Réponse d'une communauté périphytique à un effluent complexe :...

N° d’ordre 04 – ISAL - 0056 Année 2004

THÈSE

Réponses d’une communauté périphytique à un effluent complexe:

études en bio-essais et en canaux artificiels

Présentée devant L’Institut National des Sciences Appliquées de Lyon

Pour obtenir

Le grade de docteur École doctorale : École doctorale de Chimie de Lyon

Spécialité : Sciences et Techniques du Déchet

Par Laurence VOLATIER

Soutenue le 15 octobre 2004 devant la Commission d’examen

Jury : BÉRARD A. Ingénieur du GREF, HDR Rapporteur BOISSON J.C. Chargé de recherche Directeur CAZAUBON A. Professeur Rapporteur GARABÉTIAN F. Maître de Conférences LEJEUNE P. Professeur PERRODIN Y. Directeur de recherche Directeur Membres invités : LEBOULANGER C. Chargé de recherche MÉHU J. Professeur associé Cette thèse a été effectuée au Laboratoire des Sciences de l’Environnement de l’ENTPE de Vaulx-en-Velin

Septembre 2003

INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

Directeur : STORCK A. Professeurs : AUDISIO S. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE BABOT D. CONT. NON DESTR. PAR RAYONNEMENTS IONISANTS BABOUX J.C. GEMPPM*** BALLAND B. PHYSIQUE DE LA MATIERE BAPTISTE P. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BARBIER D. PHYSIQUE DE LA MATIERE BASTIDE J.P. LAEPSI**** BAYADA G. MECANIQUE DES CONTACTS BENADDA B. LAEPSI**** BETEMPS M. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE BIENNIER F. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BLANCHARD J.M. LAEPSI**** BOISSON C. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE BOIVIN M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES BOTTA H. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOTTA-ZIMMERMANN M. (Mme) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOULAYE G. (Prof. émérite) INFORMATIQUE BOYER J.C. MECANIQUE DES SOLIDES BRAU J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Thermique du bâtiment BREMOND G. PHYSIQUE DE LA MATIERE BRISSAUD M. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE BRUNET M. MECANIQUE DES SOLIDES BRUNIE L. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION BUREAU J.C. CEGELY* CAVAILLE J.Y. GEMPPM*** CHANTE J.P. CEGELY*- Composants de puissance et applications CHOCAT B. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine COMBESCURE A. MECANIQUE DES CONTACTS COUSIN M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures DAUMAS F. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et Thermique DOUTHEAU A. CHIMIE ORGANIQUE DUFOUR R. MECANIQUE DES STRUCTURES DUPUY J.C. PHYSIQUE DE LA MATIERE EMPTOZ H. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION ESNOUF C. GEMPPM*** EYRAUD L. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE FANTOZZI G. GEMPPM*** FAVREL J. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS FAYARD J.M. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS FAYET M. MECANIQUE DES SOLIDES FERRARIS-BESSO G. MECANIQUE DES STRUCTURES FLAMAND L. MECANIQUE DES CONTACTS FLORY A. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATIONS FOUGERES R. GEMPPM*** FOUQUET F. GEMPPM*** FRECON L. REGROUPEMENT DES ENSEIGNANTS CHERCHEURS ISOLES GERARD J.F. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES GERMAIN P. LAEPSI**** GIMENEZ G. CREATIS** GOBIN P.F. (Prof. émérite) GEMPPM*** GONNARD P. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GONTRAND M. PHYSIQUE DE LA MATIERE GOUTTE R. (Prof. émérite) CREATIS** GOUJON L. GEMPPM*** GOURDON R. LAEPSI****. GRANGE G. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GUENIN G. GEMPPM*** GUICHARDANT M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE GUILLOT G. PHYSIQUE DE LA MATIERE GUINET A. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS GUYADER J.L. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE GUYOMAR D. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE HEIBIG A. MATHEMATIQUE APPLIQUEES DE LYON JACQUET-RICHARDET G. MECANIQUE DES STRUCTURES JAYET Y. GEMPPM*** JOLION J.M. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION JULLIEN J.F. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures JUTARD A. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE KASTNER R. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique KOULOUMDJIAN J. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION LAGARDE M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LALANNE M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES STRUCTURES LALLEMAND A. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LALLEMAND M. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LAUGIER A. PHYSIQUE DE LA MATIERE

Mai 2003 LAUGIER C. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LAURINI R. INFORMATIQUE EN IMAGE ET SYSTEMES D’INFORMATION LEJEUNE P. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE LUBRECHT A. MECANIQUE DES CONTACTS MASSARD N. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE MAZILLE H. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MERLE P. GEMPPM*** MERLIN J. GEMPPM*** MIGNOTTE A. (Mle) INGENIERIE, INFORMATIQUE INDUSTRIELLE MILLET J.P. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MIRAMOND M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine MOREL R. MECANIQUE DES FLUIDES ET D’ACOUSTIQUES MOSZKOWICZ P. LAEPSI**** NARDON P. (Prof. émérite) BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS NIEL E. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE NORTIER P. DREP ODET C. CREATIS** OTTERBEIN M. (Prof. émérite) LAEPSI**** PARIZET E. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PASCAULT J.P. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES PAVIC G. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PELLETIER J.M. GEMPPM*** PERA J. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Matériaux PERRIAT P. GEMPPM*** PERRIN J. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PINARD P. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE PINON J.M. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION PONCET A. PHYSIQUE DE LA MATIERE POUSIN J. MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE PREVOT P. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PROST R. CREATIS** RAYNAUD M. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux REDARCE H. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE RETIF J-M. CEGELY* REYNOUARD J.M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures RIGAL J.F. MECANIQUE DES SOLIDES RIEUTORD E. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ROBERT-BAUDOUY J. (Mme) (Prof. émérite) GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES ROUBY D. GEMPPM*** ROUX J.J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON – Thermique de l’Habitat RUBEL P. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION SACADURA J.F. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux SAUTEREAU H. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SCAVARDA S. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE SOUIFI A. PHYSIQUE DE LA MATIERE SOUROUILLE J.L. INGENIERIE INFORMATIQUE INDUSTRIELLE THOMASSET D. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE THUDEROZ C. ESCHIL – Equipe Sciences Humaines de l’Insa de Lyon UBEDA S. CENTRE D’INNOV. EN TELECOM ET INTEGRATION DE SERVICES VELEX P. MECANIQUE DES CONTACTS VIGIER G. GEMPPM*** VINCENT A. GEMPPM*** VRAY D. CREATIS** VUILLERMOZ P.L. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE Directeurs de recherche C.N.R.S. : BERTHIER Y. MECANIQUE DES CONTACTS CONDEMINE G. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE COTTE-PATAT N. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE ESCUDIE D. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON FRANCIOSI P. GEMPPM*** MANDRAND M.A. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE POUSIN G. BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE ROCHE A. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SEGUELA A. GEMPPM*** VERGNE P. LaMcos Directeurs de recherche I.N.R.A. : FEBVAY G. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS GRENIER S. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS RAHBE Y. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS Directeurs de recherche I.N.S.E.R.M. : PRIGENT A.F. (Mme) BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE MAGNIN I. (Mme) CREATIS** * CEGELY CENTRE DE GENIE ELECTRIQUE DE LYON ** CREATIS CENTRE DE RECHERCHE ET D’APPLICATIONS EN TRAITEMENT DE L’IMAGE ET DU SIGNAL ***GEMPPM GROUPE D'ETUDE METALLURGIE PHYSIQUE ET PHYSIQUE DES MATERIAUX ****LAEPSI LABORATOIRE D’ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DES PROCEDES ET SYSTEMES INDUSTRIELS

Remerciements Le travail présenté ici est né d’une étude pluridisciplinaire initiée par l’ademe

(Agence de l'Environnement et de la Maîtrise de l'Energie) et solvay dont la coordination a été assurée par l’équipe polden de la Société insavalor. Je remercie sincèrement ces différentes entités ; elles m’ont donné l’opportunité de réaliser ce travail et sincèrement fait de leur mieux pour que celui-ci se déroule dans de bonnes conditions.

Yves Perrodin, Directeur du laboratoire des Sciences de l’Environnement de l’ENTPE de Vaulx-en-Velin, m’a accueillie dans ses locaux tout en acceptant le co-encadrement de ce sujet avec Jean-Claude Boisson, Chargé de Recherche dans ce même laboratoire. A ce titre, je les remercie tous deux.

Je tiens à remercier Arlette Cazaubon et Annette Bérard, rapporteurs de ce travail, pour leurs commentaires avisés suite à la lecture attentive de ce manuscript. Merci également à Frédéric Garabétian, Christophe Leboulanger et Jacques Méhu pour leur participation à mon Jury, ainsi qu’à Philippe Lejeune qui en a accepté la Présidence.

Au cours de ce travail, un Comité de Pilotage a été constitué. Arlette Cazaubon, Sandrine Charles, Jean-François Férard, Frédéric Garabétian, Charlotte Hugrel, Jean-François Humbert et Christophe Leboulanger ont accepté de donner de de leur temps pour y participer. Riches de vos connaissances et de votre expérience vous m’avez patiemment écoutée et savamment guidée. Merci !

Les essais menés en canaux artificiels ont été effectués sur la plate-forme eedems. Robert Moretto, Chef de Projets, m’a accueillie avec générosité. Robert, je te remercie pour ton accueil mais aussi pour être resté calme et confiant devant les inondations répétées de la salle.

Les analyses par DGGE et HPLC ont été effectuées en collaboration avec Ursula Dorigo, Christophe Leboulanger et Sonia Bonifacio au Laboratoire de Microbiologie Aquatique de l’INRA de Thonon dirigé par Jean-François Humbert. Le soutien humain, technique et scientifique de toute l’équipe m’a été accordé avec générosité dès mon arrivée et bien après mon départ. Jean-françois, je voudrais te remercier pour l’intérêt que tu as montré pour ce travail, pour tes nombreux conseils, pour ta confiance et ta disponibilité. Quant à toi, Ursula, tu m’as m’initiée à la DGGE avec beaucoup de soins. Merci à tous les deux pour votre éclairage scientifique, pour votre enthousiasme et pour votre patience face à mes inombrables questions de néophyte.

Combien de personnes ai-je questionné au cours de ce travail ? Il me semble impossible de citer tout le monde…merci à Frank Poly et Valérie Larno pour leurs explications relatives aux fondements des techniques biomoléculaires. Merci à Alain Devaux pour ses connaissances en écotoxicologie qu’il transmet avec passion et pédagogie. Merci à Raphëlle Godillot, André Lallemand, Lionel Soulhac, Charlotte Hugrel, Mohamed Abdelghafour et Pierre Sagne pour la conception des canaux. Merci à Bernard Montuel et Bernadette Volat pour leur aide sur les activités enzymatiques.

Merci à Charlotte Parent, Laurent Lassabatère, Sandrine et Hubert Charles, ainsi que Florian Mermillot pour leurs conseils relatifs aux analyses statistiques et multivariées. C’était dur ! Merci aussi à Philippe…

Il y a ceux que j’ai questionnés mais aussi ceux qui ont eu la chance (hum hum !) d’être à mes côtés lors du lancement de mes canaux : tuyaux à changer, équipement des pompes à revoir, trop-plein à souder, fenêtres à obscurcir et puis des fuites, des fuites et encore des fuites à éponger. Merci à Marc Danjean, Charlotte Parent, Charlotte Hugrel, Valérie Canivet, Robin Eppe, Charles et son ami Pierrot.

Je tiens aussi à remercier Laurence Matringe, Sonia Bonifacio et Sandrine Sauzet pour les travaux qu’elles ont effectués dans le cadre de leur stage. Vous m’avez beaucoup aidée et je suis heureuse d’avoir travaillé avec vous.

Charlotte, nous avons partagé le même bureau. Ensemble, nous avons déroulé le chemin de nos deux thèses. Ton infini soutien et celui de Marc, cher Marc, m’ont permis d’avancer lorsque tout me poussait à renoncer. Il y a eu le laboratoire et le terrain mais aussi les rires, les doutes et les colères ; autour d’un café, d’un apéro ou d’une pièce montée, avec les copains - Jérémy, Valou, Guillaume, Chantal, Arnaud, Laureline, Olivier, Lolo, Amélie, Antoine, Marc, Alain, Manou, Alicia, Edouard -, les bons souvenirs se sont écrits. Ne tournons pas la page…Tu nous as présenté à tes amis. Parmi eux, Guillaume. Sacré Guillaume ! Entre plaisanteries et confidences, nos complices échanges électroniques ont été un réel délice.

Plus généralement, je remercie toute l’équipe du Laboratoire des Sciences de l’Environnement pour tous ces moments passés ensemble. J’ai aussi beaucoup apprécié de travailler avec Cécile Delolme à la suite de ma thèse. Je tiens également à remercier l’équipe POLDEN (et Papy !) avec qui j’ai travaillé durant 8 ans. C’était en 1993 … ça fait un baille !

Si des amitiés sincères se sont dessinées – Charlotte, Ursi, Olivier et la ‘tite Nénette - d’autres se sont révélées plus précieuses et plus fortes que jamais. Céline, ma très chère Céline, ta tendresse et ton affection embellissent chacune de mes journées. Laurent, Manon et toi tenez une place toute particulière dans mon cœur. Il y a aussi Sandrine, toujours attentive et attentionnée, Hubert, Sarah et Jérémy. Et toi, Valérie, tu es présente chaque fois que j’en ai besoin. A présent, ensemble et sous le regard rieur de ta petite Julie, nous continuons nos longues discussions…ne les arrêtons pas.

En écrivant ces quelques mots, j’ai une pensée pour les théâtreux et les grimpeurs de Rêve’n’Cie et d’ABC - Araignée Bleue Ciel pour les officiels et Aours Binch Club pour les intimes.

Enfin, je vais remercier tout particulièrement ma famille, c’est-à-dire ma grand-mère, mes parents, ma « petite » sœur et Guillaume, ainsi que Philippe. Oubliant la sagesse, la prudence et la raison, vous m’aidez à relever le défi le plus difficile : celui de vivre ses rêves et ses envies pour ne pas connaître l’amertune du regret et de l’ennui. C’est une belle preuve d’amour, merci. Je vous aime beaucoup aussi.

Sommaire SOMMAIRE --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 LISTE DES COMMUNICATIONS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 1 ABREVIATIONS --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 LISTE DES FIGURES--------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 5 LISTE DES TABLEAUX------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 6 LISTE DES PHOTOGRAPHIES -------------------------------------------------------------------------------------------------- 7 PREAMBULE ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 INTRODUCTION ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 11 PARTIE 1. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE------------------------------------------------------------------------------------- 15 CHAPITRE 1. EVALUATION DE L'IMPACT DES DECHETS : CONTEXTE REGLEMENTAIRE ET SCIENTIFIQUE. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 17 1. Contexte réglementaire----------------------------------------------------------------------------------------------------19 2. Contexte scientifique-------------------------------------------------------------------------------------------------------21

2.1 Etudes in situ : complexité et réalisme---------------------------------------------------------------------------------21 2.2 Essais en laboratoire : contrôle et réductionnisme--------------------------------------------------------------------22

2.2.1 Essais mono-spécifiques -------------------------------------------------------------------------------------------23 2.2.2 Des essais mono-spécifiques aux essais menés à l'échelle d'une communauté------------------------------24

2.3 Essais sur le périphyton--------------------------------------------------------------------------------------------------25 2.3.1 Bio-essais in situ----------------------------------------------------------------------------------------------------25 2.3.2 Bio-essais de laboratoire sur une communauté périphytique naturelle---------------------------------------27 2.3.3 Essais en microcosmes/mésocosmes lotiques (canaux artificiels) --------------------------------------------27

CHAPITRE 2. LE PERIPHYTON : MARQUEUR BIOLOGIQUE D'UNE PERTURBATION. ---------------------- 31 1. Périphyton -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------33

1.1 Définitions et terminologie ----------------------------------------------------------------------------------------------33 1.2 Organismes périphytiques et matrice polymérique -------------------------------------------------------------------35 1.3 Les facteurs influant sur le développement du périphyton ----------------------------------------------------------37 1.4 Intérêt écologique du périphyton : son rôle dans la dégradation de la matière organique -----------------------39

1.4.1 Composés organiques : terminologie-----------------------------------------------------------------------------40 1.4.2 Enzymes : définitions et terminologie ---------------------------------------------------------------------------40 1.4.3 Enzymes extracellulaires : dégradation de la matière organique ---------------------------------------------41 1.4.4 Enzymes β-D-glucosidase et Leucine aminopeptidase ---------------------------------------------------------42 1.4.5 Utilisation des enzymes β-D-glucosidases et Leucine aminopeptidases comme biomarqueur ------------44

2 Intérêt du périphyton comme marqueur biologique d'une perturbation -------------------------------------------44 3. Biodescripteurs périphytiques -------------------------------------------------------------------------------------------46 CHAPITRE 3. COMPOSITION ET STRUCTURE DES COMMUNAUTES EUBACTERIENNES PERIPHYTIQUES : UTILISATION DE LA DGGE. ------------------------------------------------------------------------- 49 1. Fondements de la méthode------------------------------------------------------------------------------------------------52 2. Principe de la méthode ----------------------------------------------------------------------------------------------------53 3. Application à l’écologie microbienne -----------------------------------------------------------------------------------56

3.1 L’intérêt d’une approche moléculaire ----------------------------------------------------------------------------------56 3.2 Utilisation des ARNr 16S et 18S comme outils d'identification ----------------------------------------------------58

Laurence Volatier / Thèse en Sciences et Techniques du Déchet,/ Institut National des Sciences Appliquées de Lyon

3.3 Intérêt des techniques d’empreintes génétiques : cas de la DGGE -------------------------------------------------58 3.4. Limites de la DGGE ------------------------------------------------------------------------------------------------------60

4. Interprétation des gels DGGE -------------------------------------------------------------------------------------------61 4.1 Signification d’une bande -----------------------------------------------------------------------------------------------62 4.2 Limites et biais d’interprétation ----------------------------------------------------------------------------------------62

4.2.1 Limite de détection de la méthode--------------------------------------------------------------------------------63 4.2.2 Copies multiples des gènes rRNA, taille du génome -----------------------------------------------------------64 4.2.3 Molécules chimériques---------------------------------------------------------------------------------------------64 4.2.4 Hétéroduplexes -----------------------------------------------------------------------------------------------------65 4.2.5 Co-migration --------------------------------------------------------------------------------------------------------65 4.2.6 Extraction et amplification préférentielle------------------------------------------------------------------------66

4.3 Analyses des profils DGGE ---------------------------------------------------------------------------------------------68 4.4 Exploitation des données ------------------------------------------------------------------------------------------------68

4.4.1 Indices de diversité -------------------------------------------------------------------------------------------------69 4.4.2 Indice de similarité entre deux profils DGGE-------------------------------------------------------------------69 4.4.3 Analyses multivariées appliquées au profils DGGE------------------------------------------------------------70

4.5 Conclusion-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------70 4.5.1 Théorie et artéfacts : que retenir ? --------------------------------------------------------------------------------70 4.5.2 Analyse des gels et traitement des données : quels choix ? ---------------------------------------------------71

CHAPITRE 4. CONCEPTION DE CANAUX ARTIFICIELS.-------------------------------------------------------------- 75 1. Définitions et terminologie------------------------------------------------------------------------------------------------76 2. Conception des canaux artificiels----------------------------------------------------------------------------------------78

2.1 Critères de conception généraux ----------------------------------------------------------------------------------------79 2.1.1 Dimensionnement des canaux-------------------------------------------------------------------------------------79 2.1.2 Forme des canaux---------------------------------------------------------------------------------------------------80 2.1.3 Matériaux de construction des canaux ---------------------------------------------------------------------------81 2.1.4 Emplacement des canaux ------------------------------------------------------------------------------------------82 2.1.5 Mise en mouvement de l'eau --------------------------------------------------------------------------------------83 2.1.6 Température et éclairage des canaux -----------------------------------------------------------------------------84

2.2 Critères de conception spécifiques -------------------------------------------------------------------------------------86 3. Fonctionnement des canaux artificiels----------------------------------------------------------------------------------88

3.1 Nature du milieu d'essai -------------------------------------------------------------------------------------------------88 3.1.1 Eaux naturelles------------------------------------------------------------------------------------------------------88 3.1.2 Eaux du réseau ------------------------------------------------------------------------------------------------------88

3.2 Mode d'ensemencement des canaux ------------------------------------------------------------------------------------89 3.3 Taux de renouvellement du milieu d'essai -----------------------------------------------------------------------------90

3.3.1 Circuits ouverts -----------------------------------------------------------------------------------------------------91 3.3.2 Circuits fermés------------------------------------------------------------------------------------------------------92 3.3.3 Circuits semi-ouverts-----------------------------------------------------------------------------------------------93

3.4 Support de colonisation : mode de disposition ------------------------------------------------------------------------93 3.5 Stade de colonisation et mode d'injection de l'effluent --------------------------------------------------------------94 3.6 Nombre de réplicats par traitement -------------------------------------------------------------------------------------96 3.7 Mode d'échantillonnage--------------------------------------------------------------------------------------------------98 3.8 Lavage des canaux------------------------------------------------------------------------------------------------------ 104

4. Synthèse -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 105 PARTIE 2. ETUDE EXPERIMENTALE-------------------------------------------------------------------------------------- 107 CHAPITRE 1. MATERIELS ET METHODES. ------------------------------------------------------------------------------ 109


1. Dispositifs et protocoles expérimentaux------------------------------------------------------------------------------ 110 1.1 Essais en conditions statiques : bio-essais --------------------------------------------------------------------------- 110

1.1.1 Dispositif de collecte en milieu naturel ------------------------------------------------------------------------ 110 1.1.2 Dispositif de laboratoire ----------------------------------------------------------------------------------------- 112 1.1.3 Protocole expérimental ------------------------------------------------------------------------------------------ 113

1.1.31 Choix des conditions expérimentales ----------------------------------------------------------------------- 113 1.1.32 Déroulement des essais et mesure des effets écotoxicologiques ----------------------------------------- 114 1.1.33 Synthèse des bio-essais --------------------------------------------------------------------------------------- 115

1.2 Essais en canaux artificiels -------------------------------------------------------------------------------------------- 115 1.2.1 Critères de conception des canaux artificiels ----------------------------------------------------------------- 115 1.2.2 Description des canaux artificiels ------------------------------------------------------------------------------ 117

1.2.21 Equipement hydraulique des canaux ------------------------------------------------------------------------ 119 1.2.22 Eclairage des canaux ------------------------------------------------------------------------------------------ 121

1.2.3 Dispositifs connexes --------------------------------------------------------------------------------------------- 121 1.2.31 Stockage de l'effluent ----------------------------------------------------------------------------------------- 121 1.2.32 Climatisation de la salle d'expérimentation ---------------------------------------------------------------- 122

1.2.4 Choix des conditions expérimentales -------------------------------------------------------------------------- 122 1.2.41 Eclairage artificiel : qualité, intensité, photopériodisme ------------------------------------------------- 122 1.2.42 Température ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 123 1.2.43 Nature du milieu d’essai et renouvellement ---------------------------------------------------------------- 124 1.2.44 Fonctionnement des canaux ---------------------------------------------------------------------------------- 124 1.2.45 Nature et positionnement des substrats --------------------------------------------------------------------- 124

1.2.5 Déroulement des essais ------------------------------------------------------------------------------------------ 125 1.2.51 Remplissage des canaux et positionnement des substrats------------------------------------------------- 126 1.2.52 Ensemencement des canaux ---------------------------------------------------------------------------------- 126 1.2.53 Injection de l'effluent ----------------------------------------------------------------------------------------- 127 1.2.54 Echantillonnage des substrats colonisés -------------------------------------------------------------------- 127 1.2.56 Vidange et lavage des canaux et des substrats artificiels ------------------------------------------------- 128 1.2.57 Analyses physico-chimiques --------------------------------------------------------------------------------- 128 1.2.58 Analyses biologiques------------------------------------------------------------------------------------------ 128 1.2.59 Déroulement synthétique des essais en canaux artificiels ------------------------------------------------ 130

2. Mesure des effets sur le périphyton ----------------------------------------------------------------------------------- 131 2.1 Préparation des échantillons------------------------------------------------------------------------------------------- 131 2.2 Mesure des effets sur la structure globale des biofilms ------------------------------------------------------------ 131

2.2.1 Estimation de la biomasse totale-------------------------------------------------------------------------------- 131 2.2.2 Estimation de la biomasse algale ------------------------------------------------------------------------------- 132 2.2.3 Estimation de l'abondance bactérienne------------------------------------------------------------------------- 133

2.2.31 Principe de la mesure ----------------------------------------------------------------------------------------- 133 2.2.32 Protocole-------------------------------------------------------------------------------------------------------- 133

2.3. Mesure des effets sur la composition des communautés ----------------------------------------------------------- 135 2.3.1 Composition de la communauté bactérienne par DGGE ----------------------------------------------------- 135

2.3.12 Extraction et précipitation de l'ADN ------------------------------------------------------------------------ 135 2.3.13 Détermination de la pureté de l'ADN extrait et dosage --------------------------------------------------- 136 2.3.14 Choix des amorces et amplification PCR ------------------------------------------------------------------- 136 2.3.15 Visualisation des fragments amplifiés ---------------------------------------------------------------------- 138 2.3.16 Analyse DGGE et révélation du gel ------------------------------------------------------------------------- 139

2.3.2 Structure de la communauté algale ----------------------------------------------------------------------------- 141


2.3.21 Diversité pigmentaire ----------------------------------------------------------------------------------------- 141 2.3.22 Diversité taxonomique des diatomées----------------------------------------------------------------------- 141

2.4 Mesure des effets sur le métabolisme -------------------------------------------------------------------------------- 142 2.4.1 Activité photosynthétique --------------------------------------------------------------------------------------- 142 2.4.2 Activités Leucine aminopeptidase et β-D-glucosidase ------------------------------------------------------- 143

2.4.21 Principe de la mesure ----------------------------------------------------------------------------------------- 143 2.4.22 Préparation des réactifs --------------------------------------------------------------------------------------- 144 2.4.23 Protocole d'incubation ---------------------------------------------------------------------------------------- 145 2.4.24 Définition du temps d'incubation ---------------------------------------------------------------------------- 146 2.4.25 Dosage du produit formé ------------------------------------------------------------------------------------- 146 2.4.26 Détermination de la concentration saturante --------------------------------------------------------------- 147 2.4.27 Détermination de l'activité enzymatique des échantillons ------------------------------------------------ 148 2.4.28 Expression des résultats -------------------------------------------------------------------------------------- 148

3. Paramètres chimiques --------------------------------------------------------------------------------------------------- 148 GRILLE EXPERIMENTALE. --------------------------------------------------------------------------------------------------- 149 CARACTERISTIQUES DE L'EFFLUENT TESTE ------------------------------------------------------------------------- 151 1. Caractéristiques physico-chimiques ---------------------------------------------------------------------------------- 151 2. Caractéristiques écotoxiques ------------------------------------------------------------------------------------------- 151 CHAPITRE 2. REPONSE DU PERIPHYTON EXPOSE A L'EFFLUENT EN BIO-ESSAIS. ---------------------- 153 1. Mode de traitement des résultats -------------------------------------------------------------------------------------- 156 2. Caractéristiques physico-chimiques de la station de collecte du périphyton ---------------------------------- 157 3. Présentation des résultats----------------------------------------------------------------------------------------------- 158

3.1 Analyses en composantes principales -------------------------------------------------------------------------------- 158 3.1.1 Campagne effectuée au printemps 2002 ----------------------------------------------------------------------- 158 3.1.2 Campagne effectuée en été 2002-------------------------------------------------------------------------------- 160 3.1.3 Campagne effectuée en hiver 2002 ----------------------------------------------------------------------------- 162

3.2 Analyses de variance --------------------------------------------------------------------------------------------------- 163 3.2.1 Effet de la concentration sur la structure du biofilm --------------------------------------------------------- 163 3.2.2 Effet de la concentration sur le métabolisme du biofilm----------------------------------------------------- 166

3.3 Synthèse des effets observés en bio-essais -------------------------------------------------------------------------- 170 3.3.1 Effet de la concentration en effluent --------------------------------------------------------------------------- 170 3.3.2 Interactions entre les communautés algales et bactériennes ------------------------------------------------- 172

3.4 Perspectives d'amélioration des bio-essais -------------------------------------------------------------------------- 173 3.4.1 Variabilité spatiale du biofilm colonisé in situ --------------------------------------------------------------- 173 3.4.2 Etude de l'effet "incubation" ------------------------------------------------------------------------------------ 177 3.4.3 Effet de la durée d'essai sur la réponse des biofilms --------------------------------------------------------- 179

CHAPITRE 3. REPONSE DU PERIPHYTON EXPOSE A L'EFFLUENT EN CANAUX ARTIFICIELS.-------- 181 1. Mode de traitement des données--------------------------------------------------------------------------------------- 184

1.1 Calcul de l'indice autotrophique -------------------------------------------------------------------------------------- 184 1.2 Détermination des paramètres de cinétique des activités enzymatiques : K et VmM --------------------------- 184 1.3 Analyses multivariées et analyses de variance ---------------------------------------------------------------------- 185

2. Campagne d'essai principale ------------------------------------------------------------------------------------------- 187 2.1 Caractéristiques physico-chimiques initiales du milieu d'essai --------------------------------------------------- 188 2.2 Caractéristiques physico-chimiques du milieu d'essai juste avant l'injection de l'effluent dans les canaux "tests" 189 2.3 Caractérisation biologique des biofilms juste avant l'injection de l'effluent dans les canaux "tests"--------- 190

2.3.1 Structure globale du biofilm avant injection de l'effluent --------------------------------------------------- 191


2.3.2 Identification des diatomées avant injection de l'effluent --------------------------------------------------- 192 2.3.3 Diversité pigmentaire avant injection de l'effluent (HPLC) ------------------------------------------------- 193 2.3.4 Composition de la communauté eubactérienne avant injection de l'effluent (DGGE)-------------------- 194 2.3.5 Activités enzymatiques du biofilm avant injection ----------------------------------------------------------- 194

2.3.51 Activité de la leucine aminopeptidase ---------------------------------------------------------------------- 195 2.3.52 Activité de la β-D-glucosidase------------------------------------------------------------------------------- 195

2.4 Traitement des données avant injection de l'effluent --------------------------------------------------------------- 196 2.4.1 Traitement graphique des données avant injection de l'effluent -------------------------------------------- 197

2.4.11 Analyse en composantes principales des données biologiques------------------------------------------- 197 2.4.12 Variabilité inter-canal vis-à-vis de chaque biodescripteur------------------------------------------------ 199

2.4.2 Traitement statistique des données biologiques avant injection de l'effluent : ANOVA----------------- 200 2.5 Réponses des communautés périphytiques exposées à différentes concentrations en effluent ---------------- 202

2.5.1 Evolution de la structure globale des communautés périphytiques ----------------------------------------- 202 2.5.2 Evolution de la composition des communautés de diatomées----------------------------------------------- 203 2.5.3 Evolution de la diversité pigmentaire -------------------------------------------------------------------------- 204 2.5.4 Evolution de la composition des communautés eubactériennes--------------------------------------------- 205

2.5.41 Effet de l'effluent sur la richesse spécifique --------------------------------------------------------------- 205 2.5.42 Effet de l'effluent sur la composition spécifique ---------------------------------------------------------- 206

2.6 Traitement des données après l'injection de l'effluent ------------------------------------------------------------- 208 2.6.1 Traitement graphique des données après l'injection de l'effluent ------------------------------------------- 208

2.6.11 Traitement des variables biologiques continues ----------------------------------------------------------- 208 2.6.111 ACP : traitement des données biologiques ------------------------------------------------------------- 208 2.6.112 ACP : traitement des données physico-chimiques----------------------------------------------------- 211 2.6.113 Co-inertie: couplage des données biologiques et physico-chimiques ------------------------------- 213

2.6.12 Traitement des données biologiques issues de l'analyse DGGE ----------------------------------------- 214 2.6.121 Analyse factorielle des correspondances --------------------------------------------------------------- 215 2.6.122 Co-inertie: couplage des données DGGE et physico-chimiques ------------------------------------- 216

2.6.2 Traitement statistique des données biologiques continues après injection de l'effluent : ANOVA ----- 217 2.6.21 Effet sur la biomasse totale (masse organique) ------------------------------------------------------------ 218 2.6.22 Effet sur la biomasse algale (teneur en chlorophylle-a) -------------------------------------------------- 219 2.6.23 Effet sur l'effectif bactérien ---------------------------------------------------------------------------------- 221 2.6.24 Effet sur l'activité de la leucine aminopeptidase----------------------------------------------------------- 221 2.6.25 Effet sur l'activité de la β-D-glucosidase ------------------------------------------------------------------- 222

2.6.3 Traitement graphique et analyses de variance : confrontation des résultats ------------------------------- 224 3. Campagnes d'essais complémentaires -------------------------------------------------------------------------------- 226 4. Discussion ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 229

4.1 Colonisation des biofilms dans les canaux artificiels avant injection de l'effluent ----------------------------- 229 4.1.1 Importance de la phase de colonisation vis-à-vis de la réponse des biofilms à un stress chimique ---- 230 4.1.2 Colonisation du biofilm dans le canal 1 ----------------------------------------------------------------------- 231 4.1.3 Colonisation du biofilm dans le canal 4 ----------------------------------------------------------------------- 232 4.1.4 Colonisation des biofilm dans les canaux 2 et 3 -------------------------------------------------------------- 233 4.1.5 Variabilité de la colonisation inter-canal ---------------------------------------------------------------------- 234

4.2 Composition des biofilms avant injection de l'effluent ------------------------------------------------------------ 235 4.2.1 Diversité taxonomique ------------------------------------------------------------------------------------------- 235 4.2.2 Diversité pigmentaire -------------------------------------------------------------------------------------------- 236

4.3 Effet de la concentration en effluent sur les biofilms -------------------------------------------------------------- 237 4.3.1 Effet sur la structure et la composition ------------------------------------------------------------------------ 237


4.3.2 Effet de la concentration sur l'évolution des activité enzymatiques ---------------------------------------- 237 4.3.21 Principes de régulation des activités enzymatiques ------------------------------------------------------- 238 4.3.22 Evolution des activités enzymatiques suite à un stress --------------------------------------------------- 239 4.3.33 Effet de l'effluent sur l'évolution de l'activité leucine aminopeptidase --------------------------------- 239 4.3.24 Effet de l'effluent sur l'évolution de l'activité enzymatique de la β-D-glucosidase ------------------- 241

4.3.3 Effet de l'effluent sur l'évolution de la relation "structure-activité"---------------------------------------- 243 4.3.31 Caractérisation de la relation "structure-activité" avant l'injection de l'effluent----------------------- 243

CONCLUSION GENERALE ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 245 1. Effets d'une pollution riches en sels----------------------------------------------------------------------------------- 247 2. Pertinence des biodescripteurs étudiés ------------------------------------------------------------------------------- 249 3. Perspectives d'utilisation des bio-essais ------------------------------------------------------------------------------ 250 4. Améliorations et utilisations des canaux artificiels ---------------------------------------------------------------- 251 5. Propositions pour la méthode Ecocompatibilité -------------------------------------------------------------------- 254 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES--------------------------------------------------------------------------------------- 257 ANNEXES. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 291 ANNEXE 1. RELATIONS "STRUCTURE-ACTIVITE" -------------------------------------------------------------------- 293 ANNEXE 2. ANALYSE EN COMPOSANTES PRINCIPALES --------------------------------------------------------- 297 ANNEXE 3. EVALUATION DE L'ECOCOMPATIBILITE DES DECHETS ------------------------------------------ 301


Liste des communications

Publications dans des revues à comité de lecture PERRODIN Y., GOBBEY A., GRELIER-VOLATIER L. et al. Waste ecocompatibility in storage and reuse scenarios : global methodology and detailed presentation of the impact study on the recipient environments. Waste Management, 2002, vol 22, pp. 215-228.

PERRODIN Y., MEHU J. GRELIER-VOLATIER L. et al. Methodological approach to-wards the definition of new storage conditions for inert waste. Waste Management, 2002, vol 22, pp. 229-234.

GRELIER-VOLATIER L., HUGREL C. PERRODIN Y. et al. Evaluation de l’écocompatibilité de déchets mis en dépôts ou valorisés en travaux publics : une méthode pluridisciplinaire pour une approche "en scénario". Revue des Sciences de l’Eau, 2002, vol 15, N°spécial, pp. 57-66.

DORIGO U., VOLATIER L. et HUMBERT J.F. Molecular approaches for the assessment of biodiversity in aquatic microbial communities: a minireview. Soumis à Canad J. Fisheries, 2004.

Contribution à la rédaction d’ouvrages MEHU J. BAZIN C. et GRELIER-VOLATIER L. Classification réglementaire et écocompatibilité des déchets. Collection Les techniques de l’Ingénieur, 2004, vol G., article G 2030, 9 p.

GRELIER-VOLATIER L., HUGREL C. et PERRODIN Y. Evaluation de l'écocompatibilité des scénarios de stockage et de valorisation des déchets : principes généraux. ADEME éditions, 2000, 27 p.

GRELIER-VOLATIER L., HUGREL C. et PERRODIN Y. Evaluation de l'écocompatibilité des scénarios de stockage et de valorisation des déchets. ADEME éditions, 2003, 147 p.

Communications orales à des congrès internationaux avec actes

PERRODIN Y., GRELIER-VOLATIER L1, BARNA R. et GOBBEY A. Assessment of the ecocompatibility of waste disposal or waste use scenario : towards the elaboration and the implementation of a comprehensive methodology. In : WOLLEY G.R., GOUMANS J.J.J.M. ET WAINWRIGHT P.J. Waste Materials in Construction WASCON 2000. Harrogate, England, 31 may-2 june 2000. Pergamon, 2000, 1050 p.

Laurence Volatier / Thèse en Sciences et Techniques du Déchet / Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 1

PERRODIN Y.1 et GRELIER-VOLATIER L., HUGREL C. et CHATEAU L. Evaluation de l’écocompatibilité de déchets mis en dépôts ou valorisés en travaux publics : une méthode pluridisciplinaire pour une approche "en scénario". La pluridisciplinarité dans les problèmes de l’environnement – les interactions Air Sol; Eau. Université du Québec, Canada, 14-16 mars 2001. 1 : speaker.

Communication orale à des congrès internationaux sans acte

VOLATIER L.1, PERRODIN Y., HUGREL C. Vers la prise en compte de l'impact sur l'environnement dans la gestion des déchets mis en dépôt ou valorisés en travaux publics. Rencontre France-Amérique Latine, mars 2001, France. 1 : speaker.

Communications orales à des congrès nationaux avec acte

BOISSON J.C., FRUGET J.F. 1 et VOLATIER L. Effets de la salinité sur les communautés périphytiques et d’invertébrés benthiques de la Meurthe. Congrès de l'AFL, juillet 2004, Université de Franche-Comté. 1 : speaker.

Communications orales à des congrès nationaux sans acte

DORIGO U., VOLATIER L., FONTVIEILLE D.1 et HUMBERT J.F. Apport des outils de la biologie moléculaire pour l’évaluation de la diversité des communautés microbiennes aquatiques. Congrès de l'AFL, décembre 2003, Metz. 1 : speaker.

Poster VOLATIER L. DORIGO U. BOISSON J.C. et al. Use of DGGE to examine bacterial community structure in periphytic assemblages from indoor experimental channels. 7th International conference of the Aquatic Ecosystem Health and Managment Society, Institut Lumière de Lyon, France, 15-17 septembre 2003.


Abréviations A : Adénine ACP : Analyse en composantes principales ACC : analyse canonique des correspondances ADEME : Agence de l'environnement et la maîtrise de l'énergie AFC : Analyse factorielle des correspondances APS : Persulfate d'ammonium β-Gluc : β-D-Glucosidase BSA : sérum albumine bovine C : Cytosine CE : Concentration efficace Chloro-a : Chlorophylle-a cm2 : Centimètre carré DGGE : Denaturating gradient gel electrophoresis : Électrophorèse en gradient dénaturant dNTP : Désoxynucléotide triphosphate EDTA : Éthylène diamine tétra-acétique G : Guanosine g : Gramme HPLC : Chromatographie liquide à haute preformance mg : Milligramme µg : Microgramme GBL : Gel loading buffer Colorant de charge h : Heure IMFT : Institut de Mécanique des Fluides de Toulouse Km : Constante de michaelis L : Litre Leu-amp : Leucine aminopeptidase M : Molaire m2 : Mètre carré MEB : Microscope électronique à balayage mL : Millilitre µL : Microlitre mM : Millimolaire µM : Micromolaire mm : Millimètre min : Minute MO : Masse organique mol : Mole mmol : Millimole µmol : micromole nM : nanomolaire nmol : nanomole nmol/h/cm2 : nanomole par heure par centimètre carré nmol/h/cell : nanomole par heure par unité de cellule bactérienne nmol/h/gMO : nanomole par heure par milligramme de masse organique PCR : Réaction de polymérisation en chaîne pb : paire de bases rpm : rotation par minute PVC : polychlorure de vinyle Rec : Nombre de Reynolds dans la couche limite SDS : Sodium dodécyl sulfate T : Thymine TAE : Tris EDTA TEMED : N, N, N', N'-tétraméthylènediamine T-RFLP : Terminal restriction Fragment Length polymorphism TRIS : Tris-(hydroxyméthyl) aminométhane UV : Ultraviolet Vmax : Vitesse maximale de réaction % (v:v) : pourcentage volumique % (w:v) : pourcentage (weight/volume) : pourcentage (masse/volume)


Liste des figures Figure 1. Représentation schématique d'un biofilm [HAMILTON et CHARACKLIS, 1989]. ........................... 37 Figure 2. Effets contrastés des principaux facteurs agissant sur la biomasse du biofilm [BIGGS, 2000].. 39Figure 3. Classification des peptidases [GONZALES et ROBERT-BAUDOUY, 1996]...................................... 43 Figure 4. Structure en double hélice de l'ADN [ALBERTS et al., 1994] ................................................... 52 Figure 5. Principe schématique de la DGGE [DORIGO, communication personnelle 2004]. ................... 54 Figure 6. Représentation schématique des différentes approches moléculaires pour évaluer la diversité

génétique des communautés microbiennes [DORIGO et al., 2004a]. ............................................... 57 Figure 7. Développement d'une couche limite d'épaisseur δ [BLEVINS, 1992]. ......................................102 Figure 8. Profil des vitesses dans la couche limite sur une surface lisse [LALLEMAND, 1975]. ...............102 Figure 9. Rivières artificielles : entre réalisme et contrôle. .................................................................106 Figure 10. Dispositif de collecte sur substrats artificiels in situ. ..........................................................112 Figure 11. Schéma d'un canal artificiel et de ses équipements.............................................................120 Figure 12. Spectre des néons en radiance (W/Sr/m2) en fonction de la longueur d'onde. ......................123 Figure 13. Déroulement des essais en canaux artificiels et variables biologiques mesurées. .................130 Figure 14. Exemple de détermination expérimentale de la concentration saturante. ...........................147 Figure 15. ACP, campagne printemps 2002. .......................................................................................160 Figure 16.ACP, campagne été 2002....................................................................................................161 Figure 17. ACP, campagne hiver 2002. ..............................................................................................163 Figure 18. Réponses du biofilm vis-à-vis de sa masse organique en fonction de la concentration en

effluent testée et des saisons. .....................................................................................................164 Figure 19. Réponses du biofilm vis-à-vis de la teneur en chlorophylle-a en fonction de la concentration

en effluent testée et des saisons. .................................................................................................164 Figure 20. Indice autotrophique en fonction de la concentration en effluent testée et des saisons. .......165 Figure 21. Production brute en fonction de la concentration en effluent testée et des saisons. .............167 Figure 22. Respiration en fonction de la concentration en effluent testée et des saisons ......................167 Figure 23. Activité de la leu-amp en fonction de la concentration en effluent testée et des saisons ......169 Figure 24. ACP, colonisation in situ, hiver 2002. ...............................................................................175 Figure 25. Suivi de la production brute primaire dans les bio-essais en mgO2/h/m2 (hiver 2002). ........180 Figure 26. Suivi de la respiration dans les bio-essais en mgO2/h/m2 (hiver 2002). ...............................180 Figure 27. Structure globale du biofilm avant injection du polluant (T23). ..........................................192 Figure 28. Analyse en composantes principales des données biologiques avant injection de l'effluent. .198Figure 29. CV (%) inter canal à T17. .................................................................................................199 Figure 30. CV (%) inter canal à T20. .................................................................................................199 Figure 31. CV (%) inter canal à T23. .................................................................................................200 Figure 32. Evolution de l'indice autotrophique. ..................................................................................203 Figure 33. Evolution de l'indice de Simpson en fonction de la durée d'essai en jours. ..........................205 Figure 34. Évolution du nombre d'espèces et de l'effectif bactérien (nombre de cellules/cm2)..............206 Figure 35. Evolution des bandes détectées : persistance et apparition.................................................207 Figure 36. Analyse en composantes principales des données biologiques. ...........................................210 Figure 37. Analyse en composantes principales des données physico-chimiques. .................................212 Figure 38. Analyse de co-inertie ACP/ACP entre les données "biologiques" (origine de la flèche) et

"physico-chimiques" (fin de la flèche). .......................................................................................214 Figure 39. Analyse factorielle des correspondances (DGGE). .............................................................216


Figure 40. Co-inertie AFC/ACP des données "biologiques" (flèche) et des données physico-chimiques (point). ......................................................................................................................................217

Figure 41. Taux d'évolution de la masse organique (Tx/T23). .............................................................218 Figure 42. Evolution de la masse organique en mg/cm2. .....................................................................219 Figure 43. Taux d'évolution de la teneur en chlorophylle-a (Tx/T23)...................................................220 Figure 44. Evolution de la teneur en chlorophylle-a en µg/cm2. ..........................................................220 Figure 45. Evolution de l'effectif bactérien en nombre de cellules par unité de surface........................221 Figure 46. Taux d'évolution de l'activité leucine aminopeptidase (Tx/T23). .........................................222 Figure 47. Taux d'évolution de l'activité de la β-D-Glucosidase (Tx/T23). ..........................................223 Figure 48. ACP des données biologiques des campagnes complémentaires en canaux artificiels..........227 Figure 49. AFC des résultats des campagnes complémentaires en canaux artificiels. ..........................228 Figure 50. Taux d'évolution de la masse organique et de la chlorophylle-a dans les canaux

expérimentaux avant injection de l'effluent (Tx/T17). ..................................................................230

Liste des tableaux Tableau 1. Séquences du couple d'amorces utilisées. ..........................................................................137 Tableau 2. Composés du mélange PCR. .............................................................................................137 Tableau 3 Programme de la PCR........................................................................................................138 Tableau 4. Composition d'un gel de 0,75 mm d'épaisseur....................................................................139 Tableau 5. Substrats et fluorogènes utilisés. .......................................................................................144 Tableau 6. Réactifs utilisés. ...............................................................................................................145 Tableau 7. Articulation des différents essais.......................................................................................149 Tableau 8. Bio-essais : concentrations testées et biodescripteurs suivis. ..............................................149 Tableau 9. Essais en canaux artificiels : concentrations en effluent et temps de prélèvement. ..............149 Tableau 10. pH, conductivité (conduct.), composés et éléments non métalliques. ................................151 Tableau 11. Métaux : alcalino-terreux, alcalins, éléments de transition et autres métaux......................151 Tableau 12. Micro-polluants minéraux. ..............................................................................................151 Tableau 13. Température, pH, matières organiques, azotées et phosphorées à la station de Damelevière.

