Synthèse du protohème par la levure Saccharomyces cerevisiae

BIOCHIMIE, 1~J72, 54, 513-528.

Synthbse du protohbme par la levure Saccharomyces cerevisiae. II. Influence exerc6e par le glucose sur l 'adaptation respiratoire.

Pierre LABBE, Genevi6ve DECHATEAUBODEAU et R o s i n e LABBE-BoIs.

Laboratoire de Chimie Biologique, ,Service d'Enzymologie, Universit~ Paris VI, 96, Bd Raspail, Paris 6 ~.

(21/3/1972).

Summary. - - The add i t ion of glucose, in presence of oxygen, to rest ing cells f rom Saecharomyees cereoisiae anaerobica l ly grown wi th glucose as carbon source, is fol lowed by :

- - cytochrome a -1- an, b, ca and c synthes is and cytochrome c oxidase and succinate cytoehrome e reduetase act ivi t ies ( respi ra tory adap ta t ion) ; the speed of these syntheses depends on in i t ia l glucose concen t ra t ion in the adap ta t ion med ium (~cont re effet Pasteur>>) : t he less glucose, the f a s t e r is the adap ta t ion (Slonimski [41) ;

- - the rapid d i sappearance of ~ALA synthe tase (less t h a n 1 hour) which is not reco- vered for 9 hours at 25 ° ; however, the presence of large quan t i t i e s of free ~ALA at the beg inn ing of the r e sp i ra to ry adap ta t ion expla ins resp i ra to ry cha in l inked eytoehrome fo rma t ion ;

--- the fas t d i sappearance of one (or more) enzyme(s) of the p ro tohaem synthes is chain located be tween porphobi l inogen and p ro toporphyr in ; the lost enzyme, which could be the enzymic complex PBG desaminase -u roporphyr inogen III cosynthetase is synthe- sized de novo when glucose has d isappeared f rom the resp i ra to ry adap ta t ion medium.

The mechan i sm of these enzymic act ivi t ies d isappearances does not seem to depend on inh ib i t o ry protein(s) synthes is induced by glucose. The same p h e n o m e n a are observed when yeas t res t ing ceils are incuba ted w i t h glucose in the absence of oxygen.

S imi la r resul t s are obta ined w i th res t ing cells f rom aerobical ly grown yeast wi th glucose as ca rbon source.

However, for anaerobica l ly grown yeast w i th galactose as ca rbon source, the respi- r a to ry adap ta t i on of which is ve ry fast , glucose addi t ion does not induce the disap- pearance of porphobi l inogen ~- p ro topo rphy r in : 8ALA synthe tase disappears even in the absence of glucose.

These resul t s are discussed in corre la t ion wi th yeast resp i ra to ry a d a p t a t i o n ; par t i - cularly, glycogen m e t a b o l i s m ( format ion and degradat ion) by yeast res t ing cells dur ing resp i ra to ry adap ta t i on ( involving changes of glycolytic metabol i te i n t r ace l lu l a r concen t ra t ion) could p lay an i m p o r t a n t role w i t h the onset of << conlre effet Pas teu r >> and consequent ly w i t h cytochrome fo rma t ion at the level of haem format ion .

I N T R O D U C T I O N .

Les ce l lu l e s de l a l e v u r e Saccharomyces cereoisiae p r o v e n a n t de c u l t u r e s a n a 6 r o b i e s n e poss~- d e n t p a s de m i t o c h o n d r i e s n i de c h a l n e r e s p i r a - t o i r e [1, 2~, m a t s e11es p o s s b d e n t des p r o m i t o e h o n - d r i e s [2, 3]. A6r6es h 1'6tat de <<rest ing ce l l s >), d a n s u n m i l i e u t a m p o n n 6 ( pH 4,5) c o n t e n a n t u n e s o u r c e d ' 6 n e r g i e e o m m e le g lucose , e l les e f f e c t u e n t e n q u e l q u e s h e u r e s la s y n t h b s e d u s y s t 6 m e r e s p i r a - to i r e , e t e n p a r t i c u l i e r ce l l e des c y t o c h r o m e s , e n m 6 m e t e m p s q u ' a p p a r a i s s e n t des m i t o c h o n d r i e s f o n c t i o n n e l l e s : e ' e s t le p h 6 n o m ~ n e de l ' a d a p t a t i o n r e s p i r a t o i r e , d o n t l ' o x y g ~ n e m o l 6 c u l a i r e es t l ' i n - d u c t e u r s p 6 e i f i q u e [1, 4].

B i e n q u e le m 6 c a n i s m e de l ' a d a p t a t i o n r e s p i r a - t o i r e so i t e n c o r e i n c o n n u , o n s a i t c e p e n d a n t q u e

la v i t e s s e de l ' a d a p t a t i o n r e s p i r a t o i r e d 6 p e n d e s s e n t i e l l e m e n t de la n a t u r e de la s o u r c e de ea r - b o n e a y a n t s e r v i ~t la c r o i s s a n c e a n a 6 r o b i e ; e n effet :

- - q u a n d la c r o i s s a n c e a n a 6 r o b i e de la l e v u r e s ' e s t e f fec tu6e a v e c le g lucose c o m m e s o u r c e de c a r b o n e , l ' a d a p t a t i o n r e s p i r a t o i r e est r 6 p r i m 6 e p a r de f o r t e s c o n c e n t r a t i o n s en g lucose ( c o n t r e - e f f e t Pasteur) [4~ ; de rou te f a c o n , l ' a d a p t a t i o n r e s p i r a - t o i r e m e s u r 6 e e n p r 6 s e n c e de g lucose , es t u n p h 6 - n o m 6 n e l en t , d o n t l ' a c h 6 v e m e n t d e m a n d e p l u s i e u r s h e u r e s (6 h 12 h e u r e s ) ;

- - q u a n d la c r o i s s a n c e a n a 6 r o b i e de la l e v u r e s ' e s t e f fec tu6e a u x d 6 p e n s d u ga lac tose , l ' a d a p t a - t i o n r e s p i r a t o i r e est si r a p i d e q u ' e l l e a l i eu d u r a n t la r 6 c o l t e de s ce l l u l e s de l e v u r e a n a 6 r o b i e [51 ;

514 P. L a b b e , G. D e c h a l e a u b o d e a u e l R . L a b b e - B o i s .

les cellules r6colt6es pr6sentent d6s le temps 0 de l ' adapta t ion respiratoire, routes les caract6risti- ques de la levure a6robie [5, ,6].

Nous avons pr6c6demment 6tabli que toutes les activit6s enzymatiques cor respondan t aux diff6- rentes 6tapes de la synth6se du protoh6me sont pr6sentes aussi b ien chez les cellules p rovenan t de cultures a6robies que chez Its cellules p rovenan t de cultures ana6robies [7]. Cette 6tude m6ri tai t d'6tre compl6t6e par la recherche quant i ta t ive de la var ia t ion 6ventuelle de ces diff6rentes activit6s au cours de l ' adapta t ion respira toi re de cellules cultiv6es avec le glucose ou le galactose comme source de carbone.

TECHNIQUES.

La souche utilis6e est la souche ¢ yeast foam >>, diploide d e S a c c h a r o m y c e s cerevis iae .

1. C o m p o s i t i o n des m i l i e u x de cu l ture :

- - Cultures ana~robies : mi l ieu h l 'extrai t de levure pr6c6demment d6crit [7] dont le substrat carbon6 est soit ]e glucose, soit ]e galactose (50 g/l) ;

cul tures adrobies : mi l ieu ident ique au pr6- c6dent, mats exempt d'ergost6rol et de Tween 80.

2. Condi t ions de cul ture et de rdcolte :

Les pr6cultures et cultures ont 6t6 r6alis6es h 25 ° ; l ' ensemenccment d 'une cul ture est effectu6 "5 par t i r d 'une pr6cul ture a6robie de 500 ml, r6ali- s6e sur le mSme mil ieu et pa rvenue en phase sta- t ionna i re de croissance. Les cul tures sont r6ali- s6es h l 'a ide d ' un fermenteur de 50 litres conte- nan t 20, 30 ou 50 litres de mi l ieu selon la tech- nique ant6r ieurement d6crite [8].

La r6colte est toujours effectu6e au mil ieu de la phase exponent iel le d e croissance (6 g6n6rations en ana6robiose).

3. Cond i t ions d 'adapta t ion des levures (dr 25 °) :

Apr6s r6colte et lavage, les cellules de levure sont raises h incuber pendan t un temps d6termine /~ ra ison de 10 g poids frais par l i tre de tampon KH2PO 4, 0,073 M, pH 4.5, con tenan t ou non un substrat carbon6 (glucose, galactose) et 6ventuel- leincnt un inh ib i t eu r des synth6ses prot6iques (cycloheximide ou chloramph6nicol) ; l ' a6rat ion est assur6e par in jec t ion d 'a i r st6rile (1 1/min/1 de milieu) et l 'homog6n6it6 par rotat ion rapide d 'un barreau aimant6. L ' incuba t ion ana6robie a 6t6 r6a- lis6e par in jec t ion cont inue d'Azote U (moins de 5 ppm d'O2) , le t ampon ayant 6t6 au pr6alable satur6 d'Azote U pendan t 1 h 30. A la fin des incu-

bations, les cellules de levure sont collect6es par centr i fugat ion (5 m i n h 6 00~) g) et lav6es par cen- t r i fugat ion avec de l 'eau distill6e glac6e.

La vitesse de resp i ra t ion des cellules a 6t6 me- sur6e par la m6thode oxypolarographique en utili- sant une 61ectrode de Clark et un apparei l Gilson << Oxygraph >> ; les mesures ont 06 effectu6es ~ 30 ° dans la cellule de 5 ml en tampon KHzPO4, 0,073 M, pH 4.5, apr6s addi t ion de glucose (1 p. cent final). Les r6sultats sont exprim6s en QO 2 (:~1 O2/heure/ mg poids sec).

4. Au tres t e chn iques C) .

La m6thode de f rac t ionnement eel lulaire permet tant d 'ob ten i r l 'homog6nat H, la f ract ion solu- ble S e t la f ract ion par t icu la i re P, la mesure des activit6s enzymatiques relatives ~ la synth6se du protoh6me, le dosage des prot6ines et les spectres d 'absorp t ion des cellules enti6res (T ° = - - 196°), ont 0 6 effectu6s selon les techniques pr6c6dem- ment d6crites [7].

