilité vers les deux bactéries lactiques E.faecium et Lactococcus lactis subsp. lactis,

alors qu' elle résiste bien aux deux antibiotiques Amoxicilline et Clarithromycine. Ce ci

montre une bonne inhibition de ce pathogène par les bactéries lactiques isolées. D'après

les résultats obtenus les souches Hp1 et Hp3 sont sensibles à la clarithromycine et aux

bactéries lactiques B01, B04, B07, B10, B12, B13, B19, B25, B26 et B29, mais les zones

d'inhibition enregistrées ont un diamètre qui ne dépasse pas 10mm. La souche HPAG1 est

la souche la plus résistante parmi toutes les souches de H.pylori utilisées dans ce travail

dont seulement trois bactéries lactiques ont montré un effet inhibiteur.

139

Résultats

A B

C D

Fig.55: Activité antibactérienne des souches de Lactococcus et Enterococcus vis-à-vis des

souches d'Helicobacter pylori par la méthode de diffusion sur gélose: A: TN2GF4, B:

J99, C: 26695 et D: HSA3068.

140

Résultats

A B

C

Fig.56: Activité antibactérienne des souches de Lactococcus et Enterococcus vis-à-vis des

souches de Helicobacter pylori par la méthode de diffusion sur gélose:A: HPAG1, B:

Hp1, C:Hp3.

141

Résultats

2. Détermination de l’activité bactériocinogénique :

D'après les résultas obtenus dans l'étude de l'activité antibactérienne des souches

de bactéries lactiques vis-à-vis des souches de Helicobacter pylori par la méthode de

diffusion sur gélose, la souche Enterococcus faecium (B13) isolée du lait de chèvre de

Miliana a montré un net effet inhibiteur des souches de Helicobacter pylori( TN2GF4,

HSA3068, J99 et 26695, Hp1 et Hp3).

2.1. Elimination de l’effet des acides organiques et de peroxyde d’hydrogène:

Les bactéries lactiques produisent plusieurs substances à effet antibactérien.

Parmi ces substances les acides organiques, peroxyde d'hydrogène et les bactériocines.

Des centrifugations successives du milieu de culture contenant la bactérie lactique B13

ont été réalisées afin de déterminer la présence de la substance inhibitrice dans le

surnageant ou dans le culot obtenu. Afin de déterminer l'activité bactériocinogénique de la

souche Enterococcus faecium(B13), l’effet des acides organiques, notamment des acides

lactique et acétique a été éliminé, dont le surnageant a été neutralisé à pH 6,5 par une

solution de NaOH. Ainsi le peroxyde d’hydrogène accumulé dans le milieu de culture a

été éliminé avec un traitement du surnageant par 5mg d'une catalase à 30°C pendant 2h

avant de procéder au test d’inhibition. Les résultats montrent que l’extrait cellulaire

obtenu (culot) après centrifugation à 10 000 tours / min ne présente aucun effet inhibiteur

sur la croissance des souches d’H.pylori utilisées. Malgré la neutralisation et l’ajout du

catalase à la fraction extracellulaire (surnageant de B13) le même effet inhibiteur a été

constaté vis-à-vis les souches d’H.pylori (TN2GF4, HSA3068, J99 et 26695, Hp1, Hp3 et

HPAG1) dont les zones d’inhibition sont 20mm, 16mm, 15mm et 15mm, 4mm, 3mm et

0mm, respectivement (Figure 57). D’après les résultats obtenus, le culot ne contient pas

la substance inhibitrice alors cette dernière est présente dans la fraction extracellulaire. Ce

ci peut s'expliquer par la synthèse et la sécrétion par la bactérie B13 d'une substance autre

que le peroxyde d'hydrogène et les acides organiques dans le milieu extracellulaire.

142

Résultats

. A B

C D

Fig.57: Effet de l'extrait cellulaire (EC) et la fraction extracellulaire (FEC) de

Enterococcus faecium (B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la méthode

de diffusion sur gélose:A:TN2GF4, B: J99, C:HSA3068, D: 26695.

143

Résultats

2.2. Effet de l'extrait bactériocinogénique sur H.pylori en milieu liquide:

L'effet bactériocinogénique de la bactérie lactique, qui a une inhibition

importante de H.pylori sur milieu gélose par la méthode de diffusion, a été étudié sur le

surnageant neutralisé à pH 6,5 par une solution de NaOH (0,1 N) et traité par une catalase

(5mg/1mL) à 30°C pendant 2h afin d'éliminer les acides organiques et la H2O2 présentent

dans le milieu. Le test d'inhibition est réalisé en milieu liquide, dont 250 µL du surnageant

a été ensemencé avec 250µL des précultures d'H.pylori (107 CFU/ mL) et incubé à 37oC

pendant 126h. Après chaque 18h, une culture de Helicobacter pylori a été faite sur milieu

Brucella additionné à 10% du sang de cheval et incubé à 37oC sous une atmosphère

microaérophile.

Le dénombrement des fines colonies, transparentes à grisâtres et luisantes qui

appartiennent à Helicobacter pylori révèle une diminution du nombre des souches

d'H.pylori utilisées dans ce travail (TN2GF4, HSA3068, J99 et 26695, Hp1 et Hp3 ) avec

le temps (Figure 58). La souche TN2GF4 a montré une grande sensibilité au surnageant

de E.faecium(B13), avec une baisse du taux de H.pylori du 1x107 à 106UFC/mL au bout

de 18h, dont ce taux continue à diminuer jusqu'à l'obtention de 00UFC/mL à 54h, 72h,

90h,108h et 126h.

Ainsi, nous avons enregistré une inhibition importante de la souche HSA3068

(00UFC/mL au bout de 90h). Avec les deux souches J99 et 26695 d'H.pylori, l'inhibition

était moins importante ce qui nous a laissé suivi l'effet du surnageant jusqu'à 108h où on a

obtenu 00UFC/mL sur la gélose Brucella. Alors les deux souches HP1 et Hp3 ont montré

une faible sensibilité vers l'effet du surnageant, car la diminution du taux d'H.pylori était

faible après chaque 18h, le dénombrement a été fait jusqu'à 126h, avec une absence totale

des colonies sur gélose.

Par contre, le nombre des colonies de HPAG1 était le même après 126h (107

UFC/mL), ce ci s'exprime par l'effet bactéricide/bactériostatique du surnageant de B13.

144

Résultats

Les résultats obtenus par la méthode de diffusion sur gélose et dans le bouillon

ont montré que le surnageant a un effet inhibiteur sur H.pylori. Dans le bouillon et avec le

temps le nombre d'H.pylori diminue jusqu'à l'obtention d'une culture négative. Ce ci

indique que le surnageant devient bactéricide/bactériostatique de H.pylori .

Fig. 58: Nombre de colonies de Helicobacter pylori obtenu après culture sur gélose

Brucella.

2.3. Influence du pH, température et enzymes sur les bactériocines:

Après élimination des acides organiques et du H2O2 de l'extrait cellulaire qui a

montré une activité antibactérienne vis-à-vis des souches de H.pylori, la stabilité de la

substance antagoniste aux pH acide et basique a été étudiée en ajustant le pH à 4 et 8. Les

résultats de l’activité antibactérienne montrent que le surnageant de culture de E.faecium

(B13) après l’ajustement de pH garde la même activité (figure 59) dont les zones

d’inhibition vis-à-vis les souches TN2GF4, HSA3068, J99 et 26695, Hp1, Hp3 et HPAG1

sont 20mm, 16mm, 15mm, 15 mm, 4mm, 3mm et 0mm, respectivement. Cette substance

145

Résultats

est stable à pH 4 et à pH 8. Ces caractéristiques confèrent à cette substance un grand

intérêt technologique dans la bioconservation des aliments.

Les traitements thermiques du surnageant de culture de E.faecium (60°C pendant

30minutes, 80°C pendant 10minutes et 100°C pendant 05minutes) n’agissent pas sur

l’activité antibactérienne dont on trouve les mêmes résultats d’inhibition qui ont été déjà

enregistrés avec les souches TN2GF4, HSA3068, J99 et 26695, Hp1, Hp3 et HPAG1

(20mm, 16mm, 15mm et 15mm, 4mm, 3mm et 0mm, respectivement) (Figure 60). Ces

résultats suggèrent que le facteur antibactérien produit conserve son activité antagoniste

après avoir été soumis à des traitements thermiques assez élevés comparables à la

pasteurisation et la stérilisation du lait.

Afin de déterminer la nature de la substance inhibitrice extraite d'une culture de

la bactérie lactique E.faecium, des enzymes ont été utilisées à cet égard : Pepsine,

Trypsine et α amylase. L’activité de cette substance est testée par la méthode de diffusion

sur gélose. Après 24h d'incubation, le surnagent de la culture de E.faecium traité par des

enzymes non protéolytiques comme α -amylase inhibe la croissance des souches de

H.pylori : TN2GF4, HSA3068, J99 et 26695, Hp1, Hp3 et HPAG1 dont les diamètres sont

20mm, 16mm, 15mm et 15mm, 4mm, 3mm et 0mm, respectivement.

Alors la substance extraite perd son activité antibactérienne en présence de deux

enzymes protéolytiques : Pepsine et Trypsine. Ce ci indique que la substance

antibactérienne est de nature protéique, dont ces deux enzymes hydrolysent une protéine

sécrétée par la bactérie lactique E.faecium (B13) (figure 61). Cette protéine contient des

acides aminés aromatiques et basiques.

D'après les résultats obtenus in vitro, la substance inhibitrice de la souche

H.pylori sécrétée par E.faecium (B13) est de nature protéique, thermorésistante et stable

aux pH 4et 8.

146

Résultats

A B

C D

Fig.59: Effet de pH(4 et 8) sur l’activité bactériocinogénique de Enterococcus faecium

(B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la méthode de diffusion sur

gélose:A:TN2GF4, B: J99, C:HSA3086, D: 26695.

147

Résultats

A B

C D

Fig.60 : Effet du traitement thermique (60°C pendant 30min, 80°C pendant 10min et

100°C pendant 5min) de la fraction extracellulaire (FEC) de E.faecium (B13) vis-à-vis des

souches de H.pylori déterminé par la méthode de diffusion sur gélose: A: TN2GF4, B:J99,

C: 26695, D: HSA3086.

148

Résultats

A B

C D

Amy: Amylase, Try: Trypsine, Pep: Pepsine

Fig. 61: Effet des enzymes (Pepsine, Trypsine et α- Amylase) sur la fraction

extracellulaire de E.faecium (B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la

méthode de diffusion sur gélose: A: TN2GF4, B: J99, C: HSA3086, D: 26695.

149

Résultats


Les résultas obtenus in vitro ont montré que la souche Enterococcus faecium

(B13) isolée du lait de chèvre de Miliana est douée d’une activité inhibitrice plus

importante de la souche d' Helicobacter pylori TN2GF4 en sécrétant une substance de

nature protéique, thermorésistante et stable à pH 4 et 8. Ce qui nous a conduit à étudier

son effet probiotique in vivo.

Pour cela, des souris Balb/c holoxéniques, femelles, âgées de deux mois

provenant de l'institut Pasteur d'Algérie, sont reparties en 3 lots de 12 souris chacun: un

lot témoin, un lot infecté par la souche TN2GF4 et un lot infecté par TN2GF4 et traité par

Enterococcus faecium (B13). Avant toute administration de la souche H.pylori et

Enterococcus faecium (B13), une analyse des selles des souris est faite afin de déterminer

des germes occupés par l’intestin et contrôler la présence surtout de la bactérie lactique

Enterococcus faecium .

Les germes recherchés dans cette partie sont: E.coli, Salmonella spp, Shigella

spp, Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Clostridium, Enterococcus spp,

Lactobacillus spp, Lactococcus spp, levures et moisissures. Après isolement, les bactéries

trouvées ont été identifiées à l'échelle de l'espèce (Annexe). Les résultats des analyses

bactériologiques des selles de souris sont mentionnés dans la figure 62.