.................................................................................................................................................157Tableau 14. Minéralisation de l'eau à la station de Damelevière. .........................................................157 Tableau 15. Effets sur la chlorophylle-a, la production brute et le ratio PB/R. ....................................168 Tableau 16. Synthèse des effets observés en fonction des concentrations testées. ................................171 Tableau 17. Evaluation de l'homogénéité spatiale de la colonisation in situ des biofilms. ....................176 Tableau 18. Abondance relative en % des taxons majoritaires des biofilms colonisés in situ................177 Tableau 19. Caractérisation des biofilms collectés et des biofilms "témoins" en fin de période d'essai. 178Tableau 20. Synthèse des analyses effectuées et du nombre de réplicats intra-canal (n). .....................188 Tableau 21. Caractéristiques physico-chimiques de l'eau du réseau introduite dans les canaux.............188 Tableau 22. Modifications des caractéristiques physico-chimiques de l'eau du réseau introduite dans les

canaux suite à son enrichissement en Si, N et P. .........................................................................189 Tableau 23. Caractéristiques physico-chimiques de l'eau du milieu d'essai dans les canaux après 23 jours

de colonisation (T23). ................................................................................................................190 Tableau 24. Structure globale du biofilm avant injection du polluant (T23) dans les quatre canaux......191 Tableau 25. Achnanthes minutissima et Diatoma ehrenbergii avant injection ......................................193 Tableau 26. Calcul de l'indice de Sorensen dans les quatre canaux avant injection de l'effluent. ..........194


Tableau 27. Activité aminopeptidase avant injection du polluant (T23) dans les canaux expérimentaux..................................................................................................................................................195

Tableau 28. Activité β-D-Glucosidase avant injection du polluant (T23) dans les canaux expérimentaux..................................................................................................................................................196

Tableau 29. Quantificationde la différence entre les canaux "test" et le canal témoin C4 (ANOVA-1 & test de Bonferroni). ....................................................................................................................201

Tableau 30. Achnanthes minutissima et Diatoma ehrenbergii avant injection (T23) et après 11j d'exposition (T34)......................................................................................................................204

Tableau 31. Calcul de l'indice de Sorenson entre les canaux "test" et le canal témoin. .........................207 Tableau 32. Evolution des éléments nutritifs entre T23 et T34............................................................211 Tableau 33. Tableau récapitulatif des ANOVA. ..................................................................................225 Tableau 34. Evolution de l'activité Leucine aminopeptidase. ..............................................................240 Tableau 35. Evolution de l'activité β-D-Glucosidase. .........................................................................242 Tableau 36. Corrélations entre variables surfaciques du canal 1 (T17, T23). .......................................295 Tableau 37. Corrélations entre variables surfaciques du canal 2 (T17, T23). .......................................295 Tableau 38. Corrélations entre variables surfaciques du canal 3 (T17, T23). .......................................295 Tableau 39. Corrélations entre variables surfaciques du canal 4 (T17, T23). .......................................295 Tableau 40. Corrélations entre variables surfaciques du canal 1 après exposition. ...............................296 Tableau 41. Corrélations entre variables surfaciques du canal 2 après exposition. ...............................296 Tableau 42. Corrélations entre variables surfaciques du canal 3 après exposition. ...............................296 Tableau 43. Corrélations entre variables surfaciques du canal 4 après exposition. .............................296

Liste des photographies Photo 1. Culture de Pseudomonas putida vue au MEB [MURIS, 2004]. .................................................. 37 Photo 2. Un gel DGGE (image négative). ............................................................................................ 55 Photo 3. Rivière extérieure [Université Lyon 1] .................................................................................. 83 Photo 4. Alternance de zones rapides et lentes. ................................................................................... 87 Photo 5. Hémisphères du laboratoire d'Ecologie des Eaux Douces, Université Lyon 1. .......................104 Photo 6. Utilisation des hémisphères dans les canaux du laboratoire. .................................................104 Photo 7. Dispositif de collecte sur substrats artificiels avant immersion. ............................................112 Photo 8. Dispositif expérimental. 30 flacons d'essai.. ........................................................................113 Photo 9. Flacon d'essai (150 mL). ......................................................................................................113 Photo 10. Transport des lames colonisées après prélèvement in situ. ..................................................114 Photo 11. Extraction des lames de leur support. .................................................................................114 Photo 12. Canal vu de profil. .............................................................................................................117 Photo 13. Canaux vus du dessus.........................................................................................................117 Photo 14. Entonnement vu de profil. ..................................................................................................118 Photo 15. Entonnement vu du dessus. .................................................................................................118 Photo 16. Colonisation des lames.......................................................................................................125 Photo 17. Colonisation des carreaux. .................................................................................................125 Photo 18. Constitution du gel entre deux plaques de verre. .................................................................140 Photo 19. Chargement du gel. ............................................................................................................140 Photo 20. Retrait de gel en fin de migration. ......................................................................................140 Photo 21. Dispositif de collecte du biofilm en milieu naturel : 4 séries de 12 lames.............................174


Photo 22. Espèce Achnanthes minutissima .........................................................................................193 Photo 23. Etat de la colonisation des biofilms dans les canaux expérimentaux à T23. .........................229 Photo 24. Dépôt de calcaire visible sur les lames après brossage du biofilm. ......................................233


Préambule

En 1999, l'ADEME (Agence de l'Environnement et de la Maîtrise de l'Energie) a défini une méthodologie destinée à l'évaluation de l'écocompatibilité de scénarios de stockage ou de valorisation des déchets [ADEME, 2000 ; ADEME, 2003]. Il s'agit de déterminer si les flux de polluants émis par les déchets en situation de stockage ou de valorisation, que l’on dit « en scénario », sont compatibles avec les flux de polluants acceptables par les milieux récepteurs. Le cas échéant, cette méthode permet d'identifier les mesures à prendre pour s'approcher le plus possible de cette situation d'écocompatibilité.

Depuis la mise au point de la méthode, l'ADEME poursuit ses démarches et ses réflexions sur le sujet par le biais d'applications industrielles d’une part, et par l’accompagnement du développement de nouveaux outils expérimentaux d’autre part. L’amélioration de la description des scénarios d’étude et une meilleure prise en compte du long terme sont aussi l’objet d’évaluations en vue d’optimiser la méthodologie.

Le travail de thèse présenté ici s'inscrit dans le cadre d'un programme portant sur la mise en oeuvre de cette méthodologie. Il vise à évaluer l'écocompatibilité d'un dépôt de déchets de soudière situé à Dombasle (54), sur le site de SOLVAY, dont les percolats – les eaux d'infiltration collectées sous le dépôt – sont susceptibles d'avoir un impact sur la Meurthe.

Ce programme peut être décrit très succinctement comme étant la combinaison de deux phases :

la mise en œuvre pionnière de la méthode définie en 1999, afin de bénéficier des enseignements de sa première application sur le terrain ;

l'approfondissement de l'évaluation des impacts sur les milieux récepteurs aquatiques.

La réalisation du programme, coordonné par l'équipe POLDEN de l'INSA de Lyon, devait permettre d'atteindre les objectifs suivants :

évaluer la situation environnementale d'un des dépôts du site solvay de Dombasle (54) et identifier, si besoin est, les mesures à prendre pour atteindre une situation d'écocompatibilité ;

obtenir un premier retour d'expérience concernant l'application industrielle de la méthode développée par l'ademe ;

améliorer le module d'évaluation des impacts sur le milieu récepteur aquatique.


La thèse porte sur ce dernier point, et a été réalisée au Laboratoire des Sciences de l’Environnement de l’Ecole Nationale des Travaux Publics de l’Etat (ENTPE). L'impact de déchets en scénarios de stockage ou de valorisation sur les milieux aquatiques lotiques était initialement évalué dans la méthodologie grâce à des essais réalisés sur des macro-invertébrés benthiques. À présent, l'ADEME souhaite compléter cette première approche en incluant dans la batterie de tests de nouveaux essais portant sur d'autres organismes tels que ceux constituant le périphyton.


Introduction L'objectif de la thèse consiste à développer des outils de laboratoire

permettant de mieux évaluer les effets potentiels d'une perturbation anthropique chimique et, plus particulièrement, les effets de polluants émis par des déchets sur le périphyton des milieux aquatiques lotiques (eaux douces).

Le développement de ces outils répond à des enjeux environnementaux et économiques. En effet, il s'inscrit dans un contexte où se croisent les problématiques liées à la protection des milieux naturels et à la gestion des déchets. Il est de plus en plus manifeste que le mode de gestion des déchets doit privilégier leur valorisation, notamment afin de réduire les volumes mis en décharge, mais qu'il doit aussi satisfaire certains critères environnementaux nécessaires à la protection des écosystèmes aquatiques. Préalablement à la définition de ces critères, qui est délicate et relève d'une réflexion pluridisciplinaire, le développement de méthodes et d'outils adaptés à l'évaluation des effets d'une perturbation chimique complexe s'avère nécessaire. Dans les paragraphes qui suivent, nous exposerons rapidement ces différents points afin de situer les perspectives d'application des dispositifs et protocoles expérimentaux développés dans le cadre de nos travaux.

La pollution des eaux continentales est sans conteste une résultante directe de son utilisation par l’homme, notamment dans le cadre des activités urbaines, industrielles ou agricoles. Compte tenu de son caractère indispensable à la vie humaine, les efforts des communautés scientifiques et politiques se sont initialement concentrés sur la préservation de la qualité des eaux douces destinées à la production d'eau potable. A l'échelle mondiale, communautaire, et nationale, il existe maintenant des seuils de qualité relatifs à des critères physiques, chimiques et microbiologiques.

Plus récemment, depuis une trentaine d'années environ, le rejet des eaux usées est également réglementé et la qualité des eaux superficielles est davantage suivie. Cette problématique concerne en premier lieu les politiques, les démographes, les économistes et les écologues [COLLOMB, 1996]. Mais il semble légitime d'ajouter à cette liste les acteurs de la vie sociale et, plus particulièrement, ceux de la gestion des déchets. En effet, la pollution des eaux, engendrée par de multiples facteurs, a également pour origine le lessivage par les eaux de pluies des polluants contenus dans les déchets stockés, ou utilisés dans des « mauvaises » conditions dans l'environnement.

Les déchets, inhérents à la vie biologique et à l'activité de l'homme, se sont retrouvés au cœur de la problématique environnementale en quelques années. Selon NAVARRO (1999), la montée en puissance de ce problème aurait pour origine l'essor de la société de consommation depuis la fin de la seconde guerre mondiale ; celui-ci se traduit par l'industrialisation, la surexploitation des ressources naturelles, la réduction


de la durée de vie des produits et, inévitablement, la production toujours croissante de déchets [OUALLET, 1997]. Ces dernières années, la réglementation relative à la conception, à l’implantation, à l'exploitation, et au suivi post-exploitation des centres de stockage des déchets impose des dispositions visant à garantir une meilleure protection de l'environnement. Nous ne détaillerons pas les techniques mises en oeuvre mais celles-ci portent principalement sur l'étanchéité du site et la collecte des eaux résiduaires.

Depuis 1992, la politique nationale de gestion des déchets encourage la valorisation des déchets et limite le stockage aux déchets dits « ultimes ». Selon la loi 92-646 du 13 juillet 1992, ils sont définis comme « des déchets, résultant ou non du traitement d'un déchet, qui ne sont plus susceptibles d'être traités dans les conditions techniques et économiques du moment, notamment par extraction de la part valorisable ou par réduction de leur caractère polluant ou dangereux ». Cette nouvelle orientation a pour but de pallier l'insuffisance des centres de stockage, ou leur multiplication, par une diminution drastique des apports et, par conséquent, d'obliger les producteurs à une valorisation maximale de leurs déchets. Celle-ci peut prendre différentes formes :

la valorisation énergétique, telle que l'incinération avec production d'électricité, ou la méthanisation,

le compostage et l'épandage, la valorisation de la matière qui comprend le recyclage, le ré-emploi et

la ré-utilisation, termes fort bien définis par OUALLET (1997).

L'utilisation des déchets, comme matériaux de substitution en travaux publics par exemple, soulève de nombreuses questions quant aux risques de contamination des milieux naturels.

Que les déchets soient « en scénario » de stockage ou bien de valorisation, il devient impératif d'évaluer leur impact potentiel sur les écosystèmes dès lors qu'ils sont en contact avec le milieu naturel. L'évaluation des effets des polluants rejetés dans les milieux aquatiques repose en grande partie sur la recherche et la quantification d'éléments ou composés connus pour leur toxicité. Cette approche est toutefois insuffisante car elle ne permet pas d'évaluer ou de prévoir les effets des polluants sur les organismes vivants [LAGADIC et al., 1998]. A ce titre, il est important que des essais biologiques soient associés [CAIRNS, 1988].

Ce constat souligne le besoin d'utiliser des organismes comme marqueurs biologiques et de développer des outils et des méthodes permettant de caractériser les effets écotoxicologiques de matrices complexes, solides ou liquides. Les marqueurs biologiques sont définis comme des organismes dont l'étude de la réaction à certaines perturbations permet de détecter la présence de polluants et d'évaluer la gravité de leurs effets [LAGADIC et CAQUET, 1996].


Pour répondre aux objectifs précédemment exposés, deux types d'essai ont été conçus, mis au point et testés sur le percolat provenant du dépôt de déchets étudié : des essais statiques permettant de travailler avec l'eau et les organismes du milieu naturel d'une part, et des essais en canaux artificiels permettant de travailler dans des conditions dynamiques sur des écosystèmes expérimentaux d'autre part.

Le document se structure en deux parties principales, l'une bibliographique, l'autre expérimentale.

Dans la partie bibliographique, un premier chapitre fait état du contexte réglementaire et scientifique relatif à l'évaluation de l'écotoxicité des déchets ou des polluants qu'ils génèrent. Nous nous attacherons ensuite à la présentation du périphyton, retenu comme marqueur biologique au sens de la définition proposée par LAGADIC et CAQUET (1996). Enfin, nous exposerons l'intérêt de la PCR-DGGE en écologie microbienne en nous concentrant principalement sur le mode d'interprétation des données dans la mesure où le principe de la méthode a déjà fait l'objet de nombreuses publications. Le dernier chapitre est consacré à la conception de canaux artificiels. L'utilisation de ces outils est de plus en plus fréquente mais les publications relatives à leur conception demeurent peu nombreuses.

La partie expérimentale suit l'ordre traditionnel. Le premier chapitre vise à décrire les dispositifs expérimentaux conçus et les modes opératoires qui leurs sont associés, ainsi que les méthodes utilisées pour la mesure des paramètres biologiques et physico-chimiques étudiés. Les chapitres suivants présentent les résultats relatifs à l'application de ces outils pour évaluer les effets d'une matrice liquide complexe (percolat du dépôt de déchets de SOLVAY) sur le périphyton.

Enfin, nous discuterons et conclurons sur l'intérêt des outils développés et sur les effets de la matrice liquide étudiée.

Les réflexions et travaux présentés dans ce document apportent des éléments de réponses relatifs à l'applicabilité, à court terme, des outils de laboratoire développés dans le cadre de la thèse, ceci en vue de leur intégration dans la méthodologie d'évaluation de l'écocompatibilité des déchets en scénario de stockage et de valorisation proposée par l'ADEME. Plus généralement, nous nous intéresserons aux perspectives d'utilisation de ces outils dans des études portant sur l'évaluation des impacts environnementaux d'une contamination chimique.

Par ailleurs, nous verrons dans quelle mesure ces outils présentent un intérêt dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le fonctionnement des écosystèmes, c'est-à-dire dans le domaine de l'écologie.

Enfin, nous évaluerons si la composition de la communauté bactérienne périphytique, déterminée par une technique moléculaire qui est la PCR-DGGE, constitue un indicateur pertinent pour la détection et l'évaluation d'une perturbation.


Actuellement l'utilisation de cette communauté comme marqueur biologique repose essentiellement sur des paramètres démographiques (abondance) et/ou fonctionnels.

En ce qui concerne la lecture du document :

Dans la suite du texte, le terme « effluent » et non « percolat » sera employé pour désigner la matrice liquide testée ; ce choix vise à ne pas retreindre, par la seule utilisation d'un terme spécifique, l'utilisation de nos dispositifs expérimentaux au cas de l'évaluation de l'écotoxicité de percolats de déchets.

Les termes « communauté périphytique », « biofilm » et « périphyton » seront employés sans distinction, sauf lors de leurs définitions (cf partie 1, chapitre 1).

Les termes « canaux artificiels » et « rivières artificielles » seront employés sans distinction, sauf lors de leurs définitions (partie 1, chapitre 3). Nous utiliserons généralement le terme employé par les auteurs cités.

Les termes « paramètre biologique », « biomarqueur » et « biodescripteur » seront utilisés sans distinction. Ils désignent, dans ce document, les variables biologiques mesurées pour évaluer les effets écotoxiques du percolat sur le périphyton.

Les essais statiques développés dans le cadre de la thèse seront qualifiés de bio-essais.

Enfin, pour simplifier la lecture du document, nous parlerons « des activités leucine aminopeptidase et β-D-glucosidase » ; sachant que nos essais ont porté sur la mesure de la vitesse des réactions enzymatiques, il serait en effet plus juste de parler de « l'intensité des activités des enzymes leucine aminopeptidase et β-D-glucosidase ».


Partie 1. Etude bibliographique

La partie bibliographique de ce rapport aborde des thématiques appartenant à des disciplines très différentes.

Dans le premier chapitre, une présentation du contexte réglementaire et scientifique de l'étude permet de situer les enjeux environnementaux et économiques des outils expérimentaux développés au cours de ce travail. Aussi, ce chapitre est-il largement consacré à la politique de gestion des déchets et aux risques de contamination des milieux aquatiques par entraînement de la fraction mobilisable des polluants contenus dans les déchets placés en décharge (centre de stockage) ou valorisés comme matériaux de substitution des matières premières traditionnelles pour la construction de routes ou de remblais, par exemple. Nous verrons qu'il est maintenant clairement admis que les analyses chimiques (contenu total ou fraction mobilisable) sont insuffisantes pour estimer les impacts environnementaux liés aux modes de gestion des déchets et qu'elles doivent, à ce titre, être complétées par des analyses biologiques. De ce constat, est née la nécessité de développer des essais sur des organismes vivants (marqueurs biologiques) permettant d'évaluer les effets écotoxicologiques des déchets stockés ou valorisés. La complexité du dispositif expérimental et du marqueur biologique confère à ces essais un degré de réalisme écologique et un niveau de répétabilité/reproductibilité variables. Elle doit, en théorie, être définie en fonction des objectifs de l’essai.

Dans le deuxième chapitre, nous nous attacherons aux définitions les plus couramment utilisées pour désigner les assemblages périphytiques puis nous nous détaillerons ses caractéristiques, ainsi que les facteurs influant sur son développement. Nous évoquerons ensuite son intérêt écologique en nous concentrant sur son rôle dans le cycle de la matière. Ce choix est en étroite relation avec l'étude expérimentale de ce travail au cours de laquelle les effets d'un effluent industriel sur le périphyton sont, entre autres, évalués par la mesure des activités de deux enzymes impliquées dans les processus de dégradation de la matière organique, la leucine aminopeptidase et la β-D-glucosidase. Enfin, nous conclurons ce chapitre en exposant l'intérêt du périphyton comme marqueur biologique d'un stress environnemental.

Dans le troisième chapitre, nous présenterons la technique d'empreintes moléculaires qui est ensuite appliquée afin de déterminer les effets de l'effluent


industriel sur la diversité génotypique de la communauté eubactérienne périphytique, la PCR-DGGE. Comme il sera exposé dans la partie "matériels et méthodes" de ce document, les conditions expérimentales de l'analyse ont été définies à partir des publications sur le sujet. Aussi, ce chapitre est-il consacré au mode d'interprétation des résultats et non à la définition des conditions expérimentales. L'objectif est également d'éclairer le lecteur sur les nombreuses applications de la PCR-DGGE et sur son intérêt dans le cadre de l'évaluation des conséquences écologiques d'un stress environnemental. Cette méthode est par ailleurs très attrayante à plusieurs titres. D'un point de vue scientifique, nous verrons qu'elle ne restreint pas l'étude des bactéries aux micro-organismes cultivables contrairement aux techniques de mise en culture. Elle permet également d'étudier la diversité des eucaryotes sans identification taxonomique par microscopie, technique longue et coûteuse. D'un point de vue pratique, la PCR-DGGE offre la possibilité de traiter un nombre important d'échantillons et son application ne requiert pas nécessairement l'intervention d'experts en biologie moléculaire. En effet, une fois que les conditions expérimentales sont définies, une application "en routine" de cette technique est tout à fait envisageable.

Dans le quatrième chapitre, nous présenterons les critères de conception de canaux artificiels, ainsi que les différents modes de fonctionnement envisageables. Ce chapitre reflète de manière synthétique la démarche que nous avons suivie afin que que la définition de notre dispositif expérimental permette de répondre, au mieux, aux objectifs de l'étude dans la limite de nos contraintes techniques, financières et temporelles. Cette partie traite des questions ou réflexions qui doivent être abordées préalablement à la construction de canaux artificiels. Notre objectif est ici de démontrer l'influence du dispositif expérimental sur la nature et la fiabilité des résultats.


Chapitre 1. Evaluation de l'impact des déchets : contexte réglementaire et scientifique.


Partie 1. Chapitre 1. Evaluation de l'impact des déchets : contexte réglementaire et scientifique.

Dans ce chapitre, il s'agit d'apporter un éclairage sur l'évolution de la politique en matière de gestion des déchets et, plus particulièrement, sur l'intérêt des essais écotoxicologiques dans ce contexte. De même, nous souhaitons rappeler la finalité, les limites et les avantages des essais écotoxicologiques menés au laboratoire ou sur le terrain d'une part, et sur une espèce ou sur une communauté, d'autre part.

Nous présenterons ensuite différents types d'essais menés sur le périphyton et nous intéresserons à l'intérêt des essais menés en canaux artificiels.

1. Contexte réglementaire

Historiquement, les efforts de la communauté scientifique et des gestionnaires ont initialement porté sur l'évaluation des propriétés toxiques intrinsèques aux substances et, seulement dans un deuxième temps, à celles des préparations commercialisées.

Une première phase de réflexion a permis d'élaborer une classification européenne des substances dangereuses selon des critères physico-chimiques (inflammable, corrosif...), des critères relatifs à la santé humaine (irritant, cancérogène) et un critère « dangereux pour l'environnement » défini en 1991 [Directive de base 67/548/CEE modifiée]. L'évaluation de ce dernier critère repose sur des tests d'écotoxicité, normalisés, principalement menés sur des organismes aquatiques tels que des algues, des crustacés ou des poissons. Les méthodes à appliquer pour l'évaluation de ce critère sont décrites dans l'annexe V de la Directive. Ce texte a été transposé en droit national par l'arrêté du 20 avril 1994 relatif à la déclaration, la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances.

La classification des préparations dangereuses fait également l'objet d'un texte réglementaire communautaire [Directive de base 88/379/CEE]. Elle repose sur la détermination du contenu des préparations en substances dangereuses.

Les substances et préparations identifiées comme dangereuses présentent essentiellement un risque vis-à-vis de la santé humaine lors de leur utilisation ou de leur manipulation. Mais si l'usage et la valeur économique font le produit, l'abandon ou l'intention d'élimination font le déchet. Dans ce cas, les risques potentiels concernent davantage l'environnement que l'homme sauf dans le cas de la manipulation de déchets en vue de leur valorisation ou de leur traitement.

Face à ce constat et parallèlement aux évolutions en matière de classification des substances et préparations, les acteurs impliqués dans la gestion des déchets, des rejets industriels ou urbains, ainsi que dans la protection des milieux naturels sont maintenant conscients de la nécessité de prendre en compte l'évaluation de l'impact environnemental dans leur politique de gestion.



A l'échelle communautaire, les déchets dangereux sont définis par la Directive 91/689/CEE. Selon ce document, un déchet est dangereux s'il présente au moins l'une des quatorze propriétés de danger énoncées en annexe du texte et notées de H1 à H14 (« H » pour Hazardous). Ces propriétés sont largement inspirées de celles définies pour la classification des substances dangereuses. Le critère correspondant à « dangereux pour l'environnement » est le critère H14. Bien qu'une liste de déchets dangereux ait été adoptée en 1994, la communauté européenne n'a pas fourni toutes les méthodes nécessaires à l'évaluation de ces quatorze critères de danger notamment lorsque celles disponibles pour les substances n'étaient pas directement transposables aux déchets. Ainsi, pour ce qui est de l’évaluation du H14, aucune méthode n'est actuellement proposée par la Commission des Communautés Européennes.

Cela n'a pas freiné pour autant le développement de tests normalisés à l'échelle nationale, communautaire ou internationale adaptés à l'évaluation de l'écotoxicité intrinsèque des effluents. Il s'agit d'essais mono-spécifiques effectués avec des organismes aquatiques ou terrestres, issus de culture ou d'élevage. Mais, à présent, bien que les avantages des tests d'écotoxicité mono-spécifiques soient clairement reconnus, la communauté scientifique s'interroge sur le manque de réalisme écologique de ces essais pour évaluer ou prédire les effets réels d'un polluant sur l'environnement.

En parallèle et dans le contexte national, l'ADEME affiche sa volonté d'améliorer sa politique de gestion des déchets par la prise en compte de leur impact environnemental réel. C'est dans ce cadre, qu'un programme de recherche pluridisciplinaire (1999) a conduit à l'élaboration d'une méthode d'évaluation de l'écocompatibilité des déchets en scénarios de stockage ou de valorisation. Cette approche « en scénarios » tend à s'approcher au mieux des conditions d'exposition réelles des organismes aux polluants atteignant les milieux récepteurs. La méthode a pour particularité d'être une approche expérimentale dite intégrée. Elle tient compte des conditions d'émission des polluants et de leurs évolutions bio-physico-chimiques jusqu'à ce qu'ils atteignent les milieux récepteurs cibles. Ces évolutions sont fonction, entre autres, du mode de disposition des déchets dans l'environnement, des caractéristiques des polluants émis et de celles du milieu naturel.

Cette méthode n'est pas décrite plus amplement ici car elle fait déjà l'objet de nombreuses publications et d’un guide d’usage [ADEME, 2003] en ce qui concerne ses principes, ses fondements et ses objectifs [MAYEUX et PERRODIN, 1996], son contenu et ses applications [PERRODIN et al., 2000 ; PERRODIN et al., 2002a ; PERRODIN et al., 2002b]. L'intérêt de la pluridisciplinarité et de l'interdisciplinarité de cette approche a également été discuté [GRELIER-VOLATIER et al., 2002]. Dans ces articles, le lecteur trouvera les références des publications relatives aux travaux de recherche ayant conduit à l'élaboration de la méthode. Celles-ci portent sur la caractérisation des déchets, l'étude de leur comportement à long terme et l'étude de leur impact sur les



milieux terrestres (essais sur la microflore, la flore et la faune) et aquatiques (essais sur des macro-invertébrés benthiques).

2. Contexte scientifique

L'évaluation des effets écotoxicologiques peut être réalisée à différents niveaux d'organisation biologique, de la molécule à la communauté. Elle peut également être effectuée à différentes échelles d'expérimentation. En effet, il est possible de distinguer les études menées in situ dans des conditions non contrôlées et les essais menés au laboratoire dans des conditions contrôlées. Il existe également une échelle de travail intermédiaire qui consiste à travailler dans des conditions partiellement contrôlées.

Travailler à différents niveaux d'organisation biologique et à différentes échelles d'expérimentation est du plus grand intérêt. Ces approches répondent directement à des préoccupations différentes mais elles nous semblent complémentaires pour appréhender globalement un problème.

Force est de constater que la réelle difficulté liée au choix d'un type d'essai réside dans le souhait, légitime, du gestionnaire de disposer d'un outil répondant à l'ensemble des critères de performance énoncés par CALOW (1993) : le réalisme écologique, la répétabilité, la reproductibilité, la sensibilité, la fiabilité (précision) et la robustesse (facilité d'interprétation). Aucun essai ne peut a priori répondre à l'ensemble de ces critères.

Les paragraphes qui suivent sont consacrés à la présentation des différentes échelles de travail. Nos réflexions s'inscrivent dans le cadre de l'évaluation et de la prédiction de l'écotoxicité d'un effluent sur des organismes aquatiques.

2.1 Etudes in situ : complexité et réalisme

Les études in situ permettent d’appréhender la situation avec réalisme par la prise en compte globale de l’ensemble des caractéristiques physiques, chimiques et biologiques de l’écosystème étudié.

Toutefois, compte tenu de la complexité des milieux naturels, il est souvent difficile de dissocier l’effet des différents facteurs, biotiques et abiotiques, sur la réponse des organismes suivis pour évaluer l'effet d'un effluent [SAND-JENSEN, 1983 ; PUSEY et al., 1994 ; LOWE et al., 1996]. LAGADIC et al. (1998) évoquent, par exemple, les interférences avec les facteurs environnementaux, tels la température ou



l'éclairement, susceptibles de modifier les effets des polluants en agissant sur leur biodisponibilité.

La complexité des études menées in situ s'explique parfois par la multiplicité des rejets industriels ou urbains dans un même secteur ; celle-ci rend difficile la délimitation d'un tronçon amont/aval au sein duquel la perturbation serait unique. Ainsi, il est souvent délicat de relier avec certitude les effets biologiques observés à la présence de l'effluent étudié [CULP et al., 2000a]. Par ailleurs, en milieu lotique et plus particulièrement, dans le cas d'une perturbation ponctuelle, il est difficile de relier les effets observés à la concentration et à la durée d'exposition à l'effluent du fait de sa dilution et de sa dispersion sous l'effet du courant.

Du fait des difficultés évoquées ci-dessus, l'interprétation des résultats produits dans le cadre d'une étude in situ est une étape parfois délicate. Cependant, la multiplication des prélèvements à différents points du cours d'eau, notamment en amont et en aval du rejet, peut parfois aider à déterminer si la réponse des organismes, c'est-à-dire l'évolution des paramètres biologiques suivis, peut s'expliquer par le déversement de l'effluent étudié. De même, la comparaison entre des organismes prélevés dans le milieu pollué à des organismes prélevés dans un milieu de référence, supposé non pollué, facilite cette interprétation. Enfin, la répétition des campagnes de mesures permet de dissocier la variabilité « naturelle » des paramètres biologiques suivis de la variabilité liée à un facteur externe, tel que le rejet de polluants.

Bien que l’exposition à un effluent et la réponse des organismes puissent être mise en relation in situ, la difficulté d'interprétation des résultats oriente parfois les gestionnaires et les scientifiques vers des essais de laboratoire. La motivation de ces deux communautés est généralement différente. Les premiers souhaitent des outils d'aide à la décision simples et peu onéreux, alors que les seconds s'intéressent à la compréhension des mécanismes impliqués dans la réponse des organismes. Mais dans les deux cas, l'objectif est la simplification des essais par le contrôle et la maîtrise des facteurs influents sur la réponse des organismes.

2.2 Essais en laboratoire : contrôle et réductionnisme Les essais conduisent généralement à des relations « concentration-effet » ou

« exposition-réponse » plus facilement identifiables du fait de la simplification des conditions d'exposition des organismes et de l'élimination des sources d'interférences [CULP et al., 1996 ; CULP et al., 2000b]. En effet, le laboratoire permet non seulement de répliquer et de reproduire les essais mais il offre également la possibilité de définir et de maîtriser les conditions d'exposition des organismes à l'effluent, ce qui réduit considérablement les risques d’interprétation erronée.



Pour illustrer notre propos, nous faisons appel au cas, très fréquent dans le domaine de l'écotoxicologie, d'une série d'essais au cours de laquelle les organismes sont soumis, dans des conditions expérimentales identiques, à différentes concentrations en effluent. Cette approche, plus difficilement envisageable sur le terrain, permet en effet :

de tester des concentrations en effluent inférieures et supérieures à celle détectée dans l’environnement et de déterminer ainsi la zone « effet/non effet » de l'effluent [BELANGER et al., 2000],

d'évaluer la sensibilité des biodescripteurs couramment suivis en milieu naturel et de juger ainsi de leur aptitude à discriminer différents niveaux de perturbation.

Par ailleurs, dans le cas d'un effluent complexe ayant des effets antagonistes liés, par exemple, à la présence d'éléments nutritifs et d'éléments toxiques, le recours à une gamme de concentrations peut permettre de mettre en évidence cette dualité d'effets [LOWELL et al., 1995 ; DUBÉ et CULP, 1996 ; CULP et al., 2000a].

Les tests d'écotoxicité les plus fréquemment mis en oeuvre à l'échelle du laboratoire sont des essais mono-spécifiques. Toutefois, depuis une vingtaine d'années, certains scientifiques soulignent la nécessité de travailler à l'échelle d'une communauté et non d'une espèce. On le verra, il ne s'agit pas d'exclure les essais mono-spécifiques, mais plutôt de déterminer leurs limite et donc de préciser la nature des questions auxquelles ils sont susceptibles de répondre.

2.2.1 Essais mono-spécifiques

Historiquement, les premiers essais de laboratoire visaient à évaluer les effets létaux (effets aigus) ou sublétaux (effets chroniques) d'une substance sur des organismes issus d'une culture ou d'un élevage de laboratoire.

Encore largement utilisés à l'heure actuelle, ces essais sont conduits dans des conditions expérimentales contrôlées de manière à fixer et maîtriser au mieux les facteurs connus pour influer sur la réponse des organismes. Cette approche permet de se limiter à l'observation des effets strictement inhérents à la substance testée. Au cours de ces tests, les organismes sont placés dans des milieux contenant différentes concentrations en substance. A l'issue d'un temps d'exposition donné, les résultats conduisent à l'établissement de la relation « concentration-effet » dont la représentation graphique est généralement de type sigmoïdal.

Ces essais ont ensuite trouvé une application dans l'évaluation de l'écotoxicité de matrices complexes liquides ou solides tels que les effluents, les déchets ou les sols pollués. RIVIÈRE (1998) utilise le terme de bio-essais pour les distinguer de ceux



précédemment décrits mais le principe de mise en œuvre et d'exploitation des résultats reste identique.

Pour conclure, l'utilité des essais mono-spécifiques de laboratoire pour caractériser les substances ou les matrices complexes vis-à-vis de leurs caractéristiques écotoxiques intrinsèques n'est plus à prouver. Mis en œuvre au laboratoire dans des conditions contrôlées (culture/élevage des organismes et mise en oeuvre), ils satisfont au mieux les critères de répétabilité, de reproductibilité, de fiabilité et de robustesse. Toutefois, si les tests d'écotoxicité mono-spécifiques s'avèrent parfaitement adaptés à l'évaluation de l'écotoxicité intrinsèque d'une substance ou d'une matrice complexe, leur utilisation pour l'évaluation et la prédiction des effets à un niveau d'organisation biologique supérieur et, a fortiori, sur les écosystèmes naturels est cependant contestée du fait de leur manque de réalisme écologique. Dans ce cadre, il apparaît nécessaire de travailler à un niveau d'organisation biologique supérieur.

2.2.2 Des essais mono-spécifiques aux essais menés à l'échelle d'une communauté

Selon CAIRNS (1983), les essais mono-spécifiques sont, en effet, insuffisants pour la prédiction des effets réels qui seront potentiellement observés à un niveau d'organisation biologique supérieur. Le fait d'isoler une espèce supprime les relations existant entre les espèces d'une part, et entre les espèces et l'environnement naturel d'autre part. Ainsi, les essais menés à des niveaux d'organisation biologique supérieurs font apparaître des propriétés non représentées lorsque l'organisme est considéré isolément [CAIRNS et PRATT, 1993].

D'après CAIRNS et al. (1996), l'une des questions centrales du débat serait la suivante : les effets observés à l'échelle de l'individu (croissance, reproduction...) dans le cadre d'essais mono-spécifiques permettent-ils de prédire les effets sur les populations et les communautés sachant que ces derniers sont évalués sur d'autres critères telles que la composition (diversité spécifique et abondance), la structure (relation trophique) et la productivité (dynamique trophique) ?

Enfin, la prédiction des effets sur les écosystèmes demande de s'interroger sur l'importance des phénomènes de compensation qui assurent le maintien de la fonctionnalité de l'écosystème naturel, en permettant à d'autres espèces de prendre le relais de celles perturbées de manière permanente ou transitoire [VASSEUR, 2000]. Les possibilités d'adaptation des organismes, généralement observées lors d'une exposition fréquente et/ou prolongée, sont aussi à prendre en compte [LAGADIC et al., 1998].



Dans ce contexte, les auteurs utilisant le périphyton comme modèle biologique se sont orientés vers des échelles de travail intermédiaires. Il s'agit des bio-essais in situ, de bio-essais de laboratoire et d'essais en microcosmes/mésocosmes. Ces essais sont présentés ci-après.

2.3 Essais sur le périphyton

2.3.1 Bio-essais in situ

Dans le cadre des études menées in situ sur le périphyton, de nombreux scientifiques sont confrontés à l'hétérogénéité spatiale de la distribution des communautés colonisées en milieu naturel. Cette hétérogénéité est, en partie, associée à la variabilité de nature et de taille des substrats naturels servant de supports pour la colonisation du périphyton.

En effet, que les substrats soient d'origine minérale ou organique, la micro-topographie de leur surface est déterminante sur le taux de fixation des cellules donc, indirectement, sur la dynamique de succession des espèces. In fine, elle influe sur la composition et l'architecture des communautés colonisées [STEVENSON, 1983]. Plus généralement, certaines études ou revues suggèrent l'existence d'interactions entre le substrat et les micro-organismes du biofilm [WETZEL, 1983 ; BURKHOLDER, 1996 ; BIGGS, 2000]. A titre d'exemple, les substrats peuvent constituer une source d'éléments nutritifs pour les micro-organismes [PRINGLE, 1987].

La multiplicité de ces supports naturels génère également des conditions micro-environnementales dont les caractéristiques physiques et chimiques sont très variées. PRINGLE (1990) parle d'une mosaïque de substrats. L'hétérogénéité des micro-habitats augmente non seulement la complexité des opérations d'échantillonnage [COLEMAN et DHAM, 1990 ; MOLLOY, 1992 ; LOWE et al., 1996 ; CULP et al., 2000a] mais il est fortement probable qu'elle entraîne également une hétérogénéité des conditions d'exposition lors d'une perturbation chimique ou physique.

Afin de limiter l'hétérogénéité spatiale des communautés périphytiques, certains auteurs ont recours à l'utilisation de substrats artificiels. La définition des substrats artificiels proposée par CAIRNS (1982) est la suivante : « a device placed in an aquatic ecosystem to study colonization by indigenous organisms ». Cette approche tend à homogénéiser les conditions de colonisation des communautés ce qui a pour conséquence de limiter la variabilité inter-substrats [TUCHMAN et STEVENSON, 1980 ; MEIER et al., 1983 ; LAMBERTI et RESH, 1985 ; PASHKEVICH et al., 1996].



Le mode d'utilisation des substrats artificiels colonisés in situ pour évaluer l'effet d'une perturbation anthropique sur le périphyton est variable selon les auteurs. A titre d'exemple, nous pouvons citer les travaux suivants :

WATANABE et al. (1988) caractérisent le périphyton colonisé sur des substrats artificiels placés en amont et en aval de divers rejets urbains en vue d'évaluer l'influence de ces rejets sur la communauté périphytique ; les auteurs parlent de « bio-essais in situ ».

GOLD et al. (2002) transfèrent des substrats artificiels colonisés dans un milieu de référence vers différents milieux pollués afin d'évaluer les effets du cadmium et du zinc sur le périphyton. La période de colonisation des substrats vierges est de quatre semaines. Les effets à court terme sont observés à l'issue d'une période d'exposition dans les milieux pollués de 2 et 4 semaines ; les effets à long terme sont observés sur plusieurs années.

Selon ALOI (1990), les substrats artificiels les plus communément utilisés sont des lames de verre. Il s'agit de substrats inertes dont la surface est homogène. Ils permettent en outre de collecter facilement le périphyton soit par brossage soit par raclage à l'aide d'une lame de rasoir ou d'un scalpel. De nombreux auteurs utilisent des lames de verre dont la face servant de support pour la colonisation est sablée afin d'augmenter la rugosité du substrat, ce qui facilite la fixation des organismes [GUASH et al., 1997, GUASH et al., 1998 ; SABATER et al., 2002 ; GUASH et al., 2003]. Il existe d'autres types de substrats artificiels, tels que les carreaux de céramique non vernis [TUCHMAN et STEVENSON, 1980 ; LAMBERTI et RESH, 1985] ou des feuilles de polyéthylène [WATANABE et al., 1988].

Quel que soit le type de substrats artificiels utilisés, tous les auteurs s'accordent sur leur intérêt quant à la diminution de la variabilité inter-substrats. En revanche, la représentativité des communautés colonisées sur substrats artificiels est sujet à controverses. Le cœur du débat porte sur le degré de ressemblance entre les communautés développées sur substrats artificiels et les communautés développées sur substrats naturels. CATTANEO et AMIREAULT (1992) posent avec franchise le problème qui constitue le titre de leur article : quelle est l'artificialité des substrats artificiels utilisés pour le périphyton ? Leur question se décline selon des critères qualitatifs (la composition taxonomique par exemple), et quantitatifs (la teneur en chlorophylle-a). Ces auteurs concluent que d'autres facteurs, telles que la durée de colonisation, la charge trophique et la température du cours d'eau seraient plus influents que la nature du substrat artificiel.



