SA244_22-26.pdf

7/21/2019 SA244_22-26.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/sa24422-26pdf 1/5

22 SPECTRA ANALYSE n° 244 • Mai - Juin 2005

TECHNIQUE INSTRUMENTALE

DOSSIER BIOPHOTONIQUE

Olivier Haeberlé, Bruno Colicchio*

*Groupe LabEl - Laboratoire MIPS - Université de Haute-Alsace IUT Mulhouse - 61 rue A. Camus - F-68093 Mulhouse Cedex Tél : 03 89 33 76 60 - Fax : 03 89 33 76 05 – E-Mail : o [email protected]

Techniques d’amélioration dela résolution en microscopie defluorescence : de la production des

photons au traitement des imagesRÉSUMÉLe microscope de fluorescence est devenu un instrument de référence pour la biologie. Sescapacités d’imagerie en trois dimensions sur des spécimens vivants sont en effet uniques.Cependant, comparée à d’autres techniques, la résolution des microscopes confocaux estencore limitée : de l’ordre de 150 nm latéralement, mais surtout pas mieux qu’environ 350 nmlongitudinalement. Ceci limite grandement l’étude des structures fines intracellulaires. Nousprésentons certaines techniques pour améliorer la résolution en microscopie optique en champlointain.

MOTS CLÉSMicroscopie de fluorescence confocale 3D, Résolution

Techniques to improve the resolution in fl uorescence microscopy : fromphoton production to image processingSUMMARYThe fluorescence microscope is the instrument of choice for biology, because of its unique possibilities of acquiringdata in 3-D within a living specimen. However, compared to other techniques, its resolution is still limited to about150 nm laterally, and no better than about 350 nm longitudinally. This limits the study of small intracellulatstuctures. We present some techniques to improve the resolution in far field fluorescence microscopy.

K EYWORDS

3-D confocal fluorescence microscopy, Resolution

I - Introduction :

L’acquisition d’une image multidimensionnelle enmicroscopie optique requiert la maîtrise de nom-breuses techniques, photonique (lasers), optique(microscope), électronique (détection) et infor-matique (traitement des données). Une appro-che système permet cependant d’identifier troisétapes ( figure 1). On peut en effet séparer dans lachaîne d’acquisition d’une image, tout d’abord les

phénomènes physiques de production du signallumineux, le système de mesure et les post-traite-ments numériques permettant de reconstruire lesimages.

II - Processus d’émission photoniqueLa maîtrise du processus d’émission photoniqueconsiste à essayer de provoquer l’émission du

F l u o r e

s c e n

c e

7/21/2019 SA244_22-26.pdf


Technique Instrumentale

23SPECTRA ANALYSE n° 244 • Mai - Juin 2005

Techniques d’amélioration de la résolution en microscopie de fluorescence :de la production des photons au traitement des images

signal de fluorescence de manière contrôlée dansune zone la plus petite possible. On montre en ef-fet que dans un microscope à balayage, la limitede résolution est imposée par le plus petit volumedans lequel on crée le signal et non par le systèmede détection.La première amélioration de la résolution par cette

approche a donné naissance au microscope confo-cal, qui consiste à utiliser le même objectif pour àla fois exciter et observer le spécimen (1). La figu-re 2 décrit le principe des microscopes classique etconfocal. L’utilisation d’un laser permet de n’exciterle spécimen que dans un petit volume autour dupoint focal, contrairement à un microscope classi-que, où le spécimen est éclairé uniformément. Lesphénomènes d’excitation non-linéaire permettentun résultat similaire (2,3). Un « pinhole » devantle détecteur permet de rejeter la lumière venantd’autres points que le point focal. On peut aussimettre à profit le phénomène d’interférence pourréduire la zone d’observation effective. Dans cette

technique, appelée microscopie 4Pi (4), l’échan-tillon est illuminé de manière cohérente à travers 2objectifs et le signal de fluorescence est détecté parun système confocal (Microscopie 4Pi de type A).Le signal de fluorescence peut aussi être détectépar ces deux objectifs et recombiné (Microscopie4Pi de type B). Lorsque excitation et détectionsont effectuées de manière cohérente, on obtientun microscope 4Pi de type C ( figure 3).Pour un objectif d’ouverture numérique 1.4 et àune longueur d’onde de détection de 450 nm, onobtient en théorie une résolution latérale de 200nm et longitudinale de 450 nm pour un microscopeclassique. Pour un microscope confocal, en consi-

