Spectrométrie de masse – IntroductionIntérêts de la Spectrométrie de masse :

• Sensibilité, limite de détection faible ( fento mole dans certaines conditions )

• Variétés des applications : analyses chimiques quantitative et qualitative réaction ions molécule, cinétique des réactions.

• Progrès technologique rapide

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Spectrométrie de masse –

Introduction - Principes

- Un spectromètre comprend :

- Système d’introduction ( GC, LC , sas d’intro direct, … )

- Source d’ionisation

- Analyseur ( un ou plusieurs )

- Détecteur pour compter les ions

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- Détecteur pour compter les ions

- Système de traitement de donnée

Introduction ,GC, LC

Ionisation ,EI, CI

ESI, APCIFAB, …

AnalyseurSQ D,TQD,

EB, TOFDétecteur Logiciel

Spectrométrie de masse –

Introduction - Principes

Principes de la MS :

• 1er étape : Produire des ions

• La quantité de fragments produit dépend de la « force » de l’ionisation

3

Les ions sont ensuite séparés d’après leur masse et leur charge dans le système dispersif

Ils sont ensuite détectés.

Introduction ,GC, LC

Ionisation ,EI, CI

ESI, APCIFAB, …

AnalyseurSQ D,TQD,

EB, TOFDétecteur Logiciel

Spectrométrie de masse –

Analyse de Biomolécules- Electrospray (ESI)

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Spectrométrie de masse - QQQ

- MS : mode « Full scan »

Balayage d ’Ions moléculaires

Introduction ,GC, LC

Ionisation ,EI, CI

ESI, APCIFAB, …

AnalyseurSQ D,TQD,

EB, TOFDétecteur Logiciel

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Balayage d ’Ions moléculaires

Balayage d ’ions fragments

- MS : mode « Product ION »

Ion moléculaire ou pseudoIon moléculaire ou pseudo --moléculairemoléculaire

Ion Ion pseudopseudo--moléculairemoléculaire : :

�� En mode En mode positifpositif : : ajoutajout d’und’un proton sur M : (M+H)proton sur M : (M+H) + + (masse : M+1, charge+1)(masse : M+1, charge+1)

�� En mode En mode négatifnégatif : : perteperte d’und’un proton : (Mproton : (M--H)H) -- (masse : M(masse : M--1, charge 1, charge --1)1)

ElectrosprayElectrospray

1. Massifs isotopiques

• Isotopes : atomes d’un même élément qui contiennent un nombre identique de protons mais un nombre différent de neutrons

• Abondance isotopique = pourcentage des isotopes d’ un élément dans la nature

• Masse moyenne pondérée (MM) = Masse atomique appara issant sur le tableau périodique et qui tient compte des isotopes et de leur abondance

Exemple : nbre de nbre deprotons : nucléons :

nbre nbre de nbre masse abondance abondanceatomique masse neutrons isotopique en % (1) relative (2)

nbre nbre de nbre masse abondance abondanceatomique masse neutrons isotopique en % (1) relative (2)

Chlore-35 17 35 35-17 = 18 34,97 75,8% 100Chlore-37 17 37 37-17 = 20 36,97 24,2% 32,5

Masse moyenne pondérée du chlore = ( 0,758 * 34,97 uma) + (0,242 * 36,97 uma) = 35,454 uma

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(1) = nombre moyen d’isotope cité pour 100 atomes de l’élément(2) = nombre moyen d’isotope cité pour 100 isotopes majoritaires

Principaux isotopes en chimie organique

Elément isotope % Masse isotopique

isotope % Masse isotopique

isotope % Masse isotopique

Masse moyenne

C 12C 100 12.0000 13C 1.1 13.0033 12.011

H 1H 100 1.0078 2H 0.015 2.0140 1.0079

N 14N 100 14.0031 15N 0.37 15.0001 14.0067

O 16O 100 15.9949 17O 0.04 16.9991 18O 0.20 17.9992 15.9994

S 32S 100 31.9721 33S 0.789 32.9715 34S 4.44 33.9679 32.066

F

Cl

19F

35Cl

100

100

18.9984

34.968837Cl 31.98 36.9659 35.453

Br 79Br 100 78.9183 81Br 97.28 80.9163 79.904

Calcul de masses exactes

282

nbre masse masse A isotopique moyenne

Hydrogène-1 1 1.0078 1.0079Hydrogène-2 2 2.0140

Carbone-12 12 12.0000 12.011Carbone-13 13 13.0034

Soit la molécule d’eicosane C 20H42 :

