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TD1: Les microorganismes des milieux terrestres.

1. Géneralités

Les milieux terrestres abritent une variété de formes de vie, animales, végétales et microbiennes, ils

sont présents dans un sol par au moins une partie de leur cycle biologique. La biodiversité du sol

inclut les habitants de la matrice du sol ainsi que ceux des « annexes du sol » (litière, bois morts en

décomposition, cadavres d'animaux, déjections).

Les microorganismes représentent une partie majeure la microfaune du sol

(protozoaires, nématodes, bactéries, champignons, algues), ils constituent par eux-mêmes une part

non négligeable de la matière organique du sol où sont immollisés des éléments de grande

importance agronomique. Cette biomasse microbienne joue un rôle majeur en tant que puits de

carbone, producteur de sol. Elle renferme, en moyenne, 2 à 4 % du carbone et 4 à 8 % de l'azote total

d'un sol. On peut donc considérer la microflore des sols comme étant à la fois un transformateur et

un compartiment traversé par des flux d'énergie et d'éléments minéraux.

2. Diversité et abondance

Les estimations pour le microbiote du sol sont encore très imparfaites : de 1011 à 1014 bactéries/m2 et

la surface cumulée de toutes les hyphes du mycélium des microchampignons peut dépasser 100 m2.

Bactéries hétérotrophes l’énumération directe par épifluorescence montre leur abondance dans le

sol (1-60 × 109 cellules/g poids sec). Cette abondance totale liée à l’apport de matière organique. On

retrouve aussi des bactéries photosynthétiques anoxygéniques comme les bactéries pourpres et

vertes: bactéries photosynthétiques, qui utilisent le H2S (parfois H2) comme source d’électrons ; ou

précipitent le soufre élémentaire à l’intérieur ou à l’extérieur de la cellule.

Les virus sont des entités acellulaires, mais qui constituent une classe majeure des micro-organismes.

Ce sont pour la plupart des bactériophages qui peuvent infecter des bactéries hétérotrophes et des

cyanobactéries.

Champignons filamenteux, entrent en compétition avec les bactéries pour la matière organique

(Figure 1). Se subdivisent en trois phylums : deutéromycètes, ascomycètes et basidiomycètes

(quelques espèces ont la capacité de dégrader la lignine). Quelques espèces sont saprophytes, alors

que d’autres sont pathogènes pour les plantes (Moisissures/pourritures blanches, brunes, bleues du

bois).

Protozoaires Il sont d'autant plus nombreux que les sols sont humides et riches en matières

organiques (3 à 400 kg à l'hectare, soit 1 à 2 millions par gramme de terre. Les protozoaires

comportent surtout des consommateurs de bactéries ou des prédateurs d'autres protozoaires

(amibes, amibes à thèque, flagellés, ciliés), formant la chaine alimentaire microbienne ou “boucle”

microbienne.

Les algues unicellulaires ne se développent pas que dans l'eau. Dans les écosystèmes terrestres, elles

constituent une source de carbone organique importante. Abondantes dans l’eau (10 -104

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cellules/mL), vivent en suspension comme plancton ou attachées aux surfaces (roches, bois, plantes

supérieures, tortues...) comme périphyton, ou en symbiose avec les protozoaires et les invertébrés.

3. Rôles

Les micro-organismes du sol jouent un rôle fondamental dans le cycle biogéochimique des éléments

intéressant la production agricole. Hétérotrophes pour la plupart, ils interviennent au niveau du cycle

du carbone dans les processus de minéralisation-humification de la matière organique. Leur

importance est également déterminante dans le cycle d'azote, où toutes les transformations

importantes sont sous contrôle microbien, et dans les cycles du phosphore et du soufre où 'ils

interviennent dans les passages entre formes plus ou moins assimilables par les végétaux.

En effet, les micro-organismes assurent la décomposition de la matière organique (ex: les feuilles des

arbres) en élément nutritifs facilement assimilables par les plantes, comme l'azote et le phosphore.

Ils sont également responsables de la dégradation des polluants organiques comme

les hydrocarbures et les pesticides.

Figure1: Structre et microorganismes d'un sol fertile.

4. Techniques d'étude de la diversité microbienne

L'identification, le comptage et la caractérisation de la diversité des microorganismes vivants des sols

permettent de définir des indicateurs (ou bioindicateurs) de la qualité des sols et de l'environnement

souterrain (et aérien parfois).

4.1. Techniques classiques et dénombrements

Ces méthodes sont les plus anciennes, mais leurs bases solides et les perfectionnements techniques

importants qu'elles ont connus font qu'elles sont toujours utilisées.

3

4.1.1. Dénombrements indirects

Ces mesures s'appuient sur des cultures en milieu liquide ou en milieu solide après ensemencement

avec des suspensions-dilutions de sol. Pour les cultures sur mllieu solide, on détermine le nombre de

germes du sol au départ grâce à la simple multiplication du nombre de colonies par la dilution

correspondante, celle-ci étant choisie de façon à compter une centaine de colonies.

