THESE EN VUE DU DIPLOME D’ETAT DE DOCTEUR EN …
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UNIVERSITE DE PICARDIE UFR DE PHARMACIE JULES VERNE MEMOIRE POUR LE DIPLOME D’ETUDES SPECIALISEES D’INNOVATION PHARMACEUTIQUE ET RECHERCHE TENANT LIEU DE THESE EN VUE DU DIPLOME D’ETAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE Soutenue publiquement le 21 octobre 2015 Par Laure IZQUIERDO JURY Président : Professeur Gilles DUVERLIE, Virologie, CHU d’Amiens Membres : Docteur Anne GOFFARD, Virologie, CHU de Lille Docteur Coralie PALLIER, Virologie, APHP, Site Paul Brousse Docteur Christine SEGARD, Virologie, CHU d’Amiens Docteur François HELLE, Virologie, CHU d’Amiens, Directeur de thèse Année 2015 Thèse n° 3083 Etude de la résistance du Virus de l’Hépatite C à des molécules ciblant les N-glycanes
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UNIVERSITE DE PICARDIE UFR DE PHARMACIE JULES VERNE
MEMOIRE POUR LE DIPLOME D’ETUDES SPECIALISEES D’INNOVATION PHARMACEUTIQUE ET RECHERCHE
TENANT LIEU DE
THESE EN VUE DU DIPLOME D’ETAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE
Soutenue publiquement le 21 octobre 2015
Par
Laure IZQUIERDO
JURY
Président :
Professeur Gilles DUVERLIE, Virologie, CHU d’Amiens
Membres :
Docteur Anne GOFFARD, Virologie, CHU de Lille Docteur Coralie PALLIER, Virologie, APHP, Site Paul Brousse Docteur Christine SEGARD, Virologie, CHU d’Amiens Docteur François HELLE, Virologie, CHU d’Amiens, Directeur de thèse
Année 2015 Thèse n° 3083
Etude de la résistance du Virus de l’Hépatite C à des molécules ciblant les N-glycanes
REMERCIEMENTS
Je tiens tout d’abord à remercier Gilles Duverlie pour m’avoir accueillie au sein de son équipe, ouvert
les portes de la recherche et soutenue dans mon projet de formation pasteurienne.
Je remercie chaleureusement François Helle pour m’avoir initiée au monde du virus de l’hépatite C.
Merci de m’avoir encadrée durant ces années de thèse, d’avoir dirigé mon travail avec attention et
optimisme, de m’avoir poussée à dépasser mes limites. Un énorme merci également pour ta
confiance en me passant le relais sur ton sujet de prédilection, ta patience infinie et ta bonne
humeur renouvelée chaque jour.
Merci à Sandrine Castelain, Catherine François et Etienne Brochot pour leurs conseils avisés, leur
disponibilité et leur sympathie.
Un grand merci à Carole, Véronique et Virginie pour m’avoir transmis leur expérience avec autant de
gentillesse, pour m’avoir formée à quelques unes des nombreuses techniques qu’elles maitrisent
parfaitement.
Je ne peux manquer de remercier Catherine pour ses coups de main pratiques et ses expressions
revisitées tellement drôles.
Merci aussi à tous les membres de l’Unité de Virologie pour leur accueil chaleureux et leur
convivialité, et à l’équipe du laboratoire d’Oncobiologie du CHU d’Amiens pour sa précieuse aide
technique.
J’exprime ma reconnaissance aux Docteurs Anne Goffard, Coralie Pallier et Christine Segard pour
avoir accepté de participer à mon jury de thèse.
Merci mille fois à tous mes amis, entre rires, confidences, instants de détente et de partage, vous
m’avez une fois de plus prouvé que l’on est riche de ses amis. Votre présence constante est un beau
signe d’amitié. Enfin, un immense merci à François d’être auprès de moi chaque jour, malgré la
distance, de me soutenir, d’être attentif et bienveillant.
Je ne saurais suffisamment remercier ma famille, pour m’entourer de leur amour et pour m’avoir
toujours encouragée dans mon parcours, plus particulièrement durant ces années d’internat et de
thèse.
SOMMAIRE
LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX .............................................................................................. 6
LISTE DES ABREVIATIONS ....................................................................................................... 7
I. Introduction ........................................................................................................ 9
A. L’hépatite C .................................................................................................................... 9
1. Epidémiologie .......................................................................................................................... 9
a) Prévalence ......................................................................................................................................... 9 b) Modes de transmission ................................................................................................................... 10
2. Histoire naturelle de l’infection ............................................................................................. 10
a) Hépatite C aiguë .............................................................................................................................. 11 b) Hépatite C chronique ...................................................................................................................... 12
3. Diagnostic biologique ............................................................................................................ 13
a) Diagnostic indirect........................................................................................................................... 14 b) Diagnostic direct.............................................................................................................................. 15
B. Les traitements de l’hépatite C .................................................................................... 15
1. Bithérapie Interféron/Ribavirine ........................................................................................... 16
2. Molécules ciblant directement le virus ................................................................................. 17
a) Inhibiteurs de la protéase NS3/4A .................................................................................................. 18 b) Inhibiteurs de NS5A ......................................................................................................................... 19 c) Inhibiteurs de l’ARN polymérase ARN-dépendante NS5B............................................................... 21 d) Autres cibles virales ......................................................................................................................... 22
3. Molécules ciblant la cellule hôte ........................................................................................... 22
4. Stratégie vaccinale................................................................................................................. 23
C. Le virus de l’hépatite C ................................................................................................. 23
1. Découverte ............................................................................................................................ 23
2. Classification et variabilité..................................................................................................... 24
a) Classification.................................................................................................................................... 24 b) Variabilité génétique ....................................................................................................................... 25
3. Particule virale ....................................................................................................................... 26
a) Structure de la particule virale ........................................................................................................ 26 b) Organisation génomique ................................................................................................................. 27
4. Cycle de réplication ............................................................................................................... 32
D. Les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 ..................................................................... 34
1. Biogenèse .............................................................................................................................. 34
2. Maturation ............................................................................................................................ 35
3. Organisation fonctionnelle .................................................................................................... 36
E. La N-glycosylation des protéines d’enveloppe E1 et E2 .............................................. 38
1. Principe de la N-glycosylation ............................................................................................... 38
2. Mécanisme de la N-glycosylation .......................................................................................... 39
a) Biosynthèse des N-glycanes ............................................................................................................ 39 b) Maturation des N-glycanes ............................................................................................................. 41
3. Rôles fonctionnels des N-glycanes associés aux protéines E1 et E2 ..................................... 42
4. Ciblage des N-glycanes .......................................................................................................... 43
F. Les molécules capables d’interagir avec les N-glycanes .............................................. 44
1. Lectines .................................................................................................................................. 44
a) Concanavaline A .............................................................................................................................. 45 b) Cyanovirin-N .................................................................................................................................... 45
c) Galanthus Nivalis Agglutinin............................................................................................................ 45 d) Griffithsin ........................................................................................................................................ 46
2. Dérivés non peptidiques........................................................................................................ 47
3. Applications antivirales ......................................................................................................... 47
a) Activités antivirales ......................................................................................................................... 47 b) Activité anti-VHC ............................................................................................................................. 49
4. Résistance aux CBA ................................................................................................................ 50
II. Objectifs ............................................................................................................. 51
III. Matériels et méthodes ....................................................................................... 52
A. Culture cellulaire et virale ............................................................................................ 52
1. Lignée cellulaire ..................................................................................................................... 52
2. Virus et plasmide ................................................................................................................... 52
B. Réactifs ......................................................................................................................... 53
C. Test de viabilité cellulaire ............................................................................................. 53
D. Sélection de souches virales après exposition aux lectines ......................................... 53
E. Caractérisation des souches virales après exposition aux lectines.............................. 53
F. Mutagenèse dirigée ..................................................................................................... 54
1. Réaction de Polymérisation en Chaîne.................................................................................. 54
2. Transformation de bactéries ................................................................................................. 54
3. PCR à partir de bactéries ....................................................................................................... 54
4. Séquençage ........................................................................................................................... 55
5. Préparation d’ADN plasmidique ............................................................................................ 55
G. Réplication virale .......................................................................................................... 55
H. Tests d’infectiosité ....................................................................................................... 56
I. Tests d’inhibition .......................................................................................................... 56
J. Western Blot ................................................................................................................ 56
K. Analyse statistique ....................................................................................................... 57
IV. Résultats ............................................................................................................ 58
A. Production de clones viraux résistant aux lectines ...................................................... 58
1. Sélection de VHC résistant aux lectines ................................................................................ 58
2. Analyse des gènes d’enveloppe du VHC après la sélection .................................................. 59
3. Constructions plasmidiques des virus mutés ........................................................................ 60
B. Effet des mutations sur la réplication virale ................................................................ 61
C. Effet des mutations sur la production de virus infectieux ........................................... 63
D. Effet des mutations sur la sensibilité vis-à-vis de l’inhibition par les lectines ............. 64
V. Discussion .......................................................................................................... 66
VI. Conclusion et Perspectives ................................................................................. 69
BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................................. 71
ANNEXES........................................................................................................................ 106
6
LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX
Figure 1 : Prévalence de l’hépatite C dans le monde
Figure 2 : Histoire naturelle de l’infection par le VHC
Figure 3 : Cinétique des marqueurs virologiques au cours d’une hépatite C aiguë et d’une hépatite C
chronique
Figure 4 : Cycle viral du VHC et cibles thérapeutiques potentielles
Figure 5 : Arbre phylogénétique des Flaviviridae
Figure 6 : Distribution géographique des génotypes du VHC dans le monde
Figure 7 : Représentation schématique de la lipoviroparticule du VHC
Figure 8 : Organisation génomique du VHC et représentation schématique des protéines virales
Figure 9 : Récepteurs cellulaires impliqués dans l’entrée du VHC
Figure 10 : Cycle de réplication du VHC
Figure 11 : Clivage des glycoprotéines d’enveloppe du VHC
Figure 12 : Structure cristallographique de l’ectodomaine de la glycoprotéine E2
Figure 13 : Représentation schématique de l’ectodomaine de la glycoprotéine E2
Figure 14 : Noyau oligosaccharidique commun des N-glycanes
Figure 15 : Biosynthèse des protéines N-glycosylées
Figure 16 : Représentation schématique des différents types de N-glycanes
Figure 17 : Rôles fonctionnels des N-glycanes associés aux glycoprotéines E1 et E2
Figure 18 : Structures moléculaires des lectines
Figure 19 : Sélection de VHC après exposition à la GNA, CV-N, ConA et GRFT en culture cellulaire
Figure 20 : Effet des mutations sur la réplication virale
Figure 21 : Effet des mutations sur l’expression des glycoprotéines E1E2
Figure 22 : Effet des mutations sur la production de particules infectieuses
Figure 23 : Effet des mutations sur la sensibilité vis-à-vis de l’inhibition par les lectines
Tableau 1 : Lectines extraites à partir de plantes ou d’organismes procaryotes interagissant avec le
VHC, utilisées dans notre étude
Tableau 2 : Activité antivirale des CBA contre un large spectre de virus enveloppés
Tableau 3 : Caractéristiques des sélections de VHC après exposition aux lectines
7
LISTE DES ABRÉVIATIONS
ADN Acide Désoxyribonucléique
ALAT Alanine Amino Transférase
AMM Autorisation de Mise sur le Marché
Apo A1 Apolipoprotéine A1
Apo B Apolipoprotéine B
Apo C1 Apolipoprotéine C1
Apo E Apolipoprotéine E
ARFP Alternative Reading Frame Protein
ARN Acide Ribonucléique
ARNi ARN interférent
ASAT Aspartate Amino Transférase
ATU Autorisation Temporaire d’Utilisation
BNM-A Benanomicine-A
BNM-B Benanomicine-B
CBA Carbohydrate Binding Agents (molécules capables d’interagir directement avec
les glycanes)
CHC Carcinome Hépatocellulaire
CD81 Cluster of Differenciation 81 (marqueur de différenciation 81)
CE50 Concentration Efficace d’un composé où 50% de l’effet maximal est observé
CLDN1 Claudine-1
CMV Cytomégalovirus
ConA Concanavaline A
CV-N Cyanovirin-N
Da Dalton
DAA Direct Acting Antivirals (molécules antivirales directement actives sur le virus)
DC-SIGN Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin
(molécule d’adhésion intercellulaire non intégrine-3-grabbing spécifique de
cellule dendritique) DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
E. coli Escherichia coli
EGRF Epidermal Growth Factor Receptor (récepteur au facteur de croissance
épidermique)
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (test immunoenzymatique)
euHCVdb european Hepatitis C Virus database
GAG Glycosaminoglycane
GFP Green Fluorescent Protein (protéine fluorescente verte)
GL Goutelette Lipidique
GNA Galanthus Nivalis Agglutinin
gp glycoprotéine
GTP Guanosine triphosphate
GRFT Griffithsin
HHA Hippeastrum Hybrid Agglutinin
HPgV Human Pegivirus (pegivirus humain) HSV Herpes Simplex Virus (virus Herpes Simplex)
Huh-7 Human hepatoma-7 cell
HVR Hypervariable Region (région hypervariable)
8
ICTV International Comittee on Taxonomy of Viruses (comité international de
taxonomie des virus)
IFN Interféron
IgVR Intergenotypic Variable Region (région variable intergénotypique)
IMPDH Inosine-5’-MonoPhosphate Déshydrogénase
IRES Internal Ribosome Entry Site (site interne d’entrée du ribosome)
ISG IFN-Stimulated Gene (gène stimulé par l’IFN)
JFH-1 Japanese Fulminant Hepatitis 1 (isolat 1 d’hépatite fulminante japonaise)
Kb kilobase
LDL Low Density Lipoprotein (lipoprotéine de faible densité)
miR microARN
MVL Mycrocystis Viridis Lectin
NAcGlc N-Acétylglucosamine NLS Nuclear Localization Sequence (séquence à localisation nucléaire)
NPC1L1 Niemann-Pick C1-Like 1
NS Non Structural
OCLN Occludine
OMS Organisation Mondiale de la Santé
ORF Open Reading Frame (cadre de lecture ouvert)
PCR Polymerase Chain Reaction (réaction de polymérisation en chaîne)
Poly U polyuracil
PRM-A Pradimicine-A
PRM-S Pradimicine-S
RBV Ribavirine
RdpRp RNA-dependent RNA polymerase (ARN polymérase ARN-dépendante)
RE Réticulum Endoplasmique
RFP Red Fluorescent Protein (protéine à fluorescence rouge)
RLuc Renilla Luciferase
RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction
RVS Réponse Virologique Soutenue
SPgV Simian Pegivirus (pegivirus simien) SRAS-CoV Coronavirus responsable du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère
SR-BI Scavenger Receptor class B type I (récepteur scavenger de classe B type 1)
SVF Sérum de Veau Fœtal
TMD Transmembrane Domain (domaine transmembranaire)
UDA Urtica Dioica Agglutinin
UI Unité Internationale
UTR Untranslated Region (région non traduite)
VHB Virus de l’Hépatite B
VHC Virus de l’Hépatite C
VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine
VLDL Very Low Density Lipoprotein (lipoprotéine de très faible densité)
WT Wild-Type (sauvage)
9
I. Introduction
A. L’hépatite C
1. Epidémiologie
a) Prévalence
L’hépatite C représente un problème majeur de santé publique, en raison de sa large
répartition à travers le monde. Selon l’OMS, la prévalence mondiale est estimée à 2%, soit
environ 115 millions de porteurs chroniques (1). Il est considéré que 3 à 4 millions de
personnes seraient nouvellement contaminées chaque année. En France, cette infection
toucherait 400 000 personnes.
La prévalence varie suivant les zones géographiques, notamment selon un gradient
Nord/Sud. Les pays occidentaux, particulièrement l’Europe occidentale et l’Amérique du
Nord, présentent généralement une prévalence inférieure à 2,5%. En revanche, cette
prévalence atteint 5% dans certains pays d’Afrique et d’Asie et dépasse 10% en Egypte, qui
présente la plus forte prévalence mondiale [figure 1]. L’histoire de l’hépatite C en Egypte est
liée aux campagnes nationales de lutte contre la schistosomiase et au traitement massif de
la population avec du matériel à usage multiple non stérilisé.
Figure 1 : Prévalence de l’hépatite C dans le monde.
Cette carte représente la prévalence des patients présentant des anticorps anti-VHC dans la population adulte
mondiale. (d’après Gower et al., J Hepatol. 2014)
10
b) Modes de transmission
La transmission du VHC (Virus de l’Hépatite C) s’effectue essentiellement par voie
parentérale. Avant 1991, la majorité des contaminations était due à la transfusion sanguine
(produits sanguins labiles ou dérivés). Mais, cette voie de transmission a été largement
freinée par l’instauration des dépistages sérologiques systématiques chez les donneurs de
sang en 1992 (2) puis des tests de dépistage du génome viral par RT-PCR en 2001.
Aujourd’hui, dans les pays développés, le risque transfusionnel étant minime, la
toxicomanie par voie intraveineuse via le partage de seringues usagées représente la
principale source de contamination (3). La séroprévalence du VHC chez les usagers de
drogue en France est actuellement proche de 60 % et s’élève déjà à 28 % chez les moins de
30 ans laissant supposer des contaminations dès l’initiation (4). Cependant, l’incidence de
ces infections a diminué avec l’accès à du matériel stérile et grâce à une meilleure prise en
charge des toxicomanes.
Une transmission par voie nosocomiale existe aussi. Le risque relève de l’utilisation de
matériel médical mal stérilisé (endoscospes, aiguilles…), lors de transplantation d’organes ou
d’hémodialyse (5). L’amélioration des conditions d’hygiène, les recommandations de
décontamination du matériel médical non jetable et le développement du matériel à usage
unique ont permis de réduire considérablement ce risque, aussi bien dans les centres de
soins que dans les salons de tatouage, de piercing et d’acupuncture.
D’autres voies de transmission mineures ont été mises en évidence. Ainsi, le risque de
transmission materno-fœtale lors de l’accouchement est de l'ordre de 5%, si le VHC est
détectable dans le sang de la mère. La contamination par voie sexuelle reste rare, de l’ordre
de 2,5% dans le cadre de relations hétérosexuelles (6), mais celle-ci peut devenir significative
dans le cadre de rapports homosexuels non protégés entre hommes (7, 8). A l’heure
actuelle, environ 30% des contaminations restent d’origine inconnue.
2. Histoire naturelle de l’infection
La contamination par le VHC se manifeste par une hépatite C aiguë, le plus souvent
asymptomatique. Le risque majeur réside dans le passage à la chronicité qui survient dans
environ 80% des cas. Ce portage chronique se complique par le développement d’une
11
cirrhose pouvant évoluer vers un carcinome hépatocellulaire (CHC) [figure 2]. Des
manifestations extra-hépatiques peuvent également apparaitre.
Figure 2 : Histoire naturelle de l’infection par le VHC.
