WILFRIED MOREIRA

STRESS OXYDATIF, DIFFERENTIATION ET MORT CELLULAIRE

CHEZ LE PARASITE LEISHMANIA

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en Microbiologie-Immunologie pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE MEDICALE FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2011

Wilfried Moreira, 2011

Résumé Le parasite Leishmania est l'agent étiologique des leishmanioses, maladies négligées qui

affectent les régions les plus pauvres de la planète (Inde, Soudan, Iran, Bengladesh,

Amérique du Sud) et figurent parmi les priorités de l'Organisation Mondiale de la Santé

(OMS). Chaque année, 1.5 million à 2 millions d'individus sont infectés et on dénombre

entre 80 000 etl50 000 décès par année. En l'absence de vaccin, le traitement des

leishmanioses repose sur une chimiothérapie relativement limitée. Les traitements à base

d'antimoine demeurent en première ligne de l'arsenal thérapeutique dans les pays

endémiques. Près de 70 ans après le début de leur utilisation, leur mécanisme d'action reste

mal connu. A ceci s'ajoute une toxicité élevée et une résistance qui prend des proportions

endémiques dans certaines régions. Les traitements alternatifs, composés principalement de

l'amphotéricine B, de la miltéfosine et de la paromomycine, sont soit extrêmement onéreux

pour les régions les plus touchées ou encore sont associés à une toxicité élevée. Dans ce

contexte, la nécessité d'approfondir les recherches sur ce parasite est évidente, dans

l'objectif de mieux comprendre sa biologie et d'éventuellement définir des nouveaux

moyens de lutte.

Trois objectifs de recherche ont été définis au cours de mon doctorat et sont présentés dans

cette thèse : les deux premiers objectifs concernaient les rôles éventuels de la ptéridine

reductase PTR1 et des ptérines réduites dans la résistance aux stress oxydatifs et dans la

métacyclogénèse du parasite. Le métabolisme des ptérines est relativement peu connu et le

rôle de ces composés reste mystérieux. La métacyclogénèse, processus par lequel le

parasite acquiert sa forme infectieuse, est également peu comprise. Les ptérines réduites

étant connues chez d'autres organismes pour leur propriété anti-oxydante et ayant été

associées à la métacyclogénèse du parasite, nous avons souhaité mieux définir leur rôle

dans ces deux aspects essentiels de la biologie du parasite. Le troisième objectif était

également relié au stress oxydatif, s'intéressait aux mécanismes d'action des drogues anti-

Leishmania et à l'acquisition de la résistance à ces drogues. Effectivement, plusieurs

drogues connues pour induire l'apoptose induisent un stress oxydatif. Nous avons émis

l'hypothèse qu'un mécanisme commun de mort cellulaire pouvait être induit par ces

11

drogues et que l'existence d'un tel mécanisme pouvait favoriser l'acquisition de multi-

résistances chez les mutants résistants.

Une étude du rôle des ptérines réduites dans la résistance aux stress oxydatifs a ainsi

montré que ces composés pouvaient être ajoutés à la liste des antioxydants dont dispose le

parasite. En effet, nous avons montré que les ptérines réduites contribuaient à la survie du

Leishmania lorsque celui-ci est soumis à des stress de nature oxydatifs ou nitrosatifs, tant

exogène que cellulaire, c'est-à-dire générés par un macrophage activé. Les ptérines

contribuent donc également à l'infectivité du parasite. Nous avons ainsi pu proposer un

nouveau rôle pour ces composés.

Une étude protéomique de la métacyclogénèse d'une souche de Leishmania sauvage et

d'une souche inactivé pour le gène codant la ptéridine reductase PTR1 a permis

l'identification de plus de 200 protéines différentiellement exprimées. La mise en évidence

de l'augmentation du nombre de protéines différentiellement exprimées suggère

indirectement l'implication de PTR1 ou des ptérines réduites dans ce processus de

differentiation essentiel à la biologie du parasite. Par ailleurs, la variation de l'expression

des protéines associées à la mobilité, à la résistance au stress oxydatif ou encore aux

mécanismes d'expressions géniques suggère un rôle important de ses voies dans la

métacyclogénèse.

Enfin, une étude du mécanisme d'action des drogues anti-Leishmania a mis en évidence un

modèle dichotomique de la mort induite par ces drogues. En effet, l'antimoine, la

miltéfosine et l'amphotéricine B induisent la mort cellulaire programmée par apoptose avec

une accumulation d'oxydants alors que la paramomycine et le methotrexate (drogue

modèle) induisent la mort différemment. L'existence de mécanismes d'action communs, et

notamment l'induction d'un stress oxydant, a également pour conséquence de faciliter, chez

les mutants résistants, l'acquisition de multi-résistances dès lors que la drogue pour laquelle

ils sont sélectionnés induit le même type de mort. Ces résultats présentent des

conséquences importantes relativement aux mécanismes d'acquisition de la résistance et au

développement des thérapies mti-Leishmania.

Ill

Abstract Leishmania parasites are the etiological agent of leishmaniasis, a class of neglected diseases

that affect the poorest regions on earth (India, Sudan, Bangladesh, South America...) and

are among WHO's priorities. Each year, 1.5 to 2 million people are infected with

Leishmania and between 80 000 to 150 000 die. In the absence of an efficient available

vaccine, the treatment of leishmaniasis relies on a limited number of chemotherapeutic

agents. Antimony-based drugs are still the first line of treatment used in endemic countries.

Almost 70 years after the beginning of their use, their mode of action remains poorly

understood. Adding to that, there is a high toxicity and resistance problem, which is taking

epidemic proportions in certain regions.of the world Alternative treatments, mainly

composed of amphotericin B, miltefosine and paromomycin, remain very expensive for the

most affected regions and are also associated to high toxicity, which compromise their use.

In this context, more research on this parasite appears obvious, with the goal to better

understand its biology and eventually to find new ways to fight it.

Three objectives were addressed during my Ph.D. studies and are presented in this thesis:

the two first objectives were about defining the putative role of the pteridine reductase

PTR1 and reduced pterins in the resistance to oxidative stress and in metacyclogenesis of

the parasite. Pterin's metabolism is poorly understood and the role played by these

molecules remains elusive. Metacyclogenesis, which is the process by which the parasite

acquire its infectious form, is also poorly understood. Reduced pterins are known in other

organisms to have anti-oxidants properties and have been associated to Leishmania

metacyclogenesis. We therefore aimed at deciphering their role in these two very important

aspects of the parasite biology. The third objective was linked to the mode of action of anti-

Leishmania drugs and to drug-resistance acquisition. Several drugs known to induce

apoptosis are associated to oxidative stress. We emitted the hypothesis that these drugs

could induce a common mechanism of cell death and that this could favor the acquisition of

multi-drug resistance in resistant mutants.

A study of the role of reduced pterins in the resistance to oxidative stress led to the

demonstration that these molecules could be added to the list of anti-oxidants of the

IV

parasite. Indeed, we showed that reduced pterins contributed to survival of Leishmania

when exposed to oxidative and nitrosative stress from exogenous sources as well when

derived from activated macrophages. Reduced pterins also contributed to the parasite

infectivity. We were therefore able to propose a new role for these molecules.

A comparative proteomic study of the metacyclogenesis between wild-type Leishmania and

a strain in which PTR1 was inactivated allowed the identification of more than 200

differentially expressed proteins. We showed that the number of proteins differentially

expressed was substantially greater in the PTR1 deficient strain. These results indirectly

suggest an implication of PTR1 or reduced pterins in metacyclogenesis. Furthermore, the

variation of expression of several proteins associated to mobility, resistance to oxidative

stress or gene expression mechanisms suggest an important role of these pathways in

metacyclogenesis.

Finally, studying the mode of action of anti-Leishmania drugs led to the establishment of a

dichotomic model of drug-induced cell death. Indeed, antimony, miltefosine and

amphotericin B induced apoptosis with an accumulation of oxidants while paromomycin

and methotrexate (a model drug not used against Leishmania) did not. The existence of a

common mode of action, and especially oxidants accumulation, also favored the

acquisition, in drug-resistant mutants, of multi-drug resistance more easily as long as they

shared the same mode of killing. These results have important consequences in terms of

multi-drug resistance acquisition and anti-Leishmania chemotherapy development.

Avant-propos Parce qu'il à été bien plus qu'un directeur de recherche, je souhaite témoigner ma profonde

gratitude au Dr. Marc Ouellette. J'avais besoin d'un mentor, et j 'en ai trouvé un en sa

personne. J'avais besoin de liberté et j 'ai pu, au sein de son équipe et avec ses

encouragements, développer mes travaux de doctorat dans les directions qu'il me suggérait,

tout en explorant les voies qui me semblaient stimulantes et originales. Pour son talent, sa

disponibilité, son formidable esprit critique et son soutien je le remercie chaleureusement.

Je suis, comme il le dit lui-même, l'un de ses « enfants scientifiques ».

Je remercie bien évidemment les membres de mon jury d'avoir accepté de lire et critiquer

cette thèse de doctorat. Merci aux Drs. Fasel, Papadopoulou et Sato. J'ai une pensée toute

particulière pour le Dr. Sato car je me souviendrai très longtemps, je pense, de nos longues

discussions dans son petit bureau qui ne reflète en rien la largeur de son cœur et de son

esprit. Merci « Dr. Sachiko ».

J'adresse un énorme remerciement aux membres de l'équipe du Dr. Ouellette.

L'atmosphère de cette équipe vaut bien tous les Ph.D. du monde. Une mention spéciale

pour Suzanne (notre « maman du lab » à tous), à Gaétan Roy, au Dr. Jolyne

Drummelsmith, ainsi qu'au Dr. Philippe Leprohon. Un énorme merci au Dr. Danielle

Légaré pour son dévouement au travail et son soutien.

Les cinq lettres du mot « merci » seront également bien peu pour dire tout ce que je

voudrais dire à Dominic Gagnon ainsi qu'à Amin A. Ouameur, mes deux précieux amis.

Amin, je n'oublierai jamais les premiers mois de mon Doctorat ni tout ce que nous avons

partagé par la suite. Dominic, nous savons tous les deux tout ce que tu as fait pour moi et

pour tout ça, je te serai toujours reconnaissant.

À tous ceux que j 'ai côtoyés et qui ont contribué à faire de ce doctorat une expérience

humaine si enrichissante, je souhaite témoigner ma sympathie, tout particulièrement à ceux

qui sont devenus des amis. Mes pensées vont aux Dre. Michaela Muller, Dre. Céline

Deffrasnes et Dre. Alexandra Lambert, pour nos conversations et moments partagés qui

resteront inoubliables.

VI

A ma famille, ma mère, mon père et mon frère, je veux témoigner toute ma reconnaissance

pour leur soutien inconditionnel. Ni l'océan qui nous séparait ni le temps qui s'écoulait n'a

entamé l'amour qu'ils m'ont toujours porté. Aujourd'hui, je sais bien que mon doctorat est

un peu le leur !

Enfin, je voudrai conclure ces remerciements par ces mots : la plus belle chose qui me soit

arrivées au cours de ces dernières années, c'est ma rencontre avec toi, Véro ! Ma plus belle

expérience, c'est toi ! Mon plus beau résultat, c'est ton sourire, lorsque tu me l'offres ! Et la

chose la plus importante que j 'ai apprise, c'est que rien n'est inaccessible. Le monde nous

appartient et bientôt nous le ferons rouler sous nos pieds ! Je t'aime ! !

vu

À ma mère et à mon père, que j'aime profondément,

je dédie bien plus que ces quelques pages.

Ever tried. Ever failed. No matter.

Try again. Fail again. Fail better.

(Samuel Beckett)

Table des matières Résumé i Abstract iii Avant-propos v Table des matières viii Liste des Figures 10 Liste des abréviations 11 Chapitre I. Leishmania et la leishmaniose 13

1.1 Le parasite Leishmania : Généralités 13 1.2 Cycle de vie du parasite 14

1.2.1 Stade extracellulaire promastigote 15 1.2.2 Métacyclogénèse 15 1.2.3 Stade intracellulaire amastigote 17

1.3 La leishmaniose 17 1.3.1 Epidemiologic et distribution géographique 17 1.3.2 Manifestations cliniques 19 1.3.3 Diagnostic 22 1.3.4 Vaccins 24 1.3.5 Traitements 24

Chapitre II. Mode d'action des drogues et mécanismes de résistance 27 2.1 Mécanismes d'action des drogues anti-Leishmania 27

2.1.1 L'antimoine et ses dérivés 27 2.1.2 La pentamidine 28 2.1.3 L'amphotéricine B 28 2.1.4 La miltéfosine 29 2.1.5 La paromomycine 29 2.1.6 Autres molécules : sitamaquine, terbinafine et methotrexate 29 2.1.7 L'induction de l'apoptose par les drogues anti-Leishmania 30

2.2 Nouveau paradigme pour le mode d'action des antibiotiques et des drogues anticancéreuses 33 2.3 Mécanismes de résistance 34

2.3.1 Mécanismes de résistance spécifiques 34 2.3.2 Mécanismes de résistance généraux et nouveau paradigme 41

Chapitre III. Leishmania et les stress oxydatifs 44 3.1 Cycle de vie et stress oxydatifs 44 3.2 Mécanismes de résistance aux stress oxydatifs 45

3.2.1 Les thiols et le métabolisme du trypanothion 46 3.2.2 Les ptérines 49 3.2.3 Autres mécanismes de défense contre le stress oxydatif 50

Chapitre IV. Problématiques, hypothèses et objectifs 52 Problématiques 52 Hypothèses 52 Objectifs 53

Chapitre V. Le rôle des ptérines réduites dans la résistance au stress oxydatif et nitrosatif chez le parasite Leishmania 55

IX

5.1 Résumé 55 5.2 Article 56

Chapitre VI 87 6.1 Résumé 87 6.2 Article 88

Chapitre VII. La tolérance à la mort cellulaire induite par les drogues favorise l'acquisition de résistances multiples chez Leishmania 150

7.1 Résumé 150 7.2 Article 152

Chapitre VIII. Discussion générale 152 8.1 Leishmania et les stress oxydatifs : un nouveau rôle dans la résistance au stress oxydatif pour PTR1 et les ptérines réduites 182 8.2 Analyse protéomique du rôle des ptérines dans la métacyclogénèse du parasite 185 8.3 Dichotomie du mécanisme d'action des drogues anti-Leishmania : implication pour l'acquisition de la résistance 188

Conclusions 192 Bibliographie 193

Liste des Figures

Figure 1. Cycle de vie du Leishmania 11

Figure 2. Distribution géographique des leishmanioses 15

Figure 3. Classification des espèces de Leishmania 16

Figure 4. Manifestations cliniques des différentes formes de leishmanioses 17

Figure 5. Mécanismes de résistances aux drogues 31

Figure 6. Mécanisme de mort cellulaire commun induit par les antibiotiques

bactéricides 39

Figure 7. ROI and RNI produites par les systèmes enzymatique Phox et iNOS dans les

cellules phagocytaire des mammifères 40

Figure 8. Structure chimique du trypanothion ou bis(glutathionyl)spermidine 42

Figure 9. Voie de synthèse et de réduction du trypanothion (TSH) 44

Figure 10. Métabolismes des folates et des ptérines chez Leishmania 45

11

Liste des abréviations ABC ATP-binding cassette

ADN Acide déoxyribonucléique

AIF de l'anglais « Apoptosis inducing factor »

AQP1 Aquaporine 1

ARN Acide ribonucléique

ARNm Acide ribonucléique messager

BT1 Transporteur de bioptérine 1

CR3 Récepteur du complément 3

DAT de l'anglais «Direct agglutination test »

DHFR Dihydrofolate reductase

fPPG Protéophosphoglycan filamenteux

GP63 Glycoprotéine de surface 63

GSH Glutathion

GST de l'anglais « Glutathione S-transferase »

iNOS de l'anglais « Inducible nitric oxide synthase »

LdMT Transporteur de la miltefosine de Leishmania donovani

LPG Lipophosphoglycan

MDMs Macrophage dérivés de monocytes

MDRl de l'anglais « Multidrug resistance protein 1 »

MRP1 de l'anglais « Multidrug resistance-associated protein »

MRPA de l'anglais « Multidrug resistance-associated protein A »

MTX Methotrexate

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide

ODC Ornithine decarboxylase

OMS Organisation mondiale de la santé

PCD de l'anglais « Programmed cell death »

PCR de l'anglais Polymerase chain reaction

PKDL Leishmaniose dermique post-kala-azar

PMN Polymorphonucléaire

12

PRP1 Protéine de résistance à la pentamidine 1

PSG de l'anglais « Promastigote Secretory Gel »

PTR1 Ptéridine reductase 1

RNI de l'anglais « Reactive nitrogen intermediates »

ROI de l'anglais « Reactive oxygen intermediates »

ROS de l'anglais « Reactive oxygen species »

SblII Antimonite ou antimoine trivalent

SbV Antimonate

TDR1 Reductase dépendante des thiols 1

TR de l'anglais « Tryapnothion reductase »

TSH Trypanothion

TST de l'anglais « Trypanothione S-transferase »

VIH Virus de l'immunodéficience humaine

y-GCS y -glutamylcystéine synthetase

A\|/m symbole du potentiel membranaire mitochondrial

13

Chapitre L Leishmania et la leishmaniose

1.1 Le parasite Leishmania : Généralités Leishmania est un parasite protozoaire unicellulaire appartenant à l'ordre des

Kinetoplastidae et à la famille des Trypanosomatidae. Il a été décrit pour la première fois

en 1903 de manière indépendante par William Leishman et Charles Donovan (qui

donneront respectivement leurs nom à l'espèce et à un genre responsable d'une pathologie

humaine, Leishmania donovani, voir section 1.2.2). L'ordre des Kinetoplastidae regroupe

un ensemble d'eucaryotes unicellulaires flagellés qui se distingue par la présence d'une

organelle nommé le kinétoplaste. Le kinétoplaste est une mitochondrie géante fournissant

l'énergie cellulaire nécessaire au fonctionnement de la cellule et au flagelle (du grec kineto

signifiant mouvement). La famille des Trypanosomatidae (du grec trypano signifiant vrille)

regroupent plusieurs parasites dits hémoflagellés. Le genre le plus important, en termes de

nombre d'espèces, est le genre Trypanosoma (regroupant notamment les espèces

responsables de la maladie du sommeil ou trypanosomiase africaine (Trypanosoma brucei)

et de la maladie de Chagas ou trypanosomiase américaine (Trypanosoma cruzi). Le second

genre le plus important est le genre Leishmania responsable de plusieurs pathologies qui

présentent des manifestations cliniques différentes chez l'humain : les leishmanioses (voir

section 1.3.2). Leishmania possède un cycle de vie complexe impliquant un vecteur du

genre Phlebotomus (en Afrique, Asie et Europe, soit le « Vieux Monde ») ou Lutzomyia (en

Amérique centrale et en Amérique du sud, soit le « Nouveau Monde »), communément

dénommé mouche des sables, et un hôte mammifère. Leishmania est un parasite

intracellulaire de son hôte mammifère. Il infecte et se multiplie au sein des cellules

phagocytaires mononucléés, principalement les macrophages (section 1.2). Les

leishmanioses constituent un problème de santé publique majeur dans les pays tropicaux et

subtropicaux, avec une réémergence dans certains pays développés, justifiant les recherches

conduites pour lutter contre les différentes formes de cette maladie. Par ailleurs, ce parasite

est devenu depuis quelques années un modèle d'étude important, de part sa divergence

évolutive précoce au sein du domaine des Eucaryotes et sa biologie unique.

14

1.2 Cycle de vie du parasite Le parasite Leishmania présente un cycle de vie di­morphique. On le retrouve au stade

promastigote chez l'insecte vecteur, au sein duquel il passe de la forme procyclique non

infectieuse à la forme infectieuse métacyclique lors du processus de métacyclogénèse, et

au stade amastigote chez l'hôte mammifère, à l'intérieur duquel il réside et se multiplie

dans les cellules phagocytaires, principalement les macrophages. Au cours de son cycle de

vie, le parasite sera exposé à des environnements et à des stress très différents (notamment

en termes de température, de pH et de stress oxydatifs). Les processus de differentiation qui

accompagnent son cycle de vie jouent un rôle prépondérant dans la biologie du parasite et

constitue un domaine de recherche important, notamment en ce qui concerne l'acquisition

de sa forme infectieuse au cours de la métacyclogénèse, ou encore lors du passage du stade

promastigote au stade amastigote (Figure 1).

Amastigote intracellulaire

Transformation _ ■ ■ ­«w Prolifération

Phagocytose

Attachement

Plqûm \ > r ~ P**0™

ftomastlgotes métacycllques * S W S _ • « m i s â t e s

Prolifération e t \ . / Transformation Métacyclogénèse

Promastigote s procycliques

Figure 1 : Cycle de vie du Leishmania (modifié de Handman, 2001)

15

1.2.1 Stade extracellulaire promastigote Le stade promastigote du Leishmania, caractérisé par des parasites présentant une forme

allongée (11-20 um), flagellée et mobile, se retrouve au niveau de l'insecte vecteur, la

mouche des sables (du genre Phlebotomus ou Lutzomyia). Cette forme est issue de la

differentiation du parasite au stade amastigote suite à l'ingestion de parasites au cours du

repas sanguin de l'insecte sur un hôte mammifère infecté. La differentiation du stade

amastigote au stade promastigote semble être contrôlée par la variation de température et

du pH entre l'insecte vecteur et l'hôte mammifère (37°C et pH 4.5-5 au sein du

phagolysosome de l'hôte mammifère et 25°C et pH légèrement alcalin chez l'insecte

vecteur) [1]. Le stade promastigote est également marqué par un autre processus de

differentiation, au cours duquel le parasite acquiert sa forme infectieuse, lors du passage de

la forme procyclique à la forme métacyclique. Ce processus est dénommé

métacyclogénèse.

1.2.2 Métacyclogénèse Le stade promastigote est le stade au cours duquel le parasite acquiert sa forme infectieuse.

Dans un premier temps, les promatigotes sont peu mobiles et se multiplient rapidement. Ils

sont attachés aux parois de la partie postérieure du tractus digestif de l'insecte vecteur. Cet

attachement est contrôlé par des molécules de surface du parasite, principalement le LPG

(lipophosphoglycan). Le LPG est un glycolipide qui assure la liaison avec une galectine

présente à la surface des cellules épithéliales du tractus digestif de l'insecte [2]. Le LPG est

une molécule très abondante à la surface des promastigotes. Elle est constituée de

répétitions du phospho-disaccharide galactose-mannose qui, selon les espèces de

Leishmania, peuvent être modifiées par des chaînes latérales de longueur variable [3].

L'affinité des galectines des espèces d'insectes vecteurs de Leishmania serait responsable

de la restriction d'espèce entre vecteur et parasites. Il a été estimé qu'il s'écoulait entre 7 et

9 jours entre le repas sanguin et la differentiation complète des promastigotes, de leur

forme procyclique vers leur forme métacyclique. À partir du septième jour, les parasites

entrent dans la phase de métacyclogénèse. L'acquisition de cette forme infectieuse

correspond à une adaptation pré-infection en vue de favoriser la survie du parasite au sein

de l'hôte mammifère. Certaines modifications morphologiques et biochimiques sont

16

associées à ce processus : l'élongation des molécules de LPG présentes à la surface du

parasite lui permet ainsi de résister à la lyse induite par le complément [4] et favorise

l'infection des cellules phagocytaires, et l'augmentation de l'expression de la

metalloprotease GP63 contribue à l'augmentation de la virulence du parasite en assurant la

conversion du fragment du complément C3b en C3bi, favorisant ainsi sa phagocytose [5]

sans flambée oxydative via le récepteur CR3 [6]. D'autres molécules de surface sont

impliquées dans la phagocytose du parasite [7]. Au sein du tractus digestif, les formes

métacycliques migrent vers l'œsophage et le pharynx de l'insecte. Il se forme une

accumulation de parasites qui sécrètent un protéophosphoglycan filamenteux (fPPG)

formant un gel de sécrétion des promastigotes (PSG). Ce gel ainsi que la présence d'un

grand nombre de parasites causent une obstruction qui va forcer l'ouverture de la valve

stomodéale [8-10] lors de la piqûre de l'insecte. En conséquence, l'insecte est obligé de

régurgiter les parasites infectieux avant de prendre un repas sanguin, augmentant ainsi les

chances de transmission. Le PSG est également régurgité et il a été montré qu'il contribuait

significativement à l'établissement de la pathologie. Lorsque les promastigotes

métacycliques sont injectés dans l'hôte mammifère, les cellules polymorphonuclées

(PMN), principalement les neutrophiles, sont les premières cellules recrutées au site

d'inoculation (10-24 heures post-infection) [11]. Les promastigotes sont phagocytés par ces

cellules et retardent leur apoptose, favorisant ainsi l'arrivée subséquente des macrophages

au site d'infection (1 à 2 jours post-infection). Les macrophages phagocytent ensuite les

PMN infectés [12]. L'hypothèse du « cheval de Troie », selon laquelle le parasite aurait la

capacité d'infecter le macrophage « silencieusement », sans activer ses fonctions immunes,

découle de cette observation [13]. Cette hypothèse, qui repose sur le fait que les parasites

resteraient « quiescents » à l'intérieur des neutrophiles, c'est-à-dire sans se différencier en

amastigotes [14], ni se multiplier [13], reste controversée puisqu'il est très probable que les

neutrophiles soient parfaitement en mesure de détruire les parasites phagocytés. Il a

également été rapporté que, bien que la forme métacyclique soit supposément la seule

forme infectieuse, la présence des promastigotes procycliques apoptotiques contribue à

l'établissement de l'infection [15]. Finalement, lorsque les formes métacycliques se

retrouvent dans la vacuole phagocytaire du macrophage, laquelle fusionne avec les

17

lysosomes pour former le phagolysosome, les parasites se différencient en leur forme

amastigotes.

1.23 Stade intracellulaire amastigote Le stade amastigote correspond à la forme du parasite la mieux adaptée à sa survie dans

l'environnement du phagolysosome. Cette differentiation est induite par le changement

d'environnement (de 25°C et pH légèrement alcalin chez l'insecte vecteur à 37°C et pH

4.5-5 au sein du phagolysosome) (revu dans [1]). Les amastigotes (4 à 5 urn) sont non

mobiles, ronds et de formes réduites par rapport aux promastigotes. Ils se multiplient de

manière active au sein de la vacuole du phagolysosome et font finalement éclater les

macrophages, puis infectent d'autres cellules. Le mécanisme de libération des amastigotes

n'est pas totalement caractérisé. L'éclatement à été présumé comme mécanisme principal

en raison du grand nombre d'amastigotes présents dans le phagolysosome, mais des études

ont suggéré que le parasite pouvait manipuler le mécanisme d'exocytose du macrophage

afin de favoriser sa libération sans augmenter la réaction inflammatoire qu'induit un

éclatement [16].

1.3 La leishmaniose

1.3.1 Epidemiologic et distribution géographique Les leishmanioses représentent un enjeu majeur de santé publique à l'échelle de la planète

et figure sur la liste prioritaire des maladies négligées établie par l'OMS. Elles affectent

principalement et plus fortement les régions tropicales et subtropicales. Il y a 350 millions

de personnes qui vivent dans des régions à risque et la prévalence globale est estimée à 12

millions de personnes (Figure 2). Chaque année, 1.5 million à 2 millions d'individus

développent des symptômes cliniques. Ceux-ci se répartissent entre les formes cutanées (1

à 1.5 millions, voir section 1.2.2.2 et 1.2.2.3) et la forme viscérale (0.5 million, voir section

1.2.2.1) selon l'espèce de Leishmania. Les leishmanioses sont associées à 2.4 millions

d'années de vies ajustées sur l'incapacité et on estime qu'elles sont responsables de 80 000

à 150 000 décès par année [17].

18

Figure 2 : Distribution géographique des leishmanioses (à partir de Handman. 2001). Les régions affectées

par la leishmaniose viscérale son indiquées en vert et par la leishmaniose cutanée ou mucocutanée en rouge.

Les régions où les deux formes de leishmaniose coexistent sont indiquées en violet.

Le parasite est endémique dans 88 pays dont certains comptent parmi les plus pauvres de la

planète. En effet, 90% des cas de leishmanioses cutanées sont retrouvés en Afghanistan, au

Pakistan, en Syrie, en Arabie Saoudite, en Algérie, en Iran, au Brésil et au Pérou. De même,

90% des cas de leishmanioses viscérales sont retrouvés en Inde, au Bengladesh, au Népal,

au Soudan et au Brésil. Au regard de cette distribution géographique, il est aisé de constater

que la leishmaniose est associée à la pauvreté et constitue en cela une maladie négligée. Par

ailleurs, on constate la réémergence de foyers épidémiques en Israël et au Maroc, ainsi

qu'aux États-Unis (en tant que zoonose) [18-20]. D'autre part, les cas d'infections de

soldats occidentaux et de voyageurs en zones d'endémies, ainsi que la recrudescence des

cas de co-infections (notamment chez des personnes atteintes par le VIH) au niveau du

pourtour méditerranéen et du Brésil (mais également en Afrique et en Asie) font que cette

maladie n'est plus seulement restreinte aux régions pauvres de la planète [21-26]. Il est

important de noter que la plupart des leishmanioses sont des zoonoses et que les

19

mammifères domestiques ou sauvages en sont les réservoirs. Ces animaux sont

relativement bien adaptés à l'infection par Leishmania et développent des infections

mineures pouvant persister plusieurs années (à l'exception des chiens, qui constituent un

réservoir important pour L. infantum, l'agent de la leishmaniose viscérale, et développent

les symptômes cliniques sévères de la maladie). Dans la plupart des cas, l'homme n'est

qu'un hôte intermédiaire et accidentel de ce parasite (à l'exception de L. donovani, en Inde

et en Iran).

1.3.2 Manifestations cliniques Les leishmanioses prennent diverses formes cliniques, selon l'espèce qui infecte l'humain.

Les espèces infectant les mammifères, et par conséquent les humains, peuvent être classées

en deux sous-genres, Leishmania et Viannia, selon que le parasite se développe

respectivement dans la partie centrale ou postérieure du tractus digestif de l'insecte vecteur

(Figure 3).

Ordre

l'.iinilU'

Genres

Sous-genres

Complexes

Kspèces

Kinetoplastidae

Trypanosomatidae

( "rithidia Herpetontonas Leishmania Phytomonas Leptomonai Suuroleishmania Trypanosoma Endotrypuniim

J r

Leishmania I

1 I iannia

I 1 1 I » < ' 1 /.. ilimoruni L. tropica t.. major !.. acthiopica L. mtxicana L. hraziliensis L. guyaittntis

L. archihalili L. killicki L. major t.. acthiopica t.. amazoncnsis t.. acthiopica t.. guyaittnni I... chagasi L. tropica t.. gamhami t.. peruviana L. panamensis /„ ilonovam L. mexicana L. infantum L. pifanoi

L. rcnezuelcnsia

l~ tarentoalu

Figure 3 : Classification des espèces de Leishmania.

Les infections par Leishmania se manifestent de différentes manières, qui vont de la simple

lésion cutanée évoluant spontanément vers la cicatrisation et la guérison, jusqu'à la forme

20

viscérale toujours létale lorsque non traitée, en passant par une forme mucocutanée

généralement non létale mais fortement débilitante et incapacitante (Figure 4).