Dans le cas des cultures en milieu liquide, on recherche la dilution limite donnant lieu à une culture

(appréciée par l'apparition d'un trouble) ; l'utilisation des tables de MAC CRADY (1918) donnant le

nombre le plus probable (NPP) de germes présents dans l'échantillon de départ.

Ces méthodes posent par hypothèse que chaque colonie ou chaque culture à la dilution-limite ne

provient que d'un seul germe, et elles ne comptent que les germes capables de donner une colonie

ou une culture sur les milieux utilisés. Ce sont là deux limitations sérieuses des dénombrements

indirects qui ont suscité de nombreuses amêliorations techniques. Ainsi la dispersion des micro-

organismes est grandement favorisée par la mise en suspension-dilution du sol dans du

pyrophosphate de sodium ou l'action des ultrasons. De même, on peut dans une certaine mesure

prendre en compte des micro-organismes ayant des exigences trophiques différentes par l'utilisation

de milieux plus ou moins riches ou plus ou moins spécifiques.

Le principal incovéniant des ces techniques est qu'elles sous-estiment parfois largement le nombre

de bactéries et sont partiellement inadaptées au recensement des champignons pour lesquels on

estime le nombre de propagules viables (spore, fragment de mycélium plus ou moins important...

etc.).

4.1.2. Dénombrements directs

Ces techniques sont basées soit sur l'observation directe d'une suspension-dilution de sol au moyen

de la microscopie optique, soit sur l'étude de coupes fines d'échantillons de sol (agrégats) en

microscopie électronique.

En microscopie optique, la suspension-dilution de sol peut être directement observée après

étalement sur lame, ou incorporée dans une solution gélosée ou filtrée sur membrane ne retenant

que les organismes filamenteux tels les champignons.

Les préparations peuvent ensuite être observées soit de la façon classique avec utilisation de

colorants, soit en contraste de phase, soit en épifluorescence avec des colorants comme l'acridine

orange, l'isoth iocyanate de fluoresceïne, le bromure d'éthydium généralement utilisés pour la

coloration des bactéries. Le bleu d'aniline et le diacétate de fluoresceïne sont utilisés pour la

coloration des champignons.

En microscopie électronique, les clichés sont réalisés à partir d'échantil'Ions de sol non perturbés, ce

qui permet à la fois de compter ou de mesurer les micro-organismes et de visualiser leur répartition

spatiale.

Pour les mesures de biovolume, par exemple, les micro-organismes du sol sont répartis en deux

groupes : les bactéries, levures, spores et algues sont assimilées à des sphères dont on mesure le

diamètre (classes de taille) ; les champignons et actinomycètes sont assimilés à des cylindres dont on

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détermine la longueur et le diamètre. La mesure du nombre et de la taille des bactéries présentes

dans le sol s'effectue alors par référence aux particules introduites. La longueur des hyphes

fongiques peut être mesurée à l'aide d'un curvimètre, par exemple, en projetant sur un plan l'image

microscopique. Le biovolume est finalement converti en biomasse exprimée en mg de carbone

microbien par gramme ou par kilogramme de sol.

4.2. Estimation de la biomasse par dosage de composés spécifiques

Le dosage dans des extraits de sol de composés biochimiques caractéristiques des cellules vivantes

peut permettre une approche quantitative de la biomasse microbienne du sol. Il faut pour cela que le

composé à doser soit spécifique des micro-organismes et que son extraction soit quantitative.

4.2.1. Dosage des constituants de parois et membranes

Il s'agit essentiellement de l'acide muramique et des lipopolysaccharides pour les bactéries, des

hexosamines pour les champignons.

4.2.2. Dosage de composés nucléiques

Les mesures peuvent porter sur les bases nucléiques ou sur l'ADN. En dosant non pas l'ADN et/ou

l'ARN mais certaines bases nucléïques spécifiques comme la 5-méthyl-cytosine (spécifique des

végétaux) il devrait être possible de préciser l'origine des acides nucléïques présents dans le sol.

4.2.3. Dosage de l'ATP

L'Adénosine Tri-Phosphate présente la caractéristique de se trouver dans tous les tissus vivants et de

disparaître rapidement, sous l'action d'ATP-ase, après la mort des cellules. La teneur en ATP d'un sol

serait ainsi fonction de la masse des organismes vivants qui s'y trouvent.

4.3. Techniques moléculaires

Pour les bactéries et les mycètes filamenteux, les dernières technologies permettent d'extraire

leur ADN du sol et de caractériser la structure, la densité et la diversité génétique des espèces, voire

d'en identifier une partie. Les progrès de la biologie moléculaire (amplification en chaîne d'ADN,

séquençage à haut-débit…) et de la bioinformatique ont développé une taxonomie sur la phylogénie

moléculaire. L'identification des bactéries, par exemple, repose essentiellement sur l'utilisation du

gène de l'ARN ribosomique 16S comme marqueur de phylogénie et ceux pour les raisons suivantes :

- Présent chez tous les procaryotes, où il remplit la même fonction;

- Peut être facilement séquencé car il possède des domaines hautement conservés avec peu de

mutations fixées au cours de l'évolution;

- Présente des régions de séquences plus variables qui sont différentes entre deux espèces.