L’infection par le VHC débute par une infection aiguë, le plus souvent asymptomatique. Dans la majorité des
cas, l’infection évolue vers la chronicité. L’hépatite C chronique peut se compliquer par la survenue d’une
cirrhose pouvant aboutir, à plus long terme, à un carcinome hépatocellulaire. (d’après Chen et Morgan, Int J
Med Sci. 2006)
a) Hépatite C aiguë
Dans la majorité des cas, l’hépatite C aiguë est asymptomatique ; elle est donc
rarement diagnostiquée. Chez 20 à 30% des patients, des signes cliniques peu spécifiques
apparaissent après une période d’incubation de 4 à 12 semaines. L’infection aiguë se
manifeste alors par une fièvre, une asthénie, une anorexie, des troubles digestifs et, plus
rarement, un ictère cutanéo-muqueux. L’association de facteurs de co-morbidité (co-
infection par le VIH (Virus de l’Immunodéficience Humaine) ou le VHB (Virus de l’Hépatite B),
consommation d’alcool) augmente la fréquence de ces symptômes. Biologiquement,
l’hépatite C aiguë se traduit par une cytolyse hépatique, avec une élévation du taux des
transaminases sériques ALAT (Alanine Amino Transférase) et ASAT (Aspartate Amino
Transférase) supérieur à 10 fois la normale. Le pic de transaminases survient 2 à 8 semaines
12
après la contamination. Les formes graves ou fulminantes sont exceptionnelles, mais
mortelles, si le patient n’est pas transplanté.
A ce stade, l’infection aiguë par le VHC peut être diagnostiquée par la mise en évidence
d’une séroconversion ou, plus précocement, par la détection de l’ARN viral plasmatique. En
effet, les anticorps anti-VHC sont détectables entre 30 et 90 jours après la contamination, et
l’ARN du VHC est le premier marqueur à se positiver une à trois semaines suivant l’infection
[figure 3].
La guérison spontanée est observée dans 15 à 20% des cas (9) : l’ARN VHC devient alors
indétectable dans le plasma et le bilan hépatique se normalise. Le taux d’anticorps anti-VHC
diminue progressivement mais reste détectable pendant plusieurs années chez les patients
ayant spontanément éliminé le virus (10). Dans les autres cas, le virus n’est pas éliminé au
cours de la phase aigüe et l’infection évolue vers la chronicité.
b) Hépatite C chronique
L’hépatite C aiguë évolue vers la chronicité dans 80% des cas. L’hépatite C chronique
est définie par la persistance de l’ARN du VHC plasmatique plus de 6 mois après l’épisode
aigu. L’évolution de la maladie est très variable d’un patient à l’autre. De nombreux facteurs
influencent sa progression : des facteurs dépendant de l’hôte (le sexe, l’âge (11), le statut
immunitaire), des facteurs environnementaux (la consommation d’alcool, la co-infection par
le VIH ou le VHB (12, 13)) ainsi que des facteurs viraux (le génotype (10), la charge virale, les
quasi-espèces).
L’infection chronique est généralement longtemps asymptomatique ou se traduit par
des symptômes modérés, et particulièrement une asthénie persistante. Au niveau
biologique, le taux des transaminases fluctue et un syndrome inflammatoire est constaté. Le
diagnostic se fait par la recherche d’anticorps sériques anti-VHC, présents de façon
constante, associée à la détection et/ou la quantification de l’ARN viral [figure 3].
L’infection persistante est lentement évolutive avec l’installation d’une inflammation,
avec une infiltration lymphocytaire, et d’un processus fibrotique, altérant le métabolisme
hépatique. Environ 20% des patients chroniquement infectés développent une cirrhose
après 15-20 ans (14, 15), avec le risque de décompensation ou d’évolution à plus long terme
vers un carcinome hépatocellulaire (CHC) pour 1 à 4% d’entre eux par an (16, 17). A ce stade
terminal, la capacité de régénération du foie est dépassée et les lésions hépatiques
deviennent irréversibles ; seule la transplantation hépatique permet la survie des patients.
13
Ainsi, la cirrhose décompensée et le CHC liés à l’hépatite C sont devenus la première cause
de transplantation hépatique dans le monde (15, 18).
Enfin, l’hépatite C chronique peut également s’accompagner de manifestions extra-
hépatiques d’origine dysimmunitaire, avec l’apparition d’autoanticorps, de signes
rhumatologiques ou d’une prolifération lymphocytaire B (19, 20). Une résistance à l’insuline
et un diabète de type 2 (21) ainsi que des manifestations neuro-psychiatriques (22)
pourraient aussi se développer suite à une infection par le VHC.
La gravité de l’atteinte hépatique permet de juger de l’attitude thérapeutique à
adopter. Ainsi, elle est évaluée par analyse histo-pathologique d’une ponction-biopsie
hépatique grâce au score d’activité inflammatoire/nécrotique A0-A3 et de fibrose F0-F4
(score METAVIR) (23, 24). D’autres outils non invasifs d’évaluation de la fibrose ont été
validés tels que le FibrosScan® mesurant l’élasticité hépatique ou le FibroTest® combinant la
détection de plusieurs marqueurs biochimiques (22, 25, 26). Ces techniques permettent une
surveillance régulière des patients, indispensable compte tenu du risque potentiel de
progression de la fibrose.
Figure 3 : Cinétique des marqueurs virologiques au cours d’une hépatite C aiguë (a) et d’une hépatite C chronique (b).
(a) Hépatite C aiguë. Après une période d’incubation de 4 à 12 semaines, le génome viral est détectable dans le
sang. Le pic de virémie précède l’élévation transitoire du taux de transaminases hépatiques. L’augmentation
des anticorps anti-VHC signe la séroconversion. La guérison spontanée se traduit par la disparition de la virémie
et la normalisation du bilan hépatique. (b) Hépatite C chronique. La persistance de l’ARN viral plasmatique au-
delà de 6 mois marque le passage à la chronicité. Au cours de l’hépatite C chronique, la charge virale reste
élevée et le taux de transaminases est variable. Les anticorps anti-VHC persistent de façon constante. ALT :
Alanine Amino Transférase. (d’après Chevaliez., Clin Microbiol Infect. 2011)
3. Diagnostic biologique
Le diagnostic biologique repose sur deux types de tests virologiques. Les tests indirects
détectent les anticorps anti-VHC spécifiques dans le sérum. Les tests directs détectent,
14
quantifient et caractérisent les composants de la particule virale circulante, tel que l’ARN du
VHC. Ces tests de diagnostic sont capitaux pour le diagnostic de l’infection, la décision de
traiter, le choix de la meilleure prise en charge thérapeutique, la durée du traitement et
l’évaluation de la réponse au traitement.
a) Diagnostic indirect
Le diagnostic de l’hépatite C fait appel en première intention à la recherche qualitative
des anticorps anti-VHC totaux, soit au diagnostic sérologique, en raison de sa facilité et de
son faible coût. Les anticorps anti-VHC apparaissent en moyenne 2 à 8 semaines après le
début de la phase aiguë et persistent toute la vie en cas d’infection chronique. Toutefois, la
fenêtre sérologique avant séroconversion pouvant atteindre 7 à 12 semaines et l’infection
aiguë pouvant être totalement asymptomatique, les résultats doivent être interprétés en
fonction du contexte clinique.
La détection des anticorps est effectuée par des tests immuno-enzymatiques ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoAssays) de 3ème
génération, utilisant plusieurs antigènes
recombinants (Core, NS3, NS4 et NS5). Leur sensibilité est réduite en cas d’infection aiguë,
en raison de la fenêtre de séroconversion ou d’immunodépression majeure, rendant la
recherche d’ARN viral nécessaire dans ces situations.
En cas d’anticorps anti-VHC négatifs, le résultat du dépistage à annoncer est l’absence
de contact avec le VHC sauf infection récente avant séroconversion ou immunodépression
sévère. En cas d’anticorps anti-VHC positifs, un contrôle sérologique doit être réalisé sur un
deuxième prélèvement pour éviter toute erreur d’identification. Pour ce contrôle, un test
ELISA différent de celui du premier dépistage est recommandé. Si la sérologie de contrôle est
positive, le résultat à annoncer est le contact avec le VHC. Dans cette situation, la recherche
de l’ARN du VHC sur ce deuxième prélèvement est indispensable pour déterminer le statut
virologique du patient. En effet, le diagnostic d’une infection persistante est obligatoirement
confirmé par la détectabilité de l’ARN viral.
Le développement des tests rapides et des Point of care Testings (POCT) semble être
une alternative aux techniques traditionnelles de diagnostic. Le nouveau test rapide
récemment développé, OraQuick
HCV Rapid Antibody Test permet de détecter des
anticorps dirigés contre la protéine de capside, NS3 et NS4, sur sang capillaire ou liquide
craviculaire (27, 28). En cas de positivité, une confirmation par des tests conventionnels,
selon une méthode de référence, sur un prélèvement veineux s’avère nécessaire.
15
b) Diagnostic direct
La présence d’ARN du VHC dans le sang périphérique témoigne de la réplication virale.
La virémie est détectable dès une à trois semaine après l’exposition au virus et persiste au-
delà de 6 mois en cas d’infection chronique. Les tests quantitatifs mesurent de manière
précise la charge virale, qui reflète l’activité réplicative du VHC. Actuellement, la PCR
quantitative en temps réel constitue la technique de choix (29) en raison d’une très grande
sensibilité et d’une large gamme de quantification (30). Différentes plateformes de PCR en
temps réel ont été développées (31-37). La quantification de l’ARN du VHC peut trouver son
utilité dans le suivi de l’efficacité thérapeutique, consistant en une évaluation de la charge
virale au cours de traitement (semaines 4, 12 et 24 et fin de traitement) et 24 semaines
après la fin du traitement.
Par ailleurs, la quantification de l’antigène de capside, par ELISA, peut se révéler utile
pour poser le diagnostic de l’infection (38-40). En effet, le titre de cet antigène de capside
est corrélé à la charge virale et représente donc un marqueur indirect de la réplication virale
(41, 42). Des tests sérologiques de dépistage combinés « Combo », basés sur la détection
simultanée des anticorps anti-VHC et de l’antigène Core ont également été commercialisés
(43). Bien que moins sensibles que les tests de 3ème
génération pour la détection des
anticorps anti-VHC, ils permettent de réduire la fenêtre de séroconversion de 3 semaines
(44).
En outre, les tests de génotypage moléculaire permettent de déterminer le génotype
du VHC. Ils reposent sur différentes techniques, le séquençage direct ou l’hybridation
reverse (30). Des techniques commerciales ont été développées pour une appréciation en
routine (34, 45, 46). Puisque le génotype oriente la stratégie thérapeutique, la détermination
du génotype viral est réalisée avant l’initiation du traitement.
B. Les traitements de l’hépatite C
L’évaluation de l’efficacité de la thérapie repose sur des critères virologiques
(quantification de la charge virale), biochimiques (normalisation du taux sérique des
transaminases) et histologiques (amélioration des lésions histologiques du foie). Le critère
virologique constitue le critère de référence. Il est déterminé par la mesure de la réponse
virologique soutenue (RVS) 12 ou 24 semaines après l’arrêt du traitement. La RVS, définie
16
par l’absence de détection de l’ARN viral (taux inférieur à 10-15 UI/mL) dans le sérum des
patients, témoigne de l’éradication du virus dans plus de 99% des cas.
1. Bithérapie Interféron/Ribavirine
Pendant longtemps, le traitement de référence de l’hépatite C a été basé sur
l’utilisation de l’interféron-α pégylé (PEG-IFN-α) en association avec la ribavirine (RBV),
pendant 24 à 48 semaines.
L’IFN-α constitue une cytokine antivirale, tout d’abord administrée en monothérapie
(47). Il agit comme un immunomodulateur, capable de déclencher une réponse immunitaire
innée efficace. Il stimule aussi l’immunité adaptative, en induisant l’expression de gènes
stimulés par l’IFN (ISG pour IFN-Stimulated Genes). En plus d’inhiber la réplication virale, il
augmente la lyse des cellules infectées et réduit la fibrose hépatique (48). L’IFN possède
également une activité anti-proliférative, en inhibant l’expression de gènes impliqués dans
des processus anormaux de prolifération cellulaire.
Au début des années 2000, une forme pégylée (PEG-IFN-α) a été synthétisée, par
conjugaison d’une molécule de polyéthylène glycol. Cette forme recombinante a permis
d’améliorer la stabilité et la biodisponibilité de l’IFN. Par conséquent, elle a permis de
réduire la fréquence d’administration à une prise hebdomadaire (49) et d’améliorer la
réponse au traitement (50, 51).
Découverte en 1972 (52), la ribavirine (RBV) a été associée au traitement par IFN à la
fin des années 1990. Cet analogue nucléosidique de la guanosine possède une activité
virostatique non spécifique du VHC. Par inhibition de l’inosine-5’-monophosphate
déshydrogénase (IMPDH), la déplétion du stock intracellulaire en guanosine triphosphate
(GTP) provoque le blocage de la réplication virale (53). Cet effet est complété par l’inhibition
directe de la polymérase virale par la RBV sous sa forme active triphosphatée (54). En effet,
la RBV peut s’intégrer à l’ARN viral au cours de son élongation et agir comme terminateur de
chaine. Par conséquent, la RBV pourrait induire un effet mutagène, à l’origine d’une forte
production de virus défectifs non infectieux (55-58). En plus de ces effets antiviraux, la RBV
régule la réponse immunitaire (59). Son effet immunomodulateur stimule la réponse
immunitaire cellulaire de type Th1 et diminue la réponse Th2 (60).
Inefficace en monothérapie (61, 62), la RBV potentialise l’induction des ISG par l’IFN.
Des modifications épigénétiques des ISG induites par la RBV rendent plus efficace l’induction
de ces gènes par l’IFN-α et restaurent la réponse IFN (63). L’effet synergique de la bithérapie
17
PEG-IFN-α + RBV permet d’obtenir une réponse virologique prolongée plus soutenue quel
que soit le profil virologique (64, 65). Toutefois, l’efficacité de cette association est
dépendante du génotype viral. Elle s’avère limitée sur les génotypes 1, 4, 5 et 6, avec un taux
de RVS de 40 à 50% (66, 67), alors que 80% des patients chroniquement infectés par un
génotype 2 ou 3 répondent favorablement à la bithérapie. De plus, cette thérapie présente
de nombreux effets indésirables. La prise d’IFN peut induire un syndrome pseudo-grippal et
des troubles neuropsychiatriques. L’anémie hémolytique constitue le principal effet
secondaire lié à la RBV (68).
Pendant de longues années, la bithérapie PEG-IFN-α + RBV a été utilisée comme
traitement de référence de l’hépatite C. Néanmoins, en raison de sa faible efficacité sur
certains génotypes et de sa toxicité, le développement de nouvelles stratégies
thérapeutiques restait un enjeu majeur pour optimiser la prise en charge des patients
infectés. Depuis 2011, les récentes découvertes de nouvelles thérapeutiques ciblant
directement le virus ont ouvert une nouvelle ère dans le traitement de l’hépatite C.
2. Molécules ciblant directement le virus
Le traitement de l’hépatite C a considérablement progressé au cours des dernières
années avec l’arrivée de molécules directement actives sur le virus (DAA pour Direct Acting
Antivirals), et plus spécifiquement ciblant les enzymes clés du cycle viral (69) [figure 4]. Ces
nouvelles molécules, orales et pangénotypiques, offrent des perspectives de succès
thérapeutique et, grâce à leurs effets antiviraux synergiques, apportent de grandes
améliorations dans la prise en charge des patients porteurs d’une infection chronique par le
VHC. La thérapie serait même optimisée avec des combinaisons de plusieurs DAA,
dépourvues d’IFN-α.
18
Figure 4 : Cycle viral du VHC et cibles thérapeutiques potentielles.
L’arsenal thérapeutique anti-VHC offre une diversité de molécules directement actives sur le virus, ciblant
spécifiquement les enzymes clés du cycle viral, ainsi que des molécules ciblant l’hôte. Pour chaque classe
d’inhibiteurs, les molécules commercialisées ou en essai clinique sont mentionnées. (d’après Manns et al., Nat
Rev Drug Discov. 2013)
a) Inhibiteurs de la protéase NS3/4A
En 2011, deux inhibiteurs de la protéase NS3/4A de première génération sont apparus
sur le marché, le bocéprévir (Victrelis
) (70) et le télaprévir (Incivo
) (71). Ces molécules
inhibent la réplication virale, par blocage de la maturation post-traductionnelle de la
polyprotéine virale. De plus, elles rétabliraient la voie de signalisation de l’IFN, perturbée par
NS3/4A (72). En association à la bithérapie classique PEG-IFN-α + RBV pour le traitement des
patients infectés par un virus de génotype 1, le bocéprévir (70, 73, 74) et le télaprévir (71,
75) permettent d’augmenter la RVS.
En raison d’une barrière génétique faible permettant la sélection rapide de mutants de
résistance, ces nouvelles drogues ne sont pas utilisées en monothérapie (76, 77). Leurs
19
effets secondaires et leur efficacité limitée aux VHC de génotype 1 ne sont pas pleinement
satisfaisants. A l’heure actuelle, la prescription de ces molécules a été remplacée pour celle
de nouveaux inhibiteurs de protéase.
Ainsi, en 2014, un nouvel inhibiteur de protéase de seconde vague, le siméprévir
(Olysio
), a été approuvé (78, 79). Il démontre une activité antivirale puissante
pangénotypique, à l’exception du génotype 3 (80). L’efficacité du siméprévir en association
avec la bithérapie standard a été évaluée dans des essais cliniques de phase II au Japon (81),
en Europe (82) et dans des études internationales (83, 84). Des essais cliniques de phase III
ont conclu à une augmentation de la RVS chez les patients traités par siméprévir (85-88).
La seconde vague de trithérapie inhibiteur de protéase + PEG-IFN-α + RBV apporte de
nombreux avantages, tels qu’une prise quotidienne, une bonne tolérance (89) et une
barrière génétique plus élevée (87, 90). Par ailleurs, cette stratégie thérapeutique permet de
raccourcir la durée du traitement de 48 à 12 ou 24 semaines (81, 83). Le siméprévir est en
cours d’évaluation en combinaison avec le sofosbuvir ± RBV (91) et le daclatasvir ± RBV.
D’autres molécules (paritaprévir, faldaprévir (92-96), danoprévir (97, 98), soraprévir,
vaniprévir (99), asunaprévir (100-103)) sont actuellement en essai clinique de phase II et III.
Des inhibiteurs de NS3/4A de seconde génération, le grazoprévir (MK-5172), ACH-2684
ou BMS-605339 sont également en cours d’étude clinique (104-107). Ces inhibiteurs
présentent une activité pangénotypique, permettent d’obtenir une meilleure RVS et
possèdent une haute barrière à la résistance comparativement aux inhibiteurs de première
génération (88, 108). De plus, la combinaison du grazoprévir et d’elbasvir (un inhibiteur de
NS5A) avec ou sans RBV montre une RVS de 100% (109, 110).
b) Inhibiteurs de NS5A
Les inhibiteurs de NS5A bloquent l’activité de réplication de la protéine (131, 132) et
possèdent également un effet sur l’assemblage et la sécrétion de néovirions (133). Ils
apparaissent comme une alternative thérapeutique intéressante, en raison de leur puissant
effet antiviral, leur prise orale quotidienne, leur activité pangénotypique et leur haute
barrière à la résistance (134, 135). Les inhibiteurs de NS5A de première génération sont
actifs contre les génotypes 1 et 4 ; leur efficacité est variable sur les génotypes 2 et 3 (108).