Figure 4 : Manifestations cliniques des différentes formes de leishmanioses

A, forme viscérale (Kala Azar ou fièvre noire) ; B, forme cutanée (bouton d'orient);

C. forme muco-cutanée (tiré de www.who.int)

1.3.2.1 La leishmaniose viscérale La leishmaniose viscérale ou Kala-Azar (signifiant « fièvre noir » en Hindi et ainsi nommée

à cause de la coloration noire de la peau qui apparaît sur les extrémités et l'abdomen) est

causée par les espèces au tropisme viscéral : L. donovani et L. infantum dans le

« Vieux Monde » et L. chagasi dans le Nouveau Monde, particulièrement au Brésil. L.

infantum et L. chagasi sont deux espèces génétiquement identiques. La pathologie est

causée par la multiplication du parasite dans les cellules phagocytaires mononucléés des

organes viscéraux comme le foie, la rate, la moelle osseuse et les ganglions lymphatiques.

De manière habituelle, les patients atteints de leishmaniose viscérale présentent un

ensemble de symptômes incluant la fièvre, la toux, des douleurs abdominales, de la

diarrhée, des épistaxis (saignements du nez), de la cachexie (perte progressive de poids,

anémie, fatigue, perte musculaire, perte d'appétit) et enfin un gonflement progressif de la

rate (splénomégalie) et du foie (hépatomégalie). Les enfants, les personnes

immunodéprimées et souffrantes de malnutrition sont particulièrement sensibles au

21

développement de la maladie. La leishmaniose viscérale est une maladie chronique dont

l'évolution peut prendre plusieurs années. Elle aboutit généralement à la mort en 2 à 3 ans

si elle n'est pas traitée. Sous sa forme aiguë, la mort peut survenir en 6 à 12 mois.

1.3.2.2 La Leishmaniose cutanée

La leishmaniose cutanée est causée par les espèces au tropisme cutané (avec quelques

exceptions). On retrouve principalement les espèces L. major, L. tropica et L. aethiopica (et

exceptionnellement L. donovani dans le « Vieux Monde » et les espèces

L. mexicana, L. panamensis, L. amazonensis, L. peruviana, L. braziliensis et L. guyanensis

dans le «Nouveau monde» [27]. Les formes cliniques de la leishmaniose cutanée sont

connues depuis l'antiquité et on a d'ailleurs retrouvé des statuettes de l'époque Maya

portant les représentations des séquelles causées par cette forme de leishmaniose.

Classiquement, la leishmaniose cutanée se manifeste par des lésions de la peau localisées et

généralement limitées au site d'inoculation (suite à la piqûre de la mouche des sables) [28].

L'apparition des lésions, ulcéreuses ou non, est précédée d'une période d'incubation allant

de 2 semaines à 3 mois. Ces lésions sont indolores et évoluent spontanément vers la

résorption en quelques mois mais elles laissent généralement une cicatrice importante et

irréversible. La leishmaniose cutanée porte également le nom de « bouton d'orient »

1.3.2.3 La Leishmaniose muco-cutanée, cutanée diffuse et cutanée post-kala-azar La leishmaniose muco-cutanée est principalement causée par L. braziliensis, L. guyanensis

et L. panamensis. Elle se retrouve en Amérique centrale et en Amérique du Sud où elle est

également nommée « espundia ». Cette forme de leishmaniose fait généralement suite à une

première leishmaniose de type cutanée et se caractérise par une destruction progressive des

muqueuses et des cartilages au niveau du nez, de la bouche, des lèvres, des gencives, du

palais ou des oreilles. Elle conduit à une défiguration irréversible et entraine des

conséquences sociales dévastatrices au sein des populations affectées (suicide ou

marginalisation des personnes atteintes). La mort peut également survenir suite à des

infections bactériennes secondaires ou pour cause de malnutrition. Ce type de leishmaniose

survient dans 1-5% des cas de leishmaniose cutanée primaire, et peut se développer jusqu'à

5 ans après la primo-infection [29, 30]. La leishmaniose cutanée diffuse correspond à une

22

forme sévère de la leishmaniose cutanée. Elle se caractérise par la présence de multiples

nodules non-ulcéreux et riches en parasites qui finissent par converger et fusionner pour

recouvrir le corps au complet, y compris le visage. Cette évolution de la leishmaniose

cutanée semblerait correspondre à un défaut de la réponse immunitaire cellulaire. Elle est

également résistante aux traitements classiques anti-Leishmania et ne guérit jamais

spontanément. Une étude récente a montré que la métastacisation des lésions cutanées au

cours d'une leishmaniose cutanée pouvait être corrélé avec la présence d'un virus intégré

dans le génome de Leishmania et qui induisait une réponse immunitaire accrue suite à sa

détection par le système immunitaire de l'hôte. Enfin, la leishmaniose cutanée post-kala-

azar est une forme particulière de la leishmaniose viscérale. Elle est particulièrement

fréquente en Inde et au Soudan. La durée de latence suite à la première infection de type

viscérale varie entre 6 mois et 2-3 ans et peut parfois même se développer avant que les

symptômes de leishmaniose viscérale aient complètement disparus. Les lésions cutanées

qui surviennent alors de manière localisée autour de la bouche et s'étendent ensuite

généralement sur l'ensemble du corps évoluent spontanément vers la guérison dans les 6

mois qui suivent leur apparition mais peuvent également persister plusieurs années. Cette

forme de leishmaniose est particulièrement infectieuse puisque les nodules contiennent un

nombre important de parasites et jouent donc un rôle non négligeable dans la propagation

de la maladie en agissant comme réservoir de parasites.

1.3.3 Diagnostic Le diagnostic de l'infection à Leishmania représente un point critique de la lutte contre

cette maladie. L'OMS a établie qu'un cas clinique de leishmaniose viscérale se définit par

une fièvre persistante (plus de deux semaines) associée à une splénomégalie chez une

personne résidant en zone endémique (ou qui y a demeurée). La combinaison de ces deux

symptômes se retrouve dans la majorité des cas de leishmaniose viscérale bien que la

splénomégalie ne soit pas toujours présente. Ceci a conduit certains programmes de

contrôle de la leishmaniose viscérale à ajouter d'autres symptômes à cette définition

comme la cachexie et principalement le dépérissement et l'anémie qui y sont associés, ainsi

qu'une lymphadénopathie. Malheureusement, cette définition clinique manque de

spécificité puisque ces signes cliniques sont associés à d'autres pathologies également

23

présentes en zones d'endémies de la leishmaniose viscérale, comme la tuberculose, la

malaria, la fièvre entérique, la brucellose, la lèpre, les schistosomiases ou encore certains

cancers. Si on prend en compte le coût élevé et la forte toxicité des traitements actuellement

disponibles pour la leishmaniose viscérale, il est inconcevable de décider d'un traitement

anti-Leishmania en se basant seulement sur la suspicion clinique d'une telle infection. [31,

32] C'est en cela que réside tout l'enjeu d'un diagnostic confirmatoire probant pour cette

pathologie. Ils existent d'ores et déjà plusieurs techniques permettant d'établir ce

diagnostic, mais celles-ci ne sont pas toujours adaptées aux moyens des praticiens

hospitaliers dans les zones d'endémies, généralement pauvres et sous-équipées en ce qui

concerne le matériel requis. De manière générale, ces techniques reposent sur l'observation

du parasite, la détection de son ADN ou d'anticorps spécifiques de Leishmania dans les

échantillons cliniques. Ainsi, les biopsies réalisées à partir d'aspirations de moelle osseuse,

du foie ou ganglions lymphatiques sont utilisées dans les cas suspectés de leishmanioses

viscérales. Les biopsies directes de la peau au niveau de lésions cutanées seront employées

dans le cas des leishmanioses cutanées. Dans les deux cas, le matériel biologique collecté

pourra être examiné directement sous microscope après étalement sur lame, être cultivé

pour identification subséquente, ou soumis à des techniques de PCR. L'observation directe

des parasites nécessite leur coloration au Giemsa et permet la visualisation directe des

parasites sous leur forme amastigote intracellulaire. Elle demeure la technique de choix en

zone d'endémie en raison de son faible coût mais requière une bonne expérience en plus de

sa sensibilité relativement variable et de son incapacité à distinguer les espèces de

Leishmania. La culture des parasites, relativement longue, permettra cependant la

caractérisation de l'espèce par la technique d'electrophorese iso-enzymatique ou par PCR.

Il existe également deux méthodes sérologiques standardisées et commercialement

disponibles pour l'usage « sur le terrain ». Il s'agit du test dit « d'agglutination directe »

(DAT, Direct Agglutination Test) [33-35] et du test dénommé « test rK39 » [36-40]. Le test

d'agglutination direct consiste en la mise en présence d'une fraction lyophilisée de

leishmanies avec le sérum du patient. Si le sérum du patient contient des anticorps anti-

Leishmania, une agglutination est visible en moins de 20 h. Le test rK39 est basé sur la

détection d'anticorps dirigés contre un epitope de 39 acides aminés conservés chez les

espèces viscéro-tropiques. Ce test est réalisé sur une bande immuno-chromatographique à

24

partir d'une goutte de sang du patient, ce qui en fait un test bien adapté au diagnostic « sur

le terrain ». Il est par ailleurs peu coûteux (1 US$ / test), rapide (environ 20 minutes) et

présente une très forte sensibilité. Sa limite réside dans sa sélectivité pour les espèces

responsables de la leishmaniose viscérale.

1.3.4 Vaccins Il n'existe pas de vaccin disponible contre la leishmaniose. Cependant, l'immunité

protectrice que certaines personnes développent après avoir été exposées au Leishmania

indique qu'il est possible d'induire une telle protection par la vaccination. L'efficacité d'un

vaccin anti-Leishmania repose sur la capacité d'induire une réponse immunitaire à

médiation cellulaire de type Thl et d'induire une mémoire immunologique de longue

durée. Une réponse immunitaire de type Th2 est invariablement associée à une sensibilité

au parasite et à une exacerbation des symptômes. L'induction des cytokines associées à une

réponse de type Thl (IL-22,1-12, IFNy et TNF0) ou à une réponse de type Th2 (IL-4, IL-

10, IL-13) représente donc un point essentiel au niveau du développement d'un vaccin anti-

Leishmania. La plupart des vaccins reposent aujourd'hui sur des formulations de type

vaccin-recombinant et n'induisent qu'une immunité partielle insatisfaisante. Une approche

originale consiste en l'utilisation de Leishmania tarentolae, parasite du lézard non

pathogène pour l'humain, qui a démontré des capacités d'induction d'une réponse de type

cellulaire chez la souris, et pourrait servir de vecteur d'antigènes d'espèces pathogènes.

[41-44]

1.3.5 Traitements La lutte contre la leishmaniose repose, en l'absence de vaccin efficace, sur l'administration

de composés chimiques. La chimiothérapie anti-Leishmania est peu diversifiée et la

première ligne de traitement, constituée des dérivés de l'antimoine, est utilisée depuis plus

de 70 ans. Par ailleurs, la résistance à ces dérivés d'antimoine, majoritairement utilisés dans

les régions endémiques pauvres, pose un problème de plus en plus important auquel

s'associe le coût élevé ou la toxicité des thérapies alternatives, comme la pentamidine,

l'amphotéricine B, la miltéfosine ou encore la paromomycine. Ces molécules aux

propriétés anti-Leishmania seront présentées brièvement dans cette partie. Les mécanismes

25

d'action et de résistance qui y sont associés seront développés ultérieurement (parties 2.1 et

2.3 respectivement).

1.3.5.1 L'antimoine et ses dérivés L'antimoine pentavalent (sous la forme de stibogluconate de sodium ou d'antimoniate de

meglumine) constitue le principal traitement utilisé contre les différentes formes de

leishmanioses. L'antimoine est un métalloïde aux propriétés physico-chimiques similaires à

celle de l'arsenic, dont les dérivés sont utilisés dans le traitement des trypanosomiases

africaines. Les dérivés d'antimoine présentent un certains nombre d'inconvénients : la

nécessité d'une administration parentérale quotidienne pour une durée prolongée, une

toxicité non négligeable (pancréatites, myalgies, nausée, toxicité rénale, vomissements,

troubles cardiaques). Ces molécules constituent néanmoins toujours les traitements de

première lignes dans la plupart des régions endémiques pauvres de la leishmaniose, et ce en

dépit de leur forte toxicité et des hauts niveaux de résistance [45].

1.3.5.2 La pentamidine La pentamidine est un diamidine aromatique utilisé comme traitement de second choix

depuis plus de 40 ans dans les cas leishmanioses cutanées ou dans les cas de leishmanioses

viscérales lorsque les patients sont réfractaires à l'antimoine [46]. Son utilisation est en

déclin en raison d'une résistance croissante [45, 46] et de la toxicité importante qui y est

associée, relative notamment aux problèmes d'hypotension, d'hypoglycémie et de toxicité

rénale.

1.3.5.3 L'amphotéricine B L'amphotéricine B est un antibiotique polyene originellement développé pour le traitement

des infections fongiques. Il présente une très bonne efficacité dans le traitement des

leishmanioses, ce qui en fait une drogue de choix. Elle présente néanmoins une forte

toxicité, notamment au niveau rénal, et des cas de chocs anaphylactiques sévères ont été

rapporté lors de la première injection. Par ailleurs la nécessité de l'administrer par voie

intraveineuse représente un inconvénient majeur, en plus de son coût relativement élevé. La

26

formulation liposomale présente une toxicité moindre mais reste réservée aux pays riches

[47].

1.3.5.4 La miltéfosine

La miltéfosine ou hexadecylphosphocholine, est un phospholipide analogue de la

phosphocholine développé initialement pour le traitement des cancers. Son autorisation

clinique en Inde [17, 48], en Allemagne et en Colombie en 2003 fait suite à la découverte

de ses propriétés leishmanicides contre les espèces L. infantum et L. donovani [49-51].

Malgré des effets secondaires gastro-intestinaux, la miltéfosine est relativement sécuritaire

et permet un traitement complet des leishmanioses [52, 53]. Cependant, de possibles effets

tératogènes ont été démontrés dans des études utilisant des modèles animaux [54] ce qui

rend son utilisation délicate chez les femmes. Le principal avantage de la miltéfosine réside

dans son administration par voie orale.

1.3.5.5 La paromomycine La paromomycine est un antibiotique de la famille des aminoglycosides utilisé dans le

traitement des infections bactériennes. L'identification de son activité anti-Leishmania

remonte aux années 60, mais l'autorisation de son utilisation clinique date seulement de

2006 (en Inde) suite au développement d'études cliniques coordonnées par l'OMS/TDR

(www.who.int/tdr). L'efficacité de la paromomycine est similaire à celle de

l'amphotéricine B [55, 56]. Cependant, son utilisation présente certains inconvénients

majeurs : elle doit être administrée par voie intramusculaire et cause des douleurs et

irritations au site d'injection ainsi que des dommages au niveau de l'oreille interne [31].

L'avantage principal lié à son utilisation réside dans son moindre coût.

1.3.5.6 Autres molécules : sitamaquine, terbinafïne et azotés D'autres molécules présentent un potentiel anti-Leishmania relativement intéressant et sont

présentement à différent stade de développement. Parmi les plus avancés on retrouve la

sitamaquine et les azolés. La sitamaquine est un 8-aminoquinoline. Elle a été développée

initialement pendant la seconde guerre mondiale comme remplacement potentiel de la

primaquine (comme anti paludique). C'est un analogue structural de la primaquine. Elle est

27

administrée oralement et à passé avec succès les phases I/II des études cliniques contre la

leishmaniose viscérale au Brésil et au Kenya [57]. Cependant des études de toxicités

complémentaires sont en cours afin de vérifier la néphrotoxicité constatée lors des études

cliniques. La terbinafïne est une autre molécule prometteuse pour le traitement de la

leishmaniose. Elle a récemment été décrite comme un antifongique du groupe des

allylamine. La drogue est relativement sécuritaire et présente peu d'effets secondaires. Les

premiers essais cliniques de phase I/II sont actuellement en cours [58]. Deux autres

molécules, le fluconazole et le kétoconazole, appartiennent à la famille des azolés et

possèdent des propriétés anti-Leishmania. Ce sont des anti-fongiques qui possèdent un

mécanisme d'action similaire à celui de l'amphotéricine B. Cependant, leur efficacité

contre Leishmania demeure relativement limitée et les résultats des quelques études

cliniques conduites sont controversées [59].

Chapitre II. Mode d'action des drogues et mécanismes de résistance

2.1 Mécanismes d'action des drogues anti-Leishmania

2.1.1 L'antimoine et ses dérivés. Il est intéressant de noter que malgré l'utilisation de l'antimoine depuis plus d'un demi-

siècle, le mode d'action et les cibles cellulaires de cette drogue n'ont toujours pas été

identifiées. Son action anti-Leishmania semble être multifactorielle. L'antimoine

pentavalent (SbV) est une pro-drogue qui nécessite d'être réduit sous sa forme trivalente

(SblII), pour être active. Cette réduction est assurée par les thiols intracellulaires et par les

reductases dépendates des thiols (ACR2, TDR1), [60, 61]. Comme mentionné

précédemment, le mécanisme d'action de l'antimoine reste élusif, principalement dû au fait

que l'antimoine est un métal lourd très réactif et qu'il ne possède probablement pas de

cibles cellulaires spécifiques comme la plupart des autres drogues. Plusieurs cibles

cellulaires putatives ont néanmoins été proposées. Elles incluent l'ADN topoisomérase [62-

64] et la trypanothione reductase [65, 66], deux enzymes essentielles dans la biologie du

parasite, la première participant au bon fonctionnement du cycle de replication de l'ADN et

28

la seconde assurant la réduction du trypanothion, le principal thiol des Trypanosomatidae.

D'un autre coté, on pense que le mode d'action de l'antimoine est basé sur sa capacité à

inhiber l'activité métabolique du parasite, notamment la glycolyse et la respiration

mitochondriale [67]. Une depletion des thiols intracellulaires, en rapport avec l'inhibition

de la trypanothione reductase, a été observée. L'antimoine induit également un stress

oxydatif au sein du parasite [68, 69], lequel conduit à la fragmentation de l'ADN

génomique. La mort induite par l'antimoine présente les caractéristiques de la mort

cellulaire programmée par apoptose [70-72]. L'induction de la mort cellulaire par apoptose

par les drogues anti-Leishmania sera l'objet de la partie 2.1.7 de ce chapitre.

2.1.2 La pentamidine Les bases mécanistiques de l'activité anti-Leishmania de la pentamidine sont mal définies.

Sa cible cellulaire demeure inconnue, comme pour l'antimoine. Cependant, certaines études

menées chez le parasite Crithidia oncopelti suggèrent que la drogue inhibe la synthèse de

l'ADN, de l'ARN, des phospholipides et des protéines [73]. D'autres études suggèrent que

la drogue s'accumule au niveau de la mitochondrie de la cellule [74] et, en effet, il a été

montré que la pentamidine potentialise l'effet des inhibiteurs de la chaîne de respiration

mitochondriale [75]. Les travaux du laboratoire ont également pu mettre en évidence

l'accumulation d'oxydants intracellulaire chez Leishmania suite à un traitement avec la

pentamidine. La mort induite semble également être de nature apoptotique et ceci corrèle

avec les perturbations mitochondriales potentiellement induites par la drogue. Il n'en reste

pas moins que cette drogue est considérée comme ayant un mode d'action inconnu.

2.13 L'amphotéricine B Les propriétés antifongiques et antiparasitaires de l'amphotéricine B sont basées sur sa

capacité à interagir avec les ergostérols membranaires qui constituent les sterols les plus

abondants dans la membrane du Leishmania [76, 77]. Sa spécificité est également basée sur

cette affinité pour l'ergostérol plutôt que pour le cholestérol, constituant des membranes

cellulaires des mammifères. L'interaction de l'amphotéricine B avec l'ergostérol du

Leishmania induirait la formation de pores qui déstabiliserait la fluidité de la membrane du

29

parasite [77]. D'autre part, la mort cellulaire induite par l'amphotéricine B présente

également les caractéristiques de la mort par apoptose [70].

2.1.4 La miltéfosine L'activité leishmanicide de la miltéfosine a été associée à la perturbation du métabolisme

des phospholipides alkyles [78, 79]. Son analogie structurale avec la phosphocholine est à

la base de son interférence avec ce métabolisme essentiel au parasite. Par ailleurs, il a été

montré que la miltéfosine induisait également la mort cellulaire par apoptose [70, 80, 81].

2.1.5 La paromomycine La paromomycine appartient à la même famille d'antibiotiques que la néomycine. Chez les

bactéries, il a été clairement établi que la paromomycine se liait aux ribosomes et bloquait

la synthèse protéique. Il à également été démontré chez Leishmania que cette drogue

interagissait avec les ribosomes du parasites, bloquant également la synthèse protéique et

induisant sa mort de cette manière [82-85]. Le mécanisme sous-jacent consiste en la

fixation par la drogue du complexe ribosomal 30S-50S avec le codon initiateur de l'ARN

messager, ce qui conduit à l'accumulation de complexes d'initiation anormaux. Cela

induirait également des erreurs de lectures de l'ARN messager et subséquemment

l'incorporation incorrecte d'acide aminés dans la chaine polypeptidique en elongation [56].

Il a également été suggéré que certaines enzymes mitochondriales pourraient être la cible

de cette drogue, et qu'elle causerait également une altération de la fluidité membranaire

ainsi que du métabolisme lipidique [82-84]. Jusqu'à présent, la mort induite par la

paromomycine n'a pas été associé à la mort par apoptose.

2.1.6 Autres molécules : sitamaquine, terbinafïne et methotrexate Le mécanisme d'action de la sitamaquine est inconnu. La sitamaquine est une base faible

lipophilique qui s'accumule rapidement dans les compartiments subcellulaires acidiques du

parasite, principalement les acidocalcisomes. Il a été suggéré que l'alkanylisation induite

par la sitamaquine dans les acidocalcisomes pourrait être impliquée dans son action anti-

Leishmania. Par ailleurs, il a également été démontré que la sitamaquine possédait une

affinité pour les phospholipides de la membrane plasmique du parasite, et que lors de son

30

accumulation, elle altérait les fonctions mitochondriales, ce qui pourrait également

contribuer à son mode d'action [86-88]. Le mécanisme d'action de la terbinafïne repose sur

sa capacité à inhiber la synthèse de l'ergostérol membranaire, principal sterol constituant la

membrane plasmique du Leishmania. La terbinafïne inhibe la squalène-2,3-epoxidase ce

qui résulte en une accumulation de squalène et une diminution de la quantité de sterols C28

et C29 essentiels à la composition de la membrane. Ceci constitue la base de l'activité

cytotoxique de la terbinafïne [89].

Le methotrexate n'est pas une drogue utilisée dans les traitements de la leishmaniose (et ne

figure pas non plus parmi la liste des drogues en phase clinique). Néanmoins, cette drogue

utilisée en chimiothérapie contre les cancers ou l'arthrite à été très utilisée dans l'étude des

mécanismes de résistance de Leishmania et constitue en ceci un modèle [90, 91]. Le

mécanisme d'action du methotrexate repose sur l'utilisation des transporteurs de folates

comme voie d'entrée dans la cellule (par analogie structurale) et l'inhibition de la

dihydrofolate-réductase (DHFR), enzyme essentielle au métabolisme des folates.

Leishmania est auxotrophe pour les folates et dépend de son système de transporteurs

membranaire (famille FBT, revue dans [90]) pour ses besoins. De plus, les folates réduits,

produits de l'activité enzymatique de la DHFR, sont des composés essentiels à divers

métabolismes cellulaires car ils assurent la fonction de donneurs d'unités mono-carbonées.

2.1.7 L'induction de l'apoptose par les drogues anti-Leishmania Les mécanismes cellulaires conduisant à la mort cellulaire programmée (PCD) par apoptose

ont originellement été découverts en 1972 par Kerr et al. La PCD constitue une partie

essentielle de la biologie cellulaire et on pense qu'elle à évolué non seulement pour réguler

la croissance et le développement des organismes pluricellulaires [92, 93], mais également

pour protéger contre les infections virales, bactériennes et parasitaires [94-98] et

l'émergence de cancers [99-102]. L'élimination des cellules indésirables par la voie

apoptotique est efficace et prévient l'initiation de la réaction inflammatoire. La PCD peut

être initiée par de multiples signaux intra- et extracellulaires, et elle est coordonnée par un

réseau complexes de régulateurs et d'effecteurs. Brièvement, chez les eucaryotes supérieurs

ils existent deux voies principales d'induction de l'apoptose : 1) la voie extracellulaire qui

31

fait intervenir des couples récepteurs-ligands dits « récepteurs-ligands de mort, et dont nous

ne parlerons pas car son existence n'a jamais été démontré ni même suggéré chez les

organismes unicellulaires, et il à été suggéré que l'apparition de cette voie d'activation de

l'apoptose serait un événement évolutif lié à l'apparition de la multi-cellularité. 2) la voie

intracellulaire, dont le point de contrôle principal est la mitochondrie. Cette organelle joue

un rôle prépondérant dans le mécanisme apoptotique et est considéré comme un « point de

non retour » dans le cheminement vers la mort de la cellule. À partir de ces deux voies,

l'algorithme de l'apoptose fait intervenir plusieurs acteurs moléculaires conduisant aux

modifications morphologiques et à la destruction de la cellule telle que décrite plus haut.

Parmi ces acteurs moléculaires, les caspases (de l'anglais Cystéine-dependent ASpartate-

cleaving ProteASES) sont parmi les effecteurs finaux qui orchestrent la destruction de la

cellule. Plusieurs molécules sont également relâchées à partir de la mitochondrie, suite à sa

perméabilisation, notamment le cytochrome c et l'AIF (Apoptosis Inducing Factor ou

Facteur Induisant l'Apoptose). Il est classiquement admis que la voie caspases-dépendante,

est la voie de prédilection, bien qu'une voie caspases-indépendante a clairement été

démontrée [103-107]. Parmi les signaux initiateurs de la PCD, on trouve les stress

cellulaires et la depletion en facteurs de croissance ou en sérum, [93, 108, 109]. Au final, et

indépendamment du stimulus, la PCD sera marquée par des modifications de la

perméabilité de la membrane plasmique, la condensation nucléaire, la fragmentation de

l'ADN et ultimement celle de la cellule en corps apoptotiques qui seront phagocytés par les

cellules environnantes [108]. En plus de ces modifications morphologiques grossières, il

existe d'autres changements physiologiques cellulaires plus subtils, comme l'altération de

la perméabilité membranaire de la mitochondrie résultant en la perte du potentiel

transmembranaire mitochondrial (Avj/m), l'augmentation du niveau intracellulaire

d'oxydants et l'activation de proteases et de nucleases. Ces modifications physiologiques

constituent les caractéristiques principales de la mort cellulaire programmée par apoptose

[110,111].

Malgré les controverses des dix dernières années relatives à l'existence de la mort cellulaire

programmée par apoptose chez les organismes unicellulaires comme les protozoaires (revue

dans [72, 112]), il est désormais bien établi que ces mécanismes existent et qu'ils jouent

plusieurs rôles importants dans la biologie de ces organismes, comme Leishmania [15, 72,

32

112-122]. Parmi ces rôles importants, on retrouve notamment le contrôle de la population

via un mécanisme de sélection clonale et l'échappement face au système immunitaire. Les

concepts de « mort altruiste » et de «mimétisme apoptotique» [15] illustrent ces rôles

fondamentaux que jouent ce type de mort dans l'établissement de l'infection par les

Leishmania. Ces deux concepts concernent la capacité du parasite à utiliser la mort

cellulaire par apoptose, immunologiquement silencieuse, pour déjouer le système

immunitaire et favoriser ainsi son développement au sein de l'hôte mammifère. Certains

des mécanismes cellulaires conduisant à la mort par apoptose ont été caractérisés.

Néanmoins, et contrairement aux mécanismes de l'apoptose qui sont maintenant bien

connus chez les eucaryotes supérieures, les acteurs moléculaires et cellulaires qui

constituent l'algorithme de ce type de mort sont beaucoup moins bien connus chez les

parasites. Néanmoins, les modifications morphologiques et biochimiques mentionnées

précédemment et caractéristiques de l'apoptose, sont tous présents chez Leishmania. On

retrouve notamment l'accumulation d'oxydants intracellulaires, la perte du potentiel

mitochondriale (Ai|/m), la dégradation de l'ADN génomique, l'externalisation de la

phosphatidylsérine (PS) et la décomposition de la cellule en corps apoptotiques [120, 123].

Le calcium intracellulaire (Ca2+) ainsi que le fer (Fe2+) jouent un rôle important dans le

mécanisme conduisant à la mort [70]. Des controverses subsistent cependant relativement à

l'activité de type « caspases » puisque ces effecteurs protéiques ne sont pas codés par le

génome du parasite [15, 72, 112]. Il a été montré que l'apoptose est induite chez

Leishmania en réponse à divers traitements, dont certains nous intéressent particulièrement.

En effet, le SblII [71], la miltéfosine [80, 81, 124], l'amphotéricine B [125] ainsi que la

pentamidine, induisent la mort par apoptose chez Leishmania. Plus précisément, il a été

montré que ces composés induisaient au moins une des caractéristiques de l'apoptose

(incluant une augmentation du Ca2+ intracellulaire, l'accumulation d'oxydants, une perte

du A\)/m, la dégradation de l'ADN génomique et l'externalisation de la PS, ainsi que des

activités de type caspases).

Il est intéressant de noter que plusieurs des drogues anti-Leishmania, possédant des cibles

cellulaires et des mécanismes d'actions a priori très différents, induisent le même type de

mort cellulaire. Ce constat de l'existence d'un mécanisme effecteur commun, et les données

bibliographiques relatives aux mécanismes d'action des antibiotiques et des drogues

33

anti cancéreuses nous ont conduit à formuler l'hypothèse d'un mécanisme commun de mort

cellulaire induite par les anti-Leishmania, indépendant de la drogue utilisés, de sa cible

cellulaire et du mécanisme d'action. Ceci fait l'objet du troisième article présenté dans cette

thèse.

2.2 Nouveau paradigme pour le mode d'action des antibiotiques et des drogues anticancéreuses. Les antibiotiques ont traditionnellement été classés en fonction de leur mode d'action. Ce

mode d'action étant généralement défini par leurs cibles cellulaires, ils ont classiquement

été classés en groupes déterminés par cette cible: les antibiotiques ciblant la synthèse de la

paroi cellulaire (e.g. pMactam), les ribosomes et la synthèse protéique (e.g aminoglycosides,

macrolides) ou l'ADN et les mécanismes de replication ou réparation (e.g quinolones,

sulfamides) ou les voies métaboliques essentiels (sulfamides, friméthoprime). Les

antibiotiques ont également été sous-divisés en deux classes : bactéricides (létales pour la

cellule bactérienne) ou bactériostatiques (qui arrêtent la croissance mais permettent sa

reprise si la drogue disparaissait avant que la population bactérienne n'est totalement

disparue). Les drogues anticancéreuses sont également classées en fonction de leur mode

d'action, basé principalement sur leurs cibles cellulaires. De manière similaire pour ces

deux types de drogues, la cascade d'événements qui conduit à la mort de la cellule, en aval

de leur interaction primaire avec leur cible cellulaire (putative ou établie), est resté

largement elusive. Il a déjà été suggéré que les drogues anticancéreuses pouvaient induire la

mort cellulaire par apoptose, et que cela impliquait la production d'oxydants intracellulaires

[126-128]. Par ailleurs, il est intéressant de noter que la résistance à l'apoptose est une

caractéristique commune à plusieurs types de cellules cancéreuses réfractaires aux

chimiothérapies (discuté ci-après, partie 2.3.2). Les récents résultats des études conduites

par le groupe de J J . Collins [129-135] ont radicalement changé la vision classique du mode

d'action des antibiotiques. Cette étude a montré que trois antibiotiques bactéricides de

différentes classes (une quinolone, un P-lactame et un aminoglycoside) et possédant des

cibles cellulaires différentes, induisaient un mécanisme de mort cellulaire commun.

