Thèse - Ecologie Des Legionelles Dans l'Eau Des Circuits de Refroidissement Des Centrales...

7/25/2019 Thse - Ecologie Des Legionelles Dans l'Eau Des Circuits de Refroidissement Des Centrales Nuclaires en Bord de

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UNIVERSITE PARIS-SUD

COLE DOCTORALE : ABIES(AGRICULTURE,ALIMENTATION,BIOLOGIE,ENVIRONNEMENT,SANTE)

LABORATOIRE: Institut de Gntique et de Micr!i"#ie $ UMR %&' CNRS

DISCIPLINE :Science de "en*irnne+ent

THSE DE DOCTORAT SUR TRAVAUX

sutenue "e ' -ce+!re ''

./r

Delphine JAKUBEK

EECCOOLLOOGGIIEEDDEESSLLEEGGIIOONNEELLLLEESSDDAANNSSLLEEAAUUDDEESSCCIIRRCCUUIITTSSDDEERREE!!RROOIIDDIISSSSEE""EENNTTDDEESSCCEENNTTRRAALLEESSNNUUCCLLEEAAIIRREESSEENNBBOORRDDDDEE

LLOOIIRREEDi#e$%e 'e %h()e: Mic0/e" -UBO1 2 3r4esseur (Uni*ersit 3/ris2Sud 2 Institut de Gntique et

Micr!i"#ie)

C*+p*)i%i*n '& , :

Prsident du jury:St.0/n 5AC6UET -irecteur de Rec0erc0e (INRA de T0nn2"es2B/ins)Rapporteurs : 30i"i..e LEBARON -irecteur de Rec0erc0e (O!ser*/tire Oc/n"#ique de B/n7u"s2sur2Mer)

L/urence MAT8IEU M/9tre de Cn4rences 8-R (Ec"e 3r/tique des 8/utes Etudes)Examinateurs : 5u"i/ BAU-ART M/9tre de Cn4rences (O!ser*/tire Oc/n"#ique de B/n7u"s2sur2Mer)

5sse"in BO-ILIS M/9tre de Cn4rences 8-R (L/!r/tire de Micr!i"#ie En*irnne+ent/"e etBi"#ie E*"uti*e)

Ar+e" GUONVARC8 3r4esseur (Institut de Gntique et Micr!i"#ie)Membres invits : M/rie BINET In#nieur de Rec0erc0e (E-; R


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[] limagination, livre ses seules forces, sest toujours montreincapable denvisager les dimensions de la ralit telles quelles se

manifestent la science, cest--dire infiniment plus complexes, plusgigantesques, et mme plus merveilleuses que nous ne pouvions les

imaginer! "

Jean Onimus (1909 2007)

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AVANT PROPOS

Cette thse est le rsultat dun partenariat entre lInstitut de Gntique et Microbiologie(CNRS UMR 8!"# Uni$ersit %aris&Sud' et le aboratoire National )*draulique et+n$ironne,ent du dparte,ent Recherche - .$eloppe,ent d+./0 Cette thse a tencadre# 1 luni$ersit par les pro2esseurs MIC)3+.U456et G+R3R. +45N# et en entreprisepar les ingnieurs chercheurs M3RI+ 4IN+7et M377)I+U + 4RUN0

Cette thse a t co&2inance par +./ et l3ssociation Nationale de la Recherche et de la7echnologie (3NR7' au tra$ers dune Con$ention Industrielle de /or,ation par la Recherche(CI/R+ n !9:!99;'0te

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prcieuse0 7rs bon pdagogue# Matthieu ,a trans,is bon no,bre de connaissancesconcernant les probl,atiques industrielles d+./ et les tudes ralises prcde,,ent parla R-.0 .e Matthieu#


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SOMMAIREAVANT PROPOS................................................................................................................................................ 5

REMERCIEMENTS ............................................................................................................................................. 7

SOMMAIRE ...................................................................................................................................................... 9

ISTE !ES A"REVIATIONS ............................................................................................................................... 11

ISTE !ES #I$%RES ......................................................................................................................................... 1&

ISTE !ES TA"ES ........................................................................................................................................... 1'

INTRO!%CTION $ENERAE ............................................................................................................................ 17

CAPITRE 1 S*NTESE "I"IO$RAPI+%E ................................................................................................... 2&

"0 IN7R5.UC7I5N00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !O#! $%&'()%$$*000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !

#!+! istorique !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ##!#! 'nfections $egionella !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ##!.! /glementation !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! #0#!1! 2axonomie !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! .+#!3! 4aract5res bioc6imiques gnraux !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! .+

>0 7P%3G+ .+S +GI5N++S000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 >Q.!+! 2axonomie et p67lognie bactrienne !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! .1.!#! 8rincipe de lidentification des lgionelles pour le suivi pidmiologique !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! .9.!.! :t6odes didentification taxonomique pour des tudes dcologie microbienne !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! .0.!1! 4onclusions !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 3#

Q0 +C55GI+ .+S +GI5N++S000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 O>

1!+! :ode de vie planctonique et sessile !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 311!#! abitats aquatiques !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ;1!.! 'nteractions abiotiques et biotiques des lgionelles avec leur environnement !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! # 1!1! )otion de rseau trop6ique !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 0

O0 +C55GI+ +7 R+%5NS+ .+S +GI5N++S +N %R+S+NC+ .+ 4I5CI.+S C)5R+S00000000000000000000000000000000000000000000000000000000 000 Q 3!+! $es diffrents procds de dsinfection des rseaux et leur mode daction sur les micro-

organismes !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!


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3R7IC+ >A.I//+R+N7 S%37I5&7+M%5R3 .PN3MICS 5/ +GI5N+3 %N+UM5%)I3 SU4%5%U37I5NS IN NUC+3R %56+R %3N7C55ING CIRCUI7S00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "O!.+%)IN+ @3U4+#M377)I+U + 4RUN#G+R3R. +45N#MIC)3+ .U456#M3RI+ 4IN+7000000000000000000000000000000000 "O!S5UMIS %5UR %U4IC37I5N#*CD*2'4 :'4/(?'*$ %4($(&@00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "O!

3R7IC+ QA 7)+ IM%3C7 5/ M5N5C)5R3MIN+ 5N 7)+ .I+RSI7P 3N. .PN3MICS 5/ +GI5N+3 %N+UM5%)I3SU4%5%U37I5NS IN 3 NUC+3R %56+R %3N7 C55ING CIRCUI7000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "8

.+%)IN+ @3U4+#M377)I+U + 4RUN#G+R3R. +45N#MIC)3+ .U456#M3RI+ 4IN+7000000000000000000000000000000000 "8S5UMIS %5UR %U4IC37I5N#E%:=:'4/(?'($(&@ %4($(&@000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "8

3R7IC+ OASUSC+%7I4II7P 5/ +GI5N+3 S7R3INS 75 7)+ C)5RIN37+. 4I5CI.+#M5N5C)5R3MIN+00000000000000000000000000000 !9!.+%)IN+ @3U4+#C3R5+ GUI3UM+#M3RI+ 4IN+7#G+R3R. +45N#MIC)3+ .U456#M377)I+U + 4RUN0000 !9!S5UMIS %5UR %U4IC37I5N#:'4/(?%= *)> %)F'/():%)2=0000000000000000000000000000000000000000000000000000000 000000000000000000000 !9!

CONC%SIONS ET PERSPECTIVES .................................................................................................................. 2&0

"0 .PN3MI=U+ S%37I5&7+M%5R++ .+S C5MMUN3U7+S .+ $!8)%D:(8'$*CU7I34+S000000000000000000000000000000000000000 !>!!0 R+GU37I5N .+ 3 C5NC+N7R37I5N +N +GI5N++S000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !>O>0 +C55GI+ .+S +GI5N++S +N %R+S+NC+ .+ M5N5C)5R3MIN+ +7 S+NSI4II7+ C+U3IR+ 3U 4I5CI.+00000000000000000000 !>Q0 %+RS%+C7I+S G+N+R3+S0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !>;

RE#ERENCES "I"IO$RAPI+%ES ................................................................................................................. 2-2

ANNEES ...................................................................................................................................................... 2''

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LISTE DES ABREVIATIONSACE 3bundance&based Co$erage +sti,atorACP 3nal*se en Co,posantes %rincipalesA!N 3cide .soE*ribonucliqueA#P 3,pli2ied /rag,ents ength %ol*,orphis,A$R 3gence Rgionale de SantAP PCR 3rbitraril* %ri,ed %CRARN 3cide RibonucliqueARS 3gence Rgionale de SantASN 3utorit de Suret NuclaireATCC 3,erican 7*pe Culture CollectionATP 3dnosine 7ri&%hosphate"C*E 4u22ered Charcoal Peast +Etract"S 4acteriocin ie SubstanceC!" Con$ention sur la .i$ersit 4iologiqueCE/SSCP Capillar* +lectrophoresis SSC%CCIN Centre de Coordination de la utte contre les In2ections Nosoco,ialesCIN Co,it de utte contre les In2ections Nosoco,ialesCIRE Cellule Inter&Rgionale d+pid,iologieCME Conseil Mondial de l+auCNPE Centres Nuclaires de %roduction d+lectricitCNR Centre National de R2rence des gionellesCR# Circuit de Re2roidisse,entCSP# Conseil Suprieur d)*gine %ublique de /rance!ARPE .e,ande d3utorisation de Re


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AP $egionellaie 3,oebal %athogenPS ipopol*saccharideMAs Monoclonal 3ntibodiesM"C Mini,al 4acteriostatic ConcentrationMES Matires +n SuspensionMIC Mini,al Inhibitor* Concentration

MI# Mature Intracellular /or,MVA Multiple&ocus N7R 3nal*sisMRA P#$E Macro Restriction 3nal*sis %/G+nM!S non,etric Multi.i,ensional ScalingOC!E 5rganisation de Coopration et de .$eloppe,ent +cono,iqueOMS 5rganisation Mondiale de la SantON$ 5rganisation Non Gou$erne,entaleOT% 5perational 7aEono,ic UnitPCR %ol*,erase Chain ReactionP#$E %ulsed /ield Gel +lectrophoresisP#A %hosphoipid /att* 3cids+AC =uaternar* 3,,oniu, Co,pound