L'activit6 succinate cytochrome c oxydo r6duc- tase (EC 1-3-99-1) a 6t6 mesur6e ~ 30 ° d a n s les condi t ions du test d6crit par Ohaniance et colt. [93.

L'activit6 cytochrome c oxydase (ferrocyto- chrome c-O2-oxydor6ductase EC 1-9-3-1) est esti- m6e spect rophotom6tr iquement (hemM = 21,1 h )~ = 550 nm), d 'apr6s la vitesse d 'oxydat ion h 3,0 ° du cytochrome c r6dui t [10, l l ] .

Les activit6s 6&LA d6shydratase, ferroch61atase, succinate cytochrome c oxydor6ductase, cytochrome c oxydase, et la synth6se des po rphyr ines totales ont 6t6 mesur6es sur les fract ions subcellulaires (H, S o u P) pr6alablement dialys6es 18 h h 4 °, contre 20 volumes de K,AIPO4, 0,1 M, pH 7.2.

L'activit6 5A~LA synth6tase a 6t6 mesur6e sur les f ract ions H dialys6es duns les m~mes condi t ions contre le m~me t ampon contenant du phosphate de pyr idoxa l 1,3.1.0 -4 M (*).

La mesure des quantit6s de glucose dans le nil- lieu d 'adapta t ion a 0 6 effectu6e par la m6thode

(*) Abrdviations utilisdes : 6ALA : acide 8amino-ldvulinique. ATP : ad6nosine triphosphate. CoASH : eoenzyme A. NADH : nicotinamide ad6nine dinuel4otide rdduit. PBG : porphobilinog6ne. PLP : pyridoxal phosphate. Proto : protoporphyrine. - - Origine des produits chimiques. Boehringer (ATP, CoAsH, acetoglutarate, NADH). Fluka (SALA, PLP). Prolabo (autres produits). (*) La dialyse n'affecte pas les activit6s enzyma-

tiques consid4r6es.

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.

Synthdse du protoh~me par la levure. 515

e n z y m a t i q u e (g lucose o x y d a s e : g l u c o s t a t X 4 Worthinfton).

Les e x p 6 r i e n c e s que n o u s p r 6 s e n t o n s o n t 6t6 r6p6 t6es p l u s i e u r s fo i s ; i l ex i s t e des d i f f 6 r e n c e s q u a n t i t a t i v e s e n t r e les v a l e u r s a b s o l u e s des ac t iv i - t6s e n z y m a t i q u e s m e s u r 6 e s au c o u r s d ' e x p 6 r i e n c e s i d e n t i q u e s , m a i s l ' a l l u r e g 6 n 6 r a l e d u p h 6 n o m ~ n e r e s t e l a m 6 m e : e n c o n s 6 q u e n c e , c h a q u e t a b l e a u o u f igure r e p r 6 s e n t e u n e e x p 6 r i e n c e .

RE, S U L T A T S .

v a r i a t i o n du QO 2 et la v i t e s s e de d i s p a r i t i o n d u g lucose ) m o n t r e n t q u e la r 6 p r e s s i o n p a r le g lucose de l ' a d a p t a t i o n r e s p i r a t o i r e es t s e n s i h l e m e n t la m 6 m e d u r a n t les t r o i s p r e m i 6 r e s h e u r e s d ' a 6 r a t i o n en p r 6 s e n c e de g lucose 0,2 p. c e n t et en p r 6 s e n c e de g lucose 2 p. cen t . E n r e v a n c h e , a p r 6 s la 3 ~ h e u r e d ' a 6 r a t i o n , l ' e s s a i c o n t e n a n t i n i t i a l e m e n t 0,2 p. c e n t de g lucose (et qu i n ' e n c o n t i e n t p lu s ) p r 6 s e n t e u n e acc616 ra t i on de sa v i t e s s e de r e s p i r a t i o n b e a u c o u p p lu s i m p o r t a n t e que l ' e s s a i qu i c o n t i e n t e n c o r e d u g lucose (essa i en p r 6 s e n c e de g lucose 2 p. c e n t i n i - t i a l ) ;

A. E F F E T S E X E R C E S P A R LE G L U C O S E S U R L ' A D A P -

T A T I O N R E S P I R A T O I R E D E S << R E S T I N G C E L L S >> ( f i g . 1 ,

2, 3 - - T a b l e a u I).

I1 est b i e n c o n n u que le g l ucos e r 6 p r i m e la s y n - t h~se d e s e n z y m e s r e s p i r a t o i r e s l o r s de 1 ' a d a p t a - t i o n r e s p i r a t o i r e des << r e s t i n g ce l l s >> de l e v u r e p r o v e n a n t de c u l t u r e s a n a 6 r o b i e s r6a l i s6e s a v e c le g lucose c o m m e s o u r c e de c a r b o n e (<< c o n t r e - e f f e t P a s t e u r ) [4]. D a n s n o s c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s ,

Qo, (~, 0 , /~ / . . . . . ,, ...)

,, ..... (-,/~,)

50 :. •

15 2) , o . (2) .........,...

20-

~ . ~ : : : _ ' . . . . . . . . . . . . :::::.~:.~ (0)=

heure$ d'o~ration(25 °)

Fro. 1. - - Evolu t ion du QO~ (en ~ l O J h / m g poids see) et 6volut ion de la concent ra t ion en glucose dans le mi l ieu d ' i ncuba t ion (eu mg/ml ) au eours de l ' a6ra t ion h 25 ° des << res t ing cells >> de levure en prdsence de glucose h deux concent ra t ions : 0,2 p. cent et 2 p, cent.

i $ - - • glucose 0,2 p. cent QO2 © . . . . . O glucose 2 p. cent

~. [] . . . . . . . n sans glucose

glucose I ~ . . . . . . ~ glucose 0,2 p. cent + ................ + glucose 2 p. cent

ce t ef fe t r 6 p r e s s e u r d u g lucose es t c l a i r e m e n t m i s e n 6 v i d e n c e ; e n ef fe t :

- - les c o u r b e s de la f igure 1 ( d o n n a n t , e n fonc - t i o n d u t e m p s d ' a 6 r a t i o n h 25 ° des << r e s t i n g ce l l s >> e n p r 6 s e n c e de g l ucos e 0,2 p. c e n t o n 2 p. c en t , la

500 550 600 ~nm

FIG. 2. -- Speetres d ' absorp t ion h basse t empdra tu re (--196 ° ) des cellules de levure avan t et apr6s 3, 6 et 9 heures d ' a6ra t ion h 25 ° h l '6tat de • res t ing cells >> en pr6sence de glucose h deux concent ra t ions : 0,2 eL 2 p. cent.

A = temps 0

B = 3 h 1 C = 6 h d 'a~ra t ion -F glucose 2 p. cent D = 9 h

E = 3 h 1 F : 6 h d ' adra t ion + glucose 0,2 p. cent G = 9 h

- - la f igure 2 ( r e p r 6 s e n t a n t les s p e c t r e s h b a s s e t e m p 6 r a t u r e des ce l lu l e s e n t i 6 r e s e o r r e s p o n d a n t h ces d i f f 6 r e n t s t e m p s d ' a 6 r a t i o n des << r e s t i n g ce l l s >> e n p r 6 s e n c e de g lucose 0,2 ou 2 p. c en t ) sugg~re u n e co r r61a t i on , p a r t i c u l i 6 r e m e n t n e t t e au n i v e a u de la c y t o c h r o m e o x y d a s e (~'max = 603 n m ) , e n t r e l ' i n t e n s i t 6 d u s p e c t r e c y t o c h r o m i q u e et la p l u s o u m o i n s g r a n d e v i t e s s e d ' a c c r o i s s e m e n t d u QO 2 (cf. fig. 1).

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.

516 P. Labbe, G. Dechateaubodeau et R. Labbe-Bois. On eonstate 6galement ('fig. 3, tableau I), une cor-

r61ation entre la var ia t ion des activit6s succinate cy lochrome c r~ductase et cy tochrome c oxydase (mesur6es sur des homog6nats H p rovenan t des cellules a6r6es en pr6sence de glucose 0,2 ou 2 p. cent), e t l a var ia t ion du QOo ou le spectre cyto- ch romique des cellules enti6res suivant le temps d 'a6rat ion en pr6sence de glucose 0,2 p. cent ou en pr6sence de glucose 2 p. cent ; pa r exemple, l 'act i - vit6 cy tochrome c oxydase est sensiblement la m~me au temps 3 heures d 'a~rat ion pour les ¢ res- t ing cells ~> incub6es en pr6sence de glucose 0,2 p. cent que pour celles qui sont incub~es en pr6sence de glucose 2 p. cent ; mats elle pr6sente une activit6 spScifique 3 lois plus grande chez les eellules a6r6es pendan t 9 heures en pr6sence de glucose 0,2 p. cent que chez les cellules a6r&s en pr6sence de glucose 2 p. cent.

La forte augmentat ion de diff6rents param6tres de l 'act ivi t6 resp i ra to i re mi tochondr i a l e (QO2 des cellules enti6res, spectres cy tochromiques , activi-

acfivite Cytochtome • oxydose

1.~0 (.,ol.,,,o,h . . . . . . . ,,,/"/,,f,,o'O'"','.") / / i vltesse de synth6se de |o protoport)hytlne / ( . . . . . ' . , /h/mg pro t ' i nes de H) (0)2)

• 1.000 0,1 "*~

~oo o,os " ,~ (2)

• / / / ,-7-"

,

0 3 6heures dtmerotion (~5o)

Fzo. 3. - - Evolution de l'activit6 cytochrome c-oxydase (en nmoles de cytochrome c oxydd/h/mg pro- t6ines) et de la vitcsse de synth6se de la protoporphyrine (*) (en nmoles/h/mg prot6ines) d'homog6nats H provenant de << resting cells >> de levure a6r&s 3, 6 ou 9 heures h 25 ° en pr6sence de glucose h 2 concen- trations : 0,2 p. cent et 2 p. cent.

protoporphyrine { ~ _ _ _ ~ glucOseglucose 0,22 p. p'centcent

• • glucose 0,2 p. cent cytoehrome c-oxydasc O - - - - - © glucose 2 p. cent

U) A partir de 8ALA.

t6s enzymatiques) n 'a done l ieu qu 'une fois le glucose ext6r ieur d isparu ; il s 'agit main tenant de vo i r s ' i l existe une corr61atiou entre les activit6s de synth~se du pro toh6me des extrai ts acel lulaires (puisque le pro toh6me est le g roupement prosth6-

t ique des cy tochromes de type b et c et le pr~em,- seur de l 'h~me a) et :

1 °) la faible synth~se (r~pression) des enzymes resp i ra to i res duran t les 3 p remieres heures de l ' adapta t ion resp i ra to i re en prdsence de glucose 0,2 et 2 p. cent ;

2 °) la forte augmenta t ion (d6r6pression) de eette synth~se quand le glucose a d isparu du mi l ieu ext6rieur.