Ainsi, pour positionner des microorganismes procaryotes dans un groupe phylogénétique, on

procède à l'amplification et au séquençage de ce gène puis à sa comparaison avec les séquences déjà

connues disponibles dans les banques de données.

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Les progrès de la métagénomique appliqués aux sols, aux sédiments et aux nappes phréatiques ont

récemment montré que la majorité des phylums bactériens connus sont aussi présents sous la

surface des terres émergées, et 47 lignées de nouveaux phylums y ont été en outre récemment

découvertes, permettant de progressivement mieux comprendre la distribution et les voies de

pénétration/circulation des organismes du sol et des milieux souterraines connexes.

TD2: Les microorganismes des milieux aquatiques

1. Géneralités

Les milieux aquatiques sont très variés: lacs, fleuves, rivières, ruisseaux, étangs, mares ainsi que les

zones terrestres humides associées. Un grand nombre de microorganismes peuplent ces milieux, des

autotrophes (bactéries chimiotrophes, algues, protistes...) et hétérotrophes (décomposeurs en

général), ils cohabitent avec une multitude d'êtres vivants. En effet, il existe tout un ensemble

d’organismes adaptés à la vie aquatique. Ces êtres constituent la flore (végétale et bactérienne) et la

faune des eaux. Ils jouent chacun leur rôle dans l’équilibre complexe qui régit les biotopes

aquatiques, où coexistent les producteurs primaires (autotrophes) et les consommateurs

d’organismes ou de molécules organiques (hétérotrophes). Inversement, leur prolifération sous

l’effet de certaines pollutions peut entraîner des nuisances pour les usagers de l’eau.

2. Diversté et abondance

L'utilisation de la microscopie à épifluorescence a révélé des densités bactériennes variant de 105 à

107 cellules.m L-1 selon le niveau trophique du milieu. La présence d'une communauté de protistes

flagellés hétérotrophes, principaux prédateurs des bactéries, a également été estimée (102- 105

cellules.mL-1). De la même façon, le dénombrement en microscopie inversée a permis de quantifier la

polulation de ciliés planctoniques (< 1-50 cellules.mL-1). Les Archea ont été trouvées en grande

abondance dans de nombreux milieux aquatiques et, plus spécialement, dans les zones profondes

des océans. Les virus sont beaucoup plus abondants, Il ya entre 106 et 109

particules virales par

millilitre à la surface de l’océan. Les algues microscopiques, quant à elles, vivent en susupenssion

avec le plancton ou accrochées aux surfaces (10 -104 cellules/mL).

3. Pollution des milieux aquatiques

La pollution des milieux aquatiques (lacs, rivières, etangs...etc.) cause un certain nombre de

modifications indesirables du point de vue de la qualité de l'eau, en rapport direct ou indirect avec

les changements intervenus dans la communauté aquatique.

La décharge non contrôlée des eaux usées industrielles dans une masse d'eau d'un lac peut

introduire dans ce milieu: les eaux d'égout, les solutes organiques (synthétiques et naturels), les

solutes mineraux (toxiques et non toxiques), les matieres en suspension (degradables et non

dégradables), les produits petroliers (matières grasses), enfin la pollution thermique.

Les matières deversées avec les eaux usées domestiques non traitées qui peuvent affecter la qualité

de l'eau en augmentant le nombre des micro-organismes fecaux pathogènes, les substances

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nutritives dissoutes et les matières en suspension (substances organiques dégradables et non

dégradables).

4. Conéquences de la pollution des milieux aquatiques

La decharge des eaux usées domestiques dans des lacs les rend souvent dangereux pour

l'aIimentation en eau et pour les sports aquatiques. Les autres effets d'une telle pollution incluent

des modifications (en abondance et en composition) des populations d'organismes aquatiques

(eutrophisation). Cela peut causer des mauvaises odeurs par suite de la mort et de la decomposition

des organismes et propager des maladies infectiteuses.

5. Autoépuration

L'autoepuration d'un cours d'eau comporte une multitude de phénomènes et d'intéractions

physiques, chimiques, biologiques et microbiologiques. L'autoépuration resulte de l'action des

facteurs ecologiques sur la faune et la flore aquatiques. Ceux-ci se subdivisent en facteurs abiotiques

(température, rayonnement solaire, composition physique et chimique de l'eau, etc.) et facteurs

biotiques (prédation, compétition, parasitisme, etc.). Ces facteurs peuvent modifier directement ou

indirectement la croissance, la longevité et la mortalité d'une ou plusieurs espèces animales ou

végétales. Lorsque la quantité de matière organique ajoutée n’est pas excessive, les algues se

développent en utilisant les dérivés inorganiques libérés de la matière organique. Ceci conduit à la

production d’oxygène pendant la journée, alors que la respiration se déroule pendant la nuit, en

suscitant ainsi des variations diurnes en oxygène. Cette demande en oxygène est habituellement

exprimée en demande biochimique en oxygène DBO. C'est une mesure de la quantité de matière

organique biologiquement dégradable contenue dans l'eau; plus elle est faible, plus l'eau est de

bonne qualité.