RAP! Rando, 3,pli2ication o2 %ol*,orphic .N3REP Racteur 1 +au %ressuriseR#P Restriction /rag,ent ength %ol*,orphis,ROS Reacti$e 5E*gen SpeciesRSE Responsabilit Sociale des +ntreprisesSIN Signale,ent des In2ections Nosoco,ialesS"T Sequence 4ased 7*pingS!S PA$E Sodiu, .odec*l Sul2ate %ol*3cr*la,ide Gel +lectrophoresisSO! SuperoE*de .is,utaseSSCP Single Strand Con2or,ation %ol*,orphis,TAR 7our 3ror2rigranteTESS3 7he +uropean Sur$eillance S*te,

TM 7rihalo,thaneTNT 7rinitrotoluneTSN 7ransparence et Scurit en ,atire Nuclaire%#C Unit /or,ant Colonie%P$MA UnFeighted %air Group Method Fith 3rith,etic ,ean%SEPA United State +n$iron,ental %rotection 3genc*%V Ultra ioletV"NC iable 4ut Non Culti$ableVNTR ariable&Nu,ber 7ande, RepeatO 6orld )ealth 5rganiTation

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LISTE DES FIGURES/igure "&"A $! pneumop6ila# ,icroscopie lectronique 1 trans,ission recolorise (dVaprs /raser# !99O'0 000000000 ! /igure "&!A C*cle de $ie sch,atique de $!pneumop6iladans les ,acrophages (daprs SFanson et )a,,er#

!999'0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !/igure "&>A Modle conceptuel dVeEposition au ger,e $egionella1 partir de lVinhalation dVarosols pro$enant de

douche contenant des lgionelles (dVaprs Schoen et 3shbolt# !9""'0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !/igure "&QA +$olution du no,bre de cas et du tauE annuel dVincidence de la lgionellose en /rance# ";88&!9"9

(dVaprs Ca,peseet al!# !9""b'0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !8/igure "&OA Rang taEono,ique0 +Ee,ple de la lgionelle0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 >Q/igure "&A Gnes riboso,auE codant pour les 3RNr !>S# "S et OS cheT %sc6eric6iacoli!000000000000000000000000000000000 >/igure "&A Structure de l3RNr "S des bactries qui prsente neu2 rgions $ariables (" 1 ;' entoures de

rgions haute,ent conser$es0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 >/igure "&8A Slection de la ,thode approprie pour le t*page des souches bactriennes (dVaprs 6en;

/igure "&"9A +nse,ble des ,thodes utilises en cologie ainsi quVen pid,iologie pour lVidenti2ication desespces et des souches de lgionelles0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 Q9

/igure "&""A %rincipe des essais dVh*bridation 3.N&3.N (dVaprs Rossello&Mora et 3,ann# !99"'0 000000000000000000 QQ /igure "&"!A In2ection dV*cant6amoebaepol7p6aga(en haut' et dVun ,acrophage (en bas' par $! pneumop6ila

en ,icroscopie lectronique 1 trans,ission (dVaprs Mol,eretet al!# !99Q'0 0000000000000000000000000000000000000000000 OQ/igure "&">A C*cle de $ie de $! pneumop6ila(dVaprs Molo2s* et SFanson# !99Q'0 0000000000000000000000000000000000000000000 OO/igure "&"QA Rle des bio2il,s en tant que rser$oir de ,icro&organis,es pathognes et source de

conta,ination de s*st,es de distribution dVeau (dVaprs 6ingender et /le,,ing# !9""'0 00000000000000000000 O /igure "&"OA Modle de propagation des lgionelles dans un s*st,e de distribution dVeau potable (dVaprs au

et 3shbolt# !99;'0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 O;

/igure "&"A Reprsentation sch,atique des di$erses co,posantes de lVcologie des lgionelles dans less*st,es de distribution dVeauE (dVaprs e$i# !99"'0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !

/igure "&"A %hages de $egionella obser$s en ,icroscopie lectronique 1 trans,ission# grossisse,ent E""9999 (dVaprs a,,ert*net al!# !998'0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000

/igure "&"8A .i22rents t*pes dVinteractions directes et indirectes possibles entre deuE indi$idus (dVaprs Morin#!9""'0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;

/igure "&";A C*cle de la ,atire et co,parti,ents biologiques dVun cos*st,e aquatique0 0000000000000000000000000000 " /igure "&!9A 4oucle $irale et ,icrobienne (dVaprs /uhr,an# ";;;'0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 > /igure "&!"A %roprits phnot*piques des bactries aquatiques capables dVchapper 1 la prdation (dVaprs

%ernthaler# !99O'0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 >/igure "&!!A .o,,ages de lV3.N produits par les U (dVaprs US+%3# ";;;'0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000 O /igure "&!>A Mcanis,es dVinacti$ation de di22rents ,icro&organis,es par les biocides (dVaprs .o*le et al!#

!99'0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 /igure "&!QA es espces racti$es de lVoE*gne et leur s*st,e de dtoEi2ication0 00000000000000000000000000000000000000000000 8 /igure "&!OA Modi2ication de quelques acides a,ins par attaque radicalaire (dVaprs Mogoa# !9"9'0 00000000000000 89 /igure "&!A Mcanis,e en chaWne de la peroE*dation lipidique et nature des produits 2or,s (dVaprs /a$ier#

!99>'0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 8"/igure "&!A sions de lV3.N 2or,es par attaque radicalaire (dVaprs /a$ier# !99>'0 000000000000000000000000000000000000000 8"/igure "&!8A /or,ation des chlora,ines en 2onction du p) (dVaprs %alin# ";O9'0 0000000000000000000000000000000000000000000000 8Q/igure "&!;A Courbes reprsentati$es de lVe22et des antibiotiques sur des souches bactriennes rsistantes#

tolrantes et sensibles (dVaprs 3tinsonet al!# !999'00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 8O/igure "&>9A +22et de la concentration en agent antibactrien sur des ,icro&organis,es sessiles et

planctoniques0 .ter,ination des concentrations ,ini,ales inhibitrices et bactricides (MIC et M4C'(dVaprs )arrisonet al!# !99a'0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 8

/igure "&>"A Sch,a gnral des di22rents ,canis,es de lutte des bactries contre les agents antibactriens(dVaprs .o*leet al!# !99'0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 8;

tel00922431,v

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/igure "&>!A Classi2ication des ,icro&organis,es selon leur sensibilit auE biocides A du ,oins sensible (&' auplus sensible (X' (dVaprs 7u,ah# !99;'0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;9

/igure "&>>A Reprsentation sch,atique des di22rentes rponses dVune co,,unaut ,icrobienne et de leursconsquences 2onctionnelles 2ace 1 une perturbation en$ironne,entale (daprs 3llison et Martin*#!998'0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;

/igure !&> A .endrogra,,e non enracin des t*pes de $! pneumop6ilaet $0 spp0 identi2is par IRS %CR 000000 "!9

/igure !&> A .endrogra,,es issus du squenYage de l3.Nr "S# 1 gauche et du t*page par IRS %CR# 1 droite0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "!"

/igure !&>8 A Sch,a gnral si,pli2i des di22rentes $oies dinteraction entre les 2acteurs abiotiques etbiotiques# utilis pour la recherche de liens entre les co,,unauts de lgionelles et leur en$ironne,ent00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "!Q

/igure !&>;A ocalisation des sites de ltude sur la oire (site ' et sur la Moselle (site M'0 00000000000000000000000000000 "Q> /igure !&Q9A %oint de prl$e,ent localis dans le bassin 2roid des circuits de re2roidisse,ent des centrales

ther,iques0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "Q>/igure !&Q"A Courbes de rare2action des sous&populations de $egionella pneumop6ilaculti$ables originaires du

site M# identi2ies par t*page IRS %CR0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "QQ /igure !&Q!A nM.S (Stress de rusal Z 90"O8'# base sur lindice de 4ra* Curtis# anal*sant la co,position des

co,,unauts de $egionella pneumop6ilaisoles pendant un an des ciruits de re2roidisse,ent (tranche "

et !' de la centrale ther,ique du site 0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "QQ/igure !&Q>A 4iplot danal*se 3C% des sous populations culti$ables de $egionella pneumop6ila identi2ies parIRS %CR en 2onction de leur priode disolation0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "QO

/igure !&QQA 3bondance relati$e des sous&populations dintrDt# lies a$ec le caractre saisonnier de laco,position des co,,unauts0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "Q

/igure !&QOA Relation entre la concentration en $egionella pneumop6ila culti$ables et di22rents para,tresprsentant un co22icient de corrlation de %earson signi2icati20 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "Q

/igure !&QA Reprsentation sch,atique des liens signi2icati2s directs et indirectseEistant entre laconcentration en $egionella pneumop6ilaculti$ables et les 2acterus biotiques et abiotiques ,esurs0 0 "Q8

/igure !&Q A Sous&populations dtectes dans les CR/ du CN%+ de .a,pierre0 00000000000000000000000000000000000000000000000 "Q;/igure !&Q8 A Structure de la co,,unaut de $! pneumop6iladans le CR/ du CN%+ de .a,pierre et ,canis,es

h*pothtiques de rgulation de cette co,,unaut0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "O9

/igure !&Q; A Mcanis,es de rgulation h*pothtiques de la concentration en $! pneumop6ila par lespara,tres en$ironne,entauE ,esurs dans le CN%+ de .a,pierre0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000 "O"/igure !&O9 A ocalisation des sites de ltude bass sur la oire0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "9/igure !&O"A Concentrations en $egionella pneumop6ila# dter,ines par la ,thode culturale# rele$es dans

les di22rentes tranches des Q sites0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "" /igure !&O!A .iagra,,e de enn reprsentant la distribution spatiale des sous populations de $egionella

pneumop6iladtectes dans les circuits de re2roidisse,ent des Q sites tudis ainsi que dans la ri$ire00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "!

/igure !&O>A .istribution des srogroupes des isolats de $egionella pneumop6ila issus des Q sites tudis en2onction de la distance 1 partir de la source0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "!

