Université de Reims Champagne Ardenne

&

Université de Monastir

Année 2011

THESE DE COTUTELLE

Présentée pour l’obtention du

DIPLOME DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE ARDENNE

E.D. SCIENCES, TECHNOLOGIE ET SANTE EN

Biologie cellulaire et moléculaire

&

DIPLOME DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE MONASTIR

E.D. SCIENCES BIOLOGIQUES, BIOTECHNOLOGIE ET SANTE EN

Sciences pharmaceutiques

INTERLEUKINE 10 ET REGULATION DE L’ACTIVITE

PROCOAGULANTE MONOCYTAIRE INTERET DANS LE SYNDROME CORONARIEN AIGU

Présentée et soutenue publiquement le 19 Janvier 2011

Par

Sonia BEN HADJ KHALIFA Membres du Jury : Professeur Y. GRUEL Professeur A. El GAAIED Professeur A.M. FISCHER Professeur N. BEN ROMDHANE Professeur W.Y. ALMAWI

Professeur T. MAHJOUB Docteur N. HEZARD Professeur P. NGUYEN

1

Sommaire……………………..…………………………………………………………………..1

Principales abréviations…….………..……………………………………...…………….…….4

Intitulés des figures………….………………………………………………...……………....…7

Intitulés des tableaux………………………………………………...…………………………..8

INTRODUCTION GENERALE…….…….................………..…………………9

ETAT DES CONNAISSANCES SUR LE SUJET….…..………………..…....11

I. LE MONOCYTE : SUPPORT PROCOAGULANT ................................................12

1. LE FACTEUR TISSULAIRE MONOCYTAIRE ............................................................................12

1.1. Le gène FT ....................................................................................................................12

1.2. La protéine FT : Structure et formes ..............................................................................13

1.2.1. Structure de la protéine...........................................................................................13

1.2.2. Les formes du FT.....................................................................................................15

1.3. Induction de l’expression du FT par le monocyte : modèle du LPS ..............................16

1.3.1. Récepteurs monocytaires du LPS : le CD14 ...........................................................16

1.3.2. Voies de signalisation en réponse au LPS ..............................................................17

1.3.3. Régulation transcriptionnelle par le LPS...............................................................21

1.4. Régulation de l’expression du FT monocytaire .............................................................21

1.4.1. Régulation positive .................................................................................................21

1.4.2. Régulation négative................................................................................................23

1.5. Fonctions biologiques du FT..........................................................................................24

1.5.1. Initiation de la coagulation .....................................................................................24

1.5.2. FT et signalisation...................................................................................................25

2. LA GENERATION DES MICROPARTICULES ............................................................................27

2.1. Les microparticules : définition générale .......................................................................27

2.2. Processus général de la microvésiculation .....................................................................28

2.2.1. Perte de l’asymétrie de la membrane plasmique ....................................................28

2.2.2. Rupture du cytosquelette .........................................................................................29

2.2.3. Caractéristiques générales des MPs .......................................................................30

2.3. Données actuelles concernant la microparticule monocytaire........................................32

2.3.1. Régulation de la microvésiculation monocytaire....................................................32

2.3.2. Les caractéristiques de la microparticule monocytaire ..........................................32

2.3.3. Fonctions biologiques de la microparticule monocytaire.......................................33

3. GENERATION DE LA THROMBINE ET SA REGULATION .........................................................34

3.1 Activation enzymatique de la génération de thrombine et sa régulation physiologique 34

2

3.2. Les serines protéases clés, le facteur Xa et la thrombine ...............................................37

3.2.1. Le facteur Xa ...........................................................................................................37

3.2.2. La thrombine ...........................................................................................................39

3.3. Inhibition pharmacologique de la génération de thrombine...........................................42

3.3.1. Les héparines : HNF et HBPM ...............................................................................42

3.3.2. Le fondaparinux ......................................................................................................43

II. L’INTERLEUKINE -10 .............................................................................................45

1. LE GENE DE L’IL-10..............................................................................................................45

1.1. Structure du gène de l’IL-10 ..........................................................................................45

1.2. Structure du promoteur du gène de l’IL-10...................................................................45

1.2.1. Sites de fixation des facteurs de transcription ........................................................47

1.2.2. Polymorphismes génétiques ....................................................................................48

2. LA PROTEINE IL-10 ..............................................................................................................54

2.1. Structure de la protéine ..................................................................................................54

2.2. Induction de l’expression de l’IL-10..............................................................................55

2.2.1. Récepteurs, voies de signalisation, et facteurs de transcription .............................56

2.2.2. Expression de l’IL-10 et polymorphismes génétiques.............................................58

3. LE RECEPTEUR DE L’IL-10...................................................................................................59

3.1. Structure du récepteur de l’IL-10 ..................................................................................59

3.1. Signalisation induite par l’IL-10 ....................................................................................61

4. ACTIVITES BIOLOGIQUES DE IL-10......................................................................................63

4.1. IL-10 et régulation inflammatoire et immunologique ....................................................63

4.1.1. IL-10 et production de médiateur de l’inflammation ..............................................63

4.1.2. IL-10, phagocytose et présentation de l’antigène .................................................63

4.1.3. IL-10 et activité immunologique des lymphocytes B et T.......................................64

4.2. IL-10 et régulation de la coagulation .............................................................................65

4.2.1. IL-10 et régulation de l’expression du FT ..............................................................65

4.2.2. IL-10 et régulation de la génération de thrombine .................................................65

4.2.3. IL-10 et Fibrinogène ..............................................................................................66

4.2.4. IL-10 et Fibrinolyse.................................................................................................66

4.3. IL-10 et apoptose............................................................................................................66

EXPOSE DES TRAVAUX……………………………………………………...68

3

I. RÉGULATION DE L’ACTIVITÉ PROCOAGULANTE DU MONOCYTE : IL-

10, ANTICOAGULANTS ……...……………………………………………………..69

1. INTRODUCTION .....................................................................................................................69

2. RÉSULTATS............................................................................................................................70

2.1. Publication 1...................................................................................................................70

Differential inhibitory effect of fondaparinux on the procoagulant potential of intact

monocytes and monocyte-derived microparticles. J Thromb Thrombolysis 2010; 30: 412-

418.

2.2. Publication 2...................................................................................................................78

Differential coagulation inhibitory effect of fondaparinux, enoxaparin, and unfractionated

heparin in cell-models of thrombin generation. Blood Coagulation & fibrinolysis. Submited.

2.3. Publication 3...................................................................................................................96

IL-10 inhibits apoptosis and microvesiculation of human monocytes. J Thromb Haemost

2009 ; 7:1241-3.

2.4. Publication 4.................................................................................................................103

IL-10 modulates fondaparinux inhibition of monocyte induced thrombin generation. Thromb

Res. Submited.

2.5. Principaux Résultats.....................................................................................................124

3. DISCUSSION .........................................................................................................................125

II. POLYMORPHISMES DE L’IL-10 ET SYNDROME CORONARIEN AIGU .128

1. INTRODUCTION ...................................................................................................................128

2. RÉSULTATS..........................................................................................................................129

2.1. Publication 1.................................................................................................................129

Functional Interleukin 10 promoter variants in coronary artery disease patients in Tunisians.

Eur Cytokine Netw 2010 ; 21:136-141.

2.2. Publication 2.................................................................................................................136

Interleukin-10 microsatellite variants and the risk of acute coronary syndrome among

Tunisians. Int J Immunogenet. In press.

2.3. Principaux résultats ......................................................................................................144

3. DISCUSSION .........................................................................................................................144

CONCLUSION ET PERSPECTIVES………...…….………………………..150

REFERENCES………………………………………………………………....152

4

Principales abréviations

A : Adénine

aa : acide aminé

ADN : acide désoxyribonucléique

AMPc : adénosine monophosphate cyclique

AP-1 : activator protein-1

ARNm : acide ribonucléique messager

AT : antithrombine

ATP : adénosine triphosphate

Bcl-2 : ß-cell lymphoma leukemia-2

C: Cytosine

C/EBP : CCAAT-enhancer-binding proteins

Ca2+ : calcium

CD : cluster de différenciation

c-Maf : c-avian musculoaponeurotic fibrosarcoma

CMH : complexe majeur d'histocompatibilité

CR3 : complement receptor 3

CREB : cAMP response Element-Bindingc-Maf

CRP : C-reactive protein

Cu2+ : cuivre

EGF : epidermal growth factor

ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay

Erg-1 : early growth response-1

ERK : extracellular-signal-regulated kinase

FasL : Fas-ligand

FLICE : FADD-like IL-1ß converting enzyme

FT : facteur tissulaire

FTas : facteur tissulaire alternativement épissé

F (V, VII, VIII, IX, X, XI, XIII) : facteur (V, VII, VIII, IX, X, XI, XIII)

F (V, VII, VIII, IX, X, XI)a : facteur (V, VII, VIII, IX, X, XI) activé

G : Guanine

G-CSF : granulocyte colony-stimulating factor

Gla : gamma-carboxyglutamyl

GM-CSF : granulocyte macrophage colony stimulating factor

5

GPI : glycosyl phosphatidyl inositol

HBPM : héparine de bas poids moléculaires

HNF : héparine non fractionnée

ICAM-1 : Inter-cellular adhesion molecule 1

IgM : Immunoglobuline

IKK : I-kappaB kinase

IL-(1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 19, 20, 24) : interleukine-(1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 19, 20, 24)

IL-10E1 : Interleukin 10 enhancer 1

IRF: interferon regulatory factor 1

JAK : Janus kinase

JNK : Jun N-terminal kinase

LBP : LPS-binding protein

LPS : lipopolysaccharide

LRE : lipopolysaccharide responsive element

MAPK : mitogen activated protein kinase

MCP : monocyte chemotactic protein

M-CSF : macrophage colony stimulating factor

MIP : macrophage inflammatory protein

MLCK : myosin light chain kinase

MP(s): microparticule(s)

Na+ : sodium

NF-ƙB : nuclear factor kappa B

PAI : plasminogen-activator inhibitor

PAP : plasmin-alpha-2-antiplasmin

PAR : protease-activated receptor

pb : paires de bases

PBMC : Peripheral blood mononuclear cell

Pbx1 : Pre-B-cell leukemia homeobox 1

PC : phosphatidylcholine

PCa : protéine C activée

PDGF : platelet derived growth factor

PDI : protéine disulfide isomérase

PDK-1 : phosphoinositide-dependent Kinase-1

PE : phosphatidyléthanolamine

PF4 : facteur 4 plaquettaire

6

PI3K : phosphatidylinositol-3-kinase

PKC : protéine kinase C

PKR : protein kinase RNA-regulated

PMA : phorbol 12-myristate 13-acetate

PS : phosphatidylsérine

PSGL-1 : P-selectin glycoprotein ligand 1

SAPK : stress activated protein kinase

SM : sphingomyeline

SNP : single nucleotide polymorphisms

SOCS1 : suppressor of cytokine signaling-1

SP1 : stimulating protein 1

SRF : serum response factor

SRR : serum response region

STAT : signal transducer and activator of transcription

T : Thymine

TAFI : thrombin activatable fibrinolysis inhibitor

TAK1: transforming growth factor-β-activated kinase 1

TCR : T cell receptor

TFPI : tissue factor pathway inhibitor

TGF-β : transforming growth factor

Th : T-helper

TIR : TNR-IL-1R

TIRAP : TIR domain-containing adapter protein

TLR4 : toll-like receptor 4

TNF-α : tumor necrosis factor α

t-PA : tissue plasminogen activator

TRAM : TRIF-related adaptor molecule

TRIF : TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-

Tyk2 : tyrosin kinase

VCAM-1 : vascular cell adhesion molecule-1

VEGF : vascular endothelial growth factor

II : prothrombine

IIa : thrombine

7

Intitulés des figures

Figure 1. Représentation schématique du promoteur du gène du facteur tissulaire……………..13

Figure 2. Structure « ruban » du domaine extracellulaire du FT…………………….…………….14

Figure 3. Voies de signalisation dans le monocyte en réponse au LPS…………………………….20

Figure 4. Implication du FT dans la signalisation……………………………………………….…...27

Figure 5. Processus général de la microvésiculation en réponse à une stimulation cellulaire....31

Figure 6. Les phases de la génération de la thrombine………………………………………..……..36

Figure 7. Structure du FXa……………………………………………….…………………….……..…38

Figure 8. Structure de la thrombine………………….…………………………………………..……..40

Figure 9. Rôles biologiques du FXa et de la thrombine……………………………………………..41

Figure 10. Interactions fondaparinux-AT………………………………………………………………44

Figure 11. Le gène de l’IL-10……………………………………………………………………………46

Figure 12. Nomenclatures des polymorphismes de substitution d’un nucléotide…………………49

Figure 13. Structure en ruban de l’interleukine-10…………………………………………………...55

Figure 14. Structure du récepteur de l’interleukine-10 lorsqu’il est lié à son ligand (IL-10)….60

Figure 15. Voies de signalisation induites par la liaison de l’IL-10 à son récepteur…………….62

8

Intitulés des tableaux

Tableau I. Marqueurs de surfaces permettant l’identification de l’origine cellulaire des MPs…30

Tableau II. Nomenclatures des polymorphismes de répétition de CA, IL-10G et IL-10R……..51

Tableau III. Distribution allélique des trois SNPs -1082G>A, -819C>T et -592 C>A et des deux

microsatellites IL-10G et IL-10R selon l’ethnie…………………………………………………53

Tableau IV. Principaux récepteurs, voies de signalisation, et facteurs de transcription impliqués

dans la régulation de l’expression de l’IL-10……………………………………………………57

9

INTRODUCTION GENERALE

10

L’hémostase est habituellement décrite comme faisant intervenir les plaquettes puis la

coagulation plasmatique aboutissant à la génération de la thrombine. Dans ce schéma classique,

la coagulation est envisagée sous le seul angle plasmatique alors que la composante cellulaire y

est déterminante. Les monocytes y jouent un rôle particulièrement important puisqu’ils sont les

seules cellules circulantes exprimant le facteur tissulaire, initiateur principal de la coagulation.

Ces dernières années ont vu émerger un nouveau concept intriquant hémostase et phénomènes

inflammatoires voire immunologiques. Le monocyte, compte tenu de ses propriétés, y joue un

rôle central.

L’approche de notre travail est d’aborder le monocyte et ses propriétés procoagulantes et

d’évaluer sa régulation par l’interleukine-10, cytokine essentielle de la modulation inflammatoire.

Parmi les champs d’application de notre approche fondamentale, le syndrome coronarien aigu

nous semble particulièrement adapté, dans la mesure où le facteur tissulaire et les

microparticules procoagulantes jouent un rôle déterminant. A l’inverse, l’interleukine-10 pourrait

s’avérer protectrice. Ainsi, nous abordons largement, dans la seconde partie de notre travail,

l’influence des polymorphismes génétiques de l’interleukine-10, au cours de cette pathologie.

Ce travail a été mené dans le cadre d’une cotutelle entre les Universités de Reims et de

Monastir. Les études se rapportant à l’évaluation du phénotype procoagulant monocytaire par

des molécules anticoagulantes et par l’IL-10 ont été réalisées à Reims. Avec l’équipe tunisienne,

nous avons rassemblé une cohorte de patients présentant un SCA et nous avons réalisé l’étude

des polymorphismes génétiques de l’interleukine-10. L’étude des polymorphismes de répétition

de l’interleukine-10 a été préférentiellement réalisée à Reims.

11

ETAT DES CONNAISSANCES SUR LE SUJET

12

I. LE MONOCYTE : SUPPORT PROCOAGULANT

1. LE FACTEUR TISSULAIRE MONOCYTAIRE

Le facteur tissulaire (FT), appelé aussi thromboplastine, facteur de coagulation III ou

CD142 (CD : cluster de différenciation), est le principal initiateur de la génération de la

thrombine via la fixation avec une très forte affinité des facteurs VII (FVII) et VIIa (FVIIa).

1.1. Le gène FT

Le gène codant le FT est situé sur le chromosome 1 en position 1p21-p22 (Carson 1985).

Il est constitué de 12 400 paires de bases (pb) et comprend 6 exons séparés par 5 introns. La

partie codante du gène comprend 885 pb. Le promoteur du gène se situe en 5', en amont de la

région non codante (Morrissey 1987).

Outre la séquence TATA box, la région promotrice comprend une séquence SRR (Serum

Response Region) (Mackman 1997), responsable de l’expression constitutive du FT (Figure 1).

L'expression constitutive du FT a été démontrée dans plusieurs lignées cellulaires, et met en jeu

des séquences d'interaction avec les facteurs de transcription de la famille SP1 (Stimulating

Protein 1) (Cui 1996). La région SRR participe également à l’expression inductible du FT en

réponse à des stimuli tels que le stress oxydatif ou le liposaccharide (LPS), et ce via 3 sites de

fixation des facteurs de transcription de type Erg-1 (Early Growth Response-1) (Guha 2001b,

Houston 1999). La région promotrice comprend également une séquence LRE

(Lipopolysaccharide Responsive Element), située entre -227 et -172 pb. Elle comporte deux sites

de type AP-1 (Activator Protein-1) et un site NF-ƙB (Nuclear Factor Kappa B) (Mackman 1997).

Le site NF-ƙB chevauche une région NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) (Armesilla

1999). La séquence LRE régule l’expression inductible du FT après activation par le LPS, le

PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate), l’interleukine-1β ou encore le TNF-α (Tumor Necrosis

Factor α) (Mackman 1991, Oeth 1997, Parry 1995).

13

Figure 1. Représentation schématique du promoteur du gène du facteur tissulaire

Le promoteur du gène comprend deux régions majeures pour la régulation de l'expression du FT : 1) la région

SRR, comprenant 3 des 5 sites spécifiques des facteurs de transcription SP1 du promoteur, impliqués dans

l'expression constitutive du FT, et 3 sites de fixation des facteurs de transcription de type Erg-1, probablement

impliqués dans l'expression inductible du FT, et 2) la région LRE, comprenant 2 sites de type AP-1 et un site

NF-ƙB chevauchant une région NFAT; la région LRE est responsable de l'expression inductible du FT

(D’après, Mackman 1997, Cui 1996, Guha 2001a, Houston 1999, Armesilla 1999, Mackman 1991, Oeth 1997,

Parry 1995).

1.2. La protéine FT : Structure et formes

1.2.1. Structure de la protéine

Le FT est une glycoprotéine transmembranaire d’environ 47 kDa appartenant à la classe

II de la superfamille des récepteurs des cytokines. La protéine mature est constituée de 263

acides aminés (aa) et est organisée en trois domaines : un domaine extracellulaire de 219 aa, un

domaine transmembranaire de 23 aa et un court domaine intracytoplasmique de 21 aa (Morissey

1987, Spicer, 1987).

Le domaine extracellulaire du FT a été cristallisé par deux équipes différentes (Muller,

1994, Harlos, 1994). Il est constitué de deux modules, N- et C- terminal, reliés par un pont

polypeptidique Pro102-Asp107, permettant une angulation de 125° entre les deux modules.

Chaque module est constitué de 7 brins β répartis en feuillets β antiparallèles. Le domaine

extracellulaire contient 3 des 4 sites de N-glycosylation que compte le FT (Asn11, Asn124 et

Asn137) (Padorsky 1989). La glycosylation protège le FT de sa dégradation protéolytique

(Padorsky 1989) et augmente son activité procoagulante (Krudysz-Amblo 2010). Le domaine

extracellulaire contient également deux domaines fibronectine de type III possédant chacun un

pont disulfure. Le pont disulfure en N-terminal, Cys49-Cys57, est un pont disulfure de structure

NFAT

TATA

Erg-1

Sp1

NF-ƙB AP-1

-250 -150 -100 -50 +1pb -200

Serum growth factor Respensive region (SRR)

LPS responsive element (LRE)

14

typique. En revanche, le pont disulfure en C-terminal, Cys186-Cys209, est un pont disulfure

fonctionnel de type allostérique (RHStaple) (Hogg 2009) (Figure 2). Des études de mutagenèse

dirigée ont démontré le rôle du pont disulfure Cys186-Cys209 dans l’affinité du FT pour son

ligand, le FVIIa (Rehemtulla 1991, Kothari 2010). Il est également démontré que la suppression

de ce pont disulfure modifie la structure conformationelle du FT, avec une double conséquence

fonctionnelle : la perte de l'activité procoagulante du FT, et un switch vers une fonction de

signalisation (Ahamed 2006). L’implication du pont disulfure Cys186-Cys209 dans la dé-

encryption du FT est controversée. Cette notion sera abordée dans le paragraphe I.1.2.2.2.