La recherche de H.pylori dans les souris holoxéniques a été étudiée, pour cela

une souris du lot témoin a subi une dissection dont un fragment biopsique a été prélevé et

broyé. La culture de H.pylori est réalisée sur gélose Brucella additionnée à 10% du sang

de cheval et incubée à 37oC pendant 3 à 5 jours et sous une atmosphère microaérophile.

La flore intestinale des souris holoxéniques utilisées dans ce travail est

principalement composée de levures et de champignons, ainsi de Streptococcus, E.coli,

Staphylococcus cohnii et Alcaligenes faecalis. La présence de champignons chez les

souris peut être due au stockage de grains de blé qui est un substrat excellent pour le

développement des moisissures, par ailleurs l’absence de Salmonella et Shigella montre

que les conditions d’élevage semblent bonnes sur le plan hygiénique.

150

Résultats

Fig. 62: Les microorganismes présents chez des souris Balb/C (lot témoin).

La répartition de ces microorganismes chez les souris est variable de l’une à

l’autre. Les levures, Alcaligenes faecalis et Streptococcus sont présents dans la flore de

toutes les souris étudiées. Tandis que Staphylococcus apparaît chez la moitié des souris (3

sur 6), ce ci peut s’expliquer par une simple contamination ou envahissement de cette

bactérie dans leur intestin. E.coli présente chez 4 souris parmi les 6 souris étudiées, ce qui

explique l'appartenance de cette bactérie à la flore colique normale des souris.

151

Résultats

L’analyse des selles des souris avant toute expérimentation ne révèle aucune

présence de Enterococcus faecium. H.pylori n'a pas été observée sur un frottis réalisé à

partir de biopsie gastrique d'une souris témoin (figure 63). L'observation microscopique

de la muqueuse a révélé que ce tissu est constitué d'un épithélium reposant sur le chorion.

L'épithélium muqueux est formé d'une seule couche de cellules présentant de nombreuses

invaginations: les cryptes profondes, ou fovéoles qui s'étendent profondément dans la

muqueuse. Alors, après infection des souris par H.pylori, la coloration de Gram des

biopsies gastriques prélevées au cours des 2 phases de l'observation (21j et 30 j) a montré

la présence de ce pathogène sur la muqueuse gastrique ainsi une érosion des cellules

épithéliales superficielles, un rétrécissement des corps glandulaires et la présence des

amas cellulaires de petite et de grande taille dans le chorion (Lamina propria) qui indique

une activité inflammatoire de Helicobacter pylori. Ces amas ont l'aspect des follicules

(figure 64).

Cg:corps du glande, Cr: crypte

Fig.63: Aspect d'une biopsie gastrique prélevée de l’estomac d’une souris (lot témoin) après

coloration de Gram (10X100). 152

Résultats

Hp: Helicobacter pylori, ED:épithélium endommagé, AC: amas cellulaire, C:chorion

Le dénombrement de la souche TN2GF4 réalisé sur gélose Brucella à partir des

fragments biopsiques prélevés et broyés, a donné un taux qui varie de 1,5x105 à 1,2x 106

UFC/mL. Les colonies sont transparentes et luisantes et ont une catalase, une oxydase et

une uréase (Figures 65).

A partir de la 2éme phase (30 j) on note une augmentation de la population d’H

pylori pour atteindre son maximum soit 2,9x106 UFC/mL. Avec un taux d’accroissement

égal à 52.42% entre les moyennes des 2 phases de lot 2. Après 3 semaines post infection

dans le groupe traité, la culture d’ H.pylori effectuée sur des fragments des biopsies

gastriques prélevés de 6 souris infectées avec la souche TN2GF4 montre un nombre de

bactéries variant de 1,8x105 à 1,2x106 UfC/mL. Ce ci indique la colonisation de la

muqueuse gastrique des souris par la souche TN2GF4.

Fig.64: Aspect d'une biopsie gastrique prélevée de l’estomac d’une souris infectée par H.pylori après

coloration de Gram (10X100).

153

Résultats

Ce nombre commence à diminuer après l’administration de E.faecium soit de

1,2x106 à 1,6x105 UFC/mL à J 30. E.faecium réduit la colonisation d’H pylori chez les

souris, en effet du nombre du 4,9.105 à 2,8.105 UFC/mL soit un abaissement de 42,86 %

entre les moyennes des 2 phases de lot 3. Ces résultats sont confirmés grâce à l’analyse de

la variance au seuil de 5% appliquée à l’évolution du nombre de H pylori au niveau de

deux lots (Hp, Hp+Ec.f). Cette analyse montre qu’il y a une différence hautement

significative entre le groupe infecté et le groupe traité. En effet la charge d’H pylori dans

les souris traitées avec E.faecium est diminuée de prés un log comparée avec les souris

recevant H pylori seul durant les 2 phases (Figure 66). Les deux colonnes représentent

la moyenne de la charge de TN2GF4 dans les 6 souris. Une analyse statistique réalisée

avec un test t de Student entre le groupe infecté et le groupe traité par E.faecium montre

une différence hautement significative (α=0.05).

Fig.65: Aspect des colonies de Helicobacter pylori isolées sur gélose au sang d'une biopsie gastrique

prélevée de l’estomac d’une souris infectée après incubation à 37oC pendant 5jours sous atmosphère

microaérophile.

Colonies H.pylori

154

Résultats

Fig. 66:Nombre de colonies d’H pylori avant et après traitement par Enterococcus

faecium (J21 et J30).

L’analyse des selles des souris traitées par la bactérie lactique a révélé la

présence de Enterococcus faecium avec des concentrations fécales variaient de 6x 105 à

1.03x 106 UFC/mL. La souche Enterococcus faecium (B13) a un effet inhibiteur de la

souche TN2GF4 de Helicobacter pylori. La bactérie lactique B13 a réduit le nombre de

H.pylori à 42,86 % entre les moyennes des 2 phases, ce qui montre que cette bactérie peut

inhibé la croissance de ce pathogène en réduisant sa colonisation. Cette bactérie résiste

bien aux conditions physiologiques du tube digestif (pH, sels biliaires, etc…). Elle répond

aux conditions des bactéries probiotiques (Figure 67).

69

155

Résultats

Fig. 67: Culture de Enterococcus faecium à partir des selles des souris traitées

156

DISCUSSION

Discussion

1. Isolement et caractérisation des souches d'Helicobacter pylori:

H. pylori est l'agent pathogène qui infecte l'homme, on estime 50% de la

population mondiale. Il s'agit d'une cause commune de dyspepsie et d'ulcère gastro-

duodénal potentiellement curable (Malfertheiner et al. 2012). Le diagnostic de

l’infection à H. pylori se fait le plus souvent à partir des biopsies antrales ou fundiques

prélevées au cours de l’endoscopie par le gastroentérologue. Différents tests sont possibles

tels: un examen histologique des biopsies permet de détecter la présence de H. pylori par

examen microscopique ; la mise en culture des bactéries à partir des biopsies peut

également être réalisée ; des tests moléculaires d’amplification génique permettant la

détection rapide de H. pylori et la détermination de sa sensibilité à la clarithromycine

(Zine-Charaf, 2007).

Pour cela nous avons procédé à isoler et caractériser des souches de Helicobacter

pylori à partir des biopsies gastriques prélevées par endoscopie digestive haute des

patients d'âge et de sexe différents. Après observation microscopique des frottis préparés à

partir des biopsies gastriques, une culture des broyats des biopsies a été faite sur gélose

Muller Hinton additionnée au sang de cheval et deux antibiotiques et gélose pylori

(Biomérieux) dont nous avons observé des petites colonies transparentes après incubation

à 37oC pendant 7jours sur gélose Muller Hinton. Ces résultats montrent la possibilité

d'isoler H.pylori sur cette gélose et la présence de cette bactérie chez les deux sexes.

D'après Faik et Raiss, (1998), l’examen bactériologique nécessite des biopsies

conservées dans le sérum physiologique à 4°C. Il faut utiliser un milieu de transport si le

délai entre le prélèvement et la réalisation de l’examen dépasse 4 heures, au delà de 24

heures, la congélation à -70°C permet de retarder l’étude. Après coloration de Gram, les

bacilles à Gram négatif sont recherchés sur l’ensemble du frottis. Ensuite la culture de la

biopsie broyée est ensemencée dans deux milieux dont l’un est sélectif, et incubée à 37°C

sous une atmosphère microaérophile .

Les études de Cassel-Béraud et al. (1996) réalisées pendant une période de 8

mois, dont l’infection à Helicobacter pylori a été recherchée chez 140 patients qui

157

Discussion

présentaient une symptomatologie digestive haute, par les méthodes classiques

bactériologiques (coloration de Gram, test à l’urée, mise en culture) et histologiques ont

permis l’identification de cette bactérie à partir de prélèvements biopsiques de la

muqueuse antro-pylorique. La prévalence de l’infection à H. pylori était de 59 %. Les taux

de prévalence ne semblaient pas différer selon l’âge et le sexe mais l’infection à H. pylori

était significativement plus fréquemment retrouvée chez des malades présentant un ulcère

duodénal évolutif (30 cas sur 41) que chez les patients ayant une endoscopie normale (21

cas sur 47)(p<0,02).

Cette bactérie a été aussi isolée viable dans les selles d'une personne infectée de

la Gambie. Le micoorganisme a été cultivé sur un milieu sélectif après concentration de

bactéries fécales par centrifugation dans un tampon équilibré avec un mélange de gaz

microaérophile. Les caractéristiques de croissance, les apparences microscopiques, et les

activités enzymatiques de H.pylori étaient les mêmes que celles d'un isolat de type

gastrique. Des préparations de protéines dérivées de la nouvelle souche sont de type

antigéniquement similaires, et de profils électrophorétiques très similaires (y compris les

deux bandes de protéines majeures de 62 et 26 kDa, correspondant aux sous-unités

d'uréase) (Thomas et al. 1992).

Plusieurs milieux de culture ont été proposés pour isoler Helicobacter pylori.

Piccolomini et al. (1997), dans une étude ont pu comparés huit milieux de culture, quatre

non sélectifs et quatre sélectifs, et de déterminer la meilleure combinaison de milieux de

culture pour l'isolement primaire de Helicobacter pylori. Sur une période de 5 mois, des

biopsies de la muqueuse antrale ont été obtenues par endoscopie digestive haute de 222

patients dyspeptiques. Les biopsies ont été étalées en parallèle sur l'ensemble des huit

milieux. La gélose en émulsion de jaune d'oeuf (EYE), milieu de Skirrow, milieu de Dent

et le milieu modifié de Thayer-Martin ont été utilisés comme milieux sélectifs. Alors, la

gélose chocolat modifiée (MCHOC), gélose de soja Triptycase (TSA), gélose Brucella, et

la gélose coeur-cervelle ont été utilisées comme des milieux non sélectifs. Dans

l'ensemble, à l'aide de ces huit milieux, H. pylori a été récupérée à partir de biopsies de

114 sur 222 patients, soit un taux d'isolement de 51%. En comparaison de toutes les

combinaisons possibles des huit milieux de culture, le taux le plus élevé de l'isolement de

158

Discussion

H. pylori a été de 100% (114 sur 114) avec EYE-MCHOC, suivie par 96,5% (110 sur

114) lorsque EYE-TSA a été utilisé. A l'inverse, ils ont constaté qu'aucun des milieux

utilisés seuls donne un taux de 100% de récupération. Par conséquent, l'utilisation des

milieux sélectifs et non sélectifs en parallèle offre un optimal de récupération de H.pylori.