Quelque soit la cible primaire, le mécanisme effecteur conduisant à la mort cellulaire, en

aval de l'interaction primaire, est le même. Par ailleurs, la production d'oxydants comme le

34

radical hydroxyle constitue le point de convergence de ce mécanisme effecteur final.

L'étude indiquait également que l'utilisation de « scavengers » métaboliques ou de souches

génétiquement modifiées pour inhiber la production d'oxydants suite aux traitements avec

des antibiotiques bactéricides induisaient l'arrêt de la croissance, mais pas la mort. En

conséquence, ces études établissent l'accumulation d'oxydants intracellulaires comme le

mécanisme effecteur de la mort cellulaire induite par les antibiotiques et suggèrent la

possibilité d'un mécanisme « cible-indépendant » pour la résistance aux antibiotiques.

L'ensemble de ces études suggère un lien de causalité entre des événements évolutifs

conservés conduisant à la mort de la cellule et le mode d'action de divers composés

cytotoxiques. Ces études soulignent également l'importance de comprendre le mode

d'action de ces drogues dans le but de comprendre et prévenir l'émergence de la résistance.

2.3 Mécanismes de résistance La chimiothérapie anti-Leishmania repose sur un nombre limité de molécules, et les

phénomènes de résistance associés à ces traitements existent et sont actuellement en

émergence. Il est important de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-

jacent à ces phénomènes de résistance. Cette partie couvrira les mécanismes de résistance

aux anti-Leishmania, puis abordera les mécanismes de résistance aux antibiotiques et aux

drogues anticancéreuses. Enfin, nous conclurons ce chapitre par la présentation d'un

nouveau paradigme relatif au mode d'action des drogues et à l'acquisition de la résistance.

2.3.1 Mécanismes de résistance spécifiques De manière générale, les mécanismes de résistances aux drogues convergent vers un

objectif commun : la diminution de l'interaction entre la drogue et sa ou ses cible(s)

cellulaire(s), même lorsque celle(s)-ci n'est (ne sont) pas clairement identifiées. Les

moyens mis en place par la cellule pour parvenir à un tel résultat sont résumés dans la

Figure 5.

35

mlribftinn

drogue —II

Eflha

Figure 5 : Mécanismes de résistances aux drogues (adaptés de Borst, 1995 [136])

Le parasite Leishmania a développé de la résistance, au moins en laboratoire, à toutes les

drogues utilisées à jour. Nous allons revoir ici l'ensemble des mécanismes de résistance

connus.

2.3.1.1 Mécanismes de résistance à l'antimoine Depuis maintenant plusieurs années, Leishmania présente un niveau de résistance élevé aux

traitements à base d'antimoine. Ceci est particulièrement important en zone d'endémie et

notamment en Inde, dans la province du Bihar, où la résistance atteint 60% des cas

cliniques et est responsable des échecs thérapeutiques. Le mécanisme de résistance aux

dérivés de l'antimoine est de nature multifactorielle. Du fait de la très grande utilisation de

l'antimoine contre la leishmaniose, les mécanismes de résistance à cette drogue sont les

mieux connus, car ils ont fait l'objet de plusieurs études. L'ensemble des mécanismes

connus sera présenté.

Plusieurs mécanismes de résistance tendent à réduire la capacité de la drogue à agir sur la

cellule. Parmi ceux-ci, on retrouve 1) la diminution de l'entrée de la drogue dans le

parasite; 2) la diminution de la réduction de la forme pentavalente (SbV) sous sa forme

active trivalente (SblII); 3) une augmentation du niveau des thiols intracellulaires (voir

partie 3.2.1); 4) la conjugaison du SblII avec le trypanothion (TSH, voir partie 3.2.1); et 5)

36

la séquestration des conjugués SblII-tbiols par un transporteur ABC intracellulaire

(MRPA). À chacun de ses mécanismes correspond une modification phénotypique du

parasite causée la plupart du temps par un mécanisme d'adaptation de type mutation,

deletion ou amplification [137, 138].

Dans le cas de la diminution de l'entrée de la drogue dans le parasite, il a récemment été

démontré que la transfection du gène AQP1 codant pour une aquaglycéroporine, provoque

une augmentation de l'accumulation de SblII chez différentes espèces de Leishmania [139,

140]. Réciproquement, l'inactivation du gène conduit à la diminution de l'accumulation de

SblII dans le parasite et de manière corrélative, à la diminution de la sensibilité du parasite

pour la drogue. Ceci suggère que cette aquaglycéroporine constitue la principale voie

d'entrée du SblII dans la cellule. Par ailleurs, le niveau d'expression à'AQPl est

fréquemment diminué chez les mutants résistants à l'antimoine. L'accumulation de la

forme pentavalente (SbV) de la drogue n'est cependant pas affectée par la variation du

niveau d'expression d'AQPl, suggérant une voie d'entrée différente pour la forme non-

réduite de l'antimoine.

En ce qui concerne la diminution de la réduction de la forme pentavalente inactive (SbV)

en forme trivalente active (SblII) comme mécanisme de résistance, il convient tout d'abord

d'apporter quelques précisions relatives à cette étape liée au mécanisme d'action de la

drogue. Le mécanisme de réduction ainsi que le lieu exact de la réduction demeure

relativement mystérieux. Plusieurs études ont montré que seuls la forme amastigote

intracellulaire du parasite, et non la forme amastigote axénique, serait sensible à

l'antimoine pentavalent [141, 142]. En conséquence, le lieu de réduction de la pro-drogue

serait donc le macrophage. Néanmoins, d'autres études suggèrent que les amastigotes

axéniques (mais pas les promastigotes) seraient également sensibles à l'antimoine

pentavalent, leur attribuant ainsi une capacité de réduction [143]. Enfin, une autre étude

semble réconcilier l'apparente contradiction de ces observations en suggérant que la

réduction pourrait avoir lieu à la fois dans le macrophage et dans le parasite amastigote

[144]. Leishmania possède en effet les enzymes nécessaires à la réduction de l'Antimoine

pentavalent. Son génome code en effet pour une reductase thiols-dépendante (TDR1) et

possède un homologue de la reductase ACR2 de S. cerevisae responsable de la réduction de

37

l'arsenic pentavalent chez la levure [145]. La protéine ACR2 de Leishmania est capable de

réduire l'antimoine pentavalent et sa surexpression (par transfection génique) au stade

amastigote induit une hypersensibilité au SbV. TDR1 est également capable de réduire le

SbV et présente une différence d'expression entre les stades promastigote et amastigotes(en

faveur du stade amastigote) ce qui pourrait expliquer la plus grande sensibilité de ce dernier

à la drogue sous sa forme pentavalente [146]. Enfin, la diminution de l'expression de ces

enzymes pourrait conduire à une résistance accrue à l'antimoine pentavalent [143].

L'augmentation du niveau de thiols intracellulaires contribue également à la résistance à

l'antimoine. Le principal thiol du Leishmania est le trypanothion (TSH) et se compose de

deux molécules de glutathion (GSH, principal thiol des cellules d'eucaryotes supérieures)

conjuguées à une molécule de spermidine [147]. Les thiols jouent un rôle important dans le

maintien du potentiel d'oxido-réduction de la cellule (voir partie 3.2.1). L'augmentation du

niveau de TSH est associé à l'amplification et de la surexpression [148, 149] des gènes

codant pour les enzymes de la voie de synthèse du GSH, c'est à dire la y-glutamylcystéine

synthetase) et la spermidine (ornithine decarboxylase). Ces phénomènes ont été observés

chez des mutants sélectionnés en laboratoire et chez des souches cliniques résistantes [150,

151] (chez lesquels l'inhibition de ces enzymes induit la réversion de leur phénotype de

résistance). Cependant, l'augmentation des niveaux de thiols intracellulaire n'est pas

suffisante pour induire une augmentation du niveau de résistance chez une souche sauvage

[152].

Enfin, la séquestration de l'antimoine conjugué aux thiols est assurée par un transporteur

intracellulaire pour lesquels une augmentation de l'activité de transport a été observée chez

des mutants résistants. Ce transporteur nommé MRPA appartient à la famille des

transporteurs ABC [153]. MRPA est fréquemment amplifié chez les mutants résistants et

cette amplification génique fait intervenir des séquences répétées flanquant le locus

génomique [137, 154, 155]. MRPA est le premier gène dont l'amplification à été corrélée

avec la résistance aux métaux [156, 157] mais son amplification n'est pas suffisante pour

atteindre des niveaux de résistance élevés. L'augmentation du niveau de thiols

intracellulaires couplée à l'amplification de MRPA semble être une combinaison capable

de conférer de hauts niveaux de résistance.

38

2.3.1.2 Mécanismes de résistances à la pentamidine La résistance à la pentamidine est facilement induite in vitro chez plusieurs espèces de

Leishmania. Cette résistance est associée à des changements des concentrations

intracellulaires en glutamine arginine et polyamines [74, 158]. Des mutants résistants

générés in vitro ne présentent pas d'accumulation de la drogue au niveau mitochondrial, et

la fraction cytosolique de la drogue est expulsée à l'extérieur de la cellule [74]. Le

transporteur ABC (ATP Binding Cassette), PRP1 pourrait être responsable de cette activité

d'exclusion de la drogue [159-161]. Cette résistance est bloquée par l'action du verapamil,

un inhibiteur des canaux calciques, connu pour induire la réversion de phénotypes de

résistances multiples chez des cellules cancéreuses [74].

2.3.1.3 Mécanismes de résistance à l'amphotéricine B L'amphotéricine B est la drogue de choix dans les zones de forte résistance à l'antimoine.

Sa formulation liposomale, bien qu'extrêmement dispendieuse, réduit considérablement sa

toxicité. Par ailleurs, la résistance à cette drogue ne semble pas apparaître rapidement. Une

nouvelle augmentation de la charge parasitaire à été observée chez des patients co-infectés

par VIH après des traitements à l'amphotéricine B. Cependant, ces rechutes ne sont pas

associées à des phénomènes de résistance [162]. La résistante à l'amphotéricine B à

cependant facilement été généré in vitro et il à été montré qu'elle était associée à des

mécanismes d'amplifications géniques. Cependant, le lien entre ces amplifications géniques

et la résistance à cette drogue nécessite des confirmations et caractérisations

supplémentaires [163]. Une autre étude a corrélé la résistance avec la modification de la

fluidité de la membrane et montré que le principal sterol des souches résistantes était en fait

un précurseur et qu'il était différent de celui des souches sauvages. Ce changement induit la

diminution de l'affinité de la drogue pour la membrane du parasite [164]. Enfin, la

résistance à l'amphotéricine B à également été associée à l'augmentation de la résistance à

la mort cellulaire programmée par apoptose [68].

2.3.1.4 Mécanismes de résistance à la miltéfosine

En raison de son introduction récente dans le traitement des leishmanioses, aucune souche

clinique résistante pour la miltéfosine n'a encore été reportée. Cependant, la résistance est

39

facilement générée in vitro et certains des mutants résistants ont été caractérisés [165-169].

Les mécanismes de résistance incluent une réduction de l'accumulation de la drogue, une

variation de la perméabilité de la membrane plasmique et un efflux de la drogue. La

réduction de l'accumulation de la drogue constitue le premier mécanisme de résistance à la

miltéfosine. Pour y parvenir, l'altération des capacités de transport d'une drogue est un

moyen classiquement utilisé par une cellule pour devenir résistante. Des mutations au

niveau du gène codant pour le transporteur de la miltéfosine (LdMT) sont responsables de

la diminution drastique de l'accumulation de la miltéfosine et contribue grandement à la

résistance [167, 168]. LdMT possède une activité de flippase (plus précisément une activité

de translocation orientée vers l'intérieur à travers la membrane plasmique) responsable de

l'accumulation de la drogue dans le parasite. Récemment, un nouveau partenaire protéique,

LdRos3, a été identifié et caractérisé comme essentiel à l'activité de la flippase [165, 166].

LdMT nécessite une localisation membranaire spécifique et dépend pour cela de LdRos3.

LdRos3 contient deux domaines transmembranaires séparés par un large domaine

extracellulaire et sa localisation membranaire dépend de la présence d'une protéine LdMT

fonctionnelle. Les deux protéines sont donc mutuellement dépendantes pour leur fonction

et leur localisation cellulaire [165, 166]. L'inactivation de LdRos3 correspond également à

un mécanisme de résistance et à été rapporté dans un mutant généré en laboratoire [165,

166]. Cependant nous ne connaissons rien de l'importance de tels mécanismes dans le cas

de souches cliniques. Un second mécanisme conduisant à la réduction de l'accumulation

d'une drogue consiste en l'augmentation de la capacité d'efïlux de la cellule. Dans le cas de

la miltéfosine, la surexpression du transporteur de type ABC, MDRl à été associée à

l'augmentation de la résistance à la miltéfosine [170]. MDRl est une P-glycoprotéine

capable de transporter une grande variété de drogues hydrophobiques vers l'extérieur d'une

cellule, leur conférant une résistance multi-drogue [171]. Récemment, une étude a identifié

un autre transporteur de la famille ABC (LiABCG4) comme étant responsable de la

diminution de l'accumulation de la miltéfosine [172, 173]. Enfin, l'altération de la

composition de la membrane plasmique du parasite, et conséquemment de sa perméabilité

constitue un autre mécanisme de résistance à la miltéfosine. Il à été montré que chez les

mutants sélectionnés pour leur résistance à la miltéfosine, la depletion en sterols était

responsable de la diminution de leur sensibilité pour la miltéfosine [174]. L'ensemble de

40

ces mécanismes contribue certainement de manière synergique à l'acquisition de hauts

niveaux de résistance à cette drogue. Cependant jusqu'à présent personne n'est capable de

dire quel rôle ces mécanismes joueront dans l'acquisition probable de cette résistance dans

des souches cliniques.

2.3.1.5 Mécanismes de résistance à la paromomycine

Étant donné sa récente utilisation en clinique, il n'est pas surprenant qu'aucun cas de

résistance n'a encore été déclaré. Cependant, la résistance aux aminoglycosides auxquels

appartient la paromomycine est bien documentée chez les bactéries. Chez ces dernières elle

est liée à la diminution de l'accumulation de la drogue dans la cellule, à l'altération de son

interaction avec les ribosomes, et à la modification des groupes amino et hydroxyl par des

enzymes inactivantes comme les Af-acetyltransférases, O-phosphotransférases et O-

nucléotidyl transferases [175]. Ces phénomènes n'ont jamais été décrits chez Leishmania.

Une seule étude a fait le lien entre la diminution de l'accumulation de la drogue et la

résistance à la paromomycine chez des mutants sélectionnés en laboratoire [176, 177] bien

qu'aucune protéine n'ait été identifiée comme responsable de cette diminution.

2.3.1.6 Mécanismes de résistance aux autres molécules : sitamaquine, terbinafïne et methotrexate Peu de données sont disponibles sur les mécanismes de résistance à la sitamaquine et à la

terbinafïne chez Leishmania. Cependant, une étude récente à montré que la surexpression

d'un transporteur ABC conférait la résistance à la sitamaquine [172, 173] en lien avec une

réduction de l'accumulation de la drogue. Ceci ouvre les voies de nouvelles investigations

nécessaires à la fois à la compréhension des mécanismes d'action et de résistance de ces

drogues.

Les mécanismes de résistance au methotrexate chez Leishmania, drogue non-utilisée

contre les leishmanioses mais ayant servi de modèle d'étude, sont bien documentés. En fait,

c'est de l'étude de ces mécanismes que découle une grande partie de nos connaissances du

métabolisme des folates du parasite. La résistance à cet anti-métabolite se développe de

trois manières classiques déjà mentionnées pour d'autres drogues : la diminution de

l'accumulation de la drogue par diminution de son entrée dans la cellule; l'amplification de

41

l'enzyme qui constitue sa cible cellulaire; l'amplification d'une enzyme beaucoup moins

sensible et capable d'assurer la même fonction métabolique. Comme mentionné

précédemment, l'entrée du MTX dans la cellule se fait par les transporteurs de folates

(FBTs). L'inactivation génique par deletion du principale transporteur de folates (FT1),

observée chez plusieurs souches de mutants résistants sélectionnés en laboratoire, confère à

elle seule une résistance importante au MTX [178, 179] en induisant la diminution de

l'entrée de la drogue dans la cellule. L'amplification génique de la DHFR-TS, cible du

MTX, ou de la pteridine reductase PTR1, beaucoup moins sensible au MTX mais capable

d'assurer la même fonction métabolique que DHFR-TS, constituent les autres alternatives

d'acquisition de la résistance. Enfin, le gène codant pour la folylpolyglutamate synthetase

(FPGS) à également été associé à la résistance au MTX en corrélation avec le niveau de

folate disponible por le parasite. Brièvement, la FPGS est responsable de la

polyglutamylation des folates et du MTX celle-ci semble affecter l'accumulation du MTX

dans la cellule, altérant ainsi le niveau de sensibilité à la drogue [180].

2.3.2 Mécanismes de résistance généraux et nouveau paradigme Les études conduites sur les mécanismes d'actions des drogues, qu'elles soient

anticancéreuses, antibactériennes, antivirales ou antiparasitaires, ont longtemps été basées

sur le postulat que le mécanisme d'action d'une drogue est nécessairement dépendant de sa

cible cellulaire. De plus les principaux mécanismes de résistances soulignaient également

l'importance de la cible puisque les diverses voies prises par un pathogène (et également

par les cellules cancéreuses) pour acquérir la résistance à une drogue convergent toutes, de

manière directe ou non, vers la protection de cette cible. Au cours des dernières décennies,

les efforts se sont donc principalement concentrés (et continuent de l'être) sur la

compréhension des interactions entre la drogue et sa cible cellulaire, mettant ainsi à jour les

mécanismes de résistance précédemment mentionnés. Cependant, grâce à ces études, un

certain nombre de gènes, dont la fonction n'est pas directement reliée au mode d'action de

la drogue, sont apparus comme modulés suite à une exposition à une drogue ou encore chez

des lignées cellulaires résistantes à cette drogue. On retrouve notamment des gènes qui

codent pour des protéines impliqués dans la protection contre les stress cellulaires

(protéines chaperonnes, HSP, enzymes des voie de synthèses des antioxydants, enzymes

42

des voies métaboliques [181]) et dans les voies conduisant à la mort cellulaire programmée

(caspases, calpaines, nucleases, facteurs mitochondriaux [182]). En effet, il est intéressant

de noter le lien qui à été établi chez les cellules cancéreuses entre la résistance aux

chimiothérapies et la résistance à la mort cellulaire programmée par apoptose. Cette

caractéristique des cellules cancéreuses peut également être rapprochée d'un autre

phénomène mis en évidence par Otto Warburg il y a plus de 80 ans et nommé en son

honneur, « effet Warburg ». Brièvement, il correspond à un changement métabolique qui

favorise la voie de la glycolyse anaérobique aux dépens de la voie aérobique classique qui

produit pourtant plus d'énergie en termes d'équivalents ATP. Une des conséquences de ce

déroutage métabolique est de favoriser la voie des pentose-phosphates, productrices de

NADPH, un équivalent de réduction et cofacteur essentiel des enzymes de la voie de

detoxification des oxydants (glutathion reductase, peroxidases etc). La résistance au stress

oxydatif semble donc être chez les cellules cancéreuses étroitement associée à la résistance

à l'apoptose induite par les drogues [126-128, 183]. Un autre exemple intéressant de

déroutage métabolique à récemment été mis en évidence chez les bactéries. De manière

adaptative, la cellule favorise la voie des pentoses-phosphates en réponse à un stress

oxydatif. Ces études ont clairement mis en évidence l'intérêt d'un tel déroutage

métabolique pour la cellule en termes de résistance aux stress oxydatifs. Enfin, ces études

ont non seulement montré que des antibiotiques ayant des cibles cellulaires très différentes

induisaient la mort cellulaire par un mécanisme effecteur faisant intervenir la génération et

l'accumulation d'oxydants, mais elles ont également montrés que la prévention de

l'accumulation de ces oxydants (notamment par manipulation génétique de la voie

métabolique conduisant à la phosphorylation oxydative et par prévention de la réaction de

Fenton) (Figure 6) protégerait la cellule contre l'action bactéricide des antibiotiques,

43

AnanogtycoriJo Quhwrtnw (3-iactam

Primary Drug-Target Interact ion

Metabolic Feedback

Depletion of Reducing Equivalants (NADH)

Redox Cycling

Fenton F a 2 * ] » * Reaction

Hydroxy) Radical 4 4 OH* Damage

)*aW Synthesis

Cell Death

Figure 6 : Mécanisme de mort cellulaire commun induit par les antibiotiques bactéricides (issue de

Kohanski et al, 2007)

de manière indépendante de la cible primaire [129-132, 134, 135]. Ces études établissent

donc pour la première fois un mécanisme commun de mort cellulaire induit par des

antibiotiques différents, mais également un lien clair entre la résistance au stress oxydatif et

à la mort cellulaire programmée, et la résistance aux drogues. Cette notion de mécanismes

de résistance indépendants des drogues et de leur cible primaire a conduit à l'établissement

d'un nouveau paradigme. L'établissement d'un mécanisme commun conduisant à la mort

de la cellule souligne l'importance de comprendre comment les drogues tuent et comment

les cellules peuvent être conduites à résister à l'induction de cette mort programmée.

44

Chapitre III. Leishmania et les stress oxydatifs

3.1 Cycle de vie et stress oxydatif Au cours de son cycle de vie, le parasite Leishmania est soumis à des stress oxydatifs lors

de sa rencontre avec le système immunitaire de l'hôte mammifère. Les cellules hôtes du

Leishmania sont les cellules phagocytaires, principalement les macrophages et les cellules

dendritiques. Ces cellules sont spécialisées dans la production d'intermédiaires oxygénés

(ROI) et nitrogénés (RNI) réactifs (Figure 7).

Reactive Oxygen Intermediates (ROI)

oxygen O2 + 1 e I phagocyte

| oxidase superoxide O f

1 I superoxide 1 dismutase

hydrogen peroxide H A

+1e I hydroxyl Q H . radical

water

+1e I

HP

Reactive Nitrogen Intermediates (RNI)

guanidino RNHj nitrogen of

nitric oxide synthase I

NO

5e L-arginine

MO" r* I OONO-peroxynitrite r

OONOH peroxynitrous

acid 1 i

t [•NO2-OI+J

RSOH sulfenic acid

nitric oxide RSH

+ e RSNO

NOT nitnte n j t r o s o t h j o ,

•NO2 nitrogen dioxide

J.,. NO3" nitrate

Figure 7 : ROI and RNI produites par les systèmes enzymatiques Phox et iNOS dans les cellules

phagocytaires des mammifères (adapté de Nathan, 2000)

Les cellules phagocytaires possèdent deux systèmes enzymatiques très bien caractérisés et

responsables de la production d'oxydants en tant que molécules de défenses destinés à

l'élimination des agents infectieux qu'elles rencontrent et phagocytent. La NADPH-

oxydase (gp91phox ou phagocyte-oxydase) est responsable de la production

d'intermédiaires oxygénés réactifs tandis que l'oxyde nitrique synthase inductible (iNOS)

est responsable de la production d'intermédiaires nitrogénés réactifs (principalement de

l'oxide nitrique qui réagit ensuite avec les dérivés de l'oxygène pour former les RNI). Ces

deux systèmes enzymatiques sont exprimés chez les macrophages. La NADPH oxydase est

exprimée de manière constitutive par les cellules phagocytaires mais son activité est régulée

et dépend du niveau d'activation de la cellule. L'oxyde nitrique synthase inductible est

45

quant à elle, comme son nom l'indique, induite en réponse à l'activation de la cellule.

[184-195]. Ces deux systèmes enzymatiques se retrouvent au niveau de la membrane

plasmique de la vacuole du phagolysosome et contribuent à l'élimination du parasite

lorsque celui-ci est phagocyté par la cellule. Etant donné que la production d'oxydants

constitue une stratégie microbicide très importante utilisée par l'hôte mammifère contre les

pathogènes, il est établi que la localisation du parasite à l'intérieur de son hôte (i.e. la

vacuole phagolysosomale) et les mécanismes biochimiques utilisés pour la detoxification

de ces oxydants forment un aspect fondamental de l'interaction hôte-pathogène. Il est

intéressant à noter que cet aspect de l'immunité de l'hôte mammifère comporte encore

quelques zones d'ombres. En effet, le rôle de l'iNOS reste controversé relativement à son

potentiel microbicide puisque la production d'oxyde nitrique demeure indétectable bien que

l'induction de l'expression de l'enzyme soit quantifiable et réelle [196, 197]. En revanche,

un déficit génétique d'expression des composants de la NADPH oxydase conduit à

l'établissement de la granulomatose chronique, maladie caractérisée par des infections

sévères et récurrentes [198]. Il n'existe cependant pas d'équivalent connu de déficit

génétique d'expression de l'iNOS. Il est également intéressant de noter que les souris sont

capables de synthétiser de l'oxyde nitrique in vivo (et de manière quantifiable) et peuvent

ainsi compenser pour une déficience de la NADPH oxydase [198]. Elles ne survivent

cependant que dans un environnement aseptisé en cas de déficience conjointe des deux

enzymes. De manière intéressante, une étude a montré que chez les hamsters, la progression

qui conduit à la mort de la forme viscérale de la leishmaniose (reproduisant ainsi la

pathologie humaine), était due à une augmentation de l'expression de l'iNOS moins

prononcée que chez les souris qui sont, elles, capables de contrôler une infection par les

souches viscérotropiques principalement grâce à leur production d'oxyde nitrique [199].

Toutes ces données soulignent l'importance de ces mécanismes de défenses auxquels le

parasite devra faire face.

3.2 Mécanismes de résistance aux stress oxydatifs Leishmania a développé un certain nombre de stratégies afin de pouvoir faire face à ces

mécanismes de défense de son hôte. Ces stratégies font intervenir des molécules

synthétisées par le parasite et possédant des propriétés anti-oxydantes, assurant ainsi la

46

stabilité de son équilibre redox intracellulaire. Parmi ces molécules on retrouve les

composés de la famille des thiols dont le trypanothion. C'est le thiol le plus important chez

Leishmania et il est unique aux Trypanosomatidae (partie 3.2.1). Leishmania possède

également d'autres molécules anti-oxydantes dont les propriétés ont récemment été mises

en évidence : les ptérines réduites dont les propriétés anti-oxydantes ont été mises en

évidence au cours de mon doctorat, en sont un exemple (partie 3.2.1). Enfin, le parasite a

développé des moyens d'interférer directement avec le système immunitaire de l'hôte afin,

notamment, d'interférer avec l'activation des cellules phagocytaires, limitant ainsi

l'induction des activités microbicides des enzymes comme l'iNOS ou la NADPH oxydase

(partie 3.2.3)

3.2.1 Les thiols et le métabolisme du trypanothion En ce qui concerne leur système redox, les Trypanosomatidae diffèrent de tous les autres

eucaryotes connus. Celui-ci est en effet basé sur le conjugué thiol-polyamine trypanothion

(TSH) ou N ,N -bis(glutathionyl)spermidine (Figure 8) [147, 200] et sur une

r"^"" »* ° Figure 8 : Structure chimique du trypanothion ou

1/ bis(glutathionyl)spermidine (issue de Krauth-Siegel et al., 2003). Les deux

molécules de glutathion (en noir) sont conjuguées à une molécule de spermidine

en gris) o coo' v

flavoenzyme dépendante du NADPH, la trypanothione reductase (TR). Ce système basé sur

le trypanothion remplace chez ces parasites le système plus ubiquitaire basé sur le

glutathion (GSH) et les glutathione-reductases (GR), et que l'on retrouve dans la plupart

des cellules eucaryotes. Jusqu'ici, les TR ont été caractérisés chez Crithidia fasciculata,

[201, 202], Trypanosoma cruzi [203], Trypanosoma congolense [204], Trypanosoma brucei

[205], Leishmania donovani et Leishmania major [65]. Ces enzymes sont quasiment

exclusives aux Trypanosomatidae puisqu'elles n'ont été décrites qu'une seule fois chez un

organisme n'appartenant pas à cette famille, Euglena gracilis, qui possède en effet à la fois

laGRetlaTR[206].

47

La synthèse du trypanothion (Figure 9) fait intervenir trois voies enzymatiques essentielles:

la voie de synthèse du glutathion, la voie de synthèse de la spermidine et la conjugaison des

deux molécules de glutathion à la molécule de spermidine, de manière séquentielle. La

synthèse du glutathion débute par la synthèse de y-glutamylcystéine à partir de L-glutamate

et de L-cystéine. La réaction ATP-dépendante est catalysée par la y-glutamylcystéine

synthetase (y-GCS), qui est l'enzyme limitante dans la voie de synthèse du GSH chez les

cellules mammifère et du TSH chez L. tarentolae [207]. Cette enzyme est essentielle à la

survie du parasite [152]. La y-glutamylcystéine réagit ensuite avec la L-glycine pour former

le GSH. Cette réaction est catalysée par la glutathione synthase (GS). Cette enzyme n'a pas

encore été caractérisée chez les Trypanosomatidae mais un gène localisé sur le

chromosome 14 de Z,. major code potentiellement pour la GS. Par ailleurs, ce gène fait

partie d'un groupe de gènes surexprimés chez des mutants résistants aux drogues [208]. En

ce qui concerne la spermidine, il n'existe pas d'uniformité chez les Trypanosomatidae.

Leishmania, comme les trypanosomes africains, assure la synthèse de sa spermidine (alors

que les trypanosomes américains sont auxotrophes pour ce composé). La première étape de

la synthèse consiste en la decarboxylation de l'ornithine par l'ornithine decarboxylase

(ODC). La putrescine ainsi formée est le substrat de la spermidine synthase dans une

réaction qui requiert de la S-adénosylméthionine décarboxylée, fournie par la S-

adénosylméthionine decarboxylase à partir de la S-adénosylméthionine. Enfin, la

conjugaison des deux molécules de GSH à molécule de spermidine se fait de manière

séquentielle (Figure 9). La glutathionylspermidine synthase génère de la glutathionyl-

spermidine, reprise ensuite par la trypanothione synthetase qui produit du TSH. Le

maintien du TSH sous sa forme réduite est assuré par la trypanothione reductase,

dépendente du NADPH.