Figure 2. Structure « ruban » du domaine extracellulaire du FT

Les feuillets β des modules N-terminal et C-terminal sont numérotés de 1A à 7G et de 8A à 16G. La flèche

noire indique la liaison polypeptidique Pro102-Asn107 entre les deux modules, permettant une angulation de

l'un par rapport à l'autre. En rouge sont indiqués les sites de N-glycosylation, protégeant le FT de sa

dégradation protéolytique. Les traits bleus indiquent les deux ponts disulfures, dont l'un très proche de la

membrane cellulaire (d'après Daubie 2007).

Le domaine intra-cytoplasmique du FT contient deux sites de phosphorylation : le site

Ser253, site consensus faisant intervenir la protéine kinase C (PKC), et le site Ser258,

indépendant de la PKC (Sen 2009). La Ser 258 joue un rôle majeur dans la signalisation induite

par le complexe FT-FVIIa (Sen 2009). Sa phosphorylation fait l'objet d'une régulation complexe

Mo

du

le N-term

ina

l

Mo

du

le C

-ter

min

al

2b

2c

2a

15

: régulation positive dépendante de la phosphorylation de la Ser253, et régulation négative

dépendante de la palmitoylation de la Cys245 du domaine intracytoplasmique.

1.2.2. Les formes du FT

1.2.2.1. FT alternativement épissé

Outre la forme complète du FT, telle que décrite dans le paragraphe précédent (I.1.2.1),

Bogdanov et al ont montré en 2003 qu'il existe in vivo une synthèse d’une forme alternative du

FT (Bogdanov 2003). Ce FT, dénommé FT "alternativement épissé" (FTas), est plus court (206

aa). Dépourvu de ses domaines transmembranaire et intracytoplasmique, le FTas circule

librement. Son activité procoagulante est discutée : activité procoagulante en présence de

phospholipides pour l'équipe de Bogdanov VY (Bogdanov 2003), ou, à l'inverse, absence

d’activité procoagulante pour Censarek P (Censarek 2007).

1.2.2.2. FT membranaire : formes encryptée et dé-encryptée

A la surface cellulaire, le FT est présent sous deux formes : encryptée et dé-encryptée. La

forme encryptée est majoritaire, tandis que la forme dé-encryptée correspond à la forme

fonctionnelle (active) du FT. Ces deux formes fixent le FVIIa avec la même affinité, mais seul le

complexe FT dé-encrypté-FVIIa est capable d’initier la coagulation (Le DT 1992). La dé-

encryption est classiquement évaluée en termes d’activité procoagulante du FT (génération du

facteur Xa (FXa) et/ou de la thrombine).

Plusieurs observations suggèrent que les lipides anioniques, particulièrement les

phosphatidylsérines (PS), contribuent à la dé-encryption du FT. En effet, la stimulation du

monocyte par un inducteur puissant de l’externalisation de la PS, l'ionophore calcique, induit une

augmentation de l’activité procoagulante du FT (Wolberg 1999, Henriksson 2007). Cette

implication de la PS dans la dé-encryption du FT est confirmée dans un modèle de bicouche

phospholipidique reconstituée (Morrissey 2008). Selon Hathcock, les PS représenteraient

simplement une surface phospholipidique disponible autour du complexe FT-FVIIa, permettant

aux molécules de FXa de libérer les complexes FT-VIIa pour l'activation d'autres molécules de

facteur X (FX) (Hathcock 2006).

L'autre grande hypothèse permettant d'expliquer la dé-encryption du FT fait appel à la protéine

disulfide isomérase (PDI). Des travaux récents démontrent, in vitro, qu'elle favorise la dé-

encryption et augmente l’activité procoagulante du FT (Ahamed 2006, Chen 2006, Reinhardt

16

2008, Kothari 2010, Versteeg 2007, Persson 2008), et in vivo, qu'elle favorise la formation du

thrombus plaquettaire et l’accumulation de fibrine (Reinhardt 2008, Cho 2008, Furie 2008). Ceci

étant, les théories proposées pour expliquer le mécanisme d’action de la PDI sur la dé-encryption

sont très débattues : 1) activité oxydo-réductrice de la PDI sur le pont disulfure allostérique

Cys186-Cys209, la forme encryptée correspondant aux cystéines réduites, et la forme active aux

cystéines oxydées (Ahamed 2006, Chen 2006, Reinhardt 2008), 2) ou, à l'inverse, absence totale

de corrélation entre les formes oxydées/réduites du pont disulfure Cys186-Cys209 et les formes

cryptées/dé-encryptées du FT; dans cette hypothèse, ce pont disulfure ne jouerait aucun rôle

dans la dé-encryption du FT (Kothari 2010, Wolberg 1999), 3) suggestion d'un rôle de la PDI via

son activité de protéine chaperonne (Versteeg 2007, Persson 2008).

1.3. Induction de l’expression du FT par le monocyte : modèle du LPS

Il a été longtemps tenu pour acquis que le monocyte, en tant que cellule en contact avec

la lumière du vaisseau, n’exprimait pas de FT à l’état basal, l'expression de FT à sa surface étant

obligatoirement inductible, en réponse à des stimuli divers (Rivers 1975, Drake 1989). Ceci est

remis en question très récemment, puisque le monocyte circulant pourrait exprimer

constitutivement de faibles quantités de FT, sous une forme majoritairement encryptée. Ceci ne

remet pas pour autant en question le caractère inductible de l'expression du FT monocytaire

(Osterud 2008, Osterud 2010).

L’induction de l’expression du FT monocytaire par le LPS est le modèle le mieux décrit.

C'est pourquoi nous aborderons la description de l'activation monocytaire sous l'angle de

l'activation par le LPS : le récepteur monocytaire du LPS, les voies de signalisation empruntées

et la transcription du gène codant le FT.

1.3.1. Récepteurs monocytaires du LPS : le CD14

Le LPS est le constituant majeur de la membrane externe de la paroi des bactéries à Gram

négatif. Il est constitué d’un hétéro-polysaccharide hydrophile lié de façon covalente à un

composé hydrophobe, le lipide A (Rietschel 1994). Le LPS se lie à plusieurs récepteurs

monocytaires, au rang desquels la β2 intégrine CD11b/CD18 (Ingalls 1995) et la L-sélectine

(Malhotra 1997).

A une concentration d’endotoxine ne dépassant pas 2.5 µg/ml, l’activation du monocyte

implique la voie du CD14 (Shapira 1994a, Steinemann 1994). La liaison du LPS à la LBP (LPS-

Binding Protein), protéine circulante, induit un changement de conformation du LPS,

indispensable à son interaction avec le CD14 (Schumann 1990). Le CD14 ne possède pas de

17

domaine transmembranaire; il est lié à la surface cellulaire par un groupement GPI (Glycosyl

Phosphatidyl Inositol) (Lee 1993). La transduction du signal implique donc d'autres acteurs.

Le récepteur TLR4 (Toll-Like Receptor 4) joue un rôle essentiel dans l'activation par le

LPS. Ceci est démontré dans un modèle murin, où les macrophages de souris invalidées pour

TLR4 (TLR4-/-) ne sont plus activables par le LPS (Hoshino 1999). TLR4 est un récepteur

comprenant un domaine intracytoplasmique, qui porte un motif TIR (TNR-IL-1R) impliqué dans

la transduction du signal via le recrutement de molécules adaptatrices. Quatre molécules

adaptatrices ont été identifiées : MyD88 (myeloid differentiation factor 88), TIRAP (TIR

domain-containing adapter protein), TRAM (TRIF-related adaptor molecule) et TRIF (TIR-

domain-containing adapter-inducing interferon- beta). Leur rôle dans la signalisation en réponse

au LPS a été démontré dans des modèles de souris invalidées pour chacune de ces molécules

(Yamamoto 2002, Yamamoto 2003a, Yamamoto 2003b).

1.3.2. Voies de signalisation en réponse au LPS

L’activation du monocyte par le LPS induit la phosphorylation rapide de nombreuses

protéines de signalisation, incluant des protéines de la famille src, des protéines tyrosines kinases

(Stefanova I 1993), les protéines kinases C PKCβ et PCKζ (Shapira 1994b, Herrera-Velit 1997,

Kozak 1997), et la protéine hétérotrimérique Gi (Solomon, 1998). L'activation monocytaire par

le LPS implique également la voie NF-Ƙb et les voies des MAPKs (Mitogen Activated Protein

Kinases), qui sont les voies les mieux décrites actuellement.

1.3.2.1. La voie NF-ƘB

L’activation de la voie NF-ƙB par le LPS dans des modèles de monocytes humains ou de

lignées monocytaires est bien connue (Muller 1993). Cependant, la cascade des molécules de

signalisation n'a été élucidée que récemment.

L’activation de la voie NF-ƙB par le récepteur TLR-4 augmente en présence de la

protéine sécrétoire MD-2, laquelle forme un complexe avec le récepteur TLR4 au niveau de la

membrane cellulaire (Shimazu 1999, Akashi 2000).

Selon les molécules adaptatrices recrutées par TLR4, deux voies distinctes de

signalisation sont mises en jeu : la voie MyD88 impliquant TIRAP et MyD88, et la voie TRIF

impliquant TRAM et TRIF. Ces deux voies aboutissent à l’activation du complexe IKK (I-

KappaB Kinase Complex). Le complexe IKK est formé de deux kinases, IKK-α/1 et IKK-β/2,

associées à la protéine régulatrice NEMO (NF-ƙB Essential Modulator) (Essakalli 2009). Dans

18

un modèle cellulaire (lignée THP-1, exprimant constitutivement le FT), l’équipe de Mackman

démontre que la kinase IKK-β est l’enzyme clé de cette voie de signalisation (O’Connell 1998).

IKK-β permet la phosphorylation de IƙBα et la translocation nucléaire du complexe cRel-p65

(Lin 1995, DiDonato 1996) (Figure3).

1.3.2.2. La voie des MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinases)

L’activation par le LPS des trois voies des MAPKs, - la voie ERK (extracellular-signal-

regulated kinase), - la voie JNK/SAPK-1 (Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinase)

et - la voie P38, est bien démontrée dans le monocyte (Guha 2001a). Comme pour la voie NF-

ƙB, la protéine MD-2 est essentielle pour l’activation de la voie des MAPKs via TLR4 (Yang

2000).

L’activation de la voie ERK implique la protéine Ras qui régule en aval la cascade Raf-1, MEK

(MAPK/ERK kinase) 1/2 et ERK1/2 (Reimann 1994, Buscher 1995, Geppert 1994). Suite à

l’activation par le LPS, ERK1/2 induit l’activation des facteurs de transcription c-Fos (Gilley R

2009) et Elk-1 (Guha 2001b).

La voie JNK implique les protéines kinases MEKK1 et MEKK4 (Xia 2000, Abell 2005) et

TAK1 (transforming growth factor-β-activated kinase 1), (Shirakabe 1997) qui activent MKK4

(SEK1, JNKK1) et MKK7 (JNKK2) (Yang 1997, Tournier 1997). Les facteurs de transcription

cibles sont Elk-1 (Gille 1995) et c-Jun (Hambleton 1996).

La voie p38 des MAPKs implique les protéines kinases PKR (protein kinase RNA-regulated) et

TAK1, qui activent MKK6 et MKK3 (Goh 2000, Raingeaud 1996, Moriguchi 1996). Cette voie

active le facteur de transcription Elk-1 (Raingeaud 1996) (Figure 3).

1.3.2.3. La voie AKT

Plusieurs études ont rapporté l’activation de la voie phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-

protein kinase B (Akt) suite à une stimulation du monocyte par le LPS (Guha 2002, Luyendyk

2008, Chaurasia 2010). PI3K catalyse la phosphorylation de PIP2 en PIP3 pour permettre à la

PDK-1 (phosphoinositide-dependent kinase-1) de phosphoryler Akt (Lee 2007, Chaurasia 2010).

Dans le monocyte, la voie Akt semble réguler négativement la signalisation induite par le LPS.

Akt régulerait négativement à la fois la voie des MAPKs et la voie NF-ƙB (Guha 2002). Une

étude plus récente confirme la régulation négative de la voie des MAPKs, mais n'observe pas

l’effet inhibiteur décrit pour NF-ƙB (Luyendyk 2008). Enfin très récemment, les résultats de

19

l'équipe de Chaurasia B montrent que la kinase PDK-1 exerce un rétrocontrôle négatif sur

l’activation de la voie NF-Ƙb (Chaurasia 2010) (Figure 3).

20

Activation

Inhibition

Figure 3. Voies de signalisation dans le monocyte en réponse au LPS

Le LPS se lie à la LBP, change de conformation, et interagit avec le récepteur CD14. CD14 est lié à la

membrane par un groupement GPi (glycosphingoinositol). Flexible dans la membrane, le groupement GPi

permet l'interaction du LPS avec TLR4, récepteur transmembranaire, qui s’associe à MD-2 à la surface

cellulaire. Le domaine intracytoplasmique de TLR4 comprend un motif TIR pour le recrutement de 4

molécules adaptatrices, MyD88, TIRAP, TRAM et TRIF.

TLR-4 induit trois voies de signalisation :1) la voie NF-ƙB, 2) la voie des MAPKs, et 3) la voie Akt. Les 2

premières activent la transcription du gène FT. En revanche, la voie Akt permettrait une régulation négative

des voies NF-ƙB et MAPKs

(Schéma proposé d’après Schumann 1990, Mackman 1991, Lee 1993, Geppert 1994, Reimann 1994, Buscher

1995, Gille 1995, Lin 1995, DiDonato 1996, Hambleton 1996, Raingeaud 1996, Moriguchi 1996, Raingeaud

1996, Oeth 1997, Shirakabe 1997, Yang 1997, Tournier 1997, O’Connell 1998, Shimazu 1999, Akashi 2000,

Yang 2000, Xia 2000, Goh 2000, Guha 2001a, Guha 2001b, Yamamoto 2002, Yamamoto 2003a, Yamamoto

2003b, Guha 2002, Abell 2005, Lee 2007 , Luyendyk 2008, Essakalli 2009, Gilley 2009, Chaurasia, 2010).

21

1.3.3. Régulation transcriptionnelle par le LPS

Le site NF-ƙB du gène FT fixe spécifiquement le complexe hétéro-dimérique c-Rel-p65.

Dans la cellule au repos, c-Rel-p65 se trouve retenu dans le cytoplasme, où il est lié à son

inhibiteur spécifique IƙBα. Seule la dégradation de IƙBα permettra son activation et sa

translocation nucléaire (Lin 1995, DiDonato 1996).

Les facteurs de transcription de la famille Jun (c-Jun) et de la famille Fos (c-Fos) sont

spécifiques des sites AP-1 du promoteur du FT (Oeth 1997). L’équipe de Oeth rapporte que le

monocyte transcrit de façon constitutive c-Fos et c-Jun, et que l’activation du monocyte par le

LPS induit une synthèse de novo de ces facteurs (Oeth 1997). Des études fonctionnelles, dans un

modèle de cellules THP-1 transfectées, montrent que les sites AP-1 et NF-ƘB sont synergiques

pour l’induction de l’expression du FT par le LPS (Mackman 1991).

Le facteur de transcription Elk-1 interagit avec le facteur SRF (Serum response factor)

pour induire l’expression des facteurs Erg-1. L’inhibition de la voie de signalisation de

l’expression du gène ERG-1 inhibe l’induction du FT en réponse au LPS, de manière dose

dépendante (Guha 2001b).

Les facteurs de transcription SP1 interagissent de façon constitutive avec le promoteur du

gène codant pour le FT monocytaire (Hirata 2008). L’inhibition de l’expression de ces facteurs

dans la lignée THP-1 diminue significativement, après stimulation par le LPS, à la fois les taux

d’ARNm et l'activité procoagulante du FT (Hirata 2008). Ceci suggère que l’expression

constitutive des facteurs SP1 est essentielle pour induire l’expression du FT monocytaire.

1.4. Régulation de l’expression du FT monocytaire

1.4.1. Régulation positive

Outre le LPS, plusieurs autres inducteurs de l’expression du FT à la surface du monocyte

sont rapportés dans la littérature.

Les cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine-6 (IL-6), l’interleukine-8 (IL-

8), l’interleukine-1 (IL-1) α, l’IL-1β, et le TNFα sont capables d’induire l’expression du FT par

le monocyte (ARNm et protéine), et d’augmenter l’activité procoagulante dépendant du FT

(Herbert 1992, Osnes 1996, Conkling 1988, Neumann 1997).

Certains composés lipidiques régulent positivement l’expression et l’activité

procoagulante du FT monocytaire. Ainsi, il a été rapporté dans un modèle de PBMC (peripheral

blood mononuclear cell), que l’acide arachidonique augmentait l’expression du FT monocytaire

et son activité procoagulante (Cadroy 1998). L’effet de l’acide arachidonique semble être la

22

résultante des effets des métabolites de la cyclo-oxygénase1 (effet inducteur par le thromboxane

A2 et la prostaglandine G2 et effet inhibiteur par la prostaglandine E2). Dans un modèle de

macrophages dérivant de monocytes, le cholestérol libre (dé-lipoprotéiné) active l’expression du

FT et augmente son activité procoagulante(Lesnik 1992).

L’expression du FT par le monocyte est augmentée par certains effecteurs oxydants. En

effet, Polack rapporte que les espèces oxygénées réactives tels que l’ion superoxyde (O2-) et le

monoxyde d’azote (NO) contribuent à l’induction de l’expression du FT monocytaire en réponse

au LPS (Polack 1997). Il a été rapporté également que le cuivre (Cu2+) induit l’expression du FT

(ARNm et protéine) et augmente d'un facteur 70 l’activité procoagulante de la lignée

monocytaire THP-1 (Crutchley 1995).

Une régulation positive de l’expression du FT par les facteurs de la coagulation, FXa et

thrombine (IIa), est également rapportée dans des modèles monocytaires et/ou endothéliaux

(Akahane 2001, Liu 2004, Jiang 2010). Ce volet sera repris avec plus de détails dans les

paragraphes I.3.2.1 et I.3.2.2.

Les interactions du monocyte avec les autres cellules, particulièrement cellules

endothéliales et plaquettes, favorisent l’expression du FT monocytaire.

Ainsi, il a été démontré, dans des modèles in vitro de co-culture ou de transmigration

monocytes/cellules endothéliales que l’adhésion directe entre ces cellules stimule l’expression du

FT monocytaire (Collins 1995, Lo 1995, McGilvray 2002). L’adhésion monocyte-cellule

endothéliale se fait via les intégrines monocytaires, β2 (CD11/CD18) et β1 (CD42/CD29 et

VLA-4/α4β1), et les ligands endothéliaux correspondants, P-sélectine, E-sélectine, ICAM-1

(Inter-Cellular Adhesion Molecule 1) et VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion molecule-1).

Cependant, l’implication de ces molécules d’adhésion dans l’expression du FT par le monocyte,

en contact avec la cellule endothéliale, semble différente selon le modèle étudié. Selon Collins,

ICAM-1 est responsable de 30% de l’augmentation de l’expression du FT monocytaire (Collins

1995). Cependant, ICAM-1 serait sans effet dans le modèle de Lo (Lo 1995). Cet auteur a testé

également l’implication de VCAM-1, de la β2 intégrine et de la E-sélectine. Toutefois, seule la

E-sélectine semble jouer un rôle (Lo 1995). Dans un modèle de transmigration monocyte/cellule

endothéliale, McGilvray confirme la non implication des β2 intégrines et démontre la

contribution des β1 intégrines dans la régulation positive de l’expression du FT par le monocyte

(McGilvray 2002).

L'interaction directe plaquettes/monocytes augmente également l’expression du FT monocytaire.

Ceci semble se faire via plusieurs types d'interaction : P-sélectine plaquettaire / PSGL-1

monocytaire (P-Selectin Glycoprotein Ligand 1), CD40L plaquettaire / CD40 monocytaire

(Lindmark 2000), intégrine plaquettaire αIIbβ3 / fibronectine monocytaire (Steiner 2003).