Un travail de Otth et al. réalisé en 2011 dans le sud du Chili sur 240 patients ont

une gastrite ou un ulcère gastrique, chaque biopsie gastrique a été homogénéisée et

ensemencée sur une gélose au sang contenant un mélange sélectif des antibiotiques

(supplément DENT). Des boites de Pétri ont été incubées à 37 ° C dans un environnement

microaérophile pendant cinq jours. H. pylori a été isolée à partir de 99 patients (41,3%)

avec une fréquence légèrement plus élevée chez les femmes (42% des cultures positives)

que les hommes (40,2% des cultures positives). En ce qui concerne l'âge et le niveau

d'éducation, les fréquences les plus élevées d'isolation ont été obtenus chez des patients

entre 21-30 ans (55%) , 41-50 ans (52,6%) et 43,9% du secondaire et 46,2% de

l'université.

En Algérie, Allem et al. (2007), ont isolé une souche de H.pylori à partir d'une

biopsie gastrique prélevée à 2 cm du pylore d'un patient présentant un ulcère. Cette

biopsie est broyée dans 0.5 mL de bouillon nutritif et ensemencée dans des boites de Pétri

contenant de la gélose chocolat. Elles sont mises dans une jarre sous atmosphère

microaérophile pour une incubation de 5 jours à 37oC. Pour l'enrichissement, les colonies

suspectes sont mises dans un bouillon glucose tamponné additionné du sang de cheval.

L'identification a été faite par l'appréciation de la morphologie de cette bactérie; des

caractères biochimiques tels que: l'oxydase, l'uréase, la catalase et la production d'H2S sur

TSI sont également recherchés.

Après culture, un examen microscopique d'un frottis préparé à partir des colonies

suspectes, nous a permis d'observer des fins bacilles à Gram négatif qui peuvent être de

Helicobacter pylori. Ces caractères ont été démontrés par les travaux de Sobhani et al.

(1995).

Nos résultats de l'identification des souches isolées de H.pylori ont montré que

ces souches possèdent d'une part une activité uréasique très marquante exprimée par le

changement de la couleur du milieu urée-indole de l'orange vers le rose au bout de 24h

159

Discussion

d'incubation, d'autre part, une oxydase et une catalase. Ces caractères biochimiques ont été

démontrés par Monteiro en 1995. Cassel-Beraud et al. (1996) ont constaté qu'après 60

min, le changement de la couleur du milieu urée - indole de l’orange au rouge indique la

présence de la bactérie dans la biopsie gastrique. Cette bactérie a une particularité très

marquante qui est la présence d’une activité uréase très intense ; cette propriété a été mise

à profit pour un diagnostic rapide, la sensibilité de cette méthode est comprise entre 71 et

91% à la 24ème heure. L’uréase de cette bactérie hydrolyse l’urée en ammoniac et en

bicarbonates dans le but de neutraliser l’acidité de l’estomac, un moyen pour adhérer aux

cellules du mucus (Sobhani et al. 1995).

H.pylori possède plusieurs facteurs de virulence, dont la mobilité flagellaire qui a

été reconnue dans différents modèles animaux et semble essentielle à la colonisation de la

muqueuse gastrique et à la persistance d’infections chroniques (Fauconnier, 1998).

D'après Mégraud et Lehours, (2007) le cytochrome oxydase est présent dans tous les

membres du Epsilonproteobacteria. Il est habituellement détecté avec des réactifs

spéciaux sur un disque ou une bande. La catalase est aussi présente dans tous les

Helicobacters et la plupart des membres de la Campylobacteraceae et est détectée par

l'introduction d'une anse de bactéries dans une goutte de peroxyde d'hydrogène et

l'observation d'une production très abondante de bulles. L'uréase est certainement le plus

important enzyme pour l'identification. Pour survivre dans sa niche écologique, H. pylori

produit de grandes quantités de cette enzyme à tamponner le milieu acide et crée un

micro-environnement.

Selon Dunn et al. (1997) les souches de H. pylori sont des spirales à Gram

négatif et microaérophiles. Des bactéries qui démontrent des extrémités arrondies dans des

échantillons des biopsies gastriques. Toutefois, lorsqu'elles sont cultivées sur un milieu

solide, les bactéries prendre une forme analogue à une tige. Après une culture prolongée

sur des milieux solides ou liquides, généralement les formes coccoïdes prédominent. En

microscopie électronique, les formes apparaissent comme des coccis, ce sont des bacilles

avec les extrémités des deux bras reliés par une structure membraneuse. Les formes

coccoïdes sont métaboliquement inactives. Cependant, ils ne peuvent pas être cultivées in

vitro. En biopsies gastriques les H. pylori sont de 2,5 à 5,0 mm de longueur et de 0,5 à 1,0

160

Discussion

mm de largeur, il y a quatre à six flagelles unipolaires gainés, qui sont essentiels pour la

motilité bactérienne.

Des biopsies gastriques d'un échantillon de six patients sur 100 sont broyées et

leur ADN est extrait pour être quantifié par PCR en temps réel. Dans notre travail, la

détection qualitative à 640 nm a révélé la présence de deux souches d' H.pylori. Selon les

valeurs de Tm trouvées, H.pylori est sensible au clarithromycine (Wildtype).

L’amplification génique par PCR est une technique qui permet d’obtenir

rapidement de multiples copies d’un fragment d’ADN bactérien cible. Plusieurs

techniques sont utilisées : la PCR standard multiplexe et la PCR en temps réel détectent

plusieurs cibles (présence de H. pylori et résistance à la clarithromycine) et la PCR

multiplexe couplée à l’hybridation sur bandelette détecte en plus la résistance aux

quinolones. Les performances diagnostiques sont supérieures à celles de l’histologie et de

la culture. Elle nécessite des conditions de transport moins contraignantes que la culture.

L’amplification génique a une excellente sensibilité et spécificité pour le diagnostic de

l’infection par H. pylori et permet la détermination des principales mutations impliquées

dans la résistance aux macrolides et aux fluoroquinolones (Lamarque et al. 2012).

Selon Debongie, (1998), la biologie moléculaire est utile dans l’étude de la

pathogénicité et de l’immunisation vis-à-vis Helicobacter pylori. La description récente

du génome de H. pylori amène la biologie moléculaire à l’avant plan dans la recherche

concernant H. pylori. La PCR est considérée comme la méthode la plus sensible pour la

détection de micro-organismes. Ceci rendrait le test particulièrement utile dans

l’évaluation de l’éradication. D’autres indications incluent la détection de H. pylori en

dehors de l’estomac, même si H. pylori n’est présent qu’en petit nombre parmi beaucoup

d’autres micro-organismes provoquant des faux positives dans d’autres tests basés sur

l’uréase ou la culture. H. pylori a ainsi été trouvée par PCR au niveau de la bouche et les

selles.

161

Discussion

La résistance au clarithromycine peut être expliquée par une diminution de

l'affinité des ribosomes de H. pylori pour les macrolides. Le support génétique de cette

résistance a été initialement déterminé par Versalovic et al. (1996): il s'agit bien de

mutations dans le gène de l'ARNr 23S. La quasi-totalité des souches résistantes présente

une mutation: les mutations A2143G et A2144G sont les plus fréquentes. Ils ont montré

qu'une mutation sur l'une des deux copies du gène de l'ARNr 23S était suffisante pour

conférer la résistance. Une forte association a ainsi été démontrée entre la résistance aux

macrolides, l'absence de fixation de l'antibiotique sur le ribosome, et la présence d'une

mutation dans le gène de l'ARNr 23S en position 2143 ou 2144. Il est donc maintenant

bien admis que ces mutations sont à l'origine de la résistance aux macrolides de la très

grande majorité des souches (Sevin et al. 2000).

Dans notre travail, la méthode de PCR en temps réel comprenait une détection

simultanée des amplicons par hybridation de deux sondes marquées avec LC-Red et la

fluorescéine en utilisant la technique du transfert de fluorescence par l'énergie de

résonance (FRET) et une analyse des courbes de fusion avec le LightCycler

thermocycleur. En 2003, Oleastro et al. ont développé une PCR en temps réel qui est une

méthode rapide et précise pour détecter ces mutations directement sur les échantillons

biopsiques. Dans leur travail, le test a été appliqué avec succès sur des souches de

référence, des plasmides de référence et des biopsies H. pylori-négatifs. Des biopsies de

200 patients ayant échoué d'une première tentative d'éradication et pour lesquels la souche

H. pylori était disponible, sont testées avec la nouvelle méthode. Un résultat a été obtenu

dans 199 cas, un seul génotype a été détecté dans 157 cas, deux génotypes ont été détectés

dans 41 cas et trois génotypes ont été détectés dans un cas. Dans quatre cas avec des

résultats discordants, la PCR en temps réel a détecté la population résistante à une

concentration si faible qu'il ne pouvait pas être détectée par la méthode phénotypique,

tandis que dans trois cas d'autres mutations pourraient être impliqués. Ce dosage a une

précision au moins aussi satisfaisante que celle des essais phénotypiques et peut être

réalisée dans 2 h, ce qui lui permet d'être utilisé avant l'administration de la thérapie dans

le cas d'une première élimination de H. pylori.

162

Discussion

Pour mieux comprendre l'effet de H.pylori sur la muqueuse gastrique, un examen

anatomopathologique et cytologique au microscope optique est réalisé sur des coupes

histologiques préparées à partir des biopsies gastriques et colorées par l'Hématoxyline –

éosine et par le Giemsa lent. L'observation a montré la présence des bâtonnets incurvés

d'H.pylori à la surface de l'épithélium gastrique et dans la lumière glandulaire des trois

patients. La présence de ce pathogène a provoqué une gastrite chronique chez un homme

âgé de 43 ans, marquée par une atrophie glandulaire et un infiltrat dense surtout en surface

ainsi que la présence d'un foyer de polynucléaires neutrophiles dans le chorion . Alors les

autres patients (homme âgé de 19 ans et une femme de 64 ans), l'observation

microscopique de leurs tissus indique la présence d'un petit nombre de H.pylori. Cette

bactérie a provoqué une gastrite aigue d'intensité légère.

L'examen histopathologique permet en plus de la détection de H.pylori, l'étude de

l'état de la muqueuse; il est indispensable au diagnostic, au typage, au grading et à la

stadification des lésions associées à l'infection. Il permet de visualiser des

microorganismes sous forme de bâtonnets, en S et/ou en virgule, à la surface de la

muqueuse gastrique, dans le mucus au contact de l'épithélium de revêtement de surface et

des cryptes. L'ingestion de ce pathogène provoque une inflammation aigue dont en

absence de guérison, la colonisation bactérienne persiste à la surface de la muqueuse

entraînant une gastrite chronique active. S'y associe fréquemment une réaction lymphoïde

folliculaire (MALT aquis) induit par H.pylori ( Zine-Charaf, 2007).

Plusieurs facteurs interviennent dans la colonisation de la muqueuse gastrique

chez l'Homme. Selon Occhialin et Megraud, (2002) Helicobacter pylori est un bacille à

Gram négatif de forme hélicoïdale qui colonise la muqueuse gastrique de l'homme, 50 %

de la population mondiale est infectée par cette bactérie. Il s'agit donc de l'infection

bactérienne chronique la plus répandue au monde. L'infection a lieu pendant l'enfance et

peut perdurer pendant toute la vie du sujet infecté. Elle induit toujours une lésion de la

muqueuse gastrique qui, dans la majorité des cas, reste asymptomatique. Une minorité de

sujets infectés (10 % au total) développe une pathologie gastrique grave telle que la

gastrite chronique, l'ulcère duodénal ou gastrique, et deux types de néoplasie,

l'adénocarcinome et le lymphome du Malt (mucosa associated lymphoid tissue) de type B.

