TD Noyau, Chromatine, Chromosome, Caryotype (S. Delbecq) N...
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TD Noyau, Chromatine, Chromosome, Caryotype (S. Delbecq) N. Boulle Année 2015-2016
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TD Noyau, Chromatine,
Chromosome, Caryotype
(S. Delbecq)
N. Boulle Année 2015-2016
Le noyau
NOYAU
Caractéristique des cellules eucaryotes +++
- Limité par l’enveloppe nucléaire (2 membranes: interne et externe)
- Contient presque la totalité de l’information génétique (le génome nucléaire)
L’ enveloppe nucléaire: délimite le noyau
Pollard TD, Earnshaw WC, Biologie Cellulaire , Ed Elsevier Microscopie électronique: 1ères études ∼1950
chromatine
L’enveloppe nucléaire
Description:
Enveloppe constituée de 2 membranes :- membrane externe: en continuité avec le RER- membrane interne- espace périnucléaire Membrane
externe
Membrane interne
Enveloppe nucléaire Réticulum
Endoplasmique
Lumière du RE
Espace périnucléaire
Lamina nucléaire
Pore nucléaire
ribosome
L’espace périnucléaire
Espace en continuité avec la lumière du RE:- contenu similaire- stockage du calcium
Percée par les pores nucléaires
Les pores nucléaires
- Seule voie de communication entre le noyau et le cytoplasme
- Passage dans les 2 sens; notion de sélectivité
- Passage de petites molécules, ions
Protéines
ARNm, ARNt, ARNr
ribonucléoprotéines, particules ribosomales…
- Protéines constituant le pore nucléaire: les Nucléoporines (Nup)
Nucléoporines (Nup) : ~ 30 connues
~ 450 protéines en tout (par pore)
Molécules de taille variable!
Remarque: Pore nucléaire → Asymétrique, déformable
Les pores nucléaires
16 bras radiaires (2x8)
16 filaments (8 cytosoliques et 8 filaments de cage)
Fahrenkrog and Aebi; Nat Rev Mol Cell Biol 2003, 4: 757
Structure 3D des pores nucléaires
Microscopie electronique, cryofracture
8 unités répétées
notion de sélectivité
Les éléments du transport nucléo-cytoplasmique
- Signaux d’adressage sur la protéine (cargo) à transporter (NLS, NES, NRS)
- Importines, exportines: Récepteurs de transport
-Les Nucléoporines:
-Système Ran GTP / GDP → orientation du transport à travers le pore
Transport à travers le pore nucléaire dans les 2 sensÉlément transporté = cargo
Nucléoporines contenant des séquences répétées riches en phénylalanine / gly (30%):
Domaine FG ( Ex: motif FXFG)
Séquences de reconnaissance pour les Importines / ExportinesInterviennent dans le transport à travers le pore nucléaire → sélectivité du pore!
Signaux d’adressage:-NLS « classique » (Nuclear Localisation Signal), riche en aa basiques (K, R)-NES (Nuclear Exportation Signal)-NRS (Nuclear Retention Signal)
Fonctionnent de manière autonome !