/igure !&OQA 3nal*se de la co,position des co,,unauts de $egionella pneumop6iladans les di22rents sites et1 di22rentes priodes de lanne par approche nM.S bas sur lindice de 4ra* Curtis (stress de rusal Z

90";Q'0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ">/igure !&OOA Graphique radar reprsentant les $aleurs des coe22icients de correlation de %earson entre lesconcentrations en $egionella pneumop6ila culti$ables# rele$es pour chacun des sites# et di22rents2acteurs en$ironne,entauE0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "Q

/igure !&OA .iagra,,e de classi2ication hirarchique construit par lalgor*th,e de 6ard et les distanceseuclidiennes bases sur les $aleurs des coe22icients de %earson entre les concentrations en $egionellapneumop6ilaculti$ables et di22erent 2acteurs en$ironne,entauE0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "O

/igure !&OA Structure des tours aror2rigrantes des quatre sites tudis0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000 " /igure !&O8A Site de ltude localis sur la oire en /rance# appel site 0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ";O /igure !&O;A Concentrations en ,icro&organis,es deter,ines pour chaque chantillon par des ,thodes

culturales0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ";/igure !&9A 4iplot danal*se 3C% sur les indices de di$ersit des co,,unauts de $egionella pneumop6ila

culti$ables collectes 1 di22rentes priodes de lanne tudieA richesse spci2ique (indiice de Chao'#di$ersit (indice de Shannon' et structure de la co,,unaut (indice de %ilou'0 00000000000000000000000000000000000 ";

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/igure !&"A Relations entre les indices de di$ersit des co,,unauts de $egionella pneumop6ila culti$ables(Chao# Shannon et %ilou' et di22erent para,eters en$ironne,entauE prsentant des coe22icients decorrlation de %earson signi2icati2s0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ";8

/igure !&!A 3nal*se de la co,position des co,,unauts de $egionella pneumop6ila culti$ables de chaquechantillon a$ant# pendant et aprs traite,ent 1 la ,onochlora,ine# par approche nM.S base surlindice de 4ra* Curtis (stress de rusal Z 90"O' 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ";;

/igure !&>A .iagra,,es reprsentant (a' les sous populations de egionella pneu,ophila culti$ablespartages entre les priodes a$ant# pendant et aprs traite,ent 1 la ,onochlora,ine# ainsi que (b' leno,bre de souches appartenant 1 chacune des sous populations detctes aprs traite,ent00000000000000 !99

/igure !&Q A +22ets esti,s standardiss de chacune des $ariables testes et de leur co,binaison sur ("a' lete,ps ncessaire pour inacti$er > log de bactries et sur ("b' lacti$it de la ,onochlora,ine#reprsente par le 2acteur n0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !!>

/igure !&OA Reprsentations des e22ets des 2acteurs eEpri,entauE sur les rponses P"(a' et P!(b'A sur2aces derponse (1 gauche' et tracs des contours (1 droite' des intractions entre les $ariables (te,prature# p)en haut B concentrations initiales en ,onochlora,ine et en bactries en bas'0 00000000000000000000000000000000000000 !!Q

/igure !& A Inacti$ation des bactries culti$ables non&$egionella (>a' et $egionellapneumop6ila37CC >>"O!et 37CC >>8!> (>b' aprs traite,ent 1 la ,onochlora,ine0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !!O

/igure !& A aleurs des Ct;;0;[ des $egionella de r2rence ainsi que des souches non&$egionella ,esures

aprs inacti$ation 1 la ,onochlora,ine0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !! /igure !&8 A aleurs des Ct;;0;[,esures aprs inacti$ation 1 la ,onochlora,ine des $egionella pneumop6ilaen$ironne,entales isoles des ciruits de re2roidisse,ent dans di22rentes conditions de traite,ent 1 la,onochlora,ine0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !!

/igure !&; A +nse,ble des e22ets des para,tres eEpri,entauE sur les rponses A tracs de la sur2ace rponse(1 gauche' et les tracs de contour correspondant (1 droite' des intractions entre $ariableseEpri,enales sur le te,ps ncessaire pour inacti$er > log de bactries ainsi que sur lacti$it de la,onochlora,ine# reprsente par le 2acteur n0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !!8

/igure 3"&9 A Sur$eillance de la lgionellose en /rance0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !; /igure 3!&" A +tapes de recherche et de dno,bre,ent des $!spp0 et $! pneumop6ilaselon la nor,e N/ 7;9&

Q>"0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !9/igure 3!&! A +nse,ence,ent dVun chantillon dVeau sur un ,ilieu G%C0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000 !"

/igure 3!&>A 5bser$ation 1 lVil nu de colonies de $egionellaculti$e sur G%C0 0000000000000000000000000000000000000000000 !!/igure 3!&QA 5bser$ation 1 la loupe binoculaire de colonies de $egionellaculti$e sur G%C0 00000000000000000000000 !!/igure 3!&O A Con2ir,ation du genre $egionellaselon la nor,e N/ 7;9&Q>"0 00000000000000000000000000000000000000000000000000 !!/igure 3!& A 7est dVi,,uno2luorescence directe0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !> /igure 3!& A 7est dVagglutination au lateE0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !>/igure 3>&8A Sch,a dVune tour 1 circuit de re2roidisse,ent dit \ou$ert\0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000 !O /igure 3>&;A Sch,a dVune tour 1 circuit de re2roidisse,ent dit \2er,\0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !O /igure 3Q&89A Sch,a gnral du 2onctionne,ent du s*st,e de re2roidisse,ent dVune centrale nuclaire00 !/igure 3&8"A Sch,atisation des tapes de la %CR0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !89 /igure 38&8!A C*cle de $ie dVun bio2il, (dVaprs Cogan et eener# !99Q'0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !8>/igure 3;&8>A Structure des ,e,branes des bactries 1 Gra, positi2# 1 Gra, ngati2 et des ,*cobactries0 !8Q/igure 3;&8QA Sch,a dVune spore bactrienne \t*pique\ (dVaprs Russell# ";;O'00000000000000000000000000000000000000000000 !8Q

/igure 3"9&8OA %o,pes 1 e22luE des bactries 1 Gra, ngati20 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !8O /igure 3"!&8A Structure dVune centrale nuclaire et point de ,esure des dbits du CR/0 0000000000000000000000000000000 !;9 /igure 3">&8A I,portance de la richesse et de lVquitabilit pour la d2inition de la di$ersit0 00000000000000000000000 !;" /igure 3">&88A Courbes de rar2action de di22rentes espces dVarbres tropicauE (dVaprs ColFellet al!# !99Q'

0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !;!/igure 3">&8;A Modles de distribution dVabondance des espces au sein dVune co,,unaut (dVaprs

Magurran# ";88'0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !;>/igure 3">&;9A Co,paraison de di22rents esti,ateurs (graphique# para,trique# et non para,trique' sur la

$aleur calcule de la richesse spci2ique de co,,unauts bactriennes dVchantillons dVeauE (dVaprsShaFet al!# !998'0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !;8

/igure 3">&;"A Reprsentation sch,atique (dendrogra,,e' de la si,ilarit entre di22rents esti,ateurs(dVaprs ShaFet al!# !998'0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !;8

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LISTE DES TABLES7able "&"A +spces et srogroupes du genre $egionella0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 >>7able "&!A Interactions (positi$es ou ngati$es' connues des lgionelles a$ec dVautres espces procar*otes

(dter,ines par des ,thodes culturales'0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 7able "&>A Interactions connues des lgionelles a$ec des espces eucar*otes0 000000000000000000000000000000000000000000000000000 8 7able "&QA /a,illes des biocides et leurs ,canis,es dVaction (dVaprs Chap,an# !99>'00000000000000000000000000000000000 7able "&OA +22icacit des biocides chlors sur %sc6eric6iacoliet $!pneumop6ila,esure par le 2acteur Ct0 000000 887able "&A +22icacit de di22rents biocides sur les ,icro&organis,es (dVaprs Sa2e .rining 6ater et National

Research# ";8'0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 8;7able !&A Indices de discri,ination (.' calculs pour lIRS %CR# la %/G+# la S47 et ses gnes par le t*apge des

QO souches de $egionella pneumop6ila0 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 00 E44eu4 Si6ne nn 8:ini.7able !&8A 3,orces oligonuclotidiques utilises pour le t*page S47 des souches de $egionella pneumop6ila0

0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ""7able !&; A 3,orces oligonuclotidiques utilises pour le squenYage des sept gnes de la S470 00000000000000000000 ""8

7able !&"9A %ol*,orphis,e nuclotidique des genes utiliss pour le t*page par S47 des souches de $egionellapneumop6ila0 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 "";

7able !&"" A Indices de di$ersit et leurs inter$alles de con2iance ,esurs pour les co,,unauts de $!pneumop6ilaculti$ables issues des bassins 2roids des centrales nuclaires localises sur la oire0000000000 "Q!

7able !&"!A Indices de di$ersit et leurs inter$alles de con2iance des co,,unauts de $egionella pneumop6ilaculti$ables issues des basins 2roids des centrales ther,iques localises sur la oire0 000000000000000000000000000000 ";Q

7able !&"> A Souches bactriennes slectionnes pour la dter,ination de la sensibilit 1 la ,onochlora,ine00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !!"