dérant une excitation à 400 nm, on obtient une ré-solution latérale de 130 nm et longitudinale de 320nm. Avec les mêmes paramètres et pour un micros-cope 4Pi type C, la résolution longitudinale est 70nm, la résolution latérale restant celle d’un confocal( figure 4, page suivante). La firme Leica proposemaintenant un tel microscope (5).Une autre approche possible utilise les propriétésdes fluorophores. Lorsqu’un colorant est excité, latransition de fluorescence peut avoir lieu sponta-nément si on laisse la molécule relaxer librement,ou être induite par émission stimulée à l’aide d’unrayonnement externe ( figure 5, page suivante). Enmicroscopie STED (Stimulated Emission Deple-

tion) (6), on utilise cet effet pour dépeupler le ni- veau excité, qui ne peut alors plus contribuer aurayonnement de fluorescence spontanée.

Figure 1

Décomposition enblocs du processusd’amélioration des

images en microscopieoptique.

Figure 2

Principes du microscope classique4A) et du microscope confocal (en

épifluorescence) 4B).

Figure 3

Principe de la microscopie de fluorescence 4Pi de type C.

A)

B)

7/21/2019 SA244_22-26.pdf





On excite donc d’abord une petite zone, à l’aided’un faisceau focalisé ( figure 6a). Dans un micros-cope confocal classique, cette zone excitée donnenaissance à un signal de fluorescence spontanée,dont la forme est très similaire au spot d’excitation( figure 6b). Dans un microscope STED, le spotd’excitation est suivi très rapidement par un spotSTED ( figure 6c), qui provoque le phénomène de

fluorescence induite sur les bords du spot d’exci-tation. Il faut donc mettre en forme à l’aide d’unmontage optique le faisceau STED de telle manièrequ’il présente l’aspect d’une « sphère creuse ». Lafluorescence spontanée ne peut alors être émiseque de la partie centrale du spot d’excitation, qui aété excitée, mais non dépeuplée. Il en résulte doncune réponse impulsionelle optique finale bien pluspetite ( figure 6d ).Une résolution de 100 nm en trois dimensions surdes cellules vivantes a été atteinte (7). L’observationde molécules uniques fixées sur substrat avec unerésolution inférieure à 30 nm a aussi été possible(8, 9). En principe, la résolution de cet instrument

n’est limitée que par le rapport signal sur bruit ob-tenu, la résistance des molécules à l’excitation et àla désexcitation STED, et la stabilité des états mo-

léculaires impliqués (10).Pour l’instant, cette technique requiert cependantune instrumentation picoseconde et femtosecondedélicate et chère. Les fluorophores adaptés à cettemicroscopie ne sont pas nombreux. Des résultatsprometteurs ont néanmoins déjà été obtenus enimmunofluorescence (11), et l’ingénierie des mo-

lécules fluorescentes devrait permettre la créationde fluorophores spécifiquement adaptés à cettenouvelle technique (12).

III - Modélisation du microscope

Les modèles de formation d’image permettent decomprendre comment le microscope déforme lesignal émis par le spécimen. Nous avons dévelop-pé une modélisation rigoureuse des microscopesde fluorescence (13-16).En règle générale, les expressions donnant lesréponses impulsionelles optiques (RIO) en illu-

mination et en détection ne sont pas identiques.L’utilisation des expressions rigoureuses en dé-tection est indispensable si l’on désire étudierles phénomènes de polarisation en fluorescenceou si une grande différence existe entre les dif-férents indices de réfraction, par exemple encristallographie (14,16). On peut cependant direque pour les applications biologiques, les RIOd’excitation et de détection sont très proches, cequi justifie l’approximation classique consistantà dire que la RIO du microscope confocal estobtenue en élevant au carré celle du microscopeclassiqueNos modèles permettent de calculer les RIO uti-

lisées pour la déconvolution des données (voirIV-Déconvolution), mais aussi de vérifier lesconditions d’utilisation du microscope, un point

Figure 4

Réponse impulsionnelle optique d’un microscope de fluorescence 4Pi de type C pour un ob jectifd’ouverture numérique 1,4.

Figure 5

Diagramme de Jablonsky et principe du microscope STED.

Figure 6

Réponses impulsionelles optiques entrant en œuvre dans un microscopeconfocal STED. (a) : excitation, (b) : fluorescence normale, (c) : faisceau

STED, (d) : PSF finale.