500 550 600 ~nm

FIG. 4. - - Spectres d'absorption h basse temp6raturc (--19'6 °) des cellules de levure avant et apr6s 3 heures d'a6ration h 25 ° h l'6tat de ¢ resting cells )> en p r6- sence ou en absence de glucose 2 p. cent.

A ---- temps 0 B : 3 h d'a6ration sans glucose C = 3 h d'a~ration + glucose 2 p. 100

B . ]~FFETS DU (~LUCOSE AU NIVF~t~ DES DIFF]~-

RE~NTES ]~TAPES DE L k SYNTHESB DU PROTOH~M]~ PAB.

LES RXTRAITS ACEIaLULkIRESI (fig. 3 et 4 ; tableaux I et II).

Nous avons montr~ dans un pr~c6dent t ravai l [7] que la levure cultiv6e en ana6robiose poss~de tonics les activit6s enzymat iques impl iqu6es dans la synth~se du protoh6me. La mesure de ces acti- vit6s au cours de l ' adaptaf ion resp i ra to i re r6alis6e en pr6sence de glucose 2 p. cent ou 0,2 p. cent, mon t re que (fig. 3 ; tableau I) :

- - les activit6s 8ALA synth6tase et de synth6se des po rphy r ine s totales (*) ne sont plus ddcelables dans les extrai ts apr~s 3 heures d 'a6rat ion des celIules de levure en p resence de glucose 0,2 p. cent ou 2 p. cent ;

- - l a dispar i t ion de ces activit6s enzymat iques en pr6sence de glucose est un ph6nom~ne rapide ,

(*) La synth~se des porpbyrines totales correspond h la formation de protoporphyrine h partir du 8ALA ; la non formation de protoporphyrine correspond h la disparition d'au moths une enzyme participant h Fen- semble de r~aetions PBG > protoporphyrine puisque la 8ALA deshydratase est toujours pr~sente.

BIOCHIM1E, 1972, 54, n ~ 4.

Synth~se du protoh~me par la levure. 517

d ' au t r e s e x p 6 r i e n c e s nous ayan t m o n t r 6 q u ' a u bou t d ' u n e h e u r e d ' a 6 r a t i o n ces ac t iv i t6s ava i en t dis- p a r u ;

La d i s p a r i t i o n des ac t iv i t6s e n z y m a t i q u e s 6ALA syn th6 tase et de syn thbse des p o r p h y r i n e s to ta les aprbs 3 h e u r e s d ' a6 ra t ion , s emble l i6e h la p r 6 s e n c e

TABLEAU I.

Comparaison des activit6s enzymatiques (exprim6es en nmoles de produit f o r m 6 / h / m g de prot6ines) d'homogSnats (H), fractions solubles (S) et part ieu- laires (P), provenant de levures cu]tiv6es en ana6robiose, avant et apr6s a6ration de 3, 6 et 0 heures h 25 ° , en tampon KH~PO4, 0,073 M, pH 4,5 glucos6 h 0,2 et 2 p. cent.

L'activit6 5ALA synth~tase a 6t6 mesur~e ~t par t i r du succinate (I) ou de l ' t tcetoglutarate (II). La format ion de la protoporphyrine a 6t6 mesur6e h part i r du 5ALA comme substrat.

Les speetres des eellules de levure correspondant aux conditions (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G) sont donn6s figure 2.

Activit5 mesur6e (n moles/h/mg prot.)

Succinothiokinase (s) [

i i

?~ ALA I I Synth6tase II

(H)

ALA D6shydratase

(S)

Porphyrines totales (en proto.)

(H)

Ferroch61ataSe(p)

Succinate cyto. c rdductase I - O - (H)

Cyto. c oxydase (H)

Temps

] i Glucose 2 p. cent

0 (A) : 3 (B) 6 (C) 9 (D) L - - -

,, 100 140 1 70 110

l

, , 4 ! i _ 0 o o 3,5 0

~ - , 2 2,3 1,6

0,11 0 0

d'a6ration ten heures) des cellules de levure (25 o) en presence de:

20

Glucose 0,2 p. cent

3 (E) 6 (F) 9 (G)

80 120 80

0 0 0

o

1,3 1,8 1,2

7,9

40

l

60

8,3

lOO

180

1,2

0,06

3,6

425

540

60

80

0,09

4,4

280

450

0,09

4,8

970

1540

- - ce t te d i s p a r i t i o n des ae t iv i t6s n ' e s t pas re le - v6e p a r d ia lyse ; un ex t r a i t i nh ib6 (i.e. sans ac t i - vit6) n ' e n t r a i n e pas 1 ' i nh ib i t ion d ' u n ex t r a i t ac t i f q u a n d on les m61ange ;

- - l ' a c t i v i t 6 5&LA syn th6 tase n ' e s t de tou te f acon p lus d6ce lab le (dans nos c o n d i t i o n s exp6r i - men ta l e s ) , que l que soi t le t e m p s d ' a 6 r a t i o n ; au c o n t r a i r e , la syn th~se des p o r p h y r i n e s to ta les r b a p p a r a i t au t e m p s 6 h e u r e s (g lucose 0,2 p. cent) et au t emps 9 h e u r e s (g lucose 2 p. cent) jus te avan t la fo r te a u g m e n t a t i o n des p a r a m O r e s de l ' a c t iv i t6 r e s p i r a t o i r e ;

- - les ac t iv i t6s s u c c i n o t h i o k i n a s e , 5ALA d6shy- d r a t a se et fe r roch61a tase r e s t en t p r6sen te s tout au l o n g de ] ' a6ra t ion .

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.

du g lucose c o m m e le m o n t r e le t a b l e a u 2 off l ' a6ra- t i on des cel lules , en absence de glucose, ne c o n d u i t h a u c u n e d i s p a r i t i o n de ces ac t iv i t6s et n ' e n t r a i n e 6 v i d e m m e n t a u c u n e a d a p t a t i o n r e s p i r a t o i r e (me- sur6e au n i v e a u des ac t iv i t6s c y t o c h r o m e c oxydase et s u c c i n a t e c y t o c h r o m e c o x y d o - r 6 d u c t a s e ) . Le s p e c t r e d ' a b s o r p t i o n des l e v u r e s a6r6es en absence de g lucose (fig. 4-B) ne p r6sen t e que les b a n d e s d ' a b s o r p t i o n du c y t o c h r o m e b 1 (a 1 = 558 ; so = 552 nm) et de la Z n - p r o t o p o r p h y r i n e (a = 583,5 nm) c o m m e la l e v u r e << t e m p s O >> (fig. 4-A). Cet ie e x p 6 r i e n c e s i m p l e p e r m e t d o n c d ' 6 c a r t e r l ' h y p o t h b s e d ' u n rSle 6ven tue l de l ' o x y g b n e au cou r s de la d i s p a r i t i o n des ac t iv i t6s e n z y m a t i q u e s 5ALA syn th6 tase et de syn thbse des p o r p h y r i n e s totales .

35

518 P. Labbe, G. Dechateaubodeau et R. Labbe-Bois.

I1 ressort donc de nos exp6r iences :

1 ~') que l ' add i t ion du glucose aux <<resting cells >> de levure ent ra ine la d ispar i t ion de l 'act i - vit6 8ALA synth6tase et la d i spar i t ion d 'au moins une activit6 enzymat ique du cha inon PBG - - 9 pro to ;

2 ° ) qu 'une fois le glucose d isparu du mi l ieu ext6rieur, seule l 'act ivi t6 enzymat ique du cha inon PBG - - 9 proto, r6apparai t .

Bottomley et coll. [121 ayant observ6 une inhi- b i t ion par le 5ALA l ibre de l 'act ivi t6 6A,LA synth6- tase de mi tochondr i e s de cellules de moelle os- seuse, nous avons v6rifi6, avec nos extrai ts enzymat iques (d 'ai l leurs dialys6s), que la fo rmat ion de 5&LA n'est pas inhib6e en pr6sence de 5ALA libre.

des cy tochromes pendan t l ' adapta t ion respi ra to i re , h condi t ion que ce 5ALA l ibre cor responde h du 8ALA pr6-exis tant dans la cellule entibre avant broyage.

I1 semble donc exister une corr61ation entre les param6tres exp6r imentaux de l ' adapta t ion respira to i re mesur6s in vivo et les activit6s enzyma- t iques de synthbse du protoh6me, mesur6es in vitro ; il convien t de dire h c e propos que la quan- tit6 de po rphyr ines in t racel lu la i res au temps O de l ' adapta t ion resp i ra to i re (1 h 2 nlnoles/g poids frais de levures) [10, 401 ne peut en aucun cas r endre compte de la fo rmat ion de la totalit6 des noyaux h6mat in iques des cy tochromes form6s pendan t 9 heures d ' adapta t ion (45 h 50 nmoles /g

TABLEAU II.

Comparaison des activit6s enzymatiques (exprim6es en nmoles de produit form6/h/mg prot~ines) d'homog6nats (H), fractions solubles (S) et particulaires (P) provenant de levures cultiv~es en ana6robiose, avant et apr6s a6ration de 3 heures h 25 ° , en tampon KH2PO4 0,073 M, pH 4,5, glucos6 A 2 p. cent ou non.

Les spectres des cellules de levure correspondant aux conditions (A) (B) (C) sont donn6s figure 4.

Activit6 mesur6e nmoles/h/mg prot.)