2.3.2 Bio-essais de laboratoire sur une communauté périphytique naturelle

L'utilisation de substrats artificiels, on l’a vu, est très fréquente pour la caractérisation du périphyton en milieu naturel. Certains auteurs ont également recours à ces dispositifs pour la mise en oeuvre de tests de toxicité de laboratoire, désignés ici sous le terme « bio-essais de laboratoire ».

BLANCK (1985) expose du périphyton colonisé en milieu naturel sur substrats artificiels à différentes concentrations en effluent provenant d'une industrie de textile. Les concentrations testées sont obtenues par dilution de l'effluent dans l'eau du milieu naturel filtrée et stérilisée. L'objectif est de déterminer une relation « concentration en effluent - effet sur l'activité photosynthétique » et de définir la concentration efficace (CE50), c'est-à-dire la concentration en effluent qui provoque 50% d'effet par rapport à un essai témoin réalisé en l'absence de polluant. L'auteur parle de « tests d'écotoxicité ».

GUASH et al. (1997, 1998, 2003) utilisent des substrats artificiels colonisés en milieu naturel et exposent les biofilms intacts à différentes concentrations d'atrazine. Les concentrations testées sont obtenues par dilution de l'atrazine dans l'eau du milieu naturel dans des flacons où une agitation est maintenue pour éviter l'établissement d'un gradient de concentration. L'objectif est également de déterminer une relation « concentration – effet » et de définir la concentration efficace (CE50). Les auteurs parlent de « tests de toxicité ».

2.3.3 Essais en microcosmes/mésocosmes lotiques (canaux artificiels)

Le degré de complexité des essais en canaux artificiels est variable (cf partie 1, chapitre 4). Il est fonction de l'implantation du dispositif et de la biocénose testée. Les canaux artificiels peuvent être placés au laboratoire, à l'extérieur (à ciel ouvert ou dans une serre) ou au sein de l'écosystème étudié. La complexité de l'essai dépend aussi des composantes biotiques ou abiotiques représentées. Les essais en canaux artificiels menés sur du périphyton sont, par exemple, conduits en présence d'invertébrés brouteurs et/ou de sédiment.

Les essais en canaux artificiels ont en commun avec les bio-essais de laboratoire présentés ci-dessus :

de travailler à des niveaux d'organisation biologique permettant de prendre en compte les relations inter-spécifiques [GUCKERT, 1993 ; CLEMENT et KIFFNEY, 1994 ; GENTER et AMYOT, 1994 ; BELANGER et al., 2000 ; SUDERMAN et THISTLE, 2003] ;

d'établir une relation « exposition-réponse » et non une relation « concentration-effet », c'est-à-dire de prendre en compte les conditions



d'exposition des organismes aux polluants et d'adopter une approche multicritères [CALOW, 1993] ; on entend par « approche multicritère », le suivi de plusieurs paramètres biologiques.

Du fait de la taille des dispositifs, les essais en canaux artificiels conduisent généralement à des temps d'exposition supérieurs à ceux observés dans le cas des bio-essais de laboratoire. A ce titre, ils sont plus adaptés à :

l'étude des effets d'une perturbation sur la dynamique de succession des espèces.

l'étude des effets d'une perturbation sur les processus écologiques fondamentaux, tels que les cycles de la matière et les flux d'énergie [GUCKERT, 1993] ;

l'identification des effets temporaires (résilience), progressifs ou persistants [RAND et al., 2000 ; BELANGER et al., 2002] ;

l'étude des effets liés à l'intensité d'une perturbation (concentration) et à la dynamique d'exposition (continue ou intermittente) ;

l'étude simultanée du devenir (transport, dégradation, dispersion, accumulation) et les effets des polluants [BELANGER et al., 2000] ;

la distinction des effets directs et des effets écologiques indirects d'une perturbation [BELANGER et al., 2000 ; CULP et al., 2000a ; HENSE et al., 2003].

Les effets écologiques indirects sont la conséquence des relations interspécifiques [FORBES et FORBES, 1997]. Ils peuvent être définis comme les effets résultants d'un effet direct sur des espèces « clés », c'est-à-dire des espèces assurant un rôle essentiel dans la structure ou le fonctionnement de la communauté [RAND et al., 2001 ; BARRANGUET et al., 2003]. Les effets abiotiques indirects sont, quant à eux, liés à la toxicité des composés issus de la transformation bio-physico-chimique des polluants introduits dans le milieu naturel.

Plus généralement, pour de nombreux auteurs, les essais en canaux artificiels constituent une passerelle entre les essais de laboratoire et les études in situ [CROSSLAND et al., 1991 ; GUCKERT, 1993 ; FRASER et KEDDY, 1997 ; RAND et al., 2000]. CAQUET et al. (2000) soulignent également l'intérêt des rivières artificielles implantées à l'extérieur. Pour eux, l'originalité de ce système est de combiner le réalisme écologique et le contrôle de certains paramètres physiques, chimiques ou biologiques.



Selon notre point de vue, les rivières artificielles constituent un lien, une passerelle, entre deux essais de complexité différente. Quelle que soit leur implantation (intérieure, extérieure ou au sein du cours d'eau), elles permettent de :

valider des effets préalablement observés à des échelles expérimentales ou à des niveaux d'organisation biologique inférieurs. Par « valider » nous entendons « vérifier la cohérence des effets observés aux deux échelles de travail » ;

émettre des hypothèses qui devront être ultérieurement validées in situ [FLUM et al., 1993 ; CAIRNS et al., 1996]. Dans ce cas, le scientifique fait implicitement l'hypothèse que les biais liés à l'artificialité du dispositif expérimental constituent un inconvénient mineur au regard des avantages apportés par le contrôle des variables les plus influentes sur la réponse des organismes [HOFFMANN, 1993] ;

évaluer la pertinence de certaines variables biologiques comme biodescripteurs d'un type de perturbation en vue d'une étude in situ. Par « pertinence », il faut ici entendre la fiabilité de la mesure, ainsi que la sensibilité de la variable biologique proposée et son aptitude à discriminer différents niveaux d'intensité de perturbation.


Chapitre 2. Le périphyton : marqueur biologique d'une perturbation.


Partie 1. Chapitre 2. Le périphyton : marqueur biologique d'une perturbation.

1. Périphyton

1.1 Définitions et terminologie La définition du terme « biofilm » doit manifestement précéder celle du terme

« périphyton ». En effet, si les définitions du terme « périphyton » varient selon les auteurs et le domaine d'étude considéré, il est clairement reconnu que le périphyton est avant tout un biofilm.

De nombreuses définitions du terme « biofilm » co-existent mais celle de WINPENNY (2000) est des plus intéressantes. Selon cet auteur, toute définition raisonnable doit intégrer :

l'idée de surface ou d'interface, qui n'est pas nécessairement de type liquide/solide, sur laquelle se développent les micro-organismes. FLEMMING et al. (2000) rappellent effectivement que les biofilms se développent par adhésion sur une surface, le substrat, au niveau d'une interface solide/liquide, comme dans le cas du périphyton, mais aussi d'une interface solide/air ou air/liquide ;

la matrice de polymères extracellulaires qui enveloppe et protège les micro-organismes présents dans le biofilm ;

la notion de communauté et des propriétés fonctionnelles liées à la structure et la composition des biofilms.

Quant au terme « périphyton », il désigne à l'origine la couverture biologique recouvrant les macrophytes mais, comme le souligne WETZEL (1983), les définitions actuelles les plus communément admises sont moins restrictives et ne limitent pas la nature des substrats colonisés aux macrophytes. Ainsi, le terme allemand « aufwuchs » qui signifie « se développer sur » est fréquemment utilisé dans les publications [BIGGS, 2000]. Pour GENTER et AMYOT (1994), le périphyton désigne toutes communautés microbiennes associées à une surface.

Enfin, selon la nature du substrat colonisé, une terminologie plus fine est parfois adoptée. A titre d'exemple :

l'épiphyton désigne le périphyton colonisé sur les végétaux, l'épilithon désigne le périphyton colonisé sur supports minéraux

grossiers, tels que les cailloux, les rochers, ou les galets, l'épipelon désigne le périphyton colonisé sur la vase, l'épipsammon désigne le périphyton colonisé sur le sable

[BOURRELY, 1981 ; ALOI, 1990 ; BIGGS, 2000].



WETZEL (1983) définit le périphyton comme un assemblage de micro-organismes vivant à la surface de substrats immergés d'origine minérale ou organique et qui par ailleurs peuvent être vivants ou morts. Principalement composé d'algues et de bactéries, le périphyton contient également des champignons, des protozoaires (animaux unicellulaires) et des micro-métazoaires (animaux pluricellulaires).

Cette définition est très consensuelle mais les précisions et/ou restrictions suivantes sont parfois apportées :

la présence d’animaux n'est pas toujours prise en compte ; le terme de phytobenthos apparaît alors plus pertinent ;

selon KOSTEL et al. (1999), le périphyton est exclusivement présent dans les zones euphotiques des milieux aquatiques, ce qui signifie qu'il est susceptible de contenir des organismes phototrophes ; toutefois, certaines espèces algales ont été trouvées dans des zones non éclairées telles que des grottes ce qui suggère qu'elles sont capables d'adopter un comportement hétérotrophe [CAZAUBON 2004, communication personnelle] ;

les organismes, vivants, sénescents ou morts, sont noyés dans une matrice complexe composée de polysaccharides et de protéines sécrétés par les organismes eux-mêmes [MASSARET et al., 1998 ; AINSWORTH et GOULDER, 2000a] ; la matrice renferme également des matières détritiques, ainsi que des substances dissoutes et particulaires adsorbées [COSTERTON et LEWANDOWSKI, 1995 ; COSTERTON, 1999 ; Figure 1].

Si la plupart des définitions s'attardent sur la complexité du périphyton du fait de sa diversité, toutes n'évoquent pas son évolution temporelle contrairement à SAND-JENSEN (1983) qui décrit le périphyton comme un assemblage dynamique. Au cours de sa formation, une succession de différentes espèces est observée [WIMPENNY, 2000 ; Mc CORMICK et STEVENSON, 1991]. Plus généralement, l'évolution est continue tant au niveau de la composition, que de la structure ou du fonctionnement du périphyton [Mc BAIN et al., 2000]. Les thèses de BENMOUSSA (1995) et BRUNET (2000) fournissent une revue synthétique de la dynamique de croissance du périphyton.

Le travail présenté dans le cadre de cette thèse porte sur l'épilithon ; il s'agit ici d'un biofilm mixte contenant des organismes hétérotrophes et des organismes phototrophes.



1.2 Organismes périphytiques et matrice polymérique

Face à la multitude des définitions, il semble important de retenir que les biofilms ont deux composantes principales : les micro-organismes et la matrice des substances polymériques [CHARACKLIS et al., 1989a].

Les organismes composant les biofilms constituent un assemblage d'une extrême variété. Ils sont procaryotes ou eucaryotes, unicellulaires ou pluricellulaires, autotrophes (phototrophes, chimiotrophes) ou hétérotrophes. Ces organismes appartiennent à des niveaux trophiques différents : les producteurs primaires (organismes autotrophes), les décomposeurs (bactéries hétérotrophes) et les consommateurs (protozoaires brouteurs). Ils entretiennent des relations bénéfiques, telle la consommation des exsudats algaux par les bactéries, mais aussi des relations compétitives susceptibles de conduire à la prédominance de certaines espèces. La prédominance d'une espèce étant favorisée par des conditions de développement adéquates et un temps de génération court [CHARACKLIS et al., 1989b].

Certains auteurs associent le périphyton à un microcosme fonctionnel car il est le siège de processus internes et externes assurés par des organismes autotrophes et hétérotrophes [HANSSON, 1989 ; KOSTEL et al., 1999]. WATANABE et al., (1988), précisent que le fonctionnement du périphyton résulte de l'interaction entre ces différents processus.

Le périphyton joue un rôle essentiel, sinon central, dans le fonctionnement des écosystèmes aquatiques car il est le siège de processus auto- et hétérotrophes intervenant dans certains cycles biogéochimiques [KOSTEL et al., 1999]. Les cycles peuvent être définis comme l'ensemble des processus qui assurent le recyclage des différents éléments constitutifs de la matière vivante par transformation d'un état organique en un état minéral et inversement. Par sa composante algale, le périphyton contribue largement à la production primaire, c'est-à-dire la synthèse de matière organique à partir de matière minérale par photosynthèse, dans les cours d'eau. Il constitue ainsi une source de nourriture importante pour les invertébrés [CATTANEO et KALFF, 1980] et leur sert également de refuge [KOSTEL et al., 1999].

Les polymères extracellulaires sont sécrétés par les organismes du biofilm et peuvent, à ce titre, être qualifiés de polymères (macromolécules) biosynthétiques. Le gel formé par la matrice polysaccharidique est présenté sur la photographie ci-dessous prise au microscope électronique à balayage (MEB) sur une culture de Pseudomonas putida (Photo 1) dans le cadre des travaux de thèse de MURIS (2004) sur un biofilm bactérien monospécifique épipsammique. La préparation nécessaire à la photographie détruit en grande partie la matrice mais celle-ci reste visible par endroits.



Les polymères extracellulaires sont de compositions chimiques très variées ; typiquement, ils comprennent des carbohydrates, des protéines, des acides nucléiques, des acides humiques et des phospholipides dans des proportions variables [FLEMMING et al. 2000]. La nature des composés sécrétés diffère d'une espèce à l'autre [DAVIES, 2000] ; elle est aussi fonction de l'état physiologique de l'organisme [CHRISTENSEN et CHARACKLIS, 1989].

La présence de cette matrice polymérique assure l'intégrité du biofilm. Elle joue un rôle essentiel dans la protection des organismes contre les agressions extérieures naturelles (crues) ou anthropiques (polluants...) et les facteurs intrinsèques du milieu naturel biotiques (broutage) ou abiotiques (siltation) [DAVIES, 2000 ; FLEMMING et al., 2000].

Les polymères extracellulaires forment un gel de structure poreuse dont les capacités d'adsorption sont importantes. Le piégeage ou le relargage des éléments nutritifs est ainsi régulé par des processus d'échanges ioniques [FREEMAN et al., 1995] entre la colonne d'eau et la matrice polysaccharidique dont la nature polyanionique a été démontrée [GUIBAUD et al., 2003]. Par ailleurs, les propriétés de la matrice permettent l'adsorption de composés organiques hydrophobes provenant de la colonne d'eau [MARSHALL, 1980].

La matrice agit comme une barrière de diffusion [LOCK et al., 1984 ; JONES et LOCK, 1989]. Elle se caractérise par la variété des micro-environnements qu'elle contient et qui constituent de micro-habitats possibles pour les organismes susceptibles de s'y développer. A titre d'exemple, nous pouvons citer la présence de zones aérobies et anaérobies du fait de l'établissement d'un gradient de la concentration en oxygène au cours de la formation du biofilm [CHARACKLIS et MARSHALL, 1989 ; Figure 1]. Cette propriété confère aux biofilms une complexité supplémentaire liée à la variabilité spatiale des organismes.

Pour conclure, les organismes vivants fixés à la surface d'un support au sein d'une matrice polymérique bénéficient d'échanges inter-cellulaires favorisés du fait de la proximité des organismes. Des interactions existent entre les organismes, entre les organismes et les composés abiotiques contenus dans la matrice, entre les organismes et le substrat et, enfin, entre les organismes et la colonne d'eau. Deux types d'interactions peuvent être distingués : celles existant au sein du biofilm et celles impliquant le milieu extérieur [CHARACKLIS et al., 1989b].



Figure 1. Représentation schématique d'un biofilm [HAMILTON et CHARACKLIS, 1989].

Photo 1. Culture de Pseudomonas putida vue au MEB [MURIS, 2004].

Résidu de la matrice polymérique

1.3 Les facteurs influant sur le développement du périphyton Les communautés d'algues benthiques en eau courante sont dépendantes d'un

ensemble de facteurs physiques, chimiques et biologiques dont les interactions influent sur la biomasse, la composition spécifique, la physiologie et la physionomie des communautés [PETERSON, 1996].

Le schéma synthétique proposé par BIGGS (2000) illustre les principaux facteurs agissant sur les variations de biomasse d'un biofilm. Il est important de noter que ce schéma considère les facteurs isolément. En réalité, les caractéristiques du périphyton sont déterminées par l'interaction de plusieurs facteurs.



Pour illustrer la complexité de ces interactions, considérons l'influence de la teneur en éléments nutritifs d'une part et, la vitesse du courant d'autre part. De nombreux travaux montrent que les teneurs en azote et, plus particulièrement, en phosphore sont déterminantes sur le développement du périphyton [PRINGLE, 1987 ; BOTHWELL, 1989 ; ROSEMOND et al., 1993]. La vitesse du courant facilite l'accessibilité des organismes aux éléments nutritifs par réduction de la couche limite de diffusion au-dessus des substrats, ce qui a pour conséquence de favoriser le développement du biofilm [HORNER et WELCH, 1981 ; BENMOUSSA, 1995, BIGGS, 1996a]. Inversement, au-delà d'une certaine valeur de la vitesse d'écoulement, l'attachement initial des cellules sur le substrat est retardé [BIGGS et STOKSETH, 1996]. De même, sur un biofilm existant, les phénomènes d'arrachage deviennent prépondérants et la biomasse tend à diminuer [HORNER et WELCH, 1981]. Compte tenu de la variabilité des conditions expérimentales et des systèmes de mesures utilisés par les auteurs ayant travaillé sur cette interaction « éléments nutritifs/vitesse », nous nous contentons ici d'exposer les tendances observées sans donner de valeurs.

La température est également un facteur influant sur l'augmentation de la biomasse périphytique dans la mesure où elle agit sur le métabolisme de la cellule [DENICOLA, 1996] et par conséquent, sur son taux de division [BIGGS, 2000].

L'éclairage est reconnu comme un facteur favorisant le développement de la communauté périphytique du fait de la présence des organismes phototrophes [VANNOTE et al., 1980]. L'intensité lumineuse stimule la croissance algale [STEINMAN et Mc INTIRE, 1987] jusqu'à une certaine limite au-delà de laquelle elle inhibe la production primaire ; on parle de photoinhibition. La qualité du spectre émis influe sur la composition du biofilm (voir la discussion de nos résultats).

L'effet du broutage est surtout important dans un environnement physiquement stable car l'instabilité limite la capacité des invertébrés brouteurs à se fixer sur le biofilm [STEINMAN et al., 1991]. Dans ces conditions, l'effet du broutage tend à freiner l'accumulation de biomasse [ROSEMOND et al., 1993]. Une revue détaillée de l'effet de ce facteur est proposée par STEINMAN (1996).

La stabilité du substrat est aussi un facteur déterminant sur la biomasse autotrophe. Elle limite l'effet des perturbations hydrauliques comme les crues [BIGGS et al., 1999].

La présence de matières en suspension tend également à limiter l'accumulation de biomasse sous l'effet de l'abrasion ou de l'érosion du périphyton [BIGGS et CLOSE, 1989].



Low growing tightly adhering

Erect, stalked and/or filamentous taxa

Figure 2. Effets contrastés des principaux facteurs agissant sur la biomasse du biofilm [BIGGS, 2000].

1.4 Intérêt écologique du périphyton : son rôle dans la dégradation de la matière organique

On l’a vu, le périphyton joue un rôle essentiel dans les cycles de la matière au

sein des écosystèmes aquatiques, notamment dans le cycle de la matière organique. Cette fonction est en partie assurée par les activités enzymatiques extracellulaires capables de catalyser l'hydrolyse de polymères autochtones ou allochtones en molécules facilement et directement assimilables par les bactéries [CHRÓST, 1989 ; CHRÓST, 1991].

Compte tenu de ces observations, il nous semble important de rappeler quelques généralités sur les activités enzymatiques hétérotrophes du périphyton.

Préalablement au développement de ces points, quelques définitions relatives à la classification des composés organiques et des enzymes sont rappelées. Il s'agit uniquement d’expliciter les termes utilisés dans la suite de ce document afin d’en faciliter la lecture.



1.4.1 Composés organiques : terminologie

Les glucides sont des hydrates de carbone de formule générale « Cn(H2O)n ». Les glucides sont caractérisés par la présence d'une fonction alcool, c’est-à-dire d’un groupement hydroxyle (primaire ou secondaire) sur tous les carbones sauf un qui possède une fonction carbonyle (aldéhyde ou cétone). Selon leur structure, ces composés sont classés en monosaccharides (ou sucres simples), oligosaccharides et polysaccharides.

Les monosaccharides sont des hydrates de carbone qui ne peuvent être hydrolysés en composés plus simples, ce sont des oses. Les oligo- et polysaccharides sont inversement constitués de plusieurs unités monosaccharidiques hydrolysables, ce sont des osides. Les oligosaccharides les plus courants sont des disaccharides, c'est-à-dire deux monosaccharides liés entre eux par une liaison glycosidique (C-O-C). La stéréochimie des liaisons reliant les différentes unités est très stricte. Les liaisons sont établies entre deux positions carbonées précises et selon des orientations déterminées.

Les polysaccharides peuvent se présenter aussi bien sous une forme linéaire que ramifiée. Certains comportent des parties glucidiques dites « glycone » et/ou non glucidiques dites « aglycones ».

Les protéines sont constituées d’une ou plusieurs chaînes polypeptidiques. Chaque chaîne polypeptidique est un copolymère linéaire d’acides aminés. Elles sont caractérisées par une extrémité N-terminale qui marque par convention le début de la chaîne par opposition à l’extrémité C-terminale. Lorsque les protéines contiennent des portions glucidiques soudées latéralement par des liaisons covalentes elles sont alors qualifiées de glycoprotéines.

Les lipides sont des composés organiques naturels caractérisés par la présence d'acides gras.

1.4.2 Enzymes : définitions et terminologie

ALBERTS et al. (1994) définissent les enzymes comme des catalyseurs protéiques hautement spécifiques. Elles accélèrent une réaction en diminuant l’énergie d’activation nécessaire à une transformation chimique donnée. Les isoenzymes sont des enzymes différentes catalysant la même réaction. WETZEL (1991) définit les enzymes agissant à l'extérieur de la cellule comme des enzymes extracellulaires. Elles peuvent être liées à la membrane cellulaire ou, dans une moindre mesure, libres dans la colonne d'eau ou dans la matrice s'il s'agit d'un biofilm.



La définition proposée par CHRÓST (1991) est plus restrictive. Selon lui, les enzymes agissant à l'extérieur de la cellule, par opposition aux enzymes intracellulaires, sont des ectoenzymes ou des enzymes extracellulaires. Les ectoenzymes sont sécrétées par la cellule et traversent activement la membrane cytoplasmique mais restent associées à la cellule productrice. Elles sont liées à la surface de la cellule ou localisées dans l'espace périplasmique dans le cas des bactéries gram-négatives. Les enzymes extracellulaires sont les enzymes libres dans l'eau ou adsorbées sur une surface minérale ou organique autre que celle de la cellule productrice. Elles sont sécrétées par des cellules vivantes ou libérées dans le milieu suite à une dégradation de la cellule. Elles peuvent être aussi libérées sous l'action du « sloppy feeding » des bactéries par les protozoaires.

La plupart des ectoenzymes et des enzymes extracellulaires appartiennent à la classe des hydrolases. Elles catalysent l'hydrolyse de diverses liaisons covalentes, telles que des liaisons ester et glycosidiques (C-O), des liaisons peptidiques (C-N) ou phosphates (O-P) [WETZEL, 1991 ; AUDIGIÉ et ZONSZAIN, 1995]. Selon la terminologie de CHRÓST (1991), les ectoenzymes qui catalysent l'hydrolyse d'une liaison située à une extrémité du substrat provoquant la libération d'un monomère sont des exo-ectoenzymes. Les ectoenzymes qui agissent sur des liaisons centrales générant ainsi des fragments de tailles intermédiaires sont des endo-ectoenzymes.

1.4.3 Enzymes extracellulaires : dégradation de la matière organique

La matière organique dissoute dans les écosystèmes aquatiques est essentiellement présente sous la forme de polymères, c'est-à-dire de macromolécules [CHRÓST, 1991]. Ces composés organiques ne sont pas directement assimilables par les bactéries du fait de leur taille et de leur forte masse moléculaire [CHAPPELL et GOULDER, 1992], limitant ainsi leur croissance et leur activité métabolique [SINSABAUGH et al., 1997].

Les études récemment menées vont cependant à l’encontre de cette première hypothèse en montrant que de faibles teneurs en matière organique dissoute facilement et directement utilisable sont parfois associées à une production bactérienne importante. Ces observations suggèrent que la matière organique utilisable par les bactéries hétérotrophes ne se limite pas aux composés de faible masse moléculaire mais peut être étendue aux polymères. Les différents travaux menés sur le sujet montrent que les macromolécules sont effectivement utilisées par les bactéries hétérotrophes après transformation en monomères ou oligomères directement assimilables [CHRÓST, 1989 ; MÜNSTER, 1991 ; ZHENG et al., 2002].

Dans les milieux aquatiques, la plupart des bactéries sont capables de dégrader des macromolécules par l'intermédiaire d'enzymes agissant à l'extérieur de la cellule. Ces polymères représentent ainsi une source nutritionnelle importante pour les



organismes ; leur conversion en monomères puis en biomasse bactérienne est une étape essentielle de la boucle microbienne. La production bactérienne est ensuite une source potentielle de nourriture pour les niveaux trophiques supérieurs. Enfin, l'oxydation de la matière organique par les bactéries hétérotrophes permet le relargage d'éléments nutritifs, tels que les ions phosphate et ammonium, qui sont ensuite utilisés par la communauté algale [ZHENG et al., 2002].

De nombreuses études tendent à souligner l'importance de la composante périphytique, associée à une surface, par comparaison à la composante planctonique vivant dans la colonne d'eau [GEESEY, 1978 et al. ; WETZEL, 1991 ; CHAPPELL et GOULDER, 1994].

Selon CHAPPELL et GOULDER (1992), ces observations confirment le modèle de fonctionnement des biofilms épilithiques en milieux lotiques proposé par LOCK et al. (1984). Ce modèle suggère que les polymères organiques synthétisés par les organismes autotrophes du biofilm sont retenus dans la matrice polysaccharidique. Les polymères sont ensuite successivement transformés en oligomères puis en monomères assimilables par les bactéries sous l'effet d'enzymes extracellulaires synthétisées par les micro-organismes ou provenant de la colonne d'eau.

Les enzymes extracellulaires jouent ainsi un rôle essentiel dans la croissance et le métabolisme des organismes hétérotrophes épilithiques et, plus généralement, dans le fonctionnement des cours d'eau du fait de leur implication dans les processus minéralisateurs de la matière organique. Elles participent de ce fait directement ou indirectement au recyclage interne des nutriments minéraux et organiques, c'est-à-dire aux cycles biogéochimiques de la matière.

Dans les milieux aquatiques, les ectoenzymes telles que la β-D-glucosidase, la leucine-aminopeptidase et la phosphatase alcaline sont à l'origine de l'hydrolyse d'une part importante des composés organiques de forte masse moléculaire comme les polysaccharides, les protéines et acides nucléiques [CHRÓST, 1991 ; MÜNSTER, 1991].

La synthèse des enzymes β-D-glucosidases et leucine-aminopeptidases est attribuée à la composante hétérotrophe des biofilms. Le paragraphe suivant est consacré à la présentation de ces deux enzymes car leur activité a été évaluée dans le cadre de nos essais expérimentaux effectués en canaux artificiels.

1.4.4 Enzymes β-D-glucosidase et Leucine aminopeptidase

La leucine aminopeptidase est largement répandue dans les milieux aquatiques et la plupart des études suggèrent qu'elle est systématiquement associée aux bactéries hétérotrophes [CHRÓST, 1991]. Il s'agit d'une enzyme protéolytique capable de catalyser la rupture d'une liaison peptidique d'un polypeptide ou d'une protéine. Les termes de protéase et peptidase sont également utilisés. La rupture de la liaison



covalente se faisant par hydrolyse, cette enzyme appartient de ce fait à la classe des hydrolases [KRUH, 1975].

Les peptidases se répartissent en exopeptidases et endopeptidases. Les premières provoquent la rupture de la liaison adjacente à l'extrémité N-terminale ou C-terminale de la molécule. Les secondes agissent en divers point de la séquence [GONZALES et ROBERT-BAUDOUY, 1996]. La leucine aminopeptidase agit sur la liaison adjacente de l'acide aminé terminal d'un polypeptide provoquant le détachement de cet acide aminé, la leucine (C6H13NO2), d'où le terme d'aminopeptidase (Figure 3). En conclusion, cette enzyme protéolytique facilite ainsi la dégradation des protéines et des polypeptides en oligopeptides et acides aminés assimilables par les bactéries hétérotrophes [AINSWORTH et GOULDER, 2000a].

Figure 3. Classification des peptidases [GONZALES et ROBERT-BAUDOUY, 1996].

H2N X1 X2 X3 X4 X5 X6 COOH

N-terminal C-terminal

Exopeptidase : (aminopeptidase)

Endopeptidase

Exopeptidase(carboxypeptidase)

La β-D-glucosidase est synthétisée par les micro-organismes hétérotrophes,

principalement les bactéries et champignons vivant en milieux marins ou en eaux douces. Il s'agit d'une enzyme capable de catalyser la rupture d'une liaison glycosidique d'un composé polysaccharidique. Cette rupture se fait par hydrolyse. Cette enzyme appartient de ce fait à la classe des hydrolases et des glycosidases.

La β-D-glucosidase catalyse l'hydrolyse des liaisons β 1∏ 2,1∏ 3,1∏ 4, 1∏ 6 de disaccharides de glucose, de cellulose et de carboxyméthylcellulose. L'affinité de l'enzyme est supérieure pour les parties glucidiques (glycane) des composés organiques. Selon CHRÓST (1991), les aryl-glycosides sont généralement de meilleurs substrats que les alkyl-glycosides. La β-D 1,4 glucosidase catalyse plus spécifiquement l'hydrolyse des β-disaccharides de glucose [SOMVILLE, 1984].

Les enzymes leucine aminopeptidases et β-D-glucosidases existent principalement sous une forme associée à une surface vivante ou inerte et non sous une forme libre et dissoute dans le milieu [WETZEL, 1991]. Par ailleurs, l'activité de ces enzymes reflète les conditions environnementales du milieu. Pour ces deux raisons, les



activités liées aux enzymes leucine aminopeptidases et β-D-glucosidases sont des biomarqueurs a priori intéressants.

1.4.5 Utilisation des enzymes β-D-glucosidases et Leucine aminopeptidases comme biomarqueur

L'évolution des activités enzymatiques en fonction des conditions environnementales a été démontrée à maintes reprises.

En milieux lotiques, deux problématiques sont fréquemment abordées. Certains auteurs s'intéressent aux capacités bio-épuratrices du milieu et pour cela, utilisent les activités enzymatiques pour évaluer les effets d'un rejet urbain (station d'épuration, eaux pluviales) ou industriel. D'autres auteurs étudient le fonctionnement de l'hydrosystème compte-tenu de ses caractéristiques morphodynamiques et du facteur saisonnier. Dans ce cas, l'influence de la nature géologique des bassins versants et du mode d'occupation des sols (forêts, cultures, prairies ou milieux urbanisés) est fréquemment considérée [CHAPPELL et GOULDER, 1992 ; CHAPPELL et GOULDER, 1994].

Le suivi des ces activités est parfois couplé à l'étude de l'assimilation bactérienne du produit libéré sous l'action de l'enzyme [AINSWORTH et GOULDER, 1998 ; AINSWORTH et GOULDER, 2000a ; AINSWORTH et GOULDER, 2000b]. Cette approche améliore la compréhension de certaines observations ; à titre d'exemple, AINSWORTH et GOULDER (2000a) constatent que le taux d’assimilation de la leucine est toujours plus faible que l’activité Leucine-aminopeptidase responsable de l’hydrolyse de la leucine. Ils concluent que la leucine et, implicitement, la concentration en acides aminés dans le milieu ne constituent pas un facteur limitant pour le développement des bactéries.

2 Intérêt du périphyton comme marqueur biologique d'une perturbation

L'utilisation du périphyton comme indicateur d'un stress biotique ou abiotique

peut se justifier non seulement par des critères écologiques, tel que son rôle dans le cycle de la matière, mais aussi parce qu'il satisfait certains des critères énoncés par CAIRNS et al. (1993) pour le choix des marqueurs biologiques. Par exemple :

son ubiquité : il colonise tous types de milieux aquatiques à toutes saisons [LOWE et al., 1996 ; KOSTEL et al., 1999] ;

son abondance et la simplicité des opérations de collecte et de transport qui n'impliquent que du matériel classique de laboratoire ;



son mode de vie sédentaire : fixé à la surface des substrats immergés, il intègre et reflète les conditions physiques et biologiques de l'environnement dans lequel il se trouve, contrairement aux organismes qui peuvent dériver, que ce soit de manière passive ou active, et ainsi « fuir » la perturbation. Les possibilités de déplacement des organismes conditionnent en effet la fiabilité de la détection des zones polluées : la précision sera d'autant meilleure que les organismes utilisés comme marqueurs biologiques auront des capacités de déplacement plus limitées [LAGADIC et al., 1998].

son taux de reproduction élevé qui conduit à une intégration rapide des changements environnementaux biotiques ou abiotiques [Mc INTIRE, 1993 ; Mc CORMICK et CAIRNS, 1994 ; LOWE et al., 1996] et permet une visualisation des effets sur plusieurs générations [CULP et al., 2000a]. L'intégration des variations environnementales est plus rapide que celle qui serait observée sur des organismes supérieurs [GOLD et al., 2002].

A ces critères généraux, nous pouvons également ajouter des critères spécifiques inhérents à la composition et à la structure du périphyton :

sa diversité taxonomique : elle lui confère une sensibilité modérée, et non une réponse « tout ou rien » à une large gamme de stress biotiques ou abiotiques [LOWE et al., 1996 ; KOSTEL et al., 1999 ; BARRANGUET et al., 2003] ; la sensibilité aux polluants est en effet extrêmement variable selon les espèces [FORBES et FORBES, 1997] ;

ses capacités d'adsorption de composés (ou éléments) minéraux ou organiques [FLEMMING, 1995]. Rappelons ici que l'adsorption est en premier lieu un phénomène de surface mettant en jeu des liaisons faibles ;

son niveau d’organisation biologique : la présence de producteurs, consommateurs et décomposeurs, permet de travailler à un niveau d’organisation complexe et, de ce fait, d'intégrer les relations entre les espèces d'un même niveau trophique ou de niveaux trophiques différents.

La capacité d'adsorption des métaux par les biofilms est très documentée [BROWN et LESTER, 1979 ; CHARACKLIS et al., 1989a]. Dans ce cadre, l'adsorption peut se faire entre un métal et un ou plusieurs constituants périphériques de la bactérie. BAUDA (1985) explique que les bactéries caractérisées par une forte charge négative réagiraient, en présence de cations métalliques comme des résines échangeuses d'ions.



La capacité du biofilm à fixer les polluants ou substances lipophiles est également abordée par quelques auteurs [NAPOLITANO et al., 1994]. Les composés dits « lipophiles » présentent une affinité pour les milieux organiques et, plus particulièrement, pour les lipides polaires tels que les phospholipides et glycolipides qui sont des constituants de la membrane cellulaire.

Enfin, sa situation à la base de la chaîne trophique fait du périphyton un marqueur biologique intéressant car un impact sur sa composition ou sur son fonctionnement peut, a priori, fortement altérer les niveaux trophiques supérieurs [LEWIS, 1992 ; BOTHWELL, 1992 ; DUBÉ et CULP, 1996 ; KOSTEL et al., 1999]. Ainsi, l'effet d'une perturbation anthropique rapidement diagnostiquée sur le périphyton peut permettre de limiter les effets potentiels indirects et visibles à plus long terme à des niveaux trophiques supérieurs.

3. Biodescripteurs périphytiques Que ce soit sur le terrain ou au laboratoire, deux approches co-existent pour

évaluer l'impact d'une perturbation d'origine naturelle ou anthropique sur le périphyton.

La première approche porte sur la détermination de la composition taxonomique par microscopie d'une ou plusieurs composante(s) du périphyton [HILL et al., 2000]. La composante la plus communément étudiée est la communauté algale [Mc CORMICK et CAIRNS, 1994 ; PRYGIEL et al., 1996 ; HILL et al., 2003a]. L'algologie a toujours fait une place particulière aux diatomées dont l'identification n'est pas immédiate car elle nécessite une préparation préalable afin d'observer l'ornementation du squelette [RUMEAU et COSTE, 1988]. La coloration brune des plastes est due à des pigments photosynthétiques particuliers, les xantophylles, dont le plus connu est la fucoxanthine. La détermination de la composition taxonomique algale permet ensuite le calcul de nombreux indices destinés à appréhender la qualité de l'eau. Le plus courant est l'indice biologique diatomique (NF T90-354). La détermination taxonomique des bactéries par microscopie est rendue difficile voire impossible du fait de la simplicité de leurs caractères morphologiques. Cette composante ne peut donc pas être étudiée par cette méthode.

La seconde approche porte sur l'évolution de paramètres fonctionnels du périphyton indépendamment de la connaissance des espèces qui le composent. Elle porte généralement sur le suivi d'activités métaboliques ayant un rôle essentiel dans le fonctionnement global de l'écosystème. Il peut s'agir d'une activité globale (la respiration), d'une activité autotrophe (la photosynthèse), d'une activité hétérotrophe (certaines activités enzymatiques) ou d'une activité spécifique propre à une communauté fonctionnelle (la nitrification ou dénitrification).



Ces deux approches sont nécessaires pour avoir une bonne représentation de l'impact d'une perturbation sur le périphyton [MULHOLLAND et al., 1995]. Un effet sur le fonctionnement n'implique pas nécessairement un effet sur la structure, notamment en cas de récupération ou d'adaptation des organismes. Plus généralement, sauf en cas de mortalité directe, les effets liés au métabolisme sont plus sensibles que ceux liés à des changements de structure. La réalité est cependant plus complexe car un changement de structure peut être observé sans que le métabolisme semble perturbé [GESSNER et CHAUVET, 2002]. Soit la (ou les) fonction impactée n'a pas été mesurée, soit la fonction n'est pas propre aux espèces impactées et d'autres espèces ont pris le relais.

L'approche taxonomique étant longue, fastidieuse et coûteuse, de nombreux auteurs se limitent à des paramètres de structure globaux (biomasse algale et biomasse bactérienne). Ces dernières années, le recours à des méthodes qui permettent d'évaluer la diversité d'une communauté tout en s'affranchissant d'une identification par microscopie est de plus en plus fréquent. A titre d'exemple, le dosage des pigments photosynthétiques conduit à la détermination de la diversité pigmentaire et, par calcul, à l'estimation des groupes algaux présents [WILHEM et al., 1991 ; HAVENS et al., 2000]. L'application des techniques moléculaires à l'écologie microbienne permet à présent de s'intéresser davantage à la diversité des communautés eucaryotes ou procaryotes.

Le choix plus précis des variables biologiques suivies doit être fonction de la nature des effets recherchés et de la maîtrise des protocoles de mesure.

Des articles de synthèse proposent une revue des paramètres biologiques généralement suivis pour caractériser l'évolution du périphyton [BONIN et TRAVERS, 1993 ; LAZAROVA et MANEN, 1995 ; SERVAIS, 1995 ; PARENT, 2004]. Les plus utilisés sont néanmoins ceux évoqués ci-dessus.


Chapitre 3. Composition et structure des communautés eubactériennes périphytiques : utilisation de la DGGE.


Partie 1. Chapitre 3. Composition et structure des communautés eubactériennes périphytiques : utilisation de la DGGE.

La DGGE (Denaturating Gradient Gel Electrophoresis) a pour objectif l'évaluation de la diversité dans une communauté complexe de micro-organismes sur la base de leur génotype. Cette technique repose en premier lieu sur une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) qui permet d'amplifier une région cible du génome. A l'échelle d'une communauté contenant un assemblage de micro-organismes eucaryotes et procaryotes, la spécificité de l'amplification par PCR permet ainsi d'évaluer la diversité génétique sur des critères taxonomiques ou fonctionnels.

La PCR-DGGE relève de la biologie moléculaire et trouve son origine dans le domaine médical et plus particulièrement dans le diagnostic des maladies génétiques. Initialement développée par FISHER et LERMAN en 1983 [FISCHER et LERMAN, 1983], elle connaît maintenant de multiples applications dans de nombreux autres domaines : en biochimie pour la caractérisation des protéines [GIANAZZA et al., 1998], en agroalimentaire [COCOLIN et al., 2003], dans le traitement biologique des effluents urbains [BOON et al., 2002] ou encore dans la conservation des objets d’art [SCHABEREITER-GURTNER et al., 2001]. L'application récente de la DGGE dans ce domaine peut être illustrée par les travaux de SCHABEREITER-GURTNER et al. (2002) sur les célèbres peintures paléolithiques de la grotte d’Altamira en Espagne visant à déterminer les communautés bactériennes présentes dans les pigments rouges des représentations de bisons dans le but d’identifier le rôle des micro-organismes dans les mécanismes de détérioration de ces peintures.

Comme on le verra, l’utilisation de la DGGE en écologie microbienne aquatique est largement mise à profit depuis une dizaine d’années pour l'étude de la composition et de la structure des communautés microbiennes complexes.

Cette méthode conduit à la séparation de fragments d'ADN de taille identique mais de séquences variables. Elle consiste en une électrophorèse des fragments préalablement amplifiés par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR). L’électrophorèse, c’est-à-dire la migration de particules chargées sous l’effet d’un champ électrique, s’effectue à travers un gel vertical de polyacrylamide. Ce gel, fortement réticulé et de porosité variable, contient un gradient linéaire de substances dénaturantes. Lorsque ce gradient de substances est remplacé par un gradient de température, la théorie et le principe de la méthode restent identiques mais la méthode est alors désignée par le terme TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis). En DGGE comme en TGGE, la séparation des fragments dépend de leur degré de mobilité dans le gel qui est fortement affectée par la conformation du fragment d'ADN.



Les prochains paragraphes sont successivement consacrés :

aux fondements de la méthode ; nous évoquerons les conditions de changements de conformation d’un fragment d’ADN ;

au principe de la méthode ; nous aborderons les conditions de séparation d’un mélange complexe de fragments d’ADN de séquences variables ;

au mode d’interprétation des gels obtenus.

1. Fondements de la méthode

La DGGE repose sur les propriétés physico-chimiques de l'ADN. Outre le fait que la molécule soit négativement chargée et permette ainsi la réalisation d’une électrophorèse, la DGGE exploite les conditions de rupture de sa structure bi-hélicoïdale.

La molécule d'ADN est constituée de deux brins composés d’un enchaînement de nucléotides reliés par des liaisons phosphodiester réunissant le carbone 5’ et le carbone 3’ des molécules de ribose. Ces deux brins, enroulés l’un autour de l’autre, sont anti-parallèles et forment une double hélice. Ils sont appariés par des couples de bases azotées situées à l’intérieur de la double hélice et orientées latéralement. Ces bases sont elles-même reliées par des liaisons hydrogènes situées entre les bases complémentaires Guanine (G) et Cytosine (C) d’une part, et Thymine (T) et Adénine (A) d’autre part.

Figure 4. Structure en double hélice de l'ADN [ALBERTS et al., 1994]

La stabilité de cet arrangement est expliquée par les liaisons hydrogènes et par les interactions d'empilement, également appelées « forces ou énergies d'empilement ». Il s'agit de forces de Van der Waals et d'interactions hydrophobes s'exerçant entre les cycles aromatiques de deux bases adjacentes d'un même brin.



Ces forces sont variables selon la nature des bases [EZRA et STANTON, 1992 ; JACKSON et CHURCHILL, 1999].