7able !&"Q A %lan deEprience ,ulti2actoriel et rponses ,esures pour chaque condition eEpri,entale0 00 !!! 7able 3O&"OA /rquence de prl$e,ent 1 ,ettre en u$re en 2onction de la concentration en lgionelles

,esure0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !;7able 3"9&"A Mcanis,es dVe22luE des bactries rsistantes auE biocides (daprs %oole# !99O'0 000000000000000000 !8

7able 3"!&"ACaractristiques des CR/ des quatre CN%+ de la oire0 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 !;9

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INTRODUCTION GENERALE

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J $Geau est la c6ose la plus ncessaire lGentretien de la vie, mais il est ais de la corrompre!!!4ar pour la terre, le soleil, les vents, ils ne sont point sujets tre empoisonns, ni dtourns,ni drobs, tandis que tout cela peut arriver lGeau, qui, pour cette raison, a besoin que la loivienne son secours! "

8laton, $ivre F'', $es $ois, 1;; ans avant Hsus 46rist3insi lgi2rait %laton Q99 ans a$ant @0C0, anticipant de prs de !Q99 ans nos proccupationsen$ironne,entales sur les ressources en eau0

eau est une des ressources la plus ncessaire pour la $ie sur 7erre0 Cest dans leau questapparue la $ie sur notre plante# il * a en$iron >0O ,illiards dannes0 Ces pre,iersorganis,es# qui ntaient constitus que dune seule cellule# sont les lointains ancDtres detous les Dtres $i$ants actuels0 .e nos >0Q ,illiards de ,>deau ont t prle$s en /rance ,tropolitaine pour satis2aireles besoins lis 1 la production deau potable# 1 lindustrie# 1 lirrigation et 1 la productiondlectricit0 es $olu,es prle$s ne sont pas rpartis gale,ent selon les usages A laproduction dlectricit en utilise prs des deuE tiers# loin de$ant leau potable (" ['#lindustrie ("9 [' et lirrigation (; ['0 +n !99;# Q [ des prl$e,ents deau dclars auEagences de leau en /rance ,tropolitaine sont consacrs au re2roidisse,ent des centralesther,iques et nuclaires0 %lus de ;O [ des $olu,es deau prle$e pour la production

dlectricit sont restitus au ,ilieu naturel# 1 proEi,it du point de po,page0 Cesprl$e,ents sont e22ectus# 1 la 2ois en eau de sur2ace (cours deau# canauE# retenuesH' et

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en eau souterraine# selon les besoins de chaque secteur et la disponibilit de la ressource,ais la trs grande ,a(eau douce de sur2ace et eau de ,er' dont"0O ,illiard de ,> sont utiliss par les centrales nuclaires en bord de ri$ire0 4ien quengrande partie# ces $olu,es deau sont restitus au ,ilieu naturel# de part ses usages deseauE de sur2ace# +./ est directe,ent i,pact par les engage,ents de l+tat 2ranYais 2aceauE probl,atiques ,ondiales de leau0

3insi# en !99;# les dirigeants du groupe +./ ont sign une %olitique de .$eloppe,ent.urable qui sappuie sur des engage,ents socitauE 2orts A le %acte Mondial J GlobalCo,pact K des Nations Unies# la .claration Uni$erselle des .roits de l)o,,e# laCon$ention de l5rganisation Internationale du 7ra$ail# les %rincipes .irecteurs de l5C.+

(5rganisation de Coopration et de .$eloppe,ent +cono,iques' et les accords deResponsabilit Sociale des +ntreprises (RS+'0 Cette %olitique de .$eloppe,ent .urable 2iEeplusieurs ob


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(3SN'# sur la base de la .e,ande d3utorisation de Re


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CHAPITRE 1 :

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

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Chapitre 1 : Synth!e "i"liographi#ue

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1.INTRODUCTION

es lgionelles sont des bactries naturelle,ent prsentes dans len$ironne,ent0 +lles 2ont

parties intgrante des cos*st,es naturels aquatiques# tels que les ri$ires# les lacs ou leseauE souterraines (/lier,ans et al!# ";8"B .eclerc et al!# !99b'0 3 partir de cesen$ironne,ents naturels o_ elles sont gnrale,ent peu no,breuses# ces bactriespeu$ent coloniser des rser$oirs arti2iciels co,,e les rseauE de distribution deau# less*st,es de cli,atisation# les tours aror2rigrantes (5rtiT&Roque et )aTen# ";8Berissi,o et al!# ";;"B 6ullings et $an der ooi


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2.LEGIONELLA

2.1. HISTORIQUE

+n ";# lors de la O8,e con$ention de l3,ericanegion# QQ99 $trans rsident dans un htel de%hiladelphie0 "8! dentre euE contractent unepneu,opathie at*pique et !; personnes dcdent suite 1cette ,aladie que la co,,unaut scienti2ique no,,e laMaladie du gionnaire (/raser et al!# ";B Mc.ade etal!# ";'0 Ce nest que siE ,ois plus tard# que la bactrieresponsable de cette pid,ie a t isole (Mc.ade etal!# ";B 6inn# ";88'0 +lle a t appele $egionella

pneumop6ila (/igure "&"'! a source de lpid,ie a tdcou$erte# il sagissait dune conta,ination par $oiearienne issue du s*st,e de cli,atisation de lhtel(Mc.ade et al!# ";B 6inn# ";88'0 +n ";;# le genre$egionella a t tabli0 Il constitue lunique genreappartenant 1 la 2a,ille des $egionellaceae (4renner etal!# ";;'0

%ar la suite# des tudes rtrospecti$es ont per,is didenti2ier les lgionelles co,,e sourcede plusieurs pid,ies0 .es tudes ,enes sur des tissus hu,ains conser$s depuis plus deO9 ans pro$enant de personnes a*ant contracts une pneu,opathie taient in2ects par des

bactries de di22rentes espces appartenant au genre $egionella0 Ils sagissaient desbactries $!micdadei# $!pneumop6ilaet $!boKemanae(Mc.ade# !99!'0

2.2. INFECTIONS A LEGIONELLA

2.2.1. VOIE DEXPOSITION

a conta,ination se produit par inhalation darosols conta,ins ou par aspiration degouttelettes charges de bactries (4ollinet al!# ";8O'0 a dose in2ectieuse de $egionella sp!inhale entraWnant la lgionellose cheT lho,,e est 1 ce ' et dautres tudes ,oins rcentes (4erendtet al!# ";89B Meenhorstetal!# ";8>'# il se,ble que la dose ,ini,ale ncessaire pour causer une in2ection soit delordre de "9 Units /or,ant Colonies par ,illilitres (U/C:,' dair inhale0

Une 2ois inhales# si les arosols conta,ins par la bactrie atteignent les al$olespul,onaires# les lgionelles pntrent par phagoc*tose dans les ,acrophages et rsidentdans un phagoso,e o_ elles se ,ultiplient acti$e,ent (/igure "&!'0 Suite 1 la phase de,ultiplication dans la cellule hte# les bactries pro$oquent un puise,ent des ressourcesnutritionnelles et entrent en phase stationnaire0 ors de cette phase# plusieurs gnes de$irulence sont eEpri,s# per,ettant 1 la 2ois la libration et la trans,ission des cellulesbactriennes $ers une nou$elle cellule hte ($oir ` Q0"0"' (3bu Fai et al!# ";;8B Cianciotto#

!99"B @ules et 4uchrieser# !99'0

#i6u4e 1/1 L. pneumophila; mi


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#i6u4e 1/2 C3e 8e ie ses ma


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2.2.2. EPIDEMIOLOGIE

es bactries du genre $egionella sont associes 1 deuE pathologies A une 2or,e bnigneappele /i$re de %ontiac et la ,aladie des lgionnaires ,ortelle dans plus de "9[ des casen /rance (Ca,peseet al!# !9""aB !9""b'0 a /i$re de %ontiac est une 2or,e analogue 1 un

s*ndro,e grippal# non $oluti2 et 1 gurison spontane en deuE 1 cinq 0;[ des cas# $!boKemanaepour!0Q[ des cas sui$ies des espces $! micdadei# $! dumoffii# $! feeleii# $! LadsLort6iiet $! anisaresponsables de !0![ des cas de lgionellose0 +n 3ustralie# Nou$elle lande et @apon# lesin2ections par les lgionelles sont dues# en proportion gale# auE espces $! pneumop6ilaet$! longbeac6ae (Montanaro&%unTengruberet al!# ";;;B oideet al!# !99"B 5VConnoret al!#!99'0 +n /rance# "OQ9 cas# dont "![ ,ortels# ont t enregistrs en !9"9 correspondant 1une incidence de !0Q cas pour "99 999 habitants (/igure "&Q'0 .epuis !99O# une di,inutiondu tauE dincidence de la lgionellose a t obser$e


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Mondiale de la Sant (5MS' participe gale,ent au rseau de sur$eillance internationaledes lgionelloses0

+n +urope# un groupe de tra$ail sur les in2ections au genre $egionella a t cre en ";8(+uropean 6oring Group 2or $egionella In2ections & +6GI'0 Ce groupe de tra$ail a pour

ob" M*nnexe '' A )orme )E 20;-1.+ /ec6erc6e etdnombrement de $egionella spp et de $egionella pneumop6ila "N!.es $aleurs cibles de concentrations 1 ne pas dpasser ont t proposes en !99" par leConseil Suprieur d)*gine %ublique de /rance (CS)%/' sur la base des connaissancesscienti2iques et des obser$ations de terrain disponibles 1 cette date0 Ces $aleurs ne sont pas2ondes sur la relation dose&rponse cheT lho,,e qui reste incertaine 1 ce '0 es seuils 2iEs dpendent du t*pe dinstallation A

dans le cas des eauE chaudes sanitaires# la rgle,entation 2ranYaise 2iEe la $aleurcible en $!pneumop6ila1 "9>U/C: B

dans le cas des tablisse,ents ther,auE# la $aleur cible en $egionellatotales et en $!pneumop6ilacorrespond 1 labsence de bactries culti$ables dtectables B

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pour ce qui est des s*st,es industriels 2aisant appel 1 une pro .ce,bre !99Q intitule J Installations de re2roidisse,ent pardispersion deau dans un 2luE dair K (*nnexe 'F A 'nstallation de refroidissement par

dispersion deau dans un flux dair! %xemple dune tour arorfrigrante contre-courant dun circuit de refroidissement dune centrale nuclaire'0 +lle pr$oit trois casde 2igures sui$ant la concentration en $egionellatotale ,esure dans le s*st,e A seuil dacceptabilit de leau dappoint A O99 U/C: (li,ite de quanti2ication

de la ,thode culturale pour les eauE sales'0 Si leau dappoint ne respectepas ce seuil# un traite,ent de leau dappoint per,ettant datteindre cesobU/C: B bi,ensuelle si la concentration en $egionella totales est co,prise entre "9> et "9Q

U/C: (in2rieure 1 "9>U/C: pour Chinon' B hebdo,adaire si la concentration en $egionellatotales est co,prise entre "9Qet "9O

U/C: (entre "9> et "9QU/C: pour Chinon' B et


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2.4. TAXONOMIE

es lgionelles appartiennent 1 la 2a,ille des $egionellaceae0 Cette 2a,ille# constitueunique,ent du genre $egionella# a t tablie en ";; par 4renneret al!(";;' et constitue

a$ec la 2a,ille des4oxiellaceae

lordre des$egionellales

appartenant 1 la classe des&ammaproteobacteria0 e genre $egionella co,prend actuelle,ent plus de O9 espcesconnues et ce no,bre aug,ente rgulire,ent (7able "&"' (/ields et al!# !99!B .iederen#!998'0

7outes les espces de lgionelles isoles de sources cliniques ont gale,ent t dtectesdans len$ironne,ent 1 leEception de $!6acOeliaeet $!tusconensis (+delstein et Cianciotto#!99'0

Certaines espces possdent plusieurs srogroupes ($oir ` >0>0"'# lespce $!pneumop6ilaenco,pte "O alors que les autres espces nen possdent au ,aEi,u, que deuE0 7rois sous&espces ont t dcrites pour lespce $!pneumop6ilaA $0pneumop6ilasubsp0pneumop6ila#$0 pneumop6ilasubsp0 fraseriet $0 pneumop6ila subsp0 pascullei (4renneret al!# ";88'0 Cessous&espces peu$ent prsenter des souches appartenant 1 di22rents srogroupes (4renneret al!# ";88'A

srogroupes " 1 "Q pour $! pneumop6ilasubsp0pneumop6ila P srogroupes "# ># Q et O pour $! pneumop6ilasubsp0fraseri P srogroupe O unique,ent pour $! pneumop6ilasubsp0pascullei!