Succinothiokinase (s)

ALA I Synth~tase

(H) I I

ALA D~shydratase

(s)


(H)

Ferroch61at ase (P)

Succinate cyto. c. r6ductase (H)

Cyto. c oxydase (n)

Temps d'a~rat ion des cellules de levares (en heures) 'h 25* :

3 + Glucose 0 (A) 3 (B) 2 p. cent IC)

170 60 70

1,2 1,1 0,3

1,2 0,9 0

1 2,3 2,3

0,06 0,07 0

3 2,4 6,9

0 0 230

85 55 1260

D'autre part , nous avons constat6 la pr6sence de quantit6s impor tan tes de 8ALA l ibre au temps O de l ' adapta t ion resp i ra to i re (2 h 4 nmoles /mg pro- t6ines cellulaires) ; ces quantit6s pour ra i en t assez bien r endre compte de la fo rmat ion de la totalit6

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.

poids frais). Nous avons 6galement v6rifi6 que durant 1 'adaptation respi ra to i re , la levure n 'ex- cr6te pas de po rphy r ine s dans le mil ieu d 'adapta- t ion et que la quantit6 de po rphy r ine s in t racel lulaires reste constante (1 h 2 nmoles /g poids frais).

Synth~se du pro tohdme par la levure.

C. RECHERCtIE DU MECANISME DE LA DISPARITION

DE L'ACTIVITI~ DE SYNTHI~SE DES PORPH~RINES

TOTALES ET DE L'ACTIVIT]~ 8A,LA SYNTHETASE (fig. 5 ; t ab l eau I l I ) .

1 °) Incubation des cellules de levure en presence de glucose et en absence d'oxgg~ne.

L ' i n c u b a t i o n a n a 6 r o b i e des ce l lu les de l e v u r e en p r 6 s e n c e de g lucose ( tab leau III , fig. 5C)

519

2) Ef[ets des inhibiteurs des syntheses prot~i- ques (chloramph~nic'ol, cycloheximide) ajout~s au temps 0 de l'adaptation respiraloire.

E t a n t donn6e la c o m p l e x i t 6 du ph6no ln6ne de d i s p a r i t i o n i n d u i t e p a r le g lucose des ac t iv i t6s de syn thbse du p ro toh6 lne , nous avons v o u l u v o i r si ce p h 6 n o m 6 n e ne p o u v a i t pas d 6 p e n d r e - - clans u n e c e r t a i n e m e s u r e - - de l ' i n d u c t i o n p a r le glucose d ' u n e (ou p lus i eu r s ) p r o t 6 i n e i n h i b i t r i c e des

TABLE, AU III .

Comparaison des activit6s enzymatiques (exprim6es en nmoles de produit f o r m 6 / h / m g prot6ines) d 'homog6nats (H), fractions solubles (S) et particulaires (P) provenant de levures cultiv6es en ana6robiose, avant et apr6s 3 h d ' incnbation h 25 °, en tampon KH~PO4, 0,073 M, pH 4,5, soit en presence d 'air de glucose 2 p. cent et de chloramph6nicol (4 mg/ml) ou de cycloheximide (0,02 mg/ml) , soit en pr6sence d'Azote et de glucose 2 p. cent.

Les spectres des cellules de levure correspondant aux conditions (A), (B), (C), (D), (E) sont donn6s figure 5.

Aetivit6 mesur~e {nmoles/h/mg prot.)

ALA Synth6tase

(H) II

ALA D6shydratase

(S)


(H)

Ferroehelatase (P)

Succinate cyto. c r6ductase

(H)

Temps d'iacubati0n (en heures) des cellules de levure en pr6sence de glucose 2 p. cent et :

d'azote

3 (B) 3 (-~c)N~ 0 {A)

0,2

3,7

9,5

0,3

d'air

3 + CAP 3 + eyelo.

0,4

100

I 2,2

3,7

1,7

0,08

5,5

25

120

2,7

(D) {E}

0 0,7

0 1,2

3,7 0,7

0 0,06

6 6

35 6

270 160

65

Cyto. c oxydase 565 235 (H)

en t r a ine , dans nos c o n d i t i o n s op6ra to i r e s , une 16g6re a u g m e n t a t i o n des ac t iv i t6s e y t o c h r o m e c o x y d a s e et s u e c i n a t e c y t o c h r o m e c r 6 d u c t a s e p a r r a p p o r t au t emps 0 ; le s p e c t r e h 6 i u a t i n i q u e de ces l evu re s (fig. 5-c) ne m o n t r e pas de b a n d e s d ' a b s o r p - t ion c o r r e s p o n d a n t aux c y t o c h r o m e s de la c h a i n e r e s p i r a t o i r e . C e p e n d a n t , on cons t a t e que la syn- th6se des p o r p h y r i n e s to ta les et l ' a c t iv i t6 6ALA syn th6 tase d i s p a r a i s s e n t c o m m e dans le eas de la l e v u r e i neub6e en p r 6 s e n c e d ' oxygbne . La pe r t e de ces ac t iv i t6s d 6 p e n d r a i t d o n e d ' u n p r o c e s s u s d i r e c t e m e n t li6 au m 6 t a b o l i s m e du glucose.

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.

ae t iv i t~s e n z y m a t i q u e s cons id6r6es dans ce t ra - vai l .

A cet effet, nous avons ut i l i s6 2 i n h i b i t e u r s des syn th6ses p r o t 6 i q u e s chez la l e v u r e :

a) le c h l o r a m p h 6 n i c o l (CAP, 4 m g / m l de m i l i e u d ' a d a p t a t i o n ) qu i i n h i b e les syn thbses p r o t 6 i q u e s i n t r a m i t o c h o n d r i a l e s ; i l i n h i b e l ' a d a p t a t i o n re sp i - r a to i r e , et en p a r t i c u l i e r , la f o r m a t i o n des cy to- c h r o m e s a A- az, b et c r Les ac t iv i t6s cyto- c h r o m e c o x y d a s e et s u c c i n a t e c y t o c h r o m e c r6duc t a se sont f o r t e m e n t d i m i n u 6 e s p a r r a p p o r t

36

520 P. Labbe, G. Dechateaubodeau el R. Labbe-Bois.

au t6moin adapt6 p e n d a n t 3 heures ( tableau I I I ) ; cependant , l ' add i t i on de ch lo ramph6n ico l reste sans effet sur la d i s p a r i t i o n des act ivi t6s 8AI, A synth6tase et du cha inon PBG - - ~ - proto.

b) la cyc lohex imide (cyclo. 0,02 m g / m l de mi- l ieu d ' adap ta t ion ) qui inh ibe les synthbses p ro- t6iques c y t o p l a s m i q u e s : elle inh ibe to ta lement l ' adap t a t i on r e sp i r a to i r e ( tableau III) , mats, elle inh ibe aussi la d i spa r i t i on ( indui te p a r le glucose) des act ivi t6s ~ALA synth6tase et du cha inon PBG - - ) - p r o t o ; ces act ivi t6s enzymat iques subs is tent apr~s 3 heures d ' adap t a t i on r e sp i r a -

O'IA [

1

500 550 600 "X nm

Fro. 5. - - Spec t re s d ' a b s o r p t i o n h b a s s e t e m p e r a t u r e ( - -196 °) des ce l ln l e s de l e v u r e a v a n t et apr~s 3 h e u r e s d ' i n c u b a t i o n h 25 °, h l ' 6 t a t de ¢ r e s t i n g cel ls >>, en prS- sence de g lucose 2 p. cent , e n p r e s e n c e d ' a i r ou d ' azo tc , e t e n p r e s e n c e ou en a b s e n c e de c h l o r a m p h ~ n i e o l (CAP, 4 m g / m l ) on de c y c l o h e x i m i d e (cyclo. 20 ~ g / m l ) .

A = t e m p s 0 B~ D, E ---- 3 h d ' a S r a t i o n + g lucose 2 p. cent . (D = + CAP 4 m g / m l ; E = cyclo. 0,02 m g / m l ) C ---- 3 h d ' i n c u b a t i o n s o n s azo t e + g lucose 2 p. cen t

toire , b ien que diminu~es de moit i6 p a r r a p p o r t au temps 0. La e y e l o h e x i m i d e i nh ibe done le p ro - cessus d ' i nae t iva t ion p a r le glucose de ees enzymes, comme dans le cas de la mala te d6shy- drog6nase [13, 141 ou de l ' ag lucos idase de levure [15] ; cependant , il convient de p r6c i se r que les effets de la cyc lohex imide sont mul t ip les et que cet i nh ib i t eu r des syntheses prot6iques ey toplas - miques inh ibe aussi la glycolyse, chez la levure [13] et qu ' i l i nh ibe le t u rnove r des prot~ines , turn- over i m p o r t a n t chez les res t ing cells !27, 28!.

I1 est c la i r que le m6canisme de la d i spa r i t i on indu i te p a r le glucose de la 8A.LA synth6tase et du cha inon PBG - - - ~ - proto, est complexe. Cepen- dant , i l ne semble pas devoi r fa i re i n t e rven i r la format ion , indui te p a r le glucose, de prot6ines i nh ib i t r i c e s de ces activit6s.

D . R E C H E R C H E D U MI~,CANISME D E LA R E ' S T A U R A -

T I O N D U F O N C T I O N N E M E N T D U C H A i N O N P B G - - > -

PROTO. APRI~,S LA DISPARITION DU GLUCOSE (fig. 6, t ab leau IV).

L ' a d d i t i o n de cyc lohex imide (0,02 m g / m l de mi- l ieu d ' adap ta t ion ) au temps 3 heures de l ' adap ta -

40.

30

20

10

o / I cy,(o

" ~ o + y I

- - - - - - - Z £ i Z . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ' ' "

heu res d'o~¢atTon (25 a )

Fro. 6. - - E v o l u t i o n du QOz (en u l O_, /h /mg po id s see) a u t o u r s de l ' a 6 r a t i o n h 25 ° en p r6 sence de g lu - cose 0,2 p. cent , des << r e s t i n g cel ls >> de l e v u r e a d d i - t i o n n 6 e s ou n o n de c y c l o h e x i m i d e (20 ~tg/ml) ap r6s 3 h e u r e s d ' a d a p t a t i o n .

t ion r e sp i r a to i r e de la levure en pr6sence de glucose 0,2 p. cent en t ra ine , p a r r a p p o r t au t6moin :

- - l ' a r r O de l ' augmenta t ion du QO~ (et de la fo rmat ion des cy tochromes) (fig. 6) ;

Dctlvlt~ cytocheome • oxydase

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ~ /~ / . . . . . . . . . . . . . . ) (

vitess@ de syn th~e de la protoporphyHne

(en nmotes/'h//m9 prot~ine$ de H)

1.o00 o,1

1

o ~ ~ 9 heutes d ~ r a t i o n (25 ° )

Fro. 7. - - E v o l u t i o n de l ' a c t iv i t6 c y t o c h r o m e c- o x y d a s e (en n m o l e s de c y t o e h r o m e c o x y d 6 / h / m g p ro - t~ ines) et de la v i t e s s e de s y n t h ~ s e de la p r o t o p o r - p h y r i n e (*) (en n m o l e s / h / m g pro t~ ines ) d ' h o m o g ~ n a t s H p r o v e n a n t de << r e s t i n g cel ls >> de l e v u r e a~r6es 3, 6 ou 9 h e u r e s h 25 ° en p r6 sence de g lucose 0,2 p. cent , a d d i t i o n n ~ e s ou n o n de e y c l o h e x i m i d e (20 u g / m l ) apr~s 3 h e u r e s d ' a d a p t a t i o n .