Considerant que les signes + representent une valeur, alors on peut dire que, dans un etang

stagnant, il n'y a pas ou il y a peu de mouvement d'eau et l'aeration est faible. Alors, si des eaux

usées contenant beaucoup de matière organique sont deversées dans un étang stagnant, la valeur de

la DBO va augmenter (3 +), le taux d'eutrophisation va augmenter en proportion (3 +) et la quantité

de dioxygène va diminuer (+), ce qui entraine la deterioration de la qualité de l'eau. Si les eaux usées

subissent préalablement un traitement primaire, la valeur de la BDO va être moins forte (2 +) que

celle provoquee par les eaux non traitees; de la meme facon, le taux d'eutrophisation sera moins

élève (2 +) et la quantite de dioxygene dissous sera un peu plus forte (2 +). Si un traitement

secondaire a eu lieu, alors les valeurs de la DBO et du taux d'eutrophisation seront moins élevées (+)

et la quantité de dioxygène dissous sera plus élevée (3 +), valeurs qui constituent de bons indices de

la qualité de l'eau.

Si les eaux usées sont deversées dans une rivière dont le courant est rapide, l'augmentation de la

DBO et la diminution de la quantité d'oxygene dissous sont moins fortes à cause du brassage et de

l'aération de l'eau qui entrainent une rapide oxydation de la matière organique.

6. Traitement des eaux usées visant à produire de l'eau potable

Le traitement des eaux usées est l’ensemble des procédés visant à dépolluer l’eau usée avant son

retour dans le milieu naturel ou sa réutilisation.

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1) Sedimentation: l'eau non traitée est laissee à sedimenter dans un reservoir; l'eau qui en sort subit

l'étape suivante, soit la floculation.

2) Floculation: des floculants sont melangés à l'eau. A mesure que les floculants s'associent aux

particules colloidales, ces dernières se déposent dans le fond du bassin; l'eau qui en sort subit l'étape

suivante, soit la filtration.

3) Filtration: l'eau subit une filtration (sur sable ou sur charbon activé); l'eau qui en sort subit l'étape

suivante, soit la desinfection.

4) Desinfection: l'eau est desinfectée par chloration ou par traitement à l'ozone ou aux UV; l'eau qui

en sort est potable.

7. Etude globale de la qualité de l'eau

Pour juger de la qualité de l'eau il est necessaire de prendre en compte certains critères

microbiologiques (nombres bactéries, virus, spores et parasites), chimiques (pH, oxygène, sel

minéraux, métaux lourds, matière organique...) et physiques (taille des goutelettes, avtivité

photnoique, transmission de la lumière) de l'eau.

7.1. Prélèvement

Le choix du point de prélèvement est fondamental par la représentativité de l’échantillon. Il faut

prendre toutes les précautions pour éviter de contaminer l'eau pendant le prélèvement. Pour le

prélèvement des échantillons d’eau potable destinés à une analyse bactériologique : il faut flam-

ber le point de prélèvement et laisser couler l’eau à débit constant pendant une à deux minutes

sous la protection de la flamme avant de prélever. Attention, de l’air doit être présent dans le

flacon et pour cela ce dernier ne sera pas totalement rempli.

Pour une eau stagnante, le flacon est débouché et immergé complètement en position verticale

renversée en le tenant par le fond: il est alors retourné jusqu'à ce que l'ouverture soit légèrement

plus haute que le fond, le flacon est ensuite déplacé vers l'avant de manière à créer un courant

puis refermé tout de suite après le remplissage. Il faut éviter le prélèvement en surface ou au

fond pour ne pas ramasser de l'écume ou des sédiments. Utiliser des flacons lestés (à cavalier

mobile, à clapets…) spéciaux pour prélèvements en profondeur (puits, lacs, eau de mer... etc).

L'échantillon doit être maintenu à basse température (4 - 6 °C) pour éviter son altération pendant

le transport.

7.2. Analyse des coliformes totaux et fécaux

Les coliformes, dont Escherichia coli et Enterobacter aerogenes sont des membres de la famille des

entérobactéries ; représentent environ 10% des micro-organismes intestinaux chez l’homme et les

animaux. Ces bactéries sont largement utilisées comme micro-organismes indicateur, perdant leur

viabilité en eau douce à un rythme plus lent que la plupart des principaux agents pathogènes

intestinaux.

Le dénombrement des coliformes dans les eaux s'effectue, en général, par la méthode de

fermentation à tubes multiples (Figure 2). Le bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol (BCPL) est

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utilisé pour l’enrichissement sélectif utilisé pour la recherche des coliformes. Il inhibe le

développement de la flore secondaire contaminante

Test présomptif

Dans 9 tubes contenants le milieu BCPL, transférer avec une pipette stérile, respectivement 10ml,

1ml, 0,1ml de l’échantillon bien homogénéisé, et mélanger le contenu de ces 9 tubes de façon à

obtenir une répartition homogène de l’inoculum et du milieu. Les tubes sont incubés à 37°C pendant

48 h. Les tubes présentant un trouble avec production du gaz dans la cloche sont positifs.