Le daclatasvir (Daklinza
), premier inhibiteur de NS5A commercialisé, a obtenu son
AMM en 2014. Cet inhibiteur sélectif de NS5A présente une forte activité antivirale (136,
137), confirmée par des taux de RVS élevés dans une étude de phase II (138). Pour éviter le
20
phénomène de résistance (139, 140), le daclatasvir est utilisé en association avec d’autres
molécules ciblant directement le virus, tels que l’asunaprévir (141-143). La combinaison du
daclatasvir avec le sofosbuvir a également fait ses preuves (117). Par ailleurs, la trithérapie
daclatasvir, asunaprévir et béclabuvir (BMS-791325) entraine une RVS élevée (102, 129).
Le lédipasvir (144) présente une activité inhibitrice in vitro contre les génotypes 1a, 1b,
4a et 5a, et un effet réduit contre les génotypes 2 et 3. En clinique, ses propriétés antivirales
sont utilisées pour le traitement des patients infectés par le génotype 1 (145). Cette
monothérapie a montré des réductions significatives des charges virales du VHC (146),
malgré l’émergence de mutants de résistance (147). Ainsi, le lédipasvir est actuellement
testé en combinaison avec d’autres DAA, tels que le tégobuvir (un inhibiteur non
nucléosidique de la polymérase), le GS-9451 (un inhibiteur de la protéase NS3/4A) et la RBV.
L’efficacité de l’association du lédipasvir avec le sofosbuvir a largement été démontrée. Une
thérapie basée sur une prise quotidienne par voie orale a été développée. La combinaison
lédipasvir 90 mg / sofosbuvir 400 mg (Harvoni
) a obtenu son AMM en 2015.
L’ombitasvir (ou ABT-267) est un anti-NS5A pangénotypique (148), bien toléré.
L’addition de l’ombitasvir à la combinaison paritaprévir/ritonavir/dasabuvir améliore l’action
antivirale (130, 149). Des études de phase III ont affiché de hauts taux de RVS avec ou sans
RBV (150). Cet inhibiteur de NS5A a été approuvé dans le cadre d’une ATU de cohorte sous
la forme combinée ombitasvir/paritaprévir/ritonavir/dasabuvir dans le traitement de
l’hépatite C chronique due au VHC de génotypes 1 et 4.
Le samatasvir (IDX-719) a été annoncé comme un inhibiteur NS5A pangénotypique
actif contre les génotypes 1, 2, 3 et 4 (151). Ses profils pharmacocinétique et antiviral en font
une molécule intéressante pour entrer dans la composition de futures combinaisons de DAA
à prise orale quotidienne (152). Un essai clinique de phase II associant le samatasvir et le
siméprévir est en cours ; et une étude incluant le samatasvir, le siméprévir et le TMC647055
(un inhibiteur non nucléosidique de la polymérase) a également été annoncée par Idenix
Pharmaceuticals.
De nombreuses autres molécules anti-NS5A (GSK-23336805, PPI-668, BMS-824393)
sont actuellement testées et des inhibiteurs de seconde génération sont à l’étude (elbasvir
ou MK-8742, ACH-3102, GS-5816). Ces molécules présentent une activité antivirale
améliorée, puissante contre tous les génotypes et les variants résistants aux inhibiteurs de
première génération.
21
c) Inhibiteurs de l’ARN polymérase ARN-dépendante NS5B
Les inhibiteurs de polymérase interfèrent avec la réplication virale, par liaison à l’ARN
polymérase ARN-dépendante NS5B. Ces molécules se subdivisent en deux classes, les
analogues nucléos(t)idiques, ciblant le site catalytique de l’enzyme, et les inhibiteurs non
nucléos(t)idiques ou allostériques, ciblant le site allostérique.
Les analogues nucléos(t)idiques, actifs sous forme triphosphatée, causent un arrêt
précoce de la synthèse d’ARN (111). Leur puissante activité antivirale, leur spectre d’action
large contre tous les génotypes viraux et leur barrière génétique élevée (112) font des
inhibiteurs nucléos(t)idiques une classe prometteuse parmi les options thérapeutiques
exclusivement orales proposées. Bien que le développement clinique de nombreuses
molécules de cette classe (valopitabine ou NM-283, BMS-986094) ait été interrompu en
raison de leur toxicité, plusieurs inhibiteurs nucléosid(t)iques restent en cours d’évaluation
clinique ; le sofosbuvir a même obtenu son agrément en 2014.
L’introduction du sofosbuvir dans la thérapie contre le VHC permet d’atteindre plus de
90% de RVS, pour la majorité des génotypes et à des stades plus ou moins avancés de la
maladie et de réduire la durée du traitement. Après des résultats de phase II très
prometteurs (113), l’efficacité de l’association sofosbuvir + PEG-IFN-α + RBV a été évaluée au
cours de différents essais cliniques de phase III (114-116). Le sofosbuvir est actuellement
proposé dans des schémas thérapeutiques de première intention contre l’ensemble des
génotypes, et même dans des combinaisons dépourvues de PEG-IFN-α. Les combinaisons
sofosbuvir + daclatasvir ou lédipasvir avec ou sans RBV permettent d’obtenir une RVS proche
de 100% (117-119). La forme lédipasvir 90 mg / sofosbuvir 400 mg (Harvoni
) a reçu son
AMM en 2015 pour le traitement des patients atteints d’une hépatite C chronique de
génotypes 1, 3 et 4 et présentant une maladie à un stade avancé avec fibrose hépatique
F3/F4. De façon similaire, le sofosbuvir associé au GS-9669 (un inhibiteur non nucléosidique
de NS5B) (120) a prouvé une forte efficacité (121).
La méricitabine (RG-7128) exerce une activité contre tous les génotypes, mais a
surtout été étudié contre le génotype 1 (122). Des études cliniques ont démontré l’efficacité
de la méricitabine en association avec le PEG-IFN-α et la RBV (123-125).
Au contraire, les analogues non nucléos(t)idiques engendrent une modification
allostérique de la protéine (111, 126) et, par conséquent, provoquent une baisse de la
réplication virale. Leur activité pangénotypique est restreinte et le risque d’échappement
22
thérapeutique par émergence de mutants de résistance est majoré (109). De plus, ces
molécules engendrent une réduction limitée de la charge virale, en monothérapie.
Néanmoins, plusieurs composés sont en cours d’essais cliniques de phases II et III en
combinaison avec d’autres DAA (ABT-072, déléobuvir ou BI-207127, VX-222, sétrobuvir ou
ANA-598, dasabuvir ou ABT-333, tégobuvir ou GD-9190, béclabuvir ou BMS-791325 (102,
127-130).
d) Autres cibles virales
Après de premiers résultats décevants obtenus avec la viramidine (taribavirine) (153),
une étude de phase II montre que des doses élevées de la prodrogue de la RBV apporte une
efficacité sur le plan viral avec un bénéfice en terme de réduction du risque d’anémie (154).
La protéine p7 a également été la cible d’inhibiteurs de viroporines (155-157). L’amantadine,
un inhibiteur de la protéine M2 du virus Influenza, bloque la fonction de canal ionique de p7
in vitro (158). Cependant, l’utilisation de l’amantadine n’a pas semblé concluante (159-161)
et ses effets antiviraux sur le VHC restent controversés.
Une stratégie utilisant des ARN interférents (ARNi) a été envisagée pour limiter
l’infection par le VHC (162, 163). Quelques recherches ont mis à profit l’action d’ARNi ciblant
l’IRES, avec la molécule HH363-50 (164) ou les gènes NS3 et NS5A (165), pour diminuer la
traduction et la réplication du VHC (166-168).
3. Molécules ciblant la cellule hôte
Certaines protéines cellulaires et micro-ARN indispensables pour la réplication du VHC
pourraient être la cible de stratégies thérapeutiques prometteuses (169).
Une puissante activité antivirale a été décrite pour les inhibiteurs de la cyclophiline A
(170, 171). En effet, la cyclosporine A inhibe la réplication virale (172), l’assemblage des
virions et pourrait même supprimer l’attachement de NS5A à l’ARN viral (173). L’alisporivir
(Debio-025) est l’analogue non immunosuppresseur de la cyclophiline A le plus avancé dans
son développement clinique (174-177).
Selon une étude de phase IIa, le miravirsen, un antagoniste de miR-122, (178),
aboutit à une réduction prolongée et dose-dépendante de l’ARN viral (179).
23
Le ciblage des récepteurs et des facteurs d’entrée du VHC, tels que SR-BI, CD81, Cldn-1,
par des anticorps neutralisants ou des antagonistes pourrait également se révéler efficace.
(180-182, 183Fofana, 2013 #2036).
4. Stratégie vaccinale
La vaccination demeurerait la stratégie la plus efficace afin de contrôler et d’éradiquer
l’infection par le VHC. Malgré de nombreuses recherches, aucun vaccin contre le VHC n’est
actuellement développé. En effet, le développement d’un vaccin se heurte à des obstacles
importants, comme la disponibilité de modèles animaux robustes et facilement
manipulables en laboratoire, la variabilité génotypique, l’existence de quasi-espèces virales
suite à la fréquence des mutations et l’absence d’un modèle structural complet de la
protéine d’enveloppe E2 (184). Cependant, son élaboration reste toujours d’actualité ;
quelques vaccins sont même évalués en essais cliniques. Deux approches vaccinales, basées
sur différentes stratégies, sont envisagées ; une vaccination prophylactique visant à prévenir
l’infection virale et une vaccination thérapeutique destinée à éliminer le virus (185, 186).
C. Le virus de l’hépatite C
1. Découverte
Au milieu des années 1970, de nombreux cas d’hépatite virale, majoritairement post-
transfusionnelle, apparaissent. La plupart de ces hépatites n’est due ni au virus de l’hépatite
A ni au virus de l’hépatite B mais à un agent étiologique inconnu dénommé « non-A-non-B ».
L’infection est alors baptisée « Hépatite non A, non B » (NANB) (187). L’agent responsable
des hépatites NANB a été identifié en 1989 par l’équipe de M. Houghton, grâce à des
techniques de biologie moléculaire, de clonage et de séquençage du génome ; il a été
nommé Virus de l’Hépatite C (VHC) (188).
24
2. Classification et variabilité
a) Classification
Son séquençage et les études de l’organisation de son génome ont permis de classer le
VHC dans la famille des Flaviviridae. La différence d’organisation génomique des protéines
structurales du VHC a entrainé son classement dans un nouveau genre, les Hepacivirus
[figure 5]. Le VHC est l’unique espèce du genre Hepacivirus répertoriée par l’ICTV
(International Committee on Taxonomy of Viruses). Pendant longtemps, l’origine des
Hepacivirus était basée sur les primates (189). Cependant, la découverte récente d’espèces
apparentées au VHC chez des hôtes non primates laisse supposer une distribution plus large
des Hepacivirus dans le règne animal (190-192).
Selon la classification de l’ICTV Taxonomy Virus 2014, la famille des Flaviviridae
regroupe quatre autres genres : les Flavivirus (virus de l’encéphalite japonaise, virus West
Nile, virus de l’encéphalite à tiques, virus de la fièvre jaune et virus de la dengue), les
Pestivirus (virus de la diarrhée bovine virale) et les Pegivirus (HPgV pour Human Pegivirus et
SPgV pour Simian Pegivirus) [figure 5].
Figure 5 : Arbre phylogénétique des Flaviviridae.
L’analyse phylogénétique repose sur l’alignement des séquences du gène codant l’hélicase virale. (d’après
Kapoor et al., MBio 2013)
25
b) Variabilité génétique
Le VHC présente une grande variabilité ; actuellement il est dénombré 7 génotypes,
eux-mêmes subdivisés en 67 sous-types (193). Les séquences nucléotidiques des génotypes
divergent d’environ 30% alors que les sous-types diffèrent entre eux de 20% (191). La
répartition géographique des différents génotypes varie à travers le monde (193). Les
génotypes 1, 2 et 3 sont ubiquistes et retrouvés dans la majorité des infections par le VHC en
Europe de l’Ouest, en Amérique du Nord et du Sud, en Australie et dans l’Est de l’Asie
(Chine, Japon et Taiwan). Tandis que le génotype 4 est largement répandu en Egypte, au
Moyen Orient et en Afrique Centrale, le génotype 5 est particulièrement commun en Afrique
du Sud. Le génotype 6 est endémique en Asie du Sud-Est (Vietnam, Thaïlande et Birmanie).
Néanmoins, dans un contexte de mondialisation et de migrations de populations, certains
génotypes émergent dans les pays de l’Ouest. Ainsi, le génotype 4 a récemment été recensé
en France, et le génotype 6 en Amérique du Nord, au Canada et en Allemagne [figure 6].
Par ailleurs, plusieurs génotypes peuvent coexister au sein d’un pays. En France, le
génotype 1b est le plus répandu, suivi des génotypes 3 et 1a (données épidémiologiques
InVS 2001-2007 - www.invs.sante.fr). Au Japon, la prévalence du sous-type 1b (70%) est
supérieure à celle du sous-type 2a (20%) ; le reste de la population étant infectée par le
génotype 2b ou d’autres génotypes.
Figure 6 : Distribution géographique des génotypes du VHC dans le monde.
L’hépatite C est largement distribuée à travers le monde, avec une répartition géographique variable des
différents génotypes. (d’après Hajarizadeh et al., Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2013)
26
Chez un même patient infecté par un sous-type donné, le virus circule sous forme de
variants génétiquement distincts mais apparentés, désignés sous le nom de quasi-espèce et
générés par mutations spontanées ou par pression de sélection.
La variabilité génétique est essentiellement due à l’ARN polymérase. En effet, l’ARN
polymérase ARN-dépendante du VHC, dépourvue d’activité 3’-5’ exonucléase de correction,
commet des erreurs avec une fréquence de 10-4
à 10-5
mutations par nucléotide. Le taux de
réplication très élevé accentue ce phénomène d’accumulation de mutations. Par ailleurs, le
caractère majoritairement chronique de l’infection et les phénomènes de recombinaisons
intra- et inter-génotypiques favorisent la diversité (194-197). L’ensemble des variants
persiste sous la forme d’un équilibre dynamique qui évolue au cours du temps. Cette
variabilité semble influer sur la pathogenèse (sévérité de l’atteinte hépatique et persistance
virale), la réponse aux traitements antiviraux, l’échappement au système immunitaire et la
résistance du VHC aux thérapeutiques (198, 199).
3. Particule virale
a) Structure de la particule virale
Le VHC est un virus enveloppé de 55 à 65 nm de diamètre (200). La particule virale est
constituée d’une nucléocapside icosaédrique formée par l’oligomérisation de la protéine de
capside associée à l’ARN génomique viral simple brin de polarité positive. La nucléocapside
est entourée d’une enveloppe lipidique, dérivée par bourgeonnement des membranes du
réticulum endoplasmique (RE), dans laquelle sont ancrées deux glycoprotéines d’enveloppe
E1 et E2. Ces deux protéines sont assemblées en hétérodimères covalents stabilisés par des
ponts disulfures, à la surface des virions (201).
Les particules virales révèlent une grande hétérogénéité en termes de densité et de
composition (202). En effet, la densité des virions varie de 1,03 à 1,20 g/cm3
; la fraction de
plus faible densité, correspondant à la densité des lipoprotéines de très basse densité (VLDL
pour Very Low Density Lipoproteins), se trouve être la plus infectieuse (201, 203, 204). Ces
différences s’expliquent par l’association de la particule virale à des lipoprotéines (205, 206),
constituant des lipoviroparticules (207) [figure 7]. Ainsi, les apolipoprotéines ApoA1, ApoB,
ApoC1 et ApoE, formant des complexes de protéines et de lipides, sont associées aux
constituants viraux (208-211).
27
Figure 7 : Représentation schématique de la lipoviroparticule du VHC.
L’enveloppe virale est composée d’une bicouche lipidique dans laquelle sont insérées les deux glycoprotéines
d’enveloppe E1 et E2. Cette enveloppe renferme une nucléocapside à l’intérieur de laquelle se trouve la
molécule d’ARN simple brin de polarité positive. Cette particule virale est associée à des lipoprotéines. (d’après
Fénéant et al., Viruses 2014)
b) Organisation génomique
Le génome viral est constitué d’un ARN simple brin de polarité positive d’environ 9,6
kb. Il comporte un cadre de lecture ouvert unique (ORF pour Open Reading Frame), entouré
aux extrémités 5’ et 3’ par deux régions non codantes (5’ et 3’-UTR) (212, 213). L’ARN code
une polyprotéine d’environ 3000 acides aminés, secondairement clivée en dix protéines
virales. Le clivage du précurseur polyprotéique est effectué par des protéases d’origine
cellulaire ou virale au sein de la membrane du RE (214) et donne naissance aux différentes
protéines du VHC. Les protéases cellulaires (les signal peptidases ou SP et les signal peptide
peptidases ou SPP) clivent trois protéines structurales en N-terminal (la protéine de capside
et les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2) et les protéases virales NS2 et NS3/4A entrainent
la libération de sept protéines non structurales en C-terminal (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B,
NS5A et NS5B) [figure 8] Un décalage dans le cadre de lecture semble générer une protéine
structurale supplémentaire, la protéine F ou ARFP (Alternative Reading Frame Protein) (215,
216).
28
Figure 8 : Organisation génomique du VHC et représentation schématique des protéines virales.
Le VHC est un virus à ARN monocaténaire de polarité positive, comprenant un cadre de lecture ouvert unique.
L’ARN, flanqué de deux régions non codantes 5’ et 3’-UTR, est traduit en une polyprotéine. La maturation par
des protéases cellulaires (signal peptidases, indiquées par des flèches noires et signal peptide peptidase,
représentée par une flèche blanche) et virales (NS2/3 et NS3/4A, indiquées par des flèches liées) génère les
différentes protéines virales structurales (C, E1 et E2) et non structurales (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A et
NS5B). La fonction est précisée sous chaque protéine. (d’après Dubuisson et al., J Hepatol. 2014)
• Les régions non codantes
o La région 5’-UTR
Cette région non codante, hautement conservée (217), est marquée par des structures
secondaires et tertiaires très repliées. Elle contient les fonctions régulatrices de la réplication
du VHC (218, 219) et le site interne d’entrée du ribosome (IRES pour Internal Ribosome Entry
Site). Cet IRES comporte tous les éléments indispensables à l’initiation de la traduction de la
polyprotéine virale (220-222). Par ailleurs, la séquence du 5’-UTR comporte deux sites de
liaison à un micro-ARN cellulaire spécifique du foie, miR-122 (223). Ce micro-ARN stimule la
réplication de l’ARN viral (224) et la traduction de la polyprotéine (225, 226).
29
o La région 3’-UTR
A l’extrémité 3’ de l’ARN viral, la région 3’-UTR présente trois régions successives : une
courte région variable, une zone comportant un motif polyuracile/pyrimidine poly(U/C) et
un domaine 3’ terminal, appelé X-tail (227, 228).
Les éléments conservés de cette région sont nécessaires à la réplication virale (229-
231). En relation étroite avec l’IRES, la région 3’-UTR est également impliquée dans la
régulation de la traduction (232).
• Les protéines structurales
o La protéine de capside
La protéine de capside ou protéine Core est une phosphoprotéine conservée, riche en
résidus basiques (233). La protéine mature se présente sous forme de dimères stabilisés par
des ponts disulfures et s’organise en trois domaines fonctionnels (234-236).