163

Discussion

2. Isolement et caractérisation des souches de bactéries lactiques:

Le lait cru par sa richesse en substances nutritives (protéines, graisses, glucides,

vitamines…etc), constitue un milieu favorable pour le développement des germes. Il

s’agit de germes saprophytes et parmi eux, on trouve les streptocoques lactiques et les

lactobacilles. Ainsi, le lait cru représente une source de nouvelles souches de bactéries

lactiques pouvant présenter des potentialités fermentaires intéressant les industries

alimentaires et pharmaceutiques (Kacem et al. 2002). Les laits de mammifères qui ont

une importance économique et nutritionnelle sont avant tout les laits de vache, chèvre et

de brebis. Dans certaines régions spécifiques, le lait d'autres mammifères est également

exploité: c'est le cas par exemple du lait de chamelle (Afrique et Asie) (Chau et al. 2008).

Dans ce contexte, notre étude s'intéresse à isoler et caractériser des souches de

bactéries lactiques ayant une activité bactériocinogénique qui peuvent être utilisées pour

lutter contre la bactérie pathogène Helicobacter pylori. Pour cela, des échantillons du lait

cru de vache, chèvre et brebis prélevés de Miliana et Ain Defla; et d'autres échantillons du

lait cru de chamelle prélevés de Biskra et Tamanrasset ont subi des analyses dans le but de

déterminer leur qualité microbiologique. Les résultats du test de la réductase indiquent que 9

échantillons du lait cru sur 24 décolorent le bleu de méthylène en moins de deux heures.

Selon ALP, (2009), le test de la réductase, très utilisé dans l’industrie laitière,

représente une méthode indirecte simple pour surveiller la charge microbienne du lait cru.

La "réductase" figure parfois dans des contrats d’achat de lait en tant que critère de

qualité. Lors du test de la réductase, la charge en germes du lait est mesurée indirectement

par la diminution du potentiel Redox, qui résulte de l’activité métabolique des

microorganismes qui consomment l’oxygène du lait. Enfin, le bleu de méthylène est réduit

et le lait se décolore. De propres enzymes et d’autres composants du lait tels que la

vitamine C, la riboflavine et le cuivre mais également la lumière ont un impact sur la

réduction du bleu de méthylène. De plus, les différents microorganismes présentent

également des grandes différences par rapport à leur capacité à décolorer le bleu de

méthylène.

164

Discussion

Nos résultats de dénombrement du germes mésophiles totaux montre que 9

échantillons sur 30 ont un nombre élevé de 105 germes/ mL. Alors que le taux de

streptocoques et les coliformes fécaux, Staphylococcus aureus, Clostridium sulfito-

réducteurs a révélé soit un nombre inférieur à celui cité par le journal officiel algérien (105

germes/ mL) soit une absence totale de ces microorganismes dans l'échantillon analysé

(JORA, 1998).

D'après FAO, (1998), le lait traité aseptiquement d'un animal parfaitement saint,

est normalement dépourvu de micro-organismes. A la sortie des mamelles, le nombre de

germes est très faible généralement inférieur à 5000/mL. Ils proviennent de l'extérieur et

pénètrent dans la mamelle par le canal du trayon. Dans le cas d'infections de la mamelle,

le nombre de germes augmente peu (sauf dans le cas de mammites cliniques), mais ils

sont en majorité constitués de bactéries pathogènes, notamment les staphylocoques ou les

streptocoques. Ainsi, hormis les maladies de la mamelle, l'ensemencement du lait se fait

au cours des diverses manipulations dont il est l'objet à partir de la traite. Le niveau de

contamination est étroitement dépendant des conditions d'hygiène dans lesquelles sont

effectuées ces manipulations, à savoir l'état de propreté de l'animal et particulièrement

celui des mamelles, du milieu environnant (étable, local de traite), du trayon, du matériel

de récolte du lait (seaux à traire, machines à traire) et, enfin, du matériel de conservation

et de transport du lait (bidons, cuves, tanks). A noter qu'il est généralement moins élevé

dans le cas de la traite manuelle que dans la traite mécanique, car cette dernière met en

œuvre un équipement plus important et plus difficile à nettoyer.

Loumani et al. (2013) ont pu isoler et identifier 8 souches de Streptococcus

thermophilus et Lactobacillus bulgaricus à partir de 4 échantillons du yaourt collectés de

différentes régions de l'Algérie, telles que: Relizane, Oran, Ain Temouchent et

Mostaganem. Le contrôle de qualité hygiénique a révélé l'absence des bactéries

pathogènes (coliformes totaux et fécaux, Staphylococcus aureus et Salmonella) et la

présence de quelques levures qui n'influent pas sur la qualité du yaourt.

165

Discussion

Afin d'isoler des bactéries lactiques, on a réalisé des dilutions décimales à partir

des échantillons du lait cru représentant une bonne qualité microbiologique. La dernière

dilution a été ensemencée en surface de la gélose M17. Les souches mésophiles sont

incubées à 30oC et les thermophiles à 45oC. Après 24h à 48h, des colonies blanchâtres,

rondes à contour régulier apparaissent à la surface de la gélose.

Parmi les bactéries lactiques isolées dans notre travail 30 ont été purifiées et

identifiées dont leur coloration de Gram montre que les cellules bactériennes sont des

coques à Gram positif. Toutes les souches isolées sont homofermentaires, ne possédant ni

de la catalase ni de l'oxydase. L'identification biochimique et physiologique montre que

les échantillons du lait cru prélevés contiennent les espèces suivantes: Lactococcus lactis

subsp. lactis (36,66%), de Lactococcus lactis subsp. cremoris (30%), de Enterococcus

faecium (20%) et Lactococcus garvieae (13,33%). Ces souches hydrolysent l'esculine et

sont dépourvues de β-glucuronidase, de phosphatase alcaline et de pouvoir hémolytique.

Elles fermentent le Ribose, Mannose, Lactose et Tréhalose, mais pas le glycogène. Ces

bactéries lactiques produisent aussi de l'acétoine. La mesure de l'activité acidifiante de ces

souches montre que le meilleur pouvoir a été enregistré au bout de 24 h avec les deux

souches de Lactococcus lactis subsp. cremoris :B30 et B28, la quantité d'acide mesurée

égale à 45 oD et 40 oD, respectivement.

D'après Ammor et al. (2006) ; Monnet et al. (2008), les bactéries susceptibles

d'être produites et utilisées comme ferments lactiques ne doivent évidement pas présenter

de caractère pathogène et ne pas générer de substances toxiques. C’est le cas de la plupart

des espèces de bactéries lactiques, qui possèdent le statut GRAS (Generally Recognized

As Safe).

La fonction acidifiante constitue la propriété métabolique la plus recherchée des

bactéries lactiques utilisées dans les industries alimentaires. Elle se manifeste par la

production de l’acide lactique à partir de la fermentation des hydrates de carbone au cours

de la croissance bactérienne (Mäyrä-Mäkinen et Bigret, 2004 ; Monnet et al. 2008).

Une dominance des souches de Lactococcus a été observée dans nos échantillons

utilisés dans notre travail. Cette dominance de Lactococcus a été aussi trouvée par les

travaux de Kacem et al. (2002). Ils ont isolées 117 bactéries lactiques à partir de 18

166

Discussion

échantillons du lait de vache, brebis et de chèvre prélevés de la région de l'ouest Algérien.

Parmi ces souches isolées 95 sont des lactocoques: 37 souches de Lactococcus lactis

subsp. lactis, 26 souches de Lactococcus lactis subsp. diacetylactis et 32 souches de

Lactococcus lactis subsp. cremoris.

En 2006, Zadi-Karam et Karam ont permis d'isoler et identifier sur 8

échantillons du lait cru de chamelle prélevés de deux régions Timimoun et Béchar des

souches de Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Lactococcus cremoris et Lactococcus

lactis.

Badis et al. (2005) ont isolé des souches de Lactococcus à partir de 19

échantillons de lait provenaient de chèvres de la population Arabia de Djelfa et de la

population Kabyle de Tizi ouzou. Le genre Lactococcus représente 22.9% des souches

isolées de la population Kabyle, alors dans la population Arabia le même genre bactérien

est représenté par 31.02%. L'identification morphologique, physiologique et biochimique

a permis de rattacher 14 isolats qui convient à l'espèce Lactococcus lactis subsp. lactis.

Nous avons identifié dans nos échantillons du lait cru une espèce Ec.faecium.

Ces résultats supposent que les conditions de la traite et de stockage des laits sont

défavorables aux espèces d'origine fécale.

Le travail de Cheriguene et al. (2007) sur des échantillons du lait cru de vache a

permis d'isoler 153 souches de bactéries lactiques. Les souches ont été identifiées selon

les critères morphologiques, biochimiques et physiologiques en utilisant le système Api et

la technique d'électrophorèse SDS-PAGE. L'identification a rélevé la présence de six

genres dans les échantillons du lait: Enterococcus(41,82%), Lactobacillus (29,40%),

Lactococcus (19,60%), Leconostoc (4, 57%), Streptococcus thermophilus (3,26%), et

Pediococcus (1,30%). Les espèces identifiées sont présentées par Enterococcus faecium

(24), Enterococcus durans (22), Lactococcus lactis subsp. lactis (25), Lactobacillus

rhamnosus (9) et Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus (7).

D'après Aguilar-Galvez et al. (2012), les bactéries les plus couramment

présents dans les fromages sont E. faecium, E. faecalis et E. durans, aussi bien les

fromages à base de lait cru que de lait pasteurisé, retrouve moins souvent E. casseliflavus.

Les entérocoques ont un rôle important dans la maturation de plusieurs variétés de

167

Discussion

fromages, probablement en raison de leur activité protéolytique, lipolytique, de leur

capacité de production du diacétyle et d’autres composants volatils contribuant à

l’aromatisation, la flaveur et au goût caractéristique. Les Enterococcus sont des coccoïdes,

à Gram positif, oxydase et catalase négatives. Certaines espèces présentent une activité

pseudo-catalase. Ils sont généralement des anaérobies facultatifs et non mobiles. Les

cellules sont ovoïdes et se présentent sous forme de cellules isolées, par paire ou encore

sous forme de chaînette. Généralement, les entérocoques produisent des colonies de

couleur blanche. Les entérocoques capables de croître dans des conditions extrêmes

(milieux très alcalins, hypothermie à 10oC ou hyperthermie à 60oC, sels biliaires) (Dupont

et Plantefève, 2002). L'isolement et l'identification des bactéries lactiques fait l'objet de

Bekhouche et Boulahrouf, (2005). Les dénombrements et l’identification des bactéries

lactiques isolées à partir de lait cru de vaches appartenant à six stations d’élevage de la

région de Constantine ont été effectués. Le nombre moyen de bactéries lactiques varie de

0,579x 107 à 11,40x 107 UFC/mL. Sur 1645 souches isolées 1000 souches ont pu être

purifiées et identifiées. Il s'agirait des genres Streptococcus (147 souches), Lactococcus

(121), Enterococcus (95), Leuconostoc (272), Lactobacillus (197) et Pediococcus. (168).

L’étude des caractéristiques biochimiques et physiologiques a permis d’identifier soixante

six souches aux espèces suivantes : Lactococcus lactis subsp.lactis (2), Lac. lactis subsp.

cremoris (1), Enterococcus faecium (5), Ec. faecalis (2), Ec. durans (1), Streptococcus

thermophilus (8), Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (9), Ln. lactis (7),

Pediococcus acidilactici(4), Pc. urinae equi (7), Pc. pentosaceus (1), Pc. parvulus (4) et

Pc. dextrinicus (1). Dans le genre Lactobacillus , 14 souches sont classées parmi le groupe

Betabacterium et appartiennent aux espèces Lactobacillus cellobiosus (10), Lb. brevis ou

Lb. buchneri(4). Les quatre dernières souches appartenant au groupe Thermobacterium se

rapprochent des espèces suivantes : Lactobacillus delbruekii (1) et Lb. acidophilus (2) et

au groupe Streptobacterium avec comme espèce Lb. plantarum (1).