Test confirmatif

Procéder à la confirmation de chaque culture provenant des tubes ayant donné une réaction

positive, en ensemençant à l’aide d’une anse bouclée le bouillon lactosé au vert brillant. Incuber

deux séries de tubes dans les conditions suivantes:

Les coliformes totaux sont incubés à 37°C pendant 48h.

Les coliformes fécaux sont incubés à 44°C pendant 24h.

Test démonstratif

Le milieu Eosine Bleu de Methylène (EMB) réparti en boite de pétri est utilisé pour le test

démonstratif des coliformes totaux et fécaux. Les boites sont ensemensées par la méthode des

cadrans à partir des tubes BLBVB positifs puis incubées à 37°C pendant 24h.

7.3. Dénombrement des strptocoques fécaux

Test présomptif

Le milieu de Rothe est un milieu de culture utilisé pour l'enrichissement d 'Enterococcus . Selon le

système d'ensemencenment choisis, un milieu à double concentration est ensemencé par 10ml de

l'échantillon, les tubes à double concentration sont inoculés avec 1 et 0.1 ml de l'echantillon ou de

ses dilutions. Les tubes sont ensuite incubés à 37°C pendant 24 à 48h. Les tubes présentant un

trouble sont présumés contenir un streptocoque fécal et son soumis au test confirmatif.

Test confirmatif

Un trouble dans milieu de Litsky signale la présence éventuelle des Streptocoques fécaux. C'est un

test confirmatif qui se fait suite au test présomptif au milieu de Rothe. Après agitation des tubes

positifs, prélever sur chacun quelques gouttes avec la pipette Pasteur, et les reporter dans du milieu

Litsky. La lecture des résultat se fait après incubation à 37°C pendant 24 à 48h.

7.4. Dénombrement de la flore mésophile totale

Le milieu PCA (de l'anglais Plate Count Agar) ensemencé dans la masse à partir d'une série de

dilutions est utilisé pour le dénombrement de la flore aérobie mésophile totale. Un double

dénombrement est souvent réalisé en incubant une série de boites à 37°C pendant 24h pour la

croissance des bactéries qui se développent à la température du corps humain. La deuxième série de

boites est incubée à 22°C pendant 48 à 72h.

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Figure 2 : Test de fermentation à tubes multiple.

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7.5 Dénombrement par filtration sur membrane

Le procédé de filtration sur membrane est une méthode plus directe pour la détermination de la

présence et le dénombrement de nombreuses bactéries (coliformes, streptocoques, salmonelle et

shigelles... etc.) pour évaluer les caractéristiques microbiologiques de l’eau. L'échantillon d'eau est

passé à travers un une membrane filtrante de porosité déterminée (0,45 μm). . Le filtre portant à sa

surface les bactéries piégées est enlevé à l'aide d'une pince flambée et appliqué soigneusement au

centre d'une boîte de pétri contenant un milieu gélosé, en évitant d'enfermer des bulles d'air.

L'utilisation du milieu approprié correspondant aux germes à rechercher permet leur détection

rapide ainsi que leur dénombrement. La détection rapide des coliformes totaux sur milieu Endo, les

coliformes fécaux sur milieu de sel biliaire ou contenant le bleu d'aniline, et des streptocoques fécaux

sur milieu contenant de l'azoture (KF agar) avec TTC (chlorure de triphenyltétrazolium) par leurs

colonies caractéristiques. Cette méthode est adaptée pour les eaux à faible turbidité (celle-ci risque

d’obstruer le filtre), ayant une charge microbienne faible.

En effet, lorsque le nombre des bactéries dans un milieu devient trop faible pour être dénombré

dans un volume de l'ordre de 100 ml (cas des bactéries pathogènes: Salmonelles, Vibrio

parahaemolyticus, etc.), il devient nécessaire de prélever un volume beaucoup plus important et de

procéder à une concentration sur memebranes filtrantes. Cette méthode peut être utilisée pour des

volumes de 500 ou 1 000 ml d'une eau suffisament claire, en assurant des filtrations successives à

partir de 3, 4 ou 5 membranes différentes.

TD3: Les microorganismes de la phylosphère

1. Géneralités

Les racines des plantes libèrent une grande variété de substrats dans leur sol environnant,

notamment l'éthylène, divers alcools, des sucres aminés, des acides organiques, des vitamines, des

nucléotides, des polysaccharides, et des enzymes. Ceci permet de créer des environnements uniques

pour les micro-organismes du sol. Ces environnements comprennent la rhizosphère et le rhizoplan.

La rhizosphère, est représentée par le volume de sol autour de la racine influencé par les substrats

rejetées par celle-ci. Le rhizoplan, représente la surface de la racine de la plante, il fournit également

un environnement unique pour les micro-organismes, comme des matières gazeuses, solubles, et des

particules se déplaçant à partir de la plante vers sol.