- - cyclo p r o t o p o r p h y r i n e I ~ _ _ _ ~ + cyclo

• • - - cyclo c y t o e h r o m e c - o x y d a s e © - - - - - © -- cyclo

(*) A p a r t i r de 8ALA.

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.

Synth~se du protoh~me par la levure. 521

- - l ' a r r6 t de l ' a u g m e n t a t i o n des ac t iv i t6s suce i - na te c y t o c h r o m e c o x y d o r 6 d u e t a s e et c y t o c h r o - me c o x y d a s e ( tab leau IV et fig. 7) ;

Ces e x p 6 r i e n c e s c o n d u i s e n t h p e n s e r que la r6- a p p a r i t i o n de l ' a c t iv i t6 du c h a i n o n PBG - - ~ - p ro to , c o r r e s p o n d r a i t h la syn th~se de la (ou

TABLEAU IV.

Comparaison des activit6s enzymatiques (exprim6es en nmoles de produit f o rm6 /h /mg prot6ines) d'homog6nats (H) de fractions solubles (S) provenant de levures eultiv6es en ana6robiose, avant et apr6s 3, 6, 9 heures d'a6ration h 25 °, en tampon KH~POa, 0,073 M, pH 4,5, glucos6 h 0,2 p. cent additionn6es ou non de eycloheximide apr6s 3 heures d'adaptation.

Activit6 mesur6e (nmoles/h/mg prot6ines)

ALA I Synth6tase

(H) II

ALA d~shydratase

(S)

Porphyrines totales (en proto.) (H)

Succinate eyto. c rdductase

(n)

Cyto. e. oxydase (n)

Temps d'adration (en heures) des cellules de levure en prdsence de glucose 0,2 p. cent (25 °)

0 3

2,9 0,3

1,4 1,9

0 ~ 6 _ 0,005

5O

- - ~ 0 0 - - - - 100

6

0,2 0,2

0,2 0,5

1,4 2,0

0,05 0,08

125 I 330

520 I 650 I

9 ] 6 + cyclo.

0

9 + cyclo.

0,2

0,1 0,1

2,2 1,9

0,01 0,005

50 40

100 170

- - l ' i n h i b i t i o n de la r 6 a p p a r i t i o n des ae t iv i t6s de syn thbse de la p r o t o p o r p h y r i n e h p a r t i r du 8ALA ( tableau IV et fig. 7).

500 550 600 k .m

Fro. 8. - - Spectres d 'absorption h basse temp6rature (--196 °) des cellules de ]evure cultiv~es en ana~robiose en pr6sence de galactose 5 p. cent, avant et apr~s 3 heures d'a~ration h 25 °, h l '~tat de << resting cells >>, en pr6sence on en absence de glucose ou de galactose 2 p. cent.

A ---- temps 0 B -~ 3 h d'a~ration sans hexosc ~- ~ 3 h d'a~ration -k glucose on galactose 2 p. cent

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.

des) p ro t6 ine ( s ) e n z y m a t i q u e ( s ) d i spa rue ( s ) apr~s l ' a d d i t i o n du g lucose ( c o m m e dans le cas de ]a ma la t e d 6 s h y d r o g 6 n a s e [14]).

C e p e n d a n t , i l est tr~s d i f f ie i le ae tue l l e rnen t de p r 6 c i s e r que l le est la n a t u r e du s igna l qu i com- m a n d e la syn th6se de nooo de ees enzymes , et qui , p a r vo te de eons6quenee , c o m m a n d e la f o r m a t i o n de n o y a u h~me.

E . CAS DE L'ADAPTATION RESPIRATOIRE DES CEL-

LULES DE LEVURE CULTIVEES EN ANAI~ROBIOSE EN

PRESENCE DE GALACTOSE (,fig. 8, t a b l e a u V).

Tus t ano f f et Ba r t l ey ont m o n t r 6 que la ] evu re est c apab l e de c r o i t r e en a n a 6 r o b i o s e avec le ga lac tose c o m m e s o u r c e de c a r b o n e [6], et que le ga lac tose r 6 p r i m e b e a u c o u p m o i n s que le g lucose la f o r m a t i o n des e n z y m e s m i t o c h o n d r i a l e s et en p a r t i c u l i e r des c y t o c h r o m e s chez les ce l lu les en c r o i s s a n c e a6 rob ie [15, 16].

C o m p a r ~ e h ce l le de la l e v u r e cul t iv~e en pr6- sence de glucose, l ' a d a p t a t i o n r e s p i r a t o i r e des cellules de l e v u r e cul t iv6es en ana~rob iose a v e c ]e ga lac tose , est b e a u c o u p p lus r a p i d e , h tel p o i n t qu ' e l l e a l i eu p e n d a n t la r6co l t e et que les ce l lu les

522 P. Labbe , G. D e c h a t e a u b o d e a u et R. Labbe-Bois .

TABLEAU V.

Comparaison des activit6s enzymat iques (exprim6es en nmoles de produit f o r m 6 / h / m g prot6ines) d 'homog~nats (H), de fract ions solubles (S) et part icu- laires (P) provenant de levures cultiv6es ell ana6robiose avec le galactose comme source de carbone, avant et apr~s 3 heures d 'aSration h 25 °, en tampon KHoPO~, 0,073 M, pH 4,5, contenant ou non du glncose 2 p. cent ou du galaetose 2 p. cent.

Les spectres des cellules de levure correspondant aux condit ions (A), (B), (C) sont donn6s figure 8.

Activil6 mesurde ( nmoles/h/mg prot6ines)

Suceinothiokinase (S)

ALA I Synth6tase

(~) ii

ALA d6shydratase (s)

Porphyrines totales (en proto.) (H)

Ferrochdlatase (P)

Succinate cyto. c r~ductase (H)

Cyto. c oxydase (H)

_ _ ° (A) 3 (B)

I 240 240

3,2 0

6 ~ - o ~

1,5 1,5 i

0,15 0,16

380 365 ]

2880

Temps d'a6ration des cellules de lewlre ten heures fi 25o):

:l + g'lucose 3 + galactose 2 p. cent (C) 2 p. cent IC)

330 190

2,5 1,8

0,15 0,07

27 17

900 600

5400 5760

p r 6 s e n t e n t , dbs l e u r r6col te , t ou t e s les c a r a c t 6 r i s - t i q u e s de la l evu re a6 rob ie [5, 6]. C 'es t ce que con - f i rme le t a b l e a u V off l ' o n vo i t que la l evure , dbs la r6co l t e ( t emps 0), p o s s b d e de fo r t e s ac l iv i t6s s u c c i n a t e c y t o c h r o m e c r 6 d u c t a s e , et c y t o c h r o m e c o x y d a s e , a ins i q u ' u n s p e c t r e h 6 m a t i n i q u e i n t e n s e

. . . .

Fro. 9. --- Speetres d 'absorpt ion h basse tempdrature (--19'6 °) des cellules de levure cultiv6es en a6robiose en pr6sence de glucose 5 p. cent avant et apr6s 3 heures d 'a6ration h 25 ° h l '6tat de << rest ing cells >> en absence ou en pr6sence de glucose 2 p. cent.

A = temps 0 B = 3 h d 'a~ration sans glucose C : 3 h d 'adrat ion + glucose

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.

(fig. 8-A). L ' a 6 r a t i o n p e n d a n t 3 h e u r e s , des cellules de l ev u re en p r 6 s e n c e de g lucose ou de galac- rose 2 p. c e n t p r o v o q u e u n e a u g m e n t a t i o n des ac t iv i t6s r e s p i r a t o i r e s , s ans p o u r a u t a n t e n t r a i n e r des v a r i a t i o n s s p e c t r a l e s (fig. 8-C).

E n ce qui c o n c e r n e les ac t iv i t6s re l i6es h la s y n t h b s e du p r o t o h b m e , on c o n s t a t e d a n s t o u s l e s c a s :

- - la d i s p a r i t i o n de l ' a c t iv i t6 ~ALA s y n t h 6 t a s e , m 6 m e d a n s le cas de la l ev u re a6r6e en l'absence de glucose ou de galaclose ;

- - la p e r m a n e n c e des ac t iv i t6s e n z y m a t i q u e s du c h a i n o n PBG - - ~ p r o t o ;

l ' a u g m e n t a t i o n de l ' ac t iv i t6 f e r roch61a t a se d a n s le cas de l e v u r e s a6r6es en p r 6 s e n c e de glucose et de ga lac tose .

On r e m a r q u e d o n c que, l o r s q u e la l e v u r e a 6t6 cul t iv6e en a n a 6 r o b i o s e avec le ga lac tose c o m m e s o u r c e de c a r b o n e , ce n ' e s t p a s le g lucose qu i p r o - v o q u e la d i s p a r i t i o n de la 5ALA s y n t h 6 t a s e , con - t r a i r e m e n t aux r6su l t a t s que n o u s avons o b s e rv 6 s l o r s q u e la l e v u r e a 6t6 cul t iv6e avec le g lucose c o m l n e s o u r c e de c a r b o n e ( d a n s ce cas, l ' a6 r a t i on

Synthkse du pro tohbme par la levure. 523

des cellules de levure en absence de glucose n 'en- t ra ine qu 'une d iminu t ion de cette activit6). Dolt- on en conclure que la gALA synth6tase n 'est pas la m6me quand la levure a 06 cultiv6e en pr6sence de glucose, ou en pr6sence de galactose, ou bien peut-on dire que la gALA synth6tase est plus fra- gile quand la levure, cultiv6e en pr6sence de galactose, est a6r6e pendan t 3 heures en absence ou en pr6sence de glucose ou de galactose ?