Translocation des protéines cargo sous forme repliées (≠≠≠≠ mitochondrie / peroxysome)
Masquage/démasquage des signaux d’adressage par par tenaires d’interaction
REM: 40% des protéines nucléaires n’ont pas de NLS classique
Les signaux d’adressage nucléaires
Extrémité amino-terminale de la nucléoporine Nup 153
Extrémité C-terminale de la nucléoporine Nup 153 contenant le domaine FG
Fahrenkrog and Aebi (october 2003) 4: 757
Les Nucléoporines avec domaine FG: exemple de Nup 1 53
Extrémité flexible
Fixe importine / exportine
GEF
GTPGDP
PiGAP
GDPGTP
RanRan
GAP: GTPase-Activating Protéin
GEF: Guanine –nucleotide
Exchange Factor
Le système Ran: orientation du transport NC
Ran = petite GTPase monomérique
Echange
Hydrolyse
• Disposition asymétrique des régulateurs GEF et GAP de part et d’autre de la membrane nucléaire:
GEF / GAP
noyau / cytosol
• Existence d’un gradient Ran.GTP / Ran. GDP entre le noyau et le cytoplasme
Le système Ran
Ran GDP Cytosol
Ran GTP
NoyauRan GDP
Ran GTP
GEF
Importine
Exportine
GAPcytosolique
GEFnucléaire
Gradient de Ran à travers l’enveloppe nucléaire
Exercice 1
Transport nucléo -cytoplasmique
G2
G1
S
M
Cycle cellulaire et complexes
cyclines - Cdk
Schéma donné à titre d’illustration
M = Mitose
Complexes cyclines –Cdk: activité kinase
Cycline A Cdk 1
Cyclines D Cdk 4-6
Cycline E Cdk 2
Cycline A Cdk 2
Cycline B Cdk 1Cf lamines
ADN
E2F1 actif
+Progression
du cycle cellulaire
Rb active
E2F1 inactif
Rb inactive
P
P
PCyclines D
Cdk 4-6
G1
Transcription de gènes clés
Phosphorylation
Les 2 statuts de Rb
G2
G1
S
M
Rb: le verrou du cycle cellulaire
Cyclines/ Cdk4/6 de la phase G1
M = Mitose
Remarque:
Rb: inactivé dans de nombreux cancers
CDK4CDK4
Cellules WTSauvages
Cellules RRActivité Cdk4 augmentée
(idem dans certains cancers)
RB
Sites de phosphorylation par les Cdks
106 kDa
Figure 2
Phosphorylation de protéines et Western blot
1/ « Shift » de migration (Ac « total »)
Hyperphosphorylation
HypophosphorylationAc
p-Ac2/ Ac dirigés contre la forme phosphorylée de la pr otéine
Hyperphosphorylation
Figure 2
Ac anti RB totale
Ac anti RB phosphorylée sur les sérines 807-811
Ac anti RB déphosphoryléé
Lamines A, B et C: → Filaments intermédiaires
→ spécifiques du noyau
→ formation de la lamina nucléaire
- Lamine B fixée à la face nucléocytoplasmique de l’enveloppe nucléaire par un groupement farnésyl ≠≠≠≠ Lamines A et C
- Lamines A et C: lamina + nucléoplasme
- Récepteurs des lamines: prot. transmembranaires
QCM 1 Structure du noyau
Lamina: Face interne de l’enveloppe nucléaire
- Interagit avec les pores nucléaires
- Interagit avec la chromatine
- Rôle dans la régulation de l’expression des gènes+++
lamina
QCM 1 Structure du noyau
Protéines de la matrice:
- Lamines A et C hors lamina
- Actine
- Particules ribonucléoprotéiques
- Enzymes du métabolisme ADN, ARN
QCM 2 Matrice nucléaire
Réseau fibreux:
-occupe l’ensemble du nucléoplasme
-rôle dans l’organisation de la chromatine
Figure 2
RB = Anticorps anti-RB (totale)
E2F1 = Anticorps anti-E2F1
DAPI
Figure 3
Mise en évidence en microscopie:
- fluorescence: agents intercalant de l’ADN (DAPI, BET…)
- colorants basiques : hématoxyline, bleu de méthylène…
- réaction de Feulgen : hydrolyse acide de l’ADN et révélation avec le réactif de Schiff (détecte les aldéhydes)
DAPI (Fluorescence)
FeulgenHématoxyline
NOYAUQCM 3
Localisation cellulaire:
N: nucléaire
NC: nucléo-cytoplasmique (noyau + cytoplasme)
C: cytoplasmique
Comptage de cellules
(/ 100 cellules)
Fluorescence (intensité)
Anticorps anti-RB (totale)
Anticorps Rb phosphorylée (phospho-RB)
Figure 3
Cellules WTSauvages
Cellules RRActivité Cdk4 augmentée(idem certains cancers)
RB ++
RB phosphorylée +/-
RB +++
RB phosphorylée ++
Figures 2 et 3
→ Export actif de RB dans les cellules RR?