Lorsque ces substrats sont disponibles le nombre des micro-organismes augmente, mais aussi leur

composition et leur fonction changent dans la rhizosphère et le rhizoplan. Les micro-organismes de la

rhizosphère et du rhizoplan, servent à leurs tours de sources de nutriments labiles pour d'autres

organismes, créant ainsi une boucle microbienne du sol en plus de jouer un rôle essentiel dans la

synthèse et la dégradation de la matière organique.

2. Diversité et Rôles

Les cyanobacteries sont des algues qui sont en relation symbiotique avec un mycete pour former un

lichen; les cyanobacteries photoautotrophes fournissent, grace au processus de la photosynthese, de

la matiere organique au mycete qui, a son tour, procure un environnement protecteur aux algues.

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Les mycorhizes sont des mycètes qui sont en relation symbiotique avec les plantes. Le mycète joue le

même rôle que les racines, en ce sens que le mycète multiplie la surface par laquelle la plante peut

absorber les élements nutritifs, surtout le phosphore, qui est un ion peu mobile dans le sol. La

relation symbiotique fournit au mycète un substrat et de la matiere nutritive pour sa croissance.

Les bactéries fixatrices d'azote

Les bactéries fixatrices d’azote associées aux Iégumineuses sont représentées par six genres

appartenant à Ia famiIIe des Rhizobiaceae. EIIes comprennent égaIement Ies deux autres genres :

Agrobacterium et Phyllobactérium.

Rhizobium est une bacterie fixatrice d'azote qui est en relation symbiotique avec les racines des

legumineuses sur lesquelles elle forme des nodules (ex. soja, haricots, pois, arachide, luzerne et

trefle). La plante fournit les conditions anaerobies et les nutriments necessaires a la bacterie qui,en

retour, fixe l'azote qui sera incorpore dans les proteines vegetales. Frankia est une bacterie fixatrice

d'azote, du genre Actinomycetes, qui vit en relation symbiotique avec les racines de rosiers et

d'autres plantes sur lesquelles elle forme des nodules. La relation est semblable à celle de Rhizobium

avec ses hôtes.

Les micro-organismes tels que Azotobacter, Azospirillum et Acetobacter fixant l'azote sont présents

sur la surface des racines des plante, le rhizoplan, ainsi que ceux présents dans la rhizosphère

contribuent à l'accumulation d'azote par les graminées tropicales.

3. Processus d'infection d'une bactérie fixatrice d'azote

Le déveIoppement des nodosités a Iieu en une série d’étapes, commandées par des gènes aussi bien

de Ia bactérie que de Ia pIante. Chez Ies Iégumineuses, Ia première étape du processus d’infection

est Ia perception des métaboIites de Ia pIante (fIavonoïdes) par Ies Rhizobium présents dans Ia

rhizosphère (Figure 3). D’autres ensembIes de signaux, nécessaires pour I’accompIissement du

processus d'infection et la formation du noduIe, sont Ies poIysaccharides extraceIIuIaires (EPS), Ies

IippoIysaccharides, Ies antigènes, Ies gIucanes et Ies Iéctines. Cette étape est suivie d'une série

d'évènements:

- La croissance du rhizobia dans Ia rhizosphère de Ia pIante hôte;

- Induction de gènes de noduIation des Rhizobium par I'exsudat de Ia pIante;

- Production du facteur Nod et attachement des rhizobia aux racines de Ia pIante hôte;

- Induction de divisions ceIIuIaires chez Ia pIante;

- Pénétration du Rhizobium dans Ia pIante par I'intermédiaire du cordon d'infection;

- Engouffrement du rhizobium dans Ie symbiosome intraceIIuIaire (infection);

- Initiation de Ia nodosité et recourbement du poiI absorbant;

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- DéveIoppement du noduIe permettant Ia fixation d’azote atmosphérique par Ies bactéroides.

Figure 3 : Echanges de signaux entre les partenaires impliqués dans la symbiose "Rhizobium-

légumineuse" pendant les premières étapes de la nodulation.

4. La symbiose dans la nodosité

Quand Ie Rhizobium coIonise Ia surface de Ia racine de Ia pIante hôte, iI induit des changements

morphoIogiques de I’épiderme. Ces changements sont précédés par I’induction de certains gènes de

noduIation précoce. Après infection des poils absorbants, il y a formation et progression de cordons

d'infection puis libération des bactéries hors des cordons d'infection, multiplication des bactéries

dans les cellules de l'hôte et différentiation des bactéries en bactéroides fixatrices d'azote.

L'énergie nécessaire à la formation et au fonctionnement des nodosités est fournie par la

photosynthèse. Le produit majeur transporté des feuilles vers les nodules par le phloème est le

saccharose, l'ammonium produit par la bactérie se combine au carbone (produit de la

photosynthèse) pour donner des aminoacides puis des protéines (Figure 4). Dans les nodosités, la

bactérie produit une protéine (la nitrogénase) qui est capable de transformer l'azote atmosphérique

en une forme utilisable par la plante. La nitrogénase n'est pas produite lorsque la bactérie vit seule

dans le sol. San s cette protéine, la plante ne prélève que l'azote présent dans le sol sous forme de

nitrates. Le complexe enzymatique nitrogénase est formé de deux protéines distinctes. Une source

de protons, d'électrons, d'énergie et un environnement strictement anaérobie sont nécessaires pour

le fonctionnement de la nitrogénase. Cependant les organismes aérobies qui fixent l'azote

atmosphérique ont développé des mécanismes physiologiques élaborés pour maintenir les

conditions nécessaires au fonctionnement de la nitrogénase; la leghérnoglobine dont le rôle est

d'approvisionner les bactéroides en oxygène. c'est une homoprotéine détectée dans les nodules de

légumineuses, la partie protéine est contrôlée génétiquement par l'hôte alors que l'hème du pigment

semble être synthétisé par Rhizobium.