On remarque 6galement que, lorsque la levure est cult iv6e en ana6robiose, en pr6sence de galactose, le glucose n ' exerce aucun effet ¢ inact ivateur >> sur le cha inon PBG - - ) - proto.

iL'ensemble de nos r6sultats nous condui t donc h supposer que la d ispar i t ion d6finitive de la

TABLEAU VI.

Comparaison des aetivit6s enzymatiques (exprim6es en nmoles de p~oduit form6/h/mg prot6ines) d'homo- g6nats (H), fractions solubles (S) et particulaires (P) provenant de levures cultiv~es en a6robiose avec le glucose comme source de carbone, avant et apr6s 3 heures d'a~ration h 25 °, en tampon KH~PO4 0,073 M, pH 4,5, glucos6 h 2 p. cent ou non.

Les spectres des cellules de levure correspondant aux conditions (A), (B), (C) sont donnges figure 9.

Activit6 mesur6e (nmoles/h/mg prot.)

ALA I Synth6tase

( H ) II

?J ALA D6shydratase

(S)


(n)

Ferroch61atase (P)

Succinate cyto. c rdductase

(n)

Cyto. e oxydase (H)

Temps d'a6ration (en heures} des cellules de levures fi 25 °

o (A) 3 (B)

1,6 0,8 i

2,6 1,2 i

1,1 1

l

0,07 I 0,07

7,5 6,9

40 70

840 900

3 + glucose 2 p. cent (C)

0

0

1,4

0

43,5

200

2160

gALA synth6tase chez les res t ing cells, e t l a dispa- r i t iou puis la r6appar i t ion des activit6s de syn- th6se du pro toh6me (Chainon PBG - - ~ - proto) en pr6sence de glucose, sont des ph6nombnes de

nature diff6rente, qui semblent reli6s au m6ta- bol isme glycolyt ique.

F. EFFETS DU GLUCOSE SUR LES RESTING CELLS

PROVENANT DE CELLULES DE LEVURE CULTIVEES EN

AI~.ROBIOSE EN PRESENCE DE GLUCOSE ( t ig . 9, t a -

b l e a u VI).

Compte tenu des r6sultats que nous venons d 'ex- poser, il nous a sembl6 int6ressant de mesure r les effets du glucose sur des res t ing cells de levure eultiv6e en a~robiose sur mi l ieu glucos6. Les r6- sultats consign6s dans le tableau ¥ I et la figure 9, mont ren t c la i rement que les effets du glucose sur les res t ing cells de cellules cultiv6es en a6robiose, sont qual i ta t ivement ident iques h ceux que nous avons d6crits pour les cellules cultiv6es en ana6ro- biose sur glucose.

DISCUSSION E T CONCLUSION.

L 'ensemble des r6sultats que nous venons d 'ex- poser mont re que 1'addition de glucose h des << rest ing cells >> de la levure Saccharomyces cereoisiae cultiv6e en ana6robiose (ou en a6robiose) avec le glucose comme source de carbone, en t ra ine :

- - la d ispar i t ion d6finitive de la 8ALA synth6- tase quelle que soit la concen t ra t ion in i t ia le en glucose du mi l ieu d 'adapta t ion ;

- - l a dispar i t ion d 'une ou plusieurs enzymes impliqu6es dans la t r ans fo rmat ion du PBG en pro- t opo rphyr ine (puisque la 8ALA d6shydratase e t l a ferroch61atase sont toujours pr6sentes). La r6appa- r i t ion de cette ou de ces enzymes h la 6 e heure (glucose 0,2 p. cent) ou h la 9 ° heure d ' incuba t ion (glucose 2 p. cent) en t ra ine le fonc t ionnement de la chalne de synthbse du pro tohbme et pr6cbde la forte augmenta t ion des activit6s resp i ra to i res (succinate cy tochrome c r6ductase et cytochrome c oxydor6ductase) . La r6appar i t ion de cette ou de ces activit6s co r respondra i t h une synthbse prot6ique de novo.

On peut alors dissocier les effets provoqu6s par l ' add i t ion de glucose aux res t ing cells sur la chaine de synth~se du p ro tohbme suivant qu ' i l s 'agit de la 8ALA synth6tase ou du chainon PBG - - ~ - proto. :

1) gALA synth~tase : la 8ALA synth6tase est pr6sente chez la levure cultiv6e en ana6robiose E7~ et par consequent pr6sente au temps 0 de l ' adapta t ion respi ra to i re . C'est 1 'addition du glucose qui ent ra ine sa d ispar i t ion (dans le cas de la levure cultiv6e avec le glucose comme source de

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524 P. Labbe , G. D e c h a t e a u b o d e a u el R. Labbe-Bois .

carbone) , puisque l ' incubat ion des res t ing cells en absence de glucose ne p rovoque pas la d ispar i t ion de cette enzyme. Ce fair est h r a p p r o c h e r de l 'effet inh ib i teur du glucose sur la synth6se indui te de la 8ALA synth6tase h6pat ique par les agents por- phyrinog6nes [17, 18, 19~, qui se t radui t pa r une d iminut ion de la quantit6 de po rphy r ine s l ibres form&es : la r6press ion de la synth6se de cette enzyme par le gIucose reste -ace jour inexpl iqu6e [17, 18]. D'autre part , les t ravaux de Utter et coll. [20], de J aya raman et coll. [21] et ceux de Chap- man et coll. [22], effectu6s sur la levure cultiv6e en a6robiose, mont ren t que la r6press ion par le glucose s 'exerce au niveau mi tochondr i a l : en par- t icul ier , les activit6s succinate cy tochrome c oxy- dor6ductase et cy tochrome c oxydase disparais- sent apr6s l ' add i t ion du glucose aux cellules enti6res, et r6apparaissent quand le glucose a disparu du milieu. La d ispar i t ion rap ide ( inact iva- t ion ?) de la 5ALA synth6tase, enzyme in t ramito- chondr ia le [23], se fait-elle selon un processus analogue 9.

Cependant , comme nous avons 6galement observ6 que la 5ALA synth6tase de levure dispa- rai t en absence de glucose dans le cas off le s levures sont cultiv~es avec le galaclose comme source de carbone, il r6sulte de nos exp6r iences que la d ispar i t ion de l 'act ivi t6 5&LAsynth6tase de la levure s 'effectue selon un m6canisme tr6s complexe. N6anmoins, la fo rmat ion de la totalit6 de cy toehromes de la chaine resp i ra to i re au cours de l ' adapta t ion resp i ra to i re peut s 'expl iquer , m~me si la 5ALA synth6tase a disparu, par la pr6sence de fortes quantit6s de 8&LA l ibre (40 h 100 nmoles /ml d 'homog6nat H) ~ condi t ion que ce 5A.LA l ibre co r responde r6el lement ~ du 5ALA intracel lula i re . Se pose alors la quest ion de savoir pourquo i et comment la cellule accumule d 'aussi grandes quantit6s de ce pr6curseur .

2) Chainon PBG - - ~ proloporphgrine : la prbsence constante, au cours des incubat ions en pr6sence de glucose, de la ~ALA d6shydratase et de la ferroch61atase, pose le probl6me de savoir qnelle(s) enzyme(s) du cha lnon est touch6e sous l 'effet du glucose. A la lumi6re de nos exp6riences, il semblera i t que cette enzyme cor responde au complexe PBG d6saminase-uroporphyr inog6ne IH cosynth6tase ; en effet, si les effets du glucose se manifes ta ient ~t un stade ul t6r ieur de la chaine de synthbse du protoh6me, naris observer ions la format ion de porphyr inog6nes , ais6ment d6tectables h l '6tat de po rphy r ine s apr~s oxydat ion.

Nous avons montr~ que la d ispar i t ion de l 'act i - vit6 du cha lnon PBG )- proto, sous l 'effet du glucose, est un ph6nom6ne rapide , et que cette

d ispar i t ion n 'a pas l ieu en pr6sence de cyclohexi- nfide ; on ne peut cependant en d6duire avec cer- t i tude que le glucose induise une ou plusieurs pro- t$ines inh ib i t r ices de l 'act ivi t6 de ce chainon, puisque la cyc lohex imide est aussi un inh ib i t eur de la glycolyse et un inh ib i teur du tu rnover des prot6ines. En revanche, il semble que la r6appa- r i t ion de l 'act ivi t6 de ce cha inon cor responde une synth6se prot6ique, surtout si l 'on se r6f6re aux r6sultats de Ferguson et coll. et de Duntze et coll. [13, 14], "apropos de la synth6se indui te de la malate d6shydrog6nase chez la levure, off ces auteurs ant observ6 :

1 °) un effet << inac t iva teur r6presseur >> du glucose exog6ne sur la synth~se de cette enzyme, analogue h celui que nous venons de d6crire ;

2 c) la synth6se de nova de l ' enzyme une fois lc glucose 61ilnin6 du mi l ieu d ' incubat ion.

Les m6mes auteurs ant 6galement montr6 que 1'¢ inac t iva t ion r6pression >> de la malate d6shy- drog~nase indui te est sp6cifique de l 'esp6ce Sac- charomyces et que le fructose et le mannose exer- cent des effets << inac t iva teurs r6presseurs >> iden- t iques au glucose, alors que le galactose en exerce de bien moindres . Un effet << inact ivateur-r~presseur >) du glucose a 6galement ~t6 d6crit par Gortz [15] dans le cas de l ' i nduc t ion de l '~glucosidase de levure et par Gancedo clans le cas de la f ructose 1-6-diphosphatase [24].

La quest ion se pose de savoir :

1 °) si c 'est le glucose lui-m6me ou un m6tabo- lite d i rec tement d~riv6 du glucose (comme le glucose 6 phosphate , le f ructose 6 phosphate ou le f ructose 1-6 diphosphate) qui en t ra ine l'<<inacti- vat ion >>, ou si celle-ci fait i n t e rven i r des ph6no- m6nes encore plus complexes ; en d 'autres termes, quel est le m6canisme de 1'<< inac t iva t ion >> ; en effet, l ' inac t iva t ion que nous avons observ~e, bien que pr6sentant des analogies avec le phSnom6ne d'<< inact iva t ion-r6press ion >> d6cri t pa r Ferguson et coll. It3] ne peut lui ~tre compl6tement assi- mil6e puisque 1'(~ inact iva t ion-r6press ion >> par le glucose s ' exerce sur des enzymes induct ib les (ce qui n 'est pas le cas du syst6me de synth6se du protoh6me qui est consti tutif) ;

2 °) h quoi correspond, au n iveau du m6tabo- l isme cellulaire, et en pa r t i cu l i e r au n iveau de l ' adapta t ion resp i ra to i re :

- - l a dispar i t ion de l 'act ivi t6 de synth6se du pro toh6me (pendant un temps qui d6pend de la concent ra t ion ini t ia le de glucose) et qui corres- pondra i t ~ l '6tabl issement du << eontre-effet Pas- teur >>) ;

BIOCHIMIE, 1972, 54, n" 4.

