SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE

DS n°5Épreuve de biologie

12 mars 2016Durée : 2 heures

Le sujet comporte 2 parties indépendantes.

Thème 1Le candidat répondra avec concision aux questions posées en relation avec l’étude de la bactérie Listeria et proposer un schéma bilan en fin de thème.

Thème 2Le candidat s’appuiera essentiellement sur une analyse détaillée des documents pour répondre à la question posée en début de thème.

Aucune introduction n’est attendue.Le candidat ne doit pas rédiger de longs développements de connaissances sur le thème, indépendamment de l’exploitation des documents.

Les documents peuvent être découpés et collés sur la copie à condition d’être légendés, commentés et exploités ; des croquis légendés peuvent également être proposés.

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THÈME 1CONTRÔLE DE L’EXPRESSION GÉNÉTIQUE DE LA BACTÉRIE LISTÉRIA

Sources bibliographiquesDavid Ribet : conférence octobre 2015, MNHN, UPAToledo-Arana et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 2009; 459:950-956.Kortmann J, Narberhaus F. Bacterial RNA thermometers : molecular zippers and switches Nat Rev Microbiol. 2012; 10:255.O’Neil, Marquis, Listeria monocytogenes Flagella are used for motilty, not as adhesins, to increase host cell invasion, Infection and Immunity, 2006, 6675-6681Dickneite, Böckmann, Spory, Goebel, Sokolovic, Differential interaction of the transcription factor PrfA and the PrfA-activating factor (Paf) of Listeria monocytogenes with target sequences, Molecular Microbiology (1998) 27, 915-928Johansson et coll., An RNA Thermosensor controls expression of virulence genes in Listeria monocytogenes, Cell, Vol 110, 551-561, 2002

Listeria monocytogenes est une bactérie qui possède plusieurs modes de vie. Elle représente un pathogène intracellulaire facultatif, c’est-à-dire qu’elle peut aussi vivre à l’état libre dans un environnement inerte, aquatique, alimentaire, en tant que saprophyte (se nourrissant des nutriments disponibles) que dans une cellule hôte qu’elle infecte.

1.A. Conditions d’expression des gènes de virulence1.A.1. Profil d’expression des gènes de virulence en fonction de l’environnementUne méthode dérivée des puces à ARN permet de quantifier la transcription (donc le nombre de molécules d’ARNm) de tous les gènes d’une culture de cellules : il s’agit du tiling array.Dans notre étude, le niveau d’expression de référence (1:1) est celui de bactéries Listeria monocytogenes mises en culture à 37°C et prélevées en phase exponentielle. Seuls les gènes impliqués dans la virulence de la bactérie sont décrits dans les résultats suivants.

Figure 1 - Résultat de tilling array : profil d’expression des gènes de virulence de Listeriadans différentes conditions de culture. Fold change = taux multiplicatif de variation

Stat. = phase stationnaire de culture bactérienne à 37°C30°C = phase exponentielle de culture bactérienne à 30°CLow O2 = phase exponentielle de culture bactérienne à 37°C en hypoxieIntestin = extraction des ARNm de bactéries inoculées dans un intestin de souris pendant 48hBlood = extraction des ARNm de bactéries mises en culture dans du sang murin à 37°C

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Question 1 - Reliez les conditions testées aux environnements rencontrés par la bactérie.Question 2 - Analysez le résultat de tilling array afin de montrer l’effet de la température sur la virulence.Question 3 - Analysez les résultats obtenus pour l’intestin et le sang. Quel facteur de l’environnement semble expliquer cette différence ?

1.B.2. Effet de la température sur l’expression de la protéine PrfAExpérience 1Une construction a été réalisée, associant la séquence 5’ de prfA avec le gène de la gfp, codant pour une protéine fluorescente. Cette construction a été insérée dans des bactéries Listeria alors mises en culture à 30 ou 37°C.

Question 4 - Comment appelle-t-on une telle construction ? Quelle est son utilité ?