Les liaisons hydrogènes étant des liaisons faibles au regard des liaisons covalentes qui assurent la stabilité du squelette de la molécule (enchaînement des sucres et phosphates), la structure centrale de la molécule constitue ainsi une zone de moindre résistance. En conséquence, la rupture de la forme bi-hélicoïdale d'un fragment d'ADN, c'est-à-dire la séparation des deux brins qui le composent, peut être aisément obtenue in vitro par un traitement chimique ou thermique. Cette séparation, due à la rupture des liaisons hydrogènes, conduit à la dénaturation de l'ADN. Le fragment adopte alors une conformation simple brin, partielle ou totale. La transition de la conformation double-brin à simple-brin est décrite comme la fusion de l'ADN. La température de fusion d'un fragment d'ADN (Tm) est la température à laquelle 50% de l'ADN est sous la forme double brin et 50% sous la forme simple brin. La dénaturation d’un fragment n’est pas un phénomène continu, elle s’effectue au contraire étape par étape sur des zones distinctes du fragment caractérisées par des températures de fusion différentes. Ces zones constituent des domaines de fusion, elles contiennent généralement 50 à 300 paires de bases [MYERS et al., 1987]. Selon sa longueur, un fragment d’ADN comprend un nombre variable de domaines de fusion. EZRA et STANTON (1992) estiment qu'une molécule contenant plus de 200 paires de bases comporte au moins deux domaines de fusion. La dissociation totale des deux brins est alors précédée de conformation(s) intermédiaire(s) où la fusion locale des deux brins peut être observée aux extrémités et/ou à l'intérieur de la molécule.

En conclusion, deux brins d’ADN se séparent sous l’effet d’un traitement thermique ou chimique dès lors que la température de fusion d’un domaine est atteinte. L'appariement GC étant le siège de trois liaisons hydrogènes alors que l'appariement AT n'en contient que deux, les liaisons hydrogènes d'un ADN riche en GC confère plus de stabilité à la molécule qu'un ADN riche en AT. Il existe donc une relation directe entre le contenu en GC et la stabilité de la molécule. La dispersion des bases GC serait également un facteur influant. Compte tenu des forces d'empilement, la température de fusion est aussi fonction de l'ordre des bases.

2. Principe de la méthode La séparation des fragments d’ADN de même taille est effectuée par

électrophorèse sur un gel de polyacrylamide contenant un gradient supposé linéaire et croissant de substances dénaturantes. Le gel est immergé dans une solution tampon maintenue à une température légèrement inférieure à la température de fusion du domaine le moins stable (généralement 60°C).



Le principe de séparation des fragments d’ADN repose sur les hypothèses suivantes :

deux fragments d'ADN qui ne diffèrent que d'une seule paire de bases ont une température de fusion différente ;

la fusion d'un fragment d'ADN se produit sous l'effet combiné de la concentration en substances dénaturantes et de la température du bain ;

la rupture de la structure bi-hélicoïdale d'un fragment affecte sa mobilité électrophorétique au sein du gel ;

la vitesse de migration d'un fragment dépend principalement de sa conformation, de la porosité du gel et du voltage appliqué ; l'influence de la masse moléculaire des fragments est non significative [MYERS et al., 1987 ; EZRA et STANTON, 1992 ; MUYZER et al., 1993 ; JACKSON et CHURCHILL, 1999].

Lors de l'analyse, le gel est positionné verticalement et la migration des fragments s'effectue de la concentration en substances dénaturantes la plus faible vers la concentration la plus forte, parallèlement au champ électrique. Les fragments initialement introduits sous une forme entièrement hélicoïdale migrent sous l’influence de ce champ électrique jusqu’à ce que la concentration en substances dénaturantes provoque la dissociation de l'ADN double-brin du domaine de fusion le moins stable [EZRA et STANTON, 1992 ; Figure 5]. Ce changement de conformation entraîne une perte de mobilité. La migration du fragment est fortement ralentie voire stoppée du fait de sa structure plus encombrante [MUYZER et al., 1993]. La perte de vitesse est d'autant plus marquée que la longueur de la zone simples-brins est importante.

Migration Gradient de concentrations

Dénaturationpartielle de l'ADN

Zone simples-brins

Figure 5. Principe schématique de la DGGE [DORIGO, communication personnelle 2004].



La migration des fragments d’ADN double-brin présentant des différences de séquences dans leur domaine de fusion le moins stable est ainsi ralentie, ou stoppée, à des positions variables le long du gradient de concentrations en substances dénaturantes. En fin d’analyse, les fragments stoppés sont visualisés par coloration ou marquage de l’ADN, invisible à l'œil nu, fournissant ainsi « l’empreinte génétique » de l’échantillon. Le profil d'un échantillon se compose d'un nombre variable de bandes horizontales disposées verticalement le long du gradient de concentrations. Une bande symbolise en théorie un génotype.

Photo 2. Un gel DGGE (image négative).

1 bande

1 profil

Sens de la migration

Gradient dénaturant croissant

La migration des molécules contenant plusieurs domaines de fusion est

fortement ralentie au premier domaine et stoppée au deuxième [EZRA et STANTON, 1992]. En pratique, le ralentissement est tel que la fusion du second domaine s’effectue après une durée de migration élevée. EZRA et STANTON (1992) estiment cette durée comme étant supérieure à 100 heures mais sachant que la vitesse de migration est aussi fonction du voltage appliqué, cette indication reste peu précise. En conséquence, la DGGE permet difficilement de détecter les variations de séquences des domaines les plus stables du fait du fort ralentissement de la molécule lorsque le premier domaine est atteint. Inversement, si les fragments possèdent un seul domaine de fusion, la résolution du gel est meilleure. Concrètement, les bandes sont plus nettes et plus fines [EZRA et STANTON, 1992].

Le principe même de la DGGE suppose par ailleurs que la fusion des fragments reste partielle et non totale. La dissociation totale des deux brins augmente en effet le degré de mobilité des fragments, comparativement à la forme partiellement dissociée, ce qui a pour conséquence de ne pas stopper leur migration dans le gel. Ce phénomène est classiquement évité par addition, aux fragments étudiés, d’une courte région d’ADN riche en CG, appelée « queue GC ». Cette région, très stable, permet la



dénaturation partielle des fragments. En d'autres termes, elle évite la dissociation complète des deux brins [JACKSON et CHURCHILL, 1999]. L'ajout d'une queue GC peut être effectué lors de l'étape d'amplification par PCR par addition d'une séquence riche en GC de 40 paires de bases sur l'une des deux amorces [EZRA et STANTON, 1992 ; MUYZER, 1999].

3. Application à l’écologie microbienne

3.1 L’intérêt d’une approche moléculaire

L'identification et la quantification des micro-organismes sont une priorité en écologie du fait de leur rôle essentiel dans le fonctionnement des écosystèmes. Cependant, la détermination de ces deux paramètres est limitée par les méthodes traditionnelles nécessitant une étape d’isolement et de mise en culture des organismes sachant que 85 à 99% des organismes sont non cultivables [LIU et al., 1993]. Il est maintenant clairement admis que cette limite a conduit à une sous-estimation de la diversité des milieux naturels. [ØVREÅS et al., 1997 ; MUYZER et SMALLA, 1998 ; RIEMANN et MIDDELBOE, 2002 ; TORSVIK et al., 2002].

Par ailleurs, les microbiologistes confrontés à l'étude de la diversité microbienne des milieux naturels mettent en avant le manque de réalisme des techniques traditionnelles nécessitant la mise en culture des micro-organismes et l'insuffisance des observations par microscopie fondées sur leurs caractéristiques morphologiques [PACE, 1997 ; TORSVIK and ØVREÅS ; 2002]. Les protocoles de mise en culture des organismes sont généralement fonction de leurs exigences de croissance les plaçant ainsi dans des milieux favorables à leur développement mais peu représentatifs de la complexité et de la diversité des habitats rencontrés en milieu naturel [MUYZER et al., 1993]. Selon DIEZ et al. (2001a), si la mise en culture d'organismes pico-eucaryotes naturels reste la meilleure technique pour les caractériser, elle n’offre néanmoins aucune garantie sur le fait que les organismes cultivés soient dominants ou importants en milieu naturel.

Quant aux observations par microscopie, celles-ci s'avèrent tout à fait satisfaisantes pour le dénombrement des cellules ou la détermination de leur taille. Cependant, dans le cas des organismes procaryotes, la simplicité de leur morphologie ne permet pas l'identification des espèces présentes [HIORNS et al., 1997 ; MUYZER, 1999 ; CODY et al., 2000]. Si les micro-organismes eucaryotes bénéficient, inversement, d'une plus grande variété de caractères morphologiques, leur identification par microscopie nécessite toutefois un investissement de temps important et l'intervention d'un expert.



Ces quinze dernières années, l'utilisation des techniques moléculaires est venue compléter les méthodes traditionnelles. Elles permettent de détecter et d'identifier les organismes au moyen de marqueurs moléculaires sans se limiter à la fraction cultivable des organismes [OLSEN et al., 1986 ; CASAMAYOR et al., 2000 ; SCHÄFER et al., 2001 ; WATANABE et al., 2001]. Ces approches sont donc plus exhaustives et plus réalistes. Elles donnent accès à une diversité jusque-là ignorée. MUYZER et SMALLA (1998) vont jusqu'à dire que ces techniques ont donné naissance à une nouvelle discipline, celle de l'écologie microbienne. Au-delà des informations relatives à la diversité des milieux, il devient maintenant possible de s'intéresser aux interactions des micro-organismes entre eux et avec leur environnement.

Une revue des techniques moléculaires adaptées à l'étude des communautés microbiennes du milieu aquatique et du sol est proposée par différents auteurs dont MUYZER et RAMSING (1995), POLY (2000), RANJARD et al. (2000) et DORIGO et al. (2004a, article soumis).

Natural sampling

Methods non basedon the PCR

Hybridization witholigonucleotid ic probes

Microscopic countingFlow cytometry analysis

FISH, TSA-FISH, FCM

PCR amplification

Cloning

Sequencing Separation byelectrophoresis

DGGE / TGGERISA / ARISA

SSCPRAPDAFLP

Enzymatic digestion

Separation byelectrophoresis

RFLPT-RFLPARDRA

Fingerprinting methods

PCR based methods

DNA reassociationkinetics

Single strand denaturation

DNA extraction

DNA reassociationRandomsequencing in

clonelibraries

Cell fixation

Natural sampling

Methods non basedon the PCR

Hybridization witholigonucleotid ic probes

Microscopic countingFlow cytometry analysis

FISH, TSA-FISH, FCM

PCR amplification

Cloning

Sequencing Separation byelectrophoresis

DGGE / TGGERISA / ARISA

SSCPRAPDAFLP

Enzymatic digestion

Separation byelectrophoresis

RFLPT-RFLPARDRA

Fingerprinting methods

PCR based methods

DNA reassociationkinetics

Single strand denaturation

DNA extraction

DNA reassociationRandomsequencing in

clonelibraries

Cell fixation

Figure 6. Représentation schématique des différentes approches moléculaires pour évaluer la diversité génétique des communautés microbiennes [DORIGO et al., 2004a]. Légende. DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, TGGE: Temperature Gradient Gel Electrophoresis, RISA : Ribosomal Intergenic Spacer Analysis, ARISA: Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis, SSCP: Single Strand Conformation Polymorphoism, RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA, AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism, (t)-RFLP: (terminal)- Restriction Fragment Length Polymorphism, ARDRA: Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis, (TSA)-FISH: (Tyramide Signal Amplification)-Fluorescence In Situ Hybridization, FCM: Flow Cytometry



3.2 Utilisation des ARNr 16S et 18S comme outils d'identification L'utilisation des gènes codant pour l'ARNr ou de leurs transcrits comme

marqueurs moléculaires phylogénétiques et taxonomiques est clairement acceptée [MUYZER et RAMSING, 1995]. Le choix des ARN ribosomaux se justifie par :

leur présence dans tous les organismes ; leur abondance dans la cellule et leur importance dans son

fonctionnement ; la présence de zones conservées dans les molécules ; la présence de régions conservées, c'est-à-dire qui ne varient pas ou très

lentement au cours de l'évolution, et de régions très variables qui sont a priori spécifique d'une espèce ;

la richesse de leur information génétique [OLSEN et al., 1986].

Les ribosomes des procaryotes et des eucaryotes contiennent trois molécules d'ARN répartis dans deux sous-unités. Chez les procaryotes, il s'agit de l'ARN 5S, 23S et 16S et chez les eucaryotes de l'ARN 5S, 18S et 28S [ALBERTS et al., 1994]. Leur mode de désignation repose sur l'expression de la vitesse de sédimentation de la molécule en unité de Sveldberg (notée S).

La plupart des études relatives à la diversité génétique des procaryotes reposent sur une comparaison des gènes codant pour l'ARNr 16S [LINDSTRÖM, 1998] mais l'ARNr 16S est également utilisé comme marqueur moléculaire [FELSKE et al., 1998]. Dans ce cas, l'analyse des données conduit à la diversité génétique des communautés métaboliquement actives. Pour les organismes eucaryotes, il s'agit des gènes codant pour l'ARNr 18S [VAN HANNEN et al., 1998 ; DIEZ et al., 2001a ; DIEZ et al., 2001b ; DORIGO et al., 2002].

3.3 Intérêt des techniques d’empreintes génétiques : cas de la DGGE

La technique de PCR-clonage a été très appliquée pour étudier la diversité des communautés naturelles. De nombreuses études ont ainsi démontré l'extrême diversité des milieux naturels soulignant par la même occasion la limite des techniques de mise en culture traditionnellement employées [DUNBAR et al., 1999 ; MOON VAN DER STAAY et al., 2001].

A présent, il apparaît nécessaire de compléter ces informations en s'intéressant à la dynamique des communautés naturelles et au rôle de la diversité dans la stabilité des équilibres dynamiques et le fonctionnement des écosystèmes [MUYZER et al., 1996 ; MUYZER, 1999]. A ces questionnements peut être ajouté celui



des facteurs environnementaux contrôlant la structure d'une communauté tant en termes de diversité taxonomique que d'abondance [CASAMAYOR et al., 2000]. Certaines de ces études, notamment celles relatives à la dynamique des communautés sous l'effet des fluctuations saisonnières ou des perturbations environnementales naturelles ou anthropiques, requièrent néanmoins un suivi des communautés dans le temps et dans l'espace multipliant ainsi le nombre d'échantillons à analyser [MUYZER et SMALLA, 1998]. Si de nombreuses techniques moléculaires co-existent, le choix de l'une d'entre elles est en partie lié au nombre d'échantillons qu'il est possible de traiter sur une période de temps raisonnable [SCHAUER et al., 2000].

C'est dans ce contexte que les techniques d’empreintes moléculaires telle que la PCR-DGGE se sont révélées plus adaptées que celle de la PCR-clonage-séquençage qui, en dépit de son efficacité, constitue une approche longue, laborieuse et coûteuse en raison du séquençage [MUYZER et RAMSING, 1995 ; MUYZER et SMALLA, 1998 ; SCHAUER et al., 2000]. Selon DIEZ et al. (2001a), la DGGE et la T-RFLP sont les deux techniques d'empreintes moléculaires qui offrent le meilleur compromis entre le nombre d'échantillons à traiter et la richesse de l'information obtenue. Toutefois, contrairement à la DGGE, la T-RFLP ne permet pas d'affiner les résultats par séquençage ou hybridation [MUYZER, 1999]. L’étude comparative de ces deux techniques réalisée par MOESENEDER et al. (1999) montre que l’intérêt de la T-RFLP est sa capacité à détecter les espèces rares. Cependant, comme le soulignent TORSVIK et al. (1998), la trop forte sensibilité d’une méthode d’empreinte moléculaire peut être un inconvénient dans le cas d’une communauté très diversifiée. Les gels sont en effet trop denses pour qu’une analyse fiable puisse être effectuée.

La DGGE fournit une visualisation directe et rapide de la diversité génétique tout en offrant la possibilité d'affiner les résultats [SCHAUER et al., 2003]. Un premier niveau de caractérisation peut consister à rechercher la présence de séquences spécifiques d'un groupe ou d'une espèce par transfert des profils DGGE sur une membrane et hybridation avec des sondes spécifiques [ØVREÅS et al., 1997]. Selon CASAMAYOR et al. (2000), la détection des bandes de faible intensité qui, à ce titre, ne sont pas toujours comptabilisées, peut être améliorée en complétant la DGGE par une hybridation sur membrane. Enfin, l'étape ultime de caractérisation est le séquençage des bandes ; dans ce cas, les bandes sont extraites du gel à l'aide d'un scalpel ou d'un rasoir, ré-amplifiées puis séquencées. Le séquençage des bandes permet l'identification et la détermination de l'affiliation génétique des espèces détectées [MUYZER et al., 1993 ; MUYZER et RAMSING, 1995 ; MUYZER et al., 1996]. Enfin, la reproductibilité de la méthode a été démontrée à plusieurs reprises sur des assemblages naturels [MURRAY et al., 1996 ; CASAMAYOR et al., 2000 ; DIEZ et al., 2001a ; DUMESTRE et al., 2001].



La PCR couplée à la DGGE a été appliquée pour la première fois en 1993 sur une communauté eubactérienne naturelle par amplification de la région variable V3 de l’ADN codant pour l’ARN 16S [MUYZER et al., 1993]. Depuis, cette technique a conduit à de nombreuses études portant sur la composante procaryote (eubactéries et archaébactéries) des écosystèmes aquatiques de surface en milieux marins, en eaux saumâtres ou en eaux douces dans des milieux lentiques, lotiques ou stagnants. Les milieux souterrains ont également été explorés [RÖLING et al., 2001]. Cette approche est maintenant étendue, mais dans une moindre mesure, aux micro-organismes eucaryotes [VAN HANNEN, 1998] et, plus récemment, aux virus [SHORT et SUTTLE, 1999 ; DORIGO et al., 2004b]. La plupart des études concerne la composante planctonique des milieux océaniques et lacustres mais la PCR-DGGE s'est également avérée tout à fait satisfaisante pour la caractérisation des communautés bactériennes issues des assemblages benthiques de rivières [BRÜMMER et al., 2000 ; CODY et al., 2000 ; ARAYA et al., 2003]. Ces études sont majoritairement effectuées en milieux naturels mais nous pouvons néanmoins noter l'émergence d'études en systèmes artificiels visant à travailler dans des conditions partiellement contrôlées. Il s'agit, par exemple, de mésocosmes lentiques d'eau douce [VAN HANNEN et al., 1999 ; RIEMANN et WINDING, 2001] ou de mésocosmes lotiques alimentés par de l'eau de mer [SCHÄFER et al., 2001].

Différentes synthèses des applications de la PCR-DGGE en écologie microbienne ont été récemment publiées [MUYZER et SMALLA, 1998 ; JACKSON et CHURCHILL, 1999 ; MUYZER, 1999].

3.4. Limites de la DGGE

Les limites spécifiques à la PCR-DGGE sont de deux types. Il est en effet possible de distinguer les limites pratiques relatives aux conditions de mise en oeuvre de la technique et les limites relatives à l'interprétation des gels obtenus. Sachant que ce dernier point fera l'objet d'un prochain paragraphe, nous ne nous intéressons ici qu'aux limites relatives à la mise en oeuvre de la technique. Il s'agit principalement de la taille des fragments adaptés à une analyse DGGE et de la définition des conditions expérimentales.

MYERS et al. (1987) estiment que 50% des variations peuvent être détectées dans un fragment compris entre 150 et 1000 paires de bases. En dessous de 150 paires de bases, la séparation des fragments n'est pas envisageable car la dissociation totale de la structure double-brin de l'ADN est trop rapide. Selon MUYZER et al. (1996) qui travaillent sur des communautés naturelles contrairement aux auteurs précédemment cités, la DGGE est adaptée à la séparation de fragments inférieurs à 500 paires de bases. Selon eux, elle permet de détecter jusqu'à 50% des variations de séquences dans



des fragments d'ADN codant pour l'ARNr 16S allant jusqu'à 500 paires de bases et ce pourcentage peut quasiment atteindre 100% lorsqu'une queue GC est ajoutée.

Une fois le couple d'amorces défini, les difficultés de mise au point et d’optimisation de la méthode concernent essentiellement la détermination du gradient de concentration en substances dénaturantes et de la durée de la migration [MUYZER et al., 1993 ; HAYES et al., 1999]. Des études expérimentales préliminaires permettent néanmoins d'aider à la définition de ces conditions. La réalisation préalable d'un gel DGGE contenant un gradient perpendiculaire de substances dénaturantes conduit ainsi à la visualisation du comportement des fragments d'ADN. Il permet non seulement d'identifier si les fragments contiennent a priori un ou plusieurs domaines de fusion mais aussi de définir la ou les températures de fusion correspondantes. Des logiciels de calculs permettent également d'accéder à ces données, mais, ils imposent la connaissance préalable des séquences en mélange ce qui n'est pas envisageable dans le cas des études relatives à la caractérisation des communautés naturelles. Cette étape est, en toute rigueur, suivie de la réalisation d'un gel contenant cette fois-ci un gradient linéaire de substances dénaturantes (celui qui aura été précédemment déterminé) dont le chargement d'un même échantillon est effectué en plusieurs fois dans le but de définir la durée de migration optimale. Celle-ci peut être définie comme la durée pour laquelle tous les fragments ont atteint leur température de fusion ce qui provoque l'arrêt de leur migration. Une durée de migration trop courte entraîne éventuellement une qualité de résolution du gel insuffisante, notamment par la superposition de certaines bandes, mais une durée trop longue peut se traduire par un phénomène de diffusion des bandes.

La mise au point des conditions expérimentales n'est pas abordée plus en détail dans ce document car elle fait l'objet d'une présentation détaillée par MUYZER et al. (1996). Une lecture de l'article publiée par HEUER et SMALLA (1997) est également conseillée.

4. Interprétation des gels DGGE Préalablement à la présentation du mode d’interprétation des gels, il est

important de rappeler que la DGGE ne conduit pas à l’identification des espèces présentes, sauf si elle est suivie d’un séquençage, mais à l’étude de la richesse spécifique. Elle permet par ailleurs une appréciation relative et non une quantification exacte de l’abondance de chacune des espèces représentées ce qui permet cependant d'accéder à la richesse spécifique. Selon MUYZER (1999), la plupart des études menées sur des écosystèmes naturels se concentrent sur l'estimation de la composition des profils et non sur l'estimation de l'abondance relative des espèces détectées.



4.1 Signification d’une bande

En théorie, une espèce bactérienne présente un génome spécifique ; à ce titre, une bande sur un gel DGGE peut être associée à une population, c’est-à-dire à un ensemble d’organismes appartenant à la même espèce. En pratique, le lien entre l'affiliation phylogénétique et les variations de séquences n'est pas toujours évident dans le cas d'organismes génétiquement proches. D'autre part, la notion d'espèce chez les procaryotes reste relativement obscure et repose principalement sur un pourcentage d'homologie entre leurs ADN [TORSVIK et al., 1998]. L'association d'une bande DGGE à une espèce est toutefois très communément appliquée. Cela dit, en toute rigueur et plus particulièrement en l'absence d'une vérification par séquençage, il est plus juste de considérer la DGGE comme une méthode de séparation des individus selon le polymorphisme génétique de la région du génome amplifié.

Enfin, plus l'intensité de la bande est forte, plus l'abondance relative de l'espèce représentée est importante. Cette corrélation est acceptée par la majorité des auteurs et, entre autres, démontrée par CASAMAYOR et al. (2000). Toutefois, du fait de certains biais évoqués ci-dessous, l'exactitude de la relation entre l'intensité de la bande et l'abondance relative de l'espèce correspondante n'est pas toujours clairement vérifiée. Une saturation du signal liée au mode de coloration ne permet pas, par exemple, d'évaluer correctement l'abondance relative de fragments fortement amplifiés.

4.2 Limites et biais d’interprétation

L'analyse d'un gel peut être biaisée par des artéfacts naturels ou artificiels. Dans ce dernier cas, les biais peuvent être introduits à chaque étape de la procédure : le prélèvement et le stockage de l'échantillon, l’extraction et la purification de l'ADN, le choix des amorces, l’amplification par PCR, l'électrophorèse et enfin la visualisation des fragments d'ADN. JACKSON et CHURCHILL (1999) fournissent une revue synthétique des limites de la technique PCR-DGGE. CASAMAYOR et al. (2000) se sont par ailleurs intéressés aux aspects strictement liés à la DGGE.

Dans les paragraphes qui suivent, nous détaillons certains des points préalablement cités par JACKSON et CHURCHILL (1999) tout en nous concentrant principalement sur les biais introduits par la PCR et les limites de la DGGE. Ce sont là les points les plus fréquemment abordés par les auteurs. D'autre part, l'utilisation par la suite d'un kit d'extraction ne justifie pas ici une discussion approfondie sur l'efficacité relative des protocoles d’extraction utilisés.



Les difficultés liées au choix des amorces ne sont pas non plus abordées car nous avons utilisé un couple d’amorces précédemment défini par MUYZER et utilisé avec succès à plusieurs reprises [MUYZER et al., 1995 ; KIRCHMAN et al., 2001 ; SCHAUER et al, 2003].

Concrètement, lors de la lecture du gel, les artéfacts naturels ou artificiels liés à la PCR-DGGE peuvent se traduire par :

une espèce présente mais qui n'est pas représentée : limite de détection de la méthode ;

une espèce qui est représentée par plusieurs bandes : micro-hétérogénéité des copies des gènes amplifiés ;

une bande qui ne correspond pas à un authentique produit PCR : chimère, hétéroduplexe, nucléotide erroné (erreur de la polymérase ou mutation ponctuelle) ;

une bande qui correspond en réalité à plusieurs espèces : co-migration de séquences différentes (qualité de résolution insuffisante ou domaines de fusion identiques) ;

une bande dont l'intensité n'est pas représentative de l'abondance relative de l'espèce : amplification préférentielle, co-migration, copies multiples du gène amplifié.

4.2.1 Limite de détection de la méthode

MUYZER et al. (1993) montrent que la DGGE peut détecter une espèce dont l'abondance excède 1% du nombre total d'individus dans un assemblage artificiel constitué de cinq espèces bactériennes. MURRAY et al. (1996) arrivent à une sensibilité du même ordre de grandeur, à savoir 1.6%, sur un assemblage artificiel constitué de 18 espèces. De même, CASAMAYOR et al. (2000) définissent un seuil compris entre 0.4 et 1% sur un assemblage naturel (<17 bandes DGGE). Bien que ces auteurs proposent des seuils de détection tout à fait comparables, la sensibilité de la méthode est difficilement généralisable dans la mesure où elle est probablement fonction de nombreux facteurs tels que la diversité de la communauté [MUYZER et al., 1996], l'optimisation des conditions expérimentales et le mode de détection des bandes.

Nous retiendrons de ces travaux que le nombre de bandes obtenues ne représente pas la totalité des espèces (ou séquences) présentes mais qu'il correspond en réalité aux espèces dominantes. La difficulté étant de définir à partir de quel niveau d'abondance l'espèce peut être détectée compte tenu des caractéristiques de la communauté et des conditions expérimentales.

Si la sensibilité de la méthode ne permet pas d'accéder à la totalité des espèces présentes, il est toutefois possible de s'en approcher. On l’a vu, la sensibilité



de la méthode peut être améliorée en complétant l'analyse par une étape d'hybridation sur membrane [MUYZER, 1999 ; CASAMAYOR et al., 2000]. Par ailleurs, dans le cas d'une communauté très diversifiée telles que les communautés bactériennes des sols, des sédiments ou des boues de stations d'épuration des eaux urbaines, une approche progressive par groupes spécifiques (« nested approach ») peut également fournir une représentation plus juste de la diversité réelle [BOON et al., 2002].

4.2.2 Copies multiples des gènes rRNA, taille du génome

Le nombre de gènes codant pour l'ARN 16S peut varier de 1 à 34 selon les espèces bactériennes. Dans la plupart des cas, ces gènes sont regroupés en opérons rrn. Ces opérons sont présents en plusieurs copies dans le génome et ces copies peuvent être légèrement hétérogènes [FARRELY et al., 1995]. Sur un gel DGGE, ces micro-hétérogénéités peuvent conduire à la représentation d'un même individu par plusieurs bandes. Pour cette raison, certains auteurs jugent préférable d'associer une bande DGGE à un « phylotype » ou à un « type de séquence» et non à une espèce [MURRAY et al., 1996 ; VAN HANNEN et al., 1999].

Le nombre de ces copies peut varier d'une espèce à l'autre ce qui introduit également un biais lors de l'interprétation quantitative des gels. Ainsi, deux espèces représentées par un même nombre d'individus peuvent donner deux bandes d'intensités différentes si le nombre de copies du gène codant pour la région ciblée est différent [JACKSON et CHURCHILL, 1999]. FARRELY et al. (1995) démontrent l'influence de la taille du génome et du nombre de copies des opérons sur la fiabilité des résultats quantitatifs d'une amplification PCR. L'influence de ces facteurs n'a cependant pas permis d'expliquer certains de leurs résultats. Ils émettent ainsi une hypothèse supplémentaire fondée sur l'influence de la distribution des opérons rrn sur le génome.

4.2.3 Molécules chimériques

L'étude menée par WANG et WANG en 1997 montre la formation de molécules chimériques lors de la co-amplification PCR d'un mélange d'ADN par hybridation de deux brins appartenant à deux espèces différentes. Ils démontrent par ailleurs que la co-amplification de deux séquences conduit à une fréquence de formation des formes chimériques inférieure à celle de la recombinaison de deux fragments de la même origine. Ils déduisent de cette observation que la probabilité de formation des molécules chimériques augmente avec la complexité de la communauté étudiée. La formation de molécules chimériques par hybridation de deux fragments simples-brins d'origine différente a également été mise en évidence par SPEKSNIJDER et al. (2001).



Dans l'étude menée par WANG et WANG (1997) l'amplification d'une séquence unique a conduit à la formation de molécules chimériques inter-copies. La fréquence de formation de ces molécules est fonction du nombre de copies et de leur degré d'hétérogénéité.

4.2.4 Hétéroduplexes

Les hétéroduplexes se forment par l'association de deux brins d'ADN non complémentaires. SPEKSNIJDER et al. (2001) montrent que ces molécules peuvent être également générées au cours de réactions intermoléculaires par donation de séquences.

L'étude menée par MURRAY et al. (1996) sur deux assemblages artificiels constitués de 18 espèces tend cependant à démontrer que la formation d’hétéroduplexes ne constitue pas un problème majeur. Les amplifications PCR conduites de manière à favoriser la formation d’hétéroduplexes (100°C pendant 5 minutes et 50°C pendant 30 minutes) ne conduisent pas à des profils DGGE qui diffèrent de ceux obtenus selon une procédure classique d'amplification. L'influence mineure des hétéroduplexes est par ailleurs confirmée par CASAMAYOR et al. (2000). Quoi qu'il en soit, la formation des hétéroduplexes au cours de la PCR peut être limitée par la réduction du nombre de cycles car leur fréquence de formation augmente dans les derniers cycles de la PCR. La réduction de la température d'hybridation et l’augmentation de la concentration en amorces sont également des facteurs limitant la formation des hétéroduplexes [MUYZER et SMALLA, 1998 ; SPEKSNIJDER et al., 2001].

Les hétéroduplexes sont aisément repérables sur un gel car ils génèrent des bandes supplémentaires dont la migration est rapidement stoppée : la stabilité de ces molécules est plus faible du fait de la non complémentarité des deux brins. La formation des hétéroduplexes peut être contrôlée par excision des bandes suspectes, élution, ré-amplification par PCR et nouvelle migration en DGGE car un hétéroduplexe donne un profil formé de multiples bandes alors qu'une séquence réelle ne donne qu'une seule bande [JACKSON et CHURCHILL, 1999].

4.2.5 Co-migration

Le phénomène de co-migration a été mis en évidence par MURRAY et al. (1996) par comparaison du profil DGGE d'un assemblage artificiel constitué de 18 espèces avec les profils de migration de chacune des espèces. Après le découpage, la ré-amplification par PCR et le clonage de certaines bandes DGGE obtenues à partir d'un assemblage naturel, CASAMAYOR et al. (2000) observent également que des séquences différentes occupent parfois la même position sur le gel. Cela dit, leurs résultats montrent qu'une séquence PCR est souvent majoritairement représentée, ce



qui, selon eux, limite les erreurs d'interprétation liées au phénomène de co-migration. En 2001, SEKIGUCHI et al. montrent aussi qu'une bande peut contenir des fragments de séquences différentes. Dans cette étude, un échantillon prélevé dans la colonne d'eau d'une rivière est soumis à une extraction de l'ADN, une amplification de l'ADN codant pour l'ARNr 16S, une analyse DGGE et enfin, un découpage des bandes en vue d'un séquençage. Lors de cette dernière étape, les auteurs se sont heurtés à l'impossibilité de déterminer les séquences de certaines bandes. Une de ces bandes a donc été analysée plus finement par clonage et séquençage des clones. Le résultat montre que certains des clones sont phylogénétiquement différents. Par ailleurs, l'analyse DGGE de la bande découpée puis ré-amplifiée ne donne qu'une seule bande. La conjugaison de ces observations tend à confirmer qu'une bande ne correspond pas toujours à un type de séquence. En revanche, l'explication avancée ici est tout autre que celle précédemment énoncée. Pour SEKIGUCHI et al., il s'agit d'un problème de résolution des bandes.

La difficulté parfois rencontrée lors de la séparation de fragments d'ADN présentant des différences de séquences multiples n’est pas toujours liée à un problème de résolution. En effet, un changement de séquences peut augmenter ou diminuer la température de fusion d'un fragment d'ADN et si celui-ci contient plusieurs domaines de fusion, la molécule peut être le siège d'effets additifs ou compensatoires [EZRA et al., 1992]. Dans ce dernier cas, deux fragments de séquences différentes peuvent avoir une température de fusion identique.

L’hypothèse selon laquelle une bande correspond à un type de séquences n’est donc pas toujours vérifiée, ce qui implique que deux bandes issues d’échantillons différents et occupant des positions similaires ne reflètent pas nécessairement la présence d’une séquence ou espèce commune aux deux échantillons.

4.2.6 Extraction et amplification préférentielle

Une bande plus sombre est en théorie associée à une espèce plus abondante mais cette observation peut être également liée à l’extraction et/ou l’amplification préférentielle d'une espèce par rapport à une autre, ce qui modifie les ratios initialement observés entre les espèces.

L'extraction peut en effet s'avérer être une étape sélective dans la mesure où, selon les espèces, la résistance à la lyse cellulaire est variable. Un des arguments avancés est la différence de rigidité des parois cellulaires [VAN HANNEN et al., 1998 ; CASAMAYOR et al., 2000].

Quant au risque d'amplification préférentielle, celui-ci a été mis en évidence par plusieurs auteurs. La chimie de la PCR est cependant complexe, notamment lorsqu'elle est appliquée à de l'ADN extrait d'une communauté naturelle, et les mécanismes impliqués sont difficiles à déterminer et quantifier. La variation de la teneur en GC dans le mélange de fragments à amplifier, l'utilisation d'amorces



dégénérées, le nombre de cycles PCR, ainsi que la durée et la température des phases de dénaturation et d'hybridation sont néanmoins reconnus comme étant des facteurs influents sur ce phénomène.

Le contenu en GC dans un fragment d'ADN est déterminant pour la stabilité de la molécule. Ainsi, dans un mélange d'ADN à amplifier comportant des teneurs variables en GC, il se peut que des séquences soient préférentiellement amplifiées du fait de leur dénaturation plus rapide. Celle-ci a pour conséquence d'augmenter la formation des fragments d'ADN simples-brins correspondants et de privilégier leur hybridation avec les amorces [SUZUKI et GIOVANNONI, 1996 ; WANG et WANG, 1997]. REYSENBACH et al. (1992) démontrent que l'addition d'acétamide dans un mélange PCR limite l'amplification préférentielle d'une levure en mélange avec deux archéobactéries. Inversement, les essais de co-amplification de FARRELY et al. (1995) sur deux espèces bactériennes montrent que la présence d'acétamide est peu influente dans leurs conditions expérimentales.

Les amorces universelles, fréquemment utilisées pour l'amplification de l'ADN extrait d'une communauté naturelle, contiennent souvent des amorces dites « dégénérées » (mélange d'amorces). L’utilisation de ce type d’amorces peut également être à l'origine de l'amplification préférentielle de certaines espèces. La réactivité supérieure de certaines amorces, fonction des énergies de liaisons impliquées, expliquerait ce phénomène [SUZUKI ET GIOVANNONI, 1996].

Enfin, SUZUKI et GIOVANNONI (1996) constatent que l'amplification d'un mélange de deux fragments d'ADNr issus de deux bactéries marines appartenant à des groupes phylogénétiques différents et présentes dans des proportions différentes tend vers un ratio 1:1 indépendamment du ratio initialement fixé (ratio maximum testé 4:1). L'hypothèse avancée à des fins explicatives est une hybridation des fragments simples-brins de l'espèce la plus rapidement dénaturée, ce qui a pour conséquence d'empêcher l'hybridation de ces mêmes fragments avec les amorces. Selon eux, cette observation est cohérente avec la théorie de l'hybridation selon laquelle la vitesse de reconnaissance des brins complémentaires augmente avec la longueur de la molécule. Dans ce cas, l'hybridation de deux fragments d’ADN simples-brins serait plus efficace que la réaction d'hybridation avec les amorces. Ce biais dépend par ailleurs du nombre de cycles PCR. Dans le cadre de l'essai effectué avec un ratio initial 4:1, le ratio 1:1 est atteint au 15e cycle. Selon SUZUKI et GIOVANNONI ce phénomène est moins probable dans le cas d'un mélange diversifié où la concentration d'une séquence particulière peut a priori plus difficilement atteindre une concentration telle que l'hybridation entre deux brins de même origine soit plus fréquente qu'une hybridation avec les amorces.

Pour conclure sur ce point, l'extraction et l'amplification préférentielle de certaines espèces ont clairement une influence sur les résultats quantitatifs de la PCR-DGGE. Toutefois, les données qualitatives sont indirectement affectées dans la mesure où la DGGE conduit à l'estimation de la diversité des espèces prédominantes.



4.3 Analyses des profils DGGE

Le plus fréquemment, les gels obtenus sont photographiés et l'image digitalisée est ensuite analysée.

L'analyse d'un gel se fait au niveau d'un échantillon ou bien de l'ensemble des échantillons testés contenus dans un même gel. Dans le premier cas, les bandes de chaque profil sont dénombrées. Dans le second cas, la position précise de chaque bande peut être définie afin de déterminer l’absence ou la présence des bandes communes à plusieurs échantillons. Les données brutes sont généralement exprimées sous la forme d'un tableau binaire si l'interprétation des gels est uniquement qualitative (absence ou présence d'une bande) ou sous la forme d'un tableau d'abondance relative (intensité des bandes) si l'analyse intègre également des données quantitatives ou semi-quantitatives.

L'analyse du gel par comparaison d’échantillons peut être visuelle ; elle peut également être réalisée au moyen d'un logiciel capable de détecter les bandes, leur positionnement, ainsi que l'intensité relative de chacune. A titre d'exemple, peuvent être cités les logiciels Bionumerics [BOON et al., 2002] et GelCompar [RÖLING et al., 2001] développés par Applied Maths, Diversity Database [DIEZ et al., 2001a ; SCHAUER et al., 2000 ; DUMESTRE et al., 2001], Molecular Analyst/PC [KONSTANTINOV et al., 2003] et Quantity One [MURRAY et al., 1998 ; RIEMANN et MIDDELBOE, 2002] développés par Bio-Rad, NIH Image développé par l’Institut National de la Santé des USA et disponible sur internet (Maryland, US) [CASAMAYOR et al., 2000 ; JAKSON et CHURCHILL, 1999], FMBIO développé par Hitachi [MURRAY

et al., 1996]. Quant à l'analyse visuelle d’un gel, l'image préalablement digitalisée d’un gel peut ensuite être améliorée au moyen d'un logiciel de traitement d'images ce qui permet de maximaliser les contrastes, de réduire les effets indésirables et d'obtenir un négatif de l'image [LINDSTRÖM, 1998 ; VAN HANNEN et al., 1999]. Le repérage de bandes blanches sur fond noir est en effet plus aisé que celui de bandes noires sur fond blanc.

4.4 Exploitation des données L’analyse des gels DGGE conduit à l’exploitation de données qualitatives

binaires (absence/présence) ou quantitatives (effectifs). Les communautés peuvent être globalement caractérisées par le calcul

d’indices biologiques tenant compte du nombre d’espèces présentes, c'est-à-dire de la richesse spécifique, et de leur abondance relative. Bien que très fréquemment utilisés, ces indices fournissent néanmoins une information très globale et ne tiennent pas



compte de la composition spécifique des communautés. En effet, deux échantillons peuvent être équivalents au regard de leur richesse spécifique tout en étant de composition différente. Ainsi, certains auteurs utilisent l'indice de similarité de Sorenson pour évaluer la ressemblance de deux échantillons. Cette approche se limite néanmoins à une comparaison qualitative des échantillons deux à deux et ne tient pas compte de l'abondance des espèces. Pour une analyse portant sur l'ensemble des échantillons, qu'elle soit uniquement qualitative ou qu'elle intègre également des données quantitatives, le recours aux analyses multivariées est nécessaire.

4.4.1 Indices de diversité

Parmi les indices de diversité, l'indice de Shannon (H') et l'indice de Simpson (D) sont les plus fréquemment utilisés pour rendre compte de la structure des communautés bactériennes [HILL et al., 2003]. Le calcul de ces indices nécessite la connaissance de la richesse spécifique et de l'abondance des espèces représentées.

Dans le cas de la DGGE, l'abondance ne se traduit pas par un effectif mais par l'intensité des bandes. Les formules relatives au calcul de ces indices sont les suivantes :

H’ = – ∑ i=1

i=n p i

ln p i D = ∑ i=1

i=n pi

2 n le nombre de bandes, p l'intensité totale des bandes, pi l'intensité relative de la bande i

Cette approche est généralement appliquée lorsque l'interprétation des gels est

effectuée à l'aide d'un logiciel de traitement d'image et qu'elle ne repose pas uniquement sur une appréciation visuelle. Ces indices sont utilisés comme indicateurs de la structure globale d’une communauté et de ses évolutions. Leur interprétation s’accompagne généralement d’une étude de similarité des profils.

4.4.2 Indice de similarité entre deux profils DGGE

L'indice de Sorenson (Cs) est utilisé par de nombreux auteurs pour évaluer le degré de similarité entre deux échantillons selon la formule « Cs = 2j/(a + b) » avec a le nombre de bandes dans l’échantillon A, b le nombre de bandes dans l’échantillon B et j le nombre de bandes communes aux deux échantillons A et B [LINDSTRÖM, 1998 ; MURRAY et al., 1996 ; KONSTANTINOV et al., 2003]. Une valeur de 0 indique que les échantillons sont complètement différents et une valeur de 1 indique qu'ils sont identiques.



4.4.3 Analyses multivariées appliquées au profils DGGE

FROMIN et al. (2002) proposent une revue des techniques statistiques les plus communément utilisées dans le cadre de l'analyse des gels DGGE : l’étalonnage non métrique multidimensionnel (NMDS), l’analyse en composantes principales (ACP), l’analyse factorielle de correspondances (AFC), l’analyse de classification et enfin l’analyse des correspondances canoniques (ACC). Ces méthodes sont des interfaces graphiques facilitant l'interprétation des données.

Selon la terminologie utilisée par AURAY et al. (1990), les méthodes citées par FROMIN et al. (2002) peuvent être regroupées selon trois catégories distinctes : les méthodes d'ordination (NMDS, AFC, ACP), les méthodes de structuration (analyse de classification) et les méthodes d'explication (ACC).

4.5 Conclusion

4.5.1 Théorie et artéfacts : que retenir ?

Les biais évoqués ci-dessus ne remettent nullement en cause l'intérêt de la PCR-DGGE dans le domaine de l'écologie microbienne. Ils montrent que la technique est puissante et efficace mais qu'elle n'en demeure pas moins perfectible et sujette à certaines limites qu'il est nécessaire de connaître [HEUER et SMALLA, 1997]. Bien qu'une interprétation prudente des résultats soit parfois de rigueur, la richesse des informations obtenues est considérable et contribue largement à l'amélioration de notre connaissance sur l'écologie des organismes procaryotes et eucaryotes [VAN HANNEN et al., 1998]. En outre, la prise en compte des limites techniques, pratiques et théoriques de la PCR DGGE doit impérativement tenir compte de son contexte d'utilisation et des objectifs de l'étude. Il s'agit en effet de connaître les principales limites de l'outil pour évaluer dans quelle mesure celles-ci vont potentiellement influer sur la nature des informations recherchées et rendre inexacte la conclusion ultime de l'étude. Dans les paragraphes qui suivent, nous tenterons ainsi de montrer que l'utilisation de la DGGE comme outil permettant d'évaluer globalement la structure et la composition d'une communauté de micro-organismes est globalement satisfaisante.