S y n t h ~ s e du p r o t o h ~ m e par la levure . 525

- - la r6appar i t ion de cette activit6 globale, pr6- c6dant la forte augmenta t ion des activit6s li6es au m6tabolisme mi tochondr ia l .

Ce qui revient h se demander quel est le l ien entre 1'<< inac t iva t ion >> par le glucose et l 'adapta- t ion respira toi re .9

1 °) Mdcanisme de l'<<inactivation>>: il a 6t6 montr6 :

- - que le << tu rnover >> des prot6ines est 61ev6 chez les ¢ rest ing cells >> de levure, et que les acti- vit6s prot6asiques endocel lulaires en seraient res- ponsabtes [25-28]. On pourra i t alors supposer que le glucose ou un m6tabolite d6riv6 du glucose active les prot~ases des << rest ing cells >> et que celles-ci d6gradent certaines prot6ines avec une sp6cificit6 qui reste "~ d6terminer ;

- - q u e les d6riv6s phosphoryl6s du glucose jouent un rSle fondamenta l darts le m6tabolisme cellulaire, soit en activant, soit en i nh iban t l"acti- vit6 de certaines enzymes impliqu6es darts le m6- tabolisme ~nerg6tique [29]. I1 vient d'6tre claire- merit d6nmntr6 que le fructose 1-6 diphosphate inact ive la pyruvate kinase de levure in vitro en formant des monom6res inactifs h par t i r du t6tra- m6tre actif [30].

Ces derniers r6sultats nous conduisen t ~ for- muler l 'hypoth6se selon laquelle la d ispar i t ion de l 'activit6 de synth6se du protoh6me ~ par t i r du 6ALA sous l'effet du glucose pour ra i t correspondre ~ I ' inac t iva t ion du syst~me enzymatique << porphobi l inog6ne d6saminase-uroporphyr inog6ne HI isom6rase >> par un in term6dia i re phosphoryl6 du glucose tel que le glucose 6 phosphate, le fructose 1-6- diphosphate, le fructose 6 phosphate on I 'ATP, I'ADP ou I'AMP.

2 °) Relations entre I'<< inactivation >> par le glucose et l 'adaptation respiratoire.

L'examen comparat i f des spectres h6mat iniques des cellules enti6res (fig. 2) et des activit6s enzy- lnatiques (succinate cytochrome c oxydor6duc- tase et cytochrome c oxydase) pr6sentes dans les fract ions subcellulaires correspondantes (fig. 3), montre e la i rement que l ' augmenta t ion de la quan- tit6 (estim~e) des cytochromes b, c~, c, a -4- a3 et de celles des activit6s li6es au fonc t ionnement mi- tochondr ia l [cf. 20] est corr61ative de la r6appa- r i t ion de l 'activit6 du cha lnon PBG - - ~ - proto. (fig. 3), ce qui sugg6re un l ien entre ces 2 ph6no- m6nes. On constate 6galement que la r6appar i t ion de l 'activit6 du cha inon PBG - - ~ proto n 'a l ieu qu 'une fois le glucose d isparu du mil ieu ext6rieur (fig. 1). Nous sommes doric condui ts h supposer que l ' adapta t ion respira toi re des << rest ing cells >>

de Saccharomgces cerevisiae est la r6sultante de 2 ph6nom6nes successifs :

- - 1 °~ ph~nom~ne : stockage de glucose ext6- r ieur , sous forme vra i semblablement de glycog6ne, dont la dur6e, fonct ion de la quanti t6 de glucose dans le milieu, cor respond & 1'¢ inac t iva t ion >> de la synth~se du protoh6me. Cette phase pour ra i t correspondre ~ l '6tape cr i t ique d6finie par Slo- n imski [4 ] ; elle serait insensible h l 'oxyg6ne, puisque l ' i ncuba t ion ana6robie des cellules en- ti6res en pr6sence de glucose en t ra ine 1'<< inact i- vat ion >> ;

- - 2 ~ ph~nom~ne : adaptat ion respira toi re pro- p rement dite aux d6pens du glycog6ne accumul6 qui sert de source d '6nergie et de source d'616- ments carbon6s (phase de d6r6pression). Admettre cette hypoth6se condui t ~ supposer qu'h la limite, en m a i n t e n a n t le taux de glucose exog6ne cons- tant, on ne devrait jamais observer d 'adapta t ion respiratoire .

A l ' appui de cette hypoth6se, les t ravaux de Chester [31, 32], d 'Eaton [33, 34], et sur tout de Rothman et de Cabib [35, 36], ont montr6 que l ' add i t ion de glucose ~ des << rest ing cells >> de levure cultiv6e en a6robiose (sur glucose), provo- que la format ion de grandes quanti t6s de glyco- g~ne et que le glycog6ne n 'est d6grad6 qu'apr6s d ispar i t ion du glucose du milieu.

Les m~mes auteurs [35, 363 ont aussi montr~ que les cellules de levure r6colt6e en phase exponen- tielle de croissance a6robie, ne con t i ennen t pas de glycogbne, alors que les m6mes cellules r6colt6es en phase s ta t ionnai re en cont iennent , et que la levure cultiv6e en a6robiose sur galactose comme source de carbone, synth6tise beaucoup moths de glycogbne que les m6mes cellules cultiv6es sur glucose; on rapprochera de ces exp6riences le fait que les cellules de phase s ta t ionnai re ana6robie (charg6es en glycog6ne, comme les cellules de phase s ta t ionnai re a6robie) s 'adaptent beaucoup plus r i te que les cellules de phase exponent iel le ana6robie, m6me en absence de glucose [4, 31, 32, 37]. On notera 6galement que 1'<< effet glucose >> qui s 'exerce en par t icu l ie r sur la synth6se indui te des po rphyr ines par les agents porphyr inogbnes s 'observe dons le foie, organe off s 'exerce la fonc- t ion glycog6nique et que, si ces effets ne se mani - festent pas de la m6me mani6re que chez la levure (on observe une inh ib i t ion par le glucose de la synth6se iudui te de la 8ALA synth6tase h6pa- tique), le r6sultat est ident ique : on observe une inh ib i t ion de la synth6se du protoh~me.

Un des m6diateurs chimiques de la r6gulat ion de la fonct ion glycog6nique est le 3'-5'-AMP cy-

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526 P. Labbe , G. D e c h a t e a u b o d e a u et R. Labbe -Bo i s .

clique : chez la levure, Van Wijk et coll. [38] ont montr6 que la concent ra t ion en AMP cycl ique est 6 fois plus grande chez les cellules cultiv6es en pr6sence de galactose (cellules peu r6prim6es), que chez les cellules cultiv6es en pr6sence de glucose (ceilules for tement r6prim6es). Par cons6- quent, la r6press ion de la synth6se du systbme res- p i ra to i re pour ra i t 6tre li6e aussi au taux d'AMP cycl ique in t racel lu la i re , et il semble alors logique de penser que le tanx d'AM.P cycl ique in t racel lulaire (reli6 h l 'act ivi t6 glycog6nique de la levure ?) serai t 6galement reli6 h la vitesse d 'adapta t ion des levures suivant la concen t ra t ion en glucose du milieu de l ' adapta t ion rcspi ra to i re .

II convien t cependan t de r e m a r q u e r que, con- t r a i r ement h ce qui vient d 'Ore dit, il a 6t6 d6mon- tr6 que la synth6se du cy toehrome c au eours de l ' adapta t ion resp i ra to i re est un ph6nom6ne con- tinn [391; or, nos r6sultats (obtenus in vitro) montren t que la format ion du pro toh6me est un ph6nom6ne discont inu (fig. 3) ; d 'autre part , Barret t a prouv6 que la fo rmat ion des noyaux h6mat in iques (h6mes b, c, a) s 'effeetue de novo et qu' i l n 'exis te pas dans la cellule ana6robie une r6serve d 'h6me h pa r t i r de laquelle ces groupe- ments prosth6t iques p rendra i en t naissance [40] ; il faut donc admettre , clans le cas de la fo rmat ion cont inue du cy toehrome e, que la synth6se de eette mol6eule s 'effectue ind6pendamment de la synth6se des autres ey tochromes e t /ou que ]a loca- l isat ion in t raee l lu la i re de cette synth6se est diff6- rente de celle des ey toehromes b, c~ et (a + az) [41]. Cette hypoth6se re joint d 'a i l leurs celle que nous avions formul6es dans le cas du mutant << Pet i te Colonie >> cultiv6 en a6robiose et qui ne synth6tise que le cy tochrome e [7].

I1 appara i t done que l ' add i t ion du glucose aux <( res t ing ceils >) de levure au tou r s de l ' adapta t ion respira toi re , en t ra ine de profondes per turba t ions au niveau de l ' ap t i tude h la synth6se du proto- h6me par ces cellules ; ces per turba t ions doivent ~tre 6troi tement li6es au m6tabol isme 6nerg6tique eellulaire, puisque, en admet tant que le m6tabo- l isme du glyeog6ne est impliqu6 dans le ph6no- m6ne de l ' adapta t ion respira toi re , la fo rmat ion ou la d6gradat ion de ee po lysacchar ide demande de l '6nergie ou pro.eurerait celle qui est n6cessaire aux synth6ses mi tochondr ia les , selon un in6ca- nisme tr6s pr6cis faisant in te rven i r en pa r t i cu l i e r la var ia t ion du taux cel lulaire du glucose 6 phosphate (done du glucose exog6ne), de I 'ATP, et de I'&DP [35, 36] ; ces faits sont h r app roche r du passage de 1'<< 6tat r6prim6 >> h 1'<< 6tat d6r6- pr im6 >> des cellules de levure suivant qu'elles sont r6colt6es en phase exponent ie l le (non charg6es en

glycog6ne ou en phase s ta t ionnai re de croissance) (charg6es en glycog6ne) [42-441.