L’observation microscopique en contraste de phase permet de localiser les bactéries. L’utilisation de lumière à 395 nm (UV) permet de révéler la fluorescence. Les clichés obtenus sont indiqués dans le document 2 ci-dessous.

Document 2 - Images 1-2 : bactéries en culture à 30°C observées au microscope sous 395 nm (1) ou par contraste de phase (2).Images 3-4 : bactéries en culture à 37°C observées au microscope sous 395 nm (3) ou par contraste de phase (4).! ! ! ! ! ! ! ! Barre d’échelle : 10 µm

Question 5 - Décrivez les résultats obtenus et indiquez l’effet de la température sur l’expression de la protéine PrfA.

Expérience 2Des cultures de Listeria ont été réalisées dans des conditions de température entre 20 et 37°C. La quantité d’ARNm et de protéine a été évaluée par des électrophorèses, dont les gels sont présentés dans le document 4.La ligne témoin n’apparaît pas sur les clichés mais valide les résultats quantitatifs.

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! ! ! ! 20°C ! 37°C

Document 3 - Gels d’électrophorèse d’ARNm et de protéine PrfA dans des bactéries cultivées à 20°C, 30°C ou 37°C. ND = non détecté (Johansson et coll., Cell, Vol 110, 551-561, 2002)

Question 6 - Déterminez à quel niveau de l’expression génétique intervient la température. Justifiez votre réponse.

Expérience 3Grâce à des outils de cristallographie, on a pu comparer la structure tridimensionnelle de l’ARNm de prfA en fonction de la température.Le domaine 5’ de l’ARNm possède des séquences palindromes à l’origine de régions double-brin.

Figure 4 - Représentation schématique de la structure de l’extrémité 5’ de l’ARNm de prfA dans deux conditions de température (la séquence Shine-Dalgarno est celle reconnue par le ribosome pour

commencer la traduction de la protéine).

Question 7 - D’une manière générale, quel est l’effet de la température sur la structure secondaire des acides nucléiques ? Justifiez votre réponse.Question 8 - Reliez la structure de l’ARNm à la présence de la protéine PrfA, en fonction de la température. En quoi cette régulation génétique est-elle originale ?

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1.C. Étude de la protéine PfrA

1.C.1. Effet de PrfA sur l’expression des gènes de la virulence

Les bactéries Listeria possèdent différents types de facteurs sigma σ. Une souche dénuée du facteur σB (notée ΔsigB) est testée dans 2 milieux : intestin et sang de souris.Une souche mutée pour le facteur PrfA de la région de virulence, notée ΔprfA, est également testée. Le niveau d’expression de gènes impliqués dans l’infection est alors comparé à la souche sauvage WT.

! !! ! !

Document 5 - profil d’expression dans l’intestin (à gauche) et dans le sang (à droite)pour les 2 souches de Listeria mutées, ΔsigB et ΔprfA. La couleur indique le taux d’expression.

Question 9 - Analysez les résultats obtenus pour l’ensemble des gènes de virulence étudiés ici. Que peut-on en déduire quant au rôle des facteurs σB et PrfA dans l’intestin ? dans le sang ? Reliez votre analyse aux résultats du document 1.

b) Recherche du mode d’action de PrfA dans le sang

Expérience 1Le gène de virulence suivi est le gène hly, impliqué dans l’activité intracellulaire de la bactérie au cours de l’infection. Deux fragments de la séquence en amont de hly sont étudiés :

fragment hly 109 pb :! ! ! ! -40! ! ! ! -105‘ ————————— TTAACATTTGTTAA ———— TATAbox ————— site +1 ————— 3’3‘ ————————— AATTGTAAACAATT ———— TATAbox ————— site +1 ————— 5’

fragment hly 28 pb! 5‘ ————— TTAACATTTGTTAA —— 3’ 3‘ ————— AATTGTAAACAATT —— 5’

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Des extraits protéiques tirés de bactéries Listeria ont été mis à incuber 30 minutes à 37°C dans une solution d’ADN de fragments hly 28 pb. Deux souches de Listeria sont testées : l’une dénuée du gène codant pour la protéine PrfA (souche notée ΔpfrA) et une souche sauvage.Après incubation, la solution d’ADN est mise à migrer dans des conditions non dénaturantes, sur un gel d’agarose. L’ADN est révélé par une simple coloration de l’ADN.