48

cMcJenotyl. Methylth.o-CO, m<thi<wi>r>« jd«no*ine

» » Putreicnc »J ^ » Ornithine * <J> Putrescnc » » ► So»rr*.ei'­*

Sptrmidin* . GluUthiooyl»p^midin« w SynthaM \ Synthta— (

iptrmtdîrto

^ GSH

DtcartooxylaM SynthaM \ SynlhtU— Glutathione . VJ>UL

l­Gly

LGlu ♦ L­Cy» » ­Gluta«nykv»t»ine * » Glutathione Trypanothicn» GluUmylcytte.ne Glutathion* (GSH) SyntfieUM

SynttitttM Synth«Ut«

­ ­ . . Trypanothion* R*ductaM _ . . . Trypanothione Disulfide r » » Trypanothione

TS, ' > T(SH), NAOPH ♦ H* NAOP

Figure 9 : Voie de synthèse et de réduction du trypanothion (TSH) (issu de Krauth­Siegel, 2003)

Le TSH est une molécule beaucoup plus réactive que le GSH ce qui lui confère une

propriété anti­oxydante très importante pour le parasite. Cette différence de réactivité réside

dans le fait que c'est un di­thiol, ce qui augmente sa capacité de réduction [209]. Le TSH

possède la capacité de réduire directement les tryparédoxines. Les tryparédoxines sont les

enzymes qui assurent la detoxification des stress de nature oxygénée au sein du parasite

(Figure 10).

NADPH x / TR0Xv ^ T ( S H ) 2 N / Tpxoxv * Pxred x s ROOH

NADP ^ V T R r e d A TS2 > ^ T p x r e d A P x ^ A ^ R O H

Figure 10 : Cascade de réduction des tryparédoxines. (TR, trypanothion reductase; Tpx,

tryparédoxine; Px, peroxidase)

Leishmania ne possède pas deux enzymes clés : la catalase et la glutathione peroxidase

classique et son métabolisme anti­oxydatif est basé sur le trypanothion. Les tryparédoxines

transfèrent les équivalents de reduction au tryparédoxines peroxidases. Ces enzymes sont

impliquées dans la detoxification des ROS (revue dans [210­212]). Leishmania possède

également la superoxide dismutase impliquée dans la detoxification de l'anion superoxide

[213].

49

Les Trypanosomatidae tolèrent seulement des niveaux relativement faibles de peroxyde

d'hydrogène (H2O2) probablement en raison du fait qu'ils ne possèdent pas de catalase.

Cette molécule est produite en quantité abondante par les macrophages (Figure 6). Les

tryparédoxines peroxidases constituent donc une ligne de défense importante contre les

espèces oxygénées réactives produites par les cellules de l'hôte. D'autre part, le TSH est

impliqué dans la séquestration et l'extrusion de drogue comme l'antimoine, connu pour

induire des niveaux d'oxydants importants dans la cellule. La conjugaison de la drogue aux

thiols et la séquestration ou l'extrusion sont des mécanismes de résistance importants du

Leishmania (voir partie 2.3.1.1) [214, 215]. Enfin, Leishmania possède un autre thiol,

l'ovothiol, également impliqué dans la réduction des oxydants intracellulaires [216].

3.2.2 Les ptérines Les ptérines ou bioptérines sont des composés reliés au métabolisme des folates (Figure 10)

Figure 10 : Métabolisme des folates et des ptérines chez Leishmania (issu de Ouellette, 2002). (B, bioptérine, BT1, transporteur de bioptérines; BH2, dihydrobioptérine; BH4, tétrahydrobioptérine; PTR1, ptéridine reductase 1; DHPR, dihydroptérine reductase; FA, acide folique; FT1, transporteur de folate 1; DHF, dihydrofolate, THF, tétrahydrofolate; DHFR-TS, dihydrofolate reductase-thymidilate synthase)

Leishmania est auxotrophe pour les ptérines et possède un transporteur de bioptérine

unique, BT1 [217, 218]. Une fois transportées dans la cellule, les ptérines sont réduites sous

leur formes actives par la ptéridine reductase PTR1 [219, 220]. Leishmania possède

également la machinerie enzymatique nécessaire à la régénération des ptérines [221]. Le

50

rôle des ptérines réduites demeure relativement vague. L'un des premiers rôles connus de

ces composés a été d'être un facteur de croissance pour C. fasciculata [222] et plusieurs

études ont indiqué qu'elles constituent également un facteur de croissance essentiel pour

Leishmania [223, 224]. Les ptérines réduites sont également des cofacteurs de certaines

enzymes incluant l'iNOS [225]. Cependant, aucunes de ces enzymes ne sont présentes chez

Leishmania ou ne requièrent pas ces cofacteurs [220, 226]. Les ptérines réduites jouent

néanmoins un rôle très important dans la métacyclogénèse du parasite. Il a été montré que

le niveau de bioptérine réduite contrôlait le nombre de parasites métacycliques. Le

mécanisme sous-jacent demeure néanmoins inexpliqué [227]. D'autre part, des études ont

mis en évidence la nature réactive des ptérines réduites en tant qu'agent détoxifiant des

espèces oxygénées réactives [228, 229]. Au cours de mon doctorat, nous avons confirmé

cette propriété au sein du parasite Leishmania et ainsi nous avons pu proposer un nouveau

rôle pour ces composés dans la biologie du parasite. Les ptérines réduites participent à la

lutte contre le stress oxydatif et contribuent à la résistance à ce stress généré par les

macrophages. Elles favorisent la résistance et facilitent l'invasion de la cellule hôte. Elles

font donc désormais partie des composés permettant de résister à l'action destructrice du

macrophage.

3.2.3 Autres mécanismes de défense contre le stress oxydatif Leishmania à développer d'autres stratégies, principalement non-enzymatiques, lui

permettant d'interférer avec le système immunitaire de son hôte et notamment avec

l'activation des cellules phagocytaires qui conduit à la flambée oxydative. Il est notamment

reconnu que le parasite inhibe l'induction de l'iNOS et que ceci semble dû à la diminution

de la réponse l'interféron-y [7, 230]. Leishmania bloque également l'activation du

macrophage en inhibant l'activité de la protéine kinase C, enzyme importante dans la voie

de signalisation du phagocyte [231, 232]. Une autre propriété remarquable du parasite est

sa capacité d'inhiber le recrutement des sous-unités formant la NADPH-oxydase au niveau

de la membrane du phagolysosome, empêchant ainsi la génération de radicaux oxygénés.

Cette capacité inhibitrice est associée au LPG qui semble également posséder des propriétés

anti-oxydantes intrinsèques [233]. Enfin, la chaperonne cellulaire HSP70 est également

impliquée dans la défense contre le stress oxydatif [234]. Leishmania possède donc des

51

mécanismes multiples et redondants de défense contre les stress oxydatifs et nitrosatifs qui

lui sont essentiels pour sa survie, particulièrement lors de sa rencontre avec le système

immunitaire de l'hôte mammifère.

Chapitre IV. Problématiques, hypothèses et objectifs

Problématiques La leishmaniose fait partie des maladies dites « négligées » et figure sur la liste des

priorités établies par l'OMS. Ajoutons à cela l'absence patente de nouvelles thérapies

efficaces contre ces pathologies et le développement des résistances contre les thérapies

existantes. Il devient alors aisé de comprendre la nécessité de poursuivre la recherche sur ce

pathogène, afin de parfaire la compréhension de sa biologie dans le but de mieux lutter

contre lui. Ceci étant dit, les champs d'études du Leishmania sont multiples et certains

présentent un intérêt particulier. Parmi ceux-ci, la résistance aux anti-parasitaires demeure

un axe de recherche essentiel, en raison des échecs thérapeutiques qui sont associés au cas

de résistance et la proportion épidémique que ces phénomènes tendent à prendre. Les

mécanismes de résistance étant vraisemblablement étroitement liés aux mécanismes

d'actions des drogues, il apparait également essentiel de comprendre comment ces drogues

conduisent à la mort du parasite. La disponibilité de souches de Leishmania résistantes aux

différentes drogues représente un outil d'étude adéquat à l'élucidation de tels mécanismes.

La biologie du parasite, et notamment son processus de differentiation constituent

également un domaine d'étude important. Une meilleure compréhension du processus de

métacyclogénèse, essentiel au parasite pour l'acquisition de sa forme infectieuse,

permettrait de cerner la manière dont le parasite se prépare aux stress qu'il rencontrera chez

l'hôte mammifère, et éventuellement de mettre à jour des voies métaboliques ou des

mécanismes de défense importants. Enfin, le métabolisme des ptérines, demeure

relativement méconnu. Au regard du rôle joué par des enzymes comme PTR1, à la fois

dans la résistance à une drogue modèle comme le MTX ainsi que dans la métacyclogénèse

du parasite, il est nécessaire d'approfondir la compréhension de ce métabolisme.

Hypothèses Trois hypothèses seront présentées dans cette thèse. Elles correspondent aux trois objectifs

qui ont été fixés et qui seront présentés ci-après. La première hypothèse concerne le rôle

des ptérines réduites dans la résistance aux stress oxydatifs rencontrés par le parasite au

53

cours de son cycle de vie. Les ptérines réduites étant connus chez d'autres organismes pour

jouer un rôle dans la detoxification des oxydants, nous avons posé l'hypothèse qu'elles

jouaient un rôle similaire chez Leishmania. La seconde hypothèse concerne le rôle joué par

ces mêmes ptérines réduites dans la métacyclogénèse du parasite [227]. Ce processus de

differentiation correspond à une adaptation du parasite aux stress qu'il rencontrera dans son

hôte mammifère, notamment les stress oxydants. Etant donné que l'inactivation du gène

codant la ptéridine reductase PTR1 conduit à l'augmentation du nombre de parasites

métacycliques, nous avons émis l'hypothèse qu'une approche protéomique globale pourrait

suggérer le rôle des ptérines dans ce processus de differentiation. Enfin, la troisième

hypothèse était relative aux mécanismes d'action des drogues anti-Leishmania et à

l'acquisition de la résistance à ces drogues. Plusieurs drogues étant connues pour induire

l'accumulation d'oxydants et l'apoptose, nous avons émis l'hypothèse qu'un mécanisme

commun de mort cellulaire pouvait être induit par ces drogues et que l'existence d'un tel

mécanisme pouvait favoriser l'acquisition de multi-résistances.

Objectifs Comme les hypothèses susmentionnées, les objectifs généraux des travaux présentés dans

cette thèse étaient au nombre de trois et consistaient en la vérification de ces hypothèses.

Les travaux présentés dans le chapitre 5 avaient pour objectif général la confirmation du

potentiel antioxydant des ptérines réduites dans les espèces L. major et

L. infantum (respectivement responsables des formes cutanée et viscérale de la

leishmaniose) avec les objectifs spécifiques suivant de: 1) vérifier le rôle de PTR1 et des

ptérines réduites dans la résistance à des stress oxydatifs et nitrosatifs exogènes (générés

par des agents chimiques); 2) évaluer la capacité de complémentation métabolique des

ptérines réduites dans des souches PTRl7" avant exposition à un agent oxydant comme

FH2O2; et 3) vérifier le rôle joué par les ptérines réduites dans un modèle cellulaire

d'infection de macrophages (murins et humains) activés pour la production de ROI et de

RNI.

Les travaux présentés dans le chapitre 6 avaient pour objectif général d'identifier, par des

méthodes de protéomique d'enrichissement au FFE (Free Flow Electrophoresis), les

54

protéines différentiellement exprimées dans le processus de métacyclogénèse d'une souche

sauvage et d'une souche PTR1"" de L. infantum, afin d'éventuellement déterminer quel rôle

joue le métabolisme des ptérines dans ce processus de differentiation.

Plusieurs travaux ont montrés que des drogues anti-Leishmania induisaient la production

d'oxydants dans la cellule et la mort cellulaire pas apoptose [68, 70, 71, 75, 124, 235]. Les

travaux présentés dans le chapitre 7 avaient donc pour objectif général de vérifier s'il existe

un mécanisme commun de mort cellulaire induit par les drogues anti-Leishmania

classiquement utilisées (antimoine, miltéfosine, amphotéricine B, pentamidine

paromomycine) ainsi que par la drogue utilisée en tant que modèle (methotrexate), et de

déterminer quelles seraient les conséquences d'un tel mécanisme sur l'acquisition de multi-

résistances. Les objectifs spécifiques étaient de: 1) confirmer si toutes les drogues induisent

l'apoptose en mesurant trois caractéristiques de cette forme de mort cellulaire programmée

(accumulation d'oxydants, perte du potentiel mitochondriale et dégradation de l'ADN

génomique); 2) déterminer le rôle joué par le fer dans l'accumulation d'oxydants et de

confirmer la localisation mitochondriale de cette accumulation; 3) analyser les paramètres

de l'apoptose chez des mutants résistants à ces drogues, en soumettant ces mutants à la

drogue pour laquelle la résistance à été sélectionné ainsi qu'à d'autres drogues; et 4)

déterminer quelles sont les conséquences de l'existence d'un mécanisme de mort cellulaire

commun sur l'acquisition de multi-résistances, en mesurant la fréquence de génération de

mutants multi-résistants après exposition à une autre drogue.

Chapitre V. Le rôle des ptérines réduites dans la résistance au

stress oxydatif et nitrosatif chez le parasite Leishmania

Ce chapitre à fait l'objet d'une publication dans la revue Free Radicals in Biology and Medicine

(2009 Feb l;46(3):367-75) et est constitué de la version finale telle que publiée.

5.1 Résumé

Au cours de son cycle de vie, le parasite Leishmania est soumis à des stress oxydatifs lorsqu'il

rencontre le macrophage. Les ptérines réduites sont connues pour être des « scavengers » des

espèces oxygénées et nitrogénées réactives (ROIs and RNIs). Leishmania possède une ptéridine

reductase PTR1 dont la principale fonction est de fournir le parasite en ptérines réduites. Nous avons

étudié le rôle de PTR1 dans la résistance aux stress oxydatifs et nitrosatifs chez Leishmania

tarentolae, Leishmania infantum et Leishmania major PTRl" null mutants. Les cellules PTRY ' des

trois espèces étaient toutes plus sensibles aux stress induits par H202 et NO. En utilisant une sonde

fluorescente qui permet la quantification des ROIs, nous avons démontré une augmentation du

niveau d'oxydants intracellulaires chez les mutants PTRY1'. L'inactivation de PTRl augmentait

également la métacyclogénèse de L. infantum et L. major. Nous avons purifié les parasites

métacycliques à partir des mutants PTRY1' et des cellules contrôles et nous avons testé leur survie

intracellulaire dans des cellules macrophagiques J774 murines et des macrophages dérivés de

monocytes (MDMs) humains. Nos résultats ont montré que les mutants PTRY1' survivaient moins

dans les deux modèles de macrophages comparativement aux cellules contrôles et que cette

diminution de la survie était plus prononcée dans des macrophages activés pour la production

d'oxydants. Cette étude a montré qu'un des rôles physiologiques des ptérines réduites chez

Leishmania était de protéger le parasite contre les stress oxydatifs et nitrosatifs et qu'une diminution

de la disponibilité en ptérines réduites conduisait à une diminution de la survie intracellulaire.

55

5.2 Article

The role of reduced pterins in resistance to reactive oxygen and nitrogen intermediates in the

protozoan parasite Leishmania

Wilfried Moreira, Éric Leblanc and Marc Ouellette*

Centre de Recherche en Infectiologie du CHUL, Université Laval, Québec, Canada.

* Corresponding author : Marc Ouellette Ph.D.

Centre de Recherche en Infectiologie

2705 Boul. Laurier

Québec, QC

Canada

Gl V 4G2

Tel : 1-418-654-2705

Fax : 1-418-654-2715

E-mail : Marc.Ouellette@crchul.ulaval.ca

Running title: Pterins and oxidative stresses in Leishmania

Keywords: pterins, macrophages, nitric oxide, reactive oxygen species, ptéridine reductase

56

ABSTRACT

During its life cycle, the protozoan parasite Leishmania experiences oxidative stresses when

interacting with macrophages. Reduced pterins are known scavengers of reactive oxygen and

nitrogen intermediates (ROIs and RNIs). Leishmania has a ptéridine reductase PTR1 whose main

function is to provide reduced pterins. We investigated the role of PTR1 in resistance to oxidative

and nitrosative stresses in Leishmania tarentolae, Leishmania infantum and Leishmania major PTRÏ

' mutants. The PTRV1' cells of the 3 species were more sensitive to H2O2 and NO-induced stresses.

Using a fluorescent probe allowing ROIs quantification, we demonstrated an increase in intracellular

oxidant molecules in the PTR1" mutants. The disruption of PTR1 increased metacyclogenesis in L.

infantum and L. major. We purified metacyclic parasites from PTR1 ' mutants and control cells and

tested their intracellular survival in J774 mouse cell line and in human monocyte-derived

macrophages. Our results showed that PTRï' ' null mutants survived less in both macrophage models

compared to control cells and this decrease was more pronounced in macrophages activated for

oxidants production. This study demonstrates that one physiological role of reduced pterins in

Leishmania is to deal with oxidative and nitrosative species and a decreased ability to provide

reduced pterins leads to decreased intracellular survival.

57

List of abbreviations

DAF-FM, 4-Amino-5-methylamino-2',7,-difluorofluorescein-diacetate; DCF-DA, 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate; H2B/H4B, dihydro/tetrahydrobiopterin; H2O2, hydrogen peroxide; INFy, interferon gamma; iNOS, inducible nitric oxide synthase; LPS, lipopolysaccharide; MDMs, monocyte-derived macrophages; MTX, methotrexate; NO, nitric oxide; PKC, protein kinase C; PNA, peanut agglutinin; PTR1, ptéridine reductase 1; RFU, relative fluorescence unit; RNI, reactive nitrogen intermediates; ROI, reactive oxygen intermediates; SNAP, s-nitro-acetylpenicillamine

58

.INTRODUCTION

Leishmania is a human protozoan parasite infecting cells of the monocyte/macrophage

lineage. This parasite has a relatively simple life cycle with promastigotes found in the phlebotomine

sand flies. A proportion of the promastigotes in the sand fly will differentiate into the infectious

metacyclic form. Following a bite of the sand fly, the metacyclic parasites will be delivered into

blood and the parasites will be engulfed by macrophages through conventional receptor-mediated

phagocytosis. The parasite will then develop into an amastigote form where it will survive and

replicate within phagolysosomes (reviewed in [7]). Macrophages possess a number of primary

defence mechanisms against microbial pathogens including the production of reactive oxygen

intermediates (ROIs) and reactive nitrogen intermediates (RNIs) (reviewed in [236-238]).

Leishmania promastigotes were shown to be susceptible to both ROIs [239] and RNIs [240].

Macrophage derived ROIs are primarily produced by the NADPH oxidase (gp91phox) while RNIs are

produced mainly by the inducible nitric oxide synthase (iNOS). Data gathered from a number of

studies and using different approaches have clearly demonstrated that both ROIs and RNIs

contribute to the killing of a number of Leishmania species in both human and murine macrophages

[198,241,242].

However, Leishmania has developed a number of strategies to deal with ROIs and RNIs

produced by the macrophages. Leishmania can interfere with the induction of iNOS and this appears

to be due to a diminished response to IFN-y from the macrophage (reviewed in [7]). Leishmania

also appears to decrease the oxidative burst by inhibiting PKC activity [231, 232]. The parasite itself

is also well equipped to deal with ROIs and RNIs. Leishmania has glutathione, trypanothione [147]

and ovothiol A [216] as reduced thiols and these were found to be non enzymatic scavengers of

ROIs [243]. Leishmania lacks the two key antioxidant enzymes catalase and classical glutathione

peroxidise and its redox metabolism is based on trypanothione. Tryparedoxin (TXN) will transfer the

reducing equivalent of reduced trypanothione to the peroxidoxin tryparedoxin peroxidase (TXNPx)

or to the cysteine-homologue of glutathione peroxidase. The latter enzymes are involved in the

detoxification of ROIs and RNIs (reviewed in [212, 244]). Most of the published studies on these

antioxidant enzymes were carried out in the related African trypanosome parasite but TXNPx was

also shown to detoxify ROIs and RNIs in Leishmania [210]. The trypanosomatids iron superoxide

dismutases were also shown to have a role in dealing with superoxide toxicity [213, 245]. The

surface lipophosphoglycan (LPG) of Leishmania was suggested to scavenge oxygen radicals [246]

59

and genetically derived LPG deficient Leishmania cells were indeed found to be more sensitive to

ROIs [247]. Recent evidences suggest that LPG can block the assembly of the NADPH oxidase at

the membrane of the phagolysosome [233]. Finally, the cellular chaperone HSP70 was also shown to

be involved in antioxidant defense [248]. Leishmania has therefore redundant mechanisms to deal

with oxidative stresses and in this study we wanted to test whether reduced pterins are also important

scavengers of ROIs and RNIs.

Leishmania is auxotroph for pterins but it possess BT1, a unique plasma membrane pterin

transporter [249, 250]. Following BT1-mediated uptake, pterins are reduced within the parasite into

its active form by the enzyme ptéridine reductase PTR1 [251, 252]. Leishmania also contains the

enzymatic machinery for regenerating reduced pterins [253]. One of the earliest cellular function of

(6R)-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (H4B) was as a growth factor for the parasite Crithidia fasciculata

(reviewed in [254]) and many studies have indicated that it is an essential growth factor for

Leishmania [224, 255-257]. H4B serves as a co-factor for a number of enzymes, including iNOS

(reviewed in [254, 258]) but so far these enzymes were either not present or shown not to require

H4B in Leishmania (reviewed in [259, 260]). In addition of being a growth factor, H4B levels were

found to be an important factor controlling metacyclogenesis where low H4B levels increased the

number of metacyclic parasites [261]. H4B was shown to react readily with oxygen, superoxide,

H2O2 and peroxynitrite and it was suggested and eventually demonstrated that it can protect cells

against oxidative damages (reviewed in [228, 229]). Clinical trials in humans have shown that H4B,

through its antioxidant properties can decrease oxidative stresses mediated pathologies [262].

Because of the essential role of pterins in Leishmania , of the oxidant stresses that Leishmania

naturally encounters and of the role of H4B in dealing with oxidants, we tested the role of reduced

pterins in dealing with ROIs and RNIs in Leishmania.

60

MATERIALS AND METHODS

Leishmania strains and culture conditions

Leishmania tarentolae Tarll WT, Leishmania infantum (MHOM/MA/67/ITMAP-263) and

Leishmania major (UV39; wild-type, PTR1 null mutants (PTRl'') and PTR1 add-back mutants

(PTR1'A + PTR1) promastigote cells were grown in SDM-79 (containing 15uM folic acid), or in

M199 (23nM folic acid) media supplemented with 10% fetal bovine serum, 5pg/ml of haemin and

5uM biopterin (Sigma Aldrich) at pH 7.0 and 25°C. Susceptibility to methotrexate (MTX) was

carried out as described while measuring ODôoonm [153]. Susceptibility to H2O2 was carried out

similarly. Resistance to nitrosative stresses was measured using the NO donor S-nitroso-N-

acetylpenicillamine (SNAP) that spontaneously releases NO [263]. Briefly, 5 x IO7 cells were

resuspended in 5 ml of media and H2O2 or SNAP were added at different concentrations and

ODôoonm values were taken at 72 hrs.

PTR1 gene replacement in Leishmania

The generation of Leishmania tarentolae PTR1 null mutants (PTR1 ") has already been

described [256]. The Leishmania infantum and Leishmania major PTR1 null mutants (PTR1") were

obtained by targeted gene replacement. Briefly, PTR1 flanking regions were amplified from L.

infantum (or L. major) wild-type genomic DNA and fused to both neomycin phosphotransferase

(NEO) and hygromycin phosphotransferase (HYG) genes using a PCR-fusion based strategy adapted

from [264]. All primer sequences can be found in Supplementary Table 1. The 5' UTR of L.

infantum PTR1 was obtained by PCR amplification with primers A and B, the latter containing a tail

of 25 nucleotides (underlined) corresponding to the first 25 bases of the NEO gene. The NEO gene

was obtained from pSP72aA/£'Oa [265] with primers C and D, the latter containing a tail of 25 bases

(underlined) corresponding to the first 25 bases of the 3' UTR of L. infantum PTR1. The 5'UTR of

L. infantum was then fused to the NEO gene by PCR using primers A and D giving the fragment

5'UTR-A^O with a tail corresponding to the first 25 bases of the 3'UTR ofPTRl. The 3' UTR of L.

infantum PTR1 was obtained by PCR amplification with primers E and F. The fragment 5'UTR-

NEO was then fused to the 3'UTR by PCR using primers A and F yielding the fragment 5'UTR-

NEO-3 'UTR. After each round of PCR, fragments were isolated on agarose gels and purified using

the Gel Extraction Kit (Sigma Aldrich). The same strategy was used for the L. infantum 5'UTR-

//7G-3'UTR construct (primers A and G, H and I and E and F) and for L. major (primers A-J, C-K

and N-0 for the NEO construct, and primers A-L, C-M and N-O for the HYG construct). The

61

S'UTR-A^O^'UTR and 5'UTR-/7yG-3'UTR were successively transfected into either L. infantum

or L. major in order to replace sequentially the two PTR1 alleles. Null mutants were cultivated in

SDM-79 and selected for resistance to both hygromycin (New England Biolab) and G418

(Geneticin, Sigma Aldrich).

PCR and Southern blot analysis

PTR1 alleles replacement was confirmed by both PCR, using primers P and Q for L. infantum

and primers P and R for L. major, and Southern blot analysis using a 3'UTR PTR1 probe obtained

with primers E and F for L. infantum and with N and O for L. major (see also Fig. 2). The PTR1

gene and its flanking regions have also been amplified by PCR using primers S and T that contained

the restriction site Xbal and Hindlll (underlined). The fragment 5'UTR-P77?7-3'UTR was then

cloned between the Xbal and Hindlll sites of the vSPaZEOa expression vector. This construct was

electroporated in Leishmania cells and selected for zeocin resistance. The resulting transfectants

were used in functional complementation experiments of the PTR1 null mutants.

Purification of Metacyclic parasites

Metacyclics of Leishmania species were obtained using the peanut agglutin assay as

described [266].

Dichlorofluorescein-diacetate (DC FDA) fluorescence and intracellular oxidants level:

Leishmania promastigote cells were exposed to H2O2 and intracellular oxidant content was

measured using the fluorescent Dichlorofluorescein-diacetate (DCFDA) dye (Invitrogen). DCFDA is

cell permeant and nonfluorescent. Upon its entry in live cells, the diacetate groups are cleaved by

cellular esterases. Oxidation of the reduced dye will occur in the presence of ROIs, causing

fluorescence. Promastigotes were harvested from a mid-log phase M199 culture, centrifuged,

washed twice in Hepes-NaCl and counted. IO7 promastigotes were then centrifuged and resuspended

in 1ml Hepes-NaCl. For metabolic rescue, 10 uM of biopterin, or 10 uM of reduced biopterin (H2B

and H4B) or HEPES-NaCl were added for 45 minutes. Cells were centrifugated, washed and

resuspended in 1 ml of HEPES-NaCl buffer, prior to the addition of 250 uM of H2O2 or 100 uM of

SNAP for another 45 minutes. Cells were then centrifuged, washed and resuspended in 1ml of

HEPES-NaCl containing 5uM of DCFDA and left 45 minutes at 37°C in the dark. After a last

centrifugation-washing step, 200 JJ.1 of the promastigote resuspensions were analyzed with a

62

fluorometer (VictorPerkinElmer) at 485nm excitation and 535 nm emission wavelengths. Results are

expressed in Relative Fluorescence Unit (RFU) and are the average of three independent

experiments. A Mann Whitney test was conducted on raw data for statistical analysis *p <0.05,

**p<0.01 and ***p<0.001.

Macrophage infections

We tested the capacity of the L. infantum and L. major wild-type, PTR1 null mutants (PTRl'''

) and PTR1 add-back mutants (PTR1'A + PTR1) promastigotes to infect the murine macrophage cell

line J774 (ATCC J774 Al). Macrophages were seeded (25x104 cells/well) in 24 wells plate and

activated 24h either with INFy (100U/ml) and LPS (100ng/ml) in order to trigger an NO production

by iNOS [267, 268], or with complement-opsonized zymozan (100|xg/ml) in order to trigger an

oxidative burst and production of O2* and H2O2 [269]. Prior to infection, oxidative burst and nitric

oxide production were controlled using DCFDA dye [269, 270] and the Griess assay [271]

respectively. Infections were done with PNA purified metacyclic stationary phase parasites at a

parasite to cell ratio of 10:1 for a period of 3 hours. The non-engulfed parasites were removed by 2 -

3 washes with warm medium and chambers were replenished with 500 ul of fresh DMEM medium

supplemented with 10% FBS. Leishmania cells were transfected with the pSPaBLASTa-1.2LUC

expression vector, which carries the blasticidin resistance gene and the luciferase reporter gene. The

luciferase reporter gene expression was used as a measure of intracellular growth of the parasites as

validated previously [272, 273]. The relative rate of infection was measured using the luciferase

assay. Results are expressed in Relative Luminescence Unit (RLU) which is proportional to the

number of parasites that has survived the phagocytosis after 24h of infection. These experiments

have been done three times (L. infantum) and two times (L. major) in triplicate. Human peripheral

blood mononuclear cells were isolated by density-gradient centrifugation on Ficoll-Hypaque from

healthy blood donors with informed consent obtained in accordance with the Declaration of Helsinki.

Monocytes were purified and allowed to differentiate into macrophages (MDMs) in complete RPMI

1640 supplemented with human recombinant macrophage colony stimulating factor (100 ng/ml) for

6 days as described [274]. Once differentiated, MDM were recovered using PBS-EDTA and seeded

in 96 wells plate and activated 48h either with INFy (100U/ml) and LPS (100ng/ml) or with

zymozan (100ug/ml). Oxidative burst and nitric oxide production were controlled using DCFDA and

DAF-FM dyes as previously done by others in similar conditions [275]. These experiments were

63

done 3 times in triplicate. A Mann Whitney test was conducted on raw data and we considered

results as significant with *p <0.05, **p<0.01 and ***p<0.001.

64

RESULTS

L. tarentolae PTR1 " null mutants are sensitive to in vitro H2O2 and NO mediated stresses

The L. tarentolae PTR1~'~ null mutant has been previously generated in our laboratory and

was shown to be hypersensitive to MTX [256, 276]. We tested whether reduced pterins can serve in

protecting the parasite against oxidative stresses. Leishmania PTR1~'~ cells were shown to have less

H4B [261]. To assess the putative role of reduced pterins in dealing with oxidants, we tested the

susceptibility of L. tarentolae PTR1~'~ null mutant to oxidative and nitrosative stresses. The L.

tarentolae PTRV ' null mutant showed an increased sensitivity for H2O2 compared to control cells

(Fig. IA). The H2O2 EC50 of control parasites is approximately 500 uM whereas it is only about 100

uM for the PTRV ' null mutant parasites. This increased H2O2 sensitivity was reverted (partially) by

adding back an episomal copy ofPTRl in the L. tarentolae PTR1'A null mutant (Fig. 1 A). The PTRV

' null mutant also showed an increased sensitivity for SNAP mediated stresses (a nitric oxide donor)

[263], compared to the control cells (Fig. IB). The PTR1 add-back mutant regained the wild type

phenotype (Fig. IB). These data suggested that L. tarentolae PTR1, through the generation of

reduced pterins, contributed to the ability of the parasite to survive to oxidative and nitrosative

stresses and these novel observations warranted further investigations with human Leishmania

pathogenic species.

PTR1 gene replacement in L. infantum and L. major

The PTR1 genes of L. infantum and L. major were replaced by NEO and HYG markers with

cassettes allowing homologous recombination (Fig. 2A). To confirm the integration of the drug

resistance markers at the PTR1 locus we performed PCR amplifications and Southern blot analysis

on genomic DNA isolated from putative null mutants and wild type parasites of both species (Fig.