La protéine Core constitue l’élément majeur de la nucléocapside du VHC. Elle joue un
rôle essentiel pour la production de particules virales infectieuses. Outre son rôle dans
l’encapsidation de l’ARN viral et dans l’assemblage, la protéine de capside pourrait moduler
différents processus cellulaires, comme l’apoptose et la prolifération cellulaire (237-240).
o Les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2
Les protéines d’enveloppe E1 et E2 seront développées ultérieurement (cf partie I D).
• Les protéines non structurales
o La protéine p7
Située à la jonction entre les protéines structurale E2 et non structurale NS2, la
protéine p7 est synthétisée après clivage de la polyprotéine virale, par une peptidase signal
d’origine cellulaire (241). Elle s’oligomérise sous forme d’hexamères ou heptamères (242-
245), formant un pore (246, 247). Ce pore fonctionne comme un canal ionique, médiant le
transport des protons à travers les membranes (158, 248, 249). De par son activité de canal
ionique, p7 a été classée dans la famille des viroporines.
30
Cette protéine ne semble pas nécessaire à la réplication virale (250), mais elle entre en
jeu dans la morphogenèse des particules virales et participe aux étapes tardives du cycle
viral (156, 251). Ainsi, la fonction de canal ionique de la protéine p7 pourrait être impliquée
dans le relargage des particules virales (252).
o La protéine NS2
NS2 constitue une protéine hydrophobe transmembranaire, intégralement insérée
dans la membrane du RE. Le clivage entre p7 et NS2 est assuré par la peptidase signal
cellulaire du RE (253). NS2 code une cystéine protéase.
En interaction avec l’extrémité N-terminale de NS3, elle forme un complexe
autocatalytique responsable du clivage de la jonction entre NS2 et NS3 (254, 255). Son
activité protéolytique permet de libérer la protéine NS3, essentielle à la réplication. Par
ailleurs, NS2 contribue à la morphogenèse des particules virales infectieuses, à leur
assemblage (256-263) et à leur sécrétion (264). NS2 tiendrait également un rôle inhibiteur
de l’apoptose (265) et pourrait aussi contribuer à la chronicité de la pathologie (266).
o La protéine NS3/4A
La protéine NS3 possède deux fonctions enzymatiques. L’extrémité N-terminale porte
une activité sérine protéase, et la région C-terminale assure une activité hélicase/NTPase
(267). NS3 forme un complexe non covalent avec son co-facteur NS4A. La protéine NS3
active le clivage autocatalytique de la jonction NS2-NS3. En association avec NS4A, elle
intervient également dans les clivages des sites NS4A/NS4B, NS4B/NS5A et NS5A/NS5B (268,
269).
En plus de ce rôle dans la maturation des protéines virales, la protéase NS3/4A clive
des protéines cellulaires de l’hôte impliquées dans la réponse immunitaire innée (270-275).
Par ailleurs, elle pourrait interagir avec certaines protéines cellulaires (276, 277) et
contribuer aux processus d’oncogènese (278-280).
Outre son rôle de co-facteur, NS4A agirait sur la réplication virale, par
l’hyperphosphorylation de la protéine NS5A (281, 282) et sur l’assemblage des particules
infectieuses (283, 284).
31
o La protéine NS4B
NS4B est une protéine hydrophobe, clivée par la protéase NS3/4A et ancrée dans la
membrane du RE (285-287).
La protéine NS4B contribue à la formation du membranous web. Il s’agit d’un réseau
de structures membranaires altérées, dérivé des membranes du RE, et impliqué dans
l’induction du complexe de réplication (288-290). De plus, NS4B assurerait
l’hyperphosphorylation de NS5A (281). Cette protéine semble aussi tenir un rôle
prépondérant dans l’assemblage des néo-virions (291).
o La protéine NS5A
NS5A constitue une phosphoprotéine, contribuant à la réplication (292-296). La
protéine NS5A existe sous une forme « constitutivement » phosphorylée et une forme
hyperphosphorylée. Ses fonctions réplicatives semblent modulées par son état de
phosphorylation (297-299).
NS5A interviendrait dans l’assemblage des particules virales (300-304). Le recrutement
d’ApoE s’avère important pour l’assemblage et le relargage des particules infectieuses (301).
En plus d’interagir avec des protéines virales (305-307), NS5A module la réplication de l’ARN
viral en interférant avec des protéines cellulaires, comme la cyclophiline A (308-312). NS5A
interagit aussi avec de nombreux facteurs de l’hôte impliqués dans la régulation de la
transcription, l’apoptose (313-316) ou le contrôle du cycle cellulaire (317-319). La
phosphoprotéine participe ainsi à la pathogenèse et au développement d’hépatocarcinome.
o La protéine NS5B
La protéine membranaire NS5B assure la fonction d’ARN polymérase ARN-dépendante
du VHC (RdRp pour RNA-dependent RNA polymerase) (320). Le domaine enzymatique
adopte une structure tridimensionnelle traditionnelle en forme de « main droite », avec une
organisation en plusieurs sous-domaines « paume », « doigts » et « pouce » (321-324).
NS5B est responsable de la réplication de l’ARN du VHC (320, 322, 325). En outre,
l’activité enzymatique de NS5B semble être modulée par l’interaction avec la protéine virale
NS5A (307), ainsi que des protéines cellulaires, telles que la cyclophiline A (311, 326) et la
cyclophiline B (327, 328). Enfin, NS5B perturbe certaines voies de signalisation cellulaire, ce
qui lui confère un rôle dans la carcinogenèse (329).
32
o La protéine ARF
La protéine F ou ARFP représente une protéine putative générée suite à la survenue
d’un décalage +1/-2 du cadre de lecture au cours de la traduction (330-334).
La protéine ARFP pourrait être impliquée dans la réplication virale (335, 336), les
processus de pathogenèse (337-339), la modulation de la réponse immunitaire (340) ou
encore la régulation de la dégradation protéique (341), mais elle ne parait pas indispensable
au cycle de réplication virale (335).
4. Cycle de réplication
Après attachement de la particule virale à des facteurs d’entrée non spécifiques, tels
que les glycosaminoglycanes (GAG), le VHC pénètre dans la cellule hôte par un mécanisme
complexe d’interactions impliquant différents facteurs d’entrée cellulaires spécifiques à la
surface des hépatocytes (342). L’attachement favorise l’interaction entre les glycoprotéines
d’enveloppe, notamment E2, avec CD81 (Cluster of Differenciation 81) (343-345) et SR-BI
(Scavenger Receptor class B type I) (346, 347). D’autres facteurs, les protéines de jonctions
serrées Claudin-1 (CLDN1) (348, 349) et Occludine (OCLN) (350, 351), NPC1L1 (Niemann-Pick
C1-Like 1) (352) et le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGFR pour Epidermal
Growth factor Receptor) (353) interviennent par la suite dans l’étape d’entrée virale [figure
9].
Figure 9 : Récepteurs cellulaires impliqués dans l’entrée du VHC.
La particule virale se lie à la surface de sa cellule cible via des facteurs d’attachement (GAG), permettant
ensuite l’interaction entre les glycoprotéines d’enveloppes virales et des facteurs d’entrée cellulaires
spécifiques, comme CD81 et SR-BI. Puis, la particule virale interagit avec d’autres facteurs (CLDN1, OCLN, EGFR
ou NPC1L1). (d’après Fénéant et al., Viruses 2014)
33
L’internalisation de la nucléocapside repose sur un processus d’endocytose dépendant
des molécules de clathrine (354). Puis, une acidification de l’endosome induit la fusion de
l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire et le relargage de la nucléocapside (355). La
décapsidation du génome entraine la libération de l’ARN simple brin de polarité positive
dans le cytoplasme. Cet ARN est directement pris en charge par les ribosomes cellulaires et
sert d’ARN messager pour la traduction des protéines virales. Par la suite, il sert de matrice
pour la réplication de l’ARN génomique du VHC (356). L’ARN polymérase ARN-dépendante
(NS5B) et les autres protéines non structurales (NS3, NS4A, NS4B, NS5A) s’associent à des
protéines cellulaires de l’hôte pour former le complexe de réplication au contact des
structures membranaires et vésiculaires périnucléaires (357, 358). L’ARN polymérase virale
assure la réplication du génome viral en synthétisant un ARN intermédiaire de polarité
négative (216). L’ARN est ensuite encapsidé pour former de nouvelles particules virales. Les
virions sont assemblés, en association avec les gouttelettes lipidiques (GL), à proximité du RE
puis sont relargués de la cellule par la voie de sécrétion (359, 360) [figure 10].
Figure 10 : Cycle de réplication du VHC.
Les particules virales sont formées de composants viraux (sphères vertes) associés à des lipoprotéines (sphères
jaunes). (1) Le virus se lie à la surface des cellules sur leurs récepteurs spécifiques. (2) Ensuite, le virus est
endocyté via une voie dépendante de la clathrine. (3) L’enveloppe virale fusionne avec la membrane des
endosomes précoces, libérant l’ARN viral positif dans le cytoplasme. (4) Le génome sert à la traduction des
protéines virales en association au RE. (5) Parallèlement, le génome du VHC sert à la synthèse de brins négatifs
qui serviront de matrice pour la réplication de l’ARN viral. (6) Les protéines structurales et l’ARN de polarité
positive néo-synthétisé sont assemblés, en association avec les GL. (7) Les virions néoformés sont sécrétés
jusqu’à leur export hors de la cellule. (d’après Popescu et Dubuisson, Biol Cell. 2009)
34
D. Les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2
1. Biogenèse
Les protéines d’enveloppe jouent un rôle prépondérant dans le cycle viral. En plus de
participer à l’assemblage des particules infectieuses, elles sont impliquées dans l’entrée
virale. Elles permettent l’interaction avec les récepteurs cellulaires et induisent la fusion
entre l’enveloppe lipidique virale et la membrane cellulaire. Les protéines d’enveloppe E1 et
E2 sont synthétisées à partir de la polyprotéine virale et obtenues après clivage de la région
N-terminale par des peptidases d’origine cellulaire (361).
Les glycoprotéines E1 et E2 sont des protéines membranaires de type I comportant un
large ectodomaine N-terminal et un domaine transmembranaire C-terminal composé d’une
hélice α en un seul passage (215). Initialement, les domaines transmembranaires
contiennent deux segments hydrophobes séparés par un court segment polaire très
conservé (362). Lors de la synthèse des protéines, les ectodomaines de E1 et E2 sont dirigés
vers la lumière du RE et les domaines transmembranaires sont ancrés dans la membrane de
ce compartiment [figure 11]. Après le clivage entre E1 et E2 ou E2 et p7, les régions en C-
terminal sont réorientées vers le cytosol, formant un domaine transmembranaire à segment
unique (363).
Figure 11 : Clivage des glycoprotéines d’enveloppe du VHC.
Les deux glycoprotéines E1 et E2 présentent un large ectodomaine N-terminal orienté vers la lumière du RE et
des domaines transmembranaires C-terminaux insérés dans la membrane. Les ciseaux bleus indiquent les
clivages effectués par les peptidases signal cellulaires et les ciseaux rouges par la signal peptide peptidase
(SPP). Les domaines transmembranaires de E1 et E2 sont représentés dans leur topologie pré-clivage. La
réorientation post-clivage de ces domaines est indiquée par une flèche en gras. (d’après Vieyres et al., Viruses
2014)
35
Durant leur biogenèse, les formes intracellulaires des protéines d’enveloppe
s’assemblent en hétérodimères E1E2 non covalents (364-366) ; alors que les protéines E1 et
E2 associées aux virions forment des agrégats hétérogènes liés de façon covalente et
stabilisés par des ponts disulfures (201). Les hétérodimères non covalents représenteraient
les complexes fonctionnels, exerçant un rôle dans l’entrée virale. Le repliement de E1
dépend de la co-expression de E2 (367, 368) ; et la glycoprotéine E1 influence également les
étapes finales du repliement de E2 (363, 369-371). Ainsi, les deux glycoprotéines coopèrent
pour une mise en conformation correcte de l’hétérodimère E1E2 et la formation d’un
complexe fonctionnel (372). La glycoprotéine E1 s’associerait en trimère, impliquant la
formation de trimères d’hétérodimères E1E2 à la surface des particules virales (373).
2. Maturation
Au cours de leur passage dans le RE, les glycoprotéines E1 et E2 subissent des
modifications co- et post-traductionnelles, en particulier la N-glycosylation (374). Ainsi, leurs
ectodomaines deviennent hautement N-glycosylés (375, 376). La protéine E1 porte quatre
sites potentiels de N-glycosylation fortement conservés (377, 378). La glycoprotéine E2
comprend onze sites potentiels de N-glycosylation, dont neuf très conservés à travers tous
les génotypes (377-382). Certaines souches présenteraient, par ailleurs, un site potentiel de
N-glycosylation supplémentaire localisé dans la région hypervariable 1 (HVR1 pour
HyperVariable Region 1) (383).
Dans le RE, les quatre sites de glycosylation sur E1 et les onze sites sur E2 sont modifiés
par un mécanisme commun de N-glycosylation (379, 384, 385). Néanmoins, une certaine
hétérogénéité a été déterminée dans la composition des N-glycanes. Alors que la majorité
des sites de N-glycosylation sont occupés par des glycanes riches en mannoses, des N-
glycanes complexes ont été identifiés (201, 386). Les glycoprotéines d’enveloppe pourraient
également être exposées à un processus de O-glycosylation (384, 387).
Tandis que la protéine E1 exprimée seule n’est pas efficacement N-glycosylée, sa N-
glycosylation se trouve améliorée par la co-expression de E2 (377). La N-glycosylation de E1
est donc dépendante de la présence de la séquence d’un polypeptide situé en aval sur la
polyprotéine (388).
36
3. Organisation fonctionnelle
Les protéines d’enveloppe sont insérées dans la membrane par leurs domaines
transmembranaires C-terminaux. Outre leur rôle dans l’ancrage membranaire, ils
contribuent à la rétention des glycoprotéines dans le RE (389-393). Les domaines
transmembranaires participent également à la formation d’hétérodimères non covalents
entre E1 et E2 (362, 394-396).
Contrairement aux domaines transmembranaires, les ectodomaines seuls ne
s’hétérodimèrisent pas ; cependant, ils pourraient intervenir dans ce processus (397-399). La
délétion de la région hypervariable 2 (HVR2 pour HyperVariable Region 2) ou de la région
variable intergénotypique (IgVR pour Intergenotypic Variable Region) abroge également la
formation des complexes E1E2 (400). Les ectodomaines présentent des résidus cystéines,
formant des ponts disulfures au sein de chaque protéine, nécessaires à l’infectiosité des
particules virales (401, 402).
Pendant longtemps, l’organisation des glycoprotéines était supposée comparable à
celle retrouvée chez des virus apparentés de la famille des Flaviviridae. Une forte homologie
de structure avec les protéines de fusion de classe II avait été suggérée (403, 404).
Précédemment, un modèle structural de l’ectodomaine de la protéine E2 avait été établi
(405). Or, ce modèle a été remis en cause, suite à l’obtention récente de la structure
cristallographique d’une partie de la glycoprotéine E2 (406) [figure 12], confirmée par une
autre équipe (407) (408).
Figure 12 : Structure cristallographique de l’ectodomaine de la glycoprotéine E2.
37
La structure cristallographique de l’ectodomaine de E2, dépourvue de HVR1, est représentée. La couche avant
en N-terminal est colorée en bleu ciel, les feuillets externe (violet) et interne (rouge) forment le sandwich β
central, la boucle de liaison au récepteur CD81 est indiquée en bleu, une région flexible (blanc) comporte HVR2
et la couche arrière est représentée en vert. Les ponts disulfures sont indiqués en jaune et les sites de N-
glycosylation par des cercles verts. Les astérisques précisent les N-glycanes délétés dans cette construction. Les
régions désordonnées sont représentées en pointillés. (d’après Kong et al. Science 2013)
Ainsi, la protéine E2 ne se conforme pas à la structure d’une protéine de fusion de
classe II. Elle formerait une structure majoritairement globulaire constituée de boucles, de
courtes hélices α et de feuillets β antiparallèles ainsi que d’un domaine central structuré en
sandwich β, stabilisé par deux ponts disulfures (406, 407) [figure 13]. Les régions
hypervariables (HVR1, 2 et 3) contribuent à l’attachement des virions à la surface de la
cellule cible ainsi qu’à l’infectiosité des particules virales (409, 410). Elles concourent ainsi au
rôle primordial de E2 dans l’entrée virale. Si HVR1 semble avoir une importance partielle
pour certaines fonctions du récepteur SR-BI dans le processus d’entrée, cette région
modulerait l’association des virus aux apolipoprotéines (411). E2 comporte également un
domaine d’interaction au récepteur CD81, essentiel à l’entrée du VHC (405, 412) Alors que
HVR2 pourrait réguler la liaison E2-CD81 (413), la région IgVR serait impliquée durant le
changement conformationnel nécessaire au processus de fusion (405). Le domaine HVR1
pourrait, par ailleurs, permettre au virus d’échapper au système immunitaire, en protégeant
des épitopes neutralisants conservés de E2 (414-416).
Figure 13 : Représentation schématique de l’ectodomaine de la glycoprotéine E2.
A Kong et al. Les feuillets β sont représentés par des flèches et les hélices α par des cylindres. Les sites de N-
glycosylation sont numérotés à partir de l’extrémité N-terminale ; les sites 4 et 9 se trouvent mutés. Les ponts
disulfures sont indiqués par des lignes grises en pointillés fins. Les structures en bleu représentent le sandwich
β central. La boucle rouge correspond au domaine de liaison à CD81. Les structures grises représentent les
acides aminés absents de la construction et les structures jaunes indiquent les régions désordonnées. HVR2 est
délétée. Les acides aminés délimitant les autres domaines structurels sont numérotés à partir du début de la
polyprotéine. B Khan et al. Les symboles et le code couleur sont similaires à A. (d’après Sabahi et al., J Virol.
2014)
38
Le rôle des glycoprotéines E1 et E2 dans la fusion entre l’enveloppe virale et la
membrane cellulaire a été largement controversé. Si leur implication dans ce processus est
indéniablement avérée (417-420), les résultats des études divergent quant à savoir si le
peptide de fusion est précisément porté par la protéine E1 ou E2. Comme précédemment
avancé (404), E2 a longtemps été considérée comme une protéine de fusion (405).
Cependant, cette hypothèse a été récusée après la détermination de la structure
cristallographique de l’ectodomaine de E2 (406, 407). Selon d’autres études, la protéine E1
aurait une implication dans la fusion (392, 421-426). Ces données divergentes soumettent
que les deux protéines, E1 et E2, puissent participer au mécanisme de fusion (419, 427). Au
contraire, ni E1 ni E2 ne pourrait comporter le peptide de fusion, si bien que la fusion
pourrait être initiée par un autre processus (408).
E. La N-glycosylation des protéines d’enveloppe E1 et E2
1. Principe de la N-glycosylation
Au cours de leur passage dans le RE et dans l’appareil de Golgi, les protéines
immatures subissent des modifications co-et post-traductionnelles, dont la glycosylation. A
l’issue de ces modifications, les protéines se trouvent sous leur forme mature et
correctement repliée. Dans les systèmes eucaryotes, il existe deux types de glycosylation ; la
O-glycosylation et la N-glycosylation.