→ Lien avec la phosphorylation de RB?
Cellules RB -/-: absence de RB
Figure 4D et 4E: Immunoprécipitation (IP) anti-Exportin1
RB endogène
RBExp1Exp1
IgG Anti Exportine 1
Anti RB
Lysat cellulaire
WT, RR, RB-/-
Région N-terminale
(interactions avec la
matrice nucléaire)
Région LP (Large Pocket)
(répression de la transcription,
cycle cellulaire) NLS
GFPGFP
GFPGFP
GFPGFP
GFP-WTRB
GFP-WTRBLT
GFP-RB7LP
Figure 4F et 4G: Immunoprécipitation (IP) anti-Exportin1
Les constructions utilisées
GFPGFP GFP
Western-blot
Cellules RR
Anticorps anti Exp1
IP anti-Exp1lysat
Transfection
ADN
Figure 4F et 4G: Immunoprécipitation (IP) anti-Exportin1
WTRB ou GFP ou RBWTLP ou
RB7LP
GFP
Exportine 1
RB « artificielles »,
Analyse de « domaines »
1
2
3
4
Figure 4F et 4G: Immunoprécipitation (IP) anti-Exportin1
RB
Sites de phosphorylation par les Cdks
Zone d’interaction avec exportine 1 quand phosphorylée
Activité CDK faible (WT)
Blocage du cycle cellulaire /
Arrêt prolifération
cellulaire
Levée du verrou RB / Forte prolifération
cellulaire
Activité CDK forte (RR)
cytosol
nucléoplasme
Imp. αα αα
cargo
Imp. ββ ββ
1: interactionsimp. ββββ – motifs FG 2: translocation
par transporteur central
3: interaction RanGTP- imp. ββββinduit dissociation imp. αααα-cargo
RanGTP
Imp. αααα
cargo
Imp. ββββ
Imp. αααα
cargo
Imp. ββββ
RanGTP
Le transport nucléocytoplasmique
L’import nucléaire :
L’export nucléaire et le recyclage des importines:
Le recyclage des importines:
Chromosomes - Caryotype
Interphase: chromosomes décondenséspas d’enchevêtrement aléatoire: Territoires chromosomiques
Territoires chromosomiques
Cellule en interphase
Accumulation de cellules
Synchronisation / blocage
Culture cellulaire: cellules somatiques
Prométaphase ou métaphase
Solution hypotonique
Obtention d’un caryotype
Dispersion chromosomique
Fixation, coloration
Division cellulaire
Colchicine
lymphocytes, cellules foetales (amniocentèse, biopsies trophoblaste)(Cellules tumorales)
Obtention d’un caryotype
Répétition 5’ TTAGGG 3’
sur 5-10 kpb
Se raccourcit à chaque division
Structure d’un chromosome métaphasique
Observation après coloration
Classement des chromosomes ?