Maghnia et al. 2013, ont isolé 39 souches de bactéries lactiques du fromage

artisanal de la région d'Oran. Ces souches appartiennent au quatre genres, dont 49% sont

des souches de Lactobacillus, 20% de Lactococcus, 18% de Leuconostoc et 13%

d'Enterococcus. Une dominance de Lactococcus lactis et Lactobacillus dulbrueckii sp a

été constaté dans les échantillons du fromage.

168

Discussion

3. Etude de l'activité antibactérienne in vitro:

Le système digestif chez l'humain en santé pourrait contenir des espèces

bactériennes différentes. Le rôle biologique de ces bactéries est important pour la

régulation de la transition intestinale, la protection contre les bactéries pathogènes qui se

trouvent dans l'intestin, la stimulation du système immunitaire et la production des

vitamines. Les bactéries lactiques sont connues pour leur capacité d'adhésion aux cellules

épithéliales de l'homme: cette adhésion apparaît chez Lactobacillus acidophilus et les

Bifidobactéries. Ces souches sont connues pour leur forte capacité d'adhésion à la surface

de l'intestin, ceci peut les aider à résister aux conditions défavorables de l'intestin. De

l'autre côté, les bactéries lactiques peuvent empêcher l'adhésion de plusieurs bactéries

pathogènes par la sécrétion d'inhibiteurs d'adhérence (Matto et al. 2006). Reid et al.

(2003), ont clairement démontré l'application des bactéries lactiques dans la maintenance

de la santé humaine, ainsi que dans la stimulation du système immunitaire. Les bactéries

lactiques possèdent aussi des propriétés antitumorales contre le cancer du colon. De plus,

elles sont capables de diminuer le taux de cholestérol sanguin et elles présentent un effet

antidiabétique (Rafter , 2003). L'activité antagoniste des bactéries lactiques vis-à-vis des

bactéries pathogènes a été confirmée par plusieurs travaux. Les études de Makras et al.

(2006), ont montré une activité inhibitrice de Salmonella sp, Staphylococcus aureus et le

E. coli par des bactéries lactiques. Henni et al. (2013) ont montré aussi que deux souches

de Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbruekii subsp.bulgaricus isolées des

échantillons du lait cru de vache ont une activité inhibitrice de deux pathogènes

Staphylococcus aureus et Salmonella sp.

Les bactéries lactiques forment actuellement un groupe d’organismes utilisés

pour l'enrichissement de certains yaourts et laits. Cette utilisation est due aux effets

nutritionnels et thérapeutiques de ces bactéries car elles enrichissent le milieu où elles se

trouvent en vitamines (B et K), acides aminés, composés organiques (acides lactique et

acétique), enzymes (lactase) et bactériocines responsables de l'inhibition des bactéries

pathogènes. Les bactéries les plus fréquemment utilisées comme probiotiques sont des

Lactobacillus et des Bifidobacterium . Les lactobacilles ont été incorporés dans des laits

fermentés, des fromages et des glaces (Dib et al. 2012).

169

Discussion

Afin de rechercher des bactéries lactiques ayant un effet inhibiteur de la

croissance des souches de H.pylori, des interactions ont été faites entre 30 souches de

bactéries lactiques isolées du laits crus au cours de notre travail et des souches de

Helicobacter pylori (souches de références: 26695 ; J99 ; TN2GF4 et HPAG1, souche

clinique : HSA3068) proviennent du centre national de référence des Campylobacters et

des Helicobacters de Bordeaux, et deux souches Hp1 et Hp3 isolées au niveau de

laboratoire de bactériologie de l'hôpital Cochin, Paris . La méthode de diffusion sur gélose

permet d'obtenir des zones claires autour des disques imbibés par les précultures des

bactéries lactiques.

D’après nos résultats, les meilleures zones d'inhibition ont été trouvées avec les

deux souches E.faecium (B13) et Lc. lactis subsp. lactis (B01).Ces résultats montrent que

les bactéries lactiques ne présentent pas le même spectre d’action vis-à-vis les souches de

H.pylori. L'antibiogramme de la souche de réference TN2GF4 a révélé une sensibilité à

Amoxicilline, Clarithromycine et Levofloxacine, ainsi que ce pathogène est sensible aux

effet des deux bactéries B13 et B01. La souche J99 a montré une sensibilité vers les deux

bactéries lactiques E.faecium et Lactococcus lactis subsp. lactis exprimée par des zones

d'inhibition, mais elle résiste bien à l'effet de Amoxicilline et Clarithromycine. Les deux

souches Hp1 et Hp3 sont sensibles au Clarithromycine et aux effets inhibiteurs de

bactéries lactiques utilisées dans notre travail, dont le plus grand diamètre de la zone

d'inhibition est égale à 10mm, enregistré avec la souche Hp1.

Plusieurs travaux réalisés dans le domaine, montrent que les probiotiques ont des

effets bénéfiques dans le traitement de plusieurs maladies gastro-intestinales. Parmi ces

travaux, ceux de Allem et al. (2007), dont l’effet antagonique des souches de bactéries

lactiques vis-à-vis Helicobacter pylori a été évalué par la méthode de diffusion en gélose.

Des inhibitions ont été constatées avec les souches de Streptococcus thermophilus,

Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus et Bifidobacterium longum ; les

diamètres obtenus des zones d’inhibition sont entre 5 mm et 14 mm. L’analyse qualitative

des acides organiques par la chromatographie sur couche mince a montré la présence

d’acide lactique dans les cultures de bactéries lactiques. Leur activité antibactérienne est

170

Discussion

due à la production d’acide lactique. Lin et al. (2011) ont montré que des souches de

Enterococcus et Pediococcus ont un effet inhibiteur H.pylori.

Un autre travail effectuée in vitro par Medouakh et al. (2010) a pour but de

tester l'effet inhibiteur des souches de Lactobacillus isolées à partir du lait cru de chèvre,

en utilisant la méthode de puits. Les résultats montrent que toutes les souches utilisées

inhibent la croissance des souches cliniques de H.pylori, dont cette activité inhibitrice a

été perdu après neutralisation de surnageant des cultures de Lactobacillus. L'ajout de

surnageant de la culture de Lactobacillus rhamnosus 1 aux cultures de deux souches de

H.pylori(Hp1 et Hp2) a diminué la viabilité de ce pathogène de 105 au 103 UFC/mL après

24 h et aucune cellule viable a été trouvée après 72h pour Hp1 et après 60h pour Hp2.

Ces résultats ont confirmé que l'acide lactique est l'agent responsable de l'inhibition de

H.pylori.

Boyanova et al. (2009) révèlent qu'à un pH bas le diamètre moyen d'inhibition

des souches de H. pylori par Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus variait de 8-4 à

10-4 mm, alors à pH neutralisé le diamètre moyen d'inhibition variait de 7-7 à 9-0 mm.

Les écarts entre les activités de souches Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

contre les souches sensibles aux antibiotiques de H. pylori et contre les souches résistantes

aux antibiotiques n'étaient pas statistiquement important pour le métronidazole (P ≥ 0-

071), la clarithromycine (P ≥ 0-274) et les deux métronidazole et la clarithromycine (P ≥

0-054). À faible pH et neutralisé, la souche LB3 était active contre 11 et 8 de 12 souches

résistantes au métronidazole, respectivement, et contre quatre et trois de quatre souches

résistantes de clarithromycine de H.pylori, respectivement. De même, à un pH faible et

neutralisé, la souche LB2 est active contre 10 et 6 de 12 souches de H.pylori résistantes à

la métronidazole et contre quatre et deux de quatre souches de H.pylori résistantes à la

clarithromycine, respectivement. De plus, à la fois LB2 et LB3 inhibent la croissance de

trois (à pH faible) et deux (à pH neutralisé) de trois souches de H. pylori marquées une

résistance à la fois de métronidazole et la clarithromycine.

171

Discussion

D'après Aguilar-Galvez et al. (2012), les Enterococcus sont des bactéries

lactiques, ubiquitaires, trouvées fréquemment dans la flore microbienne du tractus gastro-

intestinal des animaux à sang chaud, ainsi que dans une variété de produits alimentaires.

Ils sont utilisés dans les aliments soit comme agents antimicrobiens, soit pour leurs

propriétés organoleptiques et parfois comme probiotique.

Le spectre d’inhibition des Enterococcus a été largement étudié et caractérisé

notamment au niveau de la lutte contre Listeria monocytogenes, Staphylococcus spp. et

Clostridium spp. (Ghrairi et al. 2008). López-Brea et al. (2008) ont testé l'effet de 32

souches de bactéries lactiques sur des souches cliniques de H.pylori par la méthode de

diffusion sur gélose. Parmi les souches utilisées une souche de Enterococcus faecium a

permis d'inhiber des souches de H.pylori.

Une autre souche de bactérie lactique parmi les souches isolées dans notre travail

a donné des zones d'inhibition vis-à-vis H.pylori, c'est la souche Lactococcus lactis subsp.

lactis (B01) qui possède une activité antibactérienne contre les souches à Gram négatif

d’H.pylori (J99, HSA3068, 26695, TN2GF4). Ces résultats vont dans le même sens que

ceux trouvés par Vinod Kumar et al. (2006) qui ont isolé du radis, une souche de

Lactococcus lactis qui possède une activité antibactérienne contre plusieurs espèces à

Gram négatif. La souche B25 (Lactococcus lactis subsp. cremoris) isolée du lait de

chamelle de Biskra a inhibé la croissance de quatre souches d'H.pylori: TN2GF4, J99,

26695 et HSA3068. Une souche de Lactococcus lactis subsp. cremoris isolée par

Elmoualdi et al. (2008) à partir de jus de presse de canne à sucre a inhibé in vitro la

souche Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Les propriétés antibactériennes des bactéries lactiques dépendent de plusieurs

critères: le pH, le milieu de croissance et la production de substances antibactériennes

comme les bactériocines, les acides organiques et le peroxyde d'hydrogène. La

fermentation des glucides est un procédé très important pour les bactéries lactiques.

L'acidification du milieu par l'acide lactique joue un rôle considérable dans la capacité

inhibitrice des bactéries lactiques contre plusieurs bactéries pathogènes , Hicks et

Goepfert en 1968 ont bien confirmé que l'acide lactique et l'acide acétique produits par

les bactéries lactiques participent à l'inhibition de Staphylococcus aureus. Ils ont démontré

172

Discussion

aussi que Salmonella pouvait être inhibée par le pH inférieur à 4.4 pour l'acide lactique et

à 5.4 pour l'acide acétique (Huttunen et al. 1995).

Pour déterminer l'agent inhibiteur de Helicobacter pylori, des associations

bactériènnes en milieu liquide ont été effectuées entre une souche de H. pylori isolée à

partir d'une biopsie gastrique d'un patient ayant un ulcère et de deux souches de bactéries

lactiques: Streptococcus thermophilus et Lactobacillus acidophilus. Les Surnageants

obtenus par centrifugation (12400tr/min pendant 10 min) des cultures bactériennes traitées

avec différentes températures: 100oC/60mn, 100oC/30mn et 121oC/15mn, sont analysés

par HPLC. L'analyse qualitative a montré la présence de l'acide lactique et l'absence de

l'acide acétique dans les deux surnageants obtenus, dont nous avons constaté une quantité

de 0,019 g / L sécrétée par Streptococcus thermophilus et d'une quantité de 0,058 g / L

sécrétée par Lactobacillus acidophilus (Guetarni et al. 2012).

D'après Vinod Kumar et al. (2006) , les bactéries lactiques produisent lors de

leurs croissance plusieurs composés actifs à savoir les acides organiques, du peroxyde

d’hydrogène et des substances naturelles de nature protéique (les bactériocines) douées

d’une activité antagoniste. Pour cela, l'effet des acides organiques et de peroxyde

d'hydrogène a été éliminé du milieu de culture.