I1 convient de s ignaler que l ' accumula t ion de polym6res hydrocarbon6s (tels que le glycog6ne ou le po lyhydroxybu ty ra te ) semble aussi reli6e au m6tabolisme de l 'azote, et pa r ]h-m6me, h la croissance ; il a 6t6 en effet d6montr6 que cer ta ines bact4ries accumulent ces polym6res d6s la fin de la ero issance exponent ie l le , que cette accmnula- t ion est reli6e au taux in t race l lu la i re des inter- m6diai res phosphoryl6s du glucose, et qu'el le cesse d6s l ' i n t roduc t ion d ' ions NH4 +dans le mi l ieu [45, 46~. De plus, Rothman et Cabib ont observ6 un arr6t brutal de l ' aeeumula t ion de glyeog6ne par des << rest ing cells >> de levure d6s l ' i n t roduc t ion d ' ions NH4 +dans le mi l ieu d ' incubat ion , sans que l 'on puisse pour autant s i tuer avec pr6cis ion le (ou les) po in t d ' impac t de ces ions [353.

Les recherches actuel lenlent poursuiv ies ont pour objet de t e n t e r :

- - d 'analyser le m6canislne de la d ispar i t ion de la 5ALA synth6tase ;

- - d 'ana lyser le m6canisme de 1'<< inac t iva t ion >> par le glucose de la synth6se du protoh6me h par- fir du 5ALA (on peut m~me concevo i r que les m6- canismes soient les m6mes). De toute facon, ils repr6sentent un des aspects de la r6press ion cata- bol ique exerc6e par le glucose sur la fo rmat ion des enzymes respira toi res .

- - de v6r i f ier l ' impor t ance du m6tabolisme du glycog6ne au cours de l ' adapta t ion respi ra to i re .

Reraerciemenls.

Nous remercions M ue Christiane Gauthier, Aide- Chimiste CNRS, pour sou aide aussi effieace que d6vou6e. Ce travail a b~n6fici6 de l'aide du CNRS (E.R.A. N ° 172).

R~SUM~.

En pr6sence d'air, I'addition de glucose h des ¢ resting cells >> de la levure Saeeharomyces eerevisiae eultiv6e en anadrobiose avec le glucose comme source de carbone entraine :

- - la synth6se des cytochromes a+a~, b, c~ et c, et l 'augmentation des activit6s cytochrome e oxydase et succinate cytochrome e r6ductase (adaptation respiratoire) ; la vitesse de ces synth6ses d6pend de la con- centration initiale du glucose dans le milieu d'adaptation (<< eontre effet Pasteur >>) : elle est d'autant plus rapide qu'il y a moins de glucose (Slonimski [4]) ;

- - l a disparition rapide de la 5ALA synth6tase (moths d'une heure) qui n'est plus retrouv4e tout au long de l'adaptation respiratoire mesur6e pendant 9 heures h .95°; la pr6sence de fortes quantit6s de 5ALA libre au temps 0 de l'adaptation, permet eepen- dant d'expliquer la formation de la totalit6 des tyro- chromes de la chaine respiratoire ;

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 4.

Synth~se du protoh~me par la levure.

- - la d i s p a r i t i o n r a p i d e d ' u n e (ou p l u s i e u r s ) e n z y - m e s de la c h a i n e de s y n t h 6 s e du p r o t o h 6 m e s i tu6e(s) e n t r e le p o r p h o b i l i n o g 6 n e et la p r o t o p o r p h y r i n e ; Fen - z y m e d i s p a r u e , qu i s e m b l e c o r r e s p o n d r e a u cornplexe PBG d S s a m i n a s e - u r o p o r p h y r i n o g 6 n e III c o s y n t h 6 t a s e , es t s y n t h 6 t i s 6 e de nooo u n e lo i s q u e le g lucose a d i s p a r u d u m i l i e u d ' a d a p t a t i o n .

Le m d c a n i s m e de la d i s p a r i t i o n de ces ac t iv i t~s e n z y m a t i q u e s ne s e m b l c pa s d 6 p e n d r e d ' u n e s y n t h ~ s e 1. de pro td ine(s ) i nh ib i t r i ce ( s ) de ces ac t iv i t6s s o u s l ' i n f l u e n c e du g lucose ; ce t te d i s p a r i t i o n se p r o d u i t 2. auss i darts le cas off les ¢ r e s t i n g cel ls >> s o n t i neub6es cn p rdsence de g l ucose et en a b s e n c e d 'oxyg6ne . Des 3. r 6 s u l t a t s i d e n t i q u e s s o n t r e t r o u v 6 s chez les ¢ r e s t i n g cel ls >> de l e v u r e cu l t iv6e en a6 rob iose avec le g lucose 4. c o m m e s o u r c e de c a r h o n e .

C e p e n d a n t , darts le eas de l e v u r e s cu l t iv~es en 5. a n a d r o b i o s e avec le ga l ac t o se c o m m e source de ca r -

6. bone , ce l lu l e s d o n t l ' a d a p t a t i o n r e s p i r a t o i r e es t ex t r~ - m e m e n t r ap ide , t ' a d d i t i o n de g lucose n ' e n t r a l n e pas la 7. d i s p a r i t i o n de l ' ac t iv i t~ dn c b a l n o n PBG - - ~ p r o t o - 8. p o r p h y r i n e et la ~ALA s y n t h ~ t a s e d i s p a r a i t m ~ m e en l ' a b s e n e e de g lucose . 9.

Ces r 6 s u l t a t s s o n t d i s cu t d s en r e l a t i o n avec le ph6- 10. n o m 6 n e de 1'<< a d a p t a t i o n r e s p i r a t o i r e >> : en p a r t i c u - 11. l ier , le m d t a b o l i s m e du g lycog6ne ( f o r m a t i o n p u i s d r - g r a d a t i o n ) p a r les ¢ r e s t i n g cel ls >> de l e v u r e au c o u r s 12. de l ' a d a p t a t i o n r e s p i r a t o i r e , p o u r r a i t j o u e r u n r61e 13. i m p o r t a n t dar ts l ' 6 t a b l i s s e m e n t d u << con t r e effet P a s - teur>) (en f a i s a n t i n t e r v e n i r la v a r i a t i o n d u t a u x 14. i n t r a c e l l u l a i r e de c o m p o s d s p h o s p h o r y l 6 s de la vo le g l y c o l y t i q u e ) , et p a r c o n s d q u e n t , s u r la f o r m a t i o n des 15. e y t o c b r o m e s a u n i v e a u de la f o r m a t i o n dn n o y a u h 6 m a t i n i q u e . 16.

ZUSAMMENFASSUNG, 17.

Der Z u s a t z yon G l u k o s e in G e g e n w a r t yon L u f t zu 18. <<resting cells>> de r Hefe Saccharomyces cerevisiae, w e l e h e in A n a e r o b i o s e m i t G l ukose a l s KohIens to f f - 19. que l l e kult iviea-t w u r d e , b e w i r k t : 20.

- - d ie S y n t h e s e de r C y t o c h r o m e a q- aa, b, e~ u n d c u n d die Z u n a h m e de r C y t o e h r o m e - O x y d a s e u n d de r S u e c i n a t - C y t o e h r o m c - R e d u e t a s e ( A t m u n g s a d a p t a t i o n ) ; 21. d ie G e s e h w i n d i g k e i t d i e se r S y n t h e s e n h i ing t y o n de r A n f a n g s k o n z e n t r a t i o u de r G l u k o s e i m A d a p t a t i o n s m e - 22. d i u m ( ¢ c o n t r e effet Pasteur>>) a b ; sic i s t des to r a s c h e r j e w e n i g e r G l u k o s e v o r h a n d e n i s t ( S l o n i m s k i 23. [4]) ; 24.

- - d a s r a s c h e V e r s c h w i n d e n de r 6ALA-Syt~ the tase 25. (wen ige r a l s e ine S t u n d e ) , w e l c h e i m L a u f e de r g a n z e n 26. w~ihrend 9 S t u n d e n bet 25 ° g e m e s s e n e n A t m u n g s a d a p - r a t i o n n i c h t m e h r g e f u n d e n "wird ; d a s V o r h a n d e n s e i n s t a r k e r M e n g e n yon f r e i e m 5ALA z u r Z e i t O de r A d a p - 27. t a t i o n c r l a u b t j e docb die B i l d u n g de r g e s a m t e n Cyto- c h r o m e de r A t m u n g s k e t t e zu e rk l / i r en ; 28.

- - da s r a s c h e V e r s c h ' w i n d e n e i n e s (oder m e h r e r e r ) 29. E n z y m e de r S y n t h e s e k e t t e des P r o t o h i i m s , w e l c h e z w i s e h e n d e m P o r p h o b i l i n o g e n u n d d e m P r o t o p o r p h y - 30. r i n l i egen ; da s v e r s c h w u n d e n e E n z y m , vcelches d e m K o m p l e x P B G - D e s a m i n a s e - U r o p o r p h y r i n o g e n I I I -Co- 31.

32. s y n t h e t a s e zu e n t s p r e c h e n sche in t , w i r d de nooo s y n - 33. t h e t i s i e r t , n a c h d e m die G l u k o s e a u s d e m A d a p t a - 34. t i o n s m e d i u m v e r s c h w u n d e n ist .

Der M e c h a n i s m u s des V e r s c h w i n d e n s d i e s e r E n z y - 35. mak t iv i t~ i t en s c h e i n t n i c h t v o n d e r S y n t h e s e yon e t h e r 36. ode r n~ehre re r d i e s e r Akt iv i t / i t en in G e g e n w a r t y o n G l u k o s e h e m m e n d e n P r o t e i n e n abzu l~4ngen ; d i e se s 37. V e r s c h w i n d e n w i r d a u c h b e o b a c h t e t , xvenn d ie ¢ r e s -

BIOCHIMIE, 1972, 51, n ° 4.

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t i n g cel ls >> in G e g e n w a r t v o n G l u k o s e u n d in Abwe- s e n h e i t y o n S a u e r s t o f f i n k u b i e r t w e r d e n . Gle iche E r g e b n i s s e w e r d e n bei den <(res t ing cel ls >> de r in Aerob iose m i t G l u k o s e a l s K o h l e n s t o f f q u e l l e k u l t i v i e r - t e n Hefe g e f u n d e n .

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Synthèse du protohème par la levure Saccharomyces cerevisiae

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