2). With the selected primers, PCR amplification from wild type parasites of both species should

give a band of 2,1 kb (Fig. 2A) and this is indeed what we observed (Fig. 2B, 2C,lanes 1). This band

was absent in the null mutants of both species and instead, we observed PCR amplicons of 2 kb and

2.3 kb, consistent with the integration of the NEO and HYG markers respectively (Fig. 2B, 2C, lanes

2). The generation of null mutants was further confirmed by Southern Blot analysis where DNA was

digested with Xbal and NotI and hybridised to a probe recognizing the PTR1 3'UTR region. The

digested DNAs of L. infantum and L. major wild type cells gave rise to 1,3 kb and 2,3 kb bands

respectively due to the presence of a NotI site in L. infantum only. Upon the integration of NEO and

65

HYG at the PTR1 locus, a digestion with Xbal should give rise to 2,2 kb and 2,4 kb hybridising

bands (Fig. 2A) and this is indeed what was observed when the Southern blot was hybridized to the

3'UTR PTR1 probe (Fig. 2B, 2C, lane 2). These novel bands hybridized also with either the NEO

and HYG probes (results not shown).

Phénotypes of h . major and L. infantum PTR1"/"null mutants

PTR1 is a well established marker of MTX resistance [265, 277]. The newly generated L.

infantum and L. major PTRV1' null mutants were both hypersensitive to MTX (Fig. 3A) compared to

control cells. This hypersensitivity phenotype could be rescued by complementation with an

episomal copy oiPTRl and wild-type cells overproducing PTR1 were resistant to MTX (Fig. 3A). A

link between reduced pterins and metacyclogenesis has previously been described for L. major [261]

and constituted as such the first defined cellular role of pterins in Leishmania. In our analysis of

metacyclogenesis, we also found a significant change in the procyclic/metacyclic ratio in both L.

infantum and L. major PTRV ' null mutants (Fig. 3B). This was clearly related to PTR1 inactivation

since the add-back mutants displayed a procyclic/metacyclic ratio similar to the control parasites

(Fig. 3B). In contrast to previous results [255], L. infantum and L. major PTR1~'~ null mutants didn't

require any addition of reduced biopterins to grow. Even in the poor folate medium M199

completely depleted in foetal bovine serum as well as in reduced biopterins, the L. infantum and L.

major PTRV ' null mutants grew similarly to wild type cells (results not shown).

We tested the survival of L. infantum and L. major PTRV1' null mutants against H2O2 and

SNAP. The L. infantum and L. major PTRV ' null mutants exhibited an increased sensitivity for H2O2

mediated stresses, in comparison to the control cells (Fig. 4A). The EC50 for H2O2 of L. infantum and

L. major wild-type cells were about 70 uM and 100 uM respectively. These values decreased to -40-

50 uM for the PTR1' ' null mutants in both species (Fig. 4A). By adding back an episomal copy of

PTR1, this ~2 fold measured difference in sensitivity was reverted (Fig. 4A). In fact, in both L.

infantum and L. major, the add back not only restored the wild type phenotype as it even conferred

increased resistance to H2O2. Wild-type cells overproducing PTR1 were even more resistant to H2O2

(Fig. 4A). L. major and L. infantum PTRl' ' null mutants also exhibited an increased sensitivity for

SNAP mediated stresses, compared to the control cells (Fig. 4B). The SNAP EC50 of control cells of

both species was about 90 uM whereas it was only 30-50 \iM for the PTRV1' null mutants (Fig. 4B).

The PTR1-add back mutants exhibited a wild type phenotype (Fig. 4B).

66

Reduced pterins provided by PTRl as oxidant scavengers in Leishmania cells

Reduced biopterins are known to act as scavengers of oxidant molecules [228, 254]. We

monitored the oxidants in Leishmania cells exposed to H2O2 and SNAP using the membrane

permeable oxidant-dependent dichlorofluorescein-diacetate (DCFDA) fluorescent probe [235, 278].

Under standard growth conditions more fluorescence was observed with L. infantum and L. major

PTRV ' null mutants compared to wild-type cells (Fig. 5A). This increased presence of oxidants is

due to the lack of PTRl since mutant cells retransfected with an episomal PTRl construct had the

same fluorescence levels as control cells (Fig. 5A, 5B). The main function of PTRl is to reduce

pterins [251, 252]. Supplementation with biopterin (Fig. 5, bars marked 'c') did not rescue this

phenotype. However, supplementation with dihydrobiopterin and tetrahydrobiopterin resulted in less

intracellular fluorescence both in the wild-type or PTRV1' null mutants with a significant decrease of

the fluorescence levels (Fig. 5, bars marked 'b'). When control L. infantum and L. major parasites

were subjected to an H202-induced oxidative stress, we observed a marked increase in fluorescence

compared to the non treated cells (Fig. 5A). The largest increase in fluorescence was observed in the

PTRV1' null mutants of both species (Fig. 5 A). This phenotype could be reversed in cells transfected

back with an episomal PTRl construct or by supplementing cells with reduced biopterins but not by

supplementing with oxidized pterins (Fig. 5 , bars marked 'b' and 'c'). Overall, similar albeit smaller

effects were observed in L. infantum cells subjected to a nitric oxide-induced nitrosative stress using

SNAP (Fig. 5B). Indeed, a statistically significant increase in fluorescence was observed in the

PTRl null mutant compared to control cells (Fig. 5B).

Intracellular survival of the L. infantum and L. major PTR1V~ null mutants

We tested the survival of L. infantum and L. major PTRV ' null mutant in the murine

macrophage cell line J774. Parasites were transfected with a construct coding for the firefly

luciferase and the survival of the transfectants was followed by measuring luciferase activity [272].

The intracellular survival of PNA-purified metacyclic L. infantum (Fig. 6B) or L. major (Fig. 6C)

PTRV1' null mutants were significantly reduced compared to PNA-purified metacyclic control cells

(Fig. 6B, C). This phenotype was specific to the lack of PTRl has it could be rescued for both

species by adding back PTRl (Fig. 6B, C). J774 can be readily activated for producing ROIs and

RNIs with opsonized zymozan and INFy/LPS, respectively [267, 269]. Treating J774 with INFy and

67

LPS indeed induced RNI as measured using the classical Griess reagent assay for measuring RNI

production (Fig. 6A, left panel). J774 activation with 100 pg/ml zymozan for 24 hours clearly

produced ROI compared to the non activated J774 as measured using the DCFDA probe (Fig. 6A,

right panel). Metacyclic L. infantum cells transfected with a control vector have decreased survival

in J774 cells activated with INFy/LPS but this was even more pronounced for the PTRl' ' null

mutants (Fig. 6B, middle panel). The difference between PTRV/' null mutants and control cells in

INFy/LPS activated cells was statistically significant (p<0.01) compared to the survival of the PTRV

' null mutant in the non activated J774 cells. A similar observation was done for L. major (Fig. 6C).

Surprisingly, L. infantum control cells infected better Zymozan activated J774 compared to cells

treated with Hepes-NaCl (Fig. 6B). This latter phenomenon was only observed for L. infantum,

however (Fig. 6B, C). Nevertheless, when compared to control cells, metacyclic parasites of both L.

infantum and L. major PTRV1' null mutants were killed in significantly higher proportion in the

Zymozan treated macrophages compared to the survival in non activated macrophages (Fig. 6B, C).

The phénotypes observed were rescued by transfecting back PTRl in the PTRl''mutants (Fig. 6B,

C).

We also tested the survival of the L. infantum PTRl null mutant in human monocytes-derived

macrophages (MDMs). As reported extensively in the literature [279], we could not measure

changes in RNIs in human MDM activated with INFy/LPS using either the Greiss reagent (result not

shown) or even the more sensitive fluorescent probe DAF-FM (Fig. 7A). However, treatment of

human MDM with Zymosan induced ROIs as measured using DCFDA probe (Fig. 7A, right panel).

PNA-purified PTRV1' metacyclic parasites had reduced intracellular survival and this could be

rescued by the reintroduction of PTRl (Fig. 7B). Despite our inability to detect RNIs in MDMs, the

survival of the L. infantum PTRl'' null mutant was significantly lower (p<0,05) in cells treated with

INFy/LPS compared to their survival in non activated MDMs when compared to control cells (Fig.

7B). A similar observation was also made for the Zymosan treated cells where the survival of the

purified metacyclics of L. infantum PTRl' ' were significantly reduced in the treated cells compared

to the non treated cells (Fig. 7B). Interestingly in MDMs (but not in J774 cells), we found more L.

infantum parasites in the PTRl add-back transfecteants under all conditions (Fig. 7B).

68

DISCUSSION

Pterins are known as important growth factors for Leishmania (reviewed in [259, 260]),

although their exact cellular role(s) have not yet been established in this parasite. Reduced pterins

such as H4B serve as co-factors for a number of enzymes [254, 258] including iNOS. One report has

described iNOS activity in Leishmania [280] but the genome sequence has not revealed any iNOS

homologue in Leishmania (www.genedb.org). Other enzymes known to require H4B in mammalian

cells are either absent or shown to utilise other co-factors or have not yet been studied in Leishmania

[259, 260]. Thus, it is likely that reduced pterins play other roles in Leishmania. One role that was

established consisted in a correlation between low levels of H4B and metacyclogenesis in L. major

[261]. The L. major PTRl' ' null mutant was found to be more virulent in mice and this was

suggested to be due to an increase in metacyclogenesis [261]. We confirmed that L. major PTRl' '

had increased levels of metacyclics (result not shown) and we showed here that the L. infantum

PTRl' ' mutant also had increased metacyclogenesis (Fig. 3B). Since PTRl' ' cells have increased

metacyclic parasites, we opted to purify metacyclic parasites from control cells and PTRl' ' mutants

prior to macrophage infections. This has allowed to demonstrate a marked reduced intracellular

survival of the L. infantum PTRV ' mutant compared to control cells when metacyclic parasites

infected macrophages either of murine or human origin (Fig. 6B, 7B). The same observation of

reduced survival was made with L. major PTRl' ' purified metacyclics (Fig. 6C). We choose to look

at 24hr infections as we had expected that it is in the first hours of contact, when promastigotes

interact with the macrophages, that the parasites would experienced the most ROIs. Indeed,

promastigotes are known to induce more ROIs than amastigote parasites when infecting the

macrophages [281]. Longer infection times with metacyclic parasites were also studied and we also

observed that the growth of the L. infantum PTRl' ' mutant was also decreased compared to control

parasites (results not shown). Thus a lack of PTRl increases metacyclogenesis and this contributes

to the reported increase in vivo infection [261]. However, if macrophage infections are carried out

with purified metacyclic parasites, then we showed an important function of PTRl in intracellular

survival (Fig. 6, 7). Several reports have dealt with the generation of inhibitors against PTRl [282,

283] and these efforts appear justified in light of the role of PTRl for the intracellular survival of the

parasite.

The main research question that was sought in this study was whether reduced pterins can

serve as defence mechanisms against ROIs and RNIs in Leishmania. Reduced pterins are established

radical scavengers (reviewed in [228]) although this is not known for Leishmania. Multiple drugs,

69

some putatively inducing ROIs, can induce amplification of the DNA locus encoding PTRl [90]. It

has been argued that amplification of PTRl may be due to the requirement of PTRl-produced

reduced pterins to deal with drug-induced ROIs [259]. To test this, we generated PTRl''mutant of

different Leishmania species (Fig. 2). Both the molecular (Fig. 2) and functional characterization of

the mutants confirmed that we had generated PTRl null mutants with the expected phenotype of

MTX susceptibility (Fig. 3). We did not need to supplement the growth media with reduced pterins

to sustain the growth of PTRl null mutants. As pterins are essential co-factors, we cannot exclude

small contaminating amounts in some components of the media used or that, as suggested [259],

Leishmania may have another elusive enzyme that can reduce a small amount of pterins.

The PTRl' ' cells of three Leishmania species were found to be more sensitive to RNIs and

ROIs (Fig. 1, 4). This novel phenotype was specific as it could be rescued either genetically by

transfecting back PTRl, or metabolically by supplementing the medium with reduced but not

oxidized pterins (Fig. 4). Interestingly, even under standard conditions, we observed an increased

level of oxidants in PTRl' ' cells (Fig. 5), suggesting that the maintenance of a reduced environment

is one of the physiological roles of reduced pterins that are provided in part by PTRl. Cells

transfected with PTRl were even more resistant to H2O2 compared to control cells (Fig. 4).

Interestingly, the overexpression of PTRl provided a significant advantage in growth in MDMs,

even in cells primed to produce ROIs or RNIs (Fig. 7). This supports a role for reduced pterins as a

non-enzymatic scavengers of ROIs and RNIs in Leishmania and this is consistent with the proposed

role of pterins in dealing with ROIs [284] and RNIs [285]. As discussed above, the PTRl' ' parasites

were already crippled when grown in macrophages but when ROIs or RNIs were induced in

macrophages, we observed a larger reduction of PTRV1' cells compared to control cells, further

supporting a role of reduced pterins in dealing with oxidative and nitrosative stresses. PTRl main

role is to reduce pterins obtained for the environment. Once H4B is used in the cell, it will eventually

yield quinonoid-dihydrobiopterin which is regenerated into H4B by the enzyme quinonoid

dihydropteridine reductase [254]. It would be interesting to inactivate this gene in Leishmania and, if

non essential, test its role in dealing with ROIs and RNIs. This is complicated in L. major, however,

since it is encoded by a tandemly repeated array of genes [253] although in L. infantum it would

appear to be single copy (www.genedb.org).

Leishmania often amplifies specific portions of its genome to respond to environmental

stresses such as drugs [136, 286]. A small number of loci are also found naturally amplified in field

isolates [286]. Two of those loci encode for Biopterin Transporter BT1 and PTRl [260]. It has been

70

proposed that the requirement for pterins has led to the selection of events leading to

extrachromosomal amplification of BT1 and PTRl. In light of the results presented here, one

possible driving force for gene amplification would be ROIs or RNIs that are encountered by the

parasites in its environment. Clearly, during its life cycle, the parasite, either in the sand flies or

when interacting with macrophages, is experiencing a number of stresses including ROIs and RNIs.

The parasite is well equipped with enzymatic and non enzymatic mechanisms to cope with these

molecules (see introduction) and to this list, we can now added reduced pterins.

71

ACKNOWLEDGMENTS

This work was funded in part by a CIHR group grant and operating grants to MO. We thank

Juliette Diou and Dr. Michel Tremblay for the generous gift of MDM cells. WM is a Strategic

Training Fellow of the Strategic Training Program in Microbial Resistance, a partnership of the

CIHR Institute of Infection and Immunity and the Fonds de Recherche en Santé du Québec. MO is a

Burroughs Wellcome Fund Scholar in Molecular Parasitology and holds the Canada Research Chair

in Antimicrobial Resistance.

72

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76

Fig. 1. Susceptibility of the L. tarentolae PTRV7' null mutant to oxidative and nitrosative

stresses. A. Growth of L. tarentolae cells at 72 hours with varying concentrations of H2O2. B.

Growth of L. tarentolae cells at 72 hours with varying concentrations of SNAP. Average of

triplicates repeated twice. • , L. tarentolae wild type cells transfected with pGEM-7ZF-aNEOa; ■. L.

tarentolae PTRl' ' null mutant; o, L. tarentolae PTRl' ' null mutant transfected with a PTRl

episomal construct.

Fig. 2. PTRl gene replacement in L. infantum and L. major. A. PTRl locus in L. infantum and L.

major and expected size of PCR amplicons (below the maps; dashed lines) and expected size of

hybridizing bands (above the maps) in wild type and recombinant parasites digested with Xbal and

NotI and hybridized to a 3'UTR probe. B. PCR and Southern blot analysis of L. infantum wild type

(lane 1) and the PTRl' ' null mutant (lane 2). C. PCR and Southern blot analysis of L. major wild

type (lane 1) and PTRl' ' null mutant (lane 2). X, Xbal; N, NotI. The NotI site (N) is present only in

the L. infantum PTRl gene.

Fig. 3. Susceptibility to methotrexate and metacyclogenesis of L. infantum and L. major PTRl"''

null mutants. A. Growth of L. infantum and L. major cells at 72 hours with varying concentrations

of methotrexate. Average of triplicates repeated twice. • , wild type cells transfected with

pSPaNEOa; ■, PTRl' ' null mutants; o, PTRl' ' null mutants transfected with an episomal PTRl

construct; A, wild type transfected with an episomal PTRl construct. B. Percentage of metacyclic

promastigotes in 7 days old cultures of L. infantum (left) and L. major (right). Metacyclic parasites

were separated from procyclics and counted using PNA as described in Materials and Methods.

Average of three independent experiments. *, p<0,05

Fig. 4. Susceptibilities of L. infantum and L. major PTR1V~ null mutants to oxidative and

nitrosative stresses. A. Growth of L. infantum and L. major cells at 72 hours with varying

concentrations of H2O2. B. Growth of L. infantum and L. major cells at 72 hours with varying

concentration of SNAP. Average of triplicates repeated twice. • , wild type cells transfected with

pSPaNEOa; ■, PTRl' ' null mutants; o, PTRl' ' null mutants transfected with an episomal PTRl

construct; A, wild type transfected with an episomal PTRl construct.

77

Fig. 5. Intracellular oxidative species levels and reduced pterins in Leishmania infantum and

Leishmania major. A. The level of oxidative species was measured in Leishmania cells under

standard growth conditions (left panel) or after being exposed to 250 uM of H2O2 (right panel) using

the DCFDA probe in L. infantum (upper panel) or L. major (lower panel) transfected with

pSPaNEOa (white bars) in the PTRl' ' null mutants (black bars) or in the PTRl' ' null mutants

transfected with an episomal PTRl construct (grey bars). The cells were metabolically rescued with

Hepes-NaCl buffer ('a'); 10 pM dihydrobiopterin/tetrahydrobiopterin ('b'); 10 pM biopterin ('c'). B.

We also monitored the level of oxidative species in the same L. infantum transfected cells under

normal conditions (left panel) and after being exposed to 100 pM of SNAP, a nitric oxide donor

(right panel). Results are the average of 3 independent experiments *, p<0,05 ; **, p<0,01.

Fig. 6. Intracellular survival of Leishmania PTRl''' null mutants in the murine macrophage

J774 cell line. A. J774 were activated during 24 hours with INFy (100 U/ml) and LPS (100 ng/ml)

prior to infection and nitric oxide production was measured using the Griess assay (left panel). J774

were activated during 24 hours with zymozan (100pg/ml) prior to infection and the production of

oxidants species was measured using the DCFDA oxidant-dependent fluorescent probe (right panel).

B-C. L. infantum (B) and L. major (C) cells were transfected with a construct coding for the firefly

luciferase and the survival of PNA-purified metacyclic parasites within J774 macrophages was

assessed by measuring luciferase activity after 24 hours of infection. L. infantum (B) or L. major (C)

cells transfected with pSP72aNEOa (white bars) in the PTRl null mutants (black bars) or in PTRl' '

null mutant transfected with an episomal PTRl construct (grey bars). J774 macrophages infection

was done in 24 wells plates using a 10:1 parasite to macrophage ratio. Macrophages were either

treated with the buffer (HEPES-NaCl); primed to produce RNIs (INFy/LPS) or ROIs (Zymosan).

Results are expressed as the average relative luminescence unit (RLU) of three (L. infantum) and two

(L. major) independent experiments done in triplicate. *, p<0,05 ; **, p<0,01 ; ***, p<0,001 .

Fig. 7. Intracellular survival of the L. infantum PTRl ' null mutant in human monocyte-

derived macrophages. A. MDM were activated during 48 hours with Inf-y (100 U/ml) and LPS

(100 ng/ml) or with zymozan (100pg/ml) prior to infection and the production of oxidants species

was measured using either the DAF-FM nitric oxide dependent fluorescent probe (left panel) or the

DCF-DA oxidant dependent fluorescent probe (right panel). B. L. infantum cells were transfected

with a construct coding for the firefly luciferase and the survival of metacyclic promastigotes within

78

MDM was followed by measuring luciferase activity after 24 hours of infection in L. infantum cells

transfected with pSP72aNEOa (white bars), in the PTRl null mutants (black bars) or in the PTRl' '

null mutant transfected with an episomal PTRl construct (grey bars). MDM macrophage infection

was done in 96 well plates using a 10:1 parasite to macrophage ratio. Results are expressed as the

average relative luminescence unit (RLU) of three independent experiments done in triplicate. *,

p<0,05 ; **, p<0,01.

79

1000 [ H O ] M M

100 [SNAP] pM

500

Fig. 1

80

Fig.2

2.3 kb

5'UTR

XA j 5'UTR

(N)«— _ | PTR1

1.3 kb

3'UTR x j _

2.1 kb

2.4 kb

HYG 3'UTR ■­ 2.3 kb

XM J 5'UTR

2.2 kb

NEO 2kb

5'UTR

PTR1

kb

3

­ 2 PTR1

81

L. infantum L. major

50 100

[MTX] MM

500 100

[ M T X ] M M

500

WT PTR1 -/- PTR1 -/-+ PTR1

D Procyclics ■ Metacyclics

WT PTR1 -/- PTR1 -/-+ PTR1

Fig. 3

82

L. infantum L. major

25 50 100 250 500

[H2OJ MM 25 50 100 250 500

[H202] uM

100 250

[SNAP] uM 500

100

500 [SNAP] uM

Fig. 4

83

A 40000

30000-

2 20000 QC

10000-

40000

30000-

2 20000 S

10000

B 40000

30000

20000

10000

D WT + a-NEO-a ■ PTR1 -/-m PTR1 add black

250 [H202] MM

[SNAP] pM

Fig. 5

84

o z

50-

40-

30-

20-

10-

o-untreated INF-y

LPS

250000-

200000-

3 150000-u. S 100000

50000

0 I -■- I

Y

untreated Zymozan

B

- i on

□ WT + ct-NEO-a ■ PTR1 -/-m PTR1 add black

Hepes-NaCl INFy / LPS Zymozan

où

Hepes-NaCl INFy / LPS

Fig. 6

Zymozan

85

8000-

7000-

6000-

= 5000-

U- 4000-3000-

2000-

1000-

o -untreated INF-y

LPS

25000-

20000-

3 15000-u. K 10000-

5000-

o -untreated Zymozan

B 400

300-

200-

100-

□ WT + a-NEO-a ■ PTR1 -/-M PTR1 add black

Hepes-NaCl INFy / LPS Zymozan

Fig. 7

86

Chapitre VI. Analyse de la métacyclogénèse et du rôle des

ptérines réduites chez Leishmania infantum Ce chapitre fera bientôt l'objet d'une soumission au Journal of Proetome Research et est constitué de

la dernière version du manuscrit qui sera soumis pour publication.

6.1 Résumé Leishmania, l'agent étiologique de la leishmaniose, possède un cycle de vie dimorphique et se

retrouve sous la forme promastigote flagellée dans son vecteur, la mouche des sables, et sous la

forme amastigote intracellulaire non-mobile dans les macrophages de son hôte mammifère. Les

promastigotes acquièrent leur maturité dans la mouche des sables en passant par deux stades

importants bien distincts. Ce développement séquentiel des promastigotes procycliques non-

infectieux vers les promastigotes métacycliques infectieux se nomme métacyclogénèse et constitue

une étape importante pour l'infectivité du parasite. Plusieurs modifications biochimiques et

moléculaires ont été associées à la métacyclogénèse. L'inactivation de la ptéridine reductase PTRl

provoque une augmentation du nombre de parasites métacycliques comparativement à une souche

sauvage. Peu d'études ont porté sur les changements du protéome durant la métacyclogénèse du

Leishmania et aucune, jusqu'à présent, n'a étudié le rôle des ptérines dans ce processus de

differentiation. Dans cette étude, nous avons utilisé la technique du FFE (Free Flow Electrophoresis)

pour analyser la métacyclogénèse d'une souche de L. infantum sauvage et une souche déficiente en

PTRl suite à une inactivation génique. L'utilisation du FFE améliore significativement le niveau de

résolution du protéome et nous avons pu identifier plus de 460 protéines potentiellement exprimées

de manière différentielle durant le processus de métacyclogénèse, ou bien entre la souche sauvage et

la souche PTRl''. Des voies métaboliques importantes, comme le métabolisme énergétique, les

mécanismes de défenses anti-oxidatives, la dégradation des protéines, et la mobilité du parasite

semblent jouer un rôle dans la métacyclogénèse du Leishmania et ceci paraît encore plus flagrant

chez le mutant PTRl''.

87

6.2 Article

Proteomic analysis of metacyclogenesis in Leishmania infantum and the role of

reduced pterins

To be submitted in Journal of Proteome Research

Wilfried Moreira, Gina Racine, Danielle Légaré and Marc Ouellette*

Centre de Recherche en Infectiologie du CHUL, Université Laval, Québec, QC, Canada.

*Corresponding author: Marc Ouellette Ph.D.

Centre de Recherche en Infectiologie

2705 Boul. Laurier

Québec, QC

Canada

Gl V 4G2

Tel : 1-418-654-2705

Fax : 1-418-654-2715

E-mail : Marc.Ouellette(2),crchul.ulaval.ca

Running title: Proteomic analysis of metacyclogenesis in Leishmania

Keywords: Leishmania, reduced pterins, metacyclogenesis, free-flow electrophoresis

88

Summary

Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, has a dimorphic life cycle alternating as a

flagellated promastigote within the sand fly midgut and an intracellular nonmotile amastigote within

mammalian macrophages. Promastigotes maturate in the sand fly and progress through two major

and distinct stages. This sequential development of non-infective procyclic promastigotes towards

infective metacyclic promastigotes is called metacyclogenesis and is important for parasite's

infectivity. Several biochemical and molecular differences have been associated to

metacyclogenesis. Among these, reduced pterins have been identified as an important factor

controlling the metacyclogenesis process. Indeed, inactivation of the ptéridine reductase gene PTRl

leads to an increase in metacyclic parasites compared to a wild-type strain. Only few studies have

investigated specifically the proteome changes during metacyclogenesis and none has studied the

role for reduced pterins in this process so far. In this study, we applied the liquid based free-flow

electrophoresis (FFE) technique for the analysis of L. infantum wild-type and PTRl null-mutant

(PTRV ') proteomes during the metacyclogenesis process. The use of the FFE technique greatly

improved proteome resolution and we report here the identification of more than 460 proteins

thought to be differentially expressed either during the differentiation process or between wild-type

and PTRl null-mutant metacyclic promastigotes. Important metabolic pathways such as energy

metabolism, antioxidant defences, protein degradation and motility are modulated during

Leishmania metacyclogenesis.

89

Introduction

Leishmania parasites are responsible for a wide range of diseases affecting 12 million people

worldwide with 1.5-2 million new cases each year. Leishmania has a dimorphic life cycle and is

found as a flagellated promastigotes within the sandfly midgut, and as an intracellular nonmotile

amastigotes within mammalian macrophages. Promastigotes maturate in the sandfly and progress

through two major and distinct stages. This sequential development involves the rapid division of

non-infective procyclic promastigotes in the midgut that ultimately leads to the formation of the non-

dividing and infective metacyclic promastigotes in the anterior parts of the digestive tract [1,2]. This

differentiation process of procyclic promastigotes into metacyclic promastigotes (metacyclogenesis)

is a key step for infectivity [2-4]. It has been shown that promastigotes recovered from laboratory

infected sandfly displayed a significant increase in infectivity in Balb/c mice [2]. An increase in

promastigotes infectivity was also observed in culture when promastigotes from logarithmic phase

(day 3) were compared to promastigotes from the stationary phase (day 6), the latter being more

infective [1-4]. The infectivity of stationary phase promastigotes has been attributed to the change in

their surface carbohydrates [4].

Metacyclogenesis is accompanied by a number of morphological changes that allow the

distinction of the metacyclic form. Procyclics possessed a flagella approximately one body length

whereas metacycles are shorter cells of reduced body width and flagella longer than one body length.

The mechanism underlying this differentiation has been the subject of many studies and several

investigations have been conducted in order to identify specific metacyclic stage antigens [4-6]. It is

important to note that within the Trypanosomatidae, including Leishmania spp., regulation of gene

expression mostly occurs at the post-transcriptional level, suggesting that changes in the proteome

during differentiation must be controlled by post-transcriptional mechanisms, including modulation

of mRNA stability, regulation of translation and post-translational modifications [7]. It is also known

90

that metacyclogenesis occurs in a nutrient-depleted environment [2], curtailing the resources for

protein de novo synthesis, suggesting a role for post-translational modifications in this differentiation

process. Clear biochemical and molecular differences have already been established during

metacyclogenesis. That includes a lower amount of total protein content associated to a decrease in

protein synthesis in the metacyclics compared to procyclics, as well as an increase in proteases

activity [8]. Secretory acid phosphatase and nuclease activity have also been reported to be

decreased in metacyclic parasites [8]. As mentioned earlier, there are also changes in surface

carbohydrates composition between procyclics and metacyclics.

Reduced pterins have been identified as an important factor controlling the metacyclogenesis

process [9]. Leishmania is an auxotroph for pterins but it possesses the biopterin transporter BT1

[10-12]. After BT1-mediated uptake, pterins are reduced into their active form by the enzyme

ptéridine reductase (PTRl) [13-15]. One of the earliest known cellular functions of H4B was as a

growth factor for the parasite Crithidia fasciculata [16], and many studies have indicated that it is an

essential growth factor for Leishmania [17-20]. H4B serves as a cofactor for a number of enzymes

[16, 21] but so far these enzymes were either not present or shown not to require H4B in Leishmania

[14, 22]. H4B was also shown to react readily with oxygen, superoxide, H202, and peroxynitrite and

it was demonstrated that it protects cells against oxidative damages [23, 24] (and reviewed in [25,

26]). PTRl and reduced pterins thus play important roles in Leishmania differentiation and life

cycle, in which the infective metacyclic form encounter oxidative stress as it meets with its host

immune system.

Few studies have investigated the proteome changes during the metacyclogenesis of

Leishmania [27, 28] and none related to a role for reduced pterins in this process. In this study, we

applied free-flow electrophoresis (FFE), a liquid based IEF separation technique that we recently

used for Leishmania proteins [29], for the analysis of the metacyclogenesis process in L. infantum

91

wild-type cells and in a PTRl null-mutant (PTRl') [23]. This proteomic approach was useful to

detect proteins differentially expressed during metacyclogenesis and to pinpoint possible roles for

reduced pterins in this process.

92

Material and Methods

Cell Culture, Lectin-Mcdiated Purification of Metacyclics and Protein Sample Preparation. L.

infantum (MHOM/MA/67/ITMAP-263) wild-type and PTRl' ' [23] promastigotes were grown in

SDM medium as described previously [30] and parasites (IO9 cells) in their exponential phase (3

days of culture) and stationary phase (6 days) of growth were pelleted by centrifugation (3000 rpm,

5 min). Pellets were washed twice in Hepes-NaCl (21 mM Hepes, 137 mM NaCl, 5 mM KC1, 0.7

mM Na2HP04-H20, and 6 mM Dextrose, pH 7.05). Purification of metacyclics parasites was made

as previously described [3] from the parasites population isolated in stationary phase using a final

concentration of 100pg/ml of peanut-agglutinin protein (PNA). Protein extractions were prepared by

incubating cell pellets in 300 pi of 2D lysis buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 3% (w/v) Chaps, 20 mM

DTT, 5 mM TCEP, 50 mM Tris-base 0.5% IPG buffer pH 4-7, and 0.25% IPG buffer pH 3-10)

supplemented with 10 pi of protease inhibitors cocktail (2 mM AEBSF, 14 pM E-64, 130 pM

Bestatin, 0.9 pM Leupeptin, 0.3 pM Aprotinin, and 1 mM EDTA) (Sigma-Aldrich) for 2 h at room

temperature with frequent vortexing. The supematants were collected after centrifugation (10000

rpm, 2 min) and total protein preparations were quantified using the 2-D Quant Kit (GE Healthcare).