La N-glycosylation consiste en l’ajout d’oligosaccharides sur un résidu asparagine de la
protéine. Ce processus passe par la reconnaissance d’une séquence spécifique Asparagine-X-
Sérine/Thréonine-X’ (N-X-S/T-X’). La nature de l’acide aminé central X influence l’efficacité
de la N-glycosylation (428). Les acides aminés X’ du séquon peuvent également déterminer
l’efficacité du transfert de l’oligosaccharide. En position X, la leucine, le tryptophane, l’acide
glutamique et l’acide aspartique entraînent une N-glycosylation inefficace ; tandis que les
acides aminés chargés positivement, tels que l’histidine et la lysine, sont généralement
favorables au transfert (429). Les résidus tryptophane et acide glutamique en position X’
diminuent la modification (430). Alors que la présence d’une proline en position X et X’
empêche complètement la N-glycosylation (431-434), les résidus thréonine et sérine
comptent parmi les acides aminés les plus favorables aux deux positions (429). Par ailleurs,
le remplacement d’un résidu sérine par une thréonine engendre un meilleur transfert de
39
l’oligosaccharide (435-437). Enfin, des résidus cystéines proches du site peuvent inhiber la
glycosylation, en introduisant des contraintes conformationnelles via la formation de ponts
disulfures (438-440).
2. Mécanisme de la N-glycosylation
a) Biosynthèse des N-glycanes
La synthèse des oligosaccharides commence à la face cytosolique du RE (376). Une
unité oligosaccharidique composée de deux N-acétylglucosamines et de cinq mannoses
(Man5GlcNAc2) est assemblée au dolichol pyrophosphate, un transporteur lipidique
membranaire présent à la face cytosolique du RE. Ce complexe forme le précurseur
glycanique. Sous l’action d’une flipase, le dolichol- Man5GlcNAc2 est transloqué vers le côté
luminal du RE. L’oligosaccharide est modifié par l’addition de quatre résidus mannoses et
trois résidus glucoses. Cet oligosaccharide, le Glc3Man9GlcNAc2, représente le noyau
commun des N-glycanes [figure 14]. Il est ensuite transféré sur la chaîne polypeptidique
naissante et couplé à l’atome d’azote d’un résidu asparagine par une liaison N-glycosidique.
Le transfert de l’oligosaccharide sur l’asparagine du polypeptide en cours de synthèse est
assuré par une enzyme cellulaire, l’oligosaccharyltransférase (OST) (441).
Figure 14 : Noyau oligosaccharidique commun des N-glycanes.
Dans le RE, l’oligosaccharide Glc3Man9GlcNAc2 est ajouté sur la chaîne polypeptidique naissante pour former le
noyau commun des N-glycanes. Il est couplé à un résidu asparagine (Asn) de la séquence consensus Asn-X-
Ser/Thr-X’. Les résidus glucoses et mannoses terminaux sont ensuite clivés par des glucosidases I et II et une
mannosidase I. Asn : asparagine ; Ser : sérine ; Thr : thréonine. (d’après Helenius et al., Science 2001)
40
Immédiatement après le couplage au polypeptide naissant, l’oligosaccharide subit des
étapes de maturation. Sous l’action hydrolytique des glucosidases I et II, les deux premiers
résidus glucoses terminaux sont retirés de l’oligosaccharide par la glucosidase I et II. Puis, la
glucosidase II élimine le dernier glucose. Si la glycoprotéine n’a pas atteint sa conformation
native, elle entre dans le cycle de déglucosylation/reglucosylation jusqu’à son repliement
correct. Enfin, la mannosidase I du RE clive un résidu mannose. La glycoprotéine mature
correctement repliée quitte alors le RE (442, 443) [figure 15].
Figure 15 : Biosynthèse des protéines N-glycosylées.
La N-glycosylation débute à la face cytosolique de la membrane du RE par l’ajout d’oligosaccharides sur le
dolichol pyrophophaste. Après addition de deux N-acétylglucosamines et de cinq mannoses, le précurseur
glycanique est transloqué dans la lumière du RE sous l’action d’une flipase (F). La synthèse se poursuit avec
l’ajout de sept sucres supplémentaires. Quand le dernier glucose est assemblé, l’oligosaccharyltransférase
(OST) catalyse le transfert de l‘oligosaccharide sur un résidu asparagine de la chaîne polypeptidique naissante.
Les trois résidus glucose sont ensuite éliminés par les glucosidases I et II (G1 et G2) et des résidus mannoses
terminaux sont clivés par des mannosidases du RE (MS). Le RE comporte également une glucosyltransférase
(GT) capable de reglucosyler la protéine naissante et d’établir, en association avec la glucosidase II, un cycle de
déglucosylation/reglucosylation maintenu jusqu’à l’acquisition de la conformation définitive et mature de la
glycoprotéine. La glycoprotéine correctement repliée est exportée dans l’appareil de Golgi où elle poursuit sa
maturation. Après clivage de résidus mannoses par la mannosidase I (MI), un groupement N-acétylglucosamine
41
est ajouté par la N-acétylglucosamine transférase (NAcT) puis deux résidus mannoses sont éliminés par la
mannosidase II (MII). Au cours de la glycosylation terminale, des enzymes, telles que la galactosyl-transférase
(GT), fucosyl-transférase (FT), sialyl-transférase (ST), N-acétylglucosamine transférase (NAcT), assurent l’ajout
de différents résidus saccharidiques et génèrent une diversité de glycoformes. (d’après Helle et al., Virologie
2009)
b) Maturation des N-glycanes
Le processus de maturation des N-glycanes se poursuit dans l’appareil de Golgi. Dans le
cis-Golgi, la mannosidase I supprime les résidus mannose afin de produire le substrat
Man5GlcNAc2. La glucosaminyltransférase I ajoute un groupement N-acétylglucosamine, puis
deux résidus mannose sont éliminés par la mannosidase II (428). Durant la glycosylation
terminale, sous l’action de diverses glycosyltransférases, les N-glycanes sont remaniés dans
des structures complexes et les glycoprotéines matures acquièrent une grande diversité
glycanique [figure 15]. Ainsi, le spectre des glycoformes reste homogène jusqu’à ce que les
glycoprotéines atteignent l’appareil de Golgi, où la variabilité structurale est introduite à
travers les différentes modifications enzymatiques (444). En effet, dans le RE la diversité est
limitée aux N-glycanes riches en mannose. Au contraire, les protéines circulant à travers le
Golgi affichent une large variété de N-glycanes. Selon leur composition en sucres, les N-
glycanes sont regroupés en trois types oligomannosidique, hybride et complexe [figure 16].
Figure 16 : Représentation schématique des différents types de N-glycanes.
Les N-glycanes riches en mannoses sont composés uniquement de résidus mannoses. Après ajout de résidus N-
acétylglucosamine, de galactoses ou d’acides sialiques, ils forment des N-glycanes hybrides ou complexes. Asn :
asparagine. (d’après Vieyres et al., Viruses 2014)
42
3. Rôles fonctionnels des N-glycanes associés aux protéines E1 et E2
Les propriétés des N-glycanes interviennent dans divers processus biologiques, tels que
la conformation structurale de la protéine, la stabilité, la protection contre la dégradation, la
solubilité ou le transport des peptides (445). Les N-glycanes s’avèrent également
indispensables pour la fonction des glycoprotéines E1 et E2 et confèrent plusieurs avantages
au VHC (376, 377).
D’une part, les N-glycanes affectent la formation des hétérodimères E1E2 (379, 446),
en influençant la mise en conformation et le repliement des protéines d’enveloppe. Ainsi, la
mutation des sites de N-glycosylation E1N1, E2N8 et E2N10 induit une instabilité des
glycoprotéines virales, entrainant la dégradation de ces protéines et un défaut d’assemblage
des particules virales (385) [figure 17].
D’autre part, les N-glycanes peuvent moduler l’entrée du VHC dans ses cellules cibles
(379, 384, 385). La perte du N-glycane en position E2N3 entraine une diminution importante
de l’infectiosité, liée à un défaut d’entrée. De même, la mutation du site E2N7 affecte
l’infectiosité du VHC sans répercussion sur la sécrétion de particules virales, de façon
génotype-dépendante, précisant le rôle de ce N-glycane dans l’entrée virale (385) [figure
17]. Au contraire, un virus muté dépourvu d’un N-glycane en position E2N6 devient plus
infectieux et plus sensible à l’inhibition par une forme soluble de CD81. Suite au démasquage
du site d’interaction à CD81, le mutant présente une meilleure affinité pour CD81, favorisant
alors l’entrée virale (378, 384, 385). En revanche, aucun des N-glycanes associés à la
glycoprotéine E1 ne semble intervenir dans l’étape d’entrée virale.
Par ailleurs, cinq N-glycanes portés par la glycoprotéine E2 (E2N1, E2N2, E2N4, E2N6 et
E2N11) [figure 17] réduisent l’accessibilité aux anticorps neutralisants reconnaissant des
épitopes conservés à la surface de E2 (378, 384, 385). La perte de ces N-glycanes conduit
donc à une sensibilité accrue vis-à-vis de la neutralisation par des anticorps purifiés à partir
du sérum de patients VHC-séropositifs et par des anticorps monoclonaux. Ainsi, les N-
glycanes limitent la reconnaissance des épitopes neutralisants à la surface de E2 et
protègent le virus contre la neutralisation. Quatre de ces N-glycanes, proches du site
d’interaction à CD81, modulent également l’inhibition par une forme soluble de CD81. En
effet, E2N1, E2N2, E2N4 et E2N6 masquent la liaison de E2 à CD81 (384, 385). Les N-glycanes
présents sur les protéines d’enveloppe forment un bouclier glycanique à la surface du virion,
contribuant à l’échappement du VHC à la réponse immunitaire humorale (447).
43
Figure 17 : Rôles fonctionnels des N-glycanes associés aux glycoprotéines E1 et E2.
Les sites de N-glycosylation présents sur les protéines d’enveloppe sont indiqués par un N suivi du numéro
correspondant à la position relative sur la séquence. Le rôle fonctionnel de chaque N-glycane est précisé par un
cercle de couleur. TMD : domaine transmembranaire ; HVR1 : région hypervariable 1. (d’après Helle et al.,
Virologie 2009)
4. Ciblage des N-glycanes
En raison de leur forte conservation et de leur rôle essentiel dans le cycle viral du VHC,
les N-glycanes présents sur les protéines d’enveloppe constituent une cible intéressante
pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Puisque les protéines virales utilisent la machinerie cellulaire du RE afin d’être N-
glycosylées, il s’avère possible de cibler les enzymes cellulaires nécessaires à la N-
glycosylation pour inhiber le cycle infectieux des virus. Des inhibiteurs de la N-glycosylation
ont déjà été largement utilisés pour leur propriété antivirale contre un large spectre de virus
enveloppés (448, 449). En effet, des inhibiteurs de glucosidases I et II peuvent bloquer la
réplication du VHB, du VIH, du Cytomégalovirus (CMV) ou du virus Influenza (450).
Les inhibiteurs de glucosidases présentent également une efficacité contre le VHC. Ces
molécules provoquent un mauvais repliement des protéines E1 et E2, un mauvais
assemblage des virions, et par conséquent une diminution de l’infectiosité des particules
virales (76, 451, 452). Par ailleurs, l’inhibition des glucosidases a conduit à une réduction
dose-dépendante des titres viraux (160). Cependant, en raison des effets indésirables, il
paraît difficilement concevable de cibler les enzymes cellulaires de la N-glycosylation pour le
traitement anti-VHC. Cette approche engendrerait des perturbations des réactions
enzymatiques au sein de la cellule.
44
Une stratégie prometteuse pour lutter contre le VIH a récemment été proposée. Elle
consiste à cibler directement les N-glycanes portés par les protéines d’enveloppe (453-457).
Cette nouvelle approche, d’une part, inhiberait l’entrée du VIH par des molécules capables
d’interagir avec les N-glycanes (CBA pour Carbohydrate Binding Agent) ; et d’autre part,
sélectionnerait des mutants résistants moins infectieux et mieux neutralisés par le système
immunitaire (453, 458-461). Cette démarche pourrait être appliquée dans le traitement
d’autres infections chroniques causées par des virus présentant des protéines d’enveloppe
glycosylées.
F. Les molécules capables d’interagir avec les N-glycanes
Les premières molécules ciblant les N-glycanes historiquement découvertes
représentent des lectines naturelles. Puisque des composés synthétiques ayant la capacité
d’interagir avec les N-glycanes ont également été identifiés, le terme Carbohydrate Binding
Agents (CBA) a été introduit pour désigner les lectines peptidiques et les composés non
peptidiques de bas poids moléculaire.
1. Lectines
Les lectines représentent des protéines ubiquistes dans la nature. Elles sont retrouvées
à travers une large variété d’espèces différentes, incluant les plantes et les organismes
procaryotes (462-466). Elles regroupent une classe de protéines structurellement
diversifiées ; cependant, elles possèdent une caractéristique commune. Elles interagissent
avec les sucres de façon spécifique et réversible, sans en modifier leur composition ni leur
structure, et elles agglutinent les cellules (467, 468). Impliquées dans divers processus
biologiques, les lectines participent à la reconnaissance cellulaire dans le système
immunitaire, l’induction de l’apoptose, la cancérogenèse, les infections et le ciblage des
glycoprotéines (469).
S’il existe une multitude de lectines, seules les lectines utilisées dans notre étude
seront décrites [tableau 1].
45
Nom de la lectine Abréviation Origine Spécificité de saccharide
Cyanobactéries
Cyanovirin-N CV-N Nostoc ellipsosporum α(1,2)-Man
Algues
Griffithsin GRFT Griffithsia spp. Man, Glc, GlcNAc
Plantes
Amaryllidaceae
Snowdrop lectin /
Galanthus nivalis agglutinin GNA Galanthus nivalis α(1,3)-Man, lactosamine
Fabaceae
Jack bean lectin /
Concanavaline A ConA Canavalia ensiformis Man > Glc > NAcGlc
Tableau 1 : Lectines extraites à partir de plantes ou d’organismes procaryotes interagissant avec le VHC, utilisées dans notre étude.
Man : mannose ; Glc : glucose ; NAcGlc : N-acétylglucosamine.
a) Concanavaline A
La Concanavaline A (ConA) a été extraite de la légumineuse tropicale, le jack bean
(Canavalia ensiformis) (470). La ConA, tétramère de 106 kDa, est constituée de quatre sous-
unités identiques. Chacun monomère comporte un site de reconnaissance spécifique à un
saccharide [figure 18]. L’activité biologique de cette métalloprotéine nécessite
obligatoirement la présence de cations bivalents (471, 472). La ConA se lie
préférentiellement à des N-glycanes contenant des motifs oligosaccharidiques de type
α(1,3)-Man et α(1,6)-Man (473, 474). Elle se fixe également au glucose et à la N-
acétylglucosamine (NAcGlc), avec une moindre affinité (467) [tableau 1].
b) Cyanovirin-N
La Cyanovirin-N (CV-N) est une lectine de 11 kDa, dérivée de la cyanobactérie Nostoc
ellipsosporum (475). Alors que le monomère constitue la forme prédominante [figure 18], la
protéine prend également une configuration dimérique (476, 477). Une sous-unité possède
deux sites de liaison à des oligomannoses, de haute et basse affinité, respectivement (465,
478). Cette protéine présente une spécificité de liaison exclusive à des N-glycanes riches en
mannose α(1,2)-Man (479-482) [tableau 1].
c) Galanthus Nivalis Agglutinin
La Galanthus nivalis agglutinin (GNA) a été isolée du bulbe de perce neige (Galanthus
nivalis), appartenant à la famille des Amaryllidaceae (483). La GNA est un homotétramère de
46
50 kDa constitué de quatre sous-unités identiques non covalentes. Chaque monomère
comprend trois sites fonctionnels de liaison aux oligosaccharides [figure 18]. La GNA
interagit avec des mannoses terminaux (484, 485), avec une forte affinité pour les
oligomères α(1,3)-Man (464, 486), ainsi qu’avec des structures lactosamines présentes sur
des N-glycanes hybrides ou complexes (482) [tableau 1].
d) Griffithsin
La Griffithsin (GRFT) a été isolée à partir de l’algue rouge Griffithsia sp., collectée dans
les eaux de la Nouvelle Zélande (487). La protéine se présente sous forme d’un homodimère
de 25 kDa, offrant six sites de liaison au mannose (488, 489) [figure 18]. La GRFT utilise des
modes de liaison mixtes vis-à-vis du mannose, du glucose et de la N-acétylglucosamine, avec
une affinité préférentielle pour les mannoses terminaux (487, 489) [tableau 1].
Figure 18 : Structures moléculaires des lectines.
La configuration dimérique de la GRFT (d’après François et al., Med Res Rev. 2012) comporte six sites de liaison
aux oligosaccharides. Les structures de la GNA et de la CV-N (d’après Kachko et al., Mol Pharm. 2013) sont
représentées comme des rubans bleus ; les sites de liaison aux oligosaccharides sont colorés en vert. La GNA se
présente sous la forme d’un tétramère, possédant douze sites de liaison aux oligosaccharides. Le monomère de
CV-N offre deux domaines d’interaction aux mannoses. La ConA (d’après RCSB Protein Data Bank), un
tétramère, comporte quatre sites de liaison aux oligosaccharides.
47
2. Dérivés non peptidiques
Si certaines lectines d’origine naturelle constituent aujourd’hui des candidats
antiviraux potentiels, leur taille, leur biodisponibilité, leur propriété antigénique, leur
sensibilité aux protéases, les difficultés de production à grande échelle ainsi que leur
purification les rendent moins compatibles avec un usage systémique. De façon
intéressante, des molécules non peptidiques possédant des propriétés similaires aux lectines
ont été décrits ces dernières années (466, 490, 491). La plupart appartiennent à la famille
des antibiotiques pradimicine/benanomicine, isolés à partir de champignons de la famille
des Actinomycètes. Leur mode d’action anti-fongique repose probablement sur la faculté à
interagir avec les mannoses de façon calcium-dépendante.
La pradimicine A (PRM-A) a été extraite d’un champignon Actinomadura hibisca (492).
Elle interagit avec des mannoses en liaison α(1,2)-Man. Les benanomicines A (BNM-A) et B
(BNM-B) (493, 494), produites par Actinomadura spadix, présentent une structure proche de
la BNM-A et une spécificité pour les résidus mannoses. Plus récemment encore, la
pradimicine S (PRM-S) a été isolée à partir de l’Actinomadura spinosa (495). Cet analogue
soluble de la PRM-A se lie aux N-glycanes riches en mannoses, avec une sélectivité
particulière pour les structures Manα1-6(Manα1-3)-Man (496).
Par ailleurs, il a été montré que l’alcian blue, un dérivé de la phtalocyanine, interagit
avec les N-glycanes et bloque l’infection par le VIH (497).