Dans notre travail la culture bactérienne de Enterococcus faecium B13 a subi des

centrifugations, dont la fraction extracellulaire a montré un effet inhibiteur vis-à-vis les

souches d’H.pylori (TN2GF4, HSA3068, J99, 26695, Hp1 et Hp3) que l'extrait cellulaire

(culot). Ce ci indique que la substance inhibitrice est présente dans la fraction

extracellulaire. L’extrait cellulaire de culture de E.faecium (B13) a une activité inhibitrice

qui due à une molécule de nature protéique car elle est sensible aux enzymes

protéolytiques: Pepsine et Trypsine. Nos résultats suggèrent que le facteur antibactérien

produit est de nature protéique, c'est une bactériocine. Elle conserve son activité

antagoniste après avoir été soumise à des traitements thermiques assez élevés comparables

à la pasteurisation et la stérilisation du lait (60oC pendant 30min, 80oC pendant 10min et

100oC pendant 5min). Cette bactériocine est aussi stable à pH 4 et à pH 8. Ces

173

Discussion

caractéristiques confèrent à cette bactériocine un grand intérêt technologique dans la

bioconservation des aliments et la lutte contre les bactéries pathogènes.

Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont des peptides

antimicrobiens de faible poids moléculaire. Leur spectre d'action est généralement étroit.

Cependant, la plupart ont une activité contre des pathogènes alimentaire tel que Listeria

monocytogenes. L'application des bactériocines ou des souches productrices dans les

aliments pour y éviter le développement de bactéries pathogènes ou altérantes a donc été

envisagée (Dortu et Thonart, 2009). Des études furent conduites in vitro par Kang et

Lee, (2005) afin d'évaluer les effets inhibiteurs de E. faecium GM-1 sur H. pylori, souche

isolée des selles des nouveaux-nés. E. faecium GM-1 a été choisi pour sa capacité de

résister aux conditions physiologiques du tube digestif surtout l'acidité et la bile. Les

résultats montrent que le surnageant de culture de E. faecium diminue significativement le

taux de l'uréase sécrétée par H. pylori. Cette activité inhibitrice fut conservée après

l'ajustement du pH du surnageant de culture à neutralité. Toutefois, un traitement avec des

enzymes protéolytiques a diminué l'activité anti-H. pylori de GM-1. Par conséquent, une

ou des substances de E. faecium GM-1 autre que l'acide lactique pourraient être associées

avec cette activité inhibitrice.

Vinod Kumar et al. (2006) ont démontré que le pH optimal de production des

bactériocines par les bactéries lactiques est 6,5, de plus, ils ont confirmé que l’action de

ces bactériocines est maximale au même pH (6,5). Les bactériocines sécrétées par

Enterococcus faecium ont fait l'objet des études de Cintas et al. (1998). La bactériocine

Entérocine P qui a été purifiée d'une souche de Enterococcus faecium P13 appartient à la

classe II, sous classe IIa. Cette classe est douée d'une activité inhibitrice de Listeria spp.

Ces molécules présentent en effet, soit purifiées soit à travers leur production in situ par

une bactérie lactique, un très fort potentiel en protection alimentaire. Ces bactériocines

sont des peptides de taille réduite, comprise entre 37 et 48 résidus, qui possèdent de très

fortes homologies en séquence, en particulier dans leur moitié N-terminale. L'enterocine P

est responsable de la dissipation du ∆ψ à partir de cellules énergisées uniquement, et de

l'efflux de 86 Rb+, un analogue de K+, à partir de cellules énergisées.

174

Discussion


Nos travaux réalisés in vitro, ont montré une activité anti-H.pylori de la bactérie

lactique isolée du lait cru de chèvre de Miliana: Enterococcus faecium (B13). Cette

bactérie produit une substance de nature protéique douée d'une activité inhibitrice de ce

pathogène. Afin de déterminer l'effet probiotique de B13, des souris Balb/c, femelles,

âgées de deux mois sont utilisées comme modèle d'étude. Ces souris sont divisées en trois

lots, chaque lot contient 12 souris. Avant toute expérimentation les selles des souris du

groupe témoin ont subi une analyse microbiologique. Le but de ce contrôle est de

connaître surtout la présence de la bactérie lactique Enterococcus faecium. D'autres

microorganismes ont été recherchés comme: E.coli, Salmonella spp, Shigella spp,

Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Clostridium, Enterococcus spp, Lactobacillus

spp, Lactococcus spp, levures et moisissures. Le contrôle microbiologique des selles des

souris avant toute expérimentation n'a révélé aucune présence de Enterococcus faecium.

Les souris BalB sont utiles dans la recherche du cancer et l'immunologie. Ils

produisent des plasmocytomes avec l'injection de l'huile minérale, un processus important

pour la production d'anticorps monoclonaux. Ils sont également signalés comme ayant une

faible incidence de tumeurs mammaires, mais ne développent d'autres types de cancers à

l'âge adulte, les tumeurs les plus couramment connus sont des tumeurs pulmonaires et des

tumeurs rénales. La plupart des sous espèces ont une longue durée de vie reproductive, et

sont connus par des niveaux élevés d'anxiété et d'être relativement résistants à la diète

induite par l'athérosclérose, ce qui les rend un modèle utile pour la recherche dans les

maladies cardiovasculaires (The Jackson Laboratory, 1987).

La souris est un des animaux de laboratoire les plus utilisés. La microflore de la

souris est caractérisée par une grande dominance des bactéroïdes dans le cæcum et le gros

intestin. La microflore autochtone de la souris est constituée essentiellement des

streptocoques anaérobies qui apparaissent en premier après la naissance et persistent en

plus grand nombre dans tout l’intestin et l’estomac. On trouve également des

streptocoques, des microcoques et Clostridium welchii, et la présence de levures est

souvent constatée. E. coli est trouvé constamment, mais parfois en quantité proche de

175

Discussion

celui des lactobacilles et parfois en quantité bien plus faible. Enfin certaines espèces, par

exemple les Flavobacterium, apparaissent très transitoirement et uniquement dans

l’intestin grêle, puis disparaissent rapidement (Tannock 1997; Pena et al. 2004).

Avant l'infection de nos souris, un fragment de l'estomac d'une souris du groupe

témoin a été broyé dans quelques millilitres de bouillon BGT, pour assurer la dispersion

des cellules de Helicobacter pylori de la muqueuse gastrique. L'ensemencement de ce

broyat sur la gélose Brucella, à 37oC et sous une atmosphère microaérophile, n'a pas

donné des colonies de Helicobacter pylori après 3 à 5 jours d'incubation. Ce ci indique

que les souris utilisées dans cette étude ne sont pas infectées pas Helicobacter pylori.

Alors, après infection des souris par la souche TN2GF4, H. pylori a été détectée

avec succès dans la muqueuse gastrique des souris au cours des 2 phases de l’observation

(21 J et 30 J). Cette bactérie a provoqué une érosion de l'épithélium gastrique,

rétrécissement du corps glandulaire et l'apparition des amas cellulaires (petites et grandes

follicules) parsemés sur le chorion (Lamina propria). Un dénombrement de Helicobacter

pylori a été réalisé sur des cultures sur gélose Columbia du broyat des fragments

biopsiques de l'estomac des souris infectées. Après 3 à 5 jours d'incubation à 37oC sous

une atmosphère microaérophile, des colonies grisâtres et translucides apparaissent dont

leur nombre variait de 1,5x105 à 1,2x 106 UFC/mL.

Les souris sont inoculées par 0,5mL (109 CFU/mL), cette dose est administrée

trois fois pendant une semaine, avec un intervalle de 2 jours entre les inoculations. A

partir du 30 ème jour, le nombre de H.pylori commence a augmenté pour atteindre un

maximum de 2,9x106 UFC/mL, le taux d'accroissement est 52.42% entre les moyennes

des 2 phases de lot 2. Durant les 30 jours de l'infection, H.pylori colonise bien la

muqueuse gastrique de l'estomac des souris, elle se multiplie bien dans ce tissu, ce qui

montre une augmentation du nombre d'H.pylori.

La souche TN2GF4 a l'îlot de pathogénicité CagPAI, une CagA3', CagE et CagI.

D'après Zine-Charaf, (2007) les sujets infectés par H.pylori Cag+ présenteraient un

risque plus grand de développer un ulcère, un degré plus sévère d'inflammation, d'atrophie

176

Discussion

et de lésions précancéreuses avec une synthèse augmenté d'interleukine 8 et 6 au niveau

de la muqueuse gastrique, une concentration plus faible d'acide ascorbique dans le liquide

gastrique, et une probabilité plus grande de développer un lymphome gastrique de type

MALT. Le degré de sévérité des lésions dégénératives des cellules épithéliales de la

muqueuse gastrique est en corrélation avec le nombre de bactéries adhérentes à

l'épithélium, ce qui suggère que cette adhérence soit cruciale pour l'action cytotoxique de

la bactérie. L'adhérence est considérée comme une propriété indispensable à la

multiplication et à la persistance de la bactérie au contact de la muqueuse gastrique.

H.pylori se trouve majoritairement sous la couche de mucus, à proximité de la surface des

cellules épithéliales antrales ce qui témoigne de l'existence d'antigènes bactériens

(adhésines) capables d'interagir spécifiquement avec des récepteurs cellulaires de

l'épithélium antral. Outre un effacement des microvillosités au site d'attachement,

l'adhérence de H.pylori entraîne un réarrangement du cytosquelette cellulaire et la

formation d'un piédestal.

H. pylori colonise facilement l’estomac des souris, grâce à ses flagelles et sa

forme hélicoïdale. Elle glisse à travers la muqueuse de l’estomac et s’ancre aux cellules

épithéliales grâce à des adhésines. Elle secrète une uréase et en présence de protéines

transforme l’urée en ammoniac et CO2. Cette production d’ammoniaque crée un

microenvironnement tamponné autour de la bactérie et permet sa survie en milieu acide.

L’ammoniac est toxique pour les cellules épithéliales et va endommager la surface des

cellules épithéliales. Cependant aucun effet n’a été observé chez les souris groupe témoin

qui ne sont pas infectées par la souche TN2GF4.

Le traitement des souris par une dose de 107 CFU/mL de Enterococcus faecium

(B13) isolée du lait de chèvre diminue le nombre de TN2GF4 soit de 1,2x106 à 1,6x105

UFC/mL au J 30. Ce qui indique que la souche E.faecium (B13) réduit bien la

colonisation d’H pylori de la muqueuse gastrique des souris infectées et traitées. Cette

bactérie lactique a montré un effet inhibiteur de ce pathogène in vitro par la sécrétion

d'une bactériocine. Le dénombrement des colonies de H.pylori obtenus par culture sur

gélose, révèle un abaissement de 4,9.105 à 2,8.105 UFC/mL, un taux de 42,86 % entre les

moyennes des 2 phases de lot 3.

177

Discussion

Une analyse de la variance au seuil de 5% appliquée au nombre de colonies de

H.pylori au niveau de deux lots infecté et traité par E.faecium, dont la charge de H.pylori

est diminuée de prés un log après administration de E.faecium. Le test t de Student réalisé

entre le groupe infecté et le groupe traité a montré une différence hautement significative

(α=0.05). L’analyse des selles des souris traitées par la bactérie lactique a révélé la

présence de Enterococcus faecium avec des concentrations fécales variaient de 6x 105 à

1.03x 106 UFC/ml.

Les résultats trouvés in vivo indiquent clairement que la souche Enterococcus

faecium ne colonise pas l’épithélium intestinal et sera donc présente dans la microflore

seulement pendant la période de consommation. Elle est ensuite éliminée en quelques

jours sans colonisation durable. Durant son passage B13 sécrète des métabolites ayant une

activité inhibitrice de TN2GF4. Ces molécules peuvent être de l'acide lactique ou une

bactériocine, car in vitro cette bactérie a montré un pouvoir acidifiant par la synthèse

d'une faible quantité de l'acide lactique. Aussi après élimination de l'effet antibactérien des

acides organiques et de peroxyde d'hydrogène, B13 synthétise et sécrète dans le milieu

extracellulaire une substance de nature protéique, résiste bien à l'effet de la chaleur et

stable aux pH 4 et8.