Free-Flow Electrophoresis (FFE) Continuous liquid-based isoelectro-focusing (IEF) was

performed using a BD FFE System (BD Diagnostics) essentially as described [29]. Briefly, the

Leishmania proteins (3 mg) were fractionated under denaturing conditions in a pH gradient ranging

from 3 to 10 using standard electrophoretic conditions (10 °C, 750 V, media flow rate of 57 ml/h)

[29]. Four independent biological replicates for each stage were processed. Individual fractions were

pooled to cover 3 pH ranges; 4.5 to 5.8 (fractions 27-33), 5.9 to 6.9 (fractions 34-40) and 6.9 to 8

(fractions 41-48). Proteins were concentrated using Ami con Ultra-15 columns (Millipore) and

desalted by three successive centrifugation/wash steps with 1 ml of 2D lysis buffer followed by

resuspension in the same buffer and proteins quantification using the 2DQuand Kit (GE Healthcare).

93

2D Gel Electrophoresis. Total cell extracts of procyclics and metacyclics were precipitated using

the 2-D Clean-up Kit (GE Healthcare) whereas pooled FFE fractions remained unprecipitated. One

hundred and fifty micrograms of sample (total cell extracts or pooled FFE fractions) were loaded

onto 18-cm Immobiline DryStrips of pH ranges 4,5-5,5, 5-6 and 5,5-6,7 (GE Healthcare). The first

dimension was performed in Ettan IPGphor II isoelectric focusing system (GE Healthcare) as

recommended by the manufacturer. IPG Strip equilibration and second-dimension SDS-PAGE were

done as described previously [31].

Gel Staining, Imaging, and Analysis. Proteins were visualized using SYPRO Ruby Protein Gel

Stain (Invitrogen) as described previously [32]. Gels were digitalized on the ProXPRESS 2D

Proteomic Imaging platform (PerkinElmer Life Sciences) and images were analyzed using the

Progenesis PG240 software (Nonlinear Dynamics, version 2006) in which spots were detected and

matched automatically. The data were inspected visually and edited manually when required. Spots

with differences in normalized spot volume (% Vol) greater than 1.5-fold in the four biological

replicates were considered as significantly differentially expressed. Significance levels of differences

observed were determined by the Progenesis software using the Student's two-tailed t test. P-values

< 0.05 were considered as statistically significant.

In-Gel Protein Digestion. Gel plugs containing proteins of interest were excised using a ProXcision

robot (PerkinElmer Life Science), deposited into a 96-well plate (Coming) and washed with distilled

water. In-gel protein digestion was performed at the Proteomics Platform of the Eastern Quebec

Genomics Center (http://proteomique.crchul.ulaval.ca/en/index.html) on a MassPrep liquid handling

station (Waters, Corporation) according to the manufacturer's specifications as described previously

[29, 31-33]. Digestion products were extracted from gel plugs using 1% formic acid, 2% acetonitrile

followed by 1% formic acid, 50% acetonitrile. Peptides were lyophilized in a speed vacuum and

94

resuspended in 8 pi of 0.1% formic acid and 4 pi of this peptide preparation was used for mass

spectrometry analysis.

Mass Spectrometry. Peptide MS/MS spectra were obtained by capillary liquid chromatography

coupled to an LTQ linear ion trap mass spectrometer equipped with a nanoelectrospray ion source

(Thermo Fisher Scientific). Peptides were loaded onto a reversed-phase column (PicoFrit 15-pm tip,

BioBasic C18, 10 cm x 75 pm; New Objective) and eluted with a linear gradient from 2% to 50%

acetonitrile in 0.1% formic acid at a flow rate of 200 nl/min. Mass spectra were acquired using a

data-dependent acquisition mode (Thermo Fisher Scientific Xcalibur software, version 2.0) in which

each full scan mass spectrum was followed by collision-induced dissociation of the seven most

intense ions. The dynamic exclusion function was enabled (30 ns exclusion), and the relative

collisional fragmentation energy was set to 35%.

Interpretation of Tandem Mass Spectra and Protein Identification. MS/MS spectra were

analyzed using MASCOT (Matrix Science, version 2.2.0) and searched in the GeneDB Leishpep

database assuming a theoretical digestion with trypsin. A mass tolerance of 2.0 Da for peptides and

0.5 Da for fragments were tolerated, with 2 trypsin missed cleavages allowed. The Scaffold software

(Proteome Software, version 2 0 1 0 1 ) was used to validate MS/MS-based peptide and protein

identifications. Peptide identifications were accepted if they reached greater than 95% probability as

specified by the Peptide Prophet algorithm [34]. Protein identifications were accepted if they reached

greater than 95% probability and contained at least three unique peptides as specified by the Protein

Prophet algorithm [35]. Proteins that contained similar peptides and could not be differentiated

according to MS/MS spectra alone were grouped to satisfy the principle of parsimony. The

assignment of functional classes was performed using the GeneDB database information's.

95

Results

Enrichment of procyclics and metacyclics proteins by FFE. L. infantum proteins derived

from WT and PTRl' ' procyclics and PNA purified metacyclics were fractionated by FFE in IEF

mode into about 70 fractions recovered in 96-well plates (~ 3mL/fraction). The pH of each fraction

was measured and fractions with pH between 4.5 and 5.8 (fractions 27-33), between 5.9 and 6.9

(fractions 34-40) as well as between 6.9 and 8 (fractions 41-48) were pooled. The FFE enrichment

of proteins for each condition was confirmed by 2D gel electrophoresis using IEF strips with pH

between 4.5 and 5.5, between 5 and 6 as well as between 5,5 and 6,7 by comparing FFE-enriched

proteins to whole cell extracts (total proteins) for each range of pH (Supplementary Fig. 1 and results

not shown).

Changing proteomes ofL. infantum WT and PTR1'A during metacyclogenesis. Since FFE

enriched effectively for the procyclics and metacyclics proteomes of WT and PTRl' '

(Supplementary Fig. 1) we carried out several comparative analyses of their respective proteomes

during metacyclogensis. We first compared meytacyclogenesis of L. infantum WT (Fig. 2,

comparison 1) and PTRl' ' null-mutants (Fig. 2, comparison 2) independently. This allowed the

identification of proteins differentially expressed during the transition from procyclics to

metacyclics. Fractions were separated by 2-DE with the first dimension respectively spanning pH

4.5-5.5, 5-6 and 5.5-6.7. The number of spots analyzed and proteins differentially expressed are

summarized in Supplementary Table 1. Globally, the numbers of protein spots detected over the

three pH ranges were 5323 and 5984 for L. infantum WT procyclic and metacyclic stages

respectively, and 5006 and 5207 for L. infantum PTRl' ' procyclic and metacyclic stages

respectively. We selected 20 spots that were derived from the WT cells undergoing

metacyclogenesis (Fig. 2, comparison 1); 7 were either unique or overexpressed in procyclics while

13 were either unique or overexpressed in the metacyclic stage respectively. We also selected 18

96

spots that were derived from the PTRl' ' cells undergoing metacyclogenesis (Fig. 2, comparison 2): 2

were either unique or overexpressed in procyclics while 16 were either unique or overexpressed in

the metacyclic stage of the PTRl null-mutant, respectively. Spots were excised and sent for MS/MS

identification. Out of these 38 spots, 36 spots fitted into the Scaffold software parameters (see

Material and Methods) which yielded 116 proteins: 15 unique or overexpressed in the procyclics and

101 unique or overexpressed in the metacyclic stage (Supplementary Table 1). As reported

extensively, there are extensive post-translational modifications in Leishmania and related parasites

(Jones et al., 2005, McNicoll et al., 2006, Rosenweig et al., 2008) including protein fragments

(Brotherton, 2010). Proteolysis has been shown to be a highly dynamic process in Leishmania as

experimentally validated with the tubulins (Drummelsmith et al., 2003), heat shock proteins (Bente

et al., 2003) and elongation factor-la (Brotherton, 2010). Several of the spots identified correspond

to protein fragments and are considered as a physyiological response occurring during

metacyclogenesis.

Both for the wild type cell and the PTRl null-mutants differentiating from procyclics to

metacyclics, we observed an alteration in the expression of several proteins (or fragments of)

including ones related to energy metabolism (Table 1), antioxidants metabolism (Table 2), stress

(Table 3), protein degradation (Table 4) and finally motility (Table 5). During metacyclogenesis of

wild-type cells, protein fragments related to the energy metabolism were found to be differentially

expressed (Table 1). Among these, we found the pyruvate dehydrogenase El beta subunit (LinJ

25V3.1790), which belongs of the glycolysis and TCA cycle pathway, either upregulated or

uniquely present in the metacyclic stage (Table 1). A fragment of prteins involved in GDP-mannose

biosynthesis (LinJ23_V3.0120) and the enolae were found to be increased in PTRl (Table 1). We

also identified fragments of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD, LinJ34_V3.0080) and

the fructose-1,6-biphosphate aldolase (LinJ36_V3.1320), involved in the glycolysis and the pentose

97

phosphate pathway, that are uniquely observed in the metacyclic stage of either the wild-type or

PTRl ' ' (Table 1).

A number of proteins (or fragments of) associated with antioxidants metabolism were

differentially expressed when analyzing conditions 1 and 2 (Table 2). A fragment of the

trypanothione reductase (LinJ05_V3.0350) was increased during metacyclogenesis while one

tryparedoxin peroxidase isoform (LinJ23_V3.0050) was exclusively expressed in both the wild-type

and PTRV ' procyclics (Table2). Several chaperonin isoforms (or their proteolytic fragments) were

also differentially expressed, most of which were unique to procyclics (Table 3). These

promastigotes specific chaperonin includes the mitochondrial Hsp60 chaperonin (LinJ36_V3.2130),

a putative chaperonin (LinJ36_V3.7240), the heat shock protein 83-1 (LinJ33_V3.0350) and the

Hsp70 (LinJ28_V3.2960). Fragments of a putative HSP70 (LinJ28_V3.2960), of a putative

mitochondrial Hsp70 related protein (LinJ30_V3.2470) and of Hsp83-1 (LinJ33.0370) were higher

or exclusively present in the metacyclic stage (Table 3). The presence of protein fragments derived

from proteins involved in protein degradation differed between procyclics and metacyclics (Table 4).

Fragments of the dipeptidyl-peptidase III (LinJ05_V3.0960) of a calpain-like cysteine peptidase

(LinJ27_V3.0510) and the putative protéasome beta 7 subunit (LinJ34_V3.4390) were uniquely

found in the procyclic stage while a protein fragment derived from an aminoacylase

(LinJ20_V3.1740) or protéasome related subunits (LinJ27_V3.1370, linJ29_V3.0120,

LinJ35_V3.0770) were found uniquely (or in higher amount) in the metacyclic stage (Table 4).

Tubulins are abundant proteins extensively processed in Leishmania (Drummelsmith 2003, autre ref)

and a high number of spots with varing molecular weights and pis contained either the beta tubulin

(LinJ08_V3.1280), or alpha tubulin (LinJ13_V3.0330), which seems to vary between procyclics and

metacyclics (Table 5). The presence and abundance of several other proteins and fragments involved

in motility differed between procyclics and metacyclics (Table5).

98

Comparative analysis L. infantum WT and PTRl'' ' proteomes during metacyclogenesis.

In the above analysis we listed a number of changes occurring during metacyclogenesis of L.

infantum. In order to identify proteins potentially correlated with pterin metabolism and putatively

involved in the metacyclogenesis process, we next carried out a subtractive comparative analysis of

the metacyclogenesis process by looking at differences between comparisons 1 and 2 (Figure 2,

comparison 3). A total of 51 spots that were differentially expressed between conditions 1 and 2

were sent for MS/MS identification and 42 spots fitted into the Scaffold software parameters (see

Material and Methods) which yielded 143 proteins identifications (Supplementary Table 1). Several

of the protein fragments identified were corresponding to the same proteins identified in our above

comparison of metacyclogenesis and felt within the category of energy metabolism, antioxidants

metabolism, stress, protein degradation and finally motility.

For proteins involved in energy metabolism, fragments of the acetyl-CoA synthetase

(LinJ23.0880), the L-ribulokinase (LinJ36_V3.0060) and the ribokinase (LinJ27_V3.0430) were

either increased or unique in the metacyclic stage of the PTRl null-mutant while a fragment of the

malate dehydrogenase (LinJ34_V3.01500) was unique in the metacyclics of wild-type cells (Table

1). . A putative tryparedoxin isoform (LinJ29_V3.1240) was unique to the procyclic stage while the

tryparedoxin peroxidase (LinJ15V3_1100) and a fragment of the trypanothione synthetase

(LinJ27_V3.1770) were upregulated in the metacyclic stage of the wild-type cell in comparison to

the PTRl null mutant (Table 2). We found the presence of several chaperonin fragments, the vast

majority in either the procyclics or metacyclics of the PTRl null-mutant (Table 3). The fragments of

several protéasome subunits (e.g. LinJ06_V3.0140, LinJ13_V3.0990, LinJ21_V3.0840,

LinJ27_V3.0190, etc..) and of peptidases/proteases (e.g. LinJ03_V3.0520, LinJ05_V3.0960,

LinJ13_V3.0090, etc..) were observed in comparison 3 (Fig. 1) but differences were equally found

in wild-type and PTRl null mutants with no clear trends (Table 4). A much higher number of unique

99

fragements corresponding to the beta or alpha tubulins (LinJ08_V3.1280 and LinJ13_V3.0330) was

observed in the PTRl null mutant in contrast to wild-type cells (Table 5).

Comparative analysis of the proteome of L. infantum WT and PTRï' ' in the metacyclic

stage. Finally, we contrasted the proteome of the metacyclics of wild-type cells and the PTRl null-

mutants (Fig. 1, comparison 4) that may highlight proteins correlated with pterin metabolism and

expressed in metacyclics. A total of 49 spots, 26 and 23 either present in the WT or the PTRl null-

mutant metacyclic stage respectively, were excised and sent for MS/MS identification. This led to

the identification of 208 proteins, 48 in the wild-type and 160 in the PTRl' ' cells (Supplementary

Table 1). Interestingly, the ptéridine reductase PTRl (LinJ23_V3.0310) was only present in the

metacyclic stage of the WT but not in the PTRl null-mutant showing the resolution power of our

proteomic approach (Table 2). Proteins involved in energy metabolism were among the most

abundant in our identifications. In comparison 4, 9 protein fragments were found to be upregulated

in the PTRl null-mutant metacyclics and 16 upregulated or unique in the WT metacyclics (Table 1).

A similar number of proteins or proteins fragments were either increased in the PTRl null-mutant or

WT metacyclics for proteins involved in antioxidants response (Table 2), to stress (Table 3), to

protein degradation (Table 4) or to proteins related to motility (Table 5)..

Other groups of proteins as well as many hypothetical proteins were identified during the

différents comparisons and are presented in the Supplementary Tables 2, 3 and 4

100

Discussion

Metacyclogenesis in Leishmania involves the differentiation of replicating non-infective procyclic

promastigotes into non-replicating but highly infective metacyclic forms. This differentiation

process occurring within the alimentary tract of sandfly vectors pre-adapts the parasites for infection

of the mammalian host. Several morphological and biochemical changes are operating during

metacyclogenesis, some have been already described previously, mostly at the transcriptomic level

[36-40] with some studies at the proteomic level [27, 28]. We have used isoelectric focusing-free-

flow electrophoresis (IEF-FFE) to enrich for a subset of soluble proteins from procyclic and

metacyclic parasites of both a wild-type Leishmania infantum and a PTRl null mutant. As already

reported from our group [29] and others [41, 42], IEF-FFE pre-fractionation combined with a series

of overlapping IPG strips is a powerful way to increase the proteome coverage visualised on 2D

gels, as exemplified in Supplementary Figure 1.

To ensure an adequate coverage of differentially expressed proteins potentially involved in

metacyclogenesis and/or potentially involved in the pterins metabolism, we selected 138 protein

spots (Supplementary Table 1) statistically shown to be differentially expressed and covering the 4

studied comparisons (Fig. 1). They were processed for MS analysis. Out of these 138 spots, 467

protein identifications were obtained (Supplementary Table 1), and were classified in metabolic

pathways according to the curated LeishCyc metabolic database ([43];

http://leishcvc.bio21 .unimelb.edu.au/). It is striking to note, that the number of proteins differentially

expressed and identified in metacyclic parasites is higher (e.g. 117 in metacyclic WT + 277 in

metacyclic PTRl KO = 394) than in procyclic parasites (e.g. 35 in procyclic WT + 38 in procyclic

PTRl KO = 73). This might further link pterins and metacyclogenesis since the PTRl KO cells were

shown to have an increased metacyclogenesis (REF). However, no obvious proteins involved in the

pterins metabolism were identified from our global scale analysis in any of the 4 conditions tested

101

(Fig. 1). It will remain to be tested whether some of the hypothetical proteins highlighted

(supplementary Fig. 4) have a link with pterins and metacyclogenesis. Foe example,

LinJ24_V3.2200, LinJ27_V3.1100, Linj28_V3.1210 and LinJ30_V3.3740 were found to be

upregulated or unique in the PTRl null mutant but were not identified in WT cells.

Nonetheless, our proteomic analysis revealed interesting features of metacyclogenesis operating in

L. infantum, either in WT or PTRl"7" cells. Indeed, in both parasite lines at least 5 major metabolic or

cellular processes were extensively modulated (Tables 1-5)., Antioxidants/dctox ill cation metabolic

pathways

Metacyclogenesis accelerates the production of reactive oxygen species (ROS) in Leishmania(REF).

Mitochondria are the major source generating ROS which may in rum damage these organelles. Our

proteomic analysis is suggesting that metacyclic parasites are trying to protect themselves from ROS

mitochondrial damage likely through an active antioxidant mechanism (Fig. 2, Table 2). Indeed, two

superoxide dismutases (LinJ32_V3.1910, LinJ30_V3.2780), the trypanothione redox system

(LinJ05_V3.0350, LinJ15_V3.1100, LinJ23_V3.0050), the trypanothione biosynthesis pathway

(LinJ27_V3.1770), PTRl (LinJ23_V3.0310) that was recently shown to help the parasite in dealing

with oxidative as well as nitrosoactive stresses (Moreira et al, 2009) and one cytochrome cl heme

protein (LinJ07_V3.0210) were upregulated in metacyclics compared to procyclics parasites (Table

2). An increase in the pentose phosphate (PPP) metabolism was also proposed to have a protective

role against oxidative stress (Maugeri et al, 2003) and two enzymes belonging to this pathway were

identified, namely the glucose-6phosphate dehydrogenase (LinJ34_V3.0080, Table 2) and the 6-

gluconate dehydrogenase (LinJ35_V3.3390; Table 2). Both enzymes were differentially expressed in

the metacyclic stages of both WT of PTRl KO cells (Comparison 1, 2 and 4). We have also

identified an ascorbate-dependent peroxidase (LinJ34_V3.0070, Table2) that was 1.72 times

102

upregulated in the metacyclic PTRl null mutant (Table 2). Ascorbate peroxidase in Leishmania has

already been shown to be central to the redox defence system of this parasite [45, 46]. An ascorbate

peroxidase null mutant produced a higher percentage of metacyclics compared to both the parental

WT cells and ascorbate peroxidase overexpressors [47]. Our proteomic analysis also revealed a

prostaglandin f2-alpha synthase (LinJ_V31.2210, Table 2), also part of the ascorbate biosynthesis

pathway that was upregulated in metacyclics PTRl KO parasites or unique in metacyclic WT cells,

further demonstrating the development of an effective response to oxidative stress during

metacyclogenesis.

Several energetic metabolic pathways highlighted during metacyclogenesis

Metacyclics in the sand fly are within nutrient-limited environment (REF), so intracellular

remodelling is crucial at this stage of the life cycle to generate energy necessary for its replication

and differentiation. Several enzymes part of important energetic pathways were shown to be

differentially expressed in metacyclic parasites (Table 1). The most striking observations are related

to the gluconeogenesis pathway (Fig. 3) that was strongly activated to increase the glucose-6 P

production and the parallel consumption of these through the pentose phosphate pathway (PPP) and

TCA cycle (Fig. 4). It seems that metacyclic Leishmania favour a high rate of glycolysis to generate

ATP in sufficient amount necessary for their intracellular remodelling and morphological

differentiation. We have depicted in red in Figures 3 and 4 the enzymes that were upregulated in

metacyclic parasites compared to procyclic forms. Most enzymes in these pathways were identified

in our study. Metacyclics are adapted for an exclusively glycolytic metabolism in the mammalian

host. As our proteomic study was performed with in vitro cultures of both procyclic and metacyclic

parasites, the expression patterns observed in figures 3 and 4 (and Table 2) reflect probably an

adaptation to changes in the culture medium in the levels of glucose and amino acids, since old

cultures (e.g. stationary phase where are found metacyclics) are depleted in these nutrients.

103

Protein degradation

During differentiation, Leishmania proceeds to an important protein turnover. A vast repertoire of

proteolytic enzymes (Table 4) is deployed during the transition between procyclic to metacyclic

stages. The genome of Leishmania contains at least 150 peptidases [48] and several of these seem to

be differentially expressed during metacyclogenesis. Two lysosomal cysteine peptidases, CPA and

CPB, have been directly implicated in both autophagy and development in this parasite (REF). Two

cysteine proteinases have been identified in our study, the first one (LinJ27_V3.0510) being unique

in procyclic WT (comparison 1) and the second one termed CPC (LinJ29_V3.0860) being

upregulated in metacyclic PTRl KO (comparison 2) (Table 4).

Interestingly, the oligopeptidase b enzyme (OPB, LinJ09_V3.0820, Table 4) was identified as

unique in metacyclic WT parasites (Comparison 4). A L. major null mutant of OPB [50] showed a

small deficiency in their ability to undergo differentiation to metacyclic promastigotes. Recently

[51], OPB was shown to act as a regulator of the Leishmania enolase which has a classical role in

carbohydrate metabolism.

The protéasome has been linked with Leishmania differentiation and replication [52-54], and several

proteasome-related proteins were observed in our analysis being mostly either unique or upregulated

in the metacyclic stages of both the WT and PTRl KO cells (Table 4). In addition, a polyubiquitin

protein (LinJ09_V3.0950) was identified as unique in metacyclic forms of the PTRl null mutant and

seems absent in the metacyclic WT parasites (comparison 4) (Table 4). Interestingly, the ptéridine

reductase 1 (PTRl) was shown to be degraded in the stationary phase of growth at the time when the

parasites were undergoing metacyclogenesis [55] and degradation of PTRl proceeds through the

ubiquitylation-proteasome system. A decrease in the protein level of PTRl leads to low levels of

tetrahydrobiopterin (H4B) which favours metacyclogenesis [9].

Heat-shock, chaperonins and stress-related proteins

104

We have identified several fragments of heat-shock proteins and chaperonins either differentially

expressed or being unique in the metacyclic stages, mainly in the PTRl null mutant (Table 3). One

member of the chaperonin group of proteins identified in our proteomic study is TCP1 (chaperonin

containing t-complex polypeptide) (Table 3). whose primary substrates appear to be the cytoskeletal

proteins including the tubulins and actins, (REF). Our proteomic analysis have identified the T-

complex protein 1 in Leishmania as differentially expressed in metacyclic parasites compared to

procyclics, with the subunits gamma, beta and eta as well as one other putative TCP1 subunit

(LinJ13_V3.1400) either uniquely expressed in metacyclics or significantly upregulated in this stage

(Table 3-T complexe). The functional significance of this will need to be investigated further but it is

interesting to note that several peptides derived from putative substrates including cytoskeletal

proteins (LinJ26_V3.1950, LinJ31V3_.0450, LinJ36_V3.4780; Table 5) and the tubulins

(LinJ08_V3.1280 and LinJ13_V3.0330; Table 5) were identified in our proteomic analyses. Other

fragments of chaperonins that were upregulated or unique to metacyclics include the co-chaperone

GrpE (LinJ30_V3.0760, Table 3) and the heat shock 70-related protein (mitochondrial precursor,

LinJ30 V3.2470, Table 3). Interestingly, chaperonins (and more recently ubiquitine) are also known

to be involved in autophagy (Chaperone-mediated autophagy, CMA). The primary role of autophagy

is to protect cells under stress conditions, such as starvation, low level of oxygen and oxidative stress

(REF). Autophagy is required for metacyclogenesis in this parasite [48, 57]. Leishmania has at least

6 autophagy-related genes (termed Atg) [58-61]. In mammals, some Atg proteins contain C-terminal

WD40 repeats. Three hypothetical proteins identified in our study being either upregulated or unique

in metacyclics WT and/or PTRl7" (LinJ06_V3.0030, LinJ25_V3.1660 and LinJ28_V3.1210,

Supplementary Table 3) share this motif and their putative role in autophagy/metacyclogenesis could

be investigated. Our data demonstrate that molecular chaperones and heat shock proteins are

105

implicated in the necessary adaptations sustaining the obligate passage from procyclic to metacyclic

promastigote forms in Leishmania.

Motility and morphology-related proteins

Several morphological changes are taking place during metacyclogenesis and the proteome analysis

revealed likely candidates involved in these changes (Table 5). The paraflagellar rod (PFR) of

kinetoplastid parasites are important for flagellar motility since ablation of PFR in Leishmania

prevent movement [64]. Three PFR proteins were pinpointed in our proteomic study, namely

LinJ05_V3.0040 (PAR4), LinJ16_V3.1510 (PFR2C), and LinJ29_V3.1880 (PFR1D) (Table 5).

These 3 PFR proteins were shown to be down regulated in metacyclics PTRl KO cells compared to

metacyclic WT cells (comparison 4).

We have also detected 3 kinesins (Table 5), either upregulated in procyclic forms of the PTRl KO

(LinJ14_V3.1190, in comparison 3) or unique to the metacyclics PTRl null mutant

(LinJ14_V3.1600 and LinJ30_V3.0350, in comparison 2). Kinesins regulates flagellar length via

microtubule binding and depolymerisation activities [65]. Myosin is also a component of the PFR

structure and we have identified a myosin heavy chain kinase A (LinJ36_V3.4780, Table 5) that

seems to be absent in metacyclic WT cells (in comparison 3). Finally, the i/6 autoantigen protein

(LinJ22_V3.1310) identified in comparisons 3 and 4 was shown to be either highly upregulated in

metacyclic PTRl KO or unique in metacyclic WT cells compared to metacyclic PTRl KO parasites.

In T brucei, this protein was shown to be shown to be a microtubule-associated protein and may be

involved in crosslinking microtubules [67].

Others interesting metabolic features in Leishmania metacyclic parasites

In our global scale analysis of the metacyclogenesis process operating in Leishmania, we have not

detected notable metacyclic proteins such as the HASPB (hydrophilic acylated surface protein B)

and SHERP (small hydrophilic ER-associated protein) proteins, [68-72].. The membranous-

106

associated nature may explain why we were unsuccessful in detecting them. We have identified a

sterol 24-c-methyltransferase (SMT, LinJ36_V3.2510) that is unique to metacyclics, both in WT and

PTRl KO cells (Supplementary Table 2-Ergosterol biosynthesis). This enzyme is required for the

biosynthesis of ergosterol, the major membrane sterol in Leishmania. The leishmanolysin (GP63)

metalloprotease (LinJ10_V3.0490; Supplementary Table 2), the most abundant surface protein of

Leishmania promastigotes, was upregulated in metacyclic parasites. GP63 was recently described as

a surface protease able to cleave multiple intracellular host proteins and actively participate in

mitogen-activated protein kinase inactivation during infection [80] but its role in the insect stage is

not well defined [81].

The insect-stage specific protein META-1 that is more expressed in metacyclics parasites [82] was

not detected in our study but a META-domain containing protein (LinJ17_V3.0970; Supplementary

Table 2 -unclassified) that was upregulated in metacyclic PTRl null mutant when compared to

metacyclic WT cells (Comparison 4). A role in cytoprotection against oxidative stress is suspected

for this class of meta-domain containing proteins [83].

Another cytochemical peculiarity of metacyclic promastigote Leishmania includes an extreme

depletion of RNA (REF). Our proteomic analysis revealed an important modulation of several

enzymes related to the RNA metabolism and post-transcriptional gene expression (Supplementary

Table 4). Moreover, most of these changes were detected in the PTRl mutant cells. For example,

two RNA helicases (LinJ21_V3.1820 and LinJ32_V3.0410) were found unique or upregulated in the

metacyclic stage of the PTRl KO parasites (Supplementary Table 4). Another RNA helicase

belonging to the DEAD-box family (LinJ35_V3.0370) was detected as unique in metacyclic WT

cells. The genome of Leishmania encodes 29 RNA helicases [84]. RNA helicases are enzymes

responsible for ATP-dependent unwinding of RNA secondary structures, but they have been also

described as regulatory factors for cellular growth and differentiation [85, 86]. Most RNA helicases

107

belong to the DEAD-box family whose prototype is the eukaryotic eIF-4A translation initiation

factor [87, 88]. As reported in Supplementary Table 4, we have identified many translation initiation

factors (LinJ08V3.0570, LinJ17V3.0090, LinJ17V3.1390, LinJ18V3.0740, LinJ36_V3.0200 and

LinJ36_V3. 4070) including eIF-4a (LinJ01V3.0790), as well as a translation release factor

(LinJ27_V3.1610). These proteins could play a role in metacyclogenesis in Leishmania.

This report represents a detailed proteomic analysis of metacyclogenesis. . Several proteins and

enzymes involved in 5 main metabolic or cellular processes are particularly altered during

metacyclogenesis but none seems to be linked to the levels of reduced pterins. However, numerous

hypothetical proteins have been identified, some being unique or highly upregulated in metacyclic

stages and some correlated to reduced pterins, hence leading to hypotheses than could eventually be

experiementally tested for a better understanding of the roles of pterins in differentiation..

108

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112

Acknowledgements

We would like to thank Sylvie Bourassa and Isabelle Kelly for helpful proteomic discussions and the

people from the Proteomics platform of the Eastern Quebec Genomics Center for the mass

spectrometry analysis. This work was funded by a CIHR grant to M.O. WM is a Strategic Training

Fellows of the Strategic Training Program in Microbial Resistance, a partnership of the CIHR

Institute of Infection and Immunity and the Fonds de Recherche en Santé du Québec. M.O. is a

Burroughs Wellcome Fund Scholar in Molecular Parasitology and holds the Canada Research Chair

in Antimicrobial Resistance.

113

Figure Legends

Fig. 1 Experimental design of proteomes comparisons. Four 2D-Gels were analysed for each

condition described here. 1, WT procyclic to metacyclic promastigotes comparison; 2, PTRl' '

procyclic to metacyclic promastigotes comparison; 3, subtractive analysis of non common spots

between 1 and 2; 4, WT and PTRl' ' metacyclic promastigotes comparison.