La PCR-DGGE est un outil adapté à l'évaluation de la diversité et de la structure des espèces dominantes au sein d'une communauté complexe.

En ce qui concerne les biais précédemment évoqués, nous retiendrons que la formation d'hétéroduplexes se caractérise par des bandes de courte migration. Aussi, en cas de doutes, nous proposons de ne pas les prendre en compte lors de l'analyse du gel.



Quant aux molécules chimères sans séquençage, ce point reste a priori une zone d'ombre bien que MUYZER et al. (1993) excluent la possibilité d'un tel biais.

Pour ce qui est des biais potentiellement introduits lors des étapes d'extraction, d'amplification et de migration, il est préférable d'effectuer une analyse DGGE par comparaison d'échantillons ayant subit un traitement commun tant au niveau de l'extraction, de l'amplification que de la migration. Si la quantité des échantillons à traiter ne permet pas de procéder ainsi, il est alors souhaitable d'utiliser un étalon qui sert alors de référence pour une comparaison entre plusieurs séries d'échantillons [GURTNER et al., 2000 ; BOON et al., 2002].

Le fait que l'abondance de l'espèce influe sur l'intensité de la bande est accepté par l'ensemble des auteurs. En revanche, la justesse de ce critère et par conséquent la pertinence de son utilisation sont nettement moins consensuelles. Certains auteurs estiment que cette mesure n'est pas réaliste [VAN HANNEN

et al., 1999 ; JACKSON et CHURCHILL, 1999 ; SEKIGUCHI et al, 2001]. D'autres, au contraire, mettent en avant le caractère quelque peu grossier des approches uniquement fondées sur la simple absence/présence d'une bande. Cette démarche attribue en effet autant d'importance à une espèce peu représentée qu'à une espèce fortement représentée [SCHAUER et al., 2000 ; BOON et al., 2002]. Par ailleurs, lors de la lecture des gels, certaines traces peuvent être associées à tort à des bandes de faible intensité. Cette erreur de jugement est plus importante si l’interprétation statistique des résultats est uniquement basée sur l’absence/présence des bandes alors qu’elle est de moindre importance si l’intensité des bandes est prise en compte. Pour conclure, le réalisme des informations quantitatives de la DGGE étant très controversé, une mesure fine de ce paramètre ne sera pas effectuée. Cependant, afin de tenir compte de la pertinence de certains arguments allant en défaveur d'un tel choix, il pourrait être intéressant de créer des classes d'intensité. Cette approche semi-quantitative a d'ailleurs été précédemment employée par POLY (2000).

4.5.2 Analyse des gels et traitement des données : quels choix ?

L'analyse des gels à l'aide d'un logiciel de traitement d'images est certes très attrayante. Elle réduit considérablement la durée d'analyse, minimise les erreurs liées à la subjectivité de certains choix et permet d'accéder à des données quantitatives

[ZHANG et FANG, 2000]. Cependant, compte tenu de l'investissement financier supplémentaire, et au

regard des réserves précédemment émises quant à la pertinence de la mesure de l'intensité de bandes, ces logiciels nous semblent intéressants mais pas incontournables pour autant. Par ailleurs, la lisibilité des profils n'est pas toujours parfaite et, dans ce cas précis, les yeux de l'expérimentateur demeurent sûrement l'outil le plus efficace.



Que l'analyse soit visuelle ou assistée d'un logiciel, l'acquisition de l'image est en revanche un point primordial à ne pas négliger. De sa qualité dépend fortement la précision de l'analyse qui suit.

En ce qui concerne le traitement statistique des gels, le choix de la technique appliquée doit être motivé par les objectifs de l'étude et la nature des informations recherchées. A titre d'exemple, les buts recherchés pourraient être les suivants :

Identification des relations entre la typologie des stations (milieu naturel) ou des mésocosmes (dispositifs expérimentaux) et celle de la composition de la communauté bactérienne : analyse factorielle des correspondances.

Identification d'une typologie des stations (milieu naturel) ou des mésocosmes (dispositifs expérimentaux) en fonction de la composition de la communauté bactérienne : analyse factorielle des correspondances, analyse en composantes principales ou analyse d'étalonnage multidimensionnel.

Classement des individus (stations ou mésocosmes) les uns par rapport aux autres : analyse de classification.

Analyses conjointes des données en fonction des variables biologiques et des variables physico-chimiques du milieu : analyses canoniques des correspondances ou analyse de co-inertie AFC/ACP ou ACP/ACP.

FROMIN et al. (2002) s'appuient sur les travaux effectués par TER BRAAK en 1985 (dans FROMIN et al. 1992) pour rappeler que les analyses de correspondances (AFC) sont bien adaptées au traitement des listes d'occurrences d'espèces.

Selon LEGENDRE et GALLAGHER (2001) une préférence dans le traitement de ce type de données est fréquemment attribuée aux AFC car les distances euclidiennes, donc les analyses en composantes principales (ACP), ont souvent été définies comme étant peu adaptées à des tableaux d'effectifs comprenant beaucoup d'abondances nulles. Dans ce cas, la ressemblance des relevés est davantage liée à l'absence d'espèces qu'à leur présence. Toutefois, cette préférence n'est pas sans inconvénient car la métrique du khi2 utilisée dans les analyses de correspondances font que les espèces rares ont une influence importante dans l'analyse [LEGENDRE et GALLAGHER, 2001].

L’identification de la relation « espèces-station » est surtout souhaitée lorsque les espèces sont identifiées, ce qui n’est pas notre cas. Cependant cette approche permet de déterminer si la disparition ou l’apparition de certaines espèces est liée ou non à l’introduction du polluant. Une analyse factorielle des correspondances est adaptée à cet objectif. Une attention particulière pourrait être apportée à la présence éventuelle d'espèces rares mais, tout en sachant que nous travaillons uniquement selon trois classes d'abondances (absence : 0, présence : 1, 2 ou 3 selon le niveau l'intensité de la bande), et que la notion d'espèces rares est, de ce fait, moins pertinente.



Une analyse de classification est fréquemment appliquée lorsque la PCR-DGGE est suivie d'un séquençage dans le but d'étudier l'affiliation phylogénétique des espèces détectées. Elle est également utilisée pour classer les échantillons en fonction du degré de ressemblance de leur profil DGGE. Certains auteurs utilisent cette méthode pour affiner les résultats d'une analyse d'étalonnage multidimensionnel et vérifier les tendances observées [BOON et al., 2002 ; SCHAUER et al., 2003]. L'interprétation conjointe d'un arbre et d'un plan factoriel impose néanmoins que la ressemblance entre deux individus soit définie selon la même métrique [ESCOFFIER et PAGES, 1998]. Enfin, une seconde analyse de classification peut être conduite en parallèle sur les variables environnementales afin de mettre en évidence ou non la concordance des classes relatives aux données biologiques (DGGE) et environnementales [VAN HANNEN et al., 1999].

L'analyse conjointe des données biologiques et physico-chimiques peut être réalisée par une analyse canonique des correspondances ou une co-inertie AFC/ACP ou ACP/ACP. Ce second choix est préférable lorsque le nombre de variables excède largement le nombre d'échantillons [DOLEDEC et CHESSEL, 1994]. Cette approche nécessite cependant de coupler deux tableaux ayant la même pondération des lignes ce qui revient soit à effectuer une AFC à pondération uniforme soit à effectuer une ACP normée dont la pondération des lignes est issue de l'AFC.


Chapitre 4. Conception de canaux artificiels.

Rivière de laboratoire [BRUNET, 2000 ; PARENT, 2004]

Rivière en dérivation [MADIGOU, 2004]


Partie 1. Chapitre 4. Conception de canaux artificiels.

Les premières rivières artificielles ont été conçues dans les années 1930 [SHELFORD, 1929 ; BEYERS et ODUM, 1993]. Les essais menés en canaux artificiels sur le périphyton ont été initiés par ODUM et HOSKIN en 1957 [ODUM et HOSKIN, 1957 ; Mc INTIRE et al., 1993]. Depuis, il existe à peu près autant de rivières artificielles que d'auteurs travaillant sur le sujet. Certaines sont de petites tailles et conçues pour des essais mono-spécifiques alors que d'autres sont de grandes tailles et conçues afin de travailler à des niveaux d'organisation biologique supérieurs [CROSSLAND et al., 1991 ; GUCKERT, 1993 ; CULP et al., 2000a]. Cette diversité laisse supposer qu’il n'y a pas un canal idéal mais que les canaux se déclinent selon des formes, et avec des équipements différents selon la question posée et les objectifs recherchés [LAMBERTI et STEINMAN, 1993a ; RAND et al., 2000]. Il peut sembler trivial de rappeler qu'il ne faut attendre d'un essai que les réponses pour lesquelles celui-ci a été pensé. Pourtant, l'évidence mérite d'être soulignée pour éviter de comparer des dispositifs qui ne peuvent l'être car conçus en fonction d'objectifs différents. CRAIG (1993) précise avec justesse que l'étape préalable à la définition des canaux artificiels doit être l'identification des paramètres influents (facteurs) sur les variables mesurées.

L'objectif du présent chapitre est d'effectuer une revue des systèmes existants mais surtout de rendre compte des réflexions qui ont été les nôtres lors de la conception des canaux artificiels. Nous discuterons également de l'utilisation des ces outils dans le domaine de l'écotoxicologie bien que leur application en écologie soit plus ancienne et plus fréquente.

Bien que les rivières artificielles aient été à l'origine conçues pour l'étude ou l'élevage des poissons et qu'elles soient maintenant largement exploitées dans le cadre d'essais menés sur les invertébrés [LAMBERTI et STEINMAN, 1993a], nous nous limiterons ici à l'étude des systèmes comportant, de manière exclusive ou non, une composante périphytique.

1. Définitions et terminologie

Rivières de laboratoire, rivières artificielles, canaux expérimentaux, canaux artificiels, microcosmes ou mésocosmes lotiques... Quel est le terme adéquat permettant de désigner les systèmes expérimentaux conçus pour étudier le fonctionnement des écosystèmes aquatiques lotiques ou l'effet d'un polluant sur ces milieux ?

Le première synthèse bibliographique sur le sujet a été réalisée par WARREN et DAVIES (1971). Ils emploient le terme « rivière de laboratoire » et le définissent comme un canal relativement petit dans lequel l'écoulement est contrôlé et dont l'utilisation permet d'étudier des systèmes biologiques complexes en tenant compte des interactions qu'ils entretiennent avec le milieu. Cette définition précise que les essais



se font dans des conditions d'écoulement contrôlées mais ne donne pas plus de précisions sur ce que recouvre concrètement cette notion. Elle signale également la complexité des systèmes biologiques étudiés ce qui suppose que ces essais ne sont pas mono- ou pluri-spécifiques mais qu'ils sont conduits à l'échelle de la communauté. LAMBERTI et STEINMAN (1993a) soulignent que l'appellation « rivière de laboratoire » limite les rivières à des dispositifs positionnés à l'intérieur (indoor stream).

Le terme « rivière artificielle » est fréquemment utilisé mais nous semble quelque peu abusif. La définition propre à chacun de ces deux termes rend leur association surprenante voire même paradoxale.

Les termes « canaux expérimentaux » ou « canaux artificiels » sont plus fréquemment utilisés lorsque les caractéristiques physiques du milieu sont étudiées au cours des essais.

Certains auteurs parlent de modèles d'écosystèmes aquatiques lotiques : « model stream ecosystem » [BELANGER, 1997 ; RODGERS et al., 1996]. Cette terminologie est intéressante car elle sous-entend une représentation réduite et simplifiée d'un écosystème aquatique lotique.

La définition la plus classique du terme « mésocosme » est celle énoncée par ODUM (1984). Il s'agit d'unités expérimentales extérieures, limitées dans l'espace et partiellement clôturées. Pour PETERSEN et al. (1999) un mésocosme est un écosystème expérimental clos. Cette définition est intéressante à plusieurs titres. L'utilisation du terme « écosystème » est correcte si l'on considère qu'un écosystème est un système complexe d'interactions entre un ensemble d'espèces vivantes et un milieu physique [FRONTIER, 1998]. L'introduction du terme « expérimental » montre que l'auteur n'a pas pour ambition la reproduction plus ou moins réduite d'un écosystème naturel. Enfin, le terme « clos » n'est pas sans rappeler la limite spatiale de ces systèmes expérimentaux où les échanges s'exerçant avec les écosystèmes aquatiques souterrains et les écosystèmes terrestres sont exclus.

La distinction entre les microcosmes et les mésocomes se fait principalement en fonction d'un critère de taille défini de manière plus ou moins précise selon les auteurs. Pour certains, les microcosmes sont des systèmes facilement manipulables et transportables, pour d'autres, ce sont des systèmes dont le volume et/ou la taille sont inférieurs à certaines dimensions. BELANGER (1997) reprend les critères de HILL et al. (1994) pour définir les rivières expérimentales comme étant des mésocosmes si leur longueur est supérieure à 15 mètres. Cette valeur a été définie en 1991 par la SETAC-Europe (Society of Environmental Toxicology and Chemistry). Selon cette définition, l'implantation des microcosmes ou des mésocosmes peut être intérieure ou extérieure [FORBES et FORBES, 1997 ; THYBAUD et al., 1999]. Bien que cette distinction entre les mésocosmes et les microcosmes soit reconnue au sein de la communauté scientifique, elle nous semble reposer sur des critère trop subjectifs. En effet, des canaux peuvent être grands pour des daphnies mais petits pour des poissons.



Pour illustrer la difficulté de cette définition, nous citerons le cas des rivières artificielles du laboratoire du Oak Ridge National Laboratory (ORNL) qui sont en forme de « U » et d'une longueur totale de 20 m avec la courbure située à 10 m [STEINMAN, 1993] : au sens de la définition énoncée par la SETAC-Europe, s'agit-il de microcosmes ou de mésocosmes ?

Dans le présent document, les termes utilisés par les auteurs cités seront privilégiés.

2. Conception des canaux artificiels

Notre empressement à concevoir des canaux rapidement opérationnels afin de se concentrer sur l'étude des organismes qui y sont introduits est une source d'erreur potentielle. Cette étape de conception est en effet importante et ne doit pas être négligée car les caractéristiques du dispositif et du protocole expérimental ont une influence déterminante sur la nature et la fiabilité des résultats [RODGERS et al., 1996]. CULP et al. (2000a) rappellent que « the key issue dictating the choice of an artificial stream is the explicit formulation of the research question and recognition of the type of data required ».

La conception de canaux artificiels est toutefois sujette à de nombreux choix et/ou compromis effectués selon des critères scientifiques, techniques mais également pratiques et économiques. Les critères généraux relatifs à la simple conception des canaux peuvent être distingués des critères spécifiques qui relèvent d’un aspect particulier de l’étude et de ses objectifs.

Le mode de fonctionnement des canaux est également un point d'importance. Il porte sur le taux de renouvellement du milieu d'essai, le mode d'alimentation et d'ensemencement (apport des organismes) des canaux, la nature des substrats servant de supports pour la colonisation des organismes introduits.

Le nombre de réplicats par traitement, ainsi que la procédure d'échantillonnage mise en place sont également des points à intégrer dès la conception du dispositif.



2.1 Critères de conception généraux

2.1.1 Dimensionnement des canaux

Le dimensionnement des rivières artificielles (taille et volume) est en partie dicté par la taille des organismes testés et le niveau d'organisation biologique [CULP et al., 2000a]. Il est pour l'instant admis que la taille de l'habitat est positivement corrélée à la taille de l'organisme et à son temps de réponse. En conséquence, les organismes les plus gros nécessitent des rivières artificielles de plus grandes tailles et des durées d'essai supérieures [PETERSEN et al., 1999].

La taille du système doit également être pensée en fonction de la fréquence et de l'intensité de l'échantillonnage pour que ces opérations soient possibles tout au long de l'essai mais qu'elles n'influent pas sur la dynamique du système [FLUM et al., 1993 ; RODGERS et al., 1996 ; BELANGER et al., 1996 ; BELANGER, 1997 ; CAQUET et al., 2000].

La taille, et donc le volume des rivières artificielles, est souvent associée à une échelle de travail plus ou moins réaliste [CROSSLAND et LA POINT, 1992 ; PUSEY et al., 1994]. Les artéfacts liés au dispositif expérimental sont susceptibles de modifier la dynamique du système biologique, d'exclure ou d'altérer certaines propriétés des communautés et des écosystèmes [CARPENTER, 1996]. Il semble logique de penser que ces biais expérimentaux diminuent lorsque la taille du dispositif augmente [PETERSEN et al., 1999]. La revue bibliographique de BELANGER (1997) suggère toutefois que d'autres paramètres, tels que le mode d'alimentation et la nature du milieu, seraient parfois plus déterminants sur le réalisme de l'essai. D'après lui, la diversité et la richesse spécifique ne seraient pas affectées par la taille du système dans le cas des algues, des protozoaires et des invertébrés. Pour cette raison, BELANGER (1997) doute de la pertinence de la distinction faite par certains auteurs entre les mésocosmes et microcosmes. Pour CAQUET et al. (2000), la taille minimale d'un mésocosme aquatique extérieur (lentique ou lotique) est celle qui permet à un écosystème expérimental de se s'auto-maintenir à long terme : « ...that are necessary for long-term self-functioning... ».

Enfin, de nombreux auteurs tendent à montrer que la capacité de contrôle du système expérimental diminue lorsque la taille, donc le volume, des mésocosmes/microcosmes augmente [PETERSEN et al., 1999 ; CAQUET et al., 2000].

La largeur des canaux conditionne l'importance de l'effet des parois ou « effet de bords ». Les parois peuvent localement altérer les conditions d'éclairage et créer des turbulences modifiant ainsi les transferts de matières. L'existence d'une zone centrale non soumise à l'effet des parois augmente avec la largeur des canaux. Ce point ayant



une influence directe sur la variabilité spatiale de colonisation des micro-organismes est abordé ultérieurement dans le paragraphe consacré au mode d'échantillonnage.

Enfin, si la définition de la longueur et de la largeur des canaux est un critère de conception important, la définition de la profondeur ne doit pas être négligée. Elle est, par exemple, fonction de la taille et du positionnement (vertical ou horizontal) des substrats artificiels ou naturels servant de support de colonisation au périphyton et/ou aux invertébrés testés dans les canaux. Au-delà de cet aspect pratique, plus la profondeur des canaux est importante, plus elle apporte une certaine souplesse au système. Si la hauteur des parois le permet, il devient possible de travailler dans des conditions d'écoulement différentes d'un essai à l'autre ou au sein d'un même essai. Dans ce dernier cas, la hauteur de la colonne d'eau, ainsi que la pente du canal peuvent être localement modifiées par des aménagements très simples. Cette approche augmente la diversité des habitats. Elle permet non seulement d'étudier la relation « type d'habitat - composition et structure de la communauté » mais aussi de s'intéresser à l'influence d'une même perturbation sur les différentes communautés développées.

La revue synthétique de BELANGER (1997) montre que les rivières les plus fréquemment utilisées en écotoxicologie ont une longueur de 6,1 mètres, une largeur de 0,3 mètre et une profondeur de 0,2 mètre (valeurs médianes). Ces dimensions sont très courantes pour les études menées sur le périphyton et les invertébrés. La rivière artificielle la plus grande répertoriée dans cette revue se caractérise par une longueur de 540 mètres et une largeur de 4,3 mètres. Les rivières supérieures à 50 mètres comportent généralement du périphyton, des macrophytes, des invertébrés, et des poissons. Les périodes d'essais sont de l'ordre de plusieurs mois [SWIFT et al., 1993]. Le périphyton seul est généralement étudié dans des rivières artificielles d'environ 1 mètre de longueur, le périphyton et les invertébrés dans des rivières artificielles d'environ 5 mètres et les communautés plus complexes incluant l'étude des macrophytes et des poissons dans des rivières artificielles d'environ 500 mètres ou plus [CROSSLAND et LA POINT, 1992].

2.1.2 Forme des canaux

Les canaux les plus fréquemment rencontrés sont en forme d'ellipse, d'hippodrome, de « U » ou de chenal droit. D'autres canaux, plus sophistiqués, présentent des variations de sections, de formes ou de profondeurs, et conduisent à une alternance de zones rapides et calmes au sein du système. Les canaux en forme de chenal droit sont régulièrement privilégiés lorsque l'obtention d'un écoulement simple est recherchée. Plus généralement, le choix de la forme d'un canal est lié à son mode de fonctionnement (taux de renouvellement du milieu) et d'alimentation.



2.1.3 Matériaux de construction des canaux

Les matériaux de construction sont également très variables. Certains canaux artificiels sont en bois [MC INTIRE et al., 1964 ; VYMAZAL, 1988] ou en ciment, mais la plupart sont en contre-plaqué marin, en acier, en acier inoxydable, en fibre de verre, en plexiglas®, en perspex® (plastique), en polyéthylène (plastique de qualité alimentaire), en polychlorure de vinyle (PVC), en caoutchouc, en acrylonitrile butadiène styrène (ABS, thermoplastique), en polycarbonate ou en verre.

Le choix du matériau est étroitement lié au prix de revient du canal, ce qui inclut le coût de la matière première et de sa manipulation. Il peut également être motivé par les aspects suivants :

résistance aux produits chimiques (testés ou utilisés lors du lavage), résistance à la corrosion, risque de rétention des produits chimiques (testés ou utilisés lors du

lavage, résistance à la déformation, résistance à la chaleur, durabilité, opacité ou transparence.

Lorsque le matériau est susceptible de relarguer des polluants dans le milieu d'essai ou que son étanchéité n'est pas parfaite, son utilisation impose la mise en place d'une couche de protection.

Mc INTIRE et al. (1964) recouvrent leurs canaux en bois d'un vernis « non toxique » pour garantir l'étanchéité des systèmes. Dans les canaux en bois de VYMAZAL (1988) l'intérieur, c'est-à-dire la zone en contact avec le milieu d'essai, est en bois laminé. PUSEY et al. (1994) évoquent le manque de durabilité du contre-plaqué marin et recouvrent leurs canaux d'un film plastique pour améliorer l'étanchéité. GENTER et al. (1988) ont également construit des canaux en contre-plaqué marin et les enduisent d'une résine non toxique résistante aux produits chimiques. Quant à DORN et al. (1996), qui ont eux-aussi sélectionné ce matériau, ils utilisent une peinture époxy non toxique. CARDER et HOAGLAND (1998) recouvrent leurs canaux en caoutchouc avec un film plastique. CANIVET (2001) limite les risques de corrosion des canaux en acier par application d'une peinture époxy non toxique. Les matériaux nécessitant une isolation ou un traitement sont a priori moins adaptés à un lavage par brossage du fait de l'usure de la couche protectrice ou isolante.

CROSSLAND et al. (1991) utilisent de l'acier inoxydable de qualité 316 (haute qualité) car ce matériau facilite les opérations de nettoyage entre les essais, d'une part,



et limite les phénomènes d'adsorption des polluants testés d'autre part. DEBUS et al. (1996) se sont également orientés vers ce matériau dans le but de limiter les risques de contamination du milieu d'essai. Les canaux présentés par BROOKS et al. (1996) sont en acrylonitrile butadiène styrène. Ce choix est motivé par la volonté d'éliminer toute possibilité de contamination métallique.

Les matériaux transparents augmentent la colonisation des organismes sur le fond et les parois du canal [Mc INTIRE, 1993], ce qui peut éventuellement interférer sur les résultats et rendre leur interprétation plus complexe. D'un autre côté, ils permettent la mise en œuvre de technique telle que l'anémométrie Laser-Doppler pour la caractérisation de l'écoulement [GODILLOT, 1998]. L'écoulement peut être aussi visualisé au moyen de colorant et, dans ce cas, la transparence du matériau est également nécessaire [HOFFMANN, 1993 ; REITER 2001]. Bien que cela puisse paraître secondaire, la couleur des matériaux n'est pas sans effet. Ainsi, SOBCZAK et BURTON (1996) utilise un plastique de couleur claire (vinyle) pour limiter l'adsorption de chaleur.

2.1.4 Emplacement des canaux

L’emplacement des rivières artificielles varie principalement selon la taille du système et le degré de complexité recherché.

Il existe des rivières placées à l'intérieur, au laboratoire ou sous serre, et des rivières placées à l'extérieur. Parmi les rivières extérieures, il existe les canaux artificiels placés in situ en dérivation d'un cours d'eau (« within stream »). Ces dispositifs ne sont pas considérés comme des rivières artificielles par LAMBERTI et STEINMAN (1993a).

Les rivières intérieures offrent la possibilité de travailler dans des conditions d'éclairage, de température et d'écoulement contrôlées à l'exception des rivières sous serre [WILDE et TILLY, 1981] qui sont exposées à des conditions d'éclairage naturel même si l'utilisation de stores peut permettre un contrôle de la photopériode.

Les rivières extérieures bénéficient d'un l'éclairage naturel et sont exposées à des apports allochtones (feuilles, insectes, eau de pluie...). Ceux-ci peuvent cependant être limités par recouvrement des rivières avec une « moustiquaire », ce qui permet également de réduire l'intensité lumineuse qui, selon la nature des matériaux de construction, est plus ou moins amplifiée. Ces rivières sont généralement soumises à des températures non contrôlées mais certaines sont toutefois équipées de systèmes réfrigérants.

Les rivières artificielles placées in situ en dérivation sont incontestablement les rivières artificielles les plus réalistes. Les conditions d'écoulement dans l'espace sont partiellement contrôlées mais, sans aménagements particuliers, les autres facteurs ne le sont pas. Les seuls aménagements portent alors généralement sur la régulation de



la vitesse, la sélection des organismes entrants, l’intensité de l’éclairage, la nature et la taille des substrats.

Les photographies de canaux artificiels présentés sur la première page de cette partie étant, pour l'une, des canaux de laboratoire, et pour l'autre, un canal de dérivation, nous présentons ici des canaux artificiels extérieurs alimentés par de l'eau du réseau d'alimentation en eau potable (Photo 3).

Photo 3. Rivière extérieure [Université Lyon 1]

2.1.5 Mise en mouvement de l'eau

Une étude menée en rivière artificielle nécessite une réflexion sur la mise en mouvement de l'eau et sur son taux de renouvellement.

La mise en mouvement de l'eau s'avère nécessaire pour les systèmes horizontaux où l'écoulement ne peut pas se faire par simple gravité. Les auteurs ont ainsi recours à l'utilisation de pompes, de roues à aubes, d'hélices, de vis d'Archimède ou encore à l'injection d'air comprimé.

Les pompes sont fréquemment utilisées pour la mise en mouvement, et éventuellement la re-circulation de l'eau, dans les canaux en « U » ou en forme de chenal droit.

Les roues à aubes génèrent du bruit, des éclaboussures et engendrent des ondes de surface [CRAIG, 1993]. Pour éviter ces phénomènes, Mc INTIRE et al. (1964) sont contraints de réduire la vitesse d'écoulement à 24 cm/s dans des canaux d'une longueur de 3 m et d'une largeur de 24 cm. La courbure des pales limite cependant cet inconvénient [DEBUS et al., 1996 ; GIRLING et al., 2000].



Certains auteurs précisent le positionnement de la roue à aubes. CARDER et HOAGLAND (1998) la placent 3 cm au-dessous de la surface de l'eau sans justification. BRUNET (2000) a construit des canaux dans lesquels la roue à aubes est enchâssée dans un puits de façon à ce que l'ensemble de la lame d'eau soit mise en mouvement. Cet aménagement ne permet cependant pas de régler l'un des principaux inconvénients de la roue à aubes : la mise en mouvement de l'eau n'est pas homogène mais fonction de la profondeur dans la lame d'eau. La vitesse décroît de la surface de l'eau jusqu'au fond du canal.

L'utilisation des hélices [VOGEL ET LABARBERA, 1978], des vis d'Archimède [CIBOROWSKI et al., 1977] ou de l'air comprimé [HORNER et al., 1983] est plus rare. Dans ce dernier cas, une suroxygénation du milieu est à craindre et le système doit être équipé d'un filtre pour prévenir la contamination du milieu par solubilisation des polluants provenant de l'air ou du compresseur.

2.1.6 Température et éclairage des canaux

Si le mode d'éclairage des canaux et la régulation de la température du milieu d'essai concernent principalement, a priori, les rivières artificielles situées à l'intérieur, certains auteurs travaillant en milieu extérieur ont cependant abordé ces deux points. En effet, la réduction de l'intensité lumineuse est parfois nécessaire pour réduire le réchauffement de l'eau en période estivale ou éviter la photo-transformation des produits chimiques testés. GIRLING et al. (2000) placent un filet au-dessus des canaux et CANIVET (2001) utilise un assemblage de cannisses pour couvrir l'ensemble de son installation.

Le réchauffement de l'eau est d'autant plus à craindre qu'une pompe est utilisée. Le mode de refroidissement de l'eau est variable. Ce réchauffement peut alors être compensé par un échangeur de chaleur au niveau du tuyau de remise en circulation du milieu d'essai [CROSSLAND et al., 1991]. Si les canaux sont alimentés par un réservoir commun, il est plus efficace d'agir à ce niveau.

L'eau de refroidissement peut circuler dans un serpentin placé à l'intérieur du réservoir d'alimentation, la longueur et la largeur du serpentin étant alors fonction de l'abaissement de température souhaité entre l'eau entrant dans le bac et celle sortant du bac. Le problème lié à ce mode de refroidissement provient des serpentins qui sont généralement réalisés en cuivre afin d'optimiser les échanges ce qui peut conduire à des problèmes de contamination du milieu d'essai.

Lors de la conception du réservoir, un système de double paroi peut être envisagé pour la circulation de l'eau de refroidissement. Ce système est classique en pisciculture. Enfin, il est possible que le réservoir, voire l'ensemble de l'installation, baigne dans un second bac de plus gros volume contenant l'eau de refroidissement.



Dans le cas des canaux extérieurs situés à proximité d'une rivière, d'un lac ou d'un puits, le système le plus économique consiste à utiliser cette eau comme eau de refroidissement.

Il est également intéressant de noter le système astucieux de RAND et al. (2000) qui, pour limiter les fluctuations de température, ont choisi d'enterrer les canaux.

Pour les canaux placés à l'intérieur, le réchauffement du milieu d'essai est lié à la re-circulation du milieu lorsque celle-ci est assurée par une pompe, ainsi qu'à l'éclairage artificiel des canaux. Les systèmes présentés ci-dessus restent valables si une alimentation en eau de nappe, de lac ou de rivière existe. Dans le cas contraire, l'utilisation d'un groupe frigorifique s'avère nécessaire. Ce choix soulève la question suivante : est-il préférable de climatiser l'air de l'enceinte expérimentale [REITER, 2001] ou l'eau du milieu d'essai ? Incontestablement, la climatisation de l'eau est un choix plus judicieux. Le calcul de la puissance frigorifique nécessaire au refroidissement de l'eau doit tenir compte de la différence entre la température ambiante et celle de l'eau, du volume d'eau en circulation et de la vitesse d'abaissement de température souhaitée. Il doit aussi intégrer l'apport de chaleur due à la surface de contact « air/eau », la puissance de la pompe et l'intensité de l'éclairage artificiel.

D'un point de vue strictement pratique, il est impératif de garder en mémoire qu'une condensation sur une paroi est systématiquement observée lorsqu'elle sépare deux milieux de température différente. En conséquence, si le concepteur des canaux s'oriente vers un système de refroidissement de l'eau et que la température de l'air ambiant est supérieure, il doit alors s'attendre à des condensations le long des parois du canal. Une condensation sur les murs de l'enceinte expérimentale peut également être observée pour les mêmes raisons. Pour minimiser cet effet et réduire les échanges de chaleur avec l'extérieur, un matériau isolant peut être placé contre les parois des canaux [CROSSLAND et al., 1991].

Pour ce qui est du mode d'éclairage des canaux, BOTHWELL (1993) insiste sur l'importance de ce point. Selon lui, le meilleur choix est, sans conteste, l'association de la lumière naturelle et d'un système d'ombrage pour contrôler l'intensité lumineuse. Ce système doit agir uniquement sur l'intensité et ne pas modifier la qualité de la lumière.

La qualité et l'intensité de l'éclairage influent sur l'activité [BOSTON et HILL, 1991] et sur la composition de la communauté algale [STEINMAN et Mc INTIRE, 1987]. Les longueurs d'ondes adaptées à l'activité photosynthétique algale se situent entre 400 et 700 nm et une intensité de 100 à 400 µmol m-2 s-1 (dans ce domaine) sature l'activité photosynthétique [BOSTON et HILL, 1991 ; BOTHWELL, 1993]. Les algues vertes absorbent les radiations rouges (650-705 nm) grâce aux chlorophylles a et b. Les algues bleues absorbent les radiations rouges grâce aux chlorophylles a, mais peuvent le faire à partir de longueur d'ondes plus courtes (600-650 nm) grâce à la phycocyanine ; celles qui ont de la phycoérythrine peuvent absorber



les radiations bleu-vert (500-565 nm). Les algues brunes peuvent absorber les radiations bleues et vertes (470-550 nm) grâce aux caroténoïdes et à la chlorophylle-c. Les algues rouges peuvent aussi absorber les radiations bleu-vert (500-565) grâce à la phycoérythrine. Par ailleurs, la chlorophylle a absorbe plus le bleu-violet (435 nm) que le rouge (680 nm) [De REVIERS, 2002].

Lorsque les canaux sont placés à l'intérieur, un éclairage artificiel doit être envisagé. Cette étape est délicate car il est difficile de procéder à une véritable simulation de la lumière naturelle et de ses variations qualitatives (évolution du spectre lumineux) et quantitative (évolution de l'intensité lumineuse) au cours de la journée. Sachant que des laboratoires de recherche spécialisés travaillent activement sur la simulation de la lumière naturelle en milieu intérieur cet aspect pourrait être amélioré dans un futur proche.

Il est également complexe de tenir compte de l'évolution de l'exposition du périphyton à la lumière. Le périphyton reçoit rarement une lumière incidente directe du fait de la présence des végétaux. Les rivières de Procter et Gamble (USA, Cincinnati) sont toutefois équipées de lampes à mercure positionnées de manière à simuler l'intensité du lever et du coucher du soleil [BELANGER et al., 2000].

Le mode d'éclairage le plus fréquent consiste en l'utilisation de tubes fluorescents. Les spectres sont variables et il est judicieux d'en combiner deux ou trois afin d'élargir le spectre lumineux. L'intensité lumineuse fournie par ce système n'étant pas équivalente sur la longueur du tube, il est nécessaire de veiller à ce que le périphyton échantillonné soit dans des conditions d'éclairage identiques. Certains auteurs se sont orientés vers l'utilisation de lampes à mercure [VYMAZAL, 1988 ; KOSTEL et al., 1999].

2.2 Critères de conception spécifiques Les critères spécifiques désignent ici les équipements ou aménagements des

canaux liés à un point particulier de l'étude. Ces critères concernent le plus souvent l'écoulement, la température ou l'éclairage mais il peut aussi s'agir d'aspects plus originaux. Les exemples suivants peuvent être cités à titre d'illustration :

FLUM et al. (1993) ont conçu des rivières étanches pour éviter tout risque de contamination par l'air d'espèces initialement non présentes dans l'inoculum.

CUSCHING et ROSE (1970) ont conçu des systèmes étanches afin de pouvoir travailler sur l'accumulation de radio-nucléides par le périphyton.



CROSSLAND et al. (1991) travaillent dans des canaux caractérisés par une succession de zones rapides (« riffle »), de zones lentes (« pool ») et de zones stagnantes. La variété des habitats est artificiellement créée par une modification de la profondeur de l'eau et de la nature des substrats (sables et graviers de 8-20 mm de diamètre). Les vitesses de courant sont comprises entre 3 et 30 cm/s. Cette approche permet d'étudier les différences de colonisation en fonction des habitats d'une part, et l'impact d'une même perturbation sur des communautés périphytiques différentes, d'autre part. L'étude porte sur les invertébrés et le périphyton. Un exemple de ce type de rivières artificielles, conçues par l'université du Kentucky, est présenté sur la photographie ci-dessous (Photo 4).

LOWE et al. (1996) opèrent dans des canaux intérieurs d'une longueur de 12 mètres divisés en sections de largeur et de pente variables. Ces différentes zones servent à l'étude simultanée du périphyton seul et du périphyton en présence d'invertébrés. DETENBECK et al. (1995) procèdent de la même manière pour alterner des zones rapides et lentes dans leurs canaux artificiels extérieurs.

CULP et al. (2000b) utilisent des rivières mobiles afin de les déplacer à proximité du cours d'eau étudié.

STEINMAN et al. (1990) ont ajouté un système de recouvrement partiel des canaux pour étudier l'effet des phénomènes d'ombrage.

GODILLOT (1998) a conçu un système d'injection d'eau dans le fond des canaux pour simuler le phénomène des remontées de nappe alluviale.

Photo 4. Alternance de zones rapides et lentes. Université du Kentucky, USA [http://biology.uky.edu, juin 2004].



3. Fonctionnement des canaux artificiels

3.1 Nature du milieu d'essai L'eau du milieu d'essai provient généralement d'une mare, d’un lac, d’une

rivière, d’une nappe ou d’un réseau d’alimentation en eau potable. Il peut également s'agir d'un milieu synthétique [FLUM et al., 1993].

3.1.1 Eaux naturelles

Les eaux de rivière, de lac ou de nappe sont éventuellement filtrées ou décantées [BARRANGUET et al. 2003] avant leur introduction dans les canaux pour éviter l'introduction de matières en suspension ou d'organismes. GIRLING et al. (2000) utilisent trois filtres successifs pour limiter le colmatage. Au final, l'eau pénétrant dans les canaux artificiels est filtrée à 10 µm. Ce niveau de filtration est également celui retenu par CROSSLAND et al. (1991). DUBÉ et CULP (1996) effectuent une filtration préalable à 250 µm pour éviter l'introduction d'invertébrés dans les canaux artificiels. PAULSSON et al. (2000) filtrent l'eau d'alimentation des canaux à 1 mm bien que leurs essais portent uniquement sur le périphyton. Ce niveau de filtration laisse ainsi passer la meiofaune (> 200 µm) et la macrofaune (> 500 µm).

Dans le cas des canaux fonctionnant en circuit ouvert, le pré-traitement de l'eau est d'autant plus difficile que le volume d'eau en circulation est important. Les filtrations ou décantations réduisent en effet le débit de l'eau pour alimenter les canaux [GUCKERT, 1993]. Dans certains cas, la filtration de l'eau est pourtant nécessaire pour éliminer les matières en suspension notamment à la suite d'événements pluvieux. En l'absence de filtration ou de décantation, les particules en suspension se déposent dans les canaux artificiels et recouvrent les substrats modifiant ainsi la nature du support servant à la colonisation du périphyton. L'eau de nappe nécessite parfois un traitement supplémentaire pour une réduction des teneurs élevées en fer et en carbonate de calcium [KOSTEL et al., 1999].

3.1.2 Eaux du réseau

L’eau de la ville nécessite l’élimination du chlore qu'elle contient. Certains auteurs procèdent à un simple brassage à l'air [GODILLOT, 1998], d'autres choisissent une filtration sur charbon actif [BROOKS et al., 1996]. Mc CORMICK (1993) utilise aussi de l'eau de la ville déchlorée mais ne précise pas son mode de traitement.



3.2 Mode d'ensemencement des canaux Le mode d'ensemencement ne concerne pas les auteurs qui testent l'effet d'une

perturbation en canaux artificiels sur des communautés périphytiques préalablement colonisées en milieu naturel que ce soit sur des substrats artificiels [BELANGER et al., 1996 ; MUNOZ et al., 2001 ; IVORRA et al., 2002 ; REAL et al., 2003] ou naturels [PARENT, 2004].

L’ensemencement des canaux peut se faire « naturellement » lorsque l'eau d'alimentation provient d'un lac ou d'une rivière du fait de la présence d'organismes planctoniques [LAMBERTI, 1993].

Un ensemencement par introduction d'un inoculum est favorable dans le cas d'une alimentation des canaux par de l’eau de nappe car elle contient principalement des formes hétérotrophes. En revanche, l'apport d'un inoculum est indispensable dans le cas d'une alimentation avec l’eau de ville car celle-ci est a priori très pauvre en micro-organismes.

Dans le cas d'un fonctionnement en circuit fermé, un inoculum est généralement apporté en début d'essai. Il est parfois renouvelé au cours de l'essai [LAMBERTI, 1993].

Les auteurs procèdent généralement par apport de supports naturels ou artificiels colonisés en milieu naturel [STEINMAN et al., 1990 ; CROSSLAND et al., 1991 ; Mc CORMICK, 1993 ; GIRLING et al., 2000] ou par ajout d'une « suspension périphytique ». Cette seconde méthode est bien évidemment plus « stressante » pour les organismes et, de ce fait, probablement plus sélective.

La suspension périphytique est obtenue par brossage de substrats naturels ou artificiels colonisés en milieu naturel. Cette opération se fait au moyen d'une brosse à dents, d'une lame en caoutchouc, d'un scalpel ou d'une lame de rasoir selon la nature du substrat [DUBÉ et CULP, 1996]. Dans le cas de support d'origine minérale, un traitement aux ultra-sons peut être préalablement effectué [KOSTEL et al., 1999]. Certains auteurs procèdent à une homogénéisation de la suspension par mixage ce qui conduit par ailleurs à l'élimination des macro-invertébrés [GENTER et AMYOT, 1994 ; GENTER 1995]. Préalablement à cette opération, DUBÉ et CULP (1996) effectuent une première filtration à 600 µm pour retirer les invertébrés de la suspension et une seconde filtration à 150 µm pour éliminer les matières en suspension. Le problème de l'introduction de matières en suspension est que celles-ci tendent à se déposer dans le canal [GODILLOT, 1998].

Enfin, si la plupart des auteurs versent la suspension lorsque les canaux sont en fonctionnement, KOSTEL et ses collaborateurs (1999) ont choisi d'introduire la solution périphytique lorsque les canaux sont à l'arrêt. Ils attendent ensuite 24h pour la mise en route des pompes et des lampes. Bien qu'aucune explication ne soit fournie, cette démarche vise probablement à réduire le stress des organismes.



DUBÉ et CULP (1996) procèdent de la même manière mais attendent uniquement 3 à 5h avant la mise en route des canaux. Ils justifient ce choix en expliquant que les organismes ont ainsi le temps de se déposer au fond des canaux. Quelle que soit la méthode adoptée pour l'introduction de la suspension périphytique, nous n'avons pas trouvé d'indication relative au mode de distribution de cette suspension dans les différents canaux. GENTER et AMYOT (1994) précisent que la suspension périphytique est répartie de manière homogène dans les quinze canaux artificiels mais la stratégie employée n'est pas présentée.

Enfin, certains auteurs utilisent parfois du périphyton de laboratoire obtenu dans des systèmes connexes. Les substrats ainsi colonisés sont soit placés directement dans les rivières artificielles « tests » [BARRANGUET et al., 2003], soit brossés pour collecter une suspension périphytique qui sert alors d'inoculum [GODILLOT, 1998]. Cette approche est particulièrement intéressante si le but est de maîtriser la variabilité intrinsèque du périphyton testé. Par ailleurs, elle facilite le renouvellement de l'inoculum.

Que ce soit un ensemencement par apport de substrats colonisés ou par introduction d'une suspension périphytique, la question suivante peut-être soulevée : l'ensemencement doit-il être renouvelé ou non au cours de l'essai ? DUBÉ et CULP (1996) effectuent un second ensemencement 24h après le premier apport de suspension périphytique mais ne justifient pas cette démarche.

D’une façon générale, le mode d’alimentation des canaux est souvent fonction de l’emplacement des rivières artificielles et de l’accessibilité des points d’eau d'alimentation. Ainsi, les canaux placés à l’extérieur sont souvent alimentés par de l’eau de rivière ou de lac alors que les canaux placés à l’intérieur sont plus facilement alimentés par de l’eau de nappe ou de ville.