Certaines espces de lgionelles requirent des 2acteurs de croissance encore inconnus et nepeu$ent Dtre culti$es sur des ,ilieuE s*nthtiques0 Ces espces# par,i lesquelles 2igure $!l7ticasont appeles des pathognes a,ibiens $egionella lie (J $egionella&lie a,oebalpathogen K ou 3%' et ne peu$ent Dtre isoles que par co&culture a$ec des a,ibes (3delee et al!# ";;B )ooe*et al!# ";;'0

2.5. CARACTERES BIOCHIMIQUES GENERAUX

es ,e,bres de la 2a,ille des $egionellaceaesont des bacilles arobies 1 Gra, ngati2 nonsporuls# non capsuls et non acido&rsistants0 Ces bactries ,esurent de 90> 1 90; , delarge sur ! 1 !9 , de long (6inn# ";88'0 a ,a '0 a 2or,e et

la taille de ces ,icro&organis,es sont trs $ariables et dpendent des conditions# du stadeainsi que du ,ode de croissance (intracellulaire ou eEtracellulaire' (+delstein et Cianciotto#!99'0

es lgionelles ont des besoins nutritionnels co,pleEes et particuliers0 +lles sontauEotrophes $is&1&$is de certains acides a,ins# nota,,ent la &c*stine et la ,thionine(/ields# ";;!'0 +lles se distinguent des autres bactries saccharol*tiques par leurs eEigencesen sels de 2er lors du pri,o&isole,ent sur des ,ilieuE solides (.iederen# !998'0 eslgionelles nh*drol*sent pas les sucres et sont incapables de rduire les nitrates0 Cesbactries sont catalase et glatinase positi$e# oE*dase ngati$e ou 2aible,ent positi$e eturase ngati$e (%ineet al!# ";;'0 $! pneumop6ilaprsente la particularit par rapport auE

autres espces dDtre capable dh*drol*ser lhippurate (eEcepts les srogroupes Q et "O'()ebert# ";8"B Garrit*# !99O'0

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Ta>e 1/1 Es=B


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a paroi des lgionelles est particulire par rapport 1 celle des autres bactries 1 Gra,ngati20 +lle est h*drophobe et riche en acides gras ra,i2is habituelle,ent retrou$s cheTles bactries 1 Gra, positi2 (Miller# ";8>'0 Chaque espce co,porte une co,positionspci2ique en di$ers acides gras# que ce soit en qualit ou en quantit (Moss et .ees# ";;Ba,bert et Moss# ";8;'0 es lgionelles sont gale,ent caractrises par une structure

particulire des ubiquinones de leur ,e,brane cellulaire0 3lors que la plupart des bactries1 Gra, ngati2 ren2er,ent des ubiquinones dont les chaWnes latrales co,ptent 1 "9units isoprniques# les ubiquinones des lgionelles en co,portent ; 1 "Q (Collins et Gilbart#";8>B Gilbart et Collins# ";8O'0

es lgionelles possdent un gno,e dune taille approEi,ati$e de !0O E "9;daltons (soiten$iron >0; ,gabases' (4ender et al!# ";;9'0 a co,position ,olaire de leur gno,e enbase G et C $arie entre >8 et O![ (Go,eT&aleroet al!# !99;'0

es lgionelles sont capables de se d$elopper in vitrosur une ga,,e de te,prature allantde !O 1 Q!C a$ec un opti,u, de croissance 1 > "C (7hacer et al!# ";8"'0 eur p)

opti,al de croissance in vitroest de 0; (6adoFs*et al!# ";8O'0

3.TYPAGE DES LEGIONELLES

3.1. TAXONOMIE ET PHYLOGENIE BACTERIENNE

Une tude cologique repose# entre autre# sur lidenti2ication et la dter,ination des liensqui eEistent entre les di22rents organis,es du s*st,e biologique tudi0 a taEono,ie et la

ph*lognie sont des disciplines scienti2iques qui per,ettent didenti2ier# de classer et dedter,iner les liens de parents entre les organis,es (anda,,eet al!# ";;B $an 4elu,et al!# !99"'0 a classi2ication des Dtres $i$ants est ralise selon le no,bre de caractres queles organis,es ont en co,,un0 es organis,es peu$ent# ainsi# Dtre identi2is 1 di22renteschelles (/r*et al!# ";;"B )ooe*et al!# ";;' (/igure "&O'0

#i6u4e 1/5 Ran6 aFnmi?ue. EFem=>e 8e >a >6ine>>e.

a notion despce bactrienne a t d2inie en ";8 par le Co,it International deS*st,atique 4actriologique (J International Co,,ittee on S*ste,atic 4acteriolog* K ouICS4' (6a*ne et al!# ";8B Stacebrandt et al!# !99!B onstantinidis et al!# !99' co,,etant le rasse,ble,ent de di22rentes souches a*ant de 2ortes ho,ologies dans leur

squence d3.N0 3insi# une espce bactrienne regroupe des souches prsentant unpourcentage dh*bridation de leur 3.N suprieur 1 9[ ou 1 une identit ,o*enne en

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nuclotides de ;O[ (Stacebrandt et Goebel# ";;QB Rossello&Mora et 3,ann# !99"Bonstantinidis et 7iedS ce qui rend plus 2acile son anal*se# nota,,ent par le squenYage dugne0 Il per,et donc dobtenir ais,ent des donnes sur la ph*lognie su22isa,,entin2or,ati$es (/r*et al!# ";;"B )ooe*et al!# ";;B anda,,eet al!# ";;B 7heron et Cloete#!999B Rossello&Mora et 3,ann# !99"B %aret al!# !99QB Ciccarelliet al!# !99B Ra


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#i6u4e 1/' $Bnes 4ismi?ues es ARN4 2&S; 1'S e 5S


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ph*logntiques d2inis en a,ont de ltude0 a biodi$ersit ,esure sera dpendante de larsolution taEono,ique de la ,thode choisie0 e degr de co,prhension de lasse,blage,icrobien de lcos*st,e dpendra du caractre ph*logntique de la ,thode0

tude de la biodi$ersit des co,,unauts ,icrobiennes i,plique des di22icults

,thodologiques inhrentes auE caractristiques ,D,es des bactries0 +n e22et# leur petitetaille# labsence de caractres phnot*piques distinguables et labsence de culti$abilit de la,a


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es ,thodes ,olculaires 2ont parties des techniques actuelles les plus utilises pourtudier la biodi$ersit dun cos*st,e (7heron et Cloete# !999B Morriset al!# !99!B e,p et3ller# !99QB .origoet al!# !99OB Spiegel,anet al!# !99OB Gilbrideet al!# !99'0 Ces ,thodessont bases sur lanal*se du patri,oine gntique des organis,es prsents dans laco,,unaut# que ce soit l3.N ou l3RN0 es techniques ,olculaires d$eloppes sont trs

$aries et la ,aclaration des cas delgionellose'0 a dclaration dun cas de lgionellose i,plique lidenti2ication du genre# delespce et du srogroupe de lagent in2ectieuE0 Cette dclaration est en$o*e auE 3gencesRgionales de Sant (3RS' qui ralisent en partenariat a$ec le CNR et lInS unein$estigation du cas de lgionellose dtect0 Cette enquDte per,et didenti2ier la source dela conta,ination# de dter,iner le caractre isol ou co,,unautaire de la ,aladie et derenseigner les rseauE de sur$eillance europens0 +n /rance# lidenti2ication de cas groupset des sources de conta,ination est ralise par lanal*se des pro2ils de ,acrorestriction del3.N gno,ique des souches isoles de patients ou de len$ironne,ent par lectrophorse

en cha,p puls (J %ulsed /ield Gel +lectrophoresis K ou %/G+' (Schoon,aeret al!# ";;!'0Cette technique est la ,thode de r2rence utilise au CNR0 e t*page par lectrophorse

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en cha,p puls est long (,ini,u, quatre


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es ,thodes i,,unologiques i,pliquent la ralisation dune tape de culture0 Ces,thodes sont associes 1 lidenti2ication du genre et de lespce des lgionelles par les,thodes culturales pour lidenti2ication des srogroupes0 es ,thodes biochi,iques sontralises a$ec ou sans tape de culture0 +lles prsentent lintrDt ,ae 8es mD8es ui>ises en 6ie ainsi ?uen =i8mi>6ie =u4 >i8eni:ies.