Masse exacte M :(12C20 1H42)

(20 * 12.000)Masse exacte M+1

Masse exacte M+1

Masse moyenne : (20 * 12.011)

+ (42 * 1.0079) = 282,55

(20 * 12.000)+ (42 * 1.0078) = 282,33

avec un 13C : (19 * 12.000)

+ (1 * 13.0034)+ (42 * 1.0078) = 283,33

Masse exacte M+1avec un 2H :

(20 * 12.000)+ (41 * 1.0078)+ (1 * 2.0140) = 283,33

La différence entre masse exacte M et masse moyenne MM augmente avec la taille de la molécule : ∆∆∆∆ entre MM et M = ±±±± 1 Da / 1500 Da

Calcul de l’abondance relative des satellites isotopiques M+1, M+2 pour

des petites molécules

Typed’élément Caractéristiques Exemple Abondance relative du 2ème isotope*

1! Isotope ou F -Q plusieurs isotopes I -

dont un est majoritaire P -(A > 99,9%) H 0,015

Q+1 Isotope M+1 C 1,08 non négligeable N 0,37

* Abondancede l’isotope majoritaire = 100

analyse de spectres de masse 10

O 0,2Q+2 Isotope M+2 S 4,43 non

négligeable Cl 31,98Br 97,28

M+1 ≈≈≈≈ (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N )M

M+2 ≈≈≈≈ (31,98 . Nombre de Cl) + ( 4,43 . Nombre de S ) + ……M

Satellite M+1 :

Satellite M+2 :

100

100

Massifs isotopiques complexes

Exemple : Allure du massif isotopique de molécules contenan t 2 Cl, 3 Cl, 4 Cl

En Conclusion :

Chaque formule brute est associée à un massif isoto pique qui lui est propre

Pour des molécules de masse < 500 Da :

� L’abondance des pics « M+1 » renseigne sur le nombre d’éléments Q+1 :

M+1/M ≈≈≈≈ (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N ) /100

� L’abondance des pics « M+2 » et suivants renseigne su r la présence d’éléments Q+2 (S, Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes :

analyse de spectres de masse 12

Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes :

Spectrométrie de masse –

Analyse de BiomoléculesQ1 Q2 Q3

SourceESI ESI

Détecteur

Spectrométrie de masse - QQQ

- Possibilité de la spectrométrie de masse pour l’an alyse de biomolécules.

- MS², quantification.

Balayage d ’Ions moléculaires

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Balayage d ’Ions moléculaires

Balayage d ’ions fragments

Spectrométrie de masse –

Quantification

La La sensibilité = recherche de la limite de détectio n(LOD) et Quantification (LOQ).

En analyse Qualitative , la LOD est la quantité minimal d’échantillon nécessaire àl’obtention d’un spectre de masse de qualité.

En analyse Quantitative la LOD est la quantité minimal détectable d’une molécule parrapport au bruit de fond.

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LOD = 3 S/N

LOQ = 10 S/N

Plusieurs paramètres conditionnent la LOQ :

- Paramètre de source du spectromètre de masse

- La technique d’ionisation

- les solvants et tampon en ESI

Spectrométrie de masse –

Analyse de Biomolécules

MRM, des limitations …

1. La molécule doit s’ioniser, surtout en ESI2. La molécule doit fragmenter, mais pas trop3. Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu’à 6 (TQD )3. Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu’à 6 (TQD )4. Précision des mesures : 10%5. LOD , LOQ variable en fonction des molécules, des appareil et des modes

d’acquisition.6. Répétabilité des aires : mauvais d’un jour à l’autre

1. lié à l’encrassement2. Effet matrice en ESI ( pas en EI ).

On préfère toujours la solution de l’étalon interne à la courbe de calibration externe

Idéalement, l’étalon interne est la molécule marqué iso topiquement ( Testostérone D3, Carnitine D3.

Spectrométrie de masse –

Quantification

La spectrométrie de masse apporte :La spectrométrie de masse apporte :

- Spécificité

- La sensibilité

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La La spécificité est obtenu par :est obtenu par :

- La préparation de l’échantillon pour séparer la molécule cyble des interférences.