3.3 Taux de renouvellement du milieu d'essai Le taux de renouvellement de l'eau peut être total, partiel ou nul.

Mc INTIRE (1993), distingue :

les systèmes « ouverts » dans lesquels l'eau ne s'écoule qu'une fois, les systèmes « fermés » où l'eau est remise en circulation en sortie de

rivières, les systèmes « semi-fermés » où la re-circulation est partielle.

La remise en circulation de l'eau dans les rivières en forme de chenal droit ou de « U » requiert l'utilisation d'une pompe ou d'un autre système telles que les vis d'Archimède. Plus généralement, toutes les formes de rivières se prêtent à un



fonctionnement en circuit « fermé », « semi-fermé » ou « ouvert » moyennant des aménagements plus ou moins complexes et coûteux. Ainsi, les canaux en forme de « U » ou de chenal droit sont plus adaptés à un fonctionnement en circuit ouvert et inversement, les canaux en forme d'ellipse ou d'hippodrome sont plus appropriés à un fonctionnement en circuit fermé. Certains canaux en forme de chenal droit font exception à cette tendance générale lorsqu'ils sont compartimentés dans la longueur et que l'eau est mise en mouvement par une roue à aubes [Mc INTIRE et al. 1964 ; BARRANGUET et al., 2003] ou de l'air comprimé [HORNER et al., 1983]..

3.3.1 Circuits ouverts

Le fonctionnement des canaux en circuit ouvert est préférable lorsque l'étude inclut le suivi de la dynamique de colonisation des espèces et, plus généralement, lorsque l'auteur s'intéresse à la diversité et à la stabilité de la communauté [BOTHWELL, 1993]. Certains des facteurs influençant le taux d'immigration des cellules, la composition taxonomique [STEVENSON et PETERSON, 1989] et l'abondance des cellules dans la colonne d'eau sont fonction du taux de renouvellement du milieu [BOTHWELL, 1989]. Ce point est cependant à relativiser en fonction de la nature du milieu d'essai.

D'un point de vue pratique, le mode de fonctionnement en circuit ouvert est plus difficilement envisageable lorsque :

le point d'alimentation en eau n'est pas situé à proximité de l'installation,

les essais sont effectués dans un milieu synthétique (trop de volume nécessaire),

un polluant est injecté.

Dans ce dernier cas, il est nécessaire d'anticiper sur les volumes de stockage du polluant et de l'eau en sortie de canal. Celle-ci doit être récupérée et traitée. Certaines rivières artificielles comme celles de Shell [CROSSLAND et al., 1991] sont d'ailleurs situées à proximité d'une installation de traitement des eaux usées afin de faciliter les opérations de récupération/traitement des eaux en sortie des canaux artificiels.

Les canaux fonctionnant en circuit ouvert nécessitent par ailleurs un dispositif plus complexe lorsque différentes concentrations en polluant sont testées. Dans ce cas, il est, en effet, impératif de maintenir la concentration en polluant constante au sein d'un même canal durant la durée d'exposition. Les auteurs utilisent généralement un bac intermédiaire pour effectuer le mélange « polluant-eau du milieu » au moyen de pompes à débit variable.



Plus généralement, le fonctionnement des canaux artificiels en circuit ouvert a pour conséquences :

la variabilité du milieu d’essais ; les eaux provenant d'une rivière sont probablement les plus variables.

l'apport d'organismes « sains » si les essais sont menés dans une eau de lac, de rivières ou de nappe sans filtration ou autre traitement préalable.

la nécessité d'une cuve de mélange « polluant-eau d'alimentation ». la possibilité de disposer d'une capacité de stockage et de traitement des

eaux contaminées.

3.3.2 Circuits fermés

Dans le cas des systèmes fermés, le problème principal à craindre est l'appauvrissement du milieu compte tenu de l'absence d'apport extérieur de matières nutritives [BARRANGUET et al., 2003]. Dans le cas du périphyton, ce point est d'autant moins négligeable que le rapport entre le volume d'eau en circulation et la surface colonisée est faible. Le volume disponible peut cependant être augmenté par simple ajout d'une cuve placée en dérivation du système et servant de réservoir [FLUM et al., 1993]. Enfin, la re-circulation de l'eau augmente les phénomènes d'évaporation. Ceux-ci sont bien évidemment moins problématiques dans le cas des essais menés sur une courte durée. Dans le cas contraire, il est nécessaire de compenser les évaporations. Le milieu d'essai est par ailleurs sujet à des variations de la concentration en polluant.

Ce point n'est pas anodin car un fonctionnement en circuit fermé est souvent motivé par la volonté de contrôler la nature du milieu. Or, le fait d'apporter de l'eau pour compenser les évaporations est forcément une source de variation potentielle. Si cet apport est important, il est nécessaire de s'assurer que les modifications du milieu sont négligeables. RAND et al. (2000) compensent, par exemple, l'évaporation de l'eau par apports d'eau provenant d'une nappe et non de la mare avec laquelle les canaux ont été initialement remplis, ceci pour éviter l'introduction d'organismes « sains » au cours de l'essai.

Enfin, si le milieu d'essai n'est pas commun à tous les canaux (communication entre les canaux), il est préférable de procéder à un remplissage fragmenté et alterné pour garantir une bonne homogénéité du milieu d'essai d'un canal à l'autre [CARDER et HOAGLAND, 1998].



3.3.3 Circuits semi-ouverts

Les avantages et inconvénients respectifs d'un fonctionnement en circuit ouvert ou fermé ont conduit de nombreux auteurs à s'orienter vers une re-circulation partielle du milieu [CROSSLAND et al., 1991] ou à fonctionner en circuit ouvert le temps de la colonisation du périphyton puis en circuit fermé pendant la durée du traitement [BARRANGUET et al., 2003]. Cela dit, le choix, par défaut, d'un fonctionnement en circuit semi-ouvert n'est pas toujours souhaité. En effet, selon les objectifs de l'étude, il peut être préférable de s'orienter vers l'un ou l'autre des deux modes de fonctionnement. Si l'étude porte sur la dynamique de succession des espèces, un apport continu – donc un fonctionnement en circuit ouvert – est plus adapté. Inversement, si l'auteur se concentre sur l'effet d'un facteur particulier sur le développement ou le fonctionnement du périphyton, le fait de fonctionner en circuit ouvert peut être une source de confusion en raison de l'introduction de nouveaux organismes et de la variabilité des caractéristiques physico-chimiques de l'eau d'alimentation [LAMBERTI, 1993b ; CAQUET et al. 2000].

Une re-circulation partielle du milieu impose un aménagement particulier pour la sortie d'eau. Le système le plus fréquemment utilisé est un trop-plein [CROSSLAND et al., 1991 ; BRUNET, 2000]. Ce système est simple et peu coûteux mais il ne permet pas d'évaluer précisément le taux de renouvellement réel de l'eau. Lorsque les canaux fonctionnent avec une re-circulation partielle, le temps de séjour et le temps de renouvellement du milieu d'essai sont généralement indiqués. A titre d'exemple, dans les canaux présentés par GENTER et AMYOT (1994), le renouvellement total du milieu (7.3 L) s'effectue sur une journée.

3.4 Support de colonisation : mode de disposition Dans les rivières artificielles, les substrats naturels ou artificiels servant de

supports de colonisation pour le périphyton sont fréquemment disposés sur le fond du canal en position horizontale. Certains auteurs ont néanmoins choisi de suspendre les substrats réservés à la colonisation du périphyton dans la colonne d'eau, parallèlement au sens de l'écoulement [GIRLING et al., 2000 ; BARRANGUET et al. 2003]. GENTER et al. (1988) placent les substrats au fond du canal mais en position verticale parallèlement au sens de l'écoulement. PAULSSON et al. (2000) placent aussi leurs substrats verticalement mais fixés aux parois. Les études où les substrats sont placés dans la colonne d'eau sont plus généralement effectuées en milieu naturel ou dans des microcosmes lentiques. Ce positionnement vertical évite non seulement une



colonisation passive des substrats mais limite aussi le dépôt des matières qui sont en suspension dans la colonne d'eau [WATANABE, 1985 ; ALOI, 1990].

Si la nature et les dimensions des substrats sont des données présentées dans la quasi-totalité des publications, le mode de disposition au fond du canal est moins clair. Ce point est pourtant important car les conditions d'écoulement au fond du canal sont, entre autres, fonction des caractéristiques des substrats introduits. Ainsi, si le développement d'une communauté homogène est recherché, il faut tenir compte du fait qu'un substrat subit les turbulences liées à la présence des substrats placés en amont, notamment dans le cas d'un écoulement de type fluvial (voir partie « échantillonnage »). Une distance égale à dix fois l'épaisseur des substrats est nécessaire pour éliminer l'interaction substrat/substrat (LALLEMAND, communication personnelle, 2001).

Dans le but de placer les substrats dans des conditions d'écoulement comparables, certains auteurs ne laissent aucun espace entre les substrats et les disposent sur la totalité du fond du canal afin que l'écoulement soit le plus homogène possible [LAU et LIU, 1993 ; GODILLOT, 1998 ; REITER, 2001].

3.5 Stade de colonisation et mode d'injection de l'effluent Selon BELANGER (1997), la plupart des auteurs respectent une durée de

colonisation suffisante pour que les communautés biologiques testées atteignent une certaine stabilité vis-à-vis de leur composition et de leur biomasse. Mc CORMICK (1993) respecte un temps de colonisation de 21 jours pour que la communauté algale du périphyton développé dans ces canaux atteigne un stade « mature ». D'autres auteurs, au contraire, injectent le polluant lorsque le périphyton est en phase de croissance exponentielle. Ce choix peut être la conséquence de considérations pratiques et/ou scientifiques.

D'un point de vue pratique, la durée d'essai est souvent limitée du fait d'une re-circulation totale du milieu et/ou du nombre d'échantillons prélevés avant et après traitement. Ainsi, limiter la durée de colonisation du biofilm avant traitement permet d'augmenter la durée d'exposition.

D'un point de vue scientifique, le fait de travailler sur un biofilm « jeune » peut être motivé par la volonté d'étudier l'effet d'une perturbation sur les processus de colonisation (succession des espèces, structure du biofilm...) ou par la volonté d'étudier l'effet d'une perturbation lorsque les échanges entre la colonne d'eau et les organismes présents dans le biofilm sont maximums. En effet, lors du développement des biofilms, les interactions intra et inter-spécifiques se complexifient et les processus de régulation internes deviennent progressivement plus importants que les facteurs de régulation



externes [SAND-JENSEN, 1983 ; WATANABE et al., 1988]. Ainsi, au fur et à mesure de la croissance du biofilm, la relation "exposition-réponse" est plus complexe.

Par ailleurs, l'épaisseur globale du biofilm augmente au cours du temps, jusqu'à un stade « critique » de décrochement fonction des conditions hydrodynamiques à proximité des substrats. La matrice polysaccharidique s'épaissit également et agit comme une barrière de diffusion limitant ainsi les échanges avec la colonne d'eau [LOCK et al., 1984]. Ces échanges concernent le transport d'éléments nutritifs et des cellules planctoniques jusqu'au substrat [STOOLEY et al., 2000]. La matrice polysaccharidique permet au biofilm de mieux résister aux agressions extérieures et limite les effets d'un polluant aux couches de surface [MARSH et BOWDEN, 2000 ; SABATER et al., 2002].

Pour conclure sur ce sujet, LOWE et al. (1996) montrent que les variations inter-canal observées lors de la colonisation du périphyton en canaux artificiels diminuent au cours du temps et deviennent négligeables dès la quatrième semaine. Une corrélation négative significative est mise en évidence entre le coefficient de variation inter-canal et le nombre de cellules algales. Plus la communauté algale se développe (augmentation du nombre de cellules), plus les variations inter-canal diminuent vis-à-vis de ce biodescripteur (CV < 6% à partir de la quatrième semaine).

Les conclusions de LOWE et al. (1996) confirment les résultats d'études précédentes [SAND-JENSEN, 1983 ; WATANABE et al., 1988] : lorsque les communautés périphytiques atteignent leur stade « mature », elles sont davantage influencées par les processus endogènes que par les processus de colonisation exogènes. Il était nécessaire d'aborder ce point car plus les variations inter-canal sont faibles, plus la réponse du périphyton à un traitement est facilement identifiable.

CROSSLAND et al. (1991) testent deux modes d'injection du polluant (pesticide). Le premier consiste à introduire « aussi vite que possible » le polluant par ajout du volume nécessaire dans le canal pour atteindre la concentration souhaitée. Dans le second cas, le polluant est apporté avec l'eau de renouvellement car les canaux fonctionnent en circuit partiellement ouvert. Ce système nécessite un équipement supplémentaire tels que des bacs d'alimentation propres à chaque canal au sein desquels le mélange « milieu d'essai & polluant » est effectué à la concentration testée.

De notre point de vue, le mode d'injection du polluant n'est pas sans conséquence sur les résultats. Dans le cas du périphyton, par exemple, le changement brutal de la nature du milieu d'essai, par introduction du polluant directement dans le canal, est susceptible d'entraîner une modification rapide de la composition taxonomique et/ou du fonctionnement du périphyton. Si l'effet est clairement observé, il est cependant difficile de distinguer l'effet lié au changement brutal des conditions environnantes de celui lié à l'exposition aux polluants. Cette remarque n'est valable que si l'auteur cherche à découpler l'influence des deux facteurs. L'importance de ce point est toutefois fonction des effets observés. Si l'auteur s'intéresse à l'effet immédiat



d'un pic de pollution, la réponse doit prendre en compte l'effet couplé « changement de milieu & exposition au polluant ». Inversement, si le polluant est apporté en mélange avec l'eau de renouvellement du milieu d'essai, il est légitime de penser que la résistance de certains organismes est favorisée par l'exposition progressive au polluant qui permet un temps d'acclimatation. Cette approche présente plus d'intérêt si la pollution étudiée est chronique. Une solution intermédiaire peut consister à préparer le mélange « milieu d'essai & polluant » à la concentration souhaitée pour procéder ensuite au renouvellement total du milieu mais elle est plus complexe à mettre en pratique.

Par ailleurs, l'injection du polluant ne doit pas créer de perturbation physique susceptible d'entraîner des phénomènes d'arrachage du périphyton à moins que l'effet d'une crue soit également simulé.

En conclusion, le mode d'injection retenu doit être fonction des effets étudiés et, bien évidemment, des contraintes expérimentales. Il est également important de se soucier du temps nécessaire à l'obtention de la concentration en polluant souhaitée dans les canaux et du maintien de cette concentration pendant la durée totale d'exposition.

3.6 Nombre de réplicats par traitement Dans ce paragraphe, le terme « réplicat » est utilisé au sens de « réplicat de

canal ». Les « pseudo-réplicats » désignent les réplicats d'échantillons prélevés au sein d'un même canal.

La réplication des traitements améliore la fiabilité des données dans la mesure où elle permet de distinguer la variabilité naturelle entre les systèmes, des effets attribuables au traitement. Dans ce sens, le nombre de réplicats nécessaire pour pouvoir conclure sur la réponse à un traitement est fonction de la variabilité naturelle de la variable mesurée.

Les études visant à identifier les effets indirects secondaires d'un traitement nécessitent plus de réplicats car ils s'effectuent à plus long terme, c'est-à-dire plusieurs mois, ce qui augmente la variabilité inter-systèmes [CROSSLAND et LA POINT, 1992]. Pourtant, à cette échelle temporelle, les essais sont généralement effectués dans des rivières artificielles supérieures à 50 mètres et il est difficile de répliquer les traitements [SWIFT et al., 1993]. Précédemment, nous avons évoqué les résultats de LOWE et al. (1996) qui montrent que les variations inter-canal observées lors de la colonisation du périphyton en canaux artificiels diminuent au cours du temps mais les essais n'étaient pas menés sur plusieurs mois mais sur plusieurs semaines.



Plus généralement, le nombre de réplicats par traitement est plus ou moins fonction de la taille des canaux et, indirectement, des moyens humains, des moyens financiers et de l'espace disponible. Ce dernier point est en opposition avec le fait que la variabilité inter-canal augmente avec la taille des systèmes [PETERSEN et al., 1999].

Dans le domaine de l'écotoxicologie, les auteurs privilégient souvent la multiplication de systèmes non répliqués sur le nombre de réplicats afin d'élargir la gamme de concentrations testées [KOSINSKI, 1989 ; GUCKERT, 1993 ; LOWE et al., 1996] et d'optimiser l'identification de la relation « exposition-effet ».

Du point de vue du traitement des données le statisticien va incontestablement défendre la nécessité de répliquer les traitements afin d'augmenter la fiabilité des résultats, notamment par la prise en compte de la variabilité naturelle des variables biologiques et physico-chimiques étudiées. Mais, comme il a été mentionné ci-dessus, la multiplication des réplicats par traitement implique généralement une réduction de la taille des systèmes expérimentaux. Si la taille ne définit pas à elle seule le réalisme de l'essai, elle y contribue fortement et permet, par ailleurs, de diminuer l'effet « dispositif ». Ces observations soulèvent la question suivante : est-il préférable de travailler dans l'optique d'un traitement statistique des données ou de favoriser le réalisme de l'essai et de diminuer l'effet « dispositif » ? Enfin, quelle doit être la taille minimale nécessaire du dispositif expérimental et le nombre minimal nécessaire de réplicats par traitement ? Différentes approches sont appliquées.

Certains auteurs procèdent à une étude préliminaire visant à vérifier l'homogénéité des rivières artificielles avant traitement [BRUNET, 2000]. Cette vérification est généralement effectuée par une analyse de variance visant à évaluer « l'effet canal ». Si les variations inter-canal sont non significatives (p < 0,05) pour chacune des variables biologiques et chimiques mesurées, le nombre de réplicats par traitement est limité, voire nul, lors des essais suivants. Cette approche a été retenue par BELANGER et al. (2000) qui s'appuient sur l'étude de LOWE et al. (1996) pour justifier le fait de ne pas répliquer les rivières « tests » et de répliquer uniquement la rivière « témoin ». L'étude de LOWE et al. (1996) montre effectivement une variabilité très faible entre les rivières artificielles à partir de la quatrième semaine de colonisation. Cette démarche suppose que les auteurs font l'hypothèse que l'homogénéité des systèmes expérimentaux est vérifiée quels que soient la période d'essai et le traitement.

Afin qu'un traitement statistique des données soit possible alors que les différents traitements n'ont pas fait l'objet de réplicats, les auteurs ont recours à ce que l'on pourrait qualifier de pseudo-réplicats. Il s'agit de réplicats prélevés au sein d'un même canal et non de réplicats de canaux soumis au même traitement. Une question se pose : lorsque le milieu d'essai est commun aux canaux exposés à un même traitement (circulation entre les canaux), est-il juste de considérer ces mêmes canaux comme de vrais réplicats ?



Concluons avec la remarque de HURLBERT (1984). Celui-ci constate que le besoin de réplication est fortement imposé dans le cadre de la publication des travaux. Les auteurs ont ainsi tendance à s'orienter vers des canaux de petites tailles pour favoriser la réplication des systèmes. Bien que cette approche augmente la fiabilité des résultats, Mc INTIRE (1993) s'interroge sur la prise en compte des considérations scientifiques dans cette démarche. Si la réplication des systèmes augmente en effet la fiabilité et la crédibilité des résultats, les scientifiques devraient alors privilégier la multiplication de systèmes de petites tailles et non la réalisation de systèmes plus larges et plus réalistes qui forcent à restreindre le nombre de réplicats par traitement. Il souligne cependant que les seules données pertinentes du laboratoire sont celles qui fournissent avant tout une information réaliste sur la réponse et privilégie ainsi les canaux de plus grandes tailles. Au-delà de l'aspect provocateur de cette réflexion, il nous semble essentiel de retenir que la taille des systèmes doit résulter d'un compromis équilibré entre les contraintes de réalisme et les contraintes de fiabilité.

3.7 Mode d'échantillonnage Le mode d'échantillonnage n'est pas toujours précisé dans les articles, ce qui

laisse supposer que la plupart des auteurs effectuent des prélèvements de manière aléatoire. A titre d'exemple, BELANGER et al. (2002) procèdent à un échantillonnage aléatoire de 5 prélèvements par rivière artificielle d'une longueur de 12 mètres. La zone d'échantillonnage du périphyton contient 3 colonnes (parallèles au sens de l'écoulement) constituées de 45 carreaux en céramique non vernis.

D'autres auteurs effectuent un échantillonnage stratifié aléatoire :

KOSTEL et al. (1999) prélève aléatoirement le même nombre de substrats dans trois zones du canal (amont, centre et aval). Il s'appuie sur l'absence de variabilité dans la largeur du canal pour justifier ce découpage longitudinal dans des canaux d'une longueur de 2.43 m et d'une largeur de 63.5 cm.

STEINMAN et al. (1990) opère de la même manière que KOSTEL et al. (1999) dans des canaux en « U » d'une longueur de 10 m et d'une largeur de 30 cm en se limitant à deux zones seulement (amont/aval). FLUM et al. (1993) effectuent également un découpage amont/aval dans des canaux d'une longueur de 3 m et d'une largeur de 10 cm.

GENTER et AMYOT (1994) effectuent également un échantillonnage stratifié dans des canaux ayant une longueur de 41 cm. Les canaux sont recouverts de trois colonnes (parallèles au sens de l'écoulement) constituées de cinq carreaux en céramique non vernis. Leur procédure



d'échantillonnage consiste à prélever au hasard trois carreaux : un dans la première rangée, un dans la dernière rangée et le troisième est aléatoirement prélevé dans les rangées du milieu (perpendiculaire au sens de l'écoulement). Ces trois substrats sont regroupés pour former un échantillon. Un seul échantillon est collecté au sein d'un même canal et trois réplicats de canaux sont effectués par traitement.

Il est intéressant de noter que les auteurs cités ci-dessus se soucient de l'hétérogénéité spatiale de la colonisation du périphyton mais ne considèrent que la variabilité longitudinale. Pourtant, les parois des canaux sont susceptibles de modifier localement les conditions d'éclairage ou d'écoulement. Dans ce cas, une variabilité latérale peut être observée.

La plupart des auteurs remplacent les substrats prélevés par de nouveaux substrats vierges dans le but de limiter les perturbations hydrauliques [LAU et LIU, 1993 ; LOWE et al., 1996 ; GODILLOT, 1998 ; REITER, 2001 ; BELANGER et al., 2002]. Lorsque les substrats ne sont pas remplacés ou que l'écoulement est de type torrentiel, certains auteurs prélèvent les substrats en remontant de l'aval vers l'amont des canaux artificiels pour minimiser les perturbations hydrauliques [LOWE et al., 1996 ; BRUNET, 2000]. Dans le cas d'un régime torrentiel cette approche se justifie par le fait que la célérité des ondes est inférieure à la vitesse de l'eau et une perturbation n'affecte les conditions de l'écoulement qu'à l'aval de son départ. Si au contraire, l'écoulement est fluvial, les ondes se propagent plus vite que l'eau et toute perturbation affecte les conditions de l'écoulement à la fois en amont et en aval de son point de départ. La distinction entre ces deux régimes se fait par le calcul du nombre de Froude : le régime est fluvial si le nombre de Froude est inférieur à 1 [CHOCAT, 1997].

À notre sens, la procédure d'échantillonnage est un point essentiel car l'échantillon testé doit être représentatif de la communauté et, de ce fait, intégrer l'éventuelle hétérogénéité spatiale du périphyton dans les canaux. De nombreuses études ont pour objectif d'établir un lien entre l'évolution structurelle ou fonctionnelle du périphyton dans des conditions expérimentales spécifiques. En cas d'hétérogénéité spatiale du périphyton, le risque est de se méprendre sur l'effet d'un facteur dont l'influence est étudiée. Si, entre deux temps de prélèvement, une évolution significative du périphyton est déterminée, on peut se demander si elle est le résultat de l'effet « facteur étudié » ou bien d'un effet « position dans le canal » ? Face à cette question, plusieurs attitudes sont possibles :

Procéder à un échantillonnage aléatoire. Diviser la zone d'étude en plusieurs secteurs homogènes et procéder à

un échantillonnage stratifié aléatoire. Définir une zone d'échantillonnage au sein de laquelle la variabilité

spatiale est réduite voire négligeable.



La fiabilité de ces trois approches est fonction de l'intensité de l'échantillonnage. Plus l'opérateur aura le souci de découper sa zone d'étude en secteurs homogènes ou, mieux, de définir une zone d'échantillonnage homogène, plus la taille de l'échantillon (nombre de prélèvements) peut être limitée sans risque d'introduire un biais dû à l'échantillonnage [BOTHWELL, 1993]. Cela réduit le temps de prélèvement, le temps d'analyse et permet d'augmenter la fréquence d'échantillonnage et/ou la durée de l'étude.

En dehors des problèmes d'effets d'ombrage ou de température, la variabilité spatiale peut être réduite par homogénéisation des conditions d'écoulement à proximité des substrats. Les interactions « périphyton-écoulement » ont été mises en évidence par de nombreux auteurs. Parmi ces travaux, nous soulignerons ceux de GODILLOT (1998) qui procède à des mesures précises et non intrusives de profils de vitesses longitudinaux par anémométrie Laser-Doppler. Il ressort de ces études que les conditions hydrodynamiques à proximité des substrats ont une influence sur la morphologie des espèces algales [REITER, 1989], la composition et l'architecture du périphyton mais que le développement du biofilm modifie en retour les conditions hydrodynamiques micro-environnementales [REITER et CARLSON, 1986 ; REITER, 1989 ; DENICOLA et Mc INTIRE, 1990]. Les conditions d'écoulement près des substrats sont, dans un premier temps, influencées par la rugosité du substrat puis le développement du biofilm augmente [REITER, 1986 ; NIKORA et al., 1997, NIKORA et al., 1998] ou diminue [BIGGS et HICKEY, 1994 ; GODILLOT, 1998], ce qui expliquerait cet effet « feedback ».

Afin que les substrats placés au fond du canal soient dans les conditions d'écoulement les plus homogènes possibles, il est important de limiter les perturbations liées à l'entrée et à la sortie du flux, de faire en sorte que l'épaisseur de la couche limite, développée sur le fond du canal, soit constante et de tenir compte des effets de bords.

NOWELL et JUMARS (1987) insistent sur l'importance des conditions d’entrée du flux dans la veine d'étude du canal pour le développement d’un écoulement simple. Selon eux, cette problématique revient à essayer d'obtenir un flux dont « l'histoire récente est oubliée ». Ainsi, à l'entrée de la zone de travail, il est nécessaire de limiter autant que possible les changements de section car ils provoquent la formation d'un jet central. Ce phénomène est généralement observé lorsque l'eau arrive dans le canal par un tuyau. Dans ce cas, NOWELL et JUMARS (1987) estiment que le jet central ne disparaît totalement de l'écoulement qu'après une distance équivalente à vingt fois le diamètre du tuyau. Dans des canaux de petites tailles ou lorsqu'un débit important est souhaité (augmentation du diamètre de la canalisation d'alimentation), cette contrainte limite fortement la zone d'écoulement homogène au sein de laquelle l'échantillonnage peut être effectué. Dans ce cas, il est possible d'ajouter une cuve de tranquillisation [GODILLOT, 1998 ; LAU ET LIU, 1993] et/ou de briser le « jet central » en forçant son passage au travers d'une grille [VYMAZAL, 1988 ; KOSTEL et al., 1999] ou d'un filtre



[GODILLOT, 1998]. Enfin, l'extrémité du tuyau d'alimentation entrant dans le canal peut être en forme de « T » et perforé [GODILLOT, 1998]. Il s'agit d'une « clarinette ». Par ailleurs, les courbures des tuyaux d'alimentation doivent être limitées car elles entraînent une accélération de la vitesse et une dissociation du flux. Une fois que le « jet central » est brisé certains auteurs utilisent un déflecteur pour re-canaliser le flux [REITER, 2001].

Les conditions de sortie du flux de la partie linéaire du canal sont moins abordées. Si la chute d'eau n'est pas libre, les auteurs utilisent un clapet ou une barrière ce qui permet d'ailleurs de contrôler la hauteur de lame d'eau dans le canal. Pour NOWELL et JUMARS (1987), le meilleur système est une barrière à claire-voie (barrière à lamelles).

Lors de l'écoulement d'un fluide sur une paroi solide, il existe une interaction entre le liquide en mouvement et la paroi solide. Sous l'effet de la viscosité du fluide, la vitesse d'écoulement à proximité de la frontière avec un autre milieu est proche de la vitesse de cet autre milieu. Autrement dit, dans le cas d'un écoulement sur une surface fixe, telle une paroi (bord ou fond du canal), la vitesse de l'eau à proximité de la paroi est nulle puis elle augmente jusqu'à une valeur constante. Cette zone, appelée « couche limite », se caractérise par une variation rapide de la vitesse selon un axe perpendiculaire à la paroi (gradient de vitesse important). A l'extérieur de cette zone, le gradient de vitesse est pratiquement nul. Les contraintes de cisaillement dans cette couche sont fonction de la viscosité du fluide et de la rugosité de la paroi [LENCASTRE, 2001].

De l'entrée du canal vers son aval, et de ses bords latéraux vers son centre, l'épaisseur de la couche limite augmente avec la distance jusqu'à une valeur maximale à partir de laquelle elle reste constante (Figure 7). Près du bord d'attaque, la couche limite est toujours laminaire puis, après une certaine distance parcourue celle-ci peut devenir turbulente. La limite de turbulence est caractérisée par une brusque augmentation de l'épaisseur de la couche limite et du cisaillement. Le point de transition est donné par le nombre de Reynolds de la couche limite (Rec). En cas de régime turbulent dans la couche limite, les fluctuations propres à la turbulence tendent graduellement vers zéro au voisinage immédiat de la paroi. Ainsi, sur une surface lisse, il persiste toujours un film laminaire au voisinage de la paroi, celui-ci est également connu sous le terme de sous-couche visqueuse (Figure 8).



Figure 7. Développement d'une couche limite d'épaisseur δ [BLEVINS, 1992]. Légende : δ : épaisseur de la couche limite. u : vitesse au sein de la couche limite. U : vitesse à l'extérieur de la couche limite.

Figure 8. Profil des vitesses dans la couche limite sur une surface lisse [LALLEMAND, 1975].

Laminaire Transition Turbulent

Turbulent outlayer

Viscous sublayer

On ne détaillera pas ce point plus avant, mais il était nécessaire d'introduire

ces concepts car la couche limite conditionne fortement le micro-environnement du périphyton. D'une part, les échanges entre le périphyton et la colonne d'eau se font via cette couche limite par phénomène de diffusion [SAND-JENSEN, 1989]. L'accessibilité aux éléments nutritifs et aux cellules présentes dans la colonne d'eau est ainsi fonction de l'épaisseur de la couche limite, elle-même fonction de la vitesse d'écoulement dans les canaux. Plus la couche limite est importante moins bien se fait la diffusion selon un axe perpendiculaire à cette couche, c'est-à-dire de la colonne d'eau vers le périphyton. L'augmentation de la vitesse peut réduire l'épaisseur de la sous-couche laminaire [HORNER et WELCH, 1981 ; BOTHWELL, 1993]. D'autre part, la couche limite joue également un rôle dans les possibilités de fixation ou d'arrachement des algues diatomées (immigration/émigration), ce qui influe sur la structure de la communauté et la dynamique de succession des espèces [HOFFMANN, 1993]. Ainsi, le taux d'immigration des espèces algales est, entre autres, fonction de la taille des cellules et de l'épaisseur de la couche limite. Ces facteurs suggèrent que la succession des espèces est, au moins en partie, fonction de l'évolution des conditions hydrodynamiques à proximité des substrats [REITER, 2001].



Pour ces différentes raisons, il importe de travailler dans une zone où la couche limite est d'une épaisseur constante. Ce point est vérifié lorsque le régime est établi, c'est-à-dire uniforme. Selon LENCASTRE (2001), un écoulement uniforme peut être obtenu dans un canal rectiligne de pente et de section constantes à condition de se placer suffisamment loin des extrémités amont et aval. Malheureusement, l'auteur ne donne pas plus de précisions quant à l'estimation des distances minimales à respecter en amont et en aval de la zone d'étude au sein de laquelle l'écoulement serait homogène. PAULSSON et al. (2000) ont choisi d'insérer dans leurs canaux (aquarium avec une alimentation continue) un système d'agitation afin de réduire la couche limite qui se développe entre le périphyton et la colonne d'eau. Si les substrats sont rapprochés, la couche limite déclenchée par chaque substrat finit par envahir l'ensemble de la colonne d'eau, ce qui homogénéise l'écoulement.

Quant aux « effets de bords », ils résultent de la formation de tourbillons engendrés à l'intersection des couches limites développées sur le fond et les parois du canal. Ce phénomène existe également à l'intersection entre la couche limite de surface (interface air/eau) et celle qui se développe sur le fond du canal si la profondeur de la lame d'eau est faible. NOWELL et JUMARS (1987) conseillent de travailler dans des canaux aussi larges que possible pour minimiser ces effets. Au minimum, ils suggèrent de fixer un ratio « largeur/profondeur » supérieur à cinq et si possible voisin de dix pour réduire ces effets. Ils conseillent également de limiter la zone de travail à 25% de la largeur du canal. Selon CAQUET et al. (2000), la procédure d'échantillonnage mise en place doit tenir compte de ces effets de bords.

Le biologiste ne possède pas toujours les moyens et la connaissance du physicien pour déterminer une zone de travail au sein de laquelle l'écoulement est uniforme. Aussi, nous évoquerons les techniques plus accessibles afin de procéder à cette identification :

l'identification des zones de turbulence au moyen de particules fines et d'un colorant ; cette technique est utilisée mais non décrite par REITER (2001) ;

la caractérisation intégrée des caractéristiques du flux par l'utilisation d'hémisphères de taille et de surface identiques mais de densités différentes [STATZNER et MÜLLER, 1989 ; STATZNER et al., 1991 ; Photo 5 ; Photo 6].



Photo 5. Hémisphères du laboratoire d'Ecologie des Eaux Douces, Université Lyon 1.

Photo 6. Utilisation des hémisphères dans les canaux du laboratoire.

3.8 Lavage des canaux Avant de conclure sur ce chapitre, nous souhaitons aborder le problème du

lavage des canaux car cet aspect est peu explicité dans la bibliographie. Il a pour objectif l'élimination des organismes éventuellement fixés sur les parois ou dans les tuyaux.

D'un point de vue biologique et chimique (adsorption), la qualité et la facilité de cette opération sont fonction de la nature du matériau de construction des canaux. Les canaux en verre (aquarium avec circulation d'eau) peuvent être lavés avec de l'acide nitrique concentré [IVORRA et al., 2002]. Certains matériaux comme l'acier inoxydable peuvent être nettoyés par brossage. Cependant, la présence de zones inaccessibles, tels que les tuyaux de circulation d'eau, rend parfois cette opération insuffisante. Dans ce cas, un traitement chimique doit être envisagé. L'injection d'un mélange de désinfectant, d’algicide et d'eau de javel pendant 24h suivie de trois lavages à l'eau facilite le détachement du biofilm résiduel ou, au minimum, le détruit [FLUM et al., 1993].

D'un point de vue chimique, après nettoyage des canaux, une analyse systématique de l'eau en sortie de canal peut permettre de vérifier la qualité du lavage.



4. Synthèse Le degré de réalisme des essais en canaux artificiels dépend de leur mode de

fonctionnement. Une synthèse des critères qui nous semble les plus déterminants est proposée sur la figure ci-après (Figure 9).

Pour conclure ce chapitre, nous suggérons la lecture des articles de synthèses relatifs à l'utilisation des rivières artificielles publiés par WARREN et DAVIS (1971), SHRINER et GREGORY (1984), KOSINSKI (1989), LAMBERTI et STEINMAN (1993b) et enfin, GUCKERT (1993).

SHRINER et GREGORY (1984), KOSINSKI (1989) et GUCKERT (1993) traitent de l'utilisation des rivières artificielles en écotoxicologie. Les articles de WARREN et DAVIS (1971) et de LAMBERTI et STEINMAN (1993b) portent principalement sur l'utilisation des rivières artificielles en écologie.


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6

PARTIE 2. Etude expérimentale

La partie expérimentale de ce rapport se compose de trois chapitres où sont successivement présentés :

les dispositifs expérimentaux (bio-essais et canaux artificiels) conçus dans le cadre de ce travail, ainsi que les méthodes biologiques et chimiques appliquées : chapitre 1 ;

les réponses de communautés périphytiques naturelles exposées à différentes concentrations de l'effluent industriel dans des cosmes statiques (bio-essais) : chapitre 2 ;

les réponses de communautés périphytiques de laboratoire exposées à différentes concentrations de l'effluent industriel dans des cosmes lotiques : chapitre 3.

Une synthèse des différents essais effectués (grille expérimentale) et des caractéristiques chimiques et écotoxiques de l'effluent industriel testé est proposée entre le premier chapitre relatif au "matériels et méthodes" et ceux relatifs à la présentation des résultats.


Partie 2. Chapitre 1. Matériels et méthodes.

Chapitre 1. Matériels et méthodes.

Dénombrement bactérien (DAPI)

Navicula lanceolata [DRUART, INRA de Thonon]

Achnanthes minutissima

[DRUART, INRA de Thonon]



Cette partie se compose de la description des dispositifs et des protocoles expérimentaux définis. Il s'agit de tests d'écotoxicité menés en conditions statiques, que nous appellerons « bio-essais », et de tests d'écotoxicité menés en canaux artificiels. Les méthodes appliquées pour la mesure des effets écotoxicologiques de l'effluent industriel sur le périphyton sont également explicitées. Quant aux méthodes relatives aux analyses chimiques, seules les références normatives sont indiquées.

Les paramètres biologiques suivis varient selon les campagnes d'essais et selon le type d'essais. Pour cette raison, à la fin de cette partie, un tableau synthétique illustre l'ensemble des expérimentations effectuées et exploitées dans le cadre de ce travail. Les essais préliminaires ayant conduit à la mise au point des bio-essais et des essais en canaux artificiels ne sont pas présentés.

Enfin, il est nécessaire de signaler que l'effluent testé provient d'un échantillonnage unique réalisé par POLDEN et SOLVAY. Compte tenu des quantités nécessaires, un stockage à 4°C n'a pas pu être envisagé. En conséquence, l'effluent a été stocké dans deux cuves opaques extérieures de 6 m3. L'évolution de l'effluent dans le temps a été contrôlée par POLDEN qui a conclu à une évolution non significative, ceci en raison du caractère essentiellement salin et minéral de l'effluent.

1. Dispositifs et protocoles expérimentaux

1.1 Essais en conditions statiques : bio-essais Des substrats artificiels sont placés en milieu naturel sur le site d’étude,

c'est-à-dire la Meurthe (54), et sont collectés après six semaines de colonisation. Le périphyton est ensuite exposé à des concentrations variables en effluent dans des flacons en verre d'une contenance de 150 mL. L'essai est réalisé dans des conditions de température et de lumière contrôlées durant 14 jours. Le biofilm est caractérisé avant et après exposition à l'effluent et des mesures bihebdomadaires d'activités photosynthétiques sont effectuées pendant la période d'essai.

1.1.1 Dispositif de collecte en milieu naturel

Ces essais sont effectués sur des communautés périphytiques colonisées sur des substrats artificiels pour diminuer la variabilité naturelle et éliminer la



subjectivité des choix lors des opérations de collecte. Sachant que les supports artificiels sont sujets au vandalisme et aux aléas hydrologiques, ces derniers ont été placés dans un canal alimenté par la Meurthe à quelques kilomètres en amont des rejets de l’usine de Dombasle. Cet emplacement est peu fréquenté, non accessible au public et les variations de la hauteur d’eau sont moindres (20 cm maximum). Ce choix évite les problèmes d'accessibilité aux berges, et indirectement aux substrats lors des crues répétées du cours d'eau.

Le dispositif de collecte est conçu pour permettre un positionnement vertical des substrats. La résistance et la durabilité de l'installation sont prévues pour supporter un séjour d’une année dans l’eau sans dommage. En effet, les substrats sont régulièrement collectés et remplacés mais le support principal est, quant à lui, installé de manière permanente pendant la durée des expérimentations.

Le dispositif est constitué de quatre séries de douze lames de verre. Les lames (68*24*4 mm) ont une face sablée pour faciliter la colonisation du périphyton ; chaque série de douze lames est encastrée dans deux rails en aluminium [BRUNET et al., 2001] d’une section interne carrée de 4 mm et d’une longueur de 33 cm, dimensions imposées par la taille de la glacière utilisée pour le transport des lames colonisées jusqu’au laboratoire. Le maintien des lames de verre est assuré par deux petites plaques en PVC de même épaisseur que les lames comportant des encoches dans lesquelles viennent s’encastrer les deux rails. L’ensemble «lames et rails» ainsi constitué est fixé sur une plaque en PCV de 300*800*7 mm par des vis en acier inoxydable et des écrous à oreilles pour éviter la rouille et faciliter les opérations de desserrage (Photo 7).

L’ensemble est immergé à 20 cm au-dessous de la surface de l’eau et au centre du canal dont la largeur est égale à 7,5 mètres. Le dispositif n'est pas équipé d'un flotteur, ce qui garantirait une hauteur d'eau constante au-dessus des substrats [WATANABE, 1985], car les variations du niveau de l'eau dans le canal sont rares. Néanmoins, le dispositif est contrôlé régulièrement et, si nécessaire, un ajustement de la hauteur d'immersion est effectué. Enfin, l'installation est telle que les substrats sont positionnés verticalement et parallèlement à l'écoulement (Figure 10).



Photo 7. Dispositif de collecte sur substrats artificiels avant immersion.

Figure 10. Dispositif de collecte sur substrats artificiels in situ. [représentation J.C MARTINEZ, 2004]

Lame de verre (68*24*4 mm)

rails en aluminium

Plaque PVC pour le maintien des lames

288 mm

Rive gauche

Rive droite

1.1.2 Dispositif de laboratoire

Le dispositif comporte trente flacons en verre transparent ayant un diamètre de 57 mm, une hauteur totale de 106 mm et une contenance de 150 mL (Photo 8 ; Photo 9). Afin de pouvoir effectuer les mesures d'activités photosynthétiques par dosage de l'oxygène dissous dans des conditions hermétiques, il s’agit de flacons à col rodé ; ce matériel est classiquement utilisé pour les mesures de DBO (Demande Biochimique en Oxygène). Les flacons sont disposés sur deux plaques d’agitation immergeables équipées de quinze postes chacune. L’ensemble est placé dans un bain thermostaté situé sous une rampe de néons. Ceuc-ci se composent d’un tube fluorescent « lumière du jour » (PRESTIFLUX TF P 58 JR/865) couplé à un tube spécial « plantes vertes » (SYLVANIA GROLUX) fournissant une intensité lumineuse est de 8000 lux. la



photopériode est régulée par un système. Le spectre de ces néons est présenté dans le chapitre relatif aux essais en canaux artificiels. Ces conditions d'éclairage (intensité et qualité du spectre) respectent les prescriptions de la norme NFT95-375 (1998) relative à la détermination de la toxicité chronique des eaux par inhibition de la croissance de l'algue douce Pseudokircneriella subcapitata.

Photo 8. Dispositif expérimental. 30 flacons d'essai..

Photo 9. Flacon d'essai (150 mL).

106m

m

1.1.3 Protocole expérimental

1.1.31 Choix des conditions expérimentales

La température ainsi que la photopériode fixées pendant les essais sont fonction des conditions observées sur le terrain lors de la collecte des substrats colonisés. Les milieux d'essai sont préparés par dilution de l'effluent testé dans l'eau du milieu de collecte des substrats, c'est-à-dire l'eau de la Meurthe ; ils sont renouvelés une fois par semaine. Le nombre de concentrations testées et le nombre de réplicats par concentration dépendent du nombre de postes disponibles, à savoir 30, et du nombre de réplicats minimum pour un traitement statistique. Selon les essais, 5 à 6 concentrations en effluent comprises entre 0.4% et 70% (vol.) ont été testées. Des essais témoins (absence d'effluent) ont systématiquement été effectués. En revanche, compte tenu du nombre limité de postes, des essais blancs (absence de lames colonisées) n'ont pas été réalisés. Ainsi, l'activité photosynthétique mesurée inclut aussi bien l'activité des organismes en suspension dans le milieu d’essai que celle des organismes périphytiques.