- Taille
- Position du centromère
Ic= p/(p+q)
- Bandes (G, R, C)
Classement en 7 groupes (A à G)
*
*
Caryotypes:
A B
C
D E
F G C G
métacentriques
submétacentriques
acrocentriques
Classement d’après la longueur et l’index centromérique :7 groupes de A–>G
acrocentriques
13 14 15
21 22
Obtention d’un caryotype
Coloration des chromosomes au Giemsa
Nombre de bandes variable selon le degré de condensation de la chromatine
- Bandes G: sombres, digestion enzymatique ménagée + Giemsa
- Bandes R: sombres, digestion thermique ménagée + Giemsa
• Bandes:
→ Caractéristiques d’une paire chromosomique
→ Reproductible d’une mitose à l’autre
→ Caractéristique d’une espèce donnée
• Métaphase: 200 – 500 bandes
→ résolution 5-10 Mpb
Métaphase Prométaphase
550-850 bandes en prométaphase : >3Mb(300-500 bandes en métaphase : 5-10 Mb)
Résolution
Scan résultat caryotype avec résolution
Région pseudo-autosomique 1PAR 1
Crossing-over obligatoiredes chromatides non-sœurs
pendant la méïose
Région pseudo-autosomique 2PAR 2
Centre d’inactivation en Xq13
SRY
X Y
Les gonosomes
Y: Contient 10 fois moins de
gènes que le X
= Mosaïque physiologique
?Inactivation du chromosome X
• Respect du dosage génique entre homme (XY) / femme (XX) :Inactivation quasi-complète d’un chromosome X chez la femme
• X inactivé forme le corpuscule de Barr
• se met en place pendant l’embryogenèse mais réversible durantl’ovogenèse (hétérochromatine facultative )
• L’inactivation se fait au hasard puis se transmet aux cellules filles= Mosaïque de cellules
Mosaïque chez les femelles
Inactivation du chromosome X
Corpsucule de Barr
QCM 7
FISH: Hybridation In Situ Fluorescente
Hybridation moléculaire (sondes ADN/ARN)
+Ne nécessite pas de cellules en division (métaphase ou interphase)
Bonne résolution
Outil de recherche
-Etude ciblée (sonde spécifique)
Les différents types de sonde
Cytogénétique moléculaire:
FISH: Fluorescent in situ hybridization:
Sondes télomériques
- Constitutionnelle (l'ensemble de l'individu porte la même anomalie) ou acquise
- Équilibrée (il n'y a ni perte ni gain de matériel génétique) ou déséquilibrée
- Homogène (toutes les cellules ) ou en mosaïque (certaines cellules)
• Anomalies du degré de ploïdie Ex: 69, XXX
• Anomalies de nombre : 2n +/- 1,2,3
Exemple: 47, XY, +21
Les anomalies chromosomiques
Les anomalies chromosomiques
Translocation robertsonienne
Translocation réciproque équilibrée
Chromosomes acrocentriques :
13, 14, 15, 21 et 22
Ex: 45, XY, der(14,21)(q10; q10)
Ex: 46, XX, t(7,8)(q11.1; q21.2)
Nomenclature à connaître!
?
Les anomalies chromosomiquesAnomalies de structure
délétion inversion duplication isochromosome
Exercice 2
Exploration d’une anomalie chromosomique
Figure 3
Figure 4A- pcp 3q: sonde spécifique du bras long du chromosome 3 –
subtel 3q: sonde subtélomérique spécifique du bras long du chromosome 3
B- cen 12: sonde spécifique du centromère du chromosome 12 –
subtel 12p: sonde subtélomérique spécifique du bras court du chromosome 12
subtel 3q
pcp3q
subtel 3q
pcp3q
subtel 3q
subtel 3q
pcp3q
pcp3q
FISH 4A: sondes chromosome 3
Figure 3
Figure 3
FISH 4B: sondes chromosome 12
subtel 12p
cen12cen12
subtel 12p
Exercice 2 Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization
Préparation de l’ADN
Hybridation sur support contenant les sondes (« puce »)
Acquisition des signaux d’hybridation
Analyse quantitative des données
→ Plus résolutif qu’un caryotype classique : cf nombre de sondes sur le support
Mais on ne voit pas les chromosomes
Anomalie équilibrée ?
Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization
+ = Gain- = Perte
IR =
Intensity Ratio
Figure 5
subtel 3q
pcp3q
subtel 3q
pcp3q
subtel 3q
subtel 3q
pcp3q
pcp3q
FISH 4A: sondes chromosome 3
Figure 3
3q26.31