L'analyse quantitative par HPLC a révélé qu' une souche de Streptococcus

thermophilus, qui a montré un effet inhibiteur important d'une souche de Helicobacter

pylori isolée chez un patient ayant l'ulcère gastrique, sécrète une faible quantité de l'acide

lactique estimée à 0,019 g / L (Guetarni et al. 2012).

Menad et al. (2012) ont démontré in vivo l'effet antibactérien des souches de

bactéries lactiques vis-à-vis Salmonella enterica sérotype typhimurium. Cette étude a été

menée sur des souris albinos suisses afin de connaître l'effet probiotique des souches de

référence Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus et

Lactobacillus paracasei en combinaison avec Bifidobacterium sp sur les complications

intestinales liées à la présence de Salmonella enterica sérotype typhimurium. Le nombre

de Salmonella enterica sérotype typhimurium diminue dans l'intestin, l'estomac et dans le

foie dans le cas d'un traitement préventif.

178

Discussion

Un travail réalisé in vivo par Doumandji, (2007) révèle que les probiotiques ont

un effet antibactérien sur des bactéries pathogènes impliquées dans la physiopathologie

gastro-intestinale. Une souche de Streptococcus thermophilus est associée à

Bifidobacterium bifidum dans du lait adapté au 1er âge. Le rapport respectif d’association

7/1 en nombre de cellules semble favorable à la croissance de B.bifidum. L’effet

antagoniste in vitro apparaît après 4 h de fermentation en présence de B. bifidum en

culture mixte avec S. thermophilus. Le pourcentage d’inhibition d’Escherichia coli est de

90 %. Ce pourcentage de diminution du nombre d’E. coli n’est observé qu’après 8 h de

fermentation en présence de B. bifidum seul. Une mortalité de 50 % est notée chez les

souris ayant reçu E. coli seul (lot 1). L’effet antagoniste in vivo lors d’un traitement

préventif est significativement plus important en présence des deux espèces associées (lot

3) que lorsque B. bifidum est donné seul (lot 2). Au niveau des lots 4 et 5 (traitement

thérapeutique), une diminution d’E. coli a été constaté au terme du 2ème jour après la prise

du lait fermenté au B. bifidum en culture mixte (lot 5) avec un taux de diminution de 89,52

%. Or cet effet n’est observé qu’après le 5ème jour de la prise du lait fermenté au B.

bifidum seul (lot 4).

Le devenir après ingestion d’une souche d’ Enterococcus faecium utilisée dans

un produit probiotique a été étudié par Lund et al. (2002). Ils ont montré que chez 8

volontaires sur 10 qui avaient consommé quotidiennement environ 109 UFC pendant 10

jours, que la bactérie était récupérée à des taux entre 103.1 et 106.6 UFC/g. Les auteurs

montraient aussi que la présence de la souche était transitoire et ne persistait pas après

l’arrêt de la consommation.

Des souches d'Enterococcus faecium isolées à partir de Chungkukjang ont une

résistance éprouvée contre les conditions gastro-intestinales telles que l'environnement

acide et des sels biliaires. Ces souches ont également montré une activité hydrolase des

sels biliaires, mais ni l'activité hémolytique ni le facteur de virulence a été détecté. Pour

cette raison, les souches pourraient être utilisées comme entrée ou des cultures de

couvertures sélectionnées dans la production alimentaire à partir de graines de soja

fermentées. Cette bactérie a montré une activité inhibitrice in vitro de la bactérie Listeria

monocytogenes (Yoon et al. 2008).

179

Discussion

La présence de Enterococcus faecium dans les selles indique que cette bactérie

résiste bien aux conditions physiologiques du tube digestif (bile, sécrétion pancréatique et

l'acidité de l'estomac). Durant son transit, cette bactérie n'a pas causé une pathologie chez

les souris par contre elle a inhibé la croissance de H.pylori. Cette bactérie transite dans le

système digestif et résiste à l’acidité gastrique et les sécrétions bilio-pancréatiques par un

passage rapide dans l’estomac. Tsai et al. (2004) ont observé que la souche Enterococcus

faecium TM 39 ayant la capacité de tolérer l’acide et les sels biliaires et inhiber la

croissance d’H pylori in vitro

Dans le modèle de souris, l’inhibition d’H pylori par Enterococcus faecium peut

se faire par différentes manières:

Diminution de synthèse d’ammoniaque: H. pylori possède une activité uréase et peut

produire de l'ammoniaque par hydrolyse de l'urée. Il peut donc contribuer à

l'hyperammoniémie (Gubbins et al., 1993) mais l’introduction d’ Enterococcus faecium

ralentie la synthèse de NH3. L'efficacité de l'administration d' Enterococcus

faecium (SF68) a été démontrée par les travaux de Loguercio et al. (1995) qui confirment

que cette bactérie dépourvue d'uréase diminue la synthèse colique d'ammoniaque.

Des effets immunomodulateurs : Ces effets ont été signalés par les travaux de Sun et al.

(2010). Cette étude a démontré que E. faecium SF68 affecte la flore microbienne

intestinale et module les réponses immunitaires par l’augmentation des niveaux

d'interleukine-4 (IL-4), l'interleukine-6 (IL-6) et l'interféron γ-(IFN-γ), ce qui indique une

caractéristique probiotique de E. faecium SF68 dans la modification de la fonction

immunitaire.

Des résultats similaires sont obtenus par Kang et Lee, (2005) montrent que le

surnageant de culture de E. faecium (GM-1) diminue significativement la viabilité et

l'uréase d’ H. pylori ainsi l'analyse par microscopie électronique a également démontré

que l'ajout de GM-1 détruisait la structure cellulaire de H. pylori. Des études

supplémentaires ont suggéré que la liaison de H. pylori à des cellules humaines du côlon a

diminué en présence de GM-1. Tsai et al. (2004) ont décrit que le traitement

de H. pylori avec les cellules de la souche Enterococcus faeciumTM39 réduit

significativement sa liaison aux cellules de carcinome gastrique (TSGH 9201).

180

Discussion

De ce fait, certaines souches d’Enterococcus faecium sont montrées comme des

probiotiques qui induisent des effets bénéfiques sur la santé du consommateur. Sur le

marché, ces microorganismes sont disponibles sous forme de compléments alimentaires,

tels que la souche Enterococcus faecium Cernelle 68 (SF 68) sous une forme déshydratée,

commercialisée par la société bioflorin (Suède) (Özcan et al. 2003).

Plusieurs études in vitro ont montré l'addition de certains probiotiques, également

des bactéries, inhibe Helicobacter pylori. Pourtant les démonstrations de cette action in

vivo restent rares. Des chercheurs espagnols de l’université de Valence ont montré que

Bifidobacterium bifidum est le prometteur dans la prévention des infections gastro-

intestinales et il a un effet inhibiteur in vitro sur l’Helicobacter pylori. Dans leur étude, les

scientifiques ont isolé Bifidobacterium bifidum des selles d’enfants allaités et ont évalué

ensuite son action contre l'Helicobacter pylori. Il est effectivement capable d’inhiber 82%

des Helicobacters et cette action peut aller jusqu’à 95% dans certaines conditions de

purification préalables. Son effet a ensuite été évalué in vivo chez des souris

génétiquement modifiées pour déclencher des ulcères. Après 21 jours, les animaux

recevant Bifidobacterium bifidum ont développé moins d’ulcères. Bifidobacterium

bifidum réduit les dommages causés par l’acidité gastrique tout comme il réduit la

pathogénécité d’Helicobacter pylori, sans que son ingestion ne déclenche de maladie

particulière. Ce nouveau probiotique remplit selon les auteurs “les propriétés nécessaires

et recherchées pour un probiotique : résistance aux sels billiaires, au chlorure de sodium et

à un pH bas ; adhérence à la muqueuse intestinale ; sensibilité aux antibotiques". Des

essais chez l’homme doivent être conduits avant que la commercialisation de ce

probiotique ne puisse être autorisée (Chenoll et al. 2011).

181

CONCLUSION

Conclusion

CONCLUSION

Helicobacter pylori constitue un problème majeur de la santé publique en

Algérie. Pour cela, à partir des broyats de biopsies gastriques deux souches d'H.pylori sont

isolées sur gélose au sang (Hp1 et Hp3). L'utilisation de la PCR en temps réel a révélé la

présence des souches sensibles à la clarithromycine de Helicobacter pylori dans des

biopsies gastriques prélevées par endoscopie digestive haute des patients ayant subi un

examen anatomopathologique et cytologique. L'observation microscopique a montré la

présence de Helicobacter pylori. Ce pathogène a provoqué une gastrite aigue et

chronique.

L'identification phénotypique, biochimique et physiologique des bactéries

lactiques isolées à partir des laits crus de vache, brebis, chèvre et chamelle a permis

d'obtenir 30 souches des espèces suivantes: Lactococcus lactis subsp.lactis(36,66%),

Lactococcus lactis subsp cremoris (30%), Enterococcus faecium(20%), et Lactococcus

garvieae(13,33%). Toutes les souches isolées sont homofermentaires et poussent à 37oC.

Elles hydrolysent l'esculine, produisent de l'acétoine et fermentent le ribose, mannose,

lactose et tréhalose. Elles sont dépourvues de β -glucuronidase, de phosphatase alcaline et

le pouvoir hémolytique. Le meilleur pouvoir acidifiant a été enregistré au bout de 24 h

avec les deux souches de Lactococcus lactis subsp. cremoris :B30 et B28 avec une

quantité d'acide estimée à 45 oD et 40 oD, respectivement

Afin de déterminer l'effet antagonique des bactéries lactiques isolées vis-à-vis

des souches d'H.pylori(Hp1, Hp3, TN2GF4, J99, 26695, HPAG1 et HSA3068) des

interactions ont été faites par la méthode de diffusion sur gélose. Sur 30 souches de

bactéries lactiques seulement 14 souches ont un effet inhibiteur in vitro. Le meilleur effet

inhibiteur a été trouvé avec les souches Enterococcus faecium (B13) et Lc. lactis

subsp.lactis (B01) dont les diamètres varient entre 20mm et 03mm, respectivement.

182

Conclusion

Le surnageant de la culture de Enterococcus faecium B13 contient une substance

secrétée dans le milieu extracellulaire. L'inhibition a été confirmée par la méthode de

diffusion sur gélose et dans le bouillon, dont l'inhibition a été suivie après chaque 18h par

un dénombrement des colonies d'H.pylori ensemencées sur gélose au sang. Cette

substance conserve son activité antagoniste à pH 4 et 8 et après traitements thermiques à

60oC pendant 30 min, 80oC pendant 10 min et 100 oC pendant 5min. Alors que, le pouvoir

inhibiteur de surnagent de B13 disparaît complètement en présence de deux enzymes

protéolytiques Trypsine et Pepsine, ce qui indique la nature protéique de la substance

inhibitrice. De plus l'activité antibactérienne persiste après contacte avec l'α -amylase.

L'effet antibactérien de la souche Enterococcus faecium B13 a été confirmé in

vivo. Une infection des souris, femelles, holoxéniques et âgées de deux mois, pendant 3

semaines par la souche TN2GF4, qui a montré une sensibilité vis-à-vis les bactéries

lactiques isolées, provoque l'apparition d'une érosion de l'épithélium gastrique avec la

présence des masses cellulaires dans leur chorion. Un traitement avec B13 pendant 7 jours

a prouvé une efficacité de cette bactérie lactique à inhiber la croissance d'H.pylori et à

bien résister aux conditions physiologiques du tractus gastro-intestinal. En effet, elle

réduit le nombre d'H.pylori de prés un log durant les deux phases d'observation (J21 et

J30) soit 43%.