1.1.32 Déroulement des essais et mesure des effets écotoxicologiques

Les lames sont collectées avec les rails en aluminium ; l'ensemble est disposé verticalement dans une glacière contenant l'eau du milieu naturel pour le transport jusqu'au laboratoire (Photo 10). Une fois au laboratoire, les lames sont extraites des rails et aléatoirement sélectionnées pour le lancement des bio-essais (Photo 11). Elles sont introduites dans les flacons à DBO préalablement remplis avec l'effluent à différentes dilutions dans l'eau de la Meurthe, à raison d'une lame par flacon (Photo 9). Les lames sont placées verticalement, légèrement inclinées, la surface colonisée orientée de manière à ce que le biofilm soit exposé à la lumière. L'agitation permanente du milieu d'essai évite la formation d'un gradient de concentrations.

Photo 10. Transport des lames colonisées après prélèvement in situ. Photo 11. Extraction des lames de leur

support.

La variabilité spatiale inter-lames colonisées est contrôlée par une

caractérisation initiale du biofilm. Le nombre de lames retenu pour cette opération varie de 8 à 18 selon les essais.

Les mesures biologiques visant à évaluer l'écotoxicité potentielle de l'effluent sont la biomasse totale, la biomasse algale et l'activité photosynthétique. Cette dernière mesure étant « non destructive », elle est effectuée durant l'essai à raison de deux fois par semaine.

En complément, les effets de l'effluent sur deux activités enzymatiques hétérotrophe, la leucine aminopeptidase et la β-D-glucosidase, ont été évalués sur une campagne d'essai.

D'un point de vue des caractéristiques physico-chimiques des milieux d'essai, le pH et la conductivité ont été régulièrement contrôlés.



1.1.33 Synthèse des bio-essais

Au total, trois campagnes d'essai ont été effectuées en mai, juin et décembre 2002. L'une d'entre elles fait l'objet du travail d'études approfondies de L. MATRINGE (2002).

1.2 Essais en canaux artificiels Une communauté périphytique colonisée en canaux artificiels est

exposée, au cours de sa phase exponentielle de croissance, à des concentrations variables en effluent. Les essais sont effectués dans quatre canaux placés au sein d'une pièce climatisée de 50 m2.

L’influence de la concentration en effluent sur la structure et le fonctionnement du périphyton est étudiée par prélèvement avant et après exposition de substrats artificiels colonisés dans les canaux artificiels pendant environ 23 jours. Les canaux sont ensemencés avec une suspension périphytique prélevée dans un cours d'eau (l'Ain) par brossage de substrats naturels.

1.2.1 Critères de conception des canaux artificiels

La conception des canaux répond à des exigences de durabilité, de fonctionnement et de qualité d'échantillonnage.

Les canaux sont prévus pour un fonctionnement en circuit fermé, semi-fermé ou ouvert. Les paramètres souhaités variables et contrôlables sont la pente, la vitesse, le débit, la hauteur d'eau, la qualité de l'eau, l'intensité et la qualité de l'éclairage et la photopériode. Le dimensionnement des canaux doit être tel qu'il permet la réalisation future d'essais en présence de macro-invertébrés et/ou de sédiment.

L'obtention d'une zone d'échantillonnage au sein de laquelle les conditions d'écoulement sont identiques, ou pour le moins comparables, est recherchée. L'existence d'une telle zone vise à faciliter, pour chaque temps de prélèvement, la constitution d'un échantillon représentatif de la communauté périphytique. Elle limite par ailleurs le risque d'une confusion entre les effets recherchés, liés à l'effluent introduit ou à la durée de colonisation, et les effets « parasites » liés à la variabilité des conditions d’écoulement au sein d'un même canal.



A partir de ces critères, les décisions suivantes sont prises :

Les canaux ainsi que leurs supports sont en acier inoxydable d'une haute qualité (316L) pour les parties en contact avec le milieu d'essai et de qualité moyenne (304L) pour les structures portantes. Lors de la construction des canaux, les pliages sont préférés aux soudures car celles-ci dénaturent et sensibilisent le matériau, notamment vis-à-vis des risques de corrosion qui sont déjà fort élevés compte tenu de la concentration en chlorures dans l'effluent. Quant aux soudures, elles sont préférablement effectuées sur les parois extérieures et non intérieures de la pièce usinée afin que la partie dénaturée du matériau ne soit pas en contact avec le milieu d'essai. Enfin, sur les conseils du constructeur, l’épaisseur du matériau est fixée à 20/10è.

Les canaux sont placés à l'intérieur afin d'opérer dans des conditions partiellement contrôlées.

La forme en chenal droit est retenue car elle facilite l'obtention d'un écoulement simple et permet un fonctionnement avec une re-circulation du milieu d’essai totale, partielle ou nulle. Sachant que nous fonctionnerons en circuit fermé, une pompe est nécessaire.

La longueur du canal est un facteur favorable à l'obtention d'une zone dans laquelle l'écoulement est homogène dans l'espace mais le fait de travailler à l'intérieur limite la taille maximale des canaux. La taille maximale de la partie linéaire du canal est fixée à 4 mètres. Cette longueur permet de travailler en présence d'invertébrés mais des aménagements spécifiques sont nécessaires pour limiter les perturbations liées à la pompe et, plus précisément, à l'entrée du fluide par un tuyau.

La largeur du canal doit être la plus importante possible afin de limiter les « effets de bords ». Toutefois, comme nous souhaitons que les canaux fonctionnent à des vitesses voisines de 40cm/s, il convient de tenir compte de la puissance de la pompe qui assure la re-circulation du milieu d'essai. Sachant que le prix d'achat d'une pompe est en partie fonction de sa puissance, nous nous limitons ici à une largeur de 40 cm.

Pour conclure sur ce point, nous insistons sur le fait que notre objectif est de réduire une éventuelle hétérogénéité de colonisation des substrats et non pas de concevoir un canal expérimental dont l'écoulement est parfaitement maîtrisé. A ce titre, la prise en compte des conditions d'écoulement pour la



définition des canaux est empirique et repose essentiellement sur le savoir-faire et les connaissances de différents experts en mécanique des fluides dont l'Institut de Mécanique des Fluides de Toulouse (IMFT).

1.2.2 Description des canaux artificiels

Chaque canal se compose de trois modules indépendants et aisément ajustables afin de faciliter les opérations de transport :

une partie linéaire ouverte, de section rectangulaire constante, la veine d’étude : 4000 x 400 x 350 mm ;

une cuve située en extrémité amont de la veine d’étude qui joue le rôle de cuve de tranquillisation du flux : 700 x 700 x 1250 mm ;

une cuve aval qui sert essentiellement à la remise en circulation du fluide lorsque l’installation fonctionne en circuit semi-fermé ou fermé : 1300 x 920 x 1240 mm.

Photo 12. Canal vu de profil.

Photo 13. Canaux vus du dessus.

Pour que les parois soient perpendiculaires au fond du canal sur toute sa longueur, leur rigidité est renforcée par la constitution d'un rebord de 35 mm de largeur. De même la partie linéaire du canal est consolidée et rigidifiée par l'intermédiaire d'une structure portante composée de montants verticaux et latéraux de section carrée (profilés creux 40 x 40 mm).



La structure portante de la veine d'étude est fixée sur des pieds (profilés creux de 40 x 40 mm) au moyen de six tiges filetées ce qui permet un réglage de l’inclinaison de la veine d’étude tant dans la longueur pour appliquer une pente que dans la largeur pour corriger les irrégularités du sol. Dans les deux cas, le réglage se fait avec un niveau à bulle.

La cuve de tranquillisation et la veine d’étude sont assemblées par simple boulonnage ce qui facilite les opérations de montage et démontage. L’étanchéité entre ces éléments est assurée par un joint en néoprène recouvert d’une couche de silicone pour aquarium ; l’épaisseur du joint est suffisante pour pouvoir incliner la veine d’étude d’environ un centimètre mais elle est volontairement limitée pour ne pas créer de ressauts hydrauliques.

La forme et le dimensionnement de la cuve de tranquillisation ont été définis dans le but de créer une zone intermédiaire pour « absorber » les perturbations dues à l’entrée du fluide dans la cuve et de limiter celles liées à l’entrée du fluide dans la veine d’étude. Ainsi, l’alimentation de la cuve se fait par le fond et la jonction cuve/veine d’étude est assurée par un convergent (entonnement) en forme d’ellipse (Photo 14, Photo 15) pour éviter un changement de section brutal.

Photo 14. Entonnement vu de profil.

Photo 15. Entonnement vu du dessus.

Afin de fonctionner correctement et durablement, la pompe doit être mise en charge du point de vue hydraulique. Cette charge correspond à une hauteur de 1 mètre minimum dans la cuve d'alimentation de la pompe (nommée cuve aval). Le volume total de cette cuve a par ailleurs été calculé de manière à



ce qu’elle puisse recevoir, lors de l’arrêt de l’installation, la totalité du volume d’eau contenu dans la veine d’étude.

1.2.21 Equipement hydraulique des canaux

Un schéma de principe de fonctionnement des canaux est présenté ci-dessous (Figure 11).

La circulation d’eau se fait à l'intérieur de tuyaux flexibles en aspiration de pompe (65 mm de diamètre) et rigides en refoulement (80 mm de diamètre). Cette mixité est involontaire ; elle est due au remplacement d'une partie des tuyaux flexibles qui se sont révélés trop fragiles. Ces tuyaux flexibles, transparents à l'origine, sont opacifiés par des bâches en plastique noir pour éviter la formation d'un biofilm dans le tuyau [FLUM et al., 1993]. La mise en mouvement de l'eau et sa re-circulation sont assurées par une pompe en acier inoxydable (GRUNDFOS, tri 400V) équipée de garniture en carbure afin de permettre le passage, sans dommage, de petites particules minérales provenant des opérations de brossage des cailloux lors de la collecte de la suspension de périphyton. La pompe a été fixée au sol. Afin de limiter les vibrations, elle peut également être montée sur une résine spéciale mais, en aucun cas, sur un support en caoutchouc qui, contrairement à ce qu'on pourrait imaginer, amplifierait les vibrations. Aucun système de protection visant à réduire les risques de colmatage n’a été placé en aspiration de la pompe (crépine) afin de limiter les pertes de charges. Enfin, des vannes de section (tout ou rien) en acier inoxydable sont placées en amont et en aval de la pompe. En cas de panne, celle-ci peut donc être aisément examinée et réparée sans qu'une vidange des canaux ne s'avère nécessaire ce qui constitue un atout indéniable si un incident se produit en cours d'essai.



Figure 11. Schéma d'un canal artificiel et de ses équipements.

Le débit entrant dans la veine d’étude est contrôlé par une vanne de réglage en fonte placée en aval de la pompe et équipée d’une fiche pour la lecture du débit. Associée à une pompe à débit constant, cette vanne permet un réglage plus fin qu'une pompe à débit variable. Un clapet anti-retour, installé au niveau de cette vanne, garantit le maintien d'une lame d’eau minimale (1 à 2 cm) dans la veine d’étude en cas d’arrêt accidentel du dispositif ; le biofilm reste ainsi immergé. Ce système évite également que les cuves amont et aval soient en communication et limite ainsi les risques d’inondation lors de l’arrêt des canaux (dus au principe des vases communicants). En refoulement de la pompe, un by-pass permet de travailler à des débits plus faibles que ceux autorisés par la pompe qui ne doit pas fonctionner à moins de 10% de son régime maximal.

La hauteur d’eau dans la veine d’étude est fixée au moyen d’un clapet à l’extrémité aval dont l'inclinaison est réglée par un serre-câble. Ainsi, la vitesse d’écoulement dans les canaux est déterminée par combinaison de la pente de la veine d'étude, de l'inclinaison du clapet et du débit de la pompe. La pompe utilisée ici est une pompe à débit constant.

La cuve de tranquillisation est équipée de deux séries de cornières soudées sur les parois à 15 et 20 cm du fond. Ces cornières ont pour objectif de supporter deux grilles perforées utilisées pour « briser » le jet central formé par l’entrée du fluide dans la cuve et réduire ainsi les turbulences qui en découlent. Nos essais ont été réalisés avec une grille unique placée à 15 cm de l'entrée du flux (fond de la cuve). Cette grille est perforée avec des mailles rondes d’un centimètre de diamètre et, pour augmenter son efficacité, une plaque en acier

Evacuation/trop plein

Évacuation

Vanne de réglage

GrilleCuve aval

Cuve de tranquillisation

Vanne de sectionnement

Clapet

By-pass

Pompe à débit constantEvacuation/trop plein

Évacuation

Vanne de réglage

GrilleCuve aval

Cuve de tranquillisation

Vanne de sectionnement

Clapet

By-pass

Pompe à débit constant

Veine détude

Rampe de néons Ecoulement



inoxydable non perforée de 10 cm de diamètre est soudée en son centre, c'est-à-dire sur la trajectoire du jet central.

L'utilisation d'un clapet placé en sortie de la veine d’étude permet par ailleurs de limiter les turbulences, dans la partie aval de la veine d'étude, dues à la sortie de l’eau. Celles-ci seraient en effet supérieures dans le cas d'une chute libre de l'eau. Ce clapet est tel qu'il permet le maintien d'une lame d'eau d'environ 1 à 2 cm en cas d'arrêt accidentel du fonctionnement des pompes sur une courte durée.

Un point de vidange est installé sur chaque cuve. Dans le cas de la cuve aval, il est situé sur une paroi latérale au plus près du sol et, dans le cas de la cuve amont, il est situé en fond de cuve. Dans les deux cas, la vidange est amorcée par l'ouverture de vannes de section et l'eau s'écoule dans des tuyaux flexibles de 40 mm de diamètre. Les tuyaux des cuves amont sont amovibles pour limiter l'encombrement. En cuve aval, le tuyau de vidange est maintenu verticalement à une hauteur ajustable car il sert également de trop-plein lorsque les canaux fonctionnent en circuit ouvert ou semi-fermé.

1.2.22 Eclairage des canaux

L’éclairage est assuré de manière artificielle par quatre rampes de néons pour chaque canal. Ces tubes sont disposés parallèlement à l'écoulement deux à deux. La qualité de l’éclairage est fonction de la nature des tubes fluorescents utilisés et son intensité peut être ajustée dans une certaine limite par simple réglage de la hauteur des néons.

Le réglage de la photopériode est assuré par une minuterie électronique.

1.2.3 Dispositifs connexes

1.2.31 Stockage de l'effluent

L'effluent étudié est stocké dans deux cuves cylindriques d’une capacité totale de 12 m3 en polyéthylène haute densité de qualité alimentaire. Compte tenu de la taille du local, elles ont dû être placées à l’extérieur. En revanche, une cuve de même nature mais d’une capacité de 2 m3 est placée à l’intérieur et permet ainsi un stockage intermédiaire et une « mise à température » de l'effluent avant son injection.

La cuve intérieure est équipée d’une pompe (LOWARA 46m3/h) en aval de laquelle un compteur à eau (VEGAS S, 4 m3/h max) permet de maîtriser et d'évaluer les volumes d'effluent à injecter dans les canaux pour atteindre les concentrations requises.



La capacité de la pompe ainsi que le diamètre du tuyau de vidange (40 mm), permettent d’injecter l'effluent rapidement ce qui limite les perturbations liées à l’arrêt du fonctionnement des canaux.

1.2.32 Climatisation de la salle d'expérimentation

La température du local est régulée par deux groupes frigorifiques indépendants, ainsi en cas de panne de l’un d’entre eux, une climatisation minimale reste assurée. La puissance frigorifique totale est de 11 000 watts. Les deux systèmes de ventilation sont installés sur les deux murs opposés dans la longueur de la pièce afin d’assurer une meilleure répartition de l’air refroidi. Afin d’améliorer l'isolation de la pièce et de l'obscurcir, des panneaux en polystyrène ont été placés sur chaque fenêtre. Ce mode d’isolation limite les échanges thermiques avec l’extérieur mais ne permet pas de les éviter ; aussi, la température intérieure obtenue grâce aux groupes frigorifiques reste tributaire de la température extérieure.

Il est évident qu'une régulation de l'eau en circulation dans les canaux, et non de l'air ambiant, aurait été préférable. Le coût d'une telle installation n'est pas plus élevé mais dans le cas présent sa mise en place aurait considérablement retardé le début des essais.

1.2.4 Choix des conditions expérimentales

1.2.41 Eclairage artificiel : qualité, intensité, photopériodisme

L'éclairage artificiel est assuré par des tubes fluorescents « spécial plantes vertes » (SYLVANIA GROLUX) qui ont des pics d'émission dans le rouge (660 nm), le vert (550 nm) et le violet (440 nm). Ces tubes sont associés à des tubes « lumière du jour » (PRESTIFLUX TF P 58 JR/865) qui n'émettent pas dans le rouge mais qui émettent dans le bleu (490 nm), le jaune (590 nm) et le orange (610 nm). Cette association a pour objectif d'obtenir une distribution spectrale plus large que celle obtenue avec un seul type de tubes fluorescents. En effet, sachant qu'au cours de la journée la lumière naturelle varie tant dans son intensité que dans sa distribution spectrale, il paraît difficile de la reproduire artificiellement ; en revanche, tenter de couvrir un spectre complet peut être pertinent. La norme NFT95-375 (1998) relative à la détermination de la toxicité chronique des eaux par inhibition de la croissance de l'algue douce Pseudokircneriella subcapitata préconise un spectre allant de 400 à 700 nm.

Des mesures effectuées par le Laboratoire des Sciences de l'Habitat de l'ENTPE de Vaulx-en-Velin ont permis d'établir le spectre utilisé avec précision



(Figure 12). Les résultats sont exprimés en Watt par stéradian par mètre carré (W/Sr/m2).

Figure 12. Spectre des néons en radiance (W/Sr/m2) en fonction de la longueur d'onde.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

350 370 390 410 430 450 470 490 510 530 550 570 590 610 630 650 670 690 710 730 750 770 790

L’intensité lumineuse est réduite de 12000 à 8000 Lux afin de travailler

à une intensité lumineuse comprise dans la gamme préconisée par la norme NFT95-375 (1998) précédemment citée. La réduction de l'intensité lumineuse se fait par ajout d'un film en papier blanc sur les néons qui, après vérification, ne modifie pas le spectre. Le papier est par ailleurs placé au centre du néon de manière à limiter les différences d’intensité existant entre le centre et les extrémités des tubes fluorescents.

La photopériode est définie est de 16/8, soit 16 heures de lumière et 8h d'obscurité.

1.2.42 Température

La température de l'air ambiant du local d'expérimentation est réglée en fonction de la saison dans les limites techniques des groupes froids exposées ci-dessus. Concrètement, elle varie de 18°C à 21°C selon les saisons (18°C en hiver et 21°C en été).



1.2.43 Nature du milieu d’essai et renouvellement

Les essais sont conduits dans l’eau du réseau urbain déchlorée pendant 24h par simple brassage (circulation dans les canaux) puis enrichie en nitrates sous forme de KNO3, en phosphates sous forme de KH2PO4 et en silice sous forme de SiO2,Na2O,5H2O. Cet enrichissement correspond à un apport de 3 mg/L de nitrates, de 0.8 mg/L de phosphates et de 7 mg/L de silice. Il a pour objectif de favoriser le développement du biofilm. Dans le cadre de nos essais, l'enrichissement est apporté en une seule fois lors de l'ensemencement. Il aurait été préférable, mais plus complexe à mettre en oeuvre, de procéder à un enrichissement continu visant à maintenir une concentration minimale en substances nutritives.

Le milieu n’est pas renouvelé, seules les pertes par évaporation sont quotidiennement compensées par ajout d’eau du réseau urbain préalablement déchlorée par simple stockage à l’air. Les pertes par évaporation sont de l’ordre de dix litres par jour et par canal.

1.2.44 Fonctionnement des canaux

Dans le cadre de nos travaux les canaux fonctionnent en circuit fermé. La pente est fixée à un millième pour compenser les pertes de charges (IMFT, communication personnelle). La vitesse d'écoulement est fixée à 30 cm/s. La hauteur d'eau est fixée à 8 cm.

1.2.45 Nature et positionnement des substrats

Les substrats artificiels utilisés sont des lames de verre (7.5x2.5 cm) avec une face sablée pour une meilleure adhésion du biofilm. Ils sont placés sur le fond du canal, côte à côte, dans une zone d'échantillonnage définie selon les profils de vitesse au fond du canal. L'établissement de ces profils montre que la vitesse est plus homogène à partir de 240 cm, distance mesurée à partir du début de la partie linéaire du canal.

Ils sont organisés selon 17 rangées (largeur) et 12 colonnes (longueur), ce qui correspond à un total de 204 lames soit une surface de colonisation de 0.38 m2. Les substrats occupent toute la largeur du canal et une longueur de 90 cm qui correspond à une zone de vitesses constantes. Lors des premiers essais de colonisation, des plaques de verre de même épaisseur que les lames ont été placées en amont et en aval de celles-ci pour une meilleure homogénéisation de l'écoulement dans la zone d'échantillonnage [LAU et LIU, 1993]. Cette approche a dû être abandonnée pour des raisons de sécurité (casses et coupures) et les plaques ont par la suite été remplacées par des carreaux de céramique non traités de même épaisseur. Du point de vue hydraulique, cette seconde solution est



moins satisfaisante mais du point de vue biologique, il s'avère que les carreaux se colonisent plus rapidement et plus abondamment que le verre du fait de leur rugosité supérieure (meilleure adhésion du biofilm). Ils servent ainsi d'inoculum pour les lames de verre. Les photographies présentées ci-dessous (Photo 16, Photo 17), prises le même jour dans le même canal, illustrent bien cette différence de colonisation entre les substrats en verre et en céramique.

Photo 16. Colonisation des lames. Photo 17. Colonisation des carreaux.

1.2.5 Déroulement des essais

Les essais durent environ cinq semaines, soit trois semaines de colonisation en « milieu non pollué » et deux semaines d’exposition à l'effluent. Ils se déroulent selon les étapes suivantes :

remplissage des canaux avec l'eau du réseau et positionnement des substrats (4h) ;

mise en route des canaux pour permettre l'évaporation du chlore par brassage de l'eau (24h) ;

enrichissement de l'eau des canaux par apport d'azote, de phosphates et de silice ;

collecte de l'inoculum et répartition de la suspension périphytique en 4 lots homogènes puis ensemencement des canaux (6 à 8h) ;

colonisation des substrats artificiels (environ 23 jours) ; injection de l'effluent (1/4h maximum) ; exposition à l'effluent (2 semaines) ; arrêt, vidange et lavage des canaux (8h) ; lavage des substrats (4h).



Des substrats colonisés sont prélevés pour analyses à intervalles variables dès le 17e jour de colonisation jusqu’à la fin de l’essai. Les opérations de prélèvements durent environ 2h. Le biofilm est immédiatement caractérisé vis-à-vis de l'intensité des activités enzymatiques. La détermination des autres paramètres se fait ultérieurement sur échantillons congelés ou formolés. Le dosage de la chlorophylle-a et l'analyse par PCR-DGGE sont effectuées sur des échantillons congelés, le dénombrement bactérien et la détermination taxonomique algale sur des échantillons formolés.

1.2.51 Remplissage des canaux et positionnement des substrats

La climatisation de la pièce expérimentale est mise en route 24h avant le lancement des essais. Les cuves amont et aval des canaux sont remplies avec l’eau du réseau urbain à l’aide d’une lance à incendie.

Une fois les cuves remplies et les substrats introduits, les pompes sont mises en route et le volume d'eau est ajusté pour que la hauteur d’eau dans chacune des cuves aval soit de 115 cm lorsque les canaux fonctionnent, ce qui représente un volume total de 2 m3 environ. Les substrats artificiels sont disposés dans la zone d’échantillonnage des canaux.

Les canaux sont mis en route pendant 24h pour permettre l’évaporation du chlore.

1.2.52 Ensemencement des canaux

L’ensemencement des canaux est effectué par ajout d’une suspension de périphyton obtenue par brossage de cailloux collectés dans l’Ain au niveau de la station de Port Galland. Cette station est retenue car elle est considérée comme une station de référence par les Agences de l'Eau [CANIVET, 2001].

Des galets de tailles et de formes variables sont aléatoirement collectés dans différents faciès du cours d’eau dans la limite de leur accessibilité. D'une campagne à l'autre, les zones de collecte sont inchangées. Les galets sont brossés dans un seau contenant l’eau de la rivière avec des brosses à ongles à poils « souples ». La suspension ainsi obtenue est successivement stockée dans des bidons maintenus dans le cours d’eau pendant les opérations de collecte pour limiter les écarts de température. Au laboratoire, les différentes solutions sont regroupées (15 litres environ) dans un bidon unique pour agitation et constitution de quatre lots homogènes destinés à l’ensemencement des quatre canaux. Le sous-échantillonnage se fait par prélèvements fractionnés (250 mL maximum) et alternés.

Il est difficile de définir le nombre de galets nécessaires à l’ensemencement des canaux car celui-ci est fonction de la biomasse fixée aux substrats, laquelle dépend essentiellement du statut trophique du cours d’eau, des



conditions hydrauliques, et de la saison. Dans le cadre de ces essais, un apport minimum en chlorophylle-a de 10 µg par litre d’eau dans le canal a été fixé suite aux essais préliminaires de colonisation où des teneurs probablement trop faibles (2 à 5 µg/l) en chlorophylle-a n'avaient pas permis une colonisation des substrats. Ainsi, l’ensemencement des canaux a parfois été répété jusqu'à atteindre cette valeur (cumulée). En revanche, aucune limite supérieure de concentration en chlorophylle-a n'a été fixée

1.2.53 Injection de l'effluent

L'influent est injecté au 22e jour de colonisation. Pour cette opération, le volume à introduire dans les canaux est calculé à partir de la concentration en effluent souhaitée et du volume total en circulation dans les canaux lorsque la hauteur d’eau en cuve aval est égale à 115 cm. La variation de hauteur d’eau en cuve aval correspondant au volume de l'effluent à ajouter est calculée puis les canaux sont vidangés de cette hauteur et remplis à 115 cm avec l'effluent.

Si la vidange entraîne une hauteur d’eau inférieure à 90 cm en cuve aval, les pompes doivent être arrêtées pendant cette opération, mais une lame d’eau d’environ 1 à 2 cm est cependant conservée dans la veine d’étude. Le biofilm reste donc immergé.

1.2.54 Echantillonnage des substrats colonisés

Dans le cadre de cette étude, un prélèvement aléatoire dans la zone d'échantillonnage qui a été préalablement déterminée est retenu. Les lames des deux rangées situées à chaque extrémité (amont/aval) et sur chaque bord (rive droite/rive gauche) ne sont pas prises en compte dans le tirage au sort car elles ne sont visiblement pas soumises aux mêmes conditions d'écoulement. Le même tirage au sort, effectué via l'outil proposé par le logiciel Excel (Office 2000), est appliqué lors de chaque campagne d'essai. A chaque temps de prélèvement et pour chaque canal, 15 lames regroupées en 5 échantillons de 3 lames sont collectées. Le choix des lames constituant un échantillon est lui aussi aléatoire et identique d'une campagne d'essai à l'autre. Un échantillon représente une surface colonisée d'environ 56 cm2 et les cinq échantillons analysés par canal correspondent à une surface d'environ 281 cm2. A titre indicatif, la norme relative à la détermination de l'indice biologique diatomées (NF T 90-354, juin 2000) recommande d'échantillonner une surface de l'ordre de 100 cm2.

Le biofilm des trois lames constituant un échantillon est retiré des substrats par brossage avec une brosse à dents dans 100 mL d'eau des canaux correspondant.

Les prélèvements sont systématiquement effectués à la même heure, soit à 7h le matin dans le cadre de nos recherches.



1.2.56 Vidange et lavage des canaux et des substrats artificiels

La vidange des canaux se fait par gravité. Quant au lavage, il s'agit d'une opération plus délicate qui doit conduire à l'élimination totale du polluant et du biofilm afin de ne pas contaminer les essais suivants. L'élimination complète des organismes est sans nul doute le point le plus délicat dans la mesure où ceux-ci peuvent se fixer dans des zones non accessibles, telles que les canalisations

Le lavage des canaux est fait par brossage sous un jet d'eau de forte pression (lance à incendie) avec des ajouts ponctuels d'acide nitrique faiblement concentré pour retirer les dépôts de calcaire dans la veine d'étude. Dans le cas présent, sur les trois campagnes menées en présence de l'effluent, l'élimination du polluant a été vérifiée par une mesure de conductivité uniquement pour la dernière campagne. Cette correction a été apportée suite à l'exploitation des analyses chimiques de la deuxième campagne qui montrait une teneur en chlorures supérieure à la concentration normalement observée dans l'eau du réseau (93 à 184 mg/L de chlorures selon les canaux au lieu d'environ 12 mg/L).

Les substrats artificiels sont lavés à l’acide sulfo-chromique, acide classiquement utilisé pour le nettoyage de la verrerie de laboratoire, et rincés abondamment avant d'être ré-utilisés.

1.2.57 Analyses physico-chimiques

Des mesures de pH, conductivité et température sont effectuées à différents intervalles de temps dans la colonne d'eau. Des échantillons d'eau sont par ailleurs prélevés pour un dosage du carbone total et l'analyse de divers anions et cations. Les méthodes analytiques sont précisées plus loin.

1.2.58 Analyses biologiques

Les analyses biologiques effectuées sont clairement exposées dans la partie suivante relative à la mesure des effets écotoxicologiques. Celles-ci portent sur une estimation :

des paramètres globaux de structure : biomasse totale et algale, de l'intensité des activités enzymatiques leucine aminopeptidase

et β-D-glucosidase, de la composition et de la structure de la communauté

bactérienne.



Les essais menés en présence de l'effluent ont fait l'objet de trois campagnes :

août - septembre 2002 : 3 canaux « test » (10, 25 et 50% d'effluent) et un canal « témoin »,

septembre-octobre 2002 : 2 canaux « test » (25%) et deux canaux « témoin »,

octobre-décembre 2002 : 2 canaux « test » (10%) et deux canaux « témoin ».

Des mesures complémentaires ont également été effectuées lors des deux premières campagnes. La diversité pigmentaire a été évaluée dans le cadre de la première campagne et le dénombrement bactérien a été effectué pour les deux premières campagnes.



1.2.59 Déroulement synthétique des essais en canaux artificiels

Figure 13. Déroulement des essais en canaux artificiels et variables biologiques mesurées.

Jours d’essai

T0 Mise en route des canaux et positionnement des substrats

T1

T17

T20

T23

Enrichissement (N, P, K, Si) et ensemencement

Prélèvement des substrats (5 lots de 3 lames)

T24

Injection de l'effluent

T30

T34


Collecte du biofilm dans l'eau des canaux (brosse à dent)

Homogénéisation des suspensions(mixeur)

Chlorophylle-a

Constitution d'un échantillon moyen par canal

Activités enzymatiques hétérotrophes

Biomasse totale

Diversité des diatomées

(2)Diversité de la

communauté bactérienne Diversité p igmentaire(2)

Dénombrement bactérien(1)



2. Mesure des effets sur le périphyton On l’a vu, les paramètres biologiques ont été choisis en fonction de leur

signification écologique et de la maîtrise des protocoles de mesure.

2.1 Préparation des échantillons A l'exception de l'évaluation de l'activité photosynthétique, les analyses

présentées ci-dessous sont effectuées à partir d'une suspension du périphyton testé. Cette suspension est obtenue par brossage des substrats dans l'eau provenant du milieu où ils ont été prélevés pour être analysés.

En ce qui concerne les bio-essais, il s'agit de l'eau de la Meurthe contenant des concentrations variables en effluent ; pour les essais en canaux artificiels, il s'agit de l'eau des canaux. Le brossage du biofilm se fait directement dans le flacon d'essai.

Dans le cas des essais en canaux artificiels, les lames colonisées sont prélevées et le brossage du biofilm se fait dans des flacons en polyéthylène de 180 mL contenant 100 mL d'eau du canal. Les suspensions sont homogénéisées à l'ultra-turax pendant 1 minute (Bioblock) [GENTER, 1995] et conservées dans une glacière. Certaines analyses se font immédiatement alors que d'autres sont effectuées ultérieurement sur des aliquots de la suspension périphytique formolés ou sur des sous-échantillons de biofilm congelés (-80°C).

2.2 Mesure des effets sur la structure globale des biofilms

2.2.1 Estimation de la biomasse totale

Dans le cas présent, la biomasse totale est estimée par mesure de la teneur en matière organique ; elle-même est évaluée par détermination de la masse sèche puis de la masse minérale. Cette estimation ne concerne pas seulement la matière organique vivante ; elle inclut la nécromasse et tout autre dépôt de matière organique provenant d’apports allochtones ou autochtones.

Un aliquot de la suspension périphytique obtenue par brossage des lames dans l’eau de leur milieu d'essai est filtré sous dépression (pompe à vide) sur un filtre Watman GF/C (porosité : 1,2 µm). Les filtres utilisés sont



préalablement séchés et leur masse sèche déterminée. En revanche, leur masse sans cendre n'a pas été déterminée. Le volume filtré est variable selon la densité de la solution périphytique mais il est compris entre 10 et 15 mL. Afin de prélever un aliquot le plus représentatif possible de la totalité de la solution périphytique, celui-ci est constitué de trois prises successives et chacune d'elles est précédée d’une homogénéisation de la suspension par agitation manuelle. Dans le même état d’esprit, le volume maximal filtrable sans colmatage du filtre est recherché.

La mesure de la masse sèche est effectuée par pesage après séchage du filtre à 105°C pendant 24h et refroidissement en dessiccateur sous vide pendant 2h au minimum. La mesure de la masse minérale se fait de la même manière mais après calcination à 480°C dans un four à moufles pendant 2h. Les pesées sont effectuées sur une balance pour analyses (METTLER AE 240).

La biomasse sèche totale est calculée par soustraction de la masse minérale obtenue après calcination à la masse sèche totale. Les résultats sont exprimés en mg/cm2.

2.2.2 Estimation de la biomasse algale

La biomasse algale est estimée par spectrophotométrie selon la méthode de SCOR-UNESCO avec une correction par rapport aux phéopigments (forme dégradée de la chlorophylle) décrite dans la norme NFT90-117 (décembre 1999) relative au dosage de la chlorophylle-a et d’un indice phéopigments.

Comme précédemment, un aliquot de 10 à 15 mL est prélevé dans la solution périphytique et filtré sur un filtre WHATMAN GF/C (porosité : 1,2 µm) de 47 mm de diamètre sous une dépression légère afin de limiter l’éclatement des cellules et la dégradation de la chlorophylle. L’extraction de la chlorophylle se fait dans de l’acétone pour analyses, diluée à 90% avec de l’eau distillée, à l’obscurité et à 4°C pendant 4h après broyage manuel du filtre à l’aide d’une tige en verre.

En fin d’extraction, une centrifugation est effectuée pendant 20 minutes à 4000 rpm (2540 g) à 4°C et la chlorophylle contenue dans le surnageant est dosé par spectrophotométrie (uvikon 930, kontron). Notons que l’extraction de la chlorophylle est effectuée dans les tubes à centrifuger afin de limiter les transvasements et qu’un témoin négatif (acétone seule) est ajouté pour vérifier l’absence de pertes par évaporation.

Les résultats sont exprimés par unité de surface (µg/cm2) ou par unité de biomasse (µg chloro-a/mg biomasse sèche).



2.2.3 Estimation de l'abondance bactérienne

2.2.31 Principe de la mesure

L'abondance bactérienne totale est estimée par comptage direct en microscopie en épifluorescence après une dilution adéquate de l'échantillon et une coloration des cellules au DAPI (4-6 diamidino 2 phénylindol). Celui-ci forme un complexe avec l'ADN contenu dans le noyau, les chloroplastes et les mitochondries des cellules, vivantes ou mortes, présentes dans l'échantillon. Dans le cas d'une solution périphytique, les bactéries se distinguent aisément des algues ou champignons par leur taille nettement inférieure.

Le complexe ADN-DAPI devient fluorescent lorsqu'il est excité par une lumière de 365 nm ; il adopte une couleur bleue à une longueur d'onde supérieure ou égale à 390 nm. Lorsque la matière non vivante est marquée en dépit de la spécificité du colorant, celle-ci apparaît de couleur jaune ce qui permet de la différentier des bactéries [PORTER et FEIG, 1980].

Le nombre minimum de bactéries par champs microscopiques, ainsi que le nombre de champs à prendre en considération sont fixés. Après lecture de la lame, le nombre de bactéries comptées est extrapolé au nombre total de bactéries sur le filtre et, enfin, au nombre de bactéries par unité de masse ou de surface de périphyton.

2.2.32 Protocole

Trois réplicats (4 mL) de chaque suspension périphytique sont prélevés et fixés avec 1 mL de formaldéhyde à 30% (v:v), ce qui permet un stockage de plusieurs mois à 4°C dans l'obscurité. Une solution dispersante de pyrophosphate de sodium (0,01 mol/l) est ajoutée pour compléter l’action de la sonication ultérieurement effectuée [MERMILLOD-BLONDIN et al., 2001].

Lors des analyses, une solution de fluorochrome (DAPI, SIGMA) est préparée par dilution du réactif dans de l'eau distillée puis filtrée à 0,22 µm. Elle est conservée à l'obscurité et à 4°C pendant un maximum de trois semaines.

Les échantillons stockés sont passés au vortex environ deux minutes pour assurer une bonne homogénéisation des suspensions préalablement aux opérations de sous-échantillonnage en vue des analyses. Un aliquot de 0,1 mL est prélevé et dilué dans l'eau du milieu d'essai filtrée à 0,22 µm (filtres GS, Millipore) et autoclavée (120°C, 20 min) pour un volume final de 5 mL. Une sonication des solutions (bac à ultra-sons, Selecta, 40 kHz, 10 min) est ensuite effectuée pour détruire une partie des agrégats formés, ce qui revient notamment à détacher les bactéries fixées aux particules minérales ou organiques. Ce



traitement limite les risques de sous-estimation de l’effectif bactérien lors du comptage.

Un volume de la solution de DAPI est ajouté pour obtenir une concentration finale de 2 µg/mL. L'ensemble est placé à l'obscurité et à température ambiante pendant 10 minutes. Les échantillons sont ensuite filtrés sur un filtre noir non fluorescent (filtre GTBP, Millipore) d'une porosité de 0,2 µm. La filtration est réalisée sous un vide réduit (810 mbar) pour une meilleure répartition des cellules sur le filtre. Pour la même raison, le filtre est placé sur un second filtre d'une porosité de 1,2 µm (Whatman, GF/C). Une légère humidification de celui-ci améliore par ailleurs la stabilité, et indirectement la manipulation du filtre GTBP [PORTER et FEIG, 1980]. L'appareil de filtration multi-postes (Millipore) est entièrement opaque et équipé de bouchon ce qui permet d'éviter toute exposition à la lumière. Le montage des lames est ensuite effectué en chambre noire et les lames sont ensuite stockées à l'obscurité et à 4°C pendant 24h au maximum.

Le comptage se fait en microscopie à épifluorescence au grossissement X 1000. Le microscope (Zeiss Axioskop) est équipé d’un filtre d’excitation de 365 nm, d’un filtre d'émission de 420 nm et d’une lampe à mercure HBO de 50W. Le dénombrement s'effectue à l'aide d'une grille de comptage montée sur l'un des occulaires. Elle se compose de 10 rangées et de 10 colonnes définissant un « champ ». Environ 20 à 50 cellules bactériennes sont comptées par champ ; 30 champs d'une surface de 15 x 10-3 mm2 sont aléatoirement sélectionnés et analysés, ce qui revient à compter plus de 600 bactéries par lames [GARABETIAN et al., 1999].

Pour information, la durée d'incubation est ici fixée à 10 minutes pour faciliter les manipulations, mais PORTER et FEIG (1980) ont estimé la durée minimale d'incubation à 5 minutes. A partir des données issues de la bibliographie, deux concentrations finales de DAPI ont été testées : 0,2 µg/mL, 2 µg/mL. La concentration intermédiaire (2 µg/mL) s'est avérée être un bon compromis entre la coloration non souhaitée des particules et la visibilité des bactéries. La concentration supérieure marque trop la matière inorganique, ce qui est également observé par SOBCZAK et BURTON (1996), alors que la concentration inférieure est insuffisante pour la visualisation des bactéries.

Les résultats sont exprimés par unité de surface (nombre de cellules/cm2) ou par unité de biomasse sèche.



2.3. Mesure des effets sur la composition des communautés

2.3.1 Composition de la communauté bactérienne par DGGE

La structure de la communauté eubactérienne est abordée par établissement d’empreintes génétiques obtenues sur un gel d’électrophorèse contenant un gradient de substances dénaturantes (DGGE).

2.3.12 Extraction et précipitation de l'ADN

Une suspension de périphyton de 50 mL est décongelée par immersion dans un bain-marie à 20°C pendant 10 minutes. Après homogénéisation manuelle de la suspension, un aliquot de 15 mL est prélevé et centrifugé à 4°C et à 9500 rpm soit 8300g pendant 20 minutes. Le surnageant est retiré à l'aide d'une micropipette et le culot est transféré dans un microtube stérile de 1,5 mL pour une nouvelle centrifugation à 4°C et 15300 rpm soit 13367g pendant 10 minutes. Le surnageant est retiré de la même manière que précédemment et le culot est conservé à -80°C.

L'extraction de l'ADN a été effectuée avec le kit d'extraction DNeasyTM Plant Mini Kit for DNA isolation plant tissue selon le protocole du fabricant (QIAGEN S.A., novembre 1999). Seule la première étape, ayant pour objectif l'éclatement des cellules, a été légèrement modifiée. Le microtube contenant l'échantillon congelé est plongé dans un bain à 65°C pendant 5 minutes et immédiatement recongelé à -80°C pendant 5 minutes. L'échantillon congelé est ensuite broyé manuellement avec un piston en plastique stérile de la largeur du microtube. Les étapes suivantes sont effectuées conformément au protocole du kit d'extraction. Elles comprennent la lyse enzymatique et chimique des cellules, la déprotéinisation et, enfin, l'extraction des acides nucléiques.

Une fois l'ADN extrait, celui-ci est concentré par précipitation dans l'éthanol absolu froid (2 volumes d'éthanol pour 1 volume de solution d'ADN) en présence d'acétate de sodium (0,1 volume d'une solution 3M pour 1 volume de solution d'ADN) pendant 8h. Après une séparation liquide/solide par centrifugation (14000 rpm soit 12232g, 4°C, 30 mn), le culot est lavé avec 300 µL d'éthanol à 80% (v:v). Une nouvelle centrifugation de 10 minutes dans les mêmes conditions est effectuée. Le surnageant est retiré et le culot est séché au speedvacuum (Speed vac, SAVANT) pendant une heure afin d'éliminer toutes traces de solvant.



Enfin, l'ADN est conservé sous forme dissoute par redissolution dans 30 µL de tampon TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM, pH8) pendant 30 minutes à 37°C. La solution est ainsi stockée à -80°C.

2.3.13 Détermination de la pureté de l'ADN extrait et dosage

L'ADN ayant une capacité d'absorbance à une longueur d'onde 260 nm, son dosage se fait par densité optique au spectrophotomètre (Genequant, Pharmacia Biotech). Les échantillons dosés sont préalablement dilués, si nécessaire, avec de l'eau distillée stérile (qualité biologie moléculaire, Eurobio) pour que l'absorbance soit comprise entre 0,1 et 1 qui correspond au domaine de linéarité de l'appareil. La concentration en ADN est calculée à partir de la relation : « 1 unité de A260 = 50 µg/mL d'ADN double brin ».

La pureté de l'ADN extrait est également évaluée au spectrophotomètre par détermination du ratio de l'absorbance à 260 nm et de l'absorbance à 280 nm (absorbance maximale des protéines). Un ratio compris entre 1,7 et 2 correspond à une pureté optimale.

2.3.14 Choix des amorces et amplification PCR

L'amplification est effectuée par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) à partir d'une solution d'ADN diluée à 30 ng/µL. Cette concentration de travail est obtenue par dilution des solutions mère d'ADN avec de l'eau distillée stérile (Eurobio).