- Le spectromètre de masse en lui même

La La sensibilité est obtenu par :est obtenu par :

- La technologie employée

- Les modes du spectromètre de masse

Spectrométrie de masse –

Quantification La La spécificité est obtenu par :est obtenu par :

- La purification de l’échantillon

- Extraction ( liquide liquide )

- SPE / MIP

- La dérivatisation : augmentation du poids de la molécule d’intêret et ciblage d’ion caractéristique de masse supérieur.

- Le spectromètre de masse.

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- Le spectromètre de masse.

- Augmenter la résolution

- R= 2000 TQD

- R= 20 000 Q-TOF

- - mode SRM ( Single Reaction Monitoring ) .

Spectre “Produit” de l’Atrazine à Ce =5, 19,33,47 eV

Spectre “Produit” de l’Atrazine-D5 à Ce =5, 19,33,47 eV

Transition M.R.M pour l’ATRAZINE et son étalon interne

MRMCompound Name ISTD? Precursor Ion MS1 Res Product Ion MS2 Res Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator Voltage PolarityATRAZINE-D5 True 221.1 Unit 179.1 Unit 200 120 17

7 PositiveATRAZINE-D5 True 221.1 Unit 69.1 Unit 200 120 41

7 PositiveATRAZINE False 216.1 Unit 174.1 Unit 200 110 13

7 PositiveATRAZINE False 216.1 Unit 104 Unit 200 110 29

7 Positive

HPLC : colonne type C18 2.1 x 50 mm, 1.8µm

Debit 500µl/min Temps B%

Solvant A H2O 0.1% FA 0 10

Solvant B Méthanol 3 904 90

4.01 105 10

QQQ.Vcap 3500 VGAS Temp 350 °CDrying gaz 12 L/minNebuliseur 45 psiFragmenteur 120 VESI Positif

Qualitatif

1. Définir les Transitions MRM -> Spectre « Produit »1. Isolation de la molécule sur MS12. Fragmentation sur MS2 ( chambre de collision à l’Azote)3. Définition des fragments ( intérêt et intensité) pour la quanti et la qualification.

2. Définir les paramètres optimaux de sources.

3. Réaliser la Courbe de calibration1. Toujours la même quantité d’étalon interne dans les 200µl2. Faire varier la quantité2. Faire varier la quantité

4. Comparer le rapport de l’aire de l’atrazine / Aire de l’atrazine D5.

Quantitatif

IS-1 ( 1,9mg/L) : Diluer 100µl IS-0 (19mg/L) dans 900µl MEOH

Courbe étalon :

-Préparer les LEVEL : 20,10,5,2,0.5,0.1ng dans 200µl de MeOH- Recalculer la concentration réel après ajout IS.

Mélanger : -180µl solution STD-Lx- 20µ solution IS-1

Echantillon :

- Prélever 250 ml Eau de ville- Ajouter 20 µl IS-1

SPE – C18 :

- Equilibrer : 2x5 ml Acétone , 2x5ml H2O MilliQ- Percolation : 250 ml D’eau +IS- 20µ solution IS-1

-Injecter 20µl en LC-MSMS

- Percolation : 250 ml D’eau +IS- Lavage : 6 ml H2O MilliQ- Séchage 10 min- Elution : 3x3 ml Acétone dans ballon

Evaporation: - Evaporation sous vide

Reprise: - Reprendre par 200 µl de MeOH

LC-MS/MS: - Injecter 20µl en LC-MSMS

Quantitatif

1. Etablir une courbe de calibration avec toujours la même quantité d ’étalon interne.2. Concentré l’échantillon avec la même quantité d’étalon interne que pour la calibration3. Comparer le rapport A Atrazine / A IS pour obtenir la quantité d’étalon interne.

Cpd # Formula RT Mass [M+H]+

DEDIA C3H4N5Cl 145.0155 146.0227

DIA C5H8N5Cl 173.0468 174.0540

DEA C6H10N5Cl 187.0625 188.0697

Quantitatif

DEA C6H10N5Cl 187.0625 188.0697

ATRAZINE C8H14N5Cl 5.01 215.0938 216.1010

ATRAZINE-D5 C8H9D5N5Cl 5.02 220.1252 221.1324