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3.3.1. METHODES IMMUNOLOGIQUES

es techniques i,,unologiques sont utilises en routine dans les laboratoires pourlidenti2ication de lespce et du srogroupe des lgionelles0 es anticorps ,onoclonauE oupol*clonauE utiliss ciblent des antignes de sur2ace# 1 sa$oir les lipopol*saccharides (%S'

de la ,e,brane eEterne des bactries (Ciesielsiet al!# ";8'0 Ce %S prsente une structureparticulire cheT les lgionelles0 +lle a t ,ise en $idence par Sonesson et al! (";;>'0 e%S des $! pneumop6ila se distingue des autres espces par sa co,position en acides gras(Moss et .ees# ";;B a,bert et Moss# ";8;'0 Cest le plus i,portant dter,inanti,,unologique qui per,et la distinction des srogroupes de lespce $! pneumop6ila(6ilinson et /ies# ";89B SedgFic et 7ilton# ";8>'0 e %S est constitu par trois rgionsdistinctes A

une partie interne# le lipide 3 haute,ent conser$ B un no*au ou coreoligosaccharidique B une chaWne pol*saccharidique (5' prsentant une 2orte di$ersit et constituant la

rgion antignique du %S0 es srogroupes sont d2inis par le degr d5&act*lationsde cette chaWne pol*saccharidique0

a raction i,,unologique des anticorps a$ec les %S per,et didenti2ier les di22rentesespces de lgionelles et de grouper lespce $! pneumop6ilaen "O srogroupes nu,rotsde " 1 "Q et un groupe appel srogroupe ansing >0 +lle per,et aussi en utilisant huitanticorps ,onoclonauE di22rents de subdi$iser $! pneumop6ilasrogroupe " en neu2 sous&groupes A noE$ille# %hiladelphia# 4enidor,# /rance:3llentoFn# 5lda# 5E2ord# 4ellingha,#)e*sha, et Ca,perdoFn (@ol* et al!# ";8B )elbig et al!# ";;B )elbig et al!# !99!'0 Unpitope reconnu par lanticorps M3b >:" est li 1 une $irulence accrue du srogroupe " A ene22et# 8O0" [ des $! pneumop6ilasrogroupe " isoles cheT des patients sont reconnues parce M3b ()elbiget al!# !99!'0

a dtection de la raction positi$e antignes : anticorps peut Dtre dter,ine A par i,,uno2luorescence directe grce 1 des i,,un&sru,s de lapin dirigs contre

les O9 espces et les Q srogroupes de lgionelles B par dosage i,,uno&enT*,atique de t*pe +IS3 B ou par agglutination de billes de lateE couples 1 des anticorps spci2iques0

4ien que trs utilises pour lidenti2ication des espces et des srogroupes de lgionelles#ces ,thodes ont cependant certaines li,ites0 .es ractions i,,unologiques croises a$eccertaines bactries ou entre srogroupes ont t ,ises en $idence et biaisent

lidenti2ication par la dtection de 2auE positi2s (Chenet al!# ";;QB )elbiget al!# ";;QB @urgenset /ehrenbach# ";;OB .ito,,asoet al!# !998'0 Ces ,thodes sont utilises en routine pourlidenti2ication des souches isoles de patients ou de len$ironne,ent0 +n cologie# pourchaque dte,ination du genre et de lespce disolats de lgionelle# est gnrale,entassocie une identi2ication de leurs srogroupes0

3.3.2. METHODES BIOCHIMIQUES

es ,thodes biochi,iques regroupent# entre autres# les ,thodes qui se basent sur ltudedes protines ou des acides gras cellulaires0 a ,taproto,ique et le pro2ilage lipidiquetudient de ,anire si,ultane toutes les protines et tous les lipides eEtraits duneco,,unaut bactrienne0 Ces ,thodes per,ettent essentielle,ent daccder au pro2il

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biochi,ique dune co,,unaut entire0 es donnes sur lidentit des populations et leursproportions restent cependant li,ites0 a$antage ,a


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3$3$2$2$%&%'(S) *)S %CI*)S -%S C)''+'%I-)S

Identiication ta2ono3i#ue de! lgionelle!

es ,tabolites les plus utiliss pour lidenti2ication bactrienne sont les lipides dont les

acides gras phospholipidiques (J %hosphoipid /att* 3cids K ou %/3'# les esters ,th*liquesdacides gras (J /att* 3cids Meth*l +ster K ou /3M+' et les quinones0 es ,thodesdanal*se de ces lipides consistent 1 eEtraire et 1 puri2ier lense,ble des lipides puis 1 lesidenti2ier et les quanti2ier par des ,thodes chro,atographiques# par spectro,trie de,asse ou par rsonance ,agntique nuclaire (Spiegel,an et al!# !99O'0 Sachant que lanature# la co,binaison et la distribution des acides gras sont spci2iques dune espcebactrienne# par ces ,thodes il est possible didenti2ier di22rents groupes bactriens(Spiegel,anet al!# !99O'0 .e plus# les rsultats obtenus par ces ,thodes sont en accorda$ec ceuE obtenus par le squenYage du gne de l3RNr "S qui est la r2rence en ,atirede ph*lognie des espces bactriennes (ohringet al!# ";;QB Maliet al!# !998'0

Cette ,thode a t trs utilise pour lidenti2ication des isolats de lgionelles dans lesannes ";;9 (Ma*berr*# ";8QB Mar,etet al!# ";88B a,bert et Moss# ";8;B @antTenet al!#";;>'0 +n ";;;# elle a t teste sur lense,ble des espces de lgionelles connues 1 cettedate0 es auteurs (.iogo et al!# ";;;' ,ontrent que les espces appartenant au genre$egionella sont identi2iables par cette technique 1 leEception des lgionelles auto&2luorescentes dans le rouge A $! er7t6ra et $! rubrilucens0 4ien que standardise# cette,thode a trou$ peu dapplications tant en pid,iologie quen cologie0 Costa et al!(!99O' reportent lutilisation de cette ,thode pour lidenti2ication de lgionelles prsentesdans des eauE souterraines0 .ans cette tude# lidenti2ication des espces de lgionelles paranal*se de leurs acides gras a t co,plte par une anal*se gno,ique des souchesper,ettant daccder 1 leur persistance dans le ,ilieu0 Cette tude ,ontre le ,anquedapplicabilit de cette ,thode qui se li,ite 1 lidenti2ication des espces0

%pplication en cologie 3icro"ienne

Ces ,thodes sont plus gnrale,ent utilises pour gnrer des pro2ils co,,unautairesper,ettant de co,parer plusieurs co,,unauts entre elles ou dobser$er des $ariationste,porelles ou spatiales au sein dune co,,unaut bactrienne (Maliet al!# !998'0 Il eEisteplusieurs a$antages auE ,thodes de pro2ilage des lipides0 es cellules bactriennesadaptent la co,position lipidique de leur ,e,brane en 2onction des conditions

en$ironne,entales0 .es in2or,ations sur leur statut ph*siologique sont aussi accessibles parle pro2ilage des lipides (Mali et al!# !998'0 .e ,D,e# il est possible danal*ser des,arqueurs biochi,iques lis 1 une 2onction ,tabolique de la cellule et de dter,iner les2onctions des di22rentes populations dans leur en$ironne,ent (Spiegel,anet al!# !99O'0 epro2ilage de co,,unaut par lanal*se de ,arqueurs lipidiques per,et de co,parer laco,position de plusieurs co,,unauts bactriennes (ohring et al!# ";;QB Spiegel,an etal!# !99O'0 Ces ,thodes ne sont cependant pas adaptes au pro2ilage de co,,unautsco,pleEes car les acides gras ne sont pas spci2iques dune population bactrienne etchaque espce possde plusieurs lipides ,e,branaires (Spiegel,anet al!# !99OB Maliet al!#!998'0 ense,ble des acides gras dune co,,unaut co,pleEe est donc trs large et

lanal*se des donnes est rendue co,plique par le grand no,bre de donnes que gnrentces ,thodes (Spiegel,anet al!# !99O'0 Ces ,thodes ncessitent un quipe,ent onreuE

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,ais elles restent tout de2ractions 4NC sont donc prial!# !99O'0 es ,thodes bio,thodes didenti2icationSpiegel,anet al!# !99OB Rast

3.3.3. METHO

3$3$3$1$/)C&I

Identiication ta2ono3i

a7 5y"ridation %*&

h*bridation 3.N&3.N 2ait

(principe de la technique en!99;'0 %our les di22rentes essuprieur 1 O[ sau2 pour $!espces (Garrit* et al!# !99coteuse# les relations ph*lotablies sur la base du gne,oins discri,inante que lh*en a,ont pour slectionner(Stacebrandt et Goebel# ";;

#i6u4e 1/11 P4inu phosphore >!0 es squences dV3.Nr pes espces# les pro2ils de digestion sero";;'0 Vutilisation si,ultane de plusieurique peut per,ettre une discri,ination(Saunders et al!# ";;"'0 Cependant# ce

t*page ,olculaire pour les lgionellese que les ,thodes telles que la R3%. o

!e "i"liographi#ue

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pe de culture# lessit (Spiegel,anets utilises que lesrris et al!# !99!B

spce bactrienne

9"B 6enS ($oir

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paragraphes sui$ants' (Schoon,aeret al!# ";;!B Sallou,et al!# !99!'0 Il se,ble que cette,thode soit plus e22icace pour lidenti2ication de nou$elles espces que pour des sui$ispid,iologiques ou cologiques (Corde$antet al!# !99>'0

%pplication de! techni#ue! d9hy"ridation en cologie 3icro"ienne

a7 5y"ridation rcipro#ue

a technique dh*bridation 3.N&3.N# principale,ent utilise en taEono,ie bactrienne# at adapte 1 des tudes de di$ersit ,icrobienne0 h*bridation rciproque de l3.Nper,et de ,esurer le degr de si,ilarit entre plusieurs co,,unauts0 +lle est utiliselorsque lob


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Cette ,thode est base sur lh*bridation de sondes oligonuclotidiques courtes ("O 1 !Opaires de base' et 2luorescentes sur l3RN riboso,ique "S des di22rentes populationsdune co,,unaut bactrienne0 es sondes oligonuclotidiques utilises ciblent l3RNr "Sdes populations 1 di22rentes chelles taEono,iques selon lob B indstro,et al!# !99OB 7sia,iset al!# !998 BMa*aliet al!'

es puces 1 3.N sont des sur2aces (de $erre# pol*,re ou siliciu,' sur lesquelles sont 2iEesdes sondes oligonuclotidiques capables de sapparier 1 des squences d3.Nco,pl,entaires0 3.N 1 tester# ,arqu par un 2luorochro,e est ,is en contact a$ec lapuce 1 3.N0 Un signal 2luorescent est ,is si l3.N sh*bride par co,pl,entarit 1 unesonde (Spiegel,an et al!# !99OB Gilbride et al!# !99'0 7ous les ,icro&organis,es prsents

dans lchantillon# les bactries $iables et culti$ables# $iables ,ais non culti$ables et ,ortessont susceptibles dDtre ,esurs par les puces 1 3.N# 1 condition que chacun des ,icro&organis,es soient reprsents par une sonde (Greeret al!# !99"'0