Le choix des amorces s’est porté sur le couple 358f-GC et 907rM précédemment testé par SCHAUER et al. (2003). L'amorce 358f-GC est spécifique des eubactéries et possède une séquence riche en GC de 40 paires de bases conformément aux recommandations de MUYZER et al. (1993). L'amorce 907rM est une amorce universelle constituée par un mélange équimolaire des amorces 907rA et 907rC (équivalente à l’amorce 907r). L’amorce 907r initialement définie est fréquemment utilisée mais elle apparaît moins adaptée à l’amplification des γ-protéobactéries du fait d’un mésappariement [SCHÄFER et al., 2001]. L’amorce 907rA est a contrario exclusivement adaptée à l’amplification des γ-protéobactéries. Ainsi, dans le cas d’un mélange complexe et inconnu, l’utilisation de l’amorce 907rM dite « dégénérée » parce qu’elle résulte d’un mélange d’amorces est préférable car moins sélective. Le fragment amplifié est d'environ 550 paires de bases.



Les séquences de ces amorces sont présentées dans le tableau ci-dessous (Tableau 1).

Amorces Séquences (5-3') Références

358f-GC CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCG

CCCCCG CCCG CCTACGGGAGGCAGCAG

MUYZER et al., 1995 SCHAUER et al, 2003

907rM CCG TCA ATT C(M)T TTG AGT TT(1) MUYZER et al., 1998 SCHAUER et al, 2003

Tableau 1. Séquences du couple d'amorces utilisées. (1) M signifie qu’à cette position 50% des brins ont une base Cytosine et 50% des brins une base Adénine

Le mélange PCR est constitué dans la glace par ajouts successifs des réactifs dont la nature et la concentration finale sont indiquées dans le tableau suivant (Tableau 2).

Il s’agit principalement des amorces et du mélange des quatre désoxyribonucléotides constitutifs de l'ADN et de l’ADN polymérase. Celle-ci est ajoutée en dernier pour éviter toute amplification non spécifique. Une fois le mélange terminé, 1 µL de la solution d'ADN matriciel à amplifier (30 ng/µL) est ajouté, ce qui conduit à un volume final par échantillon de 50µL.

Composés Références Volume/ échantillon (µL)

Concentration finale

Eau stérile Eurobio 28.75

Tampon 10X Eurobio 5

MgCl2 Eurobio, 50 mM 1.5 1.5 mM

dNTP (1) Pharmacia Biotech, 200 nM 3 120 µM chacun

Amorce 358F-GC Q.BIOgene, 12,5 µmol 4 1 µM

Amorce 907RM Q.BIOgene, 12,5 µmol 4 1 µM

Bovine Serum Albumin Sigma, A-7030, 10 mg/mL 2.5 0,5 mg/mL

Taq polymérase EUROBLUETAQ®, Eurobio, 5U 0,25 1.25 U

Tableau 2. Composés du mélange PCR. (1) Le dNTP est préparé par mélange de 10 mL de chaque désoxyribonucléotide dans de l'eau stérile.

Les préparations sont introduites au plus vite dans le thermocycleur T-Personal temperature Cycler (Biometra) pour la réaction d'amplification. Celle-ci est effectuée selon le programme proposé par SCHAUER et al. (2003).



Incubation initiale 1ère boucle 2è boucle Incubation finale Nombre de cycles 1 10 20 1 Dénaturation 94°C (5 min) 94°C (1 min) 94°C (1 min) Hybridation 65°C (1 min)

-1°C/cycle 55°C (1 min)

Extension 72°C (3 min) 72°C (3 min) 72°C (5 min)

Tableau 3 Programme de la PCR.

2.3.15 Visualisation des fragments amplifiés

L'amplification de l'ADN extrait est vérifiée par électrophorèse des produits PCR sur un gel d'agarose à 1,2% (w:v).

Le gel est préparé par dissolution au four à micro-ondes 0,6 g d'agarose dans 50 mL de tampon TBE 0,5X (Tris-HCl 45mM, acide borique 22mM, EDTA 1mM, pH=8). Une goutte de bromure d'éthidium (Eurobio, 0,7 mg/mL) est ajoutée au mélange pour la coloration de l'ADN. Le mélange est coulé dans un moule horizontal équipé de deux rangées de peignes. Après une durée minimale de polymérisation de 30 minutes, le gel est totalement immergé dans une cuve électrophorétique contenant du tampon TBE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM, pH=8) puis les peignes sont délicatement retirés. Préalablement au dépôt des échantillons dans les puits, un aliquot de 4 µL de chaque produit PCR est mélangé à une goutte de colorant de charge (Tris-HCl 1M pH=8, EDTA 0,5M, SDS 20%, bleu de bromophénol 0,1%, cyanol xylène 0,1%) sur un morceau de parafilm pour la densification et la visualisation du mélange.

Un marqueur de taille de 100 paires de bases (Promega) est également mélangé avec du colorant de charge et déposé dans chaque rangée dans les mêmes conditions pour contrôler la taille des fragments amplifiés. La migration s'effectue pendant 20 minutes à 110 Volts. La visualisation de l'ADN se fait sur une plaque UV (Tex-35M, Bioblock Scientific). Celui-ci est également photographié avec un appareil numérique (Kodak DC290).



2.3.16 Analyse DGGE et révélation du gel

L'analyse DGGE est effectuée avec le système DGGE 2000 (CBS Scientific Company) selon le mode opératoire décrit par MUYZER et al. (1996) et les conditions expérimentales de SCHAUER et al. (2003). L’analyse se déroule selon quatre étapes :

La préparation d’un gel de 0,75 mm d’épaisseur contenant 6% de polyacrylamide (ratio acrylamide : bis-acrylamide de 37,5 :1) et un gradient en substances dénaturantes allant de 40 à 80%. Une solution contenant 100% de substances dénaturantes est composée d'une solution d’urée 7M et de formamide déionisée à 40% (v:v).

La migration des produits PCR pendant 16h à 100 Volts dans un bain de TAE 1X (40mM Tris, 20mM acétate de sodium, 1mM EDTA) maintenu à 60°C.

La coloration de l’ADN avec du SYBR®Gold (Molecular Probes). La visualisation des fragments migrés sur une plaque UV.

Les solutions utilisées pour la préparation du gel sont préparées à partir de deux solutions mères de polyacrylamide contenant respectivement 0% et 80% de substances dénaturantes et des réactifs nécessaires à la polymérisation du gel, c’est-à-dire une solution d'APS à 10% w:v (Eurobio) et de Temed (Eurobio GETEM18-0T). Ces solutions sont présentées ci-dessous (Tableau 4).

Solution

mère 0% Solution mère 80%

Temed APS 10% GBL 5X

Solution 0% 6 mL 0 mL 6 µL 36 µL Solution 40% 4.4 mL 4.4 mL 8 µL 45 µL Solution 80% 0 mL 8.75 mL 8 µL 45 µL 80 µL

Tableau 4. Composition d'un gel de 0,75 mm d'épaisseur.

La coulée du gel s’effectue entre deux plaques de verre (240 x 200 mm) disposées verticalement. L’étanchéité du système est assurée par un joint de 0,75 mm d’épaisseur. Une unité de mixage (CBS Scientific) composée de deux compartiments est utilisée pour assurer le bon mélange des solutions contenant les substances dénaturantes (40% et 80%).

La vitesse de remplissage des plaques est fait par gravité ; elle est maintenue constante d'un essai à l'autre pour une meilleure reproductibilité des gels. Une fois que cette opération est terminée, la nouvelle solution exempte de substance dénaturante est ajoutée.



Enfin, un peigne contenant 16 puits est inséré entre les deux plaques. De cette manière, le gradient en substances dénaturantes débute environ 1 cm au-dessous du peigne.

Photo 18. Constitution du gel entre deux plaques de verre.

Unité de mixage Plaques de verre

A l'issue d'une durée de polymérisation de 2h30, les plaques de verre

renfermant le gel sont fixées sur un portoir. Celui-ci est ensuite introduit dans le système de DGGE.

Le peigne est retiré et les produits PCR sont introduits dans chaque puits à raison de 40µL par échantillon et par puits en présence de GBL 5X (5µL). La migration s'effectue à 100Volts pendant 16h.

En fin de migration, le « sandwich » de plaques renfermant le gel est retiré du système DGGE. L'étape suivante consiste alors à retirer l'une des deux plaques de verre en vue de la coloration de l'ADN. Le gel disposé sur l'autre plaque est recouvert d'une solution contenant 20 mL de TAE 1X et 4 µL de SYBER Gold (Molecular probe). La coloration s'effectue à l'obscurité pendant 40 minutes. Le retrait du gel est effectué par immersion de la plaque dans de l'eau ultra-pure.

Photo 19. Chargement du gel. Photo 20. Retrait de gel en fin de migration.



Enfin, le gel est déposé sur une plaque UV afin de visualiser les fragments d'ADN. Le gel est photographié.

2.3.2 Structure de la communauté algale

2.3.21 Diversité pigmentaire

La diversité des pigments photosynthétiques a été réalisée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) dans le cadre du stage de Sonia Bonifacio encadré par Christophe Leboulanger à l'INRA de Thonon. La méthode appliquée étant clairement décrite dans son rapport [BONIFACIO, 2003], nous n'en reprenons ici que le principe.

Les échantillons analysés sont issus de la filtration d'un aliquot de 15 mL de suspension de périphyton avec un filtre WHATMAN GF/C (porosité : 1,2 µm ; diamètre 47 mm). Le filtre est ensuite conservé à -80°C jusqu'à l'analyse.

Celle-ci se déroule selon les étapes suivantes : extraction des pigments dans un solvant composé de méthanol

(98%) et d'acétate d'ammonium (2%) ; sonication, centrifugation et filtration de l'éluat ; étalonnage de l'HPLC en vue de l'identification et de la

quantification des pigments ; dosage ; analyses des chromatogrammes : identification des pics en

fonction de leur temps de rétention et quantification en fonction de l’aire des pics.

Les pigments ayant fait l’objet d’une calibration préalable sont caractéristiques des diatomées, des cyanobactéries et des algues vertes. Il s’agit des pigments suivants : alloxanthine, β-carotène, canthaxanthine, chlorophylle-a, chlorophylle-b, chlorophylle-c2, diadinoxanthine, échinénone, fucoxanthine, lutéine, myxoxyxanthophylle et zéaxanthine.

2.3.22 Diversité taxonomique des diatomées

L'identification des diatomées a été réalisée par Géraldine Laval, Leslie Laine et Jean-Claude Druard (INRA de Thonon) selon les prescriptions de la norme NF T90-354.



2.4 Mesure des effets sur le métabolisme

2.4.1 Activité photosynthétique

La mesure de l'activité photosynthétique est effectuée selon la méthode des flacons d'oxygène développée pour le phytoplancton mais néanmoins applicable au périphyton. Elle est également désignée sous le nom de « méthode des bouteilles claires et des bouteilles sombres » [PELLETIER, 1983 ; WETZEL et LIKENS, 1991]. Cette méthode consiste en un dosage d'oxygène en système fermé et conduit à l'estimation de l'oxygène produit en phase claire et consommé en phase sombre par unité de temps et de surface colonisée. La production d'oxygène en phase claire correspond à la production brute diminuée des pertes par respiration et la consommation d'oxygène en phase sombre correspond à la respiration. L'activité photosynthétique des organismes autotrophes est estimée par la production brute, obtenue par addition de la production nette et de la respiration en supposant que les phénomènes respiratoires sont identiques en phase claire et en phase sombre ; elle est généralement exprimée par unité de temps ramenée à la surface colonisée ou à la biomasse algale.

Les mesures de respiration et de production nette sont réalisées successivement sur les mêmes lames colonisées [DENTENBECK et al., 1995] dans des fioles à DBO (Demande Biochimique en Oxygène) de 150 mL en début et fin d'incubation avec un oxymètre WTW OXI 538 muni d’une sonde STIRROX G. Lors de l'incubation en phase sombre, l'opacité est obtenue en recouvrant les flacons d’un film aluminium opaque et l’étanchéité à l’air est assurée par le graissage du col rodé.

Les activités respiratoires et photosynthétiques mesurées sont fonction des temps d'incubation et des caractéristiques du biofilm. Ainsi, afin de ne pas carencer de façon excessive le milieu en oxygène durant l’incubation en phase sombre et, de ce fait, ne pas « stresser » les biofilms durant la mesure, le temps d'incubation est préalablement défini pour chaque série de mesures sur 3 réplicats ; il varie de 2h à 2h30. Pour l’incubation en phase claire, le temps d’incubation est également prédéfini pour ne pas sursaturer le milieu en oxygène ; il varie de 1h à 1h30 pour la production nette.

Les mesures effectuées sur les lames prélevées dans les canaux artificiels ont fait l'objet de mesures supplémentaires dans des flacons contenant de l'eau du milieu d'essai sans lame colonisée, ces flacons peuvent être assimilés à des « blancs ». Cela permet de distinguer l'activité liée aux organismes en suspension dans le milieu d'essai de celle liée au périphyton dans le but d'un simple suivi ou d'une correction des mesures effectuées en présence de périphyton.



2.4.2 Activités Leucine aminopeptidase et β-D-glucosidase

Le protocole de mesure appliqué et décrit ci-dessous conduit à la mesure des activités extracellulaires leucine aminopeptidase et β-D-glucosidase. A ce titre, elle inclut en théorie, les ectoenzymes qui sont sécrétées par les cellules viables et auxquelles elles restent activement associées, mais aussi les enzymes libérées sous l'effet de la dégradation ou de la lyse de la cellule, ainsi que les enzymes libérées sous l'action du broutage des protozoaires et du zooplancton [CHRÓST, 1991]. Bien que cela n'ait pas été fait dans le cadre de ces travaux, l'activité inhérente aux ectoenzymes peut être distinguée par la réalisation d'un témoin négatif [ROMANI et SABATER, 2001]. Un échantillon formolé peut servir de témoin négatif (killed control).

Par ailleurs, sachant que le biofilm testé est préalablement mis en suspension dans l'eau du milieu de collecte (130 mL), la mesure intègre l'activité phytoplanctonique. Celle-ci a été quantifiée dans le cas des essais en canaux artificiels mais s'est avérée négligeable.

2.4.21 Principe de la mesure

Les activités leucine aminopeptidase et β-D-glucosidase ont été déterminées par fluorimétrie selon le protocole de MONTUELLE et VOLAT (1993, 1998). Les mesures ont été faites avec un fluorimètre à microplaques (FLUOSTAR, BMG LabTechnologies).

La méthode consiste à doser par fluorescence le produit issu de la réaction d'hydrolyse enzymatique après incubation de la solution périphytique en présence d'un substrat non fluorescent. Les résultats sont exprimés en quantité de produit formé par unité de temps.

La mesure se fait à concentration saturante. Il s'agit de la concentration à partir de laquelle la quantité de produit formé par unité de temps, c'est-à-dire la vitesse de réaction, n'augmente plus asymptotiquement en fonction de la concentration initiale en substrat mais tend à atteindre une valeur limite (relation de MICHAELIS-MENTEN). A cette concentration, toutes les enzymes présentes sont combinées au substrat. Dans ces conditions, la fluorescence dépend de la concentration en produit formé et reflète de façon quantitative l'activité de l'enzyme impliquée. Décider de travailler à la vitesse maximale de la réaction répond également à la volonté de standardiser nos essais, étape nécessaire pour la comparaison ultime des résultats.

Le temps d'incubation, est défini de manière à ce que, dans cet intervalle, la relation entre la quantité de produit formé et le temps d'incubation soit linéaire.



La méthode se déroule selon trois étapes. Préalablement, la concentration saturante en substrat est déterminée sur un échantillon moyen de biofilm. Les activités sont ensuite déterminées pour chacun des réplicats à la concentration saturante. Enfin, une courbe d'étalonnage est établie pour convertir les résultats bruts, exprimés en unité de fluorescence, en quantité de produit libéré par unité de temps.

Les substrats utilisés pour la réaction enzymatique ainsi que les fluorogènes utilisés pour l'établissement des courbes d'étalonnages sont présentés dans le tableau ci-dessous (Tableau 5).

Enzyme Substrat Fluorogène

β-D-Glucosidase

(βGlc)

4-Méthylumbelliferyl β-D-Glucoside

(MUFGlp)

Méthylumbelliferone (MUF)

Excitation : 365 nm Emission : 460 nm

Leucine aminopeptidase

(Leu-amp)

L-Leucine-4-méthyl-7-coumarin hydrochloride

(Leu-MCA)

7-Amino-4-méthyl-coumarin (MCA)

Excitation : 380 nm Emission : 440 nm

Tableau 5. Substrats et fluorogènes utilisés.

2.4.22 Préparation des réactifs

Une solution mère de substrat concentrée à 3000 µmol/L est préparée par dilution du réactif dans du méthylcellosolve (Sigma, E5378) et stockée durant deux semaines maximum au congélateur. Les solutions utilisées pour le dosage des réactions enzymatiques sont en revanche préparées le jour même par dilution de la solution mère dans de l'eau du milieu (canaux ou bio-essais) filtrée à 0,22 µm (filtres GS, Millipore) et autoclavée à 120°C pendant 20 minutes.

Une solution mère de chaque fluorogène concentrée à 2000 µmol/L est également préparée par dilution dans du méthylcellosove et conservée au congélateur si nécessaire. Les solutions utilisées pour établir les courbes étalons sont obtenues par dilution de la solution mère de fluorogène dans de l'eau du milieu d'essai (canaux ou bio-essais) filtrée et autoclavée. Pour des raisons de temps, ces dilutions n'ont pas été préparées le jour même mais conservées à 4°C et à l'obscurité pendant la durée de l'essai, c'est-à-dire environ deux semaines. En revanche, les courbes étalons ont systématiquement été tracées et leur déviation dans le temps quantifiée.

Enfin, un tampon glycine-soude est préparé à partir d’une solution de glycine 0.05 M et d’une solution d’ammoniaque 0,2 M. Son pH est ajusté à 10,4 avec de la soude.



Réactifs/solvants Masse Molaire/densité Fournisseur Références

MUFGlp MM = 338.3 g/mol Sigma M3633

Leu-MCA MM = 324.8 g/mol Sigma L-2145

MUF MM = 176.2 g/mol Sigma M1381

MCA MM = 175.2 g/mol Sigma A9891

Méthyl Cellosolve d = 0.96 Sigma E5378

Glycine MM = 75.072 g/mol Merck 803K01008869

Hydroxyde d’ammonium d = 0.900 Aldrich 22.122-8

Tableau 6. Réactifs utilisés.

2.4.23 Protocole d'incubation

L'incubation se fait par ajout de deux volumes (1 mL) d'une solution de substrat, dont la concentration a préalablement été définie comme étant la concentration saturante, à un volume (0,5 mL) de suspension périphytique dans des tubes en polypropylène d'une contenance de 5 mL. Les tubes sont maintenus à l'obscurité, à température ambiante et dans des conditions de pH non contrôlées. A défaut d'un système plus sophistiqué, une agitation manuelle est régulièrement exercée pour remettre en suspension les particules de biofilm qui ont tendance à décanter, s'agglomérer ou se fixer aux parois du tube, ce qui pourrait entraîner une baisse de l'activité [HENDEL et MARXSEN, 2000]. Le temps d'incubation est de 20 minutes (justifié dans le point suivant).

En fin d'incubation, la réaction est stoppée par immersion des tubes dans un bain à 100°C pendant 2 minutes et 30 secondes, ce qui a pour conséquence d'entraîner une dégradation chimique du substrat éventuellement non consommé [FREEMAN et al., 1990]. CHRÓST (1992) de même que SABATER et ROMANI (1996) utilisent le tampon glycine pour stopper la réaction, mais cette méthode nécessite plus de temps et ce point peut poser problème lorsque les échantillons traités sont nombreux.

Lors de chaque essai un « blanc » a été effectué selon le même protocole d'incubation, mais en remplaçant la suspension de périphyton par l'eau du milieu d'essai (canaux artificiels ou bio-essais) filtrée à 0,22 µm et autoclavée pour améliorer la stérilisation du milieu et dégrader les enzymes. Cette mesure permet de quantifier la fluorescence liée à l'hydrolyse non-enzymatique du substrat ou à d'éventuelles impuretés [CHAPPELL et GOULDER, 1994 ; AINSWORTH et GOULDER, 2000a]. Des mesures effectuées sur l'eau du milieu sans périphyton ayant montré une activité négligeable dans la colonne d'eau, les



résultats obtenus sont considérés comme étant propres aux organismes épilithiques et non planctoniques.

2.4.24 Définition du temps d'incubation

Le temps d'incubation est préalablement défini de manière à ce que la relation entre la quantité de produit formé et le temps d'incubation soit linéaire.

Pour ce faire, la vitesse de réaction est étudiée en fonction du temps sur trois échantillons de suspension périphytique prélevés dans les canaux avant exposition à l'effluent. Cet essai n'a été effectué qu'une seule fois ; nous avons ensuite fait l'hypothèse que le temps d'incubation, ainsi défini, était valable pour l'ensemble des campagnes d'essais.

L'étude de la cinétique enzymatique est effectuée à concentration saturante, à température ambiante et à l'obscurité. Un mélange « suspension-substrat » est préparé en quantité suffisante pour permettre des prélèvements de 1 mL toutes les cinq minutes pendant 60 minutes ; les prélèvements débutent dès l'introduction du substrat dans la suspension périphytique.

Les aliquots prélevés sont introduits dans des tubes en polypropylène d'une contenance de 5 mL et immédiatement plongés dans un bain à 100°C pour stopper la réaction.

Une fois la série de prélèvements terminée, la concentration en produit formé est déterminée à chaque temps de prélèvement. Les résultats, non présentés ici, montrent que la relation entre la quantité de produit formé et le temps d'incubation est linéaire pendant une heure.

Compte tenu de ces résultats et de considérations d'ordre pratique, le temps d'incubation est fixé à 20 minutes.

2.4.25 Dosage du produit formé

Suite à l'étape d'incubation, les tubes sont centrifugés à 4°C et 4000 rpm pendant 10 minutes et le surnageant, prélevé à l'aide d'une micropipette, est disposé dans une microplaque de 96 puits, à raison de deux réplicats par échantillon. Le dosage se fait en présence de 10% (v:v) de tampon glycine/soude à pH 10,4 pour maximiser la fluorescence [FREEMAN et al., 1990]. Au final, chaque puits contient ainsi 30 µL de tampon et 270 µL d'échantillon. La lecture au fluorimètre se fait à une longueur d'onde d'excitation de 440 nm et de ré-émission de 380 nm.

La fluorescence de l'échantillon en présence de différentes concentrations en fluorogène (MUF et MCA) peut être mesurée pour déterminer un éventuel effet « quenching » [THOMPSON et SINSABAUGH, 2000]. Cette mesure n'a pas été faite dans le cadre des travaux présentés ici.



2.4.26 Détermination de la concentration saturante

Une suspension de périphyton est soumise à des concentrations initiales variables en substrat. Neufs concentrations en substrat allant de 100 à 1800 µmol/L ont été testées selon les protocoles d'incubation et de dosage précédemment décrits ; ces concentrations initiales correspondent à des concentrations finales dans les tubes d'incubation allant de 50 à 900 µmol/L.

En théorie, les courbes exprimant la concentration en produit formé en fonction de la concentration en substrat augmentent asymptotiquement jusqu'à atteindre leur valeur limite, la concentration saturante. En pratique et, plus particulièrement, dans le cas d'échantillons complexes comme du périphyton ou du sédiment, la détermination graphique de la concentration saturante est parfois délicate.

Le principe que nous avons adopté est le suivant : la concentration, considérée comme étant la concentration saturante, est comprise entre le premier point du plateau et l'avant dernier point de ce même plateau lorsque celui-ci est suivi d'une nouvelle augmentation ou d'une chute (Figure 14. Exemple de détermination expérimentale de la concentration saturante. ).

Compte tenu de la durée de cette étape, la concentration saturante est déterminée sur des échantillons moyens (regroupement d'échantillons) pour chaque canal dans le cas des essais en canaux artificiels et pour chaque concentration testée dans le cas des bio-essais.

Figure 14. Exemple de détermination expérimentale de la concentration saturante.

0

200

400

600

800

1 000

1 200

1 400

1 600

1 800

2 000

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

Concentrations en substrat (micromol/l) canal 1 canal2 canal 3 canal 4

prod

uit f

orm

é en

nm

ol/h

/cm

2

ChuteNouvelle

augmentation

Concentration saturante



2.4.27 Détermination de l'activité enzymatique des échantillons

L'activité enzymatique est déterminée sur chaque échantillon selon le protocole d'incubation décrit ci-dessus. Dans le cas des essais en canaux artificiels, elle est mesurée sur les 5 échantillons prélevés dans chacun des 4 canaux. Pour les bio-essais, elle est mesurée sur les 6 échantillons de chaque concentration testée.

2.4.28 Expression des résultats

Les résultats d'activité sont exprimés en quantité de produit formé par unité de temps et par unité de surface ou de biomasse sèche. Une correction des résultats vis-à-vis de la fluorescence du « blanc » est systématiquement apportée.

3. Paramètres chimiques

Les dosages du carbone total et du carbone organique sont effectués au moyen d'un analyseur de carbone (LABTOC, PPM). Les anions sont dosés par chromatographie ionique selon la norme NF EN ISO 10 301-2, à l'exception des nitrites et nitrates qui sont dosés par colorimétrie en flux continu selon la norme NF EN ISO 13 395 du fait de la teneur élevée en chlorures et des orthophosphates par colorimétrie simple (NF EN 1189). Les cations sont dosés par ICP-AES (Inductively Coupled Plasma - Atomic Emission Spectrometry) selon la norme NF EN ISO 11 885.

Tous les échantillons sont préalablement filtrés à 0,45 µm. Ceux destinés au dosage du carbone organique sont stabilisés avec de l'acide orthophosphorique (0,1% v:v) et ceux destinés aux dosages des cations sont stabilisés par ajout d'acide nitrique (0,5% v:v).


Grille expérimentale.

Nature des substrats artificiels

Colonisation du périphyton

Nature du milieu d'essai

Bio-essais (3 campagnes d'essais) Lames de verre in situ dans la Meurthe Eau de la Meurthe

Canaux artificiels (3 campagnes d'essais) Lames de verre Laboratoire Eau de la ville enrichie en

N, P et Si Tableau 7. Articulation des différents essais.

Bio-essais (chapitre 2) mai 2002 juillet 2002 décembre 2002 Concentrations testées en % (v:v) 0 ; 0.4 ; 2 ; 10 ; 50 0 ; 2 ; 10 ; 25 ; 50 ; 70 0 ; 10 ; 25 ; 50 ; 70

Réplicats d'essai 6 réplicats 5 réplicats 6 réplicats

Caractérisation initiale Masse organique Chlorophylle-a Phéopigments

Masse organique Chlorophylle-a Phéopigments


Suivi - - Production/respiration

Caractérisation finale (2 semaines)

Masse organique Chlorophylle-a Production/respirationLeu-aminopeptidase -

Masse organique Chlorophylle-a Production/respiration Leu-aminopeptidase -

Masse organique Chlorophylle-a Production/respiration Leu-aminopeptidase β-D-glucosidase

Tableau 8. Bio-essais : concentrations testées et biodescripteurs suivis.

Canaux artificiels (Chapitre 3)

Campagne principale18/08-20/09/02

Campagne complémentaire 22/09-25/10/02


Durée de l'essai 34 jours 33 jours 33 jours Concentrations testées (% vol. d'effluent) 0 ; 10 ; 25 ; 50% 0 ; 25% 0 ; 10%

Réplicats de canaux aucun 2 réplicats 2 réplicats Prélèvements avant injection en jours T17, T20, T23 T16, T19, T23 T16, T19, T22

Injection T23 jour T23 T22 Prélèvements après injection en jours T24, T25, T30, T34 T24, T25, T29, T31, T33 T24, T25, T29, T31, T33

Caractérisation

Masse organique Chlorophylle-a Densité bactérienne Leu-aminopeptidase β -D-glucosidase Diversité eubactéries Diversité pigmentaire Diversité algale

Masse organique Chlorophylle-a Densité bactérienne Leu-aminopeptidase β -D-glucosidase Diversité eubactéries - -

Masse organique Chlorophylle-a - Leu-aminopeptidase β -D-glucosidase Diversité eubactéries - -

Tableau 9. Essais en canaux artificiels : concentrations en effluent et temps de prélèvement. Légende : Tx : xème jour d'essai


Caractéristiques de l'effluent testé

1. Caractéristiques physico-chimiques

pH Conduct. mS/cm

Cl- mg/L

NO3-

mg/L NO2

-

mg/LSO4

2-

mg/L NH4

+

mg/LPO4

3-

mg/LSi

mg/LS

mg/L 7 88 26750 0.56 <0,01 9,54 17 0.132 2,16 28,2

Tableau 10. pH, conductivité (conduct.), composés et éléments non métalliques.

Na mg/L

K mg/L

Camg/L

Mg mg/L

Ag µg/L

Al mg/L

Sb mg/L

Co µg/L

Fe mg/L

Mnmg/L

9392 223 7715 1,48 < 5,07 <0,38 0,002 < 1,03 0,68 0,564

Tableau 11. Métaux : alcalino-terreux, alcalins, éléments de transition et autres métaux.

Cd µg/L

Cr µg/L

Cu µg/L

Ni µg/L

Pb µg/L

Zn µg/L

6 < 1,61 134 < 0,84 8 411

Tableau 12. Micro-polluants minéraux.

2. Caractéristiques écotoxiques

Les tests de toxicité ont été réalisés par C. BAZIN et S. COQUIBUS (POLDEN). Les données présentées ici sont les concentrations en effluent, dites "concentrations efficaces" pour lesquelles on observe un effet sublétal de 50% (CE50) ou de 20% (CE20) sur le paramètre suivi. Ce système de notation est associé au temps d'exposition. Ainsi, une CE50-48h correspond, par exemple, à une duré d'exposition des organismes à l'effluent de 48h. Enfin, les concentrations sont exprimées en pourcentage volumique.

L'essai d'inhibition de la croissance d'une algue d'eau douce (Pseudokirchneriella subcapitata) réalisé selon la norme NF T 90-375 conduit aux résultats suivants :

Inhibition biomasse CE20-72h = 0,18 % d'effluent. Inhibition croissance CE20-72h = 1,96 % d'effluent.

L'essai d'inhibition de la mobilité d'un micro-crustacé d'eaux douces ou saumâtres (Daphnia magna) mené selon la norme NF EN ISO 6341


T90-301 conduit à valeur de CE50-48h égale à 3,6 % d'effluent. L'immobilité de la daphnie précède, en général, la mort de l'organisme.

L'essai d'inhibition de la luminescence de la bactérie marine Vibrio fischeri effectué selon la norme NF EN ISO 6341 T90-301 conduit aux résultats suivants :

Inhibition luminescence CE50-5 min = 61,94 % d'effluent. Inhibition luminescence CE50-15 min = 67,05 % d'effluent. Inhibition luminescence CE50-30 min = 69,09 % d'effluent.

Les résultats mettent en évidence une toxicité très forte vis-à-vis de l'algue d'eau douce et du micro-crustacé. Dans le cas de l'algue d'eau douce, l'effet est clairement dû à la forte concentration en ions chlorures qui, sous l'effet de phénomènes osmotiques, altère les cellules. Inversement la toxicité pourrait être qualifiée de "modérée" vis-à-vis" de la bactérie marine.


Partie 2. Chapitre 2. Réponse du périphyton exposé à l'effluent en bio-essais

Chapitre 2. Réponse du périphyton exposé à l'effluent en bio-essais.






N, P et Si Rappel. Articulation des essais.

Bio-essais mai 2002 juillet 2002 décembre 2002 Concentrations testées en % (v:v) 0 ; 0.4 ; 2 ; 10 ; 50 0 ; 2 ; 10 ; 25 ; 50 ; 70 0 ; 10 ; 25 ; 50 ; 70

Réplicats d'essai 6 réplicats 5 réplicats 6 réplicats

Caractérisation initiale Masse organique Chlorophylle-a Phéopigments



Suivi - - Production/respiration

Caractérisation finale (2 semaines)

Masse organique Chlorophylle-a Production/respirationLeu-aminopeptidase -

Masse organique Chlorophylle-a Production/respiration Leu-aminopeptidase -

Masse organique Chlorophylle-a Production/respiration Leu-aminopeptidase β-D-glucosidase

. Bio-essais effectués.


Chapitre 3. Réponse du périphyton exposé à l'effluent en canaux artificiels.

Les bio-essais menés dans le cadre de nos travaux répondent à la volonté de mettre au point et de tester un outil de laboratoire permettant de travailler avec l'eau et les organismes du milieu aquatique étudié d'une part, tout en offrant la possibilité de tester l'effet de plusieurs concentrations en effluent d'autre part. Dans le but d'homogénéiser les conditions d'essai, nous rappellons que nous avons initialement fait le choix de travailler sur des substrats artificiels, des lames de verre, et non sur des substrats naturels. Cette démarche vise à réduire la variabilité spatiale des communautés périphytiques collectées et soumises aux essais (cf Partie 1, chapitre 1). Les bio-essais se composent systématiquement d'essais "témoins", menés en l'absence d'effluent, et d'essais "tests" au sein desquels le périphyton est exposé à une gamme de concentrations en effluent. Les différentes concentrations sont obtenues par dilution de l'effluent dans l'eau du milieu de collecte des organismes, c'est-à-dire l'eau de la Meurthe en amont des rejets de l'usine SOLVAY (cf Matériels et méthodes ; Partie 2, chapitre 1).

Dans le cadre de ces essais, nous nous sommes intéressés à la pertinence des biodescripteurs a priori retenus : la masse organique, la teneur en chlorophylle-a, les activités de production primaire brute (photosynthèse) et de respiration et, enfin, l'activité hétérotrophe de l'enzyme leucine aminopeptidase. Aussi, avons-nous cherché à estimer la capacité de ces biodescripteurs à discriminer les effets de différentes concentrations en effluent et à déterminer la significativité des différences observées. Par ailleurs, afin d'évaluer la sensibilité du périphyton vis-à-vis de l'effluent testé en fonction des saisons, nous avons effectué trois campagnes d'essais. Celles-ci se sont déroulées au printemps, en été et en hiver.

Enfin, nous nous sommes attachés à évaluer la variabilité spatiale du périphyton colonisé in situ, ceci afin de d'optimiser le protocole d'échantillonnage des substrats colonisés. Par ailleurs, nous avons évalué l'influence de la durée des essais sur la réponse des biofilms avec l'intention de valider sa pertinence. Sa définition est, pour l'instant, fonction des essais menés en canaux artificiels. Dans les deux cas, la durée d'exposition est d'environ deux semaines.

Préalablement, nous présenterons le mode de traitement des données biologiques, ainsi que les caractéristiques physico-chimiques de la station de collecte du périphyton.



1. Mode de traitement des résultats Le mode de traitement des données biologiques issues des trois campagnes

d'essais a été défini de manière à répondre, au mieux, aux objectifs évoqués ci-dessus. Dans un premier temps, une analyse en composantes principales (ACP)

centrée et normée est réalisée pour chaque campagne afin de visualiser graphiquement l'effet de la concentration en effluent vis-à-vis de l'ensemble des biodescripteurs.

Cette analyse conduit à la visualisation sur un espace à deux dimensions, appelé "plan factoriel", des regroupements ou oppositions entre les individus vis-à-vis de l'ensemble des variables qui les caractérisent. Les corrélations ou anti-corrélations linéaires entre variables sont représentées sur un second plan factoriel, appelé "cercle de corrélation". Ces plans sont définis par deux axes factoriels. Chaque axe factoriel définit une nouvelle variable, appelée "composante principale" ou "facteur", synthétisant les variables d'origine. La fiabilité de la représentation des données sur un plan factoriel est d'autant plus forte que le "pourcentage d'inertie" expliqué par les deux axes ayant engendrés ce plan est élevé. Une synthèse des objectifs et du principe général des ACP est proposée en annexe.

Dans le cas présent, les individus correspondent aux différents échantillons de biofilms analysés et les variables correspondent aux biodescripteurs. La proximité des individus sur le plan factoriel est d'autant plus importante que leur ressemblance est forte vis-à-vis de l'ensemble des variables qui les caractérisent. De même, la corrélation entre deux variables est d'autant plus forte que l'angle formé par les deux vecteurs les représentant sur le cercle de corrélation est faible.

Les interprétations des ACP seront faites selon la même progression. Les analyses sont réalisées en tenant compte des trois premières composantes principales (notés F1, F2 et F3) mais nous nous limiterons systématiquement à la représentation graphique des plans factoriels générés par les deux premiers axes factoriels, respectivement F1 et F2, lorsque le pourcentage d'inertie expliqué par ces deux axes est suffisant. Nous nous intéresserons à la typologie des individus d'une part, à la typologie des variables d'autre part et, enfin, nous conclurons en faisant un lien entre ces deux typologies. L'interprétation visuelle des plans factoriels étant parfois sujette à confusions, notre interprétation sera argumentée par la prise en compte des coordonnées des individus et des variables sur l'ensemble des axes factoriels pris en compte dans l'analyse, c'est-à-dire généralement trois (F1, F2 et F3).

Dans un second temps, des analyses de variance à un facteur (ANOVA-1 ; facteur "concentration en effluent") sont effectuées pour un traitement statistique des données visant à évaluer si les effets observés vis-à-vis de chaque biodescripteur sont significatifs (p < 0,05). Le cas échéant, le test de post-occurence de Bonferroni sera appliqué pour une comparaison des moyennes entre un essai "test" et un essai



"témoin". A l'issue de ce test, nous déterminerons quelles sont les concentrations en effluent provoquant un effet significatif (positif ou négatif) par rapport au témoin.

Les analyses de variance sont réalisées après vérification de la normalité de la distribution des données par application du test de Shapiro. Si les données brutes ne satisfont pas cette condition initiale leur transformation en log10 est alors effectuée. De même, l'égalité des variances est contrôlée par application du test de Levene.

Les analyses multivariées sont effectuées à l'aide du logiciel ADE-4 version

2001 [http//pbil.univ-lyon1.fr/ADE4 ; THIOULOUSE et al., 1997] et les analyses de variance à l'aide du logiciel Statistica 6.0 (StatSoft Inc., 2001).

2. Caractéristiques physico-chimiques de la station de collecte du périphyton

Les caractéristiques physico-chimiques de la station de collecte du périphyton

colonisé sur substrats artificiels sont présentées ci-dessous (Tableau 13 ; Tableau 14). Il s'agit des données de l'Agence de l'Eau mesurées à la station de Damelevière qui est située dans la Meurthe à environ 5 km de l'embranchement du canal d'alimentation dans lequel les substrats de collecte sont placés. Préalablement aux essais, et à deux reprises, une analyse physico-chimique complète de l'eau au niveau des substrats artificiels a permis de vérifier l'adéquation entre les caractéristiques physico-chimiques au niveau de la station de Damelevière et au niveau de la station de collecte des substrats artificiels (données SOLVAY non présentées).

T° pH COD

mg/L NO3

-

mg/LNO2

-

mg/LNH4

+

mg/LPO4

3-

mg/LPrintemps 11,5 7,7 3,2 4,5 0,05 0,02 0,03 Eté 22,8 7,6 2,8 3,6 0,03 0,07 0,03 Hiver 8,5 7,4 7,8 6,0 0,03 0,06 0,05

Tableau 13. Température, pH, matières organiques, azotées et phosphorées à la station de Damelevière. [Source : Agence de l'Eau Rhin-Meuse, 2004]

Conduct. µS/cm

Cl- mg/L

SO42-

mg/LNa

mg/LK

mg/LCa

mg/LMg

mg/LPrintemps 331 13,9 13,0 8,3 2,8 32,6 8,3 Eté 259 18,8 41,3 9,9 3,3 28,9 7,3 Hiver 258 17,3 44,9 9,3 2,8 33,0 8,4

Tableau 14. Minéralisation de l'eau à la station de Damelevière. [Source : Agence de l'Eau Rhin-Meuse, 2004]



L'eau de la Meurthe est légèrement alcaline et modérément minéralisée quelles que soient les saisons. Concernant certains paramètres, il apparaît cependant des différences entre les saisons printanière et estivale d'une part, et la saison hivernale d'autre part. Les différences portent sur la température qui est plus faible en hiver, ainsi que sur les teneurs en carbone dissous et en nitrates qui sont légèrement plus élevées en hiver. Malgré ces variations, les teneurs en azote inorganique restent faibles quelle que soit la saison.

Selon les critères d'évaluation de la qualité de l'eau des cours d'eau établis par les Agences de l'Eau, la classe de qualité est "bleu" ou "vert" selon les paramètres [Agence de l'Eau, 2000], ce qui correspond à une eau de bonne qualité selon cette classification.

Enfin, la vitesse d'écoulement au niveau des substrats varie entre 25 et 30 cm/s. Pour un cours d'eau, il s'agit d'une vitesse lente à moyenne.

3. Présentation des résultats Nous rappelons que les campagnes d'essai se sont déroulées au printemps, en

été et en hiver. Lors de la campagne d'essai menée au printemps 2002, les concentrations

testées ont été définies selon une suite géométrique de raison cinq avec une valeur maximale arbitrairement fixée à 50%, soit 0,4%, 2%, 10% et 50% (v:v). Les concentrations de 10% et de 50% ont été testées au cours des trois campagnes. En revanche, dans le cas des campagnes d'essais effectuées en été et en hiver, les concentrations les plus faibles, c'est-à-dire 0,4% et 2% d'effluent, ont été abandonnées et remplacées par des concentrations plus élevées, à savoir 25 et 70% d'effluent. Ce choix ce justifie par les résultats de la campagne menée au printemps et par la volonté d'élargir le nombre de concentrations testées.

3.1 Analyses en composantes principales

3.1.1 Campagne effectuée au printemps 2002

Les résultats de l'analyse en composantes principales des données issues de la campagne menée au printemps 2002 sont représentés ci-dessous (Figure 15). L'étude se limite à l'interprétation des deux premiers facteurs représentant 79,7% de l'inertie totale, ce qui est un pourcentage acceptable sur un ensemble de six facteurs générés par l'ACP.



La typologie des variables semble révéler une opposition entre les phéopigments, l'activité de la leucine aminopeptidase et la respiration d'une part, et la masse organique et la chlorophylle-a d'autre part. Cependant, seules les variables relatives à la teneur en phéopigments, la respiration et la masse organique sont majoritairement définies par l'axe F1, respectivement à hauteur de 80%, 71% et 86%, et elles participent ensemble à 71% de la définition de cet axe. En conséquence, lors de l'interprétation des individus vis-à-vis de l'axe F1, il sera plus juste de ne retenir que ces variables. Pour ce qui est de l'axe F2, nous retiendrons la variable relative à la production primaire brute qui est définie par cet axe à 88% et qui contribue à sa définition à hauteur de 60%. Les tendances concernant la chlorophylle-a sont moins nettes. Elle contribue plus fortement à la définition de F2 qu'à la défintion de F1 mais ses coordonnées sur F1 sont plus fortes. Cette variable est donc associée aux deux axes.

La typologie des individus montre une opposition selon la concentration en effluent testée le long de l'axe F1. Les essais "témoin" et les essais contenant respectivement 0,4 et 2% d'effluent ont des coordonnées négatives sur cet axe par opposition aux essais contenant 10 et 50% d'effluent. Nous pouvons également noter une ordination des essais "tests" en fonction de la concentration sur F1. Enfin, nous noterons la position particulière des points représentant les essais contenant 50% d'effluent ; ils sont définis en moyenne à 91% par F1 et sont, de ce fait, caractérisés par les teneurs en masse organique les plus élevées et les teneurs en chlorophylle-a et en phéopigments les plus faibles. Nous noterons également la position particulière des points représentant les essais contenant 10% d'effluent ; ils sont définis en moyenne à 75% par l'axe F2 et sont, de ce fait, caractérisés par les valeurs de production brute et les teneurs en chlorophylle-a les plus élevées.

Il ressort de cette analyse, que les biodescripteurs retenus permettent de différencier les essais "tests" (présence d'effluent) en fonction de la concentration en effluent, ce qui se traduit par une ordination des points en fonction de la concentration selon F1. L'augmentation de la concentration en effluent conduit à une augmentation de la croissance globale du biofilm (évolution de la masse organique) mais, inversement, à une diminution de l'activité respiratoire. Par comparaison aux biofilms témoins, la diminution de l'activité respiratoire est plus fortement marquée en présence de 50% d'effluent, ce qui suggère un effet de l'effluent sur le métabolisme global du biofilm. Par ailleurs, l'évolution de la teneur en phéopigments, de la teneur en chlorophylle-a et de l'activité photosynthétique révèle une stimulation de la croissance algale en présence de 10% d'effluent. Plus généralement, les différences entre les biofilms témoins et ceux exposés à