3. Applications antivirales
a) Activités antivirales
L’activité antivirale de nombreux CBA, particulièrement des lectines, a été décrite ces
dernières années. Ces molécules reconnaissent spécifiquement les N-glycanes riches en
mannose, fréquemment présents à la surface des protéines d’enveloppe virales mais
rarement associés aux protéines cellulaires. Bien que le mécanisme d’action des CBA ne soit
pas clairement élucidé, les CBA agissent comme des inhibiteurs de l’entrée virale au cours
d’une étape précoce de l’infection. Ces molécules multivalentes pourraient immobiliser les
protéines d’enveloppe des virus et empêcher les changements de conformation nécessaires
aux mécanismes d’entrée virale (466). Dans le cas du VIH, si la fixation directe du CBA sur la
48
glycoprotéine d’enveloppe gp120 ne prévient pas de l’interaction initiale entre le virus et la
cellule cible (464), elle empêche l’entrée du VIH. Elle pourrait bloquer la liaison du VIH à des
co-récepteurs cellulaires ainsi qu’inhiber le processus de fusion (457).
La gp120 étant une des glycoprotéines les plus fortement N-glycosylées (382), le VIH
constitue un modèle privilégié pour évaluer l’efficacité inhibitrice de molécules ciblant les N-
glycanes. Les lectines exercent une activité anti-VIH prononcée [tableau 2] en inhibant
l’entrée des particules virales dans les lymphocytes T CD4+ (463, 464, 498). La CV-N inhibe
un grand nombre de souches VIH de laboratoire et d’isolats cliniques à des concentrations
nanomolaires (460, 475). La GRFT, l’un des plus puissants CBA contre le VIH, a prouvé une
activité cytoprotective contre le VIH-1 à des doses de l’ordre du picomolaire (487). La ConA
constitue également un inhibiteur actif contre le VIH (487). Bien que la Urtica dioica
agglutinin (UDA) présente une spécificité pour les résidus NAcGlc, elle est capable de
bloquer l’infection par le VIH-1, néanmoins avec un plus faible potentiel inhibiteur (455, 458,
499). En fait, la taille, la conformation tridimensionnelle, la spécificité oligosaccharidique du
CBA ainsi que l’accessibilité stérique des N-glycanes sur la glycoprotéine d’enveloppe
semblent tenir un rôle essentiel dans l’efficacité antivirale. Les CBA de petite taille
pourraient pénétrer plus facilement dans le bouclier glycanique de la gp120 du VIH (456).
A la fin des années 1980, l’activité anti-VIH de dérivés non peptidiques a été évaluée
[tableau 2]. La PRM-A, les BNM-A et B exercent une action inhibitrice sélective contre le VIH-
1 (500-503). L’infection par le VIH est aussi inhibée par la PRM-S (496).
En plus d’inhiber efficacement l’infection virale, les lectines peptidiques et les
composés synthétiques empêchent la formation de syncytium entre les cellules infectées par
le VIH-1 et les lymphocytes T CD4+ non infectés (456, 457, 464, 496, 498, 501, 502).
Enfin, les lectines et les antibiotiques pradimicine/benanomicine bloquent la capture
des particules virales par les cellules dendritiques DC-SIGN et la transmission du virus aux
lymphocytes T CD4+ (504). De la sorte, ils préviennent la propagation du VIH à travers la
muqueuse génitale (456, 459, 496, 499, 505-507). Ces molécules, inhibant efficacement les
étapes précoces de la propagation virale, ont le potentiel d’empêcher l’établissement d’une
infection persistante (457). L’utilisation de la CV-N sous forme de microbicide a été validée
en étude pré-clinique in vivo (508-512). Par ailleurs, la GRFT constitue un candidat anti-VIH
efficace pour un usage microbicide (513-515), ainsi que la GNA et l’Hippeastrum hybrid
agglutinin (HHA), en raison de leur résistance à des pH acides et leur stabilité à des
températures élevées. La PRM-S possède ces mêmes propriétés physico-chimiques, qui lui
49
permettent d’atteindre de fortes concentrations plasmatiques ou en local et s’avèrent
intéressantes pour un usage microbicide (516).
Outre leur action contre le VIH, les CBA présentent des propriétés antivirales contre un
large spectre de virus [tableau 2]. En effet, l’activité antivirale de la CV-N a été démontrée
sur le virus Herpes Simplex (HSV) de type 1, le virus Influenza ou le virus Ebola (517-519).
Dans le contexte d’infections expérimentales de souris par le virus Ebola, après injection
sous-cutanée, la CV-N exerce une activité antivirale efficace (520). Tandis que la GRFT est
active contre le Coronavirus responsable du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère (SRAS-CoV)
et le virus Ebola (488, 521), la GNA présente un effet inhibiteur contre le CMV (464).
b) Activité anti-VHC
Récemment, l’effet inhibiteur des CBA contre le VHC a été évalué [tableau 2]. La CV-N
prévient l’infection par le VHC in vitro, en ciblant une phase précoce du cycle viral (482, 522).
Elle empêche le contact entre la glycoprotéine d’enveloppe E2 et le récepteur cellulaire
CD81, requise pour l’entrée du VHC. L’inhibition de cette interaction serait due à un
encombrement stérique au niveau du site de liaison à CD81 causé par la fixation de la lectine
sur les N-glycanes (522, 523). Par ailleurs, la GRFT possède une puissante activité inhibitrice
contre le VHC in vitro et in vivo, indépendamment des génotypes (523, 524). Cette lectine
inhibe l’entrée du VHC en bloquant l’interaction E2-CD81, empêche la transmission directe
cellule-cellule du VHC et protège partiellement des souris chimériques d’une infection par le
VHC (523, 524). La GNA inhibe l’entrée du VHC de différents génotypes in vitro (499, 525).
De plus, la GNA possède une grande affinité pour les glycoprotéines du VHC,
comparativement à la CV-N et la Microcystis viridis lectin (MVL) qui interagissent avec des N-
glycanes cellulaires et viraux (482). Elle bloque également efficacement la capture des
particules virales par les cellules dendritiques DC-SIGN (499).
L’activité anti-VHC a aussi été décrite pour d’autres CBA, tels que l’UDA, la MVL, l’HHA,
la Cymbidium agglutinin, la Scytovirin ou encore la PRM-A (482, 499, 524).
Genre du virus Exemples de virus testés Références
Coronavirus SRAS-Coronavirus (487, 526-530)
Filovirus Virus Ebola (517, 520, 531, 532)
Flavivirus Virus de la Dengue (533-535)
Hepacivirus Virus de l’Hépatite C (482, 499, 522, 523, 525)
Herpesvirus Virus Herpes Simplex de type 1 et 2 (519, 536-538)
Cytomégalovirus (463, 464, 530)
Virus Herpes Humain de type 6 (539)
50
Genre du virus Exemples de virus testés Références
Orthomyxovirus Virus Influenza A et B (518, 540-542) Retrovirus Virus de l’Immunodéficience Humaine (454, 455, 463, 475, 478, 487,
496, 499-503, 508, 513, 516, 521,
530, 543-557)
Tableau 2 : Activité antivirale des CBA contre un large spectre de virus enveloppés.
4. Résistance aux CBA
La résistance du VIH à l’action antivirale des CBA a été largement étudiée in vitro.
L’exposition du VIH à des concentrations croissantes de CBA, sur une période relativement
longue, résulte en la sélection de mutations sur la glycoprotéine d’enveloppe gp120,
notamment au niveau des sites de N-glycosylation (458, 459, 558). L’accumulation de
multiples mutations s’avère nécessaire pour identifier une résistance phénotypique
significative (456). En effet, la disparition d’un N-glycane à la surface de la protéine gp120 ne
semble pas suffisante pour que le VIH échappe efficacement à l’action antivirale des CBA. Le
degré de résistance aux CBA semble corrélé au nombre de mutations de sites de N-
glycosylation (459). Les CBA sont donc dotés d’une barrière génétique de résistance élevée.
Sous la pression de sélection induite par des lectines issues de plantes, une vaste majorité
des mutations affectent de façon prédominante des sites de N-glycosylation portant des N-
glycanes riches en mannose (460, 558, 559). Après une exposition prolongée de cellules
infectées par le VIH-1, la pression engendrée par des dérivés non peptidiques, tels que les
PRM-A et S, sélectionne également des souches virales contenant des délétions au niveau de
sites de N-glycosylation de la gp120 (500, 516).
En outre, les N-glycanes jouent un rôle fondamental dans la survie du virus, pour
l’assemblage, l’entrée virale et la protection contre la neutralisation. Leurs fonctions
pourraient donc être affectées par ce phénomène de résistance. La disparition de N-glycanes
sous la pression de sélection exercée par les CBA provoque le démasquage de certains
épitopes neutralisants à la surface de la gp120, augmentant la sensibilité du VIH à l’action
des anticorps neutralisants (453, 457, 458, 559). La perte des sites de N-glycosylation,
induite par les CBA, pourrait alors compromettre les mécanismes de l’évasion immune du
VIH. Ces virus mutés deviendraient moins infectieux et plus sensibles au système
immunitaire (456, 461).
51
II. Objectifs
Les protéines d’enveloppe E1 et E2 du virus de l’hépatite C (VHC) sont fortement N-
glycosylées, avec 4 et 11 sites de N-glycosylation sur E1 et E2 respectivement. La majorité
des sites de N-glycosylation sont très conservés dans tous les génotypes, indiquant que les
N-glycanes occupant ces positions sont importants pour la fonction des glycoprotéines
d’enveloppe. En effet, il a été prouvé que ces N-glycanes jouent un rôle primordial dans le
repliement des protéines d’enveloppe et dans l’étape d’entrée du VHC (379, 384, 385). En
raison de leur conservation et de leur fonction essentielle pour le déroulement correct du
cycle viral, les N-glycanes constituent une cible intéressante pour le développement de
nouvelles stratégies thérapeutiques anti-VHC. Plusieurs études ont largement contribué à
démontrer que l’utilisation de CBA permettait d’inhiber l’entrée du VHC in vitro et in vivo
(482, 499, 522-525). Toutefois, aucune étude concernant la résistance du VHC à une telle
stratégie thérapeutique n’a été décrite à ce jour.
Dans ce travail, nous avons cherché à évaluer in vitro la résistance du VHC à différentes
lectines. Un intérêt particulier a alors été porté à l’effet de mutations potentielles de
résistance, caractérisées après sélection, sur la sensibilité vis-à-vis de l’inhibition à la GNA,
CV-N, ConA et GRFT.
52
III. Matériels et méthodes
A. Culture cellulaire et virale
1. Lignée cellulaire
La lignée cellulaire utilisée est la lignée de cellules d’hépatocarcinome humain Huh7-
RFP-NLS-IPS (560), obtenue par transduction de cellules Huh-7 (561) avec un Lentivirus
codant la protéine rapporteuse RFP-NLS-IPS (562). Cette protéine rapporteuse est composée
de la protéine fluorescente rouge (RFP), de la séquence de localisation nucléaire de SV40
(NLS) et de la région C-terminale de la protéine IPS-1, contenant une séquence d’adressage à
la mitochondrie et un site de clivage reconnu par la protéase NS3-4A du VHC. Dans les
cellules infectées par le VHC, le clivage de la construction RFP-NLS-IPS par la protéase NS3-
4A entraîne la synthèse d’un produit de clivage RFP-NLS qui est transporté de la
mitochondrie vers le noyau.
Cette lignée cellulaire est entretenue dans un milieu de croissance Dulbecco’s Modified
Essential Medium (DMEM, Gibco®
) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF,
Gibco®
). Les cellules sont cultivées à 37°C sous 5% de CO2.
2. Virus et plasmide
Le virus utilisé code le génome JFH-1-CS-A4, une version modifiée de la souche JFH-1
(Japanese Fulminant Hepatitis 1) du VHC de génotype 2a (GenBank access number
AB237837), gracieusement fourni par T. Wakita (National Institute of Infectious Diseases,
Tokyo, Japan) (563). Il contient les mutations F172C et P173S à l’extrémité C-terminale de la
protéine Core, permettant une meilleure production virale (564) et l’épitope de l’anticorps
monoclonal A4 à l’extrémité N-terminale de la protéine E1 (365), comme précédemment
décrit (565). Pour la caractérisation des mutations par reverse génétique, le plasmide codant
le génome JFH-1-CS-A4-RLuc-DM (référencé Wild-Type (WT) dans cette étude) a été utilisé. Il
contient en plus un gène rapporteur codant la Renilla Luciferase et deux mutations
d’adaptation (R1373Q dans NS3 et C2441S dans NS5A), comme précédemment décrit (560).
Ces deux mutations sont connues pour avoir un effet bénéfique sur la réplication et la
sécrétion des virions (566-569).
53
B. Réactifs
Les lectines ont été gracieusement fournies par K. Gustafson (National Institutes of
Health, National Cancer Institute, Frederick, MD, USA) pour la Cyanovirin (CV-N) et par K. E.
Palmer (Owensboro Cancer Research Program, Owensboro, Kentucky, USA) pour la
Griffithsin (GRFT). La Galanthus nivalis agglutinin (GNA) et la Concanavaline A (ConA) ont été
acquises auprès de Sigma.
C. Test de viabilité cellulaire
Les cellules Huh7-RFP-NLS-IPS ont été incubées pendant 72 h en présence de
différentes concentrations de lectines GNA, CV-N, ConA et GRFT. La viabilité a été mesurée à
l’aide du kit « CellTiter-glo
luminescent / Cell viability assay », selon les recommandations
du fabricant (Promega®).
D. Sélection de souches virales après exposition aux lectines
Des cellules Huh7-RFP-NLS-IPS ont été infectées par un stock de virus JFH1-CS-A4
(désigné i6 dans (560)) en présence d’une concentration initiale en lectines GNA, CV-N, ConA
et GRFT (1, 0.1, 2 et 1 µg/mL, respectivement) permettant d’inhiber 90 % du virus. Les
cellules infectées ont ensuite été cultivées en présence de concentrations croissantes de
lectines jusqu’à ce que 100% des cellules soient infectées. Quand la totalité des cellules était
infectée, les surnageants de culture étaient récupérés et utilisés pour infecter des cellules
naïves en présence de la lectine.
E. Caractérisation des souches virales après exposition aux lectines
Après extraction des ARN du VHC des surnageants de culture, à l’aide du « QIAamp
Viral RNA Mini Kit » (Qiagen
), une RT-PCR a été réalisée sur les ARN viraux, au moyen du
« QIAGEN® OneStep RT-PCR Kit ». Les amorces utilisées sont disponibles en annexe [annexe
1]. Les produits de PCR ont ensuite été purifiés à l’aide du « QIAquick PCR Purification Spin
Kit » (Qiagen
). Enfin, la séquence des gènes de capside, E1, E2 et p7 a été déterminée par
séquençage direct, sur les fragments de RT-PCR purifiés, au moyen du kit « Big Dye
54
Terminator v1.1 Cycle Sequencing » (Applied Biosystems
). Les séquences des amorces
utilisées sont disponibles en annexe [annexe 1]. Le séquençage nucléotidique a été réalisé
sur le séquenceur 3500 XL Dx Genetic Analyzer et à l’aide du logiciel SeqScape v 2.7.
F. Mutagenèse dirigée
Le clonage des mutations potentielles de résistance dans un plasmide codant le
génome du virus JFH1-CS-A4-RLuc-DM (WT) a été réalisé selon le protocole du
« QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit » (Agilent Technologies
).
1. Réaction de Polymérisation en Chaîne
Les Réactions de Polymérase en Chaîne (PCR pour Polymerase Chain Reaction) ont été
effectuées sur le plasmide WT avec l’enzyme Pfu DNA polymérase, selon les
recommandations du fabricant. Les amorces utilisées sont disponibles en annexe [annexe 1].
Les produits d’amplification PCR ont été digérés par l’enzyme de restriction DpnI pendant
une heure à 37°C, afin de dégrader le plasmide d’origine non muté.
2. Transformation de bactéries
La transformation bactérienne a été réalisée, par choc thermique, pour chaque produit
de PCR digéré par DpnI, avec des bactéries chimiquement compétentes Escherichia. coli Top
10 (Invitrogen
). La sélection des clones transformés par le plasmide comprenant un gène
de résistance à l’ampicilline a été effectuée sur une gélose LB-agar contenant de la
carbénicilline à 100 µg/ml (Invitrogen
).
3. PCR à partir de bactéries
Au moyen du « QIAGEN®
Long Range PCR Kit », une PCR a été réalisée sur un extrait
d’ADN, obtenu à partir des clones sélectionnés. Les amorces utilisées sont disponibles en
annexe [annexes 1 et 2]. Puis, les produits de PCR ont été purifiés à l’aide du « QIAquick PCR
Purification Spin Kit » (Qiagen
).
55
4. Séquençage
La séquence des génomes viraux mutés, encadrant la mutation d’intérêt insérée, a été
déterminée par séquençage, sur les fragments de PCR purifiés, en utilisant le kit « Big Dye
Terminator v1.1 Cycle Sequencing » (Applied Biosystems
), comme décrit précédemment.
Les séquences des amorces utilisées sont disponibles en annexe [annexes 1 et 2].
5. Préparation d’ADN plasmidique
Les plasmides mutés ont ensuite été extraits selon les recommandations du
« Nucleobond
Xtra Maxi Kit » (Macherey-Nagel
) et le protocole « High-copy Plasmid DNA
Purification ». Après une étape de purification, les ADN plasmidiques ont été resuspendus à
une concentration de 1 µg/µl. La concentration est évaluée, au Nanodrop ND-100 v3.7.1, par
mesure de la densité optique à 260 nm et la pureté par le rapport des densités optiques à
260 et 280 nm.
La région codant le génome du VHC a été finalement séquencée entièrement, au
moyen du kit « Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing » (Applied Biosystems
), comme
décrit précédemment, afin de s’assurer de l’absence d’apparition d’autres mutations dues à
la PCR ou à une recombinaison. Les séquences des amorces utilisées sont disponibles en
annexe [annexe 1].
G. Réplication virale
Les plasmides codant le VHC WT et les génomes viraux mutés ont été linéarisés par
l’enzyme XbaI (Biolabs
), dont le site de coupure se trouve juste après la séquence codant la
région 3’UTR du virus JFH-1, puis digérés par l’enzyme Mung Bean Nuclease (Biolabs
). Les
ADN purifiés ont été resuspendus à une concentration de 1 µg/µL. Les plasmides linéarisés
ont ensuite été transcrits en ARN par la T7 RNA Polymerase en utilisant le « MEGA
scriptT7
High Yield Transcription Kit » (Ambion
). Puis, les transcrits ont été précipités par ajout de
chlorure de lithium et resuspendus à une concentration de 1 µg/µL.
Des cellules Huh-7-RFP-NLS-IPS ont été transfectées par 10 µg d’ARN viraux
synthétisés, par électroporation avec l’appareil Gene Pulser II (BIO-RAD) selon les
paramètres suivants : high capacitance 950 µF et 0,28 kV. La réplication a été évaluée à 4,
24, 48 et 72 h en mesurant les activités Renilla Luciferase dans les cellules transfectées, à
56
l’aide du kit « Renilla Luciferase Assay System » (Promega
), du luminomètre Centro XS3 LB
960 (Berthold Technologies) et du logiciel Mikrowin 2000.
H. Tests d’infectiosité
Les surnageants des cellules transfectées par des ARN WT ou des génomes mutés ont
été récupérés 2 jours après l’électroporation et filtrés. Les surnageants, contenant les
particules virales, ont été incubés pendant 4 h à 37°C avec des cellules Huh-7-RFP-NLS-IPS.