NOTE

Ce travail aété réalisé enconcertation avecle programmeInterreg III aidé par

la CommunautéEuropéenne etla région Alsace,ProgrammeRhin SupérieurCentre Sud,Rhénaphotonics.

7/21/2019 SA244_22-26.pdf


Technique Instrumentale

25SPECTRA ANALYSE n° 244 • Mai - Juin 2005

Techniques d’amélioration de la résolution en microscopie de fluorescence :de la production des photons au traitement des images

important pour préciser les protocoles d’acquisi-tion (17) et s’appliquent aussi aux nouvelles con-figurations optiques comme le microscope 4Pi

ou le microscope STED. En effet, ces instrumentsnécessitent une parfaite superposition de deuxfaisceaux d’excitation (microscope 4Pi) ou d’unfaisceau d’excitation et d’un faisceau d’émissionstimulée (microscope STED). De ce fait, ils sonttrès sensibles aux aberrations induites par les dif-férents milieux traversés.

IV - DéconvolutionLorsque le meilleur de l’instrument a été obtenu,on peut encore améliorer les données obtenues pardes techniques de déconvolution, utilisées pour si-

multanément améliorer la résolution des images,et les débruiter. Les mesures quantitatives sontalors de bien meilleure qualité. Un problème des

algorithmes de déconvolution courants est qu’ilssupposent la RIO invariante dans l’image. Cettehypothèse est en réalité souvent prise en défaut.Nous avons donc développé une méthode de dé-convolution Monte-Carlo, permettant de tenircompte de cette non-invariance spatiale de la RIO(18). Cette méthode vise à reproduire de manièrenumérique le processus de formation des images,point par point dans le volume de données. A cha-que point de l’objet est ainsi associé une RIO dansl’image finale ( figure 7 ).En déconvolution Monte-Carlo, on considèrel’objet comme un ensemble de point, et l’image

comme un ensemble de RIO. On essaye alors dereconstruire une image ressemblant le plus possi-ble à l’image enregistrée. Ce faisant, on reconstruitsimultanément l’objet donnant naissance à cetteimage. Contrairement aux algorithmes classiques,il est alors possible d’utiliser non pas une RIO,mais une famille de RIO, l’algorithme sélection-nant automatiquement celle qui est adaptée à larégion du spécimen considéré.La figure 8 montre les résultats obtenus en simula-tion pour une pile de billes de 0,5 µm de diamètre(microscope confocal, NA=1.4). La figure 8a pré-sente l’objet de départ. La figure 8b montre l’imagesimulée, tenant compte d’une variation spatiale

de la RIO avec la profondeur. La bille du fond estplus floue que la bille du haut, à cause de l’aberra-tion sphérique induite par la différence d’indices

de réfraction entre le milieu d’immersion (huile)et le spécimen (eau). La figure 8c montre le résul-tat incorrect d’une déconvolution classique à l’aidede l’algorithme Maximum A Posteriori. La figure8d montre le résultat d’une déconvolution Monte-Carlo tenant compte de la variation de la RIO avecla profondeur. Les intensités et les formes sontmaintenant correctement restaurées.On pourrait aussi tenir compte de variations in-duites par le spécimen lui-même (19). Les modèlesde calcul de RIO actuels supposent que le spéci-men est homogène. L’extension de ces modèles àdes spécimens hétérogènes est en cours (20). Une

cartographie des indices dans le spécimen (21)permettra alors une correction numérique desdonnées.

V - Conclusion

L’étude des spécimens biologiques en microscopieoptique nécessite de nouveaux développements visant à améliorer encore la résolution.Trois axes sont activement explorés. La maîtrisedes phénomènes d’émission photonique par in-génierie de la Réponse Impulsionnelle Optiquepermet de réduire le volume d’émission, et donc

d’affiner les plus petits détails détectables. Lacompréhension des mécanismes de formationdes images, en particulier dans les spécimens hé-

Figure 8

Déconvolution tenantcompte de la variationspatiale de la RIO. (a) :

objet original, (b) :convolution variantavec la profondeur,(c) : déconvolution

classique, et (d) :déconvolution Monte-

Carlo.

Figure 7

Modèle de formation d’image Monte-Carlo.

7/21/2019 SA244_22-26.pdf





(1) MINSKY M., Memoir on inventing the confocal microscope, Scan-

ning, 1988, 10, 128-138.

(2) DENK W., STRICKLER J.H. AND WEBB W.W., Two-photon laser scan-ning fluorescence microscopy. Science, 1990, 248, 73-75.