3$3$3$2$%&%'(S) *+ ,.'(.-,IS) *) /%I'') *)S


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lectrophortique spci2ique des souches0 %lusieurs approches ont t d$eloppes par,ilesquelles (i' la digestion par des enT*,es de restriction du gno,e bactrien entier B (ii'la,pli2ication alatoire du gno,e bactrien ou encore (iii' la,pli2ication slecti$e deportions de gno,e0 Ces di22rentes ,thodes sont dtailles dans les paragraphes sui$ant0

a7

*ige!tion de l9%*& gno3i#ue

Ces ,thodes prsentent toutes un 2ort pou$oir discri,inant# co,parable 1 celui dellectrophorse en cha,ps puls0

e t*page des lgionelles par mae'0 Cette ,thode per,et une identi2ication des espces de$egionellaainsi que des sous&populations de $! pneumop6ila!+lle a t 2rque,,ent

utilise pour des tudes pid,iologiques (@osephet al!# ";;QB @osephet al!# ";;B)arrison et al!# !99b'0 a ,thode R/% prsente un pou$oir discri,inantco,parable 1 celui de la %/G+ (.e o*sa et )arrison# ";;;B oet al!# !99>'0

anal*se du =>3m4=Disme 8e ai>>e 8e :4a6mens am=>i:is(J 3,pli2ied /rag,entength %ol*,orphis, K ou 3/%' est une ,thode qui per,et une discri,inationtaEono,ique au ni$eau des souches de lgionelle0 Cette ,thode consiste 1 digrerl3.N gno,ique par deuE enT*,es de restriction0 .es adaptateursoligonuclotidiques sont lis auE eEtr,its des 2rag,ents d3.N et ser$ent de ciblesauE a,orces co,pl,entaires utilises pour a,pli2ier un sous&ense,ble des2rag,ents de digestion0 a di$ersit gno,ique des souches est $isualise par la tailledes 2rag,ents d3.N gnrs par la double digestion (/r* et al!# ";;;B /r* et al!#

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!999B @onaset al!# !999B Scaturroet al!# !99OB Chiariniet al!# !998'0 Cette ,thode at d$eloppe par e*Gene ()ollande' (oset al!# ";;O'# une co,pagnie pri$ede biotechnologies qui a dpos des droits de proprit sur la technologie0 3/% at la pre,ire ,thode standardise par +6GI au ni$eau international pour let*page gno,ique de $! pneumop6ila (/r* et al!# !99!'0 Son utilisation est trs

rpandue en pid,iologie (%erola et al!# !99!B %erola et al!# !99OB Chiarini et al!#!998B .en 4oeret al!# !998'0

a PCR ase su4 8es sies 8e 4es4i3m4=Disme 8e >,A!N am=>i:ia>ai4emen(J Rando, 3,pli2ied %ol*,orphic .N3 K ou R3%.' est une technique

produisant un pro2il gntique spci2ique des souches (6illia,set al!# ";;9B Saallahet al!# ";;OB 4ansal et Mc.onell# ";;B o %resti et al!# ";;8B e*be et al!# !99;'0a,pli2ication de l3.N est ralise 1 laide dune a,orce unique qui se 2iEe sur de,ultiples sites de l3.N0 a,orce utilise est une squence d2inie de ,anirearbitraire den$iron "9 nuclotides0 Si les deuE sites dh*bridation de la,orce sontsu22isa,,ent proches# la,pli2ication %CR est possible et conduit 1 des 2rag,ents de>99 1 Q999 pb0 intrDt de cette ,thode est quelle ne ncessite pas deconnaissances pralables sur le gno,e du ,icro&organis,e tudi0 a R3%. est une,thode si,ple et rapide ,ais le caractre alatoire de la,pli2ication induit une2aible reproductibilit0 Cependant# elle peut prsenter un 2ort pou$oir discri,inant si

plusieurs a,orces sont utilises si,ultan,ent (o %resti et al!# ";;8B aFrence etal!# ";;;a'0

am=>i:i


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c7 %3pliication !lecti=e de portion! de gno3e

es ,thodes bases sur les es=a3se 8e >a a4iai>i 8u nm4e 8e s?uenusieu4s >0>0>0>'# ahlischet al!(!9"9' ont

identi2i les populations de $! pneumop6ilaprsentes dans un rseau deau potablesans culture pralable a$ec une rsolution taEono,ique au ni$eau de la souche0

%pplication de! 3thode! d9analy!e du poly3orphi!3e de taille de!

rag3ent! d9%*& en cologie 3icro"ienne

%ar,i les ,thodes dcrites prcde,,ent# seule lanal*se du =>3m4=Disme 8e >,A!Nam=>i:i a>ai4emen (R3%.' a t utilise sur l3.N total dune co,,unaut,icrobienne0 Son utilisation gnre un pro2il gntique spci2ique des co,,unauts,icrobiennes (/ranlinet al!# ";;;B 6istro,et al!# !999B Spiegel,anet al!# !99O'0 +lle nestcependant pas applicable pour les co,,unauts bactriennes co,pleEes car les pro2ils quien rsulte possdent un no,bre de bandes trop le$ ce qui rend linterprtation du geldlectrophorse ineEploitable (/ranlinet al!# ";;;B Spiegel,anet al!# !99O'0

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/ranlin et al! (";;;' utilisent la technique R3%. pour co,parer des co,,unauts,icrobiennes aquatiques entre elles et ,esurer li,pact des 2acteurs en$ironne,entauE surcelles&ci0 .autres tudes# telles que les tudes de 6ilinsonet al!(";;9' et Radlet al!(!99O'ont pour obB 6er* et al!# !998B ahlisch et al!# !9"9B %arthuisot et al!# !9"9'0 Cependant#associe 1 des ,thodes de squenYage de l3.N contenu dans les bandes

lectrophortiques obtenues par SSC%# lidenti2ication des espces ou souches de lgionellesest rendue possible0

Cette technique per,et de sparer di22rents 2rag,ents d3.N dun chantillon a*ant la,D,e taille ,ais qui possdent des squences dacide nuclique di22rentes0 e principe estle sui$ant A des gnes sont a,pli2is 1 partir deEtrait d3.N total# une dnaturation de l3.N(;O C' sui$ie dune renaturation rapide (9 C' spare les 3.N doubles brins en si,ples brinset cre des structures d3.N secondaires spci2iques pour chaque squence d3.N0 es2rag,ents d3.N de di22rentes structures sont spars ensuite par lectrophorse sur gelde pol*acr*la,ide ou par lectrophorse capillaire (C+&SSC%'0 Selon les gnes cibles utiliss#di22rentes populations bactriennes peu$ent Dtre tudies et plusieurs rsolutions

taEono,iques peu$ent Dtre atteintes0

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%ar la,pli2ication slecti$e du gne de l3RNr "S des lgionelles (utilisation da,orcesspci2iques'# %arthuisot et al! (!9"9' ont sui$i leur d*na,ique spatio&te,porelle au seindune ri$ire et ont ,is en $idence une 2orte di$ersit des espces de lgionelles dont les,e,bres ,aB 3urellet al!# !99OB Costaet al!#!99O'0 e gne dot*(defectin organelle trafficOing' code pour une protine i,plique dansla $irulence des souches# ncessaire 1 la croissance intracellulaire dans les ,acrophages(Costaet al!# !99OB PaneTet al!# !99OB Costaet al!# !9"9'0

Une base de donnes ,ise en place par l3gence de %rotection de la Sant du Ro*au,e Uni(J )ealth %rotection 3genc* K ou )%3' base sur le squenYage du gne mipest disponibleet per,et lidenti2ication rapide des di22rentes espces de lgionelles (httpA::FFF0hpa&bioin2or,atics0org0u:cgi&bin: legionella:,ip:,ipid0cgi'0

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c7 S#uen?age de l9%*&r 16S

e squenYage de l3.N codant pour l3RNr "S est une ,thode large,ent utilise pourlidenti2ication des espces appartenant au genre $egionella(/r*et al!# ";;"B )ooe*et al!#";;B o %restiet al!# !99"'0 Ce gne est utilis co,,e r2rence pour lanal*se des liens

ph*logntiques entre espces0 Cependant# cette ,thode est peu utilise enpid,iologie0 Ces ,thodes peu$ent Dtre co,pltes par une digestion enT*,atiquepost&a,pli2ication re,plaYant ainsi ltape de squenYage des 2rag,ents d3.N par unelectrophorse0

%pplication en cologie 3icro"ienne

.i22rentes tudes reportant lutilisation du squenYage de l3.Nr "S en cologie ont tpublies (Sheehanet al!# !99OB 6ullings et an der ooi


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principale,ent sur deuE do,aines dtude A (i' la di$ersit ,icrobienne# qui inclue laquanti2ication et lidenti2ication des ,icro&organis,es dans di$ers habitats B et (ii' lacti$it,icrobienne qui correspond 1 leur 2onction dans leur en$ironne,ent et co,,ent cetteacti$it sinscrit dans la di$ersit et dans les c*cles biogochi,iques des cos*st,es0

a ,esure de tous ces para,tres est sou$ent di22icile et ncessite le,ploi de plusieurs,thodes co,bines0 a qualit de lchantillon initial est un para,tre dter,inant dansle choiE des ,thodes et peut rendre la ,esure de la biodi$ersit biaise0 a quantit et laqualit des in2or,ations sur la biodi$ersit dun chantillon sont directe,ent lies auEa$ances technologiques en ,atire de dtection et de quanti2ication des ,icro&organis,es0

es ,thodes ,icrobiologiques bases sur la culture des chantillons ont t le point dedpart des tudes de biodi$ersit0 Cependant# la non&culti$abilit de la ,a


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4.1. MODE DE VIE PLANCTONIQUE ET SESSILE