Les activités Renilla Luciferase ont été mesurées sur les cellules infectées à 72 h post-
infection.
I. Tests d’inhibition
Les surnageants des cellules transfectées par des ARN WT ou des génomes mutés ont
été récupérés 6 à 8 jours après l’électroporation et filtrés. Les tests d’inhibition ont été
réalisés en incubant des surnageants comportant les particules virales, en présence de
concentrations croissantes de lectines (GNA, CV-N, ConA et GRFT). Après 1 h d’incubation à
37°C, les mélanges ont été mis en contact avec des cellules cibles pendant 4 h à 37°C. Les
lectures Luciferase ont été réalisées sur les cellules infectées à 72 h post-infection.
J. Western Blot
72 h post-électroporation, les cellules Huh-7-RFP-NLS-IPS transfectées par des ARN WT
ou des génomes mutés ont été lysées par du PBS-Triton 100X 0,1%. Après une séparation
par électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du sodium dodécyl sulfate (SDS-
PAGE), les extraits protéiques ayant migré sur gel sont transférés sur des membranes de
nitrocellulose. Les membranes sont bloquées au PBS-Tween 20 0,1%-lait 4% pendant 1 h à
température ambiante, et incubées dans une solution d’anticorps monoclonal primaire
spécifique (A4 [anti-E1, souris] et 3/11 [anti-E2, rat], gracieusement fournis par J. Dubuisson,
Université de Lille, France et J. McKeating, University of Birmingham, United Kingdom,
respectivement, dilués au 1:1000 dans du PBS-Tween 20 0.1%-BSA 5%-Azide 0.2%) sur la nuit
à 4°C. Après des étapes de lavage, les membranes sont incubées avec un anticorps
secondaire couplé à la peroxydase (anti-souris 1:10000 et anti-rat 1/20000, Sigma
) pendant
57
1 h à température ambiante puis lavées. Les protéines E1 et E2 ont été révélées à l’aide du
« Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate kit » (Millipore
).
K. Analyse statistique
Le test statistique de Mann Whitney a été utilisé, et les valeurs p < 0.05 et p < 0.001
sont considérées comme les seuils de significativité.
58
IV. Résultats
A. Production de clones viraux résistant aux lectines
En vue d’étudier la résistance du VHC à l’effet inhibiteur de différents CBA, nous avons
sélectionné en culture cellulaire du VHC résistant aux lectines GNA, CV-N, ConA et GRFT puis
effectué des constructions plasmidiques en insérant les mutations potentielles de résistance
identifiées.
1. Sélection de VHC résistant aux lectines
Afin de sélectionner in vitro des clones viraux résistants aux CBA, nous avons cultivé du
VHC en présence de concentrations croissantes de lectines spécifiques des N-glycanes riches
en mannose. Nous avons infecté des cellules Huh7-RFP-NLS-IPS (560, 562) par du VHC en
présence d’une concentration initiale en lectines GNA, CV-N, ConA et GRFT (1, 0.1, 2 et 1
µg/mL, respectivement) permettant d’inhiber 90 % du virus. Les cellules infectées ont
ensuite été cultivées tous les trois à quatre jours en présence de lectines jusqu’à ce que
100% des cellules soient infectées. Quand la totalité des cellules était infectée, les
surnageants de culture étaient récupérés et utilisés pour infecter des cellules naïves en
présence de lectines [figure 19]. Dans ces conditions, nous avons pu cultiver le VHC en
présence de 30 µg/mL de GNA après trois mois et de 2 µg/mL de CV-N après deux mois. La
concentration en ConA s’élevait à 10 µg/mL, en raison de la toxicité de la lectine à des
concentrations plus fortes [annexe 3]. Il a été difficile de cultiver le virus en présence de
GRFT, suggérant que l’adaptation du VHC à cette lectine s’avèrerait plus complexe.
59
Figure 19: Sélection de VHC après exposition à la GNA, CV-N, ConA et GRFT en culture cellulaire.
Des cellules Huh7-RFP-NLS-IPS ont été infectées par du VHC en présence d’une concentration initiale de
GNA (A), CV-N (B), ConA (C) et GRFT (D), permettant d’inhiber 90 % du virus. Les cellules infectées ont
ensuite été cultivées en présence de la lectine. Quand 100% des cellules étaient infectées (représenté
par une flèche), le surnageant de culture était récupéré et utilisé pour infecter des cellules naïves en
présence de la lectine. La courbe montre l’évolution de la concentration en lectine ajoutée dans le
milieu de culture, au cours de la sélection. Les étoiles indiquent le temps auquel le virus a été récolté et
séquencé.
2. Analyse des gènes d’enveloppe du VHC après la sélection
Dans le but d’identifier les mutations sélectionnées dans les gènes des protéines
d’enveloppe E1 et E2 pendant l’étape de sélection en culture cellulaire, nous avons séquencé
les régions génomiques compris entre la protéine de capside et p7. Pour cela, à la fin de la
sélection, nous avons procédé à l’extraction des ARN viraux. Après RT-PCR sur les ARN
viraux, nous avons séquencé les gènes d’intérêt. Le séquençage nous a permis de mettre en
évidence huit mutations potentielles de résistance, apparaissant par combinaison de trois
mutations pour chaque lectine. Trois mutations ont été identifiées avec la GNA : V284A dans
E1, V392D et S449P dans E2. De façon intéressante, la mutation S449P empêche l’addition
d’un N-glycane sur le site de N-glycosylation E2N4, en introduisant un résidu proline entre
l’asparagine 448 et la sérine 450. La mutation M338V dans E2 a été retrouvée après la
culture du VHC en présence de CV-N, ConA et GRFT. Nous avons également identifié la
mutation L755M dans p7 dans les trois virus isolés après culture en présence de ces lectines.
Trois autres mutations, L612M, N417S et A400D, ont aussi été détectées dans le génome des
60
virus sélectionnés par la CV-N, ConA et GRFT, respectivement. La mutation N417S, résultant
d’une substitution d’un acide aminé asparagine vers une sérine, entraîne un décalage du site
de N-glycosylation E2N1 du résidu N417 vers N415 (570). Par ailleurs, quand le virus est
cultivé en absence de lectine, nous avons uniquement identifié la mutation I559V dans E2.
Un résumé des mutations sélectionnées est présenté dans le [tableau 3]. A l’aide de
l’European Hepatitis C Virus database (euHCVdb) (571), nous avons observé que les
mutations V284A, N417S, S449P et L755M apparaissent sur des résidus hautement
conservés dans des séquences de VHC de génotype 2a mais également d’autres génotypes
[annexe 4]. Dans les séquences, trois mutations synonymes ont été identifiées après
exposition à la GNA (une dans la partie terminale de la capside et deux dans p7). Ainsi, ces
résultats suggèrent qu’une pression de sélection positive se produit sur les gènes des
protéines d’enveloppe du VHC en présence de lectines. Cette donnée est confortée par le
graphique représentant le ratio cumulatif dS/dN, qui reflète le nombre de mutations
synonymes versus le nombre de mutations non synonymes identifiées sur le génome,
obtenu à l’aide du programme d’analyse
(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/SNAP/SNAP.html) (572) et après comparaison
des quatre séquences des virus sélectionnés après exposition aux lectines et de la séquence
du WT [annexe 5].
Lectine Dose (µg/mL)
Identification des mutations (protéine) Début Fin
GNA 1 30 V284A (E1) ; V392D (E2) ; S449P* (E2)
CV-N 0.1 2 M338V (E1) ; L612M (E2) ; L755M (p7)
ConA 2 10 M338V (E1) ; N417S# (E2) ; L755M (p7)
GRFT 1 1 M338V (E1) ; A400D (E2) ; L755M (p7)
Ctrl - - I599V+ (E2)
Tableau 3 : Caractéristiques des sélections de VHC après exposition aux lectines.
*: Cette mutation provoque un défaut de N-glycosylation du site E2N4 sur l’asparagine 448.
#: Cette mutation entraine un décalage du site de N-glycosylation E2N1.
+: Cette mutation n’a pas d’effet sur la réplication virale ni sur la production de particules virales infectieuses
(560).
3. Constructions plasmidiques des virus mutés
Afin de caractériser l’effet des différentes mutations sélectionnées sur le fitness du
virus, nous les avons réintroduites, par mutagenèse dirigée, dans un plasmide codant le
génome du virus JFH1-CS-A4-RLuc-DM (WT) exprimant la protéine rapporteuse Renilla
Luciferase (560). Puisque la mutation L755M dans p7 a été identifiée dans trois sélections
61
indépendantes, nous avons décidé de la caractériser. Les mutations ont été introduites
individuellement et par combinaison de deux ou trois.
B. Effet des mutations sur la réplication virale
Tout d’abord, nous avons évalué l’impact des mutations sur l’étape de réplication du
VHC. Des cellules Huh-7-RFP-NLS-IPS ont été transfectées avec les ARN génomiques mutés.
Des cellules Huh-7-RFP-NLS-IPS non infectées ont été utilisées comme témoin négatif pour
définir le niveau basal d’activité Luciferase et l’ARN WT a servi de contrôle positif. Un virus
déficient pour la réplication comportant une mutation dans NS5B (GND) et un virus
contenant une délétion dans la région du génome codant les protéines d’enveloppe E1E2,
connue pour inactiver la sécrétion des particules virales (∆E1E2) ont également été utilisés
comme contrôles pour la réplication et l’assemblage, respectivement (563). La réplication a
été étudiée à 24, 48 et 72 h post-électroporation, en mesurant les activités Luciferase dans
les cellules transfectées [figure 20].
Figure 20 : Effet des mutations sur la réplication virale.
62
La réplication a été évaluée à 4, 24, 48 et 72h post-électroporation par quantification des activités Luciferase
dans les cellules transfectées. Les résultats sont exprimés en Relative Light Units (RLU) normalisés à 4 h et sont
reportés comme les moyennes ± les écart-types d’au moins trois expériences indépendantes. Les activités
Luciferase obtenues avec les surnageants des cellules non infectées sont d’environ 103 RLU. (* : p < 0.05)
Les activités Luciferase dans les cellules électroporées après 24, 48 et 72 h sont
comparables pour le virus WT et les virus mutés. Certaines mutations individuelles et
combinaisons de deux mutations entrainent de légères variations de réplication. Une
augmentation de la réplication est observée à 72 h pour les mutants N417S, L612M et
V284A-S449P (x 1.6, 1.6 et 2.0 par rapport au WT, respectivement, p < 0.05). Au contraire, le
double mutant V284A-V392D montre une diminution relativement faible de la réplication (x
0.6 comparé au WT, p < 0.05). Cependant, les combinaisons de trois mutations n’affectent
pas la réplication virale de façon significative (x 1.2, 1.2, 1.7 et 1.4 par rapport au WT pour
V284A-V392D-S449P, M338V-A400D-L755M, M338V-N417S-L755M et M338V-L612M-
L755M, respectivement).
De plus, nous avons analysé l’effet des mutations sur l’expression des glycoprotéines
d’enveloppe E1 et E2, par Western Blot sur des lysats de cellules à 72 h post-électroporation
[figure 21]. En parallèle, des cellules Huh-7-RFP-NLS-IPS non infectées ainsi que des cellules
électroporées par du virus ∆E1E2 ont servi de contrôles négatifs [données non montrées] ;
des lysats cellulaires contenant le virus WT ont été utilisés comme témoin positif. La
protéine d’enveloppe comportant la mutation S449P migre plus rapidement que les autres
glycoprotéines et présente un décalage de poids moléculaire correspondant probablement à
la perte d’un glycane (E210g). Ceci confirme que cette mutation empêche l’ajout d’un N-
glycane en position 448, sur le site de N-glycosylation E2N4, en introduisant un résidu
proline en position 449. Tandis que la détection du mutant A400D semble plus forte, la
détection de N417S se révèle plus faible. Ces variations d’intensité pourraient être dûes à
une différence d’affinité de l’anticorps 3/11 pour la protéine virale. En effet, l’épitope de
l’anticorps 3/11 est localisé entre les résidus 412 et 423 de la protéine E2 ; or la mutation
N417S se situe dans cette région et A400D s’en trouve proche. Ce problème de
reconnaissance de l’épitope par l’anticorps s’avère d’autant plus probable qu’un niveau de
détection est équivalent de la protéine E1 pour tous les mutants.
63
Figure 21 : Effet des mutations sur l’expression des glycoprotéines E1E2.
L’expression des glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 a été analysée sur des lysats cellulaires à 72 h post-
électroporation par Western Blot, en utilisant des anticorps monoclonaux anti-E1 (A4) et anti-E2 (3/11). La
glycoprotéine d’enveloppe E2 présentant la mutation S449P, dépourvue d’un glycane, est indiquée E210g. Les
glycoprotéines E1 et E2 n’ont pas été détectées dans les cellules non infectées ou électroporées par le mutant
∆E1E2.
C. Effet des mutations sur la production de virus infectieux
Afin de poursuivre la caractérisation des différentes mutations, la production de virus
infectieux a été mesurée pour chaque mutant et comparé au virus WT. Les surnageants de
culture contenant les particules virales ont été recueillis 48 h après l’électroporation et
incubés pendant 4 h à 37°C avec des cellules Huh-7-RFP-NLS-IPS naïves. 72 h après cette
infection, les activités Luciferase ont été quantifiées. Les surnageants de cellules
électroporées avec le virus WT ont servi de contrôle positif ; les surnageants de cellules non
infectées ou électroporées avec le mutant ∆E1E2 comme contrôles négatifs, afin de
déterminer le niveau basal d’activité Luciferase [figure 22].
64
Figure 22 : Effet des mutations sur la production de particules infectieuses.
La production de virus infectieux a été étudiée en mesurant les activités Luciferase dans des cellules infectées
par du virus recueilli 48 h post-électroporation. Les résultats sont exprimés en RLU normalisés par la réplication
à 48 h et sont reportés comme les moyennes ± les écart-types d’au moins trois expériences indépendantes. Les
activités Luciferase obtenues avec les surnageants des cellules non infectées ou avec les surnageants des
cellules inoculées avec le virus ∆E1E2 sont d’environ 103 RLU. (* : p < 0.05, ** : p < 0.001)
Alors que la production de particules infectieuses des virus mutés se rapproche de celle
du WT, l’infectiosité des mutants A400D et A400D-L755M est significativement réduite (x 3.8
et x 2.7 par rapport au WT, p < 0.05 et p < 0.001, respectivement). En revanche, les résultats
révèlent que d’autres combinaisons de deux mutations potentielles de résistance modulent
positivement l’infectiosité. La production de virus infectieux est nettement améliorée pour
les mutations V392D-S449P et L612M-L755M (x 3.5 et x 3.0 comparativement au WT, p <
0.001 et p < 0.05 respectivement). Néanmoins, les différentes combinaisons de trois
mutations n’ont aucun effet significatif sur la production de particules virales infectieuses.
D. Effet des mutations sur la sensibilité vis-à-vis de l’inhibition par les lectines
L’objectif de ce travail vise à déterminer si les mutations sélectionnées sous la
pression induite par les lectines confèrent une résistance à ces lectines. Pour cela, nous
avons réalisé des tests d’inhibition en incubant les virus en présence de concentrations
croissantes de GNA, CV-N, ConA et GRFT. Après 1 h d’incubation à 37°C, les mélanges ont été
mis en contact avec des cellules naïves pendant 4 h. Les activités Luciferase ont été
mesurées à 72 h post-infection. A partir de ces mesures, des courbes dose-réponse ont été
tracées [figure 23], ce qui nous a permis de comparer la capacité des lectines à inhiber le
65
virus WT et les mutants comprenant les différentes combinaisons de mutations. Pour plus de
clarté, seules les courbes d’inhibition des combinaisons trois mutations seront présentées.
L’effet des mutations individuelles et des combinaisons de deux mutations a également été
évalué [annexes 6 et 7].
Figure 23 : Effet des combinaisons des trois mutations sur la sensibilité vis-à-vis de l’inhibition par les lectines.
La sensibilité vis-à-vis de l’inhibition par la GNA (A), CV-N (B), ConA (C) et GRFT (D) a été évaluée par
quantification des activités Luciferase dans les cellules infectées, après incubation des virus avec les inhibiteurs.
Les activités Luciferase ont été mesurées 72 h après l’infection. Les résultats sont exprimés en pourcentages
d’infectiosité relative à l’infectiosité en l’absence de lectine et sont reportés comme les moyennes ± les écart-
types d’au moins trois expériences indépendantes.
De façon surprenante, les combinaisons de trois mutations V284A-V392D-S449P,
M338V-L612M-L755M, M338V-N417S-L755M et M338V-A400D-L755M ne confèrent pas de
résistance à la lectine avec laquelle elles ont été sélectionnées (GNA, CV-N, ConA et GRFT,
respectivement). Nous avons aussi testé la sensibilité de ces quatre mutants vis-à-vis de
l’inhibition par les autres lectines et observé qu’ils présentent une sensibilité égale à la CV-N,
la ConA et la GRFT [figures 22B, C, D]. Au contraire, les mutants M338V-N417S-L755M,
M338V-L612M-L755M et M338V-A400D-L755M sont plus sensibles à l’inhibition par la GNA
[figure 22A]. Ces combinaisons de trois mutations provoquent une réduction de la
concentration efficace permettant d’obtenir 50% de l’inhibition (CE50) de 9.8, 7.3 et 2.3 fois
par rapport au WT, respectivement.
66
V. Discussion
Dans cette étude, nous avons cherché à évaluer la résistance du VHC à des CBA in
vitro. Après plus de deux mois de culture du VHC en présence de concentrations croissantes
en différentes lectines, nous avons identifié plusieurs mutations localisées dans la région du
génome codant les protéines d’enveloppe E1E2 ainsi qu’une mutation dans p7 (V284A-
V392D-S449P avec la GNA, M338V-L612M-L755M avec la CV-N, M338V-N417S-L755M avec
la ConA et M338V-A400D-L755M avec la GRFT). De façon intéressante, quand le virus a été
amplifié en l’absence de lectine, une seule mutation I559V dans E2 a été retrouvée,
évoquant qu’une pression de sélection positive apparait en présence de lectine.
Cependant, la caractérisation des mutations, individuelles ou en combinaison, révèle
qu’aucune de ces mutations ne confère de résistance aux CBA. Au cours d’expériences
similaires en présence d’anticorps neutralisants, des mutations d’échappement à la
neutralisation ont été mises en évidence dès cinq jours de traitement (570, 573-575). Ainsi,
nos résultats suggèrent que la barrière génétique de résistance aux CBA semble haute pour
le VHC. Ce phénomène pourrait s’appuyer sur plusieurs explications. Tout d’abord, il est à
noter que les glycoprotéines E1 et E2 portent des N-glycanes extrêmement conservés,
jouant un rôle essentiel dans les différentes étapes du cycle viral. Les décalages des sites de
N-glycosylation sur la séquence sont très rarement observés (382). Les CBA possèdent un
nombre conséquent de cibles, puisqu’ils reconnaissent plusieurs sites de liaison aux N-
glycanes au sein d’une seule glycoprotéine. Par ailleurs, contrairement aux anticorps
neutralisants, les CBA peuvent inhiber l’infection par des virions mais également la
transmission cellule-cellule du VHC (523). Enfin, il a été proposé que certaines lectines
pourraient agir au travers d’interactions avec des N-glycanes portés par des protéines virales
et cellulaires (482).