Fig. 2. Antioxidants related pathways in Leishmania. Proteins involved in the antioxidants and

related pathways of L. infantum. Proteins indicated in red have been identified as modulated in the

metacyclogenesis. Related pathways are indicated in grey boxes. T(SH)2, trypanothione; TS2,

oxidized trypanothione; TXNo, oxidized tryparedoxin; TXNR, reduced tryparedoxin; TR,

trypanothione reductase; GPX, glutathione-dependent peroxidise, CPX, cytosolic peroxiredoxin;

H2O2, hydrogen peroxide; ONOO", peroxynitrite; N02, nitrite; FeSOD, iron superoxide dismutase;

NO", nitric oxide; 02'", anion superoxide; NADPH, reduced nicotinamide adenine dinucleotide

phosphate; NADP+, oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. G6PDH, Glucose-6-

phosphate dehydrogenase; 6PGDH, 6-phosphogluconate dehydrogenase;

Fig. 3. Gluconeogenesis and related pathways. Proteins involved in gluconeogenesis and related

pathways of L. infantum. Proteins indicated in red have been identified in this proteomic analysis as

modulated in the metacyclogenesis oî Leishmania. Related pathways are indicated in grey boxes.

Fig. 4. Pentose phosphate, TCA cycle and related pathways Proteins involved in the pentose

phosphate, TCA cycle and related pathways of L. infantum. Proteins indicated in red have been

identified as upregulated during metacyclogenesis. Related pathways are indicated in grey boxes.

114

Table 1. Energy metabolism-related proteins identified by MS/MS. Mr, molecular weight; exp,

experimental; pred, predicted; pro, procyclic promastigotes; meta, metacyclic promastigotes; All

statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis Software using Student's two-tailed t

test.

Table 2. Antioxidant-related proteins identified by MS/MS. Mr, molecular weight; exp,

experimental; pred, predicted; pro, procyclic promastigotes; meta, metacyclic promastigotes; All

statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis Software using Student's two-tailed t

test.

Table 3. Heat shock, stress-related proteins and chaperonins identified by MS/MS. Mr,

molecular weight; exp, experimental; pred, predicted; pro, procyclic promastigotes; meta, metacyclic

promastigotes; All statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis Software using

Student's two-tailed t test.

Table 4. Protéasome, protein degradation and ubiquitination-related proteins identified by

MS/MS. Mr, molecular weight; exp, experimental; pred, predicted; pro, procyclic promastigotes;

meta, metacyclic promastigotes; All statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis

Software using Student's two-tailed t test.

Table 5. Flagellum, motility and morphology related-proteins identified by MS/MS. Mr,

molecular weight; exp, experimental; pred, predicted; pro, procyclic promastigotes; meta, metacyclic

promastigotes; All statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis Software using

Student's two-tailed t test.

115

Supplementary Fig. 1. IEF-FFE Enrichment of metacyclic promastigote proteins from WT

and P T R l ' . 2D gels pictures of total cell extracts of L. infantum metacyclic promastigotes WT (A)

and PTRl'fC) compared to IEF-FFE fractionated proteins of L. infantum metacyclic promastigotes

WT (B) and PTRl (D). A number of FFE fractions were pooled and first resolved on IPG strips of

pH 4.5-5.5, 5-6 and 5.5-6.7 before being run on SDS-PAGE in the second dimension. Only gels for

the pH 5-6 conditions are presented for total protein extract and the pooled fraction number 34-40

for FFE. The same extend of enrichment was observed for procyclic promastigote proteins extracted

from either wild-type or PTRl null mutant.

Supplementary Table 1. Global data on proteome analyses. Summary of proteome conditions

analysis including pH ranges, number of spots analyzed, and number of identifications for each

condition. Pro. WT, procyclic promastigotes of WT parasites; Meta. WT, metacyclic promastigotes

of WT parasites; Pro KO, procyclic promastigotes of PTRl' ' parasites; Meta. KO, metacyclic

promastigotes oîPTRl ' ' parasites.

Supplementary Table 2. Functional classes of proteins identified by MS/MS. Mr, molecular

weight; exp, experimental; pred, predicted; pro, procyclic; meta, metacyclic; All statistically

significant (p <0.05) as determined by Progenesis Software using Student's two-tailed t test.

Supplementary Table 3. Hypothetical proteins identified in the different comparisons. Mr,

molecular weight; exp, experimental; pred, predicted; pro, procyclic; meta, metacyclic; All

statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis Software using Student's two-tailed t

test.

116

Supplementary Table 4. Proteins involved in RNA metabolism and post-transcriptional gene

regulation identified by MS/MS. Mr, molecular weight; exp, experimental; pred, predicted; pro,

procyclic; meta, metacyclic; All statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis

Software using Student's two-tailed t test.

117

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Chapitre VII. La tolérance à la mort cellulaire induite par les drogues favorise l'acquisition de résistances multiples chez Leishmania,

Ce chapitre à été accepté avec modifications dans le journal Cell Death and Disease. Une

version similaire au manuscrit soumis est présentée ici.

7.1 Résumé

Le contrôle du parasite Leishmania repose sur l'utilisation d'une poignée de drogues

(dérivés d'antimoine (SblII), amphotéricine B (AMB), pentamidine, miltéfosine (MF) et

paromomycine (PARO)). Bien que les cibles cellulaires exactes ainsi que les modes

d'action de ces drogues demeurent élusives, il est supposé que leurs cibles primaires sont

substantiellement différentes. Néanmoins, il a été montré que plusieurs anti-Leishmania

induisaient l'apoptose chez ce parasite. Nous avons donc étudié les conséquences de ce

type de mort chez des L. infantum sensibles et résistants aux drogues. Chez des parasites

sensibles, SblII, MF et AMB, mais pas PARO, induisaient la mort par apoptose. Cette mort

est associée à une production d'espèces oxygénées réactives (ROS). Les Leishmania

résistants au SblII, MF ou AMB ne produisaient pas de ROS et ne subissaient pas la mort

par apoptose après exposition à la drogue à laquelle ils étaient résistants. De manière plus

surprenante, ils étaient également plus tolérants à la mort induite pas les autres drogues, à

partir du moment où ces drogues induisaient la mort via la production d'oxydants. Cette

tolérance favorisait l'acquisition rapide de multi-résistances. La paromomycine tuait

Leishmania d'une manière non-apoptotique et ne provoquait pas la production de ROS. La

résistance à la paromomycine ne protégeait d'ailleurs pas contre la mort par apoptose

induite par les drogues et ne permettait pas l'acquisition de multi-résistances. Cependant, le

mutant résistant à la paromomycine, mais pas les mutants résistants au SblII, MF et AMB,

est devenu rapidement également résistant au methotrexate (MTX), une drogue modèle qui

ne produit également pas de ROS. Nos résultats établissent donc un modèle dichotomique

151

d'action des drogues anti-Leishmania ainsi qu'un lien entre la manière dont les drogues

tuent, la tolérance à la mort cellulaire, et la facilitation de l'émergence de multi-résistances.

Ces résultats ont des implications potentielles importantes en termes de chimiothérapie.

151

152

7.2 Article

Tolerance to Drug-Induced Cell Death Favours the Acquisition of Multi-Drug

Resistance in Leishmania

Running title: Mode of tailing and drug resistance in Leishmania

Wilfried Moreira, Philippe Leprohon and Marc Ouellette*

Centre de Recherche en Infectiologie du CHUL, Université Laval, 2705 Laurier bid,

Québec, Canada, G1V 4G2.

Corresponding author : Marc Ouellette Ph.D.

Centre de Recherche en Infectiologie

2705 Boul. Laurier

Québec, Qc.

Canada

Gl V 4G2

Tel : 1-418-654-2705

Fax: 1-418-654-2715

E-mail : Marc.Ouellette(S),crchul.ulaval.ca

Abstract 152

153

The control of the protozoan parasite Leishmania relies on few drugs with unknown

cellular targets and unclear mode of action. Several antileishmanials, however, were shown

to induce apoptosis in Leishmania and this death mechanism was further studied in drug-

sensitive and drug-resistant Leishmania infantum. In sensitive parasites, antimonials

(SblII), miltéfosine (MF) and amphotericin B (AMB) but not paromomycin (PARO)

triggered apoptotic cell death associated with reactive oxygen species (ROS). In contrast,

Leishmania mutants resistant to SblII, MF or AMB not only failed to undergo apoptosis

following exposure to their respective drugs, but were also more tolerant towards apoptosis

induced by other antileishmanials provided that these killed via ROS production. Such

tolerance favored the rapid acquisition of multidrug resistance. PARO killed Leishmania in

a non-apoptotic fashion and failed to produce ROS. PARO resistance neither protected

against drug-induced apoptosis nor provided an increased rate of acquisition of resistance

to other antileishmanials. However, the PARO-resistant mutant, but not SblII-, MF- or

AMB-resistant mutants, became rapidly cross-resistant to methotrexate, a model drug also

not producing ROS. Our results therefore link the mode of killing of drugs to tolerance to

cell death and to a facilitated emergence of multidrug resistance. These findings may have

fundamental implications in the field of chemotherapeutic interventions.

153

154

Keywords: Leishmania, apoptosis, multidrug resistance, reactive oxygen species

154

155

Introduction

The bactericidal mode of action of antibiotics has recently been shown to

depend less on their primary target, and more on the induction of common downstream

effector mechanisms leading to cell death. Indeed, the generation of oxidants has been a

unifying step of such common death mechanisms (reviewed in [1]). Similarly, the

induction of apoptosis by several anticancer drugs has been suggested to occur through

the generation of oxidants and a characteristic feature of drug resistant neoplasic cells

seems to be their ability to evade drug-induced apoptosis [2,3]. These studies suggested

a causal link between evolutionary conserved cellular events leading to death and the

mode of action of cytotoxic compounds and highlighted the importance of understanding

the mode of action of drugs in order to understand and prevent the emergence of drug

resistance.

Apoptotic features have also been reported in the eukaryotic parasite Leishmania

following exposure to several drugs [4-8]. Leishmania are unicellular parasites responsible

for a wide range of human diseases ranging from self-healing cutaneous lesions to fatal

visceral infections. Anti-Leishmania therapy relies on the use of a handful number of drugs

including pentavalent antimony (SbV), a prodrug that needs to be reduced to its trivalent

state (SblII) in order to acquire anti-parasitic activity, the polyene antibiotic amphotericin B

(AMB) and the phosphocholine analogue miltéfosine (MF) [9]. A phase 3 clinical trial has

also been successfully completed for the aminoglycoside paromomycin (PARO) [10],

leading to its approval for the treatment of visceral lesihmaniasis in India. Although the

mechanisms responsible for the anti-leishmania activities of any of these compounds have

been clearly established, their primary targets are thought to differ substantially. Indeed, 155

156

evidence suggests that antimony have a rather complex mode of action, acting at the level

of multiple cellular targets [11-18]. The leishmanicidal activity of MF has been associated

with perturbation of the metabolism of alkyl-phospholipids and the biosynthesis of alkyl-

anchored glycolipids and glycoproteins [19,20]. The cytotoxic activity of AMB has been

associated with its high affinity for ergosterol [21], the main sterol in the plasma membrane

of fungi and Leishmania [22]. Finally, PARO, which interferes with protein synthesis by

binding to ribosomes in bacteria, was also shown to affect translation in Leishmania [23] in

addition to alter the composition and fluidity of the plasma membrane of the parasite

[24,25].

Most antileishmanials were shown to induce apoptosis features in Leishmania

which include an increase in intracellular calcium levels, an accumulation of reactive

oxygen species (ROS), a drop of the mitochondrial membrane potential (A\|/m), genomic

DNA degradation, exposure of phosphatidyl serine and induction of caspase-like activity

[7,16,17,26,27]. Interestingly, the antimony resistance phenotype of field isolates was

reported to be accompanied by a decreased propensity to undergo apoptosis following

exposure to either SblII, MF or AMB [7]. Therefore, it is possible that the common

mechanisms involved in cell killing described for bactericidal antibiotics might hold true

for leishmanicidal compounds and that a decrease in sensitivity to one drug could favor

the development of resistance against other drugs.

In this study, we sought to determine the putative apoptotic features induced by SblII,

MF, AMB and PARO in Leishmania infantum drug-sensitive and drug-resistant

parasites and to assess whether an increased tolerance to apoptosis might accompanies

the selection of drug resistance. Our results are suggesting two types of drug-induced

156

157

death in Leishmania and are linking the mode of killing to tolerance to cell death and to

a facilitated emergence of multidrug resistance.

157

158

Results

Drug-induced accumulation of ROS in the Leishmania mitochondria.

As several drugs were shown to induce apoptosis in Leishmania, we first studied the

accumulation of reactive oxygen species (ROS) upon drug exposure in the context of drug

sensitivity and resistance. The L. infantum Sb2000.1, MF200.5, AMB 1000.1 and

PARO 1200.1 cell lines were respectively selected for resistance to SblII, MF, AMB and

PARO in a stepwise manner until they reached at least a ten-fold increased resistance

compared to the parental clonal strain (Table 1). None of the mutants showed marked

cross-resistance, with the exception of the SblII- and PARO-resistant mutants which were

5-6 times hypersensitive to MF (Table 1). The accumulation of ROS was measure using the

dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) dye whose fluorescence intensity is indicative of

the levels of intracellular ROS [28]. L. infantum sensitive parasites subjected to increasing

concentrations of SblII, MF and AMB exhibited a dose-dependent increase in DCFDA

fluorescence signals (Fig. IA), confirming increased ROS production upon exposure to

these antileishmanials. Pentamidine, another anti-Leishmania drug, also induced the

accumulation of ROS in sensitive L. infantum (Fig. SI A) and so was the classical

apoptosis-inducing drug staurosporine [29] (Fig. SIC). In contrast, no ROS production

could be measured by DCFDA fluorescence in the resistant mutants Sb2000.1, MF200.5

and AMB 1000.1 exposed to the drug defining their resistance phenotype (Fig. IA). PARO

behave differently as it failed to induce ROS accumulation irrespective of the PARO

susceptibility status of the parasites (Fig. IA). This was not unique to PARO as we found

158

159

that MTX, a model drug often studied in Leishmania [30,31], also failed to induce ROS in

Leishmania (Fig. S1B).

As the major source of oxidants in eukaryotes is the mitochondria, we used the MitoSox

dye to measure the mitochondrial accumulation of superoxide, which is an indicative

measure of ROS levels in the mitochondria [32]. As expected, SblII, MF and AMB

induced an increase in MitoSox fluorescence levels in sensitive but not resistant

parasites (Fig. 2A). Co-localisation experiments between DCFDA and mitotracker

fluorescence signals further confirmed that the mitochondria were the site of drug-

induced ROS accumulation (Fig. 2B). The accumulation of superoxide within the

mitochondria usually results in a misregulation of cellular iron homeostasis through the

oxidation of iron-sulfer clusters, which translates into the production of highly active

hydroxyl radicals via the Fenton reaction [4,33]. The role of iron in the drug-induced

accumulation of oxidants was confirmed by the reduced levels of ROS produced within

the mitochondria of sensitive L. infantum pretreated with the iron-chelating agent

deferoxamine before being exposed to increasing concentrations of SblII, MF and AMB

(Fig. 2C). The same protective effect against the accumulation of ROS was observed in

L. infantum parasites pretreated with the antioxidant glutathione (Fig. 2C).

Every experiments presented so far were performed with the more experimentally

tractable promastigote insect stage of the parasite. Accordingly, we tested whether a similar

drug-induced ROS accumulation could be observed with the more clinically relevant

intracellular amastigotes. MitoSOX-preloaded promastigotes were used to infect

macrophages and the resulting intracellular sensitive parasites, but not their resistant

159

160

counterparts, accumulated ROS when exposed to SbV (the prodrug that is converted to

SblII), MF or AMB (Fig. 2D).

Tolerance to drug-induced apoptosis in drug-resistant Leishmania.

As the accumulation of oxidants within the mitochondria is one of the hallmarks of

apoptosis [34,35] including in parasites [34,35], we tested whether other apoptotic features

could be observed following exposure to different antileishmanials. We monitored changes

in the mitochondrial membrane potential (ATm) using the tetramethylrhodamine ethyl ester

(TMRE) dye [7], a cationic fluorescent molecule whose accumulation within the

mitochondria is an indicative measure of the Av|/m, and tested for genomic DNA

degradation by gel electrophoresis. A significant drop in the A Fm was observed in

sensitive cells exposed to SblII, MF and AMB, but not with PARO (Fig. 3A). Similarly,

drug-induced DNA laddering occurred in L. infantum wild-type cells treated with SblII,

MF and AMB, but not with PARO (Fig. 3B). Interestingly, neither a decrease in A^m nor a

degradation of genomic DNA could be observed in the drug-resistant mutants exposed to

their selective drugs (Fig. 3A and B). In contrast, the protonophore carbonyl cyanide p-

trifluoromethoxy-phenylhydrazone (CCCP) remained potent at inducing a significant loss

in ATm in these mutants (Fig. 3A), suggesting that the proton gradient was still intact in the

resistant parasites.

Having found that SblII, MF, AMB but not PARO induced several apoptosis

features in drug-sensitive parasites but not in the Sb2000.1, MF200.5 and AMB 1000.1

resistant lines, respectively, we sought to understand whether a non-specific tolerance to

drug-induced-apoptosis occurred in these mutants. Interestingly, the Sb2000.1, MF200.5 or

160

161

AMB 1000.1 resistant mutants not only failed to produce ROS when challenged with the

drug used for their selection, there was also a significant lack of ROS production in these

mutants upon challenge with any of the ROS-inducing drugs (Fig. 4A). Again, the

PARO 1200.1 mutant behave differently as ROS levels comparable to wild-type cells were

observed in this mutant after a challenge with SblII and even higher levels were observed

after a challenged with MF or AMB (Fig. 4A). The drop in ATm following exposure either

to SblII, MF or AMB was also lower in the Sb2000.1, MF200.5 and AMB 1000.1 mutants

than in the sensitive cells or the PARO 1200.1 mutant (Fig. 4B). The modulation in ROS

production and change in A*Pm were further correlated with drug-induced laddering of

genomic DNA. Indeed, no DNA laddering was induced in the Sb2000.1, MF200.5 and

AMB 1000.1 mutants following exposure either to SblII, MF or AMB, while the same

drugs induced oligonucleosomal fragmentation in the PARO1200.1 mutant (Fig. 4C).

Tolerance to drug-induced cell death favors the acquisition of multidrug

resistance.

We showed that the tolerance to drug-induced apoptosis in the Sb2000.1, MF200.5

and AMB 1000.1 lines occurred not only against the drug initially used for the selection of

resistance but also extended to any apoptosis-inducing drugs. We hypothesized that this

phenomenon may facilitate the emergence of multi-resistance against other drugs, provided

that these shared similar killing effector mechanisms. We thus compared the rates of

selection of resistant parasites by plating 5 x IO6 drug-sensitive or drug-resistant parasites

in the presence of MF, AMB or PARO at a concentration inhibiting the growth of L.

infantum wild-type parasites. SblII was omitted as the susceptibility to this drug varied

between mutants (Table 1). The AMB1000.1, MF200.5, PARO1200.1 and MTX1000.3

161

162

mutants yielded from 6.9 x IO4 to 1.3 x IO5 colonies respectively, a plating efficiency of

-10% when plated with their respective drugs (Fig. 5). In contrast, the wild-type cells did

not yield any colony when plated in the presence of MF or PARO and on average 14

colonies were counted on the AMB plates (Fig. 5A). Remarkably, the L. infantum Sb2000.1

and MF200.5 mutants generated significantly more colonies on the AMB plate than the L.

infantum wild-type strain or the PARO 1200.1 mutant (Fig. 5A). Similarly, the AMB 1000.1

mutant yielded significantly more colonies under MF pressure than wild-type parasites or

the PARO 1200.1 mutant (Fig. 5A). The Sb2000.1 mutant behaved unexpectedly however,

as few colonies were observed on MF-containing plates (Fig. 5A). This is probably due to

the fact that Sb2000.1 is 5-fold hypersensitive to MF (Table 1).

In the presence of PARO, the MF200.5 and AMB 1000.1 mutants did not yield

significantly more colonies than wild-type parasites (Fig. 5A). Again, the Sb2000.1

behaved in an unexpected fashion, producing a very high number of colonies on PARO

plates (Fig. 5 A). This observation might be explained in part by the fact that the Sb2000.1

mutant initially exhibited a slight but significant cross-resistance to PARO (Table 1).

Although PARO and MTX did not induce ROS in wild-type parasites (Fig. 1), it is not

clear whether similar killing effector mechanisms are shared by both drugs. Nonetheless, it

is intriguing that the MTX-resistant mutant yielded more colonies than the MF200.5 mutant

or wild-type parasites in the presence of PARO (Fig. 5B) and that the PARO 1200.1 mutant

also yielded a higher number of colonies on MTX-containing plates than wild-type or

MF200.5 cells (Fig. 5B).

162

163

Discussion

Our study has revealed that anti-Leishmania compounds kill by at least two

different mechanisms, with SblII, AMB, MF and most likely pentamidine killing by

apoptosis, and PARO and the model drug MTX acting through another lethal mechanism.

In order to be classified as apoptosis-inducing drugs, compounds were required to fulfill a

number of criteria, including the induction of mitochondrial ROS, a drop in A\|/m and

genomic DNA degradation. Several studies had already reported on the role of redox

pathways in the increased survival of Leishmania in the presence of SblH [18,36,37], with

iron potentiating the antileishmanial activity of SblII [4]. Our results indicate that this is

probably valid for all drugs inducing ROS since experiments under iron-depleted

conditions demonstrated a key role for iron in drug-induced ROS production (Fig. 2C).

The dichotomy in the mode of killing between antileishmanials was further

reinforced by the observation that cells resistant to SblII, MF and AMB were tolerant to

apoptosis not only against the initial selective drug but also against all drugs sharing a

similar mode of killing. This tolerance is likely to arise by alterations in shared death

pathways. Obviously, alterations in these pathways do not lead to high-level cross-

resistance (Table 1) but can contribute to a decreased propensity to undergo apoptosis,

thereby favouring the emergence of more specific resistance mechanisms. For example,

although no specific mutations leading to a high level of AMB resistance are present in

Sb2000.1 or MF200.5 cells (Table 1), an alteration in a death pathway allowing tolerance to

AMB-induced apoptosis may likely be shared by these mutants, (Fig. 4). In contrast, since

PARO kills through a different mechanism, we did not observe tolerance to SblII-, MF-, or

AMB-induced apoptosis in the PARO-resistant mutant (Fig. 4). We are currently searching

163

164

for phenotypic features related to PARO and MTX killing as this would allow to test

whether non-ROS producing drugs constitute a distinct class of unrelated compounds that

also share similar killing mechanisms.

Such tolerance to drug-induced killing accelerated the emergence of cross-

resistance. Indeed, the SblII-, MF- and AMB-resistant mutants, but not the PARO-resistant

mutant, became more easily cross-resistant to the apoptosis-inducing drugs SblII, MF and

AMB. Conversely, the PARO- and MTX resistant mutants acquired cross-resistance to the

non-ROS producing drugs more easily. Two exceptions were noted, both involving the

Sb2000.1 mutant when plated with either MF or PARO. This could possibly be explained

by collateral hypersusceptibility or cross-resistance already present in this mutant (Table 1),

where a mutation leading to resistance or susceptibility may supersede alteration(s) in a

death pathway when cross-resistance is selected. Since SblII interferes with the thiol redox

metabolism [18], it is possible that oxidant-induced mutational events occurred specifically

in the Sb2000.1 mutant and led to increase PARO resistance (Fig 5A). This would be

reminiscent of bactericidal antibiotic-induced mutagenesis in bacteria [38].

The present results suggest that Leishmania parasites resistant to SblII, MF or AMB

in the field could be more prone at acquiring multidrug resistance to these antileishmanials,

while retaining sensitivity to PARO. These conclusions are supported by the observation

that field isolates resistant to SblII were less prone to undergo apoptosis following exposure

to either SblII, MF or AMB [7]. A recent study also suggested the possible cross-resistance

of L. donovani field isolates to SblII, MF and AMB in areas of endemicity [39]. Drug

combination is now an important strategy in our fight against infectious diseases and this

164

165

has now recently been shown to be effective in Leishmania [40]. Our data provide a

rationale for combining drugs with different modes of killing.

In summary, there are at least two effector mechanisms for anti-Leishmania drugs.

Resistance is accompanied by tolerance to drug-induced apoptosis not only against the

selective drug but also against drugs sharing a similar mode of killing. This cross-tolerance

leads to a facilitated emergence of cross-resistance against other drugs that have different

cellular targets but similar mode of killing.

165

166

Materials and Methods

Leishmania strains and culture conditions. Leishmania infantum

(MHOM/MA/67/ITMAP-263) and the drug resistant mutants L. infantum Sb2000.1, L.

infantum MF200.5, L. infantum AMB 1000.1 and L. infantum PARO 1200.1 (respectively

resistant to 2000 pM SblII, 200 pM miltéfosine, ImM amphotericin B and 1680 pM

paromomycin) were grown in SDM-79 medium supplemented with 10% fetal bovine serum

at 25 °C. Drug susceptibilities were obtained as described. Log-phase parasites were pre­

incubated with deferoxamine (500 pM) or glutathione (2 mM) for 24 hours before being

washed and subsequently exposed to drugs for 48 hours. To determine apoptotic features

(ROS, Av|/m and gDNA laddering), log-phase cultures were exposed to toxic drug

concentrations for 48 hours in order to trigger apoptosis.

Measurement of ROS accumulation. Intracellular ROS accumulation was measured

using the DCFDA dye (Invitrogen, Burlington, CANADA) as described [28]. Briefly,

DCF-DA is cell permeant and nonfluorescent. Upon its entry into live cells, the diacetate

groups are cleaved by cellular esterases. Oxidation of the reduced dye occurs in the

presence of ROIs, causing fluorescence. After drug exposure (48 hours), parasites were

centrifuged at 3000rpm, washed, resuspended in 500 pi of Hepes-NaCl (21 mM Hepes, 137

mM NaCl, 5 mM KC1, 0.7 mM Na2HP04.7H20, 6 mM glucose) and incubated for 30

minutes in presence of DCFDA (40 nM). After another centrifugation-wash step, 200 pi of

the promastigote resuspension was analyzed with a fluorometer (Victor Perkin-Elmer) at

485 nm excitation and 535 nm emission wavelengths. Fluorescence was normalized with

proteins concentration measured using the 2D QuantKit (GE Healthcare). A similar

166

167

procedure was used with the MitoSOX dye (Invitrogen) to determine the ROS

accumulation occurring within the mitochondrion. MitoSOX is a live-cell permeant and

rapidly and selectively targets the mitochondria. Once in the mitochondria, the MitoSOX

probe is oxidized by superoxide hence exhibiting a red fluorescence (580nm).

Measurement of mitochondrial membrane potential ( \\\im) and gDNA laddering.

Mitochondrial membrane potential was measured using the cationic lipophilic fluorescent

tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) dye as described [7], Fluorescence was

normalized with proteins concentrations as described above. gDNA was harvested from

untreated and treated parasites using a method previously described [7]. Ten pg of gDNA

was loaded on a 1.3% agarose gel and migrated at 90V for 1 hour.

Mitochondrial localization of drug-induced ROS using fluorescence microscopy. After

drug exposure (48 hours), parasites were centrifuged at 3000rpm, washed, resuspended in

500 pi of Hepes-NaCl and co-incubated for 30 minutes in presence of both DCFDA (40

nM) and Mitotracker (40 nM). Parasite were subsequently centrifuged at 3000rpm, washed,

resuspended in 500 pi of Hepes-NaCl and 20 pi was layered on poly-L-lysine coated

microscope slides under a cover slips. Slides were analysed using a fluorescence

microscope (Nikon eclipse TE300 fluorescence microscope) using typical green and red

filters. Images were captured using Image Pro Plus 5.0 software. At least 20 microscopic

fields were observed for each sample.

167

168

Cross-resistance selection on drug-containing SDM-Agar plates. Equal number (5 x 106

) of wild-type or drug-resistant parasites were centrifuged at 3500 rpm, washed 2 times in

Hepes-NaCl, resuspended in 50 pi Hepes-NaCl and subsequently plated on SDM-Agar

plates containing either 0.24 pM of AMB, 80 pM of MF or 480 pM of PARO. These

concentrations, which corresponded to 6 times the EC50 of the wild-type strain, were the

lowest allowing minimal growth of wild-type parasites. Colonies were counted after 14

days. Plating was repeated at least three independent times.

168

169

Conflict of interest

The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgments

We thank Drs. Danielle Légaré and Richard Poulin for critical reading of the manuscript.

This work was funded in part by a CIHR group grant and operating grants to MO. WM is a

Strategic Training Fellow of the Strategic Training Program in Microbial Resistance, a

partnership of the CIHR Institute of Infection and Immunity and the Fonds de la Recherche

en Santé du Québec. MO holds the Canada Research Chair in Antimicrobial Resistance.

169

170

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172

173

Titles and legends to figures

Fig. 1. Drug-induced reactive oxygen species in L. infantum wild-type and drug

resistant mutants. Drug-induced ROS accumulation in L. infantum cells. L. infantum WT

or L. infantum Sb.2000.1, MF200.5, AMB 1000.1 and PARO 1200.1 log-phase cultures,

selected respectively for resistance to SblII, MF, AMB and PARO, were exposed to

increasing concentrations of drugs for 48 h. Aliquots (500 pi) were washed and incubated

in the presence of DCFDA for 30 min. Fluorescence was measured at 530 nm and

normalised according to protein concentrations.

Fig 2. Drug-induced ROS accumulation in L. infantum mitochondria. A. Log-phase

cultures of L. infantum WT or L. infantum Sb.2000.1, MF200.5 and AMB 1000.1 drug-

resistant mutants were pre-loaded with MitoSOX for 2 h, washed and exposed to two

concentrations of SblII, MF or AMB for 48 h. Aliquots (500 pi) were taken, washed and

the fluorescence was measured at 580 nm. B. ROS accumulation in Leishmania cells was

visualised with the fluorescent dye DCFDA and the mitochondria-specific dye Mitotracker.

Log-phase cultures were exposed to drugs for 48 h, washed and incubated with DCFDA

and Mitotracker for 30 min each. Fluorescence microscopy showed co-localisation of the

oxidant-dependent DCFDA and the mitochondria-specific Mitotracker in drug-treated cells,

i, brightfield; ii, DCFDA fluorescence; iii, Mitotracker fluorescence, iv, merge. C.

Protection against drug-induced mitochondrial ROS accumulation. Log-phase cultures of

WT and drug-resistant mutants were pre-loaded with MitoSOX for 2 h, washed,

preincubated with Hepes-NaCl (bars a), 500 pM of deferoxamine (bars b), or with 2 mM

glutathione (GSH) (bars c) for 24 h, washed and exposed to two concentrations of SblII,

MF or AMB for 48 h. Aliquots (500 pi) were taken, washed and the fluorescence was

173

174

measured at 580 nm. D. Drug-induced ROS accumulation within intramacrophagic

Leishmania infantum. L. infantum WT (black bars) Sb2000.1 (white bars, left panel),

MF200.5 (white bars, central panel), AMB 1000.1 (white bars, right panel) promastigotes

containing a luciferase expression vector were pre-loaded with MitoSOX and subsequently

used to infect J774 macrophages. The drug-induced ROS accumulation in intracellular

parasites was measured 48 h post infection and fluorescence (RFU) was normalised to

luciferase activity level (RLU). Results are the average of at least 3 independents

experiments. *,/?<0,05 ;**,/K0,01.