1 2 3 4 5

Document 6 - Gel d’électrophorèse montrant la migration de laséquence d’ADN de 28 pb située en amont du gène de virulence hly. Les puits sont en haut du gel.

piste 1 = ADN incubé avec un extrait protéique de bactéries Listeria ΔpfrA ;piste 2 = ADN incubé avec un extrait protéique de bactéries Listeria ΔpfrA auquel on a ajouté de la protéine PfrA purifiée ;pistes 3 et 5 = ADN incubé avec un extrait protéique de bactéries Listeria sauvages ;piste 4 = ADN incubé avec un extrait protéique de bactéries Listeria sauvages auquel on a jouté un anticorps spécifiquement ciblé contre la protéine PfrA ;

Question 10 - Analysez précisément les pistes 1, 2, 3 et 5 du gel obtenu. Déduisez-en l’activité de PrfA.

Question 11 - Que montre la piste 4 ? Quel est l’intérêt de cet essai ?

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ne pas tenir compte de cette bande

Expérience 2Une expérience de footprinting est réalisée sur le fragment de 109 pb en amont du gène hly, en présence ou non de la protéine PfrA, dans des concentrations croissantes. Le gel obtenu est donné ci-dessous.

Document 7 - Résultat de footprinting obtenu après traitement de fragments d’ADNà l’enzyme DNaseI. La quantité de protéine PfrA est indiquée en haut de chaque

piste et exprimée en ng. La piste G+A est un marqueur de séquence.

Question 12 - Indiquez quel est le principe du footprinting.Question 13 - Interprétez le gel obtenu.Question 14 - Formulez une hypothèse sur le mode d’action de la protéine PrfA. Comment pourriez-vous qualifier cette protéine ?

BILANQuestion 15 - Réalisez un schéma résumant l’origine et l’action de la protéine PrfA.

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THÈME 2UNE ORIGINE POSSIBLE DE CANCÉRISATION : LE GÈNE RAC1

À l’aide des documents suivant, proposez :- un modèle explicatif succinct montrant un lien possible entre le niveau de méthylation de l’ADN

au niveau du gène codant pour le microARN miR-124, activité de Rac1 et cancérisation ;- le principe d’une expérience qui permettrait de tester votre modèle.

Une activité anormalement élevée de la protéine Rac1 est observée dans plusieurs types de cancers. Le petit ARN régulateur miR-124 étant connu pour inhiber la synthèse de la protéine Rac1, le gène codant miR-124 est séquencé chez des patients atteints d’un cancer du pancréas. Aucune modification de séquence n’est identifiée. Le pourcentage de méthylation de l’ADN au niveau de 9 sites de méthylation du gène codant miR-124 est quantifié chez 10 patients atteints d’un cancer du pancréas («Cancer») et chez 10 personnes saines («Non-cancer»).

Document A : Chaque barre correspond à la moyenne des pourcentages de méthylation pour un site de méthylation donné, chez 10 personnes atteintes d’un cancer ou non.Document B : Chaque carré représente la moyenne des pourcentages de méthylation des 9 sites de méthylation, chez une personne atteinte de cancer ou non.

Document C : Le pourcentage de méthylation du gène codant miR-124 a été quantifié dans 64 tumeurs, après leur exérèse (prélèvement chirurgical) chez des patients, hommes et femmes, d’âges différents, et présentant les symptômes associés à des stades variables de la maladie.Ces 64 patients, sous surveillance médicale, sont répartis en 2 groupes de 32 personnes selon le pourcentage de méthylation du gène codant miR-124 quantifié dans les tumeurs. Le taux de survie est comparé dans deux groupes (bleu : groupe dont les tumeurs ont présenté les pourcentages de méthylation les plus faibles ; rouge : groupe dont les tumeurs ont présenté les pourcentages de méthylation les plus élevés).

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