183

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220

ANNEXES

Annexes

ANNEXE I : milieux de culture Bouillon urée-indole (g/L): En grammes par litre d'eau purifiée

• L-Tryptophane: 3,00 • Phosphate monopotasique: 1,00 • Phosphate dipotassique: 1,00 • Chlorure de sodium: 5,00 • Urée: 20,00 • Rouge de Phénol à 1% 2,50 mL • Alcool à 95% 10,00 mL

pH final : 6.7 + /- 0.2 à 25°C Gélose pour dénombrement (PCA) (g/L):

• Tryptone:5,0 g • Extrait de levure:2,5 g • Glucose:4,0 g • Agar:9,0 g • Eau qsp 1L

pH = 7

Gélose désoxycholaté à 1% (g/L):

• Peptone: 10,0 g • Citrate de sodium: 1,0 g • Lactose: 10,0 g • Rouge Neutre: 0,03 g • Désoxycholate de sodium: 1,0 g • Chlorure de sodium: 5,0 g • Hydrogénophosphate de potassium: 2,0 g • Agar: 13,0 g

pH = 7,3

Brucella bouillon (g/L)

• Peptone de caséine: 10g • Peptone de viande: 10g • Extrait de levure: 2g • Dextrose: 1g • Chlorure de sodium: 5g • Bisulfite de sodium: 0,1g

pH=7

Annexes

Gélose Brucella (g/L):

• Tryptone : 10,0. • Extrait de tissus animal : 10,0 • Glucose : 1,0 • Extrait de levure : 2,0 • Sodium chlorure : 5,0 • Bisulfite de sodium : 0,1 • Agar : 15,0

pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C : 7,0 ± 0,2

Gélose Columbia (g/L):

• Polypeptone: 17g • Peptone pancréatique de cœur: 3g • Extrait autolytique de levure: 3g • Amidon de mais:1g • Chlorure de sodium: 5g • Agar: 13,5

Ajouter de 5 à 10% de sang de cheval stérile, après autoclavage et refroidissement.

Milieu BGT (Bouillon Glucose Tamponné) (g/L):

• Peptone : 20.00g • Extrait de viande: 02,00g • Chlorure de sodium: 2,5g • Phosphate monopotassique: 0,7g • Chlorure di-sodique: 8,3g • Glucose: 4,0g

pH= 7.7

Gélose maison (g/L): Pour une série de 24 boites de géloses au sang de cheval avec un flacon de sang à 50mL:

- Prendre 2 flacons de milieu Muller Hinton agar dans la pièce;

- Décongeler la solution d'antibiotique;

- Faire fondre le milieu Muller Hinton agar à 100oC puis laisser refroidir à 54oC dans un bain-marie;

- Ajouter 0,5 mL de solution d'antibiotiques par flacon de 225 mL de milieu, bien homogénéiser.

- Répartir dans 24 tubes stériles: 2mL de sang de cheval stérile+18 mL de milieu Muller Hinton agar;

Annexes

- Couler le tout dans une boite de Pétri ronde de 20mL - Laisser solidifier la gélose; - Ranger dans le réfrigérateur.

Solution d'antibiotiques: Elle est préalablement préparée et congelée. Elle se compose de:

- 50 mg d'Amphotéricine à reconstituer; - 0,25 g de Vancomycine à reconstituer; - QSP 40mL.

Aliquoter à 2mL; Conserver au congélateur à -20oC.

Gélose Chapman (g/L):

• Peptone: 10,0 g • Extrait de viande de bœuf: 1,0 g • Chlorure de sodium: 75,0 g • Mannitol: 10,0 g • Rouge de phénol: 0,025 g • Agar-Agar: 15,0 g • Eu distillée qsp 1 Litre

pH = 7,4

Gélose Viande foie(g/L):

• Base viande foie : 30,0 g • Glucose : 2,0 g • Agar : 6,0 g

pH = 7,4

Gélose M17 (g/L):

Tryptone: 2,5 g

• Peptone papaïnique de soja: 5,0 g • Peptone pepsique de viande: 2,5 g • Extrait de viande: 5,0 g • Extrait autolytique de levure: 2,5 g • Béta-Glycérophosphate de sodium: 19,0 g • Sulfate de magnésium: 0,25 g • Lactose: 5,0 g • Acide ascorbique: 0,5 g • Agar-agar bactériologique: 15,0 g • pH à 25 °C : 7,1 ± 0,2

Annexes

ANNEXEII:

Tableau I: Résultats de l’identification des espèces bactériennes des selles des souris

(témoin)

CIT: Citrate-Simmons, MAN: Mannitol-mobilité, LAC: Lactose, GLU: Glucose, SAC: Saccharose, LDC: Lysine déshydrogénase, ODC: Ornithine décarboxylase, ADH: Arginine dihydrolase, ONPG: Ortho-Nitro-Phenyl-Galactopyranozide, URE: Urée-indole, CAT: Catalase, OXY: Oxydase.

Tableau II: Dénombrement des colonies de H.pylori sur gélose Brucella (UFC/mL).

Temps(h)

H.pylori

0h 18h 36h 54h 72h 90h 108h 126h

Hp1 107 7x106 105 2x104 2x103 2x102 2x10 00

Hp3 107 6x106 2x105 4x104 3x103 4x102 10 00

TN2GF4 107 106 104 10 00 00 00 00

HSA3068 107 2x106 6x104 3x102 10 00 00 00

26695 107 4x106 6x105 3x103 2x102 10 00 00

J99 107 3x106 5x105 103 2x102 10 00 00

HPAG1 107 107 107 107 107 107 107 107

Identification sur galerie biochimique classique Espèce C I T

M A N

L A C

G L U

S A C

L D C

O D C

ADH

O N P G

U R E

C A T

O X Y

- + - - - - - - - + + - Staphylococcus cohnii

+ - - - - - - + - - + + Alcaligenes faecalis

- + + + + + + - + - + - Escherichia coli

Annexes

Tableau III: le pouvoir acidifiant des bactéries lactiques

Temps(h) Bactérie

0h 2h 4h 6h 24h

B01 13 16 17 20 25 B02 13 15 20 22 30 B03 13 15 20 23 35 B04 13 16 21 25 35 B05 13 14 15 17 25 B06 13 16 21 25 35 B07 13 17 22 25 30 B08 13 15 20 23 25 B09 13 15 20 25 35 B10 13 15 17 19 20 B11 13 16 21 25 30 B12 13 16 21 25 30 B13 13 15 17 19 19 B14 13 16 20 23 25 B15 13 15 21 22 25 B16 13 15 23 25 30 B17 13 14 15 17 20 B18 13 17 20 21 30 B19 13 16 17 18 25 B20 13 15 20 21 35 B21 13 14 16 20 25 B22 13 15 19 20 25 B23 13 15 20 25 35 B24 13 16 20 23 30 B25 13 15 16 20 25 B26 13 16 21 23 25 B27 13 14 16 17 19 B28 13 15 23 30 40 B29 13 16 25 30 35 B30 13 15 25 30 45

Annexes

Tableau IV: Résultats de dénombrement de H pylori isolée à partir de l’estomac

Nombre de colonies d’H pylori en UFC/mL

prélèvement J 21 J 30

Lot 2 : groupe infecté par H pylori

1 7.105 1,7. 106 2 5. 105 6. 105 3 1,2. 106 2,9. 106 4 6,5. 105 1,21. 106 5 3,8. 105 5,6. 105 6 1,5. 105 4,7. 105

moyenne 5,9. 105 1,24. 106

Lot 3 : groupe infecté par H pylori et traité par E.faecium

1 2,7. 105 2. 105 2 4. 105 3. 105 3 3. 105 2,7. 105 4 1,2. 106 4,5. 105 5 1,8. 105 1,6. 105 6 6. 105 3,1. 105

moyenne 4,9. 105 2,8. 105

Annexes

Tableau VI: Analyse statistique Nombre de colonie (CFU/mL) Lot 2(infecté) Lot 3(infecté +traité) A 21jour post infection 70 27 50 40 120 30 65 120 38 18 15 60 A30 jour post infection 170 20 60 30 290 27 121 45 56 16 47 31 Nombre de souris (n) =12 =12

La moyenne arithmétique ) = 91.83 = 38.66

La variance ( ) = 5256.63 = 811.86 Ecart type (S) =72.5 =28.49 DDL= + - 2 DDL=12+12 -2= 22 H0 : U1=U2 pas de différence entre lot2 et lot 3

T cal = -

1 + 1 +

+ - 2 Tcal =23.44 T α = 2.074 avec α =0.05 T cal > tα donc H0 rejeté, il y a une différence significative entre le groupe infecté et le groupe infecté plus traité.

PUBLICATIONS

PERSPECTIVES

Ce travail a pour but de rechercher des souches de bactéries lactiques isolées des

laits crus Algériens ayant une activité inhibitrice de la souche pathogène Helicobacter

pylori. A cet effet, certains aspects de la thèse méritent d'être approfondis et qui restent en

perspectives entre autres:

1. Un séquençage (16S) des souches de Helicobacter pylori isolées en Algérie;

2. Un séquençage (16S) de la souche Enterococcus faecium (B13) qui a montré un

effet inhibiteur important de Helicobacter pylori;

3. Caractérisation de la substance protéique (bactériocine) sécrétée par la bactérie

lactique Enterococcus faecium (B13) par HPLC et MS;

4. Étudier d'autres mécanismes d'action de E.faecium(B13) pour inhiber la croissance

de H.pylori in vivo (adhérence, compétition, etc…);

5. Production d'un lait fermenté probiotique par Enterococcus faecium B13.

RESUME

L'objectif de ce travail est de chercher des souches de bactéries lactiques qui

pourraient inhiber in vitro et in vivo la croissance d’Helicobacter pylori impliquée dans la

pathologie gastroduodénale. Pour cela, deux souches de Helicobacter pylori (Hp1 et

Hp3) sensibles à la clarithromycine, ont été isolées des biopsies prélevées par endoscopie

digestive haute par culture sur gélose au sang et caractériser par PCR en temps réel. Ces

souches ont provoqué des gastrites aigue et chronique déterminer par un examen

anatomopathologique et cytologique. 30 souches de bactéries lactiques du genre

Lactococcus et Enterococcus ont été isolées à partir des échantillons des laits crus de

chèvre, vache, brebis et chamelle prélevés de différentes régions de l'Algérie. Des

interactions ont été réalisées entre des bactéries lactiques isolées, les deux souches

d’Helicobacter pylori et d'autres souches de références (TN2GF4, J99, 26695, HPAG1) et

clinique (HSA3068). La meilleure zone d'inhibition a été constatée avec la souche

TN2GF4 en présence d’Enterococcus faecium (B13) isolée du lait de chèvre de Miliana

(Zi=20mm). La recherche de la substance antagoniste a été réalisée suivant la méthode de

diffusion sur gélose et dans le bouillon après élimination de l'effet des acides organiques

(neutralisation du milieu à pH 6,5) et le peroxyde d'hydrogène (ajout du catalase). Les

substances inhibitrices produites par la souche d'Enterococcus faecium (B13) perdent leur

activité après traitement par la trypsine et la pepsine, mais retiennent cette activité

antibactérienne après traitement thermique pendant 30 minutes à 60oC, 80oC pendant 10

minutes et 100oC pendant 5 minutes. Cette protéine est stable à pH acide et basique. In

vivo, l'administration orale de la souche Enterococcus faecium (B13) réduit le nombre de

H pylori dans l’estomac des souris Balb/c prés d'un log soit 43%.

Mots clés: Lait cru, bactéries lactiques, Helicobacter pylori, PCR en temps réel,

bactériocines, inhibition, in vitro, in vivo.

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