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Figure 4: Schéma de la symbiose dans une nodosité.

5. Techniques de caractérisation des rhizobia

Depuis Ieur isoIement et Ia découverte de Ieur intérêt agronomique, Ies rhizobia sont des bactéries

de mieux en mieux connues. La pIupart des investigations sont effectuées sur des Iégumineuses qui

présentent une importance agricoIe, principaIement Ies Fabaceae. ActueIIement, Ia diversité des

rhizobia est évaIuée par un choix de méthodes de caractèrisation phénotypique et génotype. Celles-

ci incIuent : I'anaIyse phénotypique cIassique et taxonomie numérique, I'anaIyse entière de protéine

de Ia ceIIuIe, I'anaIyse des acides gras ceIIuIaires, Ia RFLP des gènes conservés qui incIut Ies gènes du

16S ARNr et I'espace intergenique.

5.1. Caractérisation phénotypique

Les méthodes classiques visent à receuillir des données sur les caractères phénotypiques teIs que Ia

morphoIogie (sur milieu Yeast-Manitol Agar YEM), Ia pigmentation, Ia réaction aux coIorants, Ia

présence ou I'absence de spores, Ies conditions nutritionneIs, Ia capacité de produire des acides à

partir des sucres et Ia sensibiIité aux inhibiteurs. Ces méthodes simpIifiées de caractérisation restent

toujours Ia base des systèmes de cIassification et d'identification.

5.2. Caractérisation physiologique

Les différents facteurs considérés sont, en général, Ie pH, Ia saIinité et Ia température. La croissance

des bactéries est estimée visueIIement après 7 jours d’incubation par rapport à un témoin sur YMA

sans modification.

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5.3. Caractérisation sérologique

Des techniques immuno-enzymatiques peuvent être utilisées comme le test ELISA indirect qui est

précis et extrêmement sensibIe. Cette technique utiIise un marqueur enzymatique pour visuaIiser

une réaction antigéne-anticorps. La réaction est révéIée par I’empIoi d’un substrat chromogène et Ia

coIoration obtenue est mesurée par spectrophotométrie.

5.4. Caractérisation symbiotique (nodulation et fixation d’azote)

La caractérisation des rhizobia utiIisant Ia noduIation est largement utilisée. Il s'agit mettre en

évidence l'efficience de l a symbiose fixatrice est son aptitude plus ou moins grande et fixer l'azote

atmosphérique. L'efficience d'une symbiose Rhizobium - légumineuse doit être testée en premier

lieu au laboratoire, ensuite en serre et enfin in situ.

Des techniques basées sur I’inocuIation des pIants légumineuses en cuIture monoxenique avec des

souches sont comparés à un témoin non inocuIé. Après un certain temps, on note la présence ou

l'absence de nodules, Ieur nombre et Ieur poids frais, pour estimer le potentieI de fixation d'azote.

5.5. Caractérisation moléculaire

Le nombre éIevé de bactéries isoIées des noduIes de Iégumineuses, I’introduction de différentes

méthodes basées sur Ia PCR, Ie séquençage des gènes codant Ie 16S ampIifié par PCR et anaIysé par

RFLP, ont été à Ia base de Ia cIassification des Rhizobium.

TD4: Les microorganismes de l'air et la santé humaine

L'air véhicule des allergènes, des polluants chimiques et des micro-organismes et leur nui- sance sur

l'organisme provoque des réactions variées. La contamination microbiologique de l’air a pour origine

la formation d’un bioaérosol complexe qui peut contenir plusieurs contaminants biologiques : micro-

organismes vivants (bactéries, virus, levures, moisissures), fragments microbiens antigéniques,

toxines et/ou autres substances d’origine microbienne.

La contamination de l’air dépend de trois conditions essentielles (présence de sources de

contamination, amplification microbienne par multiplication active et dissémination par perturbation

du réservoir) qui conduisent à une contamination soit permanente, soit le plus souvent transitoire de

l’air ambiant, ou flore microbienne de l’air.

1. Les microorganismes de l'air et les sources de contamination

La flore atmosphérique est constituée d’une flore de base, présente sur les supports que sont les

poussières, et composée d’organismes saprophytes résistant à la dessiccation et aux ultraviolets :

bactéries à Gram positif (Bacillus, sarcines, etc.) et champignons filamenteux. Les espèces fongiques

les plus souvent isolées dans l'air extérieur appartiennent aux genres Cladosporidium,

Alternaria et Aureobasidium, alors qu'à l'intérieur des batiments et systèmes de climatisation, ce sont

les genres Penicillium, Aspergillus et Trichoderma. Au sein des genres, il faut distinguer les espèces

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puisque le caractère pathogène de Aspergillus flavus est totalement différent de celui de Aspergillus

fumigatus.