De façon similaire au VIH, le degré de résistance phénotypique pourrait être corrélé au
nombre de mutations des N-glycanes (558). L’apparition de multiples mutations est requise
pour qu’une résistance phénotypique significative soit détectée (456). Ainsi, l’accumulation
de plus de trois mutations aurait peut-être induit une résistance aux lectines. Il pourrait
même être avancé un seuil minimal de délétions de N-glycanes en dessous duquel la
résistance aux CBA n’est pas détectée. De plus, une exposition prolongée aux CBA est
également nécessaire afin de pouvoir mettre en évidence une résistance à ces molécules
(456, 459). La prolongation de la sélection de VHC résistant aux lectines en culture cellulaire
67
aurait pu permettre de détecter un nombre plus important de mutations, et par conséquent
un phénomène de résistance.
Dans le cas du VIH, Jan Balzarini a évoqué une théorie totalement nouvelle pour lutter
contre cette infection, fondée sur le ciblage des N-glycanes présents à la surface des
protéines d’enveloppe du virus. En effet, il a même été proposé qu’une telle stratégie
thérapeutique basée sur les CBA pourrait, d’une part, inhiber directement l’entrée du VIH et,
d’autre part, induire une perte partielle du bouclier glycanique et sélectionner des variants
viraux moins infectieux et plus sensibles au système immunitaire (453, 456-458, 559). Même
si aucune mutation de résistance n’a pu être identifiée pour le VHC, nous observons que la
sélection positive a entrainé une modification du bouclier glycanique du virus. En effet,
parmi les mutations identifiées, le changement d’acide aminé S449P empêche la N-
glycosylation du résidu asparagine 448, correspondant au site de N-glycosylation E2N4 ; qui
se révèle important pour l’assemblage des particules virales, l’infectiosité et la protection
contre les anticorps neutralisants. Aussi, la combinaison V392D-S449P, entrainant la perte
d’un N-glycane sur la protéine E2, pourrait augmenter l’infectiosité du virus muté par
modulation de la fonction d’entrée en démasquant le site d’interaction à CD81 [figure 22].
Par analogie, l’équipe de Wychowski avait démontré que la disparition du site de N-
glycosylation en position E2N6, suite à la mutation N534K, favorisait l’interaction entre le
virus et le récepteur cellulaire CD81, facilitant l’entrée virale (564). Cependant, la mutation
individuelle S449P n’induit pas cette hausse d’infectiosité. Ce phénomène observé pour le
mutant V392D-S449P pourrait alors s’expliquer par un changement de conformation de la
glycoprotéine E2, suite à l’introduction des mutations individuelles V392D et S449P ou de la
combinaison des deux mutations. Nous avons également identifié la mutation N417S qui a
déjà été largement caractérisée. La substitution du résidu asparagine en sérine entraine un
décalage du site de N-glycosylation. Cette mutation (ou la mutation similaire N417T) a été
décrite comme une mutation d’adaptation améliorant l’étape d’entrée virale et l’infectiosité
in vitro (400, 567, 576-578). Nous avons observé que cette mutation, individuelle ou en
combinaison, est responsable d’une augmentation de l’infectiosité (x 1.7, x 1.7, x 2.4, x 1.6
par rapport au WT pour N417S, M338V-N417S, N417S-L755M et M338V-N417S-L755M,
respectivement), bien que cette hausse ne soit pas significative [figure 22].
68
De façon intéressante, les courbes dose-réponses avec les simples, doubles et triples
mutants suggèrent que la mutation N417S engendre une sensibilité accrue à la GNA [figure
23A, annexes 6A et 7A]. Puisque la GNA se lie à des résidus terminaux riches en mannose et
lactosamine, présents au sein de N-glycanes de type oligomannosidique, hybride et
complexe, cette forte sensibilité ne serait pas due à une différence de maturation des N-
glycanes. En revanche, une meilleure accessibilité du N-glycane E2N1 à la GNA pourrait
expliquer ce phénomène. De plus, nos résultats révèlent que la mutation L612M,
indispensable à l’architecture de la glycoprotéine E2 (408), augmente également la
sensibilité à la GNA [figure 23A, annexes 6A et 7A].
69
VI. Conclusion et Perspectives
Au cours de ce travail, nous avons pu étudier la résistance du VHC à des CBA in vitro.
La sélection positive induite par les lectines a engendré une modification de l’organisation
des N-glycanes, en ciblant deux sites de N-glycosylation. Puisqu’aucune mutation de
résistance aux CBA n’a pu être identifiée, la barrière génétique de résistance à une telle
stratégie thérapeutique semble forte pour le VHC. Contrairement au VIH, les N-glycanes du
VHC sont fortement conservés et les décalages des sites de N-glycosylation sont rarement
retrouvés. En outre, la majorité des N-glycanes portés par les protéines d’enveloppe joue un
rôle important pour la survie du virus. Par conséquent, l’adaptation du VHC à une pression
de sélection exercée par des CBA pourrait être plus difficile que dans le cas du VIH.
A notre connaissance, la résistance virale aux CBA a seulement été évaluée sur des souches
de VIH, caractérisées par un bouclier glycanique malléable. Donc, nos résultats apportent de
nouvelles connaissances dans le développement d’une stratégie antivirale basée sur les CBA
puisqu’ils confirment la haute barrière génétique de résistance vis-à-vis des CBA du VHC
possédant des sites de N-glycosylation conservés.
Puisqu’aucune mutation de résistance aux CBA n’a été sélectionnée dans notre étude,
nous ne pouvons envisager la théorie de Balzarini. Néanmoins, nous projetons d’étudier
l’effet des mutations sélectionnées sur la sensibilité vis-à-vis d’anticorps monoclonaux
neutralisants et d’anticorps polyclonaux purifiés à partir de sera de patients séropositifs pour
le VHC ainsi que d’une forme soluble du récepteur CD81.
Face à l’émergence récente de nombreuses molécules ciblant directement les
protéines virales NS3/4A, NS5A ou NS5B, les CBA, et plus généralement les inhibiteurs de
l’entrée virale, ne sont pas susceptibles de trouver une indication dans le traitement contre
l’infection par le VHC (579). Cependant, en raison du coût, l’accès aux DAA pourrait être
freiné (580), notamment dans les pays émergents. De plus, environ 30 % des patients
infectés par le VIH sont co-infectés par le VHC (581, 582). Chez ces patients, une progression
plus rapide de l’hépatite et un risque plus important d’apparition d’une hépatotoxicité suite
à l’initiation d’une thérapie antirétrovirale sont fréquemment reportés (581). Le
développement de thérapies basées sur l’utilisation de CBA, efficaces contre les deux virus,
pourrait être une alternative intéressante pour la prise en charge de ces patients. Les CBA
pourraient également être utilisés comme inhibiteurs d’entrée chez des patients
70
transplantés hépatiques infectés par le VHC, en prévention de la réinfection du greffon (523,
583). Le développement de stratégies antivirales combinant des inhibiteurs d’entrée et des
DAA pourraient, par ailleurs, tirer bénéfice de l’effet synergique de cette association (583).
Si les données actuelles ne permettent pas de présumer d’un usage clinique dans le
cadre du traitement d’une infection par le VHC, les CBA constituent des molécules à large
spectre antiviral. Il a déjà été montré que les CBA inhibent efficacement le HSV, le CMV, le
virus de la grippe, ainsi que des virus émergents tels que le SRAS-CoV, le virus Ebola ou le
virus de la dengue [tableau 2]. Ils pourraient ainsi permettre de lutter contre des infections
causées par divers virus enveloppés. Nos résultats apportent des données intéressantes en
vue de l’utilisation des CBA comme traitement antiviral contre les virus enveloppés.
71
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106
ANNEXES
Nom Séquence 5’-3’ Position
Sens
5’UTR S * ACCTGCCCCTAATAGGGGCGACACT 5’UTR
241 S + CAAGACTGCTAGCCGAGTAG 5’UTR
1062 S + *
CAGTCTCGCAAACATGG E1 N-terminal
2098 S + *
TACGGATTGTTTTAGGAAGCA E2 N-terminal
3183 S * GGACTGGCACCTACATCTATG NS2 milieu
4217 S * GAAGCCATCACGTACTCCAC NS3 milieu
5486 S * GCCTCTAGGGCGGCTCTCATCG NS4B
6542 S * TGCTACACGGAGGGCCAGTG NS5A début
7058 S GGTGTGGCTCAGACAGAGCCT NS5A
7666 S * TCCATGTCATACTCCTGGACC NS5B début
8546 S * ACATGCTATGTGAAAGCCCTA NS5B milieu
V284 AS # TGTGGCGGGGCGATGCTCGCG E1
M338V S # GGCGTACGTGGTGCGCGTCCC E1
V392D S # GGAGGCGCTGATGCACGTTCC E2
A400D S # AACGTGATTGACGGCGTGTTC E2
N417S S # ATTAACACCAGCGGCAGTTGG E2
S449P S # CCGCTTTAACCCGTCAGGGTG E2
L612M S # ACCAAAGTGCATGGTCCACTA E2
L755M S # ATTGGAGAAGATGGTCGTCTT p7
R1373Q S GGCCTCGGGCAGGAGGGTGAG NS3
C2441S S TACCACCGTGAGCTGCTCCAT NS5A
Anti-Sens
906 AS * ACCGGAACGGTGATGCAG Core C-terminal
1444 AS + *
CCACGCTCCCTGCA E1 C-terminal
2265 AS + *
TGCTCAACCCCCCCTAC E2 milieu
3298 AS + *
CTTCTTCTCCATCGGACTG NS2 milieu
4383 AS * GTTAGTCTGACCCCGGCT NS3 milieu
5540 AS * ACTTCAACATCTCGGCTATCC NS4B N-terminal
6606 AS * CCCTCCAGATGGCGGTCTTG NS5A
7882 AS * GCTTGATGTCCTTTAAGACTGAG NS5B N-terminal
8683 AS * GAAGGCTCTCAGGTTCCGCTC NS5B milieu
9440 AS * CCGAGCGGGGAGTAGGAAGAG 3’NC
V284A AS # CGCGAGCATCGCCCCGCCACA E1
M338V AS # GGGACGCGCACCACGTACGCC E1
V392D AS # GGAACGTGCATCAGCGCCTCC E2
A400D AS # GAACACGCCGTCAATCACGTT E2
N417S AS # CCAACTGCCGCTGGTGTTAAT E2
S449P AS # CACCCTGACGGGTTAAAGCGG E2
L612M AS # TAGTGGACCATGCACTTTGGT E2
L755M AS # AAGACGACCATCTTCTCCAAT p7
R1373Q AS CTCACCCTCCTGCCCGAGGCC NS3
C2441S AS ATGGAGCAGCTCACGGTGGTA NS5A
Annexe 1 : Séquences des amorces.
Les amorces mentionnées par le symbole (+) ont été utilisées pour la RT-PCR après extraction des ARN viraux et
le séquençage des gènes des glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2. Les amorces indiquées par le symbole (#)
ont servi à la PCR de la mutagenèse dirigée. Les amorces mentionnées par une étoile (*) ont été utilisées pour
le séquençage du génome du VHC complet.
107
Mutation PCR Bactéries Séquençage partiel
V284A
1062 S - 3298 AS
1062 S
V392D
M338V
A400D
N417S
S449P
L612M 2098 S
L755M
Annexe 2 : Amorces utilisées pour les PCR à partir de bactéries et le séquençage du génome contenant la mutation d’intérêt.
Annexe 3 : Viabilité cellulaire.
La viabilité cellulaire a été évaluée trois jours après l’incubation des cellules Huh-7-RFP-NLS-IPS avec 0, 1, 3, 10,
30 ou 100 µg/mL de GNA, CV-N, ConA et GRFT. Les résultats sont exprimés comme les pourcentages de
viabilité comparé à la viabilité en l’absence de lectine et sont reportés comme les moyennes ± les écart-types
d’au moins trois expériences indépendantes.
Mutation (protéine)
% de conservation (nombre de séquences)
Tous les génotypes Génotype 2a
V284 (E1) 86.8% (2556/2945) 95.2% (20/21)
M338 (E1) 4.1% (122/2945) 95.2% (20/21)
V392 (E2) 11.2% (232/2073) 22.2% (4/18)
A400 (E2) 28.9% (599/2073) 55.6% (10/18)
N417 (E2) 97.6% (2024/2073) 100% (18/18)
S449* (E2) 84.0% (1741/2073) 100% (18/18)
I599 (E2) 1.7% (35/2073) 72.2% (13/18)
L612 (E2) 56.1% (1162/2073) 88.9% (16/18)
L755 (p7) 99.5% (1449/1456) 100% (17/17)
Annexe 4 : Conservation des acides aminés mutés.
*: La mutation S449P provoque un défaut de N-glycosylation du site E2N4, conservé dans 97.6 % des séquences
de tous les génotypes et dans 100 % des séquences de génotype 2a.
108
Annexe 5 : Evolution du ratio cumulatif dS/dN.
Ce graphique représente le ratio cumulatif dS/dN, reflétant le nombre de mutations synonymes versus le
nombre de mutations non synonymes détectées sur le génome des protéines virales E1, E2 et p7 après
comparaison des quatre séquences des virus sélectionnés après exposition aux lectines et de la séquence du
WT.
Annexe 6 : Effet des mutations individuelles sur la sensibilité vis-à-vis de l’inhibition par les lectines.
La sensibilité vis-à-vis de l’inhibition par la GNA (A), CV-N (B), ConA (C) et GRFT (D) a été évaluée par mesure
des activités Luciferase dans les cellules infectées, après incubation des virus avec les inhibiteurs. Les résultats
sont exprimés en pourcentages d’infectiosité relative à l’infectiosité en l’absence de lectine et sont reportés
comme les moyennes ± les écart-types d’au moins trois expériences indépendantes.
109
Annexe 7 : Effet des combinaisons de deux mutations sur la sensibilité vis-à-vis de l’inhibition par les lectines.
La sensibilité vis-à-vis de l’inhibition par la GNA (A), CV-N (B), ConA (C) et GRFT (D) a été évaluée par mesure
des activités Luciferase dans les cellules infectées, après incubation des virus avec les inhibiteurs. Les résultats
sont exprimés en pourcentages d’infectiosité relative à l’infectiosité en l’absence de lectine et sont reportés
comme les moyennes ± les écart-types d’au moins trois expériences indépendantes.
Laure IZQUIERDO
Etude de la résistance du Virus de l’Hépatite C à des molécules ciblant les N-glycanes
Thèse pour le Diplôme d’Etat de Docteur en Pharmacie
Université de Picardie Jules Verne
Année 2015
Résumé :
Les protéines d’enveloppe du Virus de l’Hépatite C (VHC) sont fortement N-glycosylées, avec quatre et onze sites
de N-glycosylation sur E1 et E2, respectivement. La majorité de ces sites de N-glycosylation sont conservés, et certains des
N-glycanes jouent un rôle prépondérant dans le repliement des glycoprotéines E1 et E2, l’entrée virale et la protection
contre les anticorps neutralisants. Les molécules capables d’interagir avec les N-glycanes (CBA pour Carbohydrate Binding
Agents), et particulièrement les lectines, inhibent directement le VHC et de nombreux autres virus enveloppés, tels que le
Virus de l’Immunodéficience Humaine, le Coronavirus responsable du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère, le virus de la
Dengue ou le virus Ebola. Cependant, aucune étude concernant la résistance du VHC à une telle stratégie thérapeutique
n’a été décrite à ce jour.
Dans cette étude, nous avons évalué la résistance du VHC vis-à-vis des CBA in vitro. Le VHC a été cultivé en
présence de concentrations croissantes de Galanthus nivalis agglutinin (GNA), Cyanovirin-N, Concanavaline A et
Griffithsin. A la fin de la sélection, la région codant les protéines E1E2p7 a été séquencée et plusieurs mutations ont été
identifiées (V284A-V392D-S449P, M338V-L612M-L755M, M338V-N417S-L755M et M338V-A400D-L755M,
respectivement). L’effet de ces mutations sur la réplication virale, la production de virus infectieux et la sensibilité vis-à-
vis de l‘inhibition par les lectines a été déterminé. De façon surprenante, aucune de ces mutations, individuelle ou en
combinaison, ne confère de résistance aux lectines. Au contraire, les mutants M338V-L612M-L755M, M338V-N417S-
L755M et M338V-A400D-L755M sont plus sensibles à l’inhibition par la GNA.
Ainsi, nos résultats suggèrent que les CBA exercent une pression positive sur les gènes des glycoprotéines
d’enveloppe du VHC et que la barrière génétique de résistance aux CBA semble élevée pour le VHC. Ce travail apporte des
données essentielles en vue de l’utilisation des CBA comme traitement antiviral contre les virus enveloppés.
Mots clefs : Virus de l’Hépatite C, glycoprotéine d’enveloppe, N-glycane, lectine, inhibiteur d’entrée, résistance.
Abstract :
Hepatitis C Virus (HCV) envelope proteins are highly N-glycosylated, with 4 and 11 N-linked glycans on E1 and E2,
respectively. Most N-glycosylation sites of these proteins are conserved across genotypes, and some of the associated
glycans have been shown to play an essential role in E1 and E2 folding, HCV entry and protection against neutralizing
antibodies. Carbohydrate Binding Agents (CBAs), particularly natural lectins, are able to directly inhibit HCV but also many
other enveloped viruses, such as Human Immunodeficiency Virus, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,
Dengue Virus or Ebola Virus. However to date, there is no study on HCV resistance to CBA-based therapeutic strategy.
In this study, we aimed at evaluating the HCV resistance to CBAs in vitro. HCV was cultivated in the presence of
increasing Galanthus nivalis agglutinin (GNA), Cyanovirin-N, Concanavalin A and Griffithsin concentrations. At the end of
lectin exposure, the E1E2p7 region was sequenced and several mutations were identified (V284A-V392D-S449P, M338V-
L612M-L755M, M338V-N417S-L755M and M338V-A400D-L755M, respectively). The effect of these mutations on HCV
replication, on infectious virus production as well as on sensitivity to inhibition by lectins was assessed. Surprisingly, none
of these mutations, alone or in combination, confer resistance to CBAs. In contrast, we observed that M338V-L612M-
L755M, M338V-N417S-L755M and M338V-A400D-L755M mutants were more sensitive to GNA inhibition.
Altogether, our results demonstrate that CBAs exert a positive selection on the HCV envelope protein genes and
that the genetic barrier to CBA resistance for HCV is high. This provides further evidence in favor of the potential of CBAs
as therapeutic agents against viral infections.
Key words : Hepatitis C Virus, envelope protein, N-glycan, carbohydrate binding agent, entry inhibitor, resistance.
Président : Professeur Gilles DUVERLIE, Virologie, CHU d’Amiens
Membres : Docteur Anne GOFFARD, Virologie, CHU de Lille
Docteur Coralie PALLIER, Virologie, APHP, Site Paul Brousse
Docteur Christine SEGARD, Virologie, CHU d’Amiens
Docteur François HELLE, Virologie, CHU d’Amiens, Directeur de thèse