Fig. 3. Drug-induced apoptosis in Leishmania. Drug-induced loss of mitochondrial

membrane potential (A^m) (A) and gDNA laddering (B) in sensitive and resistant

Leishmania cells. Log-phase cultures were exposed to drugs (SblII, 400 pM; MF, 25 pM;

AMB, 0.2 pM; and PARO, 280 pM) or to saline buffer (control) for 48 h. A. For measuring

A^m, a 500-pl aliquot was washed, incubated with TMRE for 30 min, washed and the

fluorescence was measured (545 nm). Fluorescence was normalised to protein

concentrations. B. Genomic DNA degradation was investigated by analysing the isolated

gDNA on 1.3% agarose gels. Results represent the average of at least 3 independent

experiments and are expressed as percentage of the control. *, /K0,05 ; **, /K0,01. MW:

1KB Plus Ladder (Invitrogen).

Fig. 4. Cross-tolerance to drug-induced apoptosis in Leishmania drug-resistant

mutants. The accumulation of ROS (A), loss of ATm (B) and gDNA degradation (C)

were measured in Leishmania WT and resistant mutants (Sb2000.1, MF200.5,

AMB1000.1, PARO1200.1). Log-phase cultures were left untreated (controls, bars a) or

exposed to 400 pM SblII (bars b), 25 pM MF (bars c), 0.2 pM AMB (bars d) or 280 pM

174

175

PARO (bars e) for 48 h. Aliquots were washed and incubated in the presence of DCFDA

(ROS) or TMRE (A^m) for 30 min. Fluorescence was measured at 530 nm (DCFDA) or

545 nm (TMRE) and normalised to protein concentrations. Results are the average of three

independent experiments and are expressed as percentage of controls (A and B). *, p<0,0l

; **, statistically different from * with/?<0,01. Genomic DNA was analysed on 1.3%

agarose gels (C). MW: 1KB Plus Ladder (Invitrogen).

Fig. 5. Accelerated selection of multidrug-resistant Leishmania cells. Wild-type

parasites or drug-resistant mutants (5 x IO6 cells) were plated on drug-containing SDM-

agar plates and colonies were counted after 14 d. A. Wild-type (WT) cells and mutant cell

lines Sb2000.1, MF200.5, AMB1000.1 and PARO1200.1 were plated on AMB-, MF- and

PARO-containing plates. B. Wild-type cells and mutant cell lines MF200.5, PARO1200.1

and MTX1000.3 were plated on PARO- and MTX-containing plates. Results are the

average of 3 independents experiments. 1, WT;

2, Sb2000.1; 3, MF200.5; 4, AMB1000.1; 5, PARO1200.1; 6, MTX1000.1.

*,p<0,05 ;**,p<0,0l.

175

176

3000 9000

100 200 400 800 1600 Sb III [MM]

0.1 0.2 0.4 0.8 Amphotericin B [pM]

1.6

7000

o £ 3500-| 3 u-0u

5 10 20 40 Miltéfosine [pM]

6000-1

O £ 3000 3 E

Paromomycin [pM]

350 000

o £ 1 7 5 000 LL.

1000-

1.5 3 6 9 Pentamidine [pM]

50 100 250 500 1000 Methotrexate [pM]

Fig.l

176

177

X 300 O

200

'00

■ A T OSD2000.1

ii 400 300

SblII |pM]

25 SO Miltéfosine [uM]

0 2 0.4 Amphotericin B [pM]

B WT + Hepes­NaCl WT ♦ SblII 400 pM WT + Miltéfosine 25 |iM WT ♦ Amphotericin B 0.2 pM

i h k . b c 1 . S c a b c ■

400 600

SblII [pM]

400 800

S b V f j j M ]

225

150

Lk^ v a b c I J b c a b .

25 50

Miltéfosine [pM]

S 350­

■ WT QMF2O0 5

iv tt 25

Miltéfosine [pM|

Amphotericin B [pM]

O

2

Fig.2

177

178

140­.

CO zn O

ç 'o '*. OJ

o ­C Q. E <

ç o > s E o E o u CD

D.

en OJ CL OJ

I

O CD

</> OJ C L OJ

I

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CD

U Z o o Z CD o cn

OJ c ÛJ

u U) OJ

— CL o n ­> OJ sz ai

I CL E <

X

o > s E o E 2 CD

D.

WT Sb2000.1 MF200.5 AMB1000.1 PARO1200.1

B WT Sb2000.1 MF200.5 AMB1000.1 PARO1200.1 m c c

z OJ c en

o ' l — 0) o

.JZ

o >s E o en

OJ CL

■2

o ' l — 0) o

.JZ F en OJ CL — CD CL

E <

o MW CD

X I CL E < CD

C L

O o co co Z Z cn U) OJ CD Q . — CL CD ­Q CD X co X

OJ ç en

a (D

CQ c:

C) o C) co i _ co Z CD Z 03 CD Cu

O SZ CL

en CD CL

CD E CD X < X

o > s E o E o S. MW

I l • " * ■ • ■»)■« —• ■ ■

Fig. 3

178

179

B 2400 2200 2000 1800 1600

en O 1400 LX — 1000 ? S 800

o s? B00 3 li­er 400

200

111 liu liiii lim a b c d e i b e d l a b e d e a b c d e a b c d e

150-1

E

a. loo ê c o

50

il! Ikt a b e d e a b e d e a b c d e a b e d e a b c d

MF2005 AMB1000.1 PARO1200 1 MF200.5 AMB10001 PARO1200.1

WT Sb2000.1 MF200.5 AMB1000.1 PAROI 200.1

Fig. 4/

179

180

o 'c o o O

CD X) E

i

A 120 000-,

100 000-

80 000-

60 000 -

40 000-

20 000 -

75

50

25 H

0

1,1x10s

I

14 JL

* * 46 47 T . T

o 1 2 3 4 5

Amphotericin B [0,24pM]

6,9x104

28 X

o 1 2 3 4 5 Miltéfosine [80pM]

2,7x10*

1 2 3 4 5 Paromomycin [480pM]

B

eu O O

o

E

150 000 -, 1,3x10s

T 125 0 0 0 - ** 100 0 0 0 - 8.1X104

T 75 000 -50 000 - *

79

T *

90

m *

79

T *

90

m 100 -

* 79

T *

90

m 50 -

* 90

m 10

0 -2. o r-1-! ° 1 3 5 6 Paromomycin [480pM]

1 3 5 MTX [800pM]

Fig. 5

180

181

n- a»»B_

50 100 250 500 1000

[MTX] « m

Hepes- [Sta*ffodrxxine| NaO 25|jM

Fig. SI

181

182

Chapitre VIII. Discussion générale

Les mécanismes de résistance d'un pathogène comme Leishmania, que ce soit les

mécanismes de résistance aux drogues ou plus généralement les mécanismes de résistance

aux stress que le parasite rencontre au cours de son cycle de vie, constituent un domaine

d'étude particulièrement intéressant et important. Il conduit à la mise en évidence des

formidables capacités d'adaptation de cet organisme, fruit de sa coévolution avec l'insecte

vecteur et l'hôte mammifère. Un processus de differentiation comme la métacyclogénèse

correspond également, d'une certaine manière, à une adaptation évolutive en vue de

préparer le parasite au changement d'environnement (passage de la mouche des sables à

l'hôte mammifère) et pour garantir le succès de l'infection des cellules hôtes dont dépend

l'achèvement de son cycle de vie. L'étude de tels mécanismes de résistance et de

differentiation devrait donc conduire à une meilleure compréhension de la biologie du

Leishmania, dans l'objectif évident d'identifier de nouveaux moyens pour combattre ce

fléau. À défaut de permettre l'identification directe de nouvelles cibles thérapeutiques, ces

études pourraient néanmoins conduire à la mise en place de nouvelles stratégies de lutte.

Les objectifs de cette thèse étaient multiples et j 'ai volontairement divisé la discussion de

cette thèse en trois parties distinctes, correspondant au trois objectifs généraux présentés

précédemment.

8.1 Leishmania et les stress oxydatifs : un nouveau rôle dans la résistance au stress oxydatif pour PTRl et les ptérines réduites

Le rôle de PTRl et des ptérines réduites est demeuré relativement élusif depuis les

premières caractérisations de l'enzyme et la mise en évidence de son rôle dans la résistance

au MTX. La majeure partie de nos connaissances sur le métabolisme des folates et des

ptérines découlait d'ailleurs des études conduites avec cet anti-métabolite. L'implication de

PTRl dans la résistance au MTX, de part sa capacité à assurer la réduction des folates en

lieu et place de la DHFR (cible du MTX), avait dans un premier temps permis d'envisager 182

183

l'établissement de PTRl comme cible thérapeutique. Le rôle joué par PTRl et les ptérines

réduites dans la métacyclogénèse du parasite renforçait d'ailleurs cette approche.

Néanmoins, la mise en évidence des mécanismes d'amplifications géniques associés aux

phénotypes de résistance au MTX a rapidement rendu caduque cette voie de recherche.

Cependant, le métabolisme des ptérines et le rôle des ptérines réduites est demeuré

méconnu. Les ptérines sont connues pour être des facteurs de croissance importants du

Leishmania [219, 220] bien que leur rôle cellulaire exact n'ait pas encore été établi. Les

ptérines réduites, et notamment la tétrahydrobioptérine, est un cofacteur d'un certain

nombre d'enzymes incluant l'iNOS [222, 225], cependant ces enzymes n'ont encore jamais

été caractérisées chez Leishmania. L'un des rôles putatifs des ptérines fut établit avec la

corrélation entre le niveau de ptérines réduites et la métacyclogénèse du parasite [227] chez

L. major. Nous avons également confirmé ce phénotype chez L. infantum, en montrant

qu'un plus grand nombre de parasites métacycliques étaient générés en phase stationnaire

de culture. Ceci nous a permis de travailler avec des parasites métacycliques purifiés et

d'établir que le niveau de survie intracellulaire dans un modèle macrophagique murin ou

humain était moindre chez les souches PTRl''. La corrélation entre le niveau de ptérines

réduites et la métacyclogénèse (donc le nombre de parasites infectieux) était donc confortée

par nos résultats. Nous avons aussi clairement établit la diminution de la survie

intracellulaire des parasites n'exprimant plus PTRl, particulièrement lorsque les

macrophages étaient activés pour la production d'espèces oxygénées et nitrogénées

réactives. Il avait été établit chez d'autres organismes que les ptérines réduites possédaient

un potentiel antioxydant important [225]. Nous avons donc émis l'hypothèse que les

ptérines réduites pouvaient jouer un rôle dans la résistance aux stress oxydatifs et

nitrosatifs. Nos expériences en présence d'agent comme l'H2C>2 ou un donneur de NO ont

mis en évidence une accumulation plus importante d'oxydants intracellulaires dans les

souches PTRl'', suggérant un rôle de PTRl et des ptérines réduites dans la résistance à ces

stress. La complémentation métabolique à partir de ptérines réduites exogènes a clairement

mise en évidence les propriétés de « scavengers » d'oxydants des ptérines réduites. La

confirmation de notre hypothèse établissait donc les ptérines réduites comme un nouveau

moyen de défense contre les stress oxydatifs et nitrosatifs que le parasite rencontre au cours

de son cycle de vie et attribuait un nouveau rôle physiologique à ces molécules. Par 183

184

ailleurs, ce rôle semblait d'autant plus important que la disponibilité en ptérines réduites

semble affecter le niveau de survie intracellulaire dans un modèle d'infection de

macrophages, tant murins qu'humains. Leishmania amplifie souvent des portions

spécifiques de son génome en réponse à des stress environnementaux comme l'exposition

aux drogues. Un petit nombre de locus ont été caractérisé comme étant amplifiés chez des

souches du terrain issues de patients infectés [136, 286]. Deux de ces locus codent pour le

transporteur de bioptérine (BT1) et pour PTRl [226]. Il a été suggéré que l'amplification de

ces locus correspondait à la nécessité du parasite de s'approvisionner en ptérines. Au regard

de nos résultats, il est possible de proposer que les stress oxydatifs et nitrosatifs constituent

des pressions de sélection favorable à la génération de ces amplifications extra-

chromosomiques. Il est évident que le parasite subit, tout au long de son cycle de vie, des

stress oxydatifs, particulièrement lors de sa rencontre avec le système immunitaire de son

hôte. Leishmania possède un système enzymatique et non-enzymatique antioxydant très

performant et nous avons ajouté à cette liste les ptérines réduites. Si l'approche

thérapeutique ciblant le métabolisme des folates stricto sensu semblait compromise de part

les mécanismes d'amplifications géniques qui sont associés aux mécanismes de résistance

au MTX, il n'en demeure pas moins que PTRl constitue une enzyme importante et une

cible thérapeutique potentielle. Plusieurs études récentes soulignent d'ailleurs l'intérêt

thérapeutique de PTRl et ont conduit à 1'elucidation de la structure et à l'élaboration

d'inhibiteurs de cette enzyme [283, 366-370]. Il est intéressant de noter que PTRl est

essentielle chez Trypanosoma brucei. La compréhension des rôles physiologiques qu'elle

joue en fournissant Leishmania en ptérines réduites est une avenue de recherche

prometteuse. Par ailleurs, le lien encore inexpliqué entre le niveau de ptérines réduites et le

nombre de parasites métacycliques, que nous avons confirmé également pour l'espèce L.

infantum, souligne l'importance de la compréhension de ce métabolisme. La disponibilité

de souches PTRl' ' constitue d'ailleurs un outil d'étude privilégié pour la compréhension de

ce phénomène.

184

185

8.2 Rôle des ptérines dans la métacyclogénèse du parasite

Le lien entre les ptérines réduites et la métacyclogénèse (mentionné précédemment) à été

clairement établit, bien que le mécanisme sous-jacent demeure inexpliqué. L'approche que

nous avons favorisée, à savoir l'étude des changements dans le protéome entre une souche

PTRl' ' et une souche sauvage au cours de ce processus de differentiation, avait pour

objectif de mettre en évidence le rôle joué par ce métabolisme, et particulièrement par

PTRl, dans la métacyclogénèse. Les études protéomiques de la métacyclogénèse du

Leishmania sont relativement peu nombreuses. En raison du mode d'expression génique

particulier de ce parasite [371], ce type d'étude a l'avantage de permettre l'identification

des protéines différentiellement exprimées dans différentes conditions, ce qui est

vraisemblablement la meilleure manière de mettre en évidence la régulation des acteurs

moléculaires impliqués dans ce processus. En effet, en l'absence de régulation

transcriptionnelle, la régulation de l'expression chez Leishmania se fait presque

exclusivement au niveau post-transcriptionnel [372]. Notre approche protéomique

présentait également une particularité technique importante. Les extraits de protéines issus

de parasites métacycliques purifiés ont tous été enrichis par FFE (Free Flow

Electrophoresis). Cette méthode unique permet la concentration des protéines en fractions

dépendamment de leur point isoélectrique dans un système liquide. Ces fractions peuvent

ensuite être rassemblées en « groupes de pH », permettant leur séparation subséquente

selon la méthode classique de gels en deux-dimensions (première dimension consistant en

la séparation selon le point isoélectrique et seconde dimension consistant en la séparation

selon le poids moléculaire). Les études protéomiques classiques présentent généralement

une limite importante qui est la résolution, c'est-à-dire le nombre de protéines identifiables

en gels de 2 dimensions est relativement faible. Les protéines identifiées comme étant

différentiellement exprimées correspondent alors aux protéines les plus abondantes.

L'utilisation d'une approche incluant une étape de FFE permet de contourner ce problème

de faible résolution [304]. Notre étude présentait donc un avantage singulier par rapport à

l'ensemble des autres études protéomiques menées sur la métacyclogénèse du Leishmania.

Un autre aspect absolument essentiel de notre étude réside dans le fait que nous avons

considéré le processus de la métacyclogénèse en tenant compte du caractère « dynamique

185

186

dans le temps ». Ce processus de differentiation à lieu à l'intérieur de la mouche des sables,

et correspond à une l'acquisition de la forme infectieuse du parasite en vue de l'infection

des cellules phagocytaires de l'hôte mammifère suite à la piqûre de l'insecte. Il est admis

que ce processus peut être reproduit en laboratoire au cours de la culture du parasite en

milieu liquide, et qu'il correspond à la transition entre les phases de cultures dites

« logarithmique » et « stationnaire ». Les parasites métacycliques apparaissent au cours de

la phase stationnaire, à raison de 20 % des parasites totaux chez les souches sauvages et de

40 à 50% chez la souche PTRl''. Nous avons donc purifié les parasites métacycliques

provenant de la souche sauvage et de la souche L. infantum PTRl' ' et nous avons comparé

leur protéome à celui de parasites procycliques issus de la phase logarithmique. Ceci a

conduit à un premier niveau d'analyse qui a mis en évidence les protéines

différentiellement exprimées dans la métacyclogénèse d'une souche sauvage et d'une

souche PTRl''. La soustraction subséquente des protéines communément identifiées dans

les deux conditions indépendantes devait nous conduire à la mise en évidence de protéines

dont la différence d'expression serait potentiellement liée à l'inactivation de PTRl. En plus

de cette approche unique qui faisait appel à l'analyse simultanée de 4 conditions

différentes, nous avons également conduit des analyses comparatives des stades

métacycliques seuls entre la souche sauvage et la souche PTRl' ' ainsi que l'analyse

indépendante de la métacyclogénèse de la souche sauvage et de la souche PTRl''. C'était la

première fois que ce type d'analyses protéomiques était mené de cette manière. Notre

approche a permis l'identification d'un nombre très élevé de protéines différentiellement

exprimées. En considérant simplement l'approche soustractive entre la métacyclogénèse de

la souche sauvage et celle de la souche PTRl'', dont l'objectif était la mise en évidence du

rôle des ptérines réduites dans la métacyclogénèse, notre étude a conduit à l'identification

de 143 protéines différentiellement exprimées.

De l'ensemble de ces analyses, il est principalement ressorti un trait majeur lié à

l'inactivation de PTRl. Le nombre de protéines différentiellement exprimées au cours de la

métacyclogénèse d'une souche sauvage (c'est à dire une métacyclogénèse qu'on pourrait

qualifier de « normale »), était beaucoup plus important que chez une souche PTRl' ' (dans

des conditions qu'on pourrait qualifier d'une métacyclogénèse « supérieure »). Ceci corrèle

186

187

avec les observations faites qu'une souche PTRl''présente un niveau de métacyclogénèse

plus important conduisant à un nombre de parasites métacycliques plus élevé. Cette

observation suggère une interprétation importante : PTRl, ou les ptérines réduites, ou les

deux, sont clairement impliqués dans la métacyclogénèse du Leishmania d'une manière

probablement indirecte, en cela qu'elles semblent moduler l'expression de plusieurs

protéines qui ne sont pas nécessairement directement reliées au métabolisme des folates.

D'autre part, nous avons pu observer l'augmentation du niveau d'expression de protéines

impliquées dans des voies métaboliques importantes. Les métabolismes liés à la

detoxification des oxydants, notamment celle du métabolisme du trypanothion, ainsi que les

métabolismes énergétiques de la gluconéogénèse et le cycle de Krebs sont apparus

augmenté au cours du processus de differentiation. Il ressort donc clairement que le parasite

s'adapte, au cours de la métacyclogénèse, à l'environnement hostile qu'il rencontrera une

fois dans son hôte mammifère. Par ailleurs, les protéines liées à la structure du flagelle et à

la mobilité du parasite ont également un niveau d'expression plus important au cours de ce

processus de differentiation, en corrélation avec les observations faites d'une plus grande

mobilité chez les parasites métacycliques. Cette vaste étude, en termes techniques et

analytiques, engage des perspectives évidentes. Les variations d'expression de ces

nombreuses protéines, que l'on a pu regrouper selon des critères ontologiques de fonctions

métaboliques ou structurales, devraient conduire à l'établissement d'un profil de la

métacyclogénèse et à la caractérisation subséquente des candidats les plus intéressants

relativement à leur implication dans le dit processus. Si on considère que le processus de la

métacyclogénèse prépare le parasite à l'environnement de l'hôte mammifère, ces résultats

prennent une dimension particulièrement intéressante. Enfin, le nombre relativement élevé

de protéines hypothétiques souligne l'importance de continuer la caractérisation,

notamment fonctionnelle, d'un tel protéome.

187

188

8.3 Dichotomie du mécanisme d'action des drogues anti-Leishmania : implication pour l'acquisition de la résistance

Il a toujours été implicitement admis que les mécanismes d'action des drogues reposaient

principalement sur la nature de leurs cibles cellulaires. C'est d'ailleurs selon ce principe

que la plupart des drogues (anticancéreuses, antivirales, antibactériennes, antiparasitaires ou

autres) ont été classées. À la question : comment est-ce qu'une drogue tue une cellule ?,

était généralement apporté la réponse suivante : une drogue tue une cellule en altérant la

fonction de sa cible (que ce soit une enzyme, une structure cellulaire, un mécanisme de

réparation, une voie métabolique ou autre). Pourtant, dès la fin des années 80 [128] certains

chercheurs posaient clairement la question suivante : que se passe-t-il en aval de

l'interaction primaire entre la drogue et sa cible ? Se pourrait-il que cette interaction ne soit

que la première étape d'un mécanisme qui, éventuellement, va conduire à la mort de la

cellule via des voies de signalisation qu'il resterait alors à définir ? Les travaux du groupe

de J.J. Collins [129-132, 134] ont révolutionné le concept de mode d'action des drogues en

répondant à cette question. Ils ont en effet établi pour la première fois l'existence d'un tel

mécanisme, en aval de la cible primaire, qui s'est de surcroît avéré commun à des

antibiotiques très différents (pMactames, quinolones et aminoglycosides) et qui conduit à la

mort de la cellule via une voie commune qu'ils ont en partie déterminé. Des antibiotiques

ayant des cibles cellulaires très différentes (les P-lactames ciblent la paroi cellulaire, les

quinolones ciblent les enzymes impliquées dans la topologie de l'ADN et les

aminoglycosides ciblent les ribosomes et la synthèse des protéines) induisent un mécanisme

de mort cellulaire commun, redéfinissant ainsi le concept de mode d'action. Leurs études

mettaient également en évidence les bases moléculaires sous-jacentes à la notion de

d'antibiotiques bactéricides et bactériostatiques. Seuls les antibiotiques bactéricides

partagent l'induction de ce mécanisme de mort cellulaire. Le point de convergence de ce

mécanisme de mort cellulaire commun est l'induction d'oxydants suite au

disfonctionnement de la chaine respiratoire. L'induction d'oxydants est une des

caractéristiques principales de la mort cellulaire programmée par apoptose chez les cellules

eucaryotes. D'autre part, la chaine respiratoire est comprise dans la mitochondrie chez les

eucaryotes, et cette organelle est également le point de convergence des signaux conduisant 188

189

à l'apoptose chez ces cellules. La mort cellulaire programmée a récemment été caractérisée

chez les eucaryotes primitifs auxquels appartiennent les Leishmania [120, 361, 373, 374].

De manière indiscutable, ces organismes subissent ce genre de mort en réponse à une

variété de stress dont l'exposition aux drogues. Nous avons donc formulé l'hypothèse que

plusieurs drogues anti-Leishmania connues pour induire l'apoptose chez ce parasite

pouvaient induire un mécanisme de mort cellulaire commun impliquant, comme chez les

bactéries, l'induction de ROS. Notre hypothèse s'est avérée exacte et les conséquences sur

les modes d'acquisition de la résistance sont inédites. Nous avons en effet montré que

l'antimoine (SblII), la miltéfosine (MF) et l'amphotéricine B (AMB), mais pas la

paromomycine (PARO) ni le methotrexate (MTX), induisaient la mort cellulaire par

apoptose avec les caractéristiques suivantes : induction de ROS au niveau de la

mitochondrie, perte du potentiel mitochondrial et induction de la dégradation l'ADN

génomique. Nous établissions également par le fait même un modèle dichotomique

d'action des drogues anti-Leishmania : d'une part l'antimoine, la miltéfosine et

l'amphotéricine B induisant l'apoptose et d'autre part la paromomycine et le methotrexate

ne l'induisant pas. Ayant à notre disposition des mutants résistants pour chacune de ses

drogues, nous avons pu constater, comme nous nous y attendions, qu'aucun de ces mutants

ne présentaient ces caractéristiques lorsque soumis à la drogue pour laquelle la résistance

avait été sélectionnée. Puisque l'antimoine, la miltéfosine et l'amphotéricine B ont en

commun l'induction de la mort cellulaire par apoptose, nous avons souhaité vérifier quel

serait le comportement d'un mutant résistant qui serait soumis à une autre drogue qui induit

également l'apoptose. De façon intéressante, nous avons pu alors constater que dans ce cas

là, les mutants présentaient un phénotype de tolérance à l'apoptose induite pas les drogues.

Ceci était vrai pour les mutants résistants à l'antimoine, la miltéfosine et à l'amphotéricine

B, mais pas pour le mutant résistant à la paromomycine. Ce dernier mutant se comportait en

effet comme un parasite sauvage, présentant les caractéristiques de la mort cellulaire par

apoptose lorsqu'il était soumis à l'une des trois drogues mentionnées précédemment. Étant

donné que nous avions montré que la paromomycine n'induisait pas l'apoptose, cela nous a

conduit à formuler une seconde hypothèse selon laquelle le type de mort induit par les

drogues anti-Leishmania pouvait avoir une conséquence sur l'acquisition de résistance

secondaire (multi-résistance) chez les mutants résistants dont nous disposions. Afin de 189

190

vérifier l'hypothèse selon laquelle un mécanisme commun de mort cellulaire induite par les

drogues favoriserait l'acquisition de multi-résistance à une drogue partageant le même

mode d'action, nous avons étalé sur milieu gélose des mutants résistants en présence d'une

autre drogue pour laquelle ils n'étaient pas résistants. De plus, et afin de vérifier si

l'acquisition éventuelle d'une résistance secondaire était dépendante du mode d'action de la

drogue, nous avons également utilisé la paromomycine ainsi que le mutant résistant à cette

drogue en tant que contrôle. De manière tout à fait remarquable, nous avons alors mis en

évidence que la fréquence de génération de mutants multi-résistants était plus élevée chez

les mutants déjà résistants à une drogue présentant le même mode d'action. Ainsi, par

exemple, le mutant résistant à la miltéfosine acquérait plus facilement une résistance à

l'antimoine et à l'amphotéricine B, mais pas à la paromomycine. L'incapacité du mutant

résistant à la paromomycine à acquérir une résistance secondaire à l'antimoine, à la

miltéfosine ou à l'amphotéricine B confortait l'existence d'un modèle dichotomique

d'action des drogues ainsi que ses conséquences sur l'acquisition d'une résistance

secondaire. De la même manière, nous avons observé que les mutants résistants à la

paromomycine et au methotrexate pouvaient acquérir une résistance secondaire (au MTX et

à la paromomycine, respectivement), plus facilement que les autres mutants, qui en étaient

d'ailleurs incapables. Ceci suggère également que la paromomycine et le methotrexate

pourraient induire la mort cellulaire selon un mécanisme vraisemblablement similaire qu'il

reste néanmoins à définir.

Cette étude présente un certain nombre de conséquences relatives notamment à l'utilisation

de la chimiothérapie anti-Leishmania et au problème d'émergence de la résistance.

L'existence d'un phénomène de tolérance à la mort cellulaire induite par les drogues qui

facilitent l'acquisition de multi-résistances pose le problème du choix des thérapies

utilisées, et suggère une orientation vers des méthodes de bithérapies qui combineraient, de

manière optimale, des drogues utilisant des modes d'action différents. Ces résultats

suggèrent en effet qu'il serait plus facile pour un parasite résistant à une drogue qui induit

l'apoptose d'acquérir une résistance secondaire à une autre drogue qui induit également

l'apoptose. Par ailleurs, en terme d'élucidation du mode d'action de certaines drogues

comme l'antimoine, dont on ne connait ni les cibles cellulaires ni le mode d'action exactes,

190

191

ces résultats suggèrent d'orienter les recherches vers l'identification des acteurs

moléculaires impliqués dans les voies de signalisations qui conduisent à la mort cellulaire

par apoptose.

Les perspectives découlant de ces observations vont dans le même sens. La détermination

de l'algorithme de l'apoptose permettrait, outre l'identification des molécules effectrices de

ce type de mort, d'établir une liste de candidats potentiels, qui constitueraient de bonnes

cibles thérapeutiques et/ou éventuellement de bons candidats pour des stratégies vaccinales.

L'éventualité de pouvoir un jour «jouer» sur les mécanismes d'induction de la mort

cellulaire programmée ouvre des voies prometteuses. Enfin, la compréhension du

mécanisme effecteur de la paromomycine (vraisemblablement similaire à celle du

methotrexate), constitue un champ d'investigation important avec l'objectif d'affiner le

modèle dichotomique d'action des drogues que nous avons proposées. Il n'est d'ailleurs pas

exclu qu'on arrive un jour à la démonstration qu'il existe des drogues leishmanicides

(comme c'est clairement le cas pour l'antimoine, la miltéfosine et l'amphotéricine B) et des

drogues leishmanostatiques. La recherche de marqueurs biologiques associés aux autres

types de mort comme l'autophagie ou la nécrose pourrait notamment permettre la

caractérisation de la mort induite par ces drogues. Enfin, la détermination de l'effet

potentiellement bactériostatique de la paromomycine et du methotrexate pourrait être mise

en évidence par les méthodes classiquement utilisées pour les antibiotiques.

191

192

Conclusions Partant de l'étude du métabolisme des ptérines et du rôle de PTRl et des ptérines réduites

dans la biologie du parasite au sens large (résistance aux stress oxydatifs et

métacyclogénèse), mes travaux m'ont conduit à proposer, au cours d'un autre projet, un

mécanisme commun d'action des drogues anti-Leishmania et à discuter de son implication

dans l'acquisition de multi-résistances. Le stress oxydatif apparait comme l'élément liant

toute ces parties. Il n'est pourtant qu'un des composants de l'environnement auquel la

métacyclogénèse prépare le parasite. Mes travaux ont néanmoins permis d'établir un certain

nombre de faits nouveaux, contribuant ainsi à la meilleure compréhension du parasite

Leishmania. Les ptérines réduites, composés ne possédant jusqu'ici qu'un rôle indirect dans

la métacyclogénèse du parasite, ont rejoint l'arsenal de défense contre les stress oxydatifs

que rencontre le parasite. La démonstration de leur participation à la survie intracellulaire

du Leishmania lors de l'infection du macrophage illustre l'importance d'une telle fonction.

L'étude protéomique comparative de la métacyclogénèse entre une souche sauvage et une

souche PTRl7" a conduit à l'identification d'un très grand nombre de protéines

différentiellement exprimées au cours de ce processus de differentiation, essentiel à la

biologie du parasite. La mise en évidence de l'augmentation des voies métaboliques liées à

la résistance aux stress oxydants ainsi que l'adaptation métabolique souligne l'importance

de ce processus. Enfin, l'établissement de l'existence d'un mécanisme de mort cellulaire

commun induit par les drogues anti-Leishmania, basé sur l'induction de ROS, et ses

conséquences sur l'acquisition de multi-résistances, pose les bases d'une réflexion sur la

manière dont les drogues tuent le parasite et comment celui-ci acquière la résistance.

192

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