23

L’interaction microparticules-monocytes stimule l’expression du FT monocytaire. Cette

interaction semble impliquer le couple ICAM-1/β2-intégrine dans le cas de la microparticule

d’origine endothéliale (Sabatier 2002) et le couple P-sélectine/PSGL-1 dans le cas de la

microparticule d’origine plaquettaire (Scholz 2002).

Des interactions indirectes entre cellules font intervenir des produits de sécrétion cellulaire : le

PDGF (platelet derived growth factor)-BB et le facteur 4 plaquettaire (PF4) pour la plaquette

(Ernofsson 1996a, Engstad 1995), les cytokines pro-inflammatoires pour la cellule endothéliale

et les lymphocytes (Lukacs 1995, Del Prete 1995), et les espèces réactives oxygénées pour le

polynucléaire (Cadroy 2000).

Enfin, l’interaction lymphocyte-monocyte sensibilise le monocyte à la CRP (C-reactive

protein) : en effet, alors que la CRP est sans effet sur les monocytes purifiés, elle devient

inductrice de l’expression du FT par le monocyte dans une population de PBMC (Paffen 2004).

1.4.2. Régulation négative

Les cytokines anti-inflammatoires telles que l’interleukine-4 (IL-4), l’interleukine-13 (IL-

13), l’interleukine-10 (IL-10) et le TGF-β (Transforming growth factor) sont des inhibiteurs de

l’expression et de l’activité procoagulante du FT monocytaire (Osnes 1996, Ernofsson 1996b,

Kamimura 2005, Poitevin 2007, Ernofsson 1996b). Dans certains modèles, l’IL-10 a un effet

inhibiteur nettement supérieur à celui de l’IL-4 et de l’IL-13 (Ernofsson 1996b). L’inhibition de

l’expression du FT monocytaire par cette cytokine sera présentée dans le chapitre IL-10,

paragraphe II.4.2.1.

Les acides gras polyinsaturés, oméga-3 et oméga-6 jouent un rôle protecteur dans

l’athérosclérose et les maladies cardiovasculaires. Ceci pourrait être attribué en partie à leur

capacité à inhiber l’expression du FT monocytaire. Leur rôle inhibiteur de l’expression du FT est

démontré in vitro dans des modèles monocytaires (Chu 1999, Norris 2006). Par ailleurs,

l’administration des acides gras omégas 3 à des patients hyper-triglycéridémiques et à des

contrôles sains pendant 18 à 24 semaines entraine une diminution de l’expression du FT par les

monocytes adhérents (Tremoli 1994). L’effet inhibiteur de ces acides gras pourrait être indirect,

via l’inhibition des cytokines pro-inflammatoires (TNFα, et l’IL-1) (Chu 1999) et de métabolites

lipidiques (thromboxaneA2) (Sanigorski 1994).

Certains antioxydants tels que la vitamine E et les dérivés du probucol (AGI-1067 et

AGI-1095) inhibent l’expression du FT monocytaire (Ferro 1999, Luyendyk 2007). La vitamine

A semble également capable d’inhiber l’expression du FT monocytaire. Aucun effet inhibiteur

n’est directement attribué à cette vitamine. Cependant, il a été rapporté dans un modèle de souris

24

déficientes en vitamine A que l’activité de NF-ƙB, régulateur majeur de l’expression du FT, était

augmentée et que l’activation de NF-ƙB était atténuée par l’addition d’acide rétinoïque, un

métabolite de la vitamine A (Austenaa 2004).

Enfin, parmi les anticoagulants physiologiques de la coagulation, la protéine C activée

(PCa) inhibe l’expression du FT et son activité procoagulante (Toltl 2008). La PCa semble agir

via l’augmentation de la production d’IL-10 (Toltl 2008).

1.5. Fonctions biologiques du FT

1.5.1. Initiation de la coagulation

Le FT joue un rôle clé dans l’initiation de la coagulation. D’une part, il participe à

l’activation du FVII en FVIIa. D’autre part, il agit comme cofacteur dans l’activation des

facteurs X (FX) et IX (FIX) par le FVIIa.

Lorsqu’il n’est pas lié au FT, le FVII se présente dans la circulation sous deux formes : le FVII,

une forme monocaténaire majoritaire non active (zymogène) et des traces de FVIIa, une forme

bicaténaire partiellement activée (zymogène-like). En effet, l’activation du FVII nécessite : 1- le

clivage protéolytique de la liaison Arg152-Ile153 du domaine catalytique du FVII, et 2- la

formation, comme les autres sérines protéases de type trypsine, d’un pont salin entre la nouvelle

extrémité N-terminale Ile153 et le résidu Asp343 du site actif (Ruf 1998, Khan 1998). Cependant,

ce pont salin serait absent dans la forme FVIIa présente dans la circulation.

Le FT est capable de lier les deux formes FVII et FVIIa (Kelley 2004). Cette liaison est de très

haute affinité et se fait avec un rapport stochiométrique 1/1. Par des études de mutagenèse

dirigée et de comparaison de structure du FVIIa libre et du FVIIa présent dans le complexe FT-

FVIIa, il a été démontré que la liaison du FVIIa au FT entraine des changements conformationels

du FVIIa et favorise la formation du pont salin et donc l’activation allostérique complète du

FVIIa (Ruf 1998, Olsen 2007). Le FVIIa, ainsi complètement activé, permettrait la protéolyse de

son zymogène le FVII au sein du complexe FT-FVII (auto-activation) ; cette auto-activation est

dépendante du FT (Waters 2006).

Le FT joue également un rôle de cofacteur pour le facteur FVIIa dans l’activation des

facteurs FX et FIX augmentant considérablement son activité protéolytique vis-à-vis de ses

substrats (Bom 1990a). En effet, le FT permet de stabiliser le site actif du FVIIa

(particulièrement le résidu catalytique Ser344) et de le positionner à une distance d’environ 75

Å de la membrane (Khan 1998, McCallum 1997), position indispensable pour l’activation des

facteurs FX et FIX par le FVIIa (Waters 2006). L’activation du FX et FIX par le FT-FVIIa est

dépendante des ions Ca2+ et des phospholipides (Bom 1990b).

25

Par ailleurs, le FT participe indirectement à l’activation du FVII, les facteurs FXa et FIXa

exerçant une rétro-activation du FVII au sein du complexe FT-FVII (Ndonwi 2005).

Ainsi, par son rôle clé dans l’activation du FVII et la co-activation du FX et FIX, le FT est

considéré comme l’initiateur de la cascade enzymatique de la coagulation aboutissant à la

génération de la thrombine. Cette cascade sera décrite ultérieurement dans le paragraphe

« génération de la thrombine et sa régulation », paragraphe I-3-1.

1.5.2. FT et signalisation

En dehors de son rôle reconnu dans la coagulation, le FT est associé à plusieurs réponses

cellulaires. En effet, le FT peut induire 1- l’activation de la phospholipase C et l’augmentation

des flux calciques intracellulaires (Cunningham 1999), 2- l’activation de certaines tyrosines

kinases (Jak2, Src-kinases) (Versteeg 2000, Versteeg 2004, Ott 2005) et de plusieurs voies de

signalisation : ERK1/2, P38 et JNK MAPKs et Akt, (Cirillo 2004, Ott 2005), 3- l’activation de la

voie des caspases impliquée dans la régulation de l’apoptose (Sorensen 2003, Versteeg 2004), 4-

l’activation de plusieurs facteurs de transcription tels que Erg 1, AP-1, STAT5 (STAT : Signal

Transducer and Activator of Transcription) (Poulsen 1998, Camerer 1999, versteeg 2004), 5-

l’activation de la polymérase A dans les fibroblastes humains (Pendurthi 1997) et 6- l’expression

de gènes impliqués dans plusieurs fonctions cellulaires telles que l’inflammation (IL-6, IL-8,

TNFα) (Muth H, 2005), l’adhésion et la migration cellulaire (VCAM-1), l’angiogenèse, la

croissance des tumeurs et le développement des métastases (VEGF : vascular endothelial growth

factor) (Abe 1999, Belting 2004, Ryden 2010).

Le rôle du FT dans la signalisation est ainsi bien confirmé. Cependant son mécanisme

d’action est très complexe. Le FT agirait par au moins deux voies différentes : 1- une

signalisation dépendante de l’activité catalytique du complexe FT-FVIIa ou FT-FVIIa-FXa, et 2-

une signalisation médiée par son domaine intracytoplasmique.

Plusieurs réponses cellulaires induites par le FT (activation de la voie ERK1/2,

expression des gènes des cytokines, et angiogenèse) sont dépendantes de l’activité catalytique du

FVIIa-FT. Ainsi, l’inhibition du domaine catalytique du FVIIa inhibe ces réponses cellulaires

(Poulsen 1998, Cirillo 2004, Muth 2005, Belting 2004). Cette voie impliquerait l’activation des

récepteurs PAR2 (PAR : protease-activated receptors) par le FVIIa au sein du complexe FT-

FVIIa. Ainsi, dans des lignées de cellules cancéreuses, tous les gènes activés par le complexe

FT- FVIIa sont activés par PAR2 et l’inhibition de PAR2 inhibe la signalisation induite par le

FT-FVIIa (Albrektsen 2007, Hjortobe 2004). PAR2 serait également activé par le complexe

ternaire FT-FVIIa-FXa. L’activation de PAR2 par les complexe FT-FVIIa ou FT-FVIIa-FXa

26

déclenche une signalisation qui pourrait activer en retour la phosphorylation du domaine

intracytoplasmique du FT (Belting 2004, Ahamed 2004). Une étude récente apporte la première

preuve in vivo de l’implication de la voie FT-PAR2 dans la croissance des tumeurs et démontre

la phosphorylation du FT induite par PAR2 (Ryden 2010).

Le deuxième mécanisme d’action du FT serait la voie initiée par le domaine

intracytoplasmique du FT (Ott 2005). L’implication du domaine intracytoplasmique dans la

régulation de la signalisation semble dépendante de sa phosphorylation. Ainsi, Sen démontre, par

une méthode spectroscopique, que la phosphorylation de la Ser258 favorise une conformation

structurale particulière du domaine intracytoplasmique (formation d’une hélice II de polyproline

entre les résidus Ser258, Pro259 et Leu260) (Sen 2009). La phosphorylation du domaine

intracytoplasmique inhibe la production de VEGF et l’expression de VCAM-1, aboutissant à

l’inhibition de l’angiogenèse et de la croissance tumorale (Abe 1999, Belting 2004, Li 2008).

Ces observations sont expliquées, selon l’équipe de Ruf, par une régulation négative exercée par

le domaine intracytoplasmique du FT, contrôlant la signalisation induite par la protéase PAR2

(Belting 2004).

En conclusion, la cascade suivante peut être proposée: 1- les complexes FT-FVIIa ou FT-

FVIIa-FXa activent PAR2, 2- parmi les voies de signalisation déclenchées par PAR2, il y a celle

activant la PKCα, 3- la PKCα active la phosphorylation de la Ser253, 4- la Ser253 active la

phosphorylation de la Ser258, 5- le domaine intracytoplasmique phosphorylé régule

négativement la signalisation induite par PAR-2 ou 6-déclenche une autre voie indépendante de

PAR2 (Figure 4).

27

Figure 4. Implication du FT dans la signalisation

Les complexes FT-FVIIa ou FT-FVIIa-FXa activent le récepteur PAR2 ( ). Parmi les voies initiées

par PAR2, il y a celle activant la PKC α ( ). La PKCα active la phosphorylation de la Ser253 ( ). La

Ser253 active la phosphorylation de la Ser258 ( ). Le domaine intracytoplasmique phosphorylé régule

négativement la signalisation induite par PAR2 ( ) ou déclencherait une autre voie de signalisation

indépendante de PAR2 ( ) (Schéma proposé d’après; Hjortobe 2004, Belting, 2004, Ahamed 2004, Ott

2005, Rao 2005, Albrektsen 2007, Sen 2009, Ryden 2010 )

2. LA GENERATION DES MICROPARTICULES

2.1. Les microparticules : définition générale

Les microparticules (MPs), également appelées ectosomes, sont des vésicules anucléées

qui naissent d’un remaniement de la membrane plasmique cellulaire. Selon leur définition

actuelle, ces vésicules partagent 3 caractéristiques communes. Elles sont : 1- isolées par

ultracentrifugation à partir du plasma pauvre en plaquettes, 2- ont une taille comprise entre 0.1 et

1 µm, et 3- sont positives au marquage par l’annexine V témoignant ainsi de la présence de

phosphatidylsérine à leur surface (Shet 2008, Burnier 2009). Cependant, cette définition pose

problème. En effet, il existe une certaine confusion dans la littérature, puisque certains auteurs

incluent les exosomes dans la définition de la MP alors que les exosomes sont des vésicules

endogènes expulsées par exocytose et qu’ils ont une taille inférieure à 0.1 µm (Burnier 2009).

Certains auteurs également incluent les corps apoptotiques dans la définition alors que les corps

1

2 3

4

5

6

28

apoptotiques correspondent à des événements cellulaires plus tardifs, qu’ils sont de plus grande

taille et qu’ils comportent des fragments d’ADN. Un deuxième niveau de complexité concerne

cette fois les méthodes d’évaluation des MPs puisque 1- il existe une variabilité pré-analytique

entre équipes (type d’anticoagulant pour le prélèvement, durée et vitesse de l’ultracentrifugation,

congélation ou non) (Jy 2004, Shah 2008), 2- depuis quelques années certains auteurs rapportent

la notion de microparticules ne fixant pas l’annexine V (Shet 2003, Boulanger 2006,

Bernimoulin 2009), et 3- l’analyse des MPs par cytométrie en flux pose la question de la limite

de sensibilité des cytomètres utilisés. En effet, la comparaison des performances d’un cytomètre

classique par rapport à un cytomètre de nouvelle génération fait apparaître les limites de

sensibilité de certains instruments, ce qui aboutit clairement à une sous-estimation de la

numération des MPs (Burnier 2009). L’ensemble de ces problématiques a conduit à la création

d’un sous-comité de standardisation international spécifique, en marge de l’ISTH (The

International Society on Thrombosis and Haemostasis) (www.

Isth.org/default/assets/file/SSCMinutes/2010_minutes.pd f) (Lacroix 2010).

2.2. Processus général de la microvésiculation

Les MPs peuvent provenir de plusieurs types cellulaires tels que plaquettes, monocytes,

cellules endothéliales, érythrocytes et lymphocytes. La formation des MPs, définie sur la base

des études in vitro, est un processus commun à toutes les cellules. Ceci est la conséquence du

remaniement de la membrane cellulaire suite à l’activation de la cellule ou à l’induction de son

apoptose. Quel que soit le mécanisme de la microvésiculation, activation cellulaire ou apoptose,

le remaniement membranaire à l’origine des MPs est toujours la résultante de 1- la perte de

l’asymétrie de la membrane plasmique par externalisation des PS, et de 2- la rupture du

cytosquelette.

2.2.1. Perte de l’asymétrie de la membrane plasmique

Au repos, la membrane plasmique de la cellule est asymétrique en terme de composition

et distribution des phospholipides entre les feuillets externe et interne de la bicouche

phospholipidique. En effet, les phosphatidylcholines (PC) et les sphingomyelines (SM) sont

localisées dans le feuillet externe, alors que les phosphatidylsérines (PS) et les

phosphatidyléthanolamines (PE) sont séquestrées au niveau du feuillet interne. Cette asymétrie

est un processus dynamique, assuré par 3 enzymes : 1- une aminophospholipide translocase (la

flippase), spécifique du transport des PS et PE du feuillet externe vers le feuillet interne de la

29

membrane, 2- une floppase, assurant le transport spécifique inverse, et 3- une scramblase,

permettant un transport aspécifique bidirectionnel. Au repos, l’activité de la flippase est

prédominante, alors qu’à l’inverse, floppase et scramblase sont inactives (Daleke 2003) (Figure

5).

L’induction de l’activation de la cellule ou de son apoptose entraîne une augmentation de

la concentration cytosolique du Calcium (Ca2+) faisant suite à : 1- un relargage du Ca2+ stocké

dans le réticulum endoplasmique et 2- un influx massif de calcium d’origine extracellulaire.

Cette augmentation de la concentration du calcium cytosolique inhibe la flippase d’une part,

active la floppase et la scramblase d’autre part. L’asymétrie phospholipidique est ainsi

désorganisée avec un afflux de PS au niveau du feuillet externe de la membrane (Bratton 1997,

Rizzuto 2003, Azevedo 2007) (Figure 5).

Récemment, il est démontré dans un modèle de plaquettes murines, qu’au cours de

l’apoptose, l’externalisation des PS est également dépendante des caspases et de deux molécules

pro-apoptotiques de la famille Bcl-2 (ß-cell lymphoma leukemia-2) : Bak et Bax (Schoenwaelder

2009) (Figure 5).

2.2.2. Rupture du cytosquelette

Dans la cellule activée ou en apoptose, l’augmentation de la concentration du Ca2+

cytoplasmique entraine l’activation d’une protéase dépendante du calcium, la calpaine. Cette

dernière est à l’origine de la désintégration des liaisons entre les filaments d’actine et les

glycoprotéines membranaires conduisant à la rupture du cytosquelette (Azevedo 2007) (Figure 5).

Dans la cellule en apoptose, la rupture du cytosquelette est également dépendante de la

voie des caspases. La voie la mieux décrite est celle de la caspase 3. La caspase 3 est une caspase

exécutrice, activée soit par la caspase 8 (FLICE (FADD-like IL-1ß converting enzyme), soit par

la caspase 9 (au sein du complexe multiprotéique apoptosome). FLICE est une caspase initiatrice

de la voie extrinsèque impliquant les récepteurs membranaires de la mort cellulaire (tels que Fas

ou TNFR) ; la caspase 9 est une caspase initiatrice de la voie intrinsèque mitochondriale

impliquant le relargage du cytochrome C. Ceci étant, une interaction entre les deux voies existe

puisque la caspase 8 peut activer Bax dont l’oligomérisation avec Bak est à l’origine de la

désintégration de la membrane mitochondriale, du relargage du cytochrome C et de la formation

de l’apoptosome. Activée par la caspase 8 ou la caspase 9, la caspase 3 induit la phosphorylation

de la kinase MLCK (myosin light chain kinase) par la protéine kinase ROCKI. MLCK

phosphoryle les chaines légères des myosines, stimulant ainsi l’activité contractile des myosines

et créant une tension au niveau de la membrane plasmique aboutissant à la rupture du

30

cytosquelette (Chang 2006, Ndozangue-Touriguine 2008). D’autres données ont montré

l’implication de la voie de la caspase 2 dans la microvésiculation (Sapet 2006). La caspase 2 est

une caspase initiatrice de la voie mitochondriale. Elle semble agir via l’activation de ROCKII

(Sapet 2006) dont le mécanisme d’action le plus probable, mais non encore déterminé, est

l’activation de MLCK et la rupture du cytosquelette (Figure 5).

2.2.3. Caractéristiques générales des MPs

La surcharge en PS au niveau du feuillet externe de la membrane plasmique et la rupture

du cytosquelette sont à l’origine du remaniement de la membrane plasmique et de la formation

des MPs.

Les MPs ainsi formées sont riches en PS. Elles expriment par ailleurs à leur surface plusieurs

marqueurs antigéniques provenant des cellules d’origine (Tableau I). Cet « héritage » en

antigènes de surface permet l’identification des MPs, identification classiquement réalisée par

cytométrie en flux ou par techniques ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Les MPs

peuvent également hériter de fragments de cytosquelette, de protéines contractiles (Gasser 2003,

Bernimoulin 2009) et d’ARNm (Baj-krzyworzeka 2006) (Figure 5). Les MPs ne semblent pas

contenir d’ADN, alors que le mécanisme d’apoptose s’accompagne d’une fragmentation d’ADN.

Tableau I. Marqueurs de surface permettant l’identification de l’origine cellulaire des MPs

Origine cellulaire

de la MP

Marqueurs de surface

Plaquette

CD61 (GPIIbIIIa); CD41a (GPIIb) ; CD42a (GPIX); CD42b (GPIbα); CD62P (P-

sélectine) ; CD40L (CD154)

Erythrocyte

CD235a (Glycophorine A)

Cellule endothéliale

CD144 ; CD146 ; CD62E (E-sélectine) ; CD34; CD51; CD54 (ICAM-1); CD105;

CD106 (VCAM-1)

Leukocytes

CD45

Neutrophile

CD66e

Lymphocytes

CD4 ; CD8 ; CD20

Monocyte

CD14 (d’après Abid Hussein 2003, Nomura 2003, Jy 2004, Jimenez 2004, Shet 2004, Diagnat George 2004, Freyssinet 2005, Leroyer 2007, Poitevin 2007, Gelderman 2008, Burnier 2009).

31

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2.3. Données actuelles concernant la microparticule monocytaire

2.3.1. Régulation de la microvésiculation monocytaire

L’inducteur le plus souvent décrit pour induire la microvésiculation monocytaire in vitro

est le LPS (Satta 1994, del Conde 2005, Bernimoulin 2009, Poitevin 2007). Certains auteurs ont

également utilisé l’ionophore calcique (Cerri 2006, Aharon 2008, del Conde 2005).

Des agents plus physiologiques sont également décrits, tels que la P-sélectine

(Bernimoulin 2009), la PCa, le TNFα (Pérez-Casal 2005), l’ATP (adénosine triphosphate)

(MacKenzie 2001), et le FasL (Fas-ligand) (Essayagh 2007).

Le PMA, le collagène et la thrombine sont des inducteurs très utilisés dans l’induction de

la microvésiculation plaquettaire ou endothéliale mais aucune donnée, selon nos connaissances,

n’est rapportée dans le cas du monocyte.

2.3.2. Les caractéristiques de la microparticule monocytaire

Les MPs monocytaires se forment à partir de structures particulières de la membrane

plasmique dites « radeaux lipidiques» ou « rafts » (regroupement dynamique préférentiel des

sphingolipides et du cholestérol permettant le transport latéral des protéines) et la perturbation de

l’organisation de ces « rafts » par déplétion en cholestérol diminue la formation des MPs (del

Conde 2005).

La MP monocytaire est identifiée par la présence à sa surface du marqueur antigénique

CD14 monocytaire. Les marqueurs CD18, CD11a, CD45, CD81, et PSGL-1 sont également

décrits à la surface de la MP monocytaire (del Conde 2005, Bernimoulin 2009). Leur expression

ne semble pas être dépendante de l’inducteur utilisé, comme démontré en protéomique pour des

MPs induites par le LPS ou par la P-sélectine (Bernimoulin 2009). Cependant, dans ce même

travail, la composition en protéines totales de la MP monocytaire est différente sur le plan

quantitatif et fonctionnel selon l’inducteur utilisé (LPS versus P-sélectine). En effet, un nombre

supérieur de protéines (830) est observé dans le cas du LPS, versus 331 protéines pour la P-

sélectine. De plus, les protéines identifiées dans le cas d’une activation par le LPS sont des

protéines mitochondriales, des protéines nucléaires et des protéines impliquées dans le

métabolisme cellulaire, alors que les protéines identifiées en réponse à la P-sélectine sont des

protéines de la membrane plasmique, des protéines impliquées dans la transduction du signal ou

dans la communication inter-cellulaire (Bernimoulin 2009).

33

Enfin, la MP monocytaire exprime du FT à sa surface (Poitevin 2007, del Conde 2005,

Bernimoulin 2009) avec une densité supérieure à celle du monocyte d’origine (del Conde 2005).

2.3.3. Fonctions biologiques de la microparticule monocytaire

Les MPs, indépendamment de leurs origines cellulaires, ont été longtemps considérées

comme de la « poussière » cellulaire, dépourvues de fonctions biologiques propres. Ces MPs

constituent en réalité des effecteurs cellulaires capables de moduler de nombreuses fonctions

biologiques procoagulantes/prothrombotiques et inflammatoires/immunologiques.

2.3.3.1. Rôle procoagulant/prothrombotique des MPs monocytaires

Les MPs monocytaires sont des surfaces procoagulantes via 1- l’expression du FT,

initiateur principal de la coagulation, 2- l’expression membranaire des PS, qui favorisent

l’assemblage des complexes enzymatiques de la coagulation, augmentent l’activité protéolytique

du complexe FT-FVIIa, et favorisent la dé-encryption du FT. Ces MPs sont ainsi capables

d’initier la génération de thrombine dépendante du FT (Poitevin 2007).

In vitro, les MPs monocytaires modifient le phénotype fonctionnel endothélial. En effet,

en co-culture avec des cellules endothéliales, les MPs monocytaires entraînent : 1-

l’externalisation des PS à la surface de la membrane plasmique endothéliale (Aharon 2008), 2-

l’expression du facteur von Willebrand par les cellules endothéliales, permettant l’adhésion

plaquettaire sur la paroi vasculaire (GPIb/facteur von Willbrand) (Essayagh 2007), 3-

l’expression du FT endothélial, 4- l’inhibition de l’expression du TFPI (tissue factor pathway

inhibitor) et de la thrombomoduline (Essayagh 2007, Aharon 2008), 5- l’apoptose de la cellule

endothéliale (Aharon 2008). Ainsi, d’un phénotype protecteur en terme de thrombogénicité,

l’endothélium acquiert un phénotype procoagulant/prothrombotique.

Un autre type d’interaction concerne MPs monocytaires et plaquettes. In vitro, les MPs

monocytaires sont capables d’interagir et de fusionner avec les plaquettes activées. Cette

interaction implique la P-sélectine de la plaquette et le PSGL-1 de la microparticule

monocytaire (del Conde 2005). La fusion des membranes cellulaires permet le transfert du FT de

la MP monocytaire à la plaquette (del Conde 2005). Ceci est confirmé dans un modèle murin où

il est par ailleurs démontré que l’accumulation du FT au cours de la formation du thrombus

artériel est dépendante de l’interaction P-sélectine/PSGL-1 (Falati 2003).

34

Enfin, les MPs présentes dans la plaque d’athérome sont majoritairement d’origine

monocytaire. Ces MPs sont responsables de la quasi-totalité de la thrombogénicité de cette

plaque (Mallat 1999a, Leroyer 2007).

2.3.3.2. Rôle inflammatoire et immunologique

Les MPs monocytaires peuvent jouer un rôle direct dans la réaction inflammatoire ; en

effet les MPs issues de cellules THP-1 activées par l’ATP contiennent de l’IL-1 qu’elles peuvent

relarguer (MacKenzie 2001).

L’interaction de la MP monocytaire avec la cellule endothéliale induit une production

endothéliale d’espèces oxygénées réactives, particulièrement l’anion superoxyde (Essayagh

2007). Les espèces oxygénées réactives sont classiquement considérées comme marqueurs de

l’inflammation.

L’interaction des MPs monocytaires avec des cellules endothéliales ou des fibroblastes

entraîne la production par ces cellules de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et IL-8), de

chémokines (MCP-1 et MCP-2 ; MCP : monocyte chemotactic protein) (Mesri 1999, Distler JH,

2005) et de métalloprotéinases matricielles (MMP-1, MMP-3 et MMP-9) (Distler 2005).

Enfin, les MPs, par la forte présence des PS à leur surface, permettent aux macrophages

la reconnaissance et la phagocytose des monocytes sénescents dans la circulation (Fadok 2000,

Fadok 2001).

3. GENERATION DE LA THROMBINE ET SA REGULATION

3.1 Activation enzymatique de la génération de thrombine et sa régulation

physiologique

Deux voies aboutissant à la génération de la thrombine sont traditionnellement décrites.

La voie extrinsèque, initiée par le FT et la voie intrinsèque, initiée par le contact entre le facteur

XII (FXII), la prékallikeine, le kininogène de haut poids moléculaire et les surfaces

électronégatives. Les deux voies correspondent à des cascades de réactions enzymatiques

convergeant vers l’activation du facteur X en FXa, lequel active la prothrombine (II) en

thrombine (IIa).

La coagulation in vivo n’est plus actuellement décrite en terme de voies, mais plutôt

comme une succession de phases (phase d’initiation, phase d’amplification et phase d’inhibition)

dont l’initiateur majeur est le FT (Hoffman 2003) (figure 6).

35

Au cours de la phase d’initiation, le FT porté par la surface cellulaire est mis en contact

avec les facteurs de coagulation circulants. Le FT active le FX en FXa et le FIX en FIXa via le

complexe FT-FVIIa (Bom 1990a). L’activation du FX est plus importante que celle du FIX car

le complexe FT-FVIIa est plus affin pour le FX que pour le FIX. Le FXa active le facteur V

(FV) en facteur Va (FVa) (Monkovic 1990). Des protéases non impliquées dans la coagulation,

exprimées à la surface monocytaire (élastase, cathepsine G), activent également le FV (Allen

1995). Le FVa forme avec le FXa le complexe prothrombinase à l’origine de la génération des

premières molécules de thrombine (Figure 6a).

Ces premières traces de thrombine sont à l’origine de l’amplification de sa propre

génération. La thrombine active le facteur VIII (FVIII) en facteur VIIIa (FVIIIa) et le FV en FVa

(Camire 2009). Le FVIIIa et le FVa vont permettre d’accroître considérablement la génération de

la thrombine en tant que cofacteurs respectifs des complexes ténase (Panteleev 2004) et

prothrombinase (Tracy 1983). La thrombine active également le FXI en FXIa (Wu 2008), qui

active à son tour le facteur FIX en FIXa (Agah 2009). Le FIXa active le FX. La thrombine assure

ainsi sa rétro-activation par cette boucle d’amplification (Figure 6b).

La régulation physiologique de la génération de thrombine fait intervenir plusieurs

inhibiteurs. Le TFPI, en formant le complexe quaternaire TFPI/TF/VIIa/Xa, limite l’activité du

complexe FT-FVIIa et ainsi la génération du FXa et de la thrombine (Lindhout 1996). L’activité

anticoagulante du TFPI est augmentée par la protéine S (Hackeng 2006). La protéine C, activée

par le complexe thrombine-thrombomoduline, se lie à la protéine S et protéolyse le FVa et le

FVIIIa (Suzuki 1983 ; Khrenov 2006). L’antithrombine (AT) est le principal inhibiteur de la

coagulation puisqu'elle inhibe l'ensemble des sérines protéases (Holmer 1981) (Figure 6c).

36

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9).

37

La vitesse de génération de thrombine, la quantité de thrombine formée et la durée de sa

présence sous forme active dans le sang, sont des paramètres importants. Une génération de

thrombine ralentie ou diminuée favorise le saignement, alors qu’une génération excessive

déplace l’équilibre de l’hémostase vers un état d’hypercoagulabilité. L’étude de la cinétique

intégrale de la génération de la thrombine est actuellement possible par le test in vitro de

génération de thrombine développé par le Pr Hemker (Hemker 2000, Hemker 2002).

3.2. Les serines protéases clés, le facteur Xa et la thrombine

3.2.1. Le facteur Xa

Le FX est une sérine protéase vitamine K-dépendante. La forme active FXa est obtenue

après clivage unique en Arg194/Ile195 du zymogène FX, et est associé à la libération d’un

peptide d’activation (52 aa) (Venkateswarlu 2002). La protéine FXa a une structure bicaténaire

formée de deux chaines, une chaine légère et une chaine lourde, liées par un unique pont

disulfure. La partie N-terminale de la chaine légère forme le domaine « Gla, » (gamma-

carboxyglutamyl) impliqué dans l’ancrage membranaire du FXa. Le domaine « Gla » est suivi

par deux domaines riches en Cystéines, EGFN et EGFC (EGF : epidermal growth factor). La

chaine lourde possède le domaine catalytique constitué de 254 aa dont la triade His263, Asp282,

et Ser379 formant le site actif du FXa (Venkateswarlu 2002) (figure 7). Le domaine catalytique

présente également des sites d’interaction avec le FVa. Il s’agit des résidus Arg165 et Lys169,

situés au niveau de l’hélice α 164-170. Les résidus Arg165 et Lys169 forment avec Arg240,

Lys236, Lys96, Arg93 et Arg125, l’exosite II du FXa, important pour la fixation du FVa et de la

prothrombine, et également pour la fixation du complexe AT-héparine. Le sodium (Na+) est un

régulateur allostérique de l’activité catalytique et de la spécificité du FXa. Les sites de fixation

pour le sodium sont situés à proximité du site catalytique et des sites d’interaction avec le FVa

(Levigne 2007) (Figure 7). Calcium et PS sont des régulateurs positifs de l’activité catalytique du

FXa. Les ions Ca2+ se fixent au niveau du domaine « Gla » du FXa, et au niveau du domaine

catalytique (avec une forte affinité) et au niveau du domaine EGF (avec une faible affinité)

(Persson 1993, Srivastava 2002, Levigne 2007). Le site de fixation du calcium au niveau du

domaine catalytique forme l’exosite I (figure 7). Trois sites de fixation pour les PS sont

identifiés par Srivastava A, dans un modèle utilisant la chaine légère de la phosphatidylsérine, la

C6PS (1,2-dicaproyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine). Le premier site est situé au niveau du

domaine « Gla ». Ce site ne fixe la C6PS qu’en l’absence du Ca2+. Le second se situe dans les

domaines EGFs et requière à la fois la présence des ions Ca2+ et la fixation du domaine « Gla »

38

sur la structure phospholipidique. Le troisième site de fixation pour les PS est situé dans le

domaine catalytique et dépendant également du Ca2+ (Koppaka 1996, Srivastava 2002).

Figure 7. Structure du FXa

Le domaine « Gla » et les deux domaines EGFN et EGFC forment la chaine légère. La chaine lourde

correspond au domaine catalytique, qui comprend 1- le site actif (His 236, Asp 282, et Ser 379), 2- l’hélice

164-170 (sites d’interaction avec le FVa), 3- l’exosite I ( site de fixation pour le Ca2+), et 4- le site de fixation

pour le Na+. (L’emplacement des résidus formant l’exosite II n’est pas précisé sur cette figure) (D’après

Levigne 2007, Chattopadhyay 2009).

Le FXa joue un rôle procoagulant central en tant qu’activateur de la prothrombine en

thrombine. Le FXa, au sein du complexe prothrombinase, protéolyse d'abord la liaison Thr283-

Arg234, libérant le fragment 1 + 2 (F1+2) de la prothrombine, et la préthrombine. La

préthrombine est ensuite clivée par le FXa entre l'Ile321 et l'Arg322, aboutissant à la forme active

de la thrombine (Krishnaswamy 1987).

Le FXa active, également, par protéolyse, les récepteurs PARs : le FXa soluble active

PAR1 et PAR2 et le FXa du complexe FT-FVIIa-FXa active PAR2 (Borensztajn 2008). Les

voies de signalisation médiées par les récepteurs PARs impliquent les voies PKC, NF-ƙB et des

Site catalytique

Hélice 164-170

Ca2+ (exosite I)

Na+

COOH NH2 Domaine catalytique DA Gla EGFN EGFC

39

MAPKs (Hezi-Yamit 2005, Borensztajn 2008). Il est par ailleurs démontré que le FXa active,

premièrement l’expression du FT à la surface cellulaire (Akahane 2001, Hezi-Yamit 2005, Jiang

2010), 2- la prolifération et la différentiation cellulaire (Borensztajn, 2008; Blanc-Brude 2005),

3- la production de chémokines (MCP-1) et de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-8, TGFβ)

(Borensztajn 2008, Busch 2005, Daubie 2006), 4- l’expression de molécules d’adhésion telles

que la E-sélectine, ICAM-1 et VCAM-1(Senden 1998), 5- l’adhésion des leucocytes aux cellules

endothéliales (Senden 1998) (figure 9).

3.2.2. La thrombine

Produit de l’activation de la prothrombine par le FXa, la thrombine se présente comme

une sérine protéase formée d'une chaîne légère, la chaîne A de 36 aa et d'une chaîne lourde, la

chaîne B de 258 aa. La thrombine présente une forte homologie de structure avec les autres

protéases à sérine (Bode 2005). Son site actif est formé par la triade Ser205, His57 et Asp99. Les

données de la cristallographie montrent que cette triade est située dans une vallée profonde.

L’accès aux substrats est limité par deux boucles d’insertion, les boucles γ 149 et 60. La boucle γ

60 porte un motif hydrophobe qui participe à la sélection des substrats et au positionnement des

liaisons à cliver. La distribution des charges à la surface de la molécule de thrombine montre

deux régions fortement chargées positivement. Il s’agit des deux exosites I et II, impliqués dans

la reconnaissance des substrats Le premier correspond à l'exosite de fixation du fibrinogène et le

second est le site de liaison aux héparines (krishnaswamy 2005, Bock 2007, Crawley 2007)

(figure 8). La thrombine comporte un domaine chémotactique correspondant à la boucle Tyr47-

Pro48-Pro49-Trp50 et un peptide RGD (Arg197-Gly198-Asp199) participant à la reconnaissance

de la plaquette par la thrombine. Elle comporte également un site de liaison au sodium (Page

2005). La fixation du sodium modifie l’activité allostérique de la thrombine en favorisant l’accès

de certains substrats (fibrinogène, FV, FVIII et récepteurs PAR).

40

Figure 8. Structure de la thrombine

Le site actif de la thrombine (Ser205, His57 et Asp99) est situé dans une vallée profonde. Les deux boucles

149 et 60 contrôlent l’accès aux substrats. Les deux exosites I et II sont impliqués dans la reconnaissance des

substrats : l’exosite I reconnait le fibrinogène et l’exosite II les héparines (d’après Crawley 2007).

La thrombine joue un rôle central dans l’hémostase. Elle amplifie sa propre génération

par l’activation des cofacteurs d'activation (FV et FVIII) et du facteur FXI. La thrombine induit

la transformation, par protéolyse, du fibrinogène en monomères de fibrine (Mosesson 2005).

Elle active les plaquettes via les récepteurs PARs et la glycoprotéine V (Ramakrishnan 2001

Coughlin 2005). Par l’activation du facteur XIII (FXIII), la thrombine participe à la stabilisation

de la fibrine et ainsi du thrombus plaquettaire. Au sein du complexe thrombine-

thrombomoduline, la thrombine active le TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor)

(Nesheim 2003) favorisant ainsi la stabilisation du thrombus. La thrombine stimule l’expression

du FT à la surface cellulaire (Liu 2004). Ceci est majoré en présence du TNFα. La thrombine

possède également des propriétés anticoagulantes. Elle se lie à la thrombomoduline et active la

protéine C en PCa (Figure 9).

La thrombine joue un rôle inflammatoire via l’activation des récepteurs PARs. Elle

augmente la production de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, l’IL-1, l’IL-12), mais également

anti-inflammatoires (IL-10) (Naldini 2002, Naldini 2005) (Figure 9).

Enfin, la thrombine stimule la prolifération cellulaire (Tarzami 2006, Jiang 2010),

l’expression de molécules d’adhésion (ICAM-1 et VCAM-1), et l’adhésion des leucocytes aux

cellules endothéliales (Kaplanski 1998, Vergnolle 2002) (Figure 9).

Site actif

Boucle 60

Boucle 149

Exosite I Exosite II

(fibrinogène) (Héparine)

41

Figure 9. Rôles biologiques du FXa et de la thrombine

Le FXa est un facteur central dans la coagulation via l’activation de la prothrombine en thrombine. Le FXa

active également la signalisation cellulaire via les récepteurs PARs (PAR1 et PAR2). Le FXa active : 1-

l’expression du FT, 2-), 2- la prolifération et la différentiation cellulaire, 3- la production de chémokines

(MCP-1) et de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-8, TGFβ), 4- l’expression des molécules d’adhésion (E-

sélectine, ICAM-1 et VCAM-1), et 5- l’adhésion des leucocytes aux cellules endothéliales.

La thrombine joue un rôle central dans l’hémostase. Elle amplifie sa propre génération par l’activation des

cofacteurs d'activation (FV et FVIII) et du facteur FXI. Elle induit la transformation du fibrinogène en

monomères de fibrine. Elle active les plaquettes. La thrombine participe à la stabilisation de la fibrine par

l’activation du FXIII. Elle active également le TAFI et inhibe la fibrinolyse. La thrombine stimule l’expression

du FT à la surface cellulaire. Elle possède également des propriétés anticoagulantes. Elle se lie à la

thrombomoduline et active la protéine C en PCa. La thrombine active les récepteurs PARs et augmente la

production de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, l’IL-1, l’IL-12), et anti-inflammatoires (IL-10). Enfin, la

thrombine est à l’origine de la prolifération cellulaire, de l’expression de molécules d’adhésion (ICAM-1 et

VCAM-1), et de l’adhésion des leucocytes aux cellules endothéliales. (Schéma proposé d’après Senden 1998,

Kaplanski 1998, Akahane 2001, Ramakrishnan 2001, Naldini 2000, Vergnolle 2002, Nesheim 2003, Liu 2004,

Jiang 2010, Hezi-Yamit 2005, Naldini 2005, Blanc-Brude 2005, Busch 2005, Mosesson 2005, Coughlin 2005,

Tarzami 2006, Daubie 2006, Borensztajn 2008).

42

3.3. Inhibition pharmacologique de la génération de thrombine

Les facteurs de la coagulation concernés par cette classe d’anticoagulants sont la

thrombine et le FXa. L’inhibition de la thrombine et du FXa peut se faire soit directement

(interaction directe entre anticoagulant et site actif de la molécule), soit indirectement

(impliquant l'AT).

L’héparine non fractionnée (HNF) et les héparines de bas poids moléculaire (HBPM)

sont des inhibiteurs des facteurs IIa et FXa. Le fondaparinux en revanche est spécifique du FXa.

3.3.1. Les héparines : HNF et HBPM

Une héparine est un polysaccharide sulfaté appartenant à la famille des

glycosaminoglycanes. Il s’agit d’un enchainement d’une unité disaccharidique de base formée

par une molécule d’acide pyranosyluronique (acide uronique) et d’une molécule de 2-amino-2-

déoxyglucopyranose (une glucosamine) liées par une liaison 1-4. Cet enchainement est

interrompu par un motif pentasaccharidique irrégulier responsable de la liaison à l’AT.

L’HNF est un mélange hétérogène de chaines polysaccharidiques d’héparine d’origine

animale (poumons de bœuf, intestin de porc). Le poids moléculaire de l’HNF varie entre 4000 et

30 000 daltons (15 000 daltons en moyenne). La variabilité de la composition chimique des

polysaccharides (degré de sulfatation, présence du motif pentasaccharidique) et du degré de

polymérisation conditionne l’activité anticoagulante et les propriétés pharmacocinétiques d’une

héparine (Hirsh 2004, Hejl 2008).

Les HBPM sont obtenues par dépolymérisation chimique ou enzymatique des HNF. Il

s’agit, comme l’HNF, d’un mélange hétérogène de polysaccharides. Leur taille est plus courte

avec des chaînes dont le poids moléculaire varie entre 2000 et 12 000 daltons (5000 daltons en

moyenne) (Hirsh 2004, Hejl 2008).

Les héparines, HNF et HBPM, inhibent indirectement le FXa et le facteur IIa en

catalysant leur neutralisation par l’AT. En effet, la liaison héparine-AT provoque un changement

de conformation de l’AT multipliant par 300 à 1000 la cinétique d’inhibition de l’AT (Hirsh

2004, Hejl 2008). Pour inhiber le FXa, seul le pentasaccharide est nécessaire alors que

l’inhibition de la thrombine nécessite des chaines longues d’héparine, formées d’au moins 18

saccharides (incluant le motif pentasaccharidique) (Bray 1989). Comparés aux HNF, les HBPM

comprennent beaucoup moins de chaînes longues. Un tiers des chaînes formant l’HNF possèdent

le motif pentasaccharidique versus un quart pour l’HBPM. Ceci explique que le rapport anti-

Xa/anti-IIa soit de 1 pour les HNF, et compris entre 2 et 4 pour les HBPM (Hirsh 2004, Hejl

43

2008). Les HNF interagissent fortement avec les cellules sanguines circulantes et avec les

cellules endothéliales. Les HBPM interagissent moins avec le compartiment cellulaire, ce qui

expliquerait leur meilleure biodisponibilité (Hirsh 2004).

3.3.2. Le fondaparinux

Le fondaparinux est un pentasaccharide obtenu par synthèse chimique. Sa structure est

limitée au motif pentasaccharidique des héparines (Figure 10). Il a un poids moléculaire de 1728

daltons. Sa structure lui confère l’absence d’interaction avec la thrombine et par conséquent une

spécificité d’inhibition pour le FXa. La liaison du fondaparinux à l’AT augmente par un facteur

300 la cinétique d’inhibition de l’AT pour le FXa (Hejl 2008). Cette liaison est réversible et

implique les résidus Arg46, Arg47, Lys114, Lys125 et Arg129 de l’AT (Figure 10). Le

fondaparinux est libéré dès la fixation de l’AT sur le FXa. Le fondaparinux libéré est intact et

peut catalyser la liaison de nouvelles molécules d’AT avec le FXa (Johnson 2006).

44

Figure 10. Interactions fondaparinux-AT

a. L’hélice A de l’AT est en vert et l’hélice D en bleu. Les atomes carbones du fondaparinux sont présentés en

gris, les oxygènes en rouge et les soufres en jaune. Les traits pleins et les traits en pointillé figurent les

interactions entre fondaparinux et AT.

b. Les interactions entre fondaparinux et AT sont assurées par des liens salins (traits continus), et par

des liaisons hydrogènes (traits discontinus) (d’après Johnson 2006).

a

b

45

II. L’INTERLEUKINE -10

1. LE GENE DE L’IL-10

1.1. Structure du gène de l’IL-10

Le locus du gène de l’IL-10 humain est situé sur le chromosome 1 entre les positions

1p31 et 1p32 (Kim 1992). Sa séquence, formée de 4892 pb, est déposée dans GenBank sous le

numéro d’accession NC_000001. Elle est constituée de 5 exons séparés par 4 introns (figure 9).

Le premier exon (225 pb) code pour le peptide signal et l’hélice A de la protéine IL-10, le

deuxième (60 pb) pour la boucle AB et l’hélice B, le troisième (153 pb) pour les hélices C et D,

le quatrième (66 pb) pour la boucle DE et le cinquième (1125 pb) pour l’hélice E, l’hélice F et la

partie COOH terminale.

Sur une longueur d’environ 200 Kb, plusieurs gènes entourent le gène de l’IL-10 : les gènes

codant l’interleukine-20 (IL-20), l’interleukine-19 (IL-19) et l’interleukine-24 (IL-24) en amont,

et les gènes codant Mapkapk2 (mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2) et

Dyrk3 (dual-specificity tyrosine-regulated kinase-3) en aval. Ce regroupement de gènes, décrit

dans un modèle murin, forme l’IL-10 gene cluster (Mosser 2008). La transcription du gène de

l’IL-10 se fait dans un sens opposé à celui de la transcription de ces gènes adjacents (Figure 11).

1.2. Structure du promoteur du gène de l’IL-10

Le promoteur du gène de l’IL-10 est décrit chez l’homme pour la première fois en 1995

par Kube D et al (Kube 1995). Cette séquence promotrice est déposée dans GenBank sous le

numéro d’accession X78437. Elle correspond à la séquence allant du site d’initiation de la

transcription, jusqu’à la position -4082. Au niveau de cette séquence, la position +1 est attribuée

au premier codon ATG et la position -57 au site d’initiation de la transcription (57 pb en amont

du premier ATG). La TATA box est située en position -88/-91 et la CCAAT box en -223/-237

(Figure 11).

Par cartographie du gène de l’IL-10, Eskdale et al ont identifié 74 sites potentiels de fixation de

facteurs de transcription dans cette région promotrice (Eskdale 1997) (figure 11).

Le promoteur du gène de l’IL-10 est très polymorphe. La majorité des polymorphismes

génétiques identifiés sont des polymorphismes de substitution d’un seul nucleotide ou SNPs

(single nucleotide polymorphisms). Un polymorphisme d’une insertion/délétion de trois paires de

46

bases et deux polymorphismes de répétition de CA sont également identifiés (Eskdale 1997

D'Alfonso 2000, Kube 2001a).

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47

1.2.1. Sites de fixation des facteurs de transcription

Les facteurs de transcription jouant un rôle dans la transcription de l’IL-10 appartiennent

à 8 familles différentes: Sp1, STAT, C/EBP (CCAAT-enhancer-binding proteins), IRF

(interferon regulatory factor 1), AP-1, CREB (cAMP response element-binding), c-Maf (c-avian

musculoaponeurotic fibrosarcoma), et Pbx1 (pre-B-cell leukemia homeobox 1) et NF-ƙB.

La localisation des sites de fixation de ces facteurs de transcription est présentée en se référant à

Eskdale J et Mosser DM (revue) (Eskdale 1997, Mosser 2008) (Figure 11). Deux sites potentiels

de fixation des facteurs de transcription de la famille Sp1 sont identifiés. Le premier est situé en

position -171/-183 et le second en -631/-636. Les sites potentiels de fixation des facteurs de la

famille STAT sont au nombre de 4, localisés respectivement en -134/-154, -720/-740, -1939/-

1959 et -3608/-3628. La séquence consensus de fixation de ces facteurs est 5’-TTCCNGGAA-3’

(N peut être A, G, C ou T). Les facteurs de transcription de la famille C/EBP se lient à leur

séquence consensus (ATTGCGCAAT) sous forme d’homo- ou d’hétéro-dimères. Un seul site de

fixation de ces facteurs de transcription est identifié chez l’homme. Il est localisé en position -

439/-452. Un seul site de fixation des facteurs de transcription de la famille IRF est identifié chez

l’homme, il correspond à la séquence 5’-AATTGAAA-3’, localisée en position -201/-215.

Comme pour les facteurs de la famille C/EBP et ceux de la famille IRF, les facteurs de

transcription de la famille AP-1 ont un seul site de fixation au niveau du promoteur du gène de

l’IL-10 humain. Il correspond à la séquence 5’-TGACTCA-3’ et est localisé en position -1000/-

1006. Les facteurs de transcription de la famille CREB se lient à la séquence consensus -5’-

TGAGC/CGTCA-3’. Quatre sites potentiels de fixation de ces facteurs sont identifiés. Ils sont

localisés respectivement en -1265/-1271 (CRE1), -1048/-1055 (CRE2), -855/-862 (CRE3), et -

404/-411 (CRE4). Deux sites potentiels de fixation des facteurs c-Maf sont identifiés en

positions -200/-233 et -512/-491. La séquence consensus correspondante aux facteurs de

transcription de cette famille (c-Maf) est 5’-TGC(TGAG/CTCA)GCA-3’ ou 5’-

TGC(TGAGC/CGTCA)GCA-3’. Un seul site de fixation de Pbx1 (5’-TTGATTGTGT-3’) est

identifié en position -155/-163 du promoteur du gène de l’IL-10. Enfin, les sites de fixation de

NF-ƙB sont au nombre de 11. Ils sont localisés respectivement en position -100/-110, -464/-474,

-915/-925, -1278/-1288, -1993/-2003, -2071/-2081, -3305/-3315, -3657/-3647, -3726/-3716, et -

3950/-3940. La séquence consensus correspondant aux facteurs de transcription de cette famille

(NF-ƘB) est 5’-GGGA/GA/CTTC/TCC-3’.

48

1.2.2. Polymorphismes génétiques

Seuls trois polymorphismes SNPs parmi l’ensemble de ceux rapportés dans la littérature

et les deux polymorphismes de répétition de CA seront abordés dans ce travail.

1.2.2.1. Les SNPs

Les trois polymorphismes de substitution correspondent à : 1- une substitution de A par G

dans la séquence AAGGCTTCTTTGGGAA/GGGGGAAGTAGGGATA, 2- une substitution de

C par T au sein de la séquence GTACAGGTGATGTAAC/TATCTCTGCCTCAG, 3- une

substitution de C par A dans la séquence TGTGACCCCGCCTGTC/ACTGTAGGAAGCCAGT.

Trois nomenclatures différentes sont actuellement disponibles pour la dénomination de

ces polymorphismes : la nomenclature de Turner DM (Turner 1997), la nomenclature officielle

(http://snp500cancer.nci.nih.gov) et la plus récente, la nomenclature internationale

(http://www.hgvs.org/).

Ces différentes nomenclatures créent actuellement dans la littérature une certaine

confusion. C’est pourquoi nous nous proposons de les expliciter.

La première des nomenclatures est proposée par Turner DM. Il attribue aux trois SNPs

les positions suivantes : -1082 pour la substitution G/A, -819 pour C/T et -592 pour C/A. La

deuxième nomenclature, ou nomenclature officielle, positionne les polymorphismes à partir du

premier nucléotide situé immédiatement en amont du codon ATG. Ces polymorphismes sont

ainsi positionnés en -1116 pour la substitution G/A, -853 pour C/T et -626 pour C/A. Enfin, la

toute récente nomenclature internationale attribue à ces polymorphismes une localisation

moléculaire sur le chromosome à partir du centromère. Selon cette nomenclature, les trois

polymorphismes sont référencés rs 1800896 pour la substitution G/A, rs 1800871 pour C/T, et

rs1800872 pour C/A (Figure 12).

Dans la suite de ce travail, nous désignerons les trois SNPs selon la nomenclature de

Turner, actuellement la plus utilisée.

49

Figure 12. Nomenclature des polymorphismes de substitution d’un nucléotide

a. Nomenclature de Turner (la plus ancienne)

b. Nomenclature officielle : localisation des 3 SNPs à partir du premier nucléotide situé immédiatement en

amont du codon initiateur de la traduction.

c. Nomenclature internationale (la plus récente): localisation moléculaire des 3 SNPs à partir du centromère.

Les deux polymorphismes de répétition de CA sont également présentés sur cette figure (figure 12b). Ils sont

situés respectivement en position -1150/-1193 et - 4009/-4034.

50

1.2.2.2. Les polymorphismes de répétition

Les deux polymorphismes de répétition de CA sont situés respectivement en position -

1150/-1193 et – 4009/-4034 à partir du premier nucléotide situé immédiatement en amont du

codon ATG d’initiation de la traduction (Figure 12b). Deux nomenclatures sont décrites pour les

polymorphismes de répétition : la nomenclature d’Eskdale et la nomenclature internationale.

La nomenclature de Eskdale donne aux allèles du premier polymorphisme (en -1.1 Kb)

une dénomination en G (allant de G1 à G16) et aux allèles du second polymorphisme (en -4 Kb)

une dénomination en R (allant de R0 à R4). Eskdale nomme l’allèle le plus fréquent du premier

polymorphisme G9 et l’allèle le plus fréquent du second polymorphisme R2. Il leurs attribue

respectivement : 1- un nombre de répétition de CA égal à 22 et 15 en se référant à la séquence

X78837 publiée dans Genbank, 2- une taille de 140 pb et 114 pb après analyse de taille sur gel

de polyacrylamide

La nomenclature internationale référence le premier polymorphisme (situé en -1.1Kb) par

X7843.2 : g.8134 et le second (situé en -4 Kb) par X7843.2 : g.5325. Avec cette nomenclature,

seul le nombre de répétition de CA définit les allèles de chacun de ces deux polymorphismes

(Tableau II).

Dans la suite de ce travail, nous désignerons les deux polymorphismes de répétition selon

la nomenclature la plus usitée dans la littérature, c'est-à-dire celle de Eskdale.

51

Tableau II. Nomenclature des polymorphismes de répétition de CA, IL-10G et IL-10R

Nomenclature de Eskdale

(Eskdale, 1995, 1996) Nomenclature internationale

(http://www.hgvs.org)

Allèle Nombre de CA Taille (pb) Allèle G1 G1 14 124 X78437.2:g.8134CA 14

G2 15 126 - 15 G3 16 128 - 16 G4 17 130 - 17 G5 18 132 - 18 G6 19 134 - 19 G7 20 136 - 20 G8 21 138 - 21 G9 22 140 - 22 G10 23 142 - 23 G11 24 144 - 24 G12 25 146 - 25 G13 26 148 - 26 G14 27 150 - 27 G15 28 152 - 28 G16 29 154 - 29 R0 11 -

X78437.2:g.5325CA 11

R1 13 - - 12 R2 15 114 - 13 R3 17 116 - 14 R4 19 118 - 15

1.2.2.3. La distribution allélique des SNPs et des microsatellites

Les fréquences alléliques des 5 polymorphismes (-1082 G/A, -819 C/T, -592 C/A, IL-

10G et IL-10R) semblent être liées à l’origine ethnique puisque ces fréquences varient dans les

populations témoins étudiées dans la littérature (Tableau III). En effet, la fréquence de l’allèle -

1082 G est voisine de 50% dans la plupart des populations étudiées, population africaine noire,

population africaine du Maghreb, population allemande et population australienne. Elle est égale

à 36 % dans la population italienne et à seulement 6% dans la population chinoise. Elle est en

revanche de 61% dans la population turque. Les fréquences des allèles -819C et -592C sont

voisines de 70% dans la majorité des populations étudiées. Dans la population chinoise en

revanche, la fréquence allélique de l’allèle -592C est de seulement 33%.

Concernant les polymorphismes de répétition, les allèles IL-10G9 du polymorphisme IL-

10G et IL-10R2 du polymorphisme IL-10R sont les plus fréquents dans toutes les populations

étudiées. En revanche, les fréquences alléliques rapportées pour ces allèles sont très variables. En

effet, la fréquence de l’allèle l’IL-10G9 est de 80% dans la population italienne mais seulement

voisine de 30% dans la population française, dans la population suédoise ou encore dans la

52

population gabonaise. Enfin, la fréquence allélique de l’allèle IL-10R2 est de 88% dans la

population gabonaise, 56% dans la population écossaise, mais seulement de 35% dans la

population Italienne.

53

Tableau III. Distribution allélique des trois SNPs -1082G>A, -819C>T et -592 C>A et des deux

microsatellites IL-10G et IL-10R selon l’ethnie

Fréquences alléliques (%) Polymorphismes Polymorphismes

de substitution de répétition

Références

Ethnie de la

population témoin (effectif)

-1082

G

-819

C

-592

C

G9 G10 G11

R2 R3 R4

Eskdale 1995 Caucasiens écossais (102)

50,5 6,8 9,8

Eskdale 1996

Caucasiens écossais ( 92)

56,4 40,4 3,2

Eskdale 1998a

Noirs américains d’Atlanta (38)

72,3 23,7 0,0

Mok 1998

Chinois (166)

6,0 33,0

Edwards-Smith 1999

Caucasiens australiens

( ?)

51,0 79,0 79,0

D’Alfonso 2000

Caucasiens italiens (164)

36,0 64,0 80,0 18,0 0,9 35,0 6,0 8,0

Kube 2001b Kube 2003

Caucasiens allemand (218)

49,0 74,0 69,0 23,7 0,0 69,0 28,0 3,0

Zhou 2002 Caucasiens suédois (109)

29,0 11,0 9,0

MacKay 2003 Africains de l’Afrique du sud

(73)

77,0 15,0

Kube 2001b Kube 2003

Africains du Gabon (102)

48,0 62,0 29,0 22,0 26,0 88,0 9,0 2,0

Cochery-Nouvellon

2006

Caucasiens Français (100)

31,0 9,0 13,0 75,0 23,0 0,2

Zammiti 2006 Caucasiens Tunisien (200)

46,0 76,0 77,0

Mohebbati-kaljahi 2009

Turques (116)

61,6 69,0 69,0

54

2. LA PROTEINE IL-10

2.1. Structure de la protéine

L’IL-10 est une protéine homodimérique, non covalente, de 37 kDa. Chacun des deux

monomères de cette protéine forme un polypeptide de 160 aa issu d’un précurseur de 178 aa

contenant une séquence signal de 18 aa. La cristallographie a permis de décrire une structure en

6 hélices α pour chaque monomère, nommées de A à F pour le premier monomère et de A’ à F’

pour le second. Les hélices A et B (A’ et B’) et les hélices D et E (D’ et E’) sont reliées par des

boucles. Les hélices A, C et D (A’, C’, D’) sont reliées par deux ponts disulfures entre les

Cys62-Cys114 et les Cys12-Cys108. La structure de l’IL-10 montre une interpénétration étroite

entre les deux monomères. En effet, les 2 hélices α situées en position C-terminale d’un

monomère pénètrent, par une rotation de 180°, au milieu des 4 hélices α N-terminales du

deuxième monomère. Les deux monomères acquièrent ainsi une conformation en V. Chacun des

bras de cette conformation est ainsi formé de 4 hélices α originaires d’un monomère et 2 hélices

α originaires de l’autre monomère. (Zdanov 1996, Zdanov 2004) (Figure 13, Figure 14a). La

conformation en V ne nécessite pas de ponts disulfures entre les deux brins. Deux liens

polypeptidiques lient les deux brins de cette conformation en V lui conférant une certaine

flexibilité. Un seul site potentiel de N-glycosylation est décrit au niveau de la structure de l’IL-

10 humaine (Windsor 1993).

Une homologie allant de 20% (IL-19) à 28% (IL-20) existe entre l’IL-10 et les cytokines

humaines membres de la famille des cytokines apparentées à l’IL-10 (IL-19, IL-20, IL-22, IL-24,

IL-26). Une forte homologie existe entre l’IL-10 humaine et les cytokines virales (78% avec

Herpes virus papio ; 83% avec Epstein-Barr virus) ou des espèces animales (71% avec la souris,

74% avec le rat et 96% avec le singe) (Fickenscher 2002).

55

Figure 13. Structure en ruban de l’interleukine-10

Le premier monomère formé de 6 hélices α (A, B, C, D et E) est présenté en rouge

Le second est en vert et est constitué de 6 hélices α dénommées A’, B’, C’, D’ et E’

Les ponts disulfures sont représentés en jaune; deux ponts disulfures par monomère (Cys12-Cys108 et Cys62-

Cys114)

Les deux monomères sont étroitement interpénétrés : les 2 hélices α, E et F (ou E’ et F’), situées en position C-

terminale d’un monomère, pénètrent par une rotation de 180° au milieu des 4 hélices α N-terminales (A, B, C

et D) ou (A’, B’, C’ et D’) du deuxième monomère (d’après Zdanov 1996).

2.2. Induction de l’expression de l’IL-10

L’IL-10 est produite par de nombreux types cellulaires parmi lesquels ont été identifiés

les lymphocytes Th1, Th2, Th17 (Th : T-helper), les lymphocytes B, les mastocytes, les

polynucléaires éosinophiles, les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (Ma

2001, Ziegler-Heitbrock 2003, Brenner 2003, Okamoto 2003, Jack 2005, Cao 2005, Kremer

2007, Stumhofer 2007, Mosser 2008, Saraiva 2009). Cette cytokine est produite également par

certaines cellules pathologiques telles que les tricholeucocytes, les cellules de Hodgkin, les

cellules de Sezary et les cellules de mélanome (Vega 2004, Dummer 1996, Sato 1996).

Quel que soit le type de cellule, l’expression de l’IL-10 est induite en réponse à un

stimulus. Les inducteurs de l’IL-10 les plus décrits dans la littérature sont le LPS, les cytokines

pro-inflammatoires (IL-6, IL-2, TNFα, IL-27), les catécholamines, et la thrombine (Tableau IV).

56

2.2.1. Récepteurs, voies de signalisation, et facteurs de transcription

Différents récepteurs sont impliqués dans la production de l’IL-10 dont TLR4, CD28,

AILIM/ICOS (Activation-inducible lymphocyte immunomediatory molecule/inducible co-

stimulator), les récepteurs béta2 adrénergiques, CD36, TCR (T cell receptor) et PAR1 (Tableau

IV). L’implication de ces récepteurs dans la production de l’IL-10 semble être dépendante du

stimulus utilisé et du type cellulaire. En effet certaines associations, stimulus-récepteur ou

récepteur-cellule, sont associées à l’induction de l’expression de l’IL-10, telles que les couples

LPS-TLR4, catécholamines-récepteurs β2 adrénergiques, IL-2-CD28, thrombine-PAR-1, et

TCR-cellule T (Tableau IV).

Les voies de signalisation impliquées dans la production de l’IL-10 sont principalement

les trois voies des MAPK (P38, ERK et JNK) et la voie AKT. Ces voies (MAPKs et AKT) sont

décrites dans différents types et lignées cellulaires de monocytes, de macrophages ou de cellules

T. Elles sont activées suite à une stimulation cellulaire par le LPS et par les cytokines (IL-2, IL-

12, IL-4). La voie des caspases est également rapportée ; en effet, elle est décrite dans un modèle

de co-culture de cellules T avec des lignées leucémiques (Tableau IV).

L’activation d’un grand nombre de facteurs de transcription est associée à l’induction de

l’expression de l’IL-10. Les principaux facteurs décrits sont : 1- SP1 et Sp3 de la famille SP1, 2-

STAT1, STAT3, STAT4 et STAT6 de la famille STAT, 3- IRF1 de la famille IRF, 4- c-Maf de la

famille c-Maf, 5- CREB et TAF de la famille CREB, 6- C/EBP α, C/EBP β de la famille C/EBP,

et 7- Pbx1 de la famille Pbx1 (Tableau IV). L’implication des facteurs de transcription NF-ƙB

est controversée (Tableau IV). La multiplicité de ces facteurs de transcription a fait évoquer

dans la littérature la notion de spécificité cellulaire des facteurs de transcription impliqués dans

la régulation de l’expression de l’IL-10 (Saraiva 2010). Cependant, la non exhaustivité des

études ne permet pas de conclusions formelles. En revanche, la spécificité liée au type de

stimulus est bien démontrée. En effet, Ziegler-Heitbrock rapporte que l’activation des cellules B

de la lignée RPMI 8226.1 par l’IFNα implique les facteurs de transcription STAT3 et IRF1, alors

que seul STAT3 est activé en réponse au LPS (Ziegler-Heitbrock 2003). De plus, dans leurs

études respectives, Stumhofer et Saraiva démontrent une activation différente des facteurs

STATs en fonction de la cytokine inductrice (Stumhofer 2007, Saraiva 2009). Enfin, l’activation

des facteurs de transcription CREB et C/EBP est associée à l’activation de la voie de l’AMPc

(Tableau IV).

57

Tableau IV. Principaux récepteurs, voies de signalisation, et facteurs de transcription impliqués

dans la régulation de l’expression de l’IL-10

Inducteurs

Modèles cellulaires

Récepteurs

Voies de

signalisation

Facteurs

de transcription

Références

LPS

PBMC Cellules gliales

Astrocytes humains

TLR4 -

- Levy 2009 Jack 2005

Cellule B: lig. 8226.1 Mono: lig. Mac 6

- - STAT3 * IRF 1

Ziegler-Heitbrock 2003 Benkhart 2000

Mϕ humains alvéolaires - p38; JNK; ERK1/2

Sp1 Chanteux 2007

Mϕ de mono humains - * NF-ƙB Bondeson 1999

Mono humains - - c-Maf (+) Cao 2005

IL-2 Lymphocytes T humains

CD28 ; AILIM/ICOS

AKT ; P38 -

Okamoto 2003

IFNα Cellule B: lig. 8226.1

- STAT3 IRF 1

Ziegler-Heitbrock 2003

IL-27 Cellules Th1 et Th2 murines

- - STAT1 STAT3

Stumhofer 2007

IL-6 Cellules Th1 et Th2 murines

- - STAT3 * STAT1

Stumhofer 2007

IL-12

Cellules Th1 humaines

-

ERK1/2

STAT4 * STAT6

Saraiva 2009

IL-4 Cellules Th2 humaines - ERK1/2 STAT6 *STAT4

Saraiva 2009

SDF-1α Cellules T humines CD4+ ; CD8+

TCR ERK1/2 AP-1 Kremer 2007

Catécholamines Mono : lig. THP1 β2 adrénergique AMPc CREB ; ATF Platzer 2000

Mono lig. THP1 HL-60

β2 adrénergique AMPc C/EBP α et β Brenner 2003

gAcrp Mϕ lig. RAW 264.7 - ERK1/2 ; PKA CREB (+) Park 2008

Co-culture avec cellules T en

apoptose

Mϕ de mono humains CD36 - Pbx1/Prep-1 Chung 2007

Co-culture avec lig. U-373MG

U-118MG

Cellules T sanguins: Lig. T Jurkat et Molt-4

Fas

Caspases 8, 3 et 9

- Yang 2003

Thrombine PBMC Mono lig. U937 ; Mac-6

PAR-1 -

- Naldini 2005

LPS + Adénosine

Mϕ : lig. RAW 264.7 A2B

-

-

Nemeth 2005

PMA Ionomycine

Mϕ : lig. RAW 264.7 - - Sp1 ; Sp3 Tone 2000

dsRNA Mϕ : lig. RAW 264.7 PKR ; JNK ; NF-ƙB

NF-Ƙb Chakrabarti 2008

LPS Mϕ de mono humains NF-ƙB non impliquée

Bondeson 1999

Mϕ : macrophages ; Lig. :lignée ; * facteurs testés mais ne jouent pas un rôle la transcription ; SDF-1, stromal cell-derived factor-1 ;TCR : T cell receptor ; gAcrp : Globular adiponectin ; PKA: protéine kinase dépendante de l’AMPc ; A2B : récepteur à Adénosine ; ds RNA : double-stranded RNA ; PKR : protéine kinase R.

58

Les modèles cellulaires utilisés pour identifier le rôle régulateur (trans-activateur ou

trans-inhibiteur) de ces facteurs de transcription sont très variables et rendent le schéma de la

régulation transcriptionelle du gène de l’IL-10 complexe (Tableau IV). Le rôle régulateur des

facteurs de transcription de la famille Sp1 (Sp1 et Sp3) est un exemple de cette complexité. En

effet, les données actuelles rapportent : 1- l’existence de deux sites de fixation des facteurs de la

famille Sp1 chez l’homme (en position -171/-183 et /-631/-636), 2- un seul site de fixation de ces

facteurs chez la souris en position -146/-162. Ce site possède la même séquence AGGAGG que

le site -183 chez l’homme, 3- les facteurs de transcription Sp1 et Sp3 se lient avec une même

affinité au site -146/-162 (chez la souris) et régulent positivement la transcription du gène de

l’IL-10, 4- les facteurs de transcription Sp1 et Sp3 se lient avec une même affinité au site -631/-

636 (chez l’homme) et régulent négativement la transcription du gène de l’IL-10 (Tone 2000,

Steinke 2004, Hagen 1994).

2.2.2. Expression de l’IL-10 et polymorphismes génétiques

Des modèles de transfection cellulaire ont démontré que des polymorphismes génétiques

de substitution d’un seul nucléotide ou de répétition sont capables de moduler l’activité de

facteurs de transcription et l’activité de promoteurs. En effet, LeVan TD a démontré qu’une

substitution de C par T du polymorphisme -159C/T du promoteur du gène du CD14 diminue

l’affinité des facteurs de la famille Sp1 à leur site de fixation situé à proximité de ce

polymorphisme (LeVan 2001). De son coté, Okladnova O démontre que l’augmentation du

nombre de répétitions au niveau du polymorphisme de répétition (CA)m(GA)n situé à 1Kb en

amont du site d’initiation de la transcription du promoteur du gène CD14 augmente l’activité

transcriptionelle de ce promoteur (Okladnova 1998).

Au niveau du promoteur du gène de l’IL-10, les SNPs -1082G/A, -819C/T, -592C/A et

les deux polymorphismes de répétition IL-10G et IL-10R sont situés respectivement à proximité

d’un certain nombre de sites de fixation de facteurs de transcription (Figure 12b).

Par ailleurs, des associations entre polymorphismes génétiques et taux de production d’IL-10

sont rapportées. Ces associations sont définies par la mise en culture de PBMC de génotype

connu, par la mise en culture de sang total d’individus de profils génétiques connus, ou par

l’étude de la corrélation entre taux sériques d’IL-10 et profils génétiques d’individus sains ou

malades. Ainsi, les génotypes -1082 GG (versus GA et AA) et -592 CC (versus C/A et AA) sont

associés à des taux élevés d’IL-10 (George 2004, Wu 2010, Claudino 2008, Malarstig 2008).

L’haplotype ATA (-1082A, -819T, -592A) est associé à un taux faible d’IL-10, alors que les

haplotypes ACC et GCC à des taux moyens et élevés (Edwards-Smith 1999, Turner 1997, Hee

59

2007, Kilpinen 2002). L’allèle G9 est associé à un taux élevé d’IL-10. Enfin, l’allèle R3 du

polymorphisme IL-10R est associé à un taux faible d’IL-10 en comparaison à l’IL-10R2

(Eskdale 1998b, Anaya 2002).

3. LE RECEPTEUR DE L’IL-10

Le récepteur de l’IL-10 est exprimé constitutivement par un grand nombre de cellules,

dont le monocyte et la cellule endothéliale. L’expression du récepteur de l’IL-10 est également

inductible (Crepaldi 2001, Gleissner 2007).

3.1. Structure du récepteur de l’IL-10

Le récepteur de l’IL-10 est formé de deux types de chaînes : IL-10R1 (récepteur de haute

affinité) et IL-10R2 (récepteur de basse affinité). Chacune des deux chaînes possède 3

domaines : un domaine extracellulaire de 200 aa, un domaine transmembranaire de 20 aa et un

domaine intracytoplasmique de 322 aa pour l’IL-10R1 et de 62 aa pour l’IL-10R2. Le domaine

extracellulaire de chacune des deux chaînes IL-10R1 et IL-10R2 est organisé en deux domaines :

un domaine N terminal (D1) et un domaine C terminal (D2) formant un angle de 90° (forme en

L). Chacun des deux domaines D1 et D2 est formé de 7 brins β organisés en deux feuillets β

antiparallèles (Pletnev 2005). La chaine IL-10R1 comporte 6 sites potentiels de N-glycosylation,

alors que la chaine IL-10R2 seulement 4. Les ponts disulfures sont au nombre de 2 par chaine :

Cys54-Cys62 et Cys181-Cys202 pour l’IL-10R1 et Cys54-Cys35 et Cys181-Cys202 pour l’IL-

10R2) (Pletnev 2005) (Figure 14b).

La cristallographie du récepteur de l’IL-10 a montré que celui-ci est formé de deux

chaînes IL-10R1 et de deux chaînes IL-10R2 et que ces quatre chaînes interagissent entre elles,

en présence, et également en l’absence de leur ligand (Pletnev 2005) (Figure 14a). Les deux

domaines C terminaux de l’IL-10R1 et de l’IL-10R2 sont complémentaires. La surface de

contact entre ces deux domaines implique 15 aa de l’IL-10R1 et 13 aa de l’IL-10R2 et est limitée

par deux clusters hydrophobes (Figure 14b).

La liaison de l’IL-10 à son récepteur se fait en deux étapes. Au cours de la première

étape, l’IL-10 se lie symétriquement aux deux chaînes IL-10R1 (récepteur de haute affinité).

Cette première interaction crée la formation de sites de coopération entre le complexe IL-10/IL-

10R1/IL-10R2 (Josephson 2001, Pletnev 2005) (Figure 14a). L’interaction entre un brin de la

protéine IL-10 et une chaine IL-10R1 se fait entre 27 aa de la protéine IL-10 et 23 aa du

récepteur IL-10R1. La surface d’interaction s’étale sur 1058 Å2 et est limitée de part et d’autre

par deux clusters hydrophobes (Figure 14b). L’interaction entre un brin de la protéine IL-10 et

60

une chaine IL-10R2 se fait entre 13 aa de la protéine IL-10 et 13 aa du récepteur IL-10R1. La

surface d’interaction est de seulement 568 Å2 et est limitée de part et d’autre par deux clusters

hydrophobes (Figure 14b).

Figure 14. Structure du récepteur de l’interleukine-10 lorsqu’il est lié à son ligand (IL-10)

a. Structure générale du complexe ternaire IL-10/IL-10R1/IL-10R2

b. Interfaces entre IL-10/IL-10R1, IL-10/IL-10R2, et IL-10R1/IL-10R2.

La protéine IL-10 sous sa conformation en V est présentée en orange et bleu : en orange sont les domaines A,

B, C, et D du premier brin et A’, B’, C’, et D’ du second brin et en bleu sont les domaines E’ et F’ du premier

brin et E et F du second.

Les récepteurs IL-10R1et IL-10R2 sont en vert et en rose respectivement. Leurs sites potentiels de N-

glycosylation sont en rouge.

Les ponts disulfures sont représentés en jaune : 1- Cys12-Cys108 et Cys62-Cys114 au niveau du monomère de

l’IL-10, 2- Cys59-Cys65 et Cys181-Cys202 au niveau de la chaîne IL-10R1, et Cys59-Cys35 et Cys181-

Cys202 au niveau de la chaîne IL-10R2.

En bleu sont les clusters hydrophobes 1a et 2a limitant l’interface IL-10-IL-10R1, les clusters hydrophobes 1b

et 2b limitant l’interface IL-10-IL-10R2 et les clusters hydrophobes 1c et 2c, limitant l’interface IL-10R1-

IL10R2 (d’après Pletnev 2005).

a b

N

N

C C

C C

N

N

61

3.1. Signalisation induite par l’IL-10

La voie de signalisation la mieux décrite suite à l’activation du récepteur de l’IL-10 est la

voie JAK/STAT (Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription) (Figure 15).

L’interaction de l’IL-10 avec son récepteur active les tyrosines kinases Jak1 et Tyk2 (Tyrosin

kinase 2) liées de façon constitutive aux chaînes IL-10R1 et IL-10R2 respectivement (Finbloom

1995, Ho 1995, Usacheva 2002). L’activation de ces deux tyrosines se fait par cross-

phosphorylation de deux résidus tyrosines du domaine intracellulaire de la chaine IL-10R1,

Tyr446 et Tyr 496 (Weber-Nordt 1996). Ces deux tyrosines phosphorylées permettent au

récepteur de l’IL-10 de recruter et de phosphoryler les facteurs de transcription STAT3. La

phosphorylation des facteurs STAT-3 est suivie par leur homo-dimérisation et leur dissociation

du récepteur (Riley 1999, Chusid 2010). Par ailleurs, des facteurs STAT1, STAT3 et STAT5

sont activés par Jak1 et Tyk2 (Wehinger 1996). Ces facteurs forment des homo- ou hétéro-

dimères. Les dimères STATs migrent vers le noyau pour réguler la transcription des gènes qui en

dépendent, dont ceux codant les cytokines pro-inflammatoires (Figure 15).

L’IL-10 active également la voie JAK/IL-10E1 (Janus Kinase/interleukin 10 enhancer 1).

En effet, il a été décrit avec une lignée issue d’un cancer de prostate que les tyrosines kinases

Jak1 et Tyk2 du récepteur IL-10R1 assurent la phosphorylation du facteur de transcription IL-

10E1 et sa translocation vers le noyau. IL-10E1 régule positivement la transcription des gènes

qui en dépendent dont celui codant les inhibiteurs des métalloprotéinases (wang 2003, Stearns

2003).

L’IL-10 est capable d’assurer le rétrocontrôle négatif de la signalisation qu’elle induit via

l’activation de la transcription de SOCS1 (suppressor of cytokine signaling-1). SOCS1 bloque le

site actif des kinases Jak1 et Tyk2 et les empêche de phosphoryler leurs cibles (Ding 2003)

(Figure 15).

62

Figure 15. Voies de signalisation induites par la liaison de l’IL-10 à son récepteur

L’interaction de l’IL-10 avec son récepteur active les tyrosines kinases Jak1 et Tyk2 liées aux chaînes

IL-10R1 et IL-10R2 respectivement L’activation de Jak1 et Tyk2 se fait par cross-phosphorylation des Tyr446

et Tyr496 du récepteur IL-10R1. Phosphorylées, Tyr446 et Tyr496 permettent de phosphoryler les facteurs de

transcription STAT3. Les protéines STAT-3 forment des homo-dimères et se dissocient du récepteur. Jak1 et

Tyk2 activent également STAT1, STAT3 et STAT5, qui migrent vers le noyau pour réguler la transcription des

gènes qui en dépendent.

Jak1 et Tyk2 activent également le facteur de transcription IL-10E1. IL-10E1 migre vers le noyau et

régule positivement la transcription des gènes qui en dépendent.

L’IL-10 active la transcription de SOCS1. SOCS1 agit par rétrocontrôle négatif en bloquant les sites

actifs des kinases Jak1 et Tyk2 (Schéma proposé d’après Finbloom 1995, Ho 1995, Kotenko 1996, Weber-

Nordt 1996, Wehinger 1996, Riley, 1999, Usacheva 2002, Ding, 2003, wang 2003, Stearns 2003, Chusid

2010).

Tyk2 Tyk2 Jak1 Jak1

Tyr446 Tyr496 Stat 3 Stat 3

Stat 3

Stat 3

P P

Stat 1

Stat 5

P

P

P

P

IL-10 E1

Stat 3

Stat 3

P P

TATA box TATA box

P

IL-10 E1

SOCS1

SOCS1

Stat 3

63

4. ACTIVITES BIOLOGIQUES DE IL-10

4.1. IL-10 et régulation inflammatoire et immunologique

4.1.1. IL-10 et production de médiateur de l’inflammation

L’IL-10 diminue la production, par les monocytes et les macrophages activés, des

cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-1, l’IL-6, le GM-CSF (Granulocyte Macrophage

Colony Stimulating Factor), le G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), le M-CSF

(macrophage colony stimulating factor) et le TNFα (De Waal Malefyt 1991, Fiorentino 1991).

Par rétrocontrôle négatif, l’IL-10 régule également sa propre production (De Waal Malefyt

1991). L’IL-10 diminue la production des cytokines GM-CSF, TNFα et IL-8 par les

polynucléaires éosinophiles activés par le LPS (Takanaski 1994). Elle inhibe également la

production de l’IL-12 par les cellules dendritiques ainsi que la synthèse de IL-2 et de l’IL-5 par

les lymphocytes T CD4+ (Taga 1993, Schandené 1994).

L’IL-10 inhibe la production monocytaire de chémokines telles que MIP-1, MIP-2 (MIP :

macrophage inflammatory protein), MCP-1, et MCP-5 (Kopydlowski 1999). Ceci inhibe le

recrutement des cellules de l’immunité sur les sites infectieux.

L’IL-10 induit la production de molécules anti-inflammatoires telles que l’antagoniste du

récepteur de l’IL-1 (IL-1RA) et les antagonistes du récepteur du TNF (p55 et p75) (Hart 1996).

L’IL-10 inhibe l’expression de la cyclooxygénase 2 ainsi que la production de la

prostaglandine E2 par les monocytes et les macrophages (Niiro 1995). Ceci inhibe la synthèse de

métalloprotéinases matricielles (MMP9 et MMP1) et stimule la production de leurs inhibiteurs

(TIMP-1) (Lacraz 1995, wang 2003, Stearns 2003).

4.1.2. IL-10, phagocytose et présentation de l’antigène

L’IL-10 augmente l’expression monocytaire des récepteurs FcγRI, FcγRII (sans effet

pour FcγRIIIa) et ainsi le potentiel de phagocytose par les monocytes (te Velde 1992, Liu 2005,

van Room 2003). Cependant, l’IL-10 diminue la génération d’ions superoxydes ce qui réduit la

capacité de ces cellules à éliminer les microorganismes ingérés (Niiro 1992).

L’IL-10 inhibe l’expression des molécules du CMH (complexe majeur d'histocompatibilité) de

classe II à la surface monocytaire en réponse à l’INFγ. L’IL-10 peut également, dans le cas de sa

pré-incubation avec les monocytes, inhiber l’expression des molécules du CMH de classe I

64

induite en réponse à l’interféron-γ (Salek-Ardakani 2002). L’IL-10 inhibe également

l’expression monocytaire d’ICAM-1 et des molécules de co-stimulation CD80 et CD86 (Salek-

Ardakani 2002). Ainsi, cette cytokine inhibe le mécanisme de présentation des antigènes aux

lymphocytes T par les monocytes.

L’IL-10 inhibe la capacité des cellules dendritiques à stimuler les lymphocytes T lors de

la présentation de l’antigène mais elle n’empêche pas leur maturation (Perona-wright 2007).

L’effet de l’IL-10 sur la capacité des neutrophiles à présenter l’antigène est discuté. En

effet, il a été rapporté, in vitro, que l’IL-10 inhibe l’expression de l’intégrine CR3 (Complement

receptor 3) par les polynucléaires neutrophiles ce qui diminuerait leur capacité à phagocyter les

microorganismes opsonisés (Capsoni 1997). Cependant, une étude très récente rapporte que

l’administration de l’IL-10 dans un modèle murin infecté par Escherichia-coli, augmente

l’expression de CR3 à la surface des neutrophiles et permet la clairance de la bactérie (Mittal

2010).

4.1.3. IL-10 et activité immunologique des lymphocytes B et T

L’IL-10 augmente la durée de vie des lymphocytes B humains et favorise leur

prolifération et leur maturation en plasmocytes. L’IL-10 influence la commutation isotypique

puisqu’elle permet la production par les plasmocytes des immunoglobulines IgM, IgG, et IgA

(Rousset 1992, Burdin 1995).

L’IL-10 diminue la co-stimulation des cellules T CD4+ par les cellules dendritiques en

augmentant l’expression des ILT3 et ILT4 par les cellules endothéliales (ILT : immunoglobulin-

like transcript) (Gleissner 2007). Cette cytokine inhibe la phosphorylation et l’expression du

CD28 par les cellules CD4+ et entraîne ainsi une tolérance des cellules T à la présence de

l’antigène (Akdis 2000, Taylor 2007). L’IL-10 diminue la population CD4+ effectrice ainsi que

la population mémoire (Brooks 2010).

L’effet de l’IL-10 sur les cellules T CD8+ est discuté dans la littérature et semble

dépendre de l’antigène stimulant les cellules T. En effet, il a été démontré dans un modèle murin

que l’IL-10 favorise la prolifération des cellules CD8+ et le développement de la population

CD8 mémoire en réponse à une infection bactérienne (Foulds 2006). En revanche, dans le cas

d’une infection virale, il a été décrit que l’IL-10 diminue l’activation des cellules T CD8+

(Brockman 2009). Cette diminution est faible selon Brooks et n’affecte pas la population

mémoire (Brooks 2010).

65

4.2. IL-10 et régulation de la coagulation

4.2.1. IL-10 et régulation de l’expression du FT

La régulation de l’expression du FT par l’IL-10 est bien décrite. Le modèle le plus

souvent considéré est celui du monocyte humain stimulé par le LPS (Veltrop 2001, Kamimura

2005, Poitevin 2007). La littérature est homogène rapportant un effet inhibiteur de l’IL-10 sur :

1- la transcription du gène FT, 2- l’expression membranaire du FT, 3- l’activité procoagulante du

FT.

Poitevin et al ont évalué l’effet de l’IL-10 produite par le monocyte, 24h après son

activation par le LPS, sur l’expression du FT à la surface de ces mêmes monocytes. Les auteurs

démontrent que l’IL-10 endogène inhibe l’expression de l’ARNm du FT et l’expression du FT

membranaire (Poitevin 2007).

Kamimura et al ont étudié le mécanisme d’action de l’IL-10 sur l’expression du FT. Ils

démontrent que l’IL-10 inhibe : 1- l’expression de l’ARNm de Erg-1, 2- la fixation de la protéine

Erg-1 sur le promoteur du gène du FT, 3- l’activation de MEK1/2, 4- l’activation de Elk1

(Kamimura 2005). Par ailleurs, Chusid LA et al démontrent que l’IL-10 inhibe l’activité des

deux facteurs de transcription, AP1 et NF-ƙB (Chusid 2010).

L’inhibition de l’expression du FT par l’IL-10 est également indirecte. En effet, l’IL-10

inhibe la production des cytokines pro-inflammatoires régulant positivement l’expression du FT

(telles que l’IL-6 et l’IL-8) (De Waal Malefyt 1991).

4.2.2. IL-10 et régulation de la génération de thrombine

A notre connaissance, l’effet de l’IL-10 sur la génération de la thrombine est rapporté

dans deux études. Dans la première étude, la génération de thrombine est évaluée en termes de

taux plasmatiques des fragments F1+2 de la prothrombine et des complexes thrombine-

antithrombine, dans un modèle humain de septicémie (administration de LPS à 16 témoins

humains) (Pajkrt 1997). Dans la deuxième étude, la génération de thrombine est évaluée in vitro

dans un modèle cellulaire monocytaire de génération de thrombine (Poitevin 2007). Les deux

études sont homogènes rapportant l’effet inhibiteur de l’IL-10.

De plus, Poitevin et al rapportent que l’incubation des monocytes avec des anticorps

neutralisant l’IL-10 ou neutralisant son récepteur, avant la stimulation cellulaire 24h par le LPS,

augmente la génération de thrombine monocytaire. Ils démontrent ainsi que l’IL-10 endogène,

66

produite par le monocyte en réponse au LPS (24h), inhibe la cinétique de la génération de

thrombine médiée par ces monocytes (Poitevin 2007).

4.2.3. IL-10 et Fibrinogène

Une seule équipe a étudié l’effet de l’IL-10 sur la synthèse du fibrinogène (Vasse 1996).

Le modèle utilisé est une lignée d’hépatocyte (Hep G2) cultivée en présence d’IL-6, cytokine

connue pour induire la synthèse du fibrinogène. Les auteurs ne rapportent aucun effet significatif

de l’IL-10 sur la concentration du fibrinogène. Cependant, ils démontrent une diminution de

l’expression de l’ARNm de la chaine β du fibrinogène.

4.2.4. IL-10 et Fibrinolyse

Selon nos connaissances, deux études ont étudié l’effet de l’IL-10 sur la fibrinolyse

(Okada 2000, Pajkrt 1997). Okada K a utilisé un modèle d’ischémie/reperfusion induite chez des

souris sauvages ou invalidées pour le gène de l’IL-10. Il démontre que le taux d’ARNm de PAI-1

(Plasminogen-activator inhibitor-1), mesuré chez les souris invalidées pour le gène de l’IL-10

est 4,7 fois plus élevé que celui mesuré chez les témoins et que l’injection d’IL-10 recombinante

inhibe cette augmentation. L’activité du PAI, le rapport PAI-1/t-PA (Plasminogen-activator

inhibitor-1/Tissue plasminogen activator), ainsi que les dépôts de fibrine de localisation intra-

vasculaire, sont significativement plus importants chez les souris invalidées pour l’IL-10 versus

les souris sauvages ou les souris invalidées traitées par l’IL-10 (Okada 2000).

Pajkrt D, dans son modèle humain de septicémie induite par le LPS, rapporte que,

administré avant le LPS, l’IL-10 diminue le t-PA, le PAI, les complexes PAP (Plasmin-Alpha-2-

Antiplasmin) et les D-Dimères. Cependant, administrée après le LPS, l’IL-10 n’inhibe que le PAI

(Pajkrt 1997). Par ailleurs, cette même équipe montre que le TNFα est inhibé par l’IL-10 et ce,

uniquement si cette cytokine est administrée avant le LPS. Ainsi, la diminution de l’activation de

la fibrinolyse par l’IL-10 est corrélée à une diminution de sécrétion de TNFα. Les auteurs

concluent que l’activation de la fibrinolyse par l’IL-10 se fait via la régulation du taux du TNFα.

(Pajkrt 1997).

4.3. IL-10 et apoptose

L’effet de l’IL-10 est étudié dans des modèles cellulaires différents, cardiomyocytes de

rat, cellules microgliales, cellules ganglionnaires rétiniennes, progéniteurs myéloïdes ou

67

monocytes (Dhingra 2009, Zhou 2001, Strle 2002, Boyd 2003). Ces études sont homogènes

rapportant l’inhibition de l’apoptose par l’IL-10. Cependant, elles attribuent à l’IL-10 des

mécanismes d’action différents. Dans le modèle de cardiomyocytes de rat, où l’apoptose est

induite par le TNFα, l’IL-10 active la voie ERK 1/2 laquelle inhibe la voie NF-ƙB et l’activité

des caspases 3 (Dhingra 2009). L’activation de la voie anti-apoptotique ERK-1/2 par l’IL-10 est

confirmée par Zhou JH dans le modèle de progéniteurs myéloîdes (Zhou 2001). Deux études

rapportent la non implication de la voie Akt par l’IL-10, alors que Zhou JH démontre que l’IL-10

active la phosphorylation de Akt et de PI3 (Strle 2002, Boyd 2003, Zhou 2001).

68

EXPOSE DES TRAVAUX

69

I. REGULATION DE L’ACTIVITE PROCOAGULANTE DU MONOCYTE :

IL-10, ANTICOAGULANTS

1. INTRODUCTION

Les monocytes sont impliqués dans les différentes étapes de la progression de la plaque

d’athérome, depuis sa naissance jusqu’à sa rupture et à la formation du thrombus (Shantsila

2009). Pour preuve, l’absence de lésion athéromateuse dans un modèle murin délété en facteur

de croissance monocytaire (Smith 1995). La naissance de la plaque s’accompagne d’une

infiltration sous-endothéliale des monocytes (Ross 1999). Activés, ces monocytes recrutés

participent énergiquement à la déstabilisation de la plaque, puisqu’ils induisent une réaction

inflammatoire chronique (cytokines pro-inflammatoires, espèces oxygénées réactives)

aboutissant à la dégradation de la charpente fibreuse (stimulation de la production des métallo-

protéinases) (Galis 1994, Falk 1995, Hansson 2005, Shantsila 2009). Les monocytes sont

également dotés d’une très forte activité procoagulante, par l’expression du FT, et surtout par la

production de microparticules exprimant également le FT (Barstad 1995, Mallat 1999a, Leroyer

2007). Nous pensons donc qu’inhiber la microvésiculation monocytaire et/ou la génération de

thrombine médiée par les monocytes ou les microparticules monocytaires est pertinent dans le

contexte coronarien.

Dans cette optique, nous avons évalué l’effet des anticoagulants actuellement prescrits dans le

SCA, et celui de la cytokine anti-inflammatoire IL-10, dans un modèle monocytaire in vitro. Les

résultats obtenus ont fait l’objet de 4 publications : 1- la première évalue l’effet inhibiteur du

fondaparinux sur l’activité procoagulante du monocyte et de la microparticule monocytaire, 2- la

seconde compare l’effet anticoagulant du fondaparinux à celui des héparines utilisées dans le

SCA, héparine non fractionnée et enoxaparine, 3- la troisième évalue l’effet de l’IL-10 sur

l’apoptose et la microvésiculation monocytaire, 4- la quatrième publication aborde l’association

fondaparinux + IL-10 et évalue l’effet anticoagulant combiné de ces deux molécules dans un

modèle monocytaire de génération de thrombine.

70

2. RÉSULTATS

2.1. Publication 1

Differential inhibitory effect of fondaparinux on the procoagulant potential of intact

monocytes and monocyte-derived microparticles. J Thromb Thrombolysis 2010; 30: 412-

418.

71

72

73

74

75

76

77

78

2.2. Publication 2

Differential coagulation inhibitory effect of fondaparinux, enoxaparin, and

unfractionated heparin in cell-models of thrombin generation. Blood Coagulation &

fibrinolysis. Submited.

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

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Figure 1

94

Figure 2

95

96

2.3. Publication 3

IL-10 inhibits apoptosis and microvesiculation of human monocytes. J Thromb Haemost

2009 ; 7:1241-3.

97

98

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100

101

102

103

2.4. Publication 4

IL-10 modulates fondaparinux inhibition of monocyte induced thrombin generation.

Thromb Res. Submited.

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124

2.5. Principaux Résultats

Publication 1

• Optimisation du modèle cellulaire de génération de thrombine : 0.2 106 monocytes

activés induisent une génération de thrombine identique à 160 000 microparticules

monocytaires.

• Effet inhibiteur, dose dépendant, du fondaparinux, dans les 3 modèles testés

• L’inhibition de la génération de la thrombine est différente selon le modèle : faible dans

le modèle du monocyte intact, supérieure et similaire dans les modèles acellulaire et

microparticulaire.

• Parmi les différents paramètres quantitatifs de la génération de thrombine, le rate index

est le paramètre le plus sensible à l’inhibition par le fondaparinux.

Publication 2

• Inhibition dose-dépendante de la génération de thrombine par les 3 anticoagulants testés,

HNF, enoxaparine et fondaparinux.

• Effet inhibiteur différent : supérieur pour HNF (ratio anti-Xa/anti-IIa = 1), versus

enoxaparine (ratio anti-Xa/anti-IIa = 3,6), versus fondaparinux (absence d’activité anti-

IIa).

• Le rate index est le paramètre le plus sensible quel que soit l’anticoagulant étudié.

Publication 3

• IL-10 exogène et LPS augmentent l’expression du CD14. L’association IL-10 exogène +

LPS majore cette expression.

• IL-10 exogène et LPS diminuent apoptose et microvésiculation monocytaire après 24 h

de culture. L’association IL-10 exogène + LPS majore cette inhibition.

• L’augmentation tardive (24h) de l’IL-10 endogène en réponse à une stimulation par le

LPS explique l’augmentation du CD14 et la diminution de l’apoptose et la

microvésiculation.

125

Publication 4

• Validation d’un modèle de génération de thrombine médiée par des monocytes élutriés

humains activés par le FXa.

• Inhibition dose-dépendante de ce système par le fondaparinux.

• L’IL-10 majore l’effet inhibiteur du fondaparinux.

3. DISCUSSION

Dans la logique des travaux préalablement rapportés par l’équipe de Reims, nous avons

fait le choix d’un modèle cellulaire monocytaire de génération de thrombine pour l’évaluation

des anticoagulants utilisés dans le contexte du SCA. Nous nous sommes particulièrement

intéressés au fondaparinux. Notre modèle, les monocytes intacts activés par le LPS d’une part et

les MPs issues de ces mêmes monocytes d’autre part, a été optimisé de telle manière que leurs

profils de génération de thrombine soient superposables et donc comparables. Cependant, à notre

surprise, l’inhibition de la génération de thrombine par le fondaparinux s’est avérée très

différente entre les MPs et leurs cellules d’origine, avec une inhibition très nettement supérieure

pour les MPs. Ces résultats pourraient expliquer, au moins en partie, l’efficacité du fondaparinux

à la posologie de 2,5 mg/j dans le SCA, entité clinique dans laquelle les MPs monocytaires sont

décrites comme jouant un rôle procoagulant majeur (Mehta 2005, Mallat 1999a, Leroyer 2007).

Ce travail nous permet, par ailleurs, de conclure que, parmi les 4 paramètres de génération de

thrombine évalués, le rate index est le paramètre le plus sensible à l’inhibition par le

fondaparinux. D’ailleurs, dans le cas des monocytes intacts, il est le seul paramètre pour lequel

l’IC50 a pu être déterminée. Parallèlement, nous avons évalué le profil d’inhibition des molécules

plus anciennes que sont HNF et enoxaparine. Nous retrouvons le même type de résultats : 1- la

génération de thrombine est plus inhibée dans le cas des MPs, 2- le rate index reste le paramètre

le plus sensible. La différence d’inhibition entre MPs et monocytes pourrait être liée à des

environnements membranaires distincts en terme de : 1- densité de PL (Stampfuss 2008, Shaw

2007), 2- densité de FT (Aharon 2008), 3- forme du FT, encryptée ou dé-encryptée (Osterud

2003). L’accessibilité du FXa à l’AT pourrait ainsi s’en trouver modifiée; les anti-Xa directs,

c'est-à-dire dont le mécanisme d’action est indépendant de l’AT, pourraient nous aider à

répondre à cette question. Par ailleurs, de façon attendue, la comparaison des trois anticoagulants

(comparaison réalisée à activités anti-Xa égales) montre que l’effet inhibiteur augmente avec

l’activité anti-IIa. Ainsi, quel que soit le modèle de génération de thrombine, l’inhibition par

l’HNF est supérieure à celle de l’enoxaparine, elle-même supérieure à celle du fondaparinux.

126

La mise en perspective de nos résultats à la lumière des données clinico-biologiques

rapportées dans l’étude ancillaire OASIS-5 (Anderson 2010), suggère que le niveau

d’anticoagulation chez les patients traités par enoxaparine est probablement trop élevé. En effet,

nous rapportons in vitro des IC50 variant entre 0.19 ± 0.02 à 0.53 ± 0.01 anti-Xa IU/mL. Ces IC50

sont très nettement inférieures à l’activité anti-Xa observée chez les patients d’OASIS-5 (1.2 ±

0.45 anti-Xa IU/mL). En revanche, pour ce qui est du fondaparinux, les IC50 calculées in vitro

sont proches de l’activité anti-Xa mesurée chez les patients d’OASIS-5 (0.17 ± 0.03 à 0.59 ± 0.05

anti-Xa IU/mL dans nos modèles versus 0.52 ± 0.22 anti-Xa IU/mL chez les patients). Il est

important de rappeler que le fondaparinux est le premier des anticoagulants ayant fait l’objet

d’une étude de détermination de doses dans le SCA. Par ailleurs, OASIS-5 s’est particulièrement

attaché à l’évaluation du risque hémorragique lié à l’anticoagulation ; ses auteurs concluent,

comme nous l’avions également suggéré au vu de nos propres résultats, que les posologies

anticoagulantes actuellement utilisées chez le patient sont trop élevées (Anderson 2010). Nous

proposons notre modèle de génération de thrombine comme une approche complémentaire aux

tests habituellement utilisés dans les études de dose ranging (typiquement la détermination de

l’activité anti-Xa). Il est à souligner qu’en cas d’évaluation de molécules antithrombines

exclusives, certaines précautions sont à considérer puisque la technique nécessite un standard

thrombine, sensible, par définition, à toute activité anti-IIa.