(3) KÖNIG K., Multiphoton microscopy in life sciences, J. Microsc ., 2000,

200, 83-104.

(4) HELL S.W. AND STELZER E.H.K, Fundamental improvement of reso-lution with a 4Pi-confocal fluorescence microscope using two-photonexcitation, Opt. Comm. 93, 1992, 277-282.

(5) STORZ R., GUGEL H. AND RYGIEL R., “Compact and fast 4Pi beamscanning microscope for imaging fixed and live cells”, Focus on Mi-croscopy 2004, April 4-7, 2004, Philadelphia - USA.

(6) HELL S.W. and Wichmann J., Breaking the diffraction resolutionlimit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluores-cence microscopy. Opt. Lett. 1994, 19, 780-782.

(7) KLAR T.A., JAKOBS S., DYBA M., EGNER A., AND HELL S. W., Fluores-cence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimu-lated emission, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 8206-8210.

(8) WESTPHAL V., KASTRUP L. AND HELL S.W., Lateral resolution of28nm (lambda/25) in far-field fluorescence microscopy, 2003, Appl.

Phys. B, 77, 377-380.

(9) HELL S.W., JAKOBS S. AND KASTRUP L., Imaging and writing at thenanoscale with focused visible light through saturable optical transi-tions, Appl. Phys. A, 2003, 77, 859-860.

(10) HELL S.W., Toward fluorescence nano-scopy, Nature Biotech., 2003,21, 1347-1355.

(11) DYBA M., JOKOBS S. AND HELL S.W., Immunofluorescence stimu-lated emission depletion microscopy, Nature Biotech., 2003, 21, 1303-1304.

(12) ZHANG J., CAMPBELL R.E., TING A.Y. AND TSIEN R.Y., Creating newfluorescent probes for cell biology, Nature Rev ., 2002, 3, 906-918.

(13) TÖRÖK P. AND VARGA P., Electromagnetic diffraction of light fo-cused through a stratified medium, Appl. Opt., 1997, 36, 2305-2312.

(14) HAEBERLÉ O., AMMAR M., FURUKAWA H., TENJIMBAYASHI K. and

TÖRÖK P., Point spread function of optical microscopes Imaging trou-gh stratified media, Opt. Exp., 2003, 11, 2964-2969.

(15) HAEBERLÉ O., Focusing of light through a stratified medium: apractical approach for computing microscope point spread functions.Part I: Conventional microscopy, Opt. Comm. 2003, 216, 55-63.

(16) HAEBERLÉ O., Focusing of light through a stratified medium : apractical approach for computing fluorescence microscope pointspread functions. Part II: confocal and multiphoton microscopy, Opt.Comm., 2004, 235, 1-10

(17) HAEBERLÉ O., BICHA F., SIMLER C., DIETERLEN A., XU C., COLICCHIO C., JACQUEY S. AND GRAMMAIN M.P., Identification of acqui-

sition parameters from the point spread function of a fluorescencemicroscope, Opt. Comm., 2001, 196,109-117.

(18) COLICCHIO B., XU C., HAEBERLÉ O., DIETERLEN A. AND JACQUEYS., “Monte-Carlo reconstruction of images from a PSF variant system”,Focus on Microscopy 2002, April 4-7, 2004, Kaoshiung – Taïwan

(19) PAWLEY J. B, Limitations on optical sectioning in live-cell confocalmicroscopy, Scanning, 2002, 24, 241–246.

(20) HAEBERLÉ O., “The point spread function of optical microscopesimaging through layered and heterogeneous media”, Focus on Mi-croscopy 2004, April 4-7, 2004, Philadelphia - USA.

(21) LAUER V., New approach to optical diffraction tomography yiel-ding a vector equation of diffraction tomography and a novel tomo-graphic microscope ,J. Microscopy, 2000, 205, 165-177.

térogènes doit permettre de maintenir la qualitédes données acquises, par des solutions maté-rielles (optique adaptative) ou numériques (res-

tauration des images). Enfin, lorsque le meilleurde l’instrument a été obtenu, on peut encoreaméliorer la résolution par déconvolution des

données à l’aide de la RIO de l’instrument, quipeut être mesurée ou calculée. La combinaisonde ces diverses approches permet d’envisager

avec réalisme le développement de techniquesde nanoscopie en champ lointain, avec une ré-solution finale de quelques dizaines de nm en

BIBLIOGRAPHIE

SA244_22-26.pdf

Documents

Transcript of SA244_22-26.pdf