4.1.1. CYCLE DE VIE

.ans len$ironne,ent aquatique# les lgionelles sont des parasites intracellulaires desa,ibes# il se,ble quelles ne possdent pas la capacit de se ,ultiplier en leur absence(RoFbotha,# ";89B /ields# ";;>B Neu,eisteret al!# ";;B Murgaet al!# !99"B 4orellaet al!#!99OB Ma,pelet al!# !99'0 e c*cle de $ie intracellulaire des lgionelles a t caractris 1la 2ois dans des cellules de protoToaires et de ,acrophages (/ields et al!# !99!'0 eslgionelles pntrent dans les a,ibes ou les ,acrophages par phagoc*tose0 +lles rsidentdans un unique phagoso,e et d$eloppent deuE stratgies e,pDchant sa dgradation A (i'linhibition de la 2usion du phagoso,e a$ec les l*soso,es# ou (ii' linhibition de lacidi2icationdu phagoso,e ()orFitT et Sil$erstein# ";89B )orFitT# ";8>B )orFitT et MaE2ield# ";8Q'0 .ansle phagoso,e# les lgionelles se ,ultiplient a$ant de l*ser leur cellule hte et Dtre libresdans len$ironne,ent de ,anire libre ou dans des $sicules (Molo2s* et SFanson# !99QB

Garduno# !99' (/igure "&"!'0

#i6u4e 1/12 In:e


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#i6u4e 1/1& C3e 8e ie 8e L. pneumophila(8a=4Bs M>:s3 e Sansn; 200-).+tudes ralises en laboratoire qui supportent le ,odle sui$ant du c*cle de $ie des lgionelles dans

len$ironne,ent aquatique A ("' a 2or,e planctonique de $! pneumop6ilaen phase trans,issi$e est ingrepar des cellules phagoc*taires (a,ibes ou ,acrophages' et 2or,e une $acuole la protgeant de la digestion

l*soso,ale0 (!' =uand les conditions sont 2a$orables (nutri,ents abondants'# la bactrie rpri,e les traits detrans,ission et acti$e les $oies 2a$orisant la rplication0 (>' orsque les conditions dans le co,parti,ent de

rplication se dtriorent# les cellules bactriennes stoppent leur di$ision cellulaire et eEpri,ent des traits qui2a$orisent la sur$ie dans len$ironne,ent et la trans,ission $ers un nou$el hte phagoc*taire0 (Q' 3prs une

priode prolonge# les bactries eEpri,ent le phnot*pe de la 2or,e intracellulaire ,ature (J MatureIntracellular /or, K ou MI/'# qui est trs rsistant et in2ectieuE0 (O' a cellule hte est l*se et les bactries sontlibres dans len$ironne,ent aquatique0 (' es lgionelles qui ne rencontrent pas de nou$elles cellules htes#

stablissent dans les bio2il,s0 (' es lgionelles planctoniques rencontrent une nou$elle cellule phagoc*taire#un nou$eau c*cle co,,ence0 (8' es lgionelles culti$es en ,ilieu liquide en prsence de cellulesphagoc*taires# en phase eEponentielle ou stationnaire# a22ichent de 2ortes si,ilarits a$ec les 2or,es

rplicati$es et trans,issi$es respecti$e,ent0

3ssocie 1 la phase eEponentielle de croissance# la phase de rplication est rencontrequand les conditions sont 2a$orables 1 la croissance0 .ans le phagoso,e intra&a,ibien# lesnutri,ents sont abondants et les lgionelles adaptent leur eEpression gntique en 2a$eurde la rplication (Molo2s* et SFanson# !99QB Garduno# !99'0 es bactries ne sont pas,obiles# leur paroi est rugueuse et elles contiennent peu de f&h*droE*but*rate# utilisableco,,e source de carbone et dnergie (RoFbotha,# ";8'0 orsque les nutri,ents de la

$acuole de$iennent li,itant suite 1 leur conso,,ation par les lgionelles# les bactries sedi22rencient# passant de la phase rplicati$e 1 la phase trans,issi$e0 es bactries sont alorsde petite taille# ,obiles# prsentent une paroi lisse et elles contiennent une quantiti,portante de f&h*droE*but*rate (RoFbotha,# ";8'0 a di,inution des ressources enacides a,ins de la cellule hte# entraWne laug,entation de la quantit du 2acteur de laphase stationnaire /po=# ce qui conduit 1 leEpression des gnes de la phase stationnaire()a,,er et SFanson# ";;;'0 eEpression de ces gnes inhibe la ,ultiplication cellulaire(Molo2s* et SFanson# !99QB Garduno# !99' et entraine la s*nthse dinducteurs de lancrose phagoc*taire# de la ,obilit# ainsi que des 2acteurs de rsistance auE stressen$ironne,entauE (U# chaleur# pression os,otique# nutri,ents li,itant' (4*rne et

SFanson# ";;8B 3lli et al!# !999B SFanson et )a,,er# !999B Molo2s* et SFanson# !99QBGarduno# !99'0 7ous ces caractres sont absents lors de la phase rplicati$e0 ors de cette

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phase trans,issi$e# les lgionelles prparent leur sortie de la cellule a,ibienne $erslen$ironne,ent aquatique# leur sur$ie en phase planctonique et leur rintgration dans unenou$elle cellule hte (SFanson et )a,,er# !999B Molo2s* et SFanson# !99QB Garduno#!99'0 es bactries intracellulaires# prpares 1 leur libration dans len$ironne,entaquatique eEpri,ent un phnot*pe appel J /or,e Intracellulaire Mature K (J Mature

Intracellular /or, K ou MI/'0 es lgionelles intracellulaires possdent donc deuE,orphologies A la 2or,e rplicati$e et la 2or,e MI/0 a 2or,e rplicati$e correspond 1 unestructure t*pique des bactries 1 Gra, ngati20 es bactries MI/ sont plo,orphes# a$ecune paroi paisse0 +lles sont trs rsistantes et contagieuses (/aulner et Garduno# !99!BGardunoet al!# !99!B Greub et Raoult# !99>B Molo2s* et SFanson# !99QB Garduno# !99'0

4.1.2. COLONISATION DES BIOFILMS

.ans les ,ilieuE aquatiques# le bio2il, constitue pour les ,icro&organis,es une ,atriceidale pour leur ,ultiplication et leur sur$ie (4arbeauet al!# ";;8B 3tlas# ";;;'0 Ce ,ode de

$ie est trs rpandu dans le ,onde ,icrobien# il se,ble que la $ie sessile prsente desa$antages $is&1&$is du ,ode de $ie planctonique (6atnic et olter# !999B )indre et al!#!998B .eclerc# !99;'0 .ans les rseauE de distribution deau potable# le bio2il, constitue leprincipal rser$oir de ,icro&organis,es0 +n e22et# ;O[ de la 2lore ,icrobienne est localisedans le bio2il, contre O[ seule,ent dans leau circulante (/le,,inget al!# !99!B Codon*etal!# !99O'0 es bio2il,s peu$ent se d$elopper dans di$ers endroits tels que des tissus$i$ants# des dispositi2s ,dicauE# des s*st,es de distribution deau potable ou encore dess*st,es aquatiques naturels (.onlan# !99!'0 Ils constituent des $oies din2ectionbactrienne pri$ilgies (/igure "&"Q' (Costertonet al!# ";;;B MatTet al!# !9""B 6ingenderet /le,,ing# !9""'0

.e no,breuses tudes ,ontrent la prsence des lgionelles dans les bio2il,s# issusden$ironne,ents naturels ou arti2iciels (4arbeauet al!# ";;8B 3tlas# ";;;B )arbet al!# !999B/ieldset al!# !99!B iuet al!# !99'0 Rogers et ee$il (";;!' ont ralis une tude portant surla prsence des lgionelles dans un bio2il, se d$eloppant dans un s*st,e de distributiondeau0 Ils ont ,ontr quelles reprsentaient ![ de la 2lore culti$able du bio2il, et que laconcentration en lgionelles sessiles est large,ent suprieure 1 celle des lgionellesplanctoniques (Rogers et al!# ";;Q'0 Ce rsultat# con2ir, par des tudes plus rcentes,enes par /le,,ing et al! (!99!' ainsi que 6ingender et /le,,ing (!9""'# tendent 1supposer que le bio2il, est un rser$oir naturel des lgionelles0 .ans le bio2il,# leslgionelles sont capables de sur$i$re dans des conditions en$ironne,entales trs $aries0

+lles ont t dtectes dans des prl$e,ents de ri$ires# de lacs o_ la te,prature taitco,prise entre >09 et !!0OC B un p) entre 0> et 80 B une conducti$it entre >99 et "9O9S:c, (Gri,, et al!# ";;8'0 e bio2il, leur per,et de se protger contre des conditionsen$ironne,entales d2a$orables (Store* et al!# !99Q'0 %lus gnrale,ent# des tudes ontd,ontr le22et protecteur du bio2il, A les bactries sessiles sont O9 1 "999 2ois plusrsistantes auE biocides que les bactries planctoniques (Sutherland# !99"B Mc4ain et al!#!99!B /uEet al!# !99O'0

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#i6u4e 1/1- RK>e 8es i:i>ms en an ?ue 4se4i4 8e mi


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trans2erts horiTontauE de gnes entre bactries et dune co,,unication intercellulairedense# appele J =uoru, Sensing K (Rogerset al!# ";;QB )ugheset al!# ";;8B Crespi# !99"BSutherland# !99"B elicer# !99>B re2t# !99QB 3,ino$# !9""B 6ingender et /le,,ing# !9""'0

e c*cle d$olution dun bio2il, se droule en trois tapes (*nnexe F''' A $e biofilmNA ("'

lattache,ent des ,icro&organis,es# (!' la ,aturation du bio2il,# (>' le dtache,ent et ladispersion des cellules dans la phase circulante (.onlan# !99!B .eclerc# !99;'0 esorganis,es peu$ent sattacher auE sur2aces i,,erges et 2or,er un bio2il, ,ono ou pluri&espces# ce sont les colonisateurs pri,aires0 Ils peu$ent gale,ent sintgrer 1 un bio2il,daB6adoFs* et Pee# ";8O'0 .autres tudes suggrent que les ressources ncessaires 1 lacroissance eEtracellulaire des lgionelles dans les bio2il,s# et nota,,ent les acides a,ins#pro$iennent de la dgradation de ,atires organiques (Stout et al!# ";8OB .e$os et al!#!99O'0 Ces rsultats ont t con2ir,s rce,,ent par 7e,,er,an et al! (!99' qui ont

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Chapitre 1 : Synth!e "i

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