La deuxième partie de ce travail concerne l’IL-10. Ce travail s’inscrit dans la continuité

des travaux antérieurs de l’équipe de Reims, qui a rapporté un effet inhibiteur de l’IL-10 sur

l’expression du FT monocytaire et sur la génération de la thrombine induite par le monocyte

activé (Poitevin 2007). Pour la première fois, nous démontrons la capacité de l’IL-10 exogène,

en plus de son effet inhibiteur de l’apoptose, à inhiber la microvésiculation du monocyte humain

élutrié. Nous sommes également les premiers à démontrer que le monocyte, par une production

endogène d’IL-10, production tardive après 24h d’activation par le LPS, serait en mesure

d’autoréguler sa propre apoptose et microvésiculation. Nous avons également observé une

augmentation de l’expression du CD14 par le monocyte en réponse à cette cytokine et démontré

le rôle de l’IL-10 endogène dans l’induction de l’expression de ce marqueur. Ceci témoigne du

rôle protecteur, anti-apoptotique, de l’IL-10 ; l’augmentation de l’expression du CD14

membranaire est rapportée comme associée à la viabilité cellulaire (Heidenreich 1997, Lund

2002). Nos résultats sont confirmés dans la littérature démontrant une augmentation par l’IL-10

de l’expression de l’ARNm du CD14 (Sandanger 2009).

L’ensemble des résultats que nous avions rapportés, concernant le fondaparinux et l’IL-10

évalués isolement, nous ont logiquement conduits à émettre l’hypothèse d’une potentielle

synergie anticoagulante entre ces deux molécules. Dans un premier temps, nous avons optimisé

127

un modèle de monocytes stimulés, non plus par le LPS, mais par le FXa. Le choix du FXa nous a

été dicté par le contexte du SCA : le FXa augmente en situation aiguë chez ces patients, et il est

décrit comme associé à un état pro-inflammatoire (Busch 2005). Il nous a ainsi semblé plus

pertinent que le LPS. Nos résultats nous ont permis de confirmer la seule publication, datant

d’une dizaine d’années, ayant montré le rôle du FXa sur l’expression du FT monocytaire

(Akahane 2001). Par ailleurs, la littérature récente rapporte que le FXa clive les récepteurs PAR-

1 et PAR-2 (Camerer 2002, Morris 2006, Schuepbach 2010) et que le monocyte exprime ces

récepteurs PARs (Lopez-Pedrera 2010). Ainsi, nous proposons un mécanisme où l’expression du

FT monocytaire faisant suite à l’activation par le FXa serait médiée par le clivage des récepteurs

PARs. Dans un deuxième temps, nous avons déterminé la concentration optimale de l’IL-10 (200

pg/mL), notre pré-requis étant de travailler à une concentration sans effet sur la génération de

thrombine. A cette concentration d’IL-10, nous démontrons une potentialisation de l’effet

anticoagulant du fondaparinux. Une telle synergie, entre une molécule anticoagulante et une

cytokine anti-inflammatoire, n’avait jamais été rapportée. Il est donc possible que l’IL-10,

décrite comme élevée à la phase aigue de la maladie coronarienne, potentialise l’effet

anticoagulant du fondaparinux (Yip 2007, Chang 2009, Malarstig 2008). Il nous semble

important d’insister sur le fait que l’effet anticoagulant de l’IL-10, dans la combinaison IL-10 +

fondaparinux, n’est pas mesurable en terme d’activité anti-Xa. En revanche, notre test de

génération de thrombine y est sensible. D’autres cytokines, anti-inflammatoires voire même pro-

inflammatoires, pourraient également chez le patient modifier l’activité anticoagulante des

médicaments anti-thrombotiques, et ce, sans pour autant modifier l’activité anti-Xa. Le test de

génération de thrombine est pour nous une approche complémentaire, plus complète et pertinente

dans ce contexte.

128

II. POLYMORPHISMES DE L’IL-10 ET SYNDROME CORONARIEN AIGU

1. INTRODUCTION

Le SCA est la manifestation clinique de la rupture ou de l’érosion de la plaque

d’athérome au niveau d’une artère coronaire. Ceci est à l’origine de l’activation de la cascade de

la coagulation et de la formation d’un thrombus entraînant une réduction voire une oblitération

complète de la lumière du vaisseau (Falk 1995, Hansson 2005).

Le développement des lésions athéroscléroses est considéré comme un processus

inflammatoire. Parallèlement aux cytokines pro-inflammatoires, il existe également une

production de cytokines anti-inflammatoires. L’IL-10 a été identifiée parmi les cytokines anti-

inflammatoires synthétisées au cours de l’athérosclérose. Elle est présente aux stades précoces et

avancés de la plaque (Uyemura 1996, Mallat 1999b). L’IL-10 a pour particularité,

comparativement aux autres cytokines anti-inflammatoires, d’être produite en grande quantité

par le macrophage, cellule clé de l’athérosclérose. La production d’IL-10 est contrôlée

génétiquement. Certains polymorphismes situés dans le promoteur du gène de l’IL-10 régulent

cette production : trois SNPs (-1082GA, -819CT et -592CA) et deux polymorphismes de

répétition de CA (IL-10G et IL-10R). De plus, le rôle protecteur de l’IL-10 dans l’athérosclérose

est bien décrit dans les modèles animaux. Dans ces modèles sont démontrées : 1- la modulation

du métabolisme lipidique (Caligiuri 2003, von der Thusen 2001), 2- l’inhibition de la réponse

pro-inflammatoire impliquant cytokines et lymphocytes (Mallat 1999c, Potteaux 2004 ;

Caligiuri 2003), 3- la réduction de l’accumulation du collagène au niveau de la plaque (Potteaux,

2004), 4- l’augmentation de la synthèse des métallo-protéinases (Caligiuri 2003), et 5-

l’inhibition de l’activité procoagulante liée au FT présent dans la plaque (Caligiuri 2003).

L’étude de ces polymorphismes dans le contexte coronaire nous semble donc particulièrement

intéressante. Des données existent dans la littérature mais sont, d’une part, limitées à l’étude des

SNPs (il n’existe pas de données concernant polymorphismes de répétition et SCA), et d’autre

part, ne concernent pas la population tunisienne.

Nos objectifs sont les suivants : étudier une population tunisienne, déterminer la

distribution allélique des polymorphismes de répétition de CA chez les témoins sains, et évaluer

l’association potentielle de l’ensemble des polymorphismes (SNPs et polymorphismes de

répétition de CA) avec la pathologie coronaire.

129

2. RÉSULTATS

2.1. Publication 1

Functional Interleukin 10 promoter variants in coronary artery disease patients in

Tunisians. Eur Cytokine Netw 2010 ; 21:136-141.

130

131

132

133

134

135

136

2.2. Publication 2

Interleukin-10 microsatellite variants and the risk of acute coronary syndrome among

Tunisians. Int J Immunogenet. In press.

137

138

139

140

141

142

143

144

2.3. Principaux résultats

Publication 1

• La distribution allélique et génotypique des polymorphismes -1082 G/A et -819 C/T est

identique chez les patients coronariens et chez les témoins sains.

• La distribution allélique du polymorphisme -592 C/A est différente entre patients et

témoins sains (alléle A plus fréquent chez les patients).

• Ce polymorphisme est impliqué dans la sévérité de la maladie avec un OR de 1.82 pour

l’hétérozygotie C/A, et avec OR de 3.33 pour l’homozygotie A/A.

• Pas d’association des différents haplotypes avec la pathologie coronaire.

Publication 2

• Trois allèles pour le polymorphisme IL-10R et 9 allèles pour IL-10G sont identifiés dans

la population témoin tunisienne. Les allèles IL-10 R2 (13 CA) et IL-10G9 (21 CA) sont

les plus fréquents.

• Les fréquences alléliques de l’IL-10G12 (24 CA) et de l’IL-10 G15 (27 CA) sont

significativement plus faibles chez les patients coronariens. Inversement, la fréquence

allélique de l’IL-10 R3 (14 CA) est plus élevée.

• Deux des 14 haplotypes possibles, R2-G9 et R2-G15, sont associés à la pathologie

coronaire : effet protecteur pour R2-G9 (OR = 0.67) et facteur de risque pour R2-G15

(OR = 5.29).

3. DISCUSSION

Notre étude cas-témoins a porté sur la corrélation avec la pathologie coronaire de 5

polymorphismes génétiques du promoteur du gène de l’IL-10, trois polymorphismes de

substitution d’un seul nucléotide (-1082G/A, -819 C/T et -592 C/A) et deux polymorphismes de

répétition de CA (l’IL-10G et l’IL-10R).

Concernant les SNPs, nous rapportons que seul le polymorphisme -592 C/A est associé à

la pathologie coronaire. De plus, nous montrons, pour ce polymorphisme, une association entre

la surexpression de l’allèle A et la sévérité de la maladie. En revanche, l’étude des haplotypes

montre qu’aucun des 14 haplotypes n’est associé à la maladie. Dans la littérature, seules 5 études

ont abordé les polymorphismes SNPs de l’IL-10 sous l’angle du SCA. Nos résultats sont en

145

accord avec la plus large de ces études (5804 patients irlandais, néerlandais, écossais) (Trompet

2007). Cependant, nos résultats sont différents de ceux des quatre autres études. Trois parmi ces

quatre études ne rapportent aucune association : 1- Donger, dans une population française

(Donger 2001), 2- Koch, dans une population allemande (Koch 2001), et 3- Hirashiki, dans une

population japonaise (Hirashiki 2003). En revanche, la quatrième étude réalisée dans une

population grecque montre une association entre l’haplotype ATA (-1082GA/-819CT/-592CA)

et l’infarctus du myocarde (Manginas 2008). L’hétérogénéité de ces résultats peut être expliquée

par : 1- l’ethnie étudiée, 2- la méthodologie des études (critères cliniques d’inclusion, présence

ou non d’une population contrôle saine, effectif de la cohorte étudiée), et 3- l’épistasie entre le

locus -592 et les loci voisins -819 et -1082.

Les polymorphismes de répétition de CA sont, pour la première fois, étudiés dans la

population tunisienne. En effet, nous ne disposions d’aucune donnée préalable concernant la

répartition allélique de ces polymorphismes. Chez les témoins sains, nous avons identifié 3

allèles pour l’IL-10R et 9 allèles pour l’IL-10G, et observé que les allèles IL-10R2 (13 CA) et

l’IL-10G9 (21 CA), respectivement, étaient les plus fréquents (82 et 31%). Ces résultats sont

concordants avec les données de la littérature rapportées dans d’autres populations caucasiennes.

Nous tenons à préciser que nous avons, dans l’esprit de respecter la nomenclature internationale,

déterminé par séquençage le nombre de répétition de CA. Cependant, pour pouvoir se comparer

aux autres études, nous avons dû repositionner nos résultats selon la nomenclature de Eskdale

(Eskdale 1995, Eskdale 1996). Pour ce, nous avons attribué la dénomination G9 à l’allèle le plus

fréquent de notre population témoin, comme l’ont fait les autres auteurs. Cet allèle correspond à

21 CA, ce que nous avons déterminé par séquençage, et à 22 CA, selon Eskdale. Ce décalage

d’une répétition de CA est expliqué par le fait que Eskdale a attribué au microsatellite IL-10G de

la séquence de référence X78837 (dans GenBank) 22 répétitions de CA, au lieu des 21

réellement présentes.

Aucune donnée à ce jour n’est disponible concernant une association potentielle entre les

polymorphismes de répétition de l’IL-10 et la pathologie coronaire. Nous démontrons dans une

population tunisienne que les allèles G12 (24 CA) et G15 (27 CA) et que l’haplotype R2 (13

CA)-G9 (21 CA) sont protecteurs. En revanche l’allèle R3 (14 CA) et l’haplotype R2 (13 CA)-

G15 (27 CA) sont des facteurs de risque.

Nous n’avons pas mesuré le taux d’IL-10 chez nos patients. Cependant, les données de la

littérature associant les génotypes –592 CA, -592 AA et l’allèle IL-10R3 à un taux de production

faible d’IL-10, nous autorisent à penser qu’un taux faible d’IL-10 est un facteur de risque de

maladie coronaire et qu’à l’inverse, une forte production d’IL-10 est protectrice. Il n’existe pas

de données entre les allèles G12 et G15, ni entre les haplotypes R2G9 et R2G15, et le niveau de

146

production d’IL-10. Nous émettons l’hypothèse que : 1- les deux allèles G12 et G15 déterminent

une forte production d’IL-10, 2- l’haplotype R2G9 soit associé à une forte réponse et ce d’autant

plus que les deux allèles séparément ont été associés à une forte production d’IL-10, et 3-

l’haplotype R2G15 soit associé à une faible production d’IL-10. Ainsi, la taille (nombre de CA)

et/ou certains types de combinaisons alléliques conditionneraient le niveau transcriptionnel. La

seule expérimentation qui permette d’évaluer cette hypothèse est l’analyse des modifications

transcriptionnelles du gène de l’IL-10 dans un modèle de transfection cellulaire. Si de tels

résultats étaient confirmés, ils pourraient être pris en compte pour adapter au mieux la thérapie

génique de l’IL-10, dont les essais actuels dans des modèles animaux d’athérosclérose sont très

prometteurs (Mallat 1999b, von der Thusen 2001, Namiki 2004, Han 2010).

147

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

148

Nous démontrons, dans une population tunisienne, l’association entre certains variants

polymorphes de l’IL-10 et le SCA. Ceci étant, les valeurs des odds ratio que nous avons

obtenues rendent l'étude systématique de ces polymorphismes peu pertinente pour une

stratification des patients coronariens. Nos résultats ne sont pas étonnants au regard de la

littérature, puisque les études rapportent des odds ratio du même ordre.

Au terme de ce travail, nous envisageons désormais l'IL-10, non plus comme un facteur

de risque de pathologie coronaire, mais comme une modalité thérapeutique nouvelle et

prometteuse. En effet, cette cytokine, en plus de ces capacités anti-inflammatoires, possède des

propriétés anticoagulantes : elle inhibe notamment l’expression du FT monocytaire. Nos résultats

apportent une preuve supplémentaire de l’effet anticoagulant de l'IL-10 en démontrant, non

seulement son effet inhibiteur sur l’apoptose et sur la microvésiculation monocytaire, mais

également son rôle potentialisateur de l’effet anticoagulant d’un anti-thrombotique, le

fondaparinux. Deux modalités thérapeutiques sont envisageables pour l’IL-10 : 1- thérapie

génique pour la prévention de la maladie athéroscléreuse, et/ou 2- IL-10 sous forme d’IL-10

recombinante en phase aiguë. L’avenir de l’IL-10 en tant que médicament ne nous semble pas si

lointain, compte-tenu des résultats prometteurs que nous apportent déjà les essais de thérapie

génique chez l'animal. Par l’IL-10 recombinante, nous pensons pertinent de cibler, dans le SCA,

en plus de la coagulation et des plaquettes, d’autres cellules, au premier rang desquelles le

monocyte bien sûr, mais également la cellule endothéliale. En effet l'endothélium représente une

surface considérable et acquière un phénotype procoagulant en conditions de stress. Notre

proposition d’IL-10 recombinante serait d’aboutir à la passivation de cette surface. L’IL-10

recombinante n’a pas encore fait l’objet d’une évaluation en pathologie coronaire ; en revanche,

des données cliniques sont d’ores et déjà disponibles pour d’autres pathologies inflammatoires.

149

RÉFÉRENCES

150

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INTERLEUKINE 10 ET REGULATION DE L’ACTIVITE PROCOAGULANTE MONOCYTAIRE INTERET DANS LE SYNDROME CORONARIEN AIGU Résumé. Les monocytes jouent un rôle procoagulant majeur au cours du Syndrome Coronaire Aigu (SCA). Ils expriment à leur surface le Facteur Tissulaire (FT), initiateur majeur de la génération de la thrombine et sont à l’origine de la génération de microparticules (MPs) procoagulantes exprimant également le FT. L’inhibition de la génération de thrombine et/ou de la génération des MPs monocytaires est ainsi d’un grand intérêt dans le contexte coronaire. Dans la première partie de ce travail, nous avons effectué une étude fondamentale évaluant, in vitro,

l’effet d’anticoagulants utilisés dans le SCA, particulièrement le fondaparinux, ainsi que l’effet de l’interleukine-10 (IL-10), une cytokine anti-inflammatoire dotée des propriétés anti-athéromateuses. Ces deux types de molécules ont été analysées seules ou de façon combinée dans des modèles de génération de thrombine et de microvésiculation monocytaire. Ainsi, nous démontrons 1- que l’IL-10 inhibe la microvésiculation monocytaire, 2- que les molécules anticoagulantes inhibent d’avantage la génération de thrombine médiée par la MP monocytaire que celle médiée par le monocyte activé 3- que l’IL-10 potentialise l’effet anticoagulant du fondaparinux. Dans la mesure où la production de l’IL-10 est contrôlée génétiquement, nous avons évalué, dans la seconde partie de ce travail, l’association possible entre 5 polymorphismes génétiques de l’IL-10 et le risque de pathologie coronaire aigue, et ce, dans une population tunisienne (291 patients/291témoins sains). Nous rapportons une association positive entre les variants polymorphes, IL-10 -592A (Odds

ratio : 1,82) et IL-10R3 (Odds ratio : 1,46), et la pathologie coronaire. De façon intéressante, la littérature rapporte que ces deux variants polymorphes sont associés à une synthèse faible d’IL-10. En conclusion, nos résultats ne nous autorisent pas à proposer l’étude systématique des polymorphismes de l’IL-10 dans l’appréciation du risque coronaire aigu chez le patient. En revanche, nos résultats suggèrent que l’IL-10 pourrait constituer une molécule prometteuse dans l’arsenal des thérapeutiques anti-thrombotiques. Mots clés. Interleukine-10, génération de thrombine, facteur tissulaire, microparticule, monocyte, polymorphismes, syndrome coronaire aigu. INTERLEUKIN-10 AND REGULATION OF MONOCYTE-PROCOAGULANT ACTIVITY RELEVANCE IN ACUTE CORONARY SYNDROME. Abstract. Procoagulant monocytes play a major role in the pathogeny of the acute coronary syndrome (ACS). Indeed, they express Tissue Factor (TF), the main trigger of thrombin generation, and generate highly procoagulant TF-bearing microparticles (MPs). It is therefore a major issue to control MP-associated thrombin generation in SCA. This led us to evaluate, in the first part of this work, the effect of anticoagulant molecules used in the management of ACS (including fondaparinux) but also of IL-10, an anti-inflammatory cytokine, which can modulate the progression of atheroma. Both types of molecules were evaluated separately or in combination, in a in vitro model of thrombin generation and monocytic MP generation. Ours results show that: 1- IL-10 inhibits monocytic-MP generation; 2- anticoagulants inhibit more potently MP-induced thrombin generation than activated monocyte-induced thrombin generation; 3- IL-10 potentiates fondaparinux inhibitory effect on thrombin generation. As IL-10 production is genetically controlled, we evaluated the possible influence of 5 well-described IL-10 polymorphisms on the risk of ACS among Tunisians (291 patients/291 healthy controls). Results show that two polymorphic variants of IL-10 i.e. SNP-592A (Odds ratio: 1,82) and microsatellite IL-10R3

Odds ratio: 1,46) are significantly associated with the risk of SCA. Interestingly, the literature reports that these two polymorphic variants are associated with low levels of IL-10 production. In conclusion: Our results do not allow us to recommend the analysis of IL-10 polymorphisms in the assessment of ACS risk. However, our data suggest that IL-10 is a promising antithrombotic pharmacological agent, in this clinical situation. Key words: Interleukin-10, thrombin generation, tissue factor, microparticle, monocyte, genetic polymorphisms, acute coronary syndrome.