L’émission par l’homme de gouttelettes buccales et nasales ainsi que la dissémi-nation de squames

cutanées, entraînent la présence dans l’air d’une flore d’origine humaine qui comprend à la fois des

microorganismes commensaux et d’autres potentiellement pathogènes (Staphylococcus

epidermis, S. aureus) (Figure 5). Les virus sont également présents dans l'air. Leur survie dépend de

nombreux paramètres, notamment l'humidité relative et la température de l'atmosphère, ainsi que

des conditions du milieu.

Figure 5. Chaine de transmission des microorganismes entre l'homme et l'environnement.

Les milieux secs comme les poussières et les supports inertes agglomèrent ou fixent les micro-

organismes. Ceux-ci sont composés de bactéries à Gram positif (Bacillus sp., staphylocoques,

entérocoques, actinomycètes...), de bactéries à Gram négatif telles qu’Acinetobacter sp., de spores

de bactéries anaérobies à Gram positif et de champignons microscopiques.

Les milieux humides favorisent la survie des micro-organismes : bactéries à Gram négatif comme les

entérobactéries ou les pseudomonas et espèces apparentées, Legionella sp., mycobactéries

atypiques, champignons microscopiques, virus tels que les entérovirus ou le virus de l’hépatite A.

2. Les contrôles particulaires et microbiologiques de l’air

Le contrôle microbiologique de l’air est réalisé de façon ponctuelle pour vérifier l’efficacité de

mesures de prévention de la dissémination de contaminants fongiques lors de travaux, pour

rechercher et identifier une source environnementale lors d’une enquête épidémiologique, ou à titre

pédagogique pour sensibiliser le personnel à la qualité microbiologique de son environnement.

3. Contrôle microbiologique de l'air

Le mesurage de l'aérobiocontamination, c'est à dire la recherche de bactéries, levures et

champignons filamenteux est un complément indispensable lorsque le danger à prévenir est un

danger lié aux micro-organismes, en particulier, dans les zones à environnement maitrisé (ZEM).

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Les méthodes utilisées permetent le dénombrement des microorganismes viables, c'est-à-dire, ceux

qui ont la capacité de se développer sur les milieux de culture utilisés et ce, aux conditions de

croissance fournies (température, oxygène, humidité, lumière, etc...).

La contamination microbiologique de l’air est évaluée de façon active à l’aide d’un aérobiocollecteur

dont la fonction est d’aspirer l’air et de récupérer les particules viables qui seront mises en évidence

par culture. Le principe de la méthode consiste à faire un dénombrement bactérien ou mycologique

à partir d’un prélèvement fait sur filtre de polycarbonate. Cette méthode permet d’analyser une

concentration plus élevée de microorganismes. Une autre technique basée sur la sédimentation

consiste à recueillir les micro-organismes sur une gélose ouverte pendant un temps donné ; elle

correspond à un prélèvement passif ne permettant pas de récupérer la totalité des particules viables

(vitesse de sédimentation fonction de leurs taille et poids), ni de ramener le résultat à un volume

défini. Cette méthode évalue le risque de biocontamination par voie aérienne d’une surface pendant

un temps d’exposition donné (unité formant colonie [UFC]/unité de surface/unité de temps). Elle est

préconisée pour les contrôles dans les enceintes de stockage des endoscopes thermosensibles et les

isolateurs. La méthode la plus utilisée en pratique en milieu hospitalier est l’aérobiocollecteur.

4. Interprétation des résultats

La réalisation des méthodes de contrôle microbiologique doivent être standardisées et leur résultats

interprétés en fonction de valeurs cibles, selon la normalisation, la réglementation ou les

recommandations.

Le dénombrement des colonies bactériennes et fongiques est réalisé sur différents milieux de culture

(PCA, trypticase soja, gélose à l’extrait de malt ou gélose Sabouraud glucosé, etc.) au terme de la

période d’incubation. Les résultats quantitatifs sont exprimés en UFC par volume: UFC/500 litres ou

UFC/m3, pour un prélèvement d’air par aérobiocollecteur ; UFC/surface exposée/durée d’exposition,

pour un prélèvement d’air par sédimentation.

En effet, ces contrôles ne permettent pas d’apprécier la contamination microbienne réelle de

l’environnement, du fait de plusieurs facteurs :

• les micro-organismes présents font partie d’écosystèmes complexes au sein desquels leurs états

physiologiques varient (viables, stressés) ;

• suivant les conditions de culture (milieu de culture, tempéra-ture, durée d’incubation,

atmosphère), ces micro-organismes sont ou ne sont pas cultivables ;

• les techniques de prélèvement ne permettent la récupération que d’une fraction de la population

microbienne du fait de sa répartition au niveaux des particules en suspenssion et l’effet direct de

l’impaction sur la viabilité des micro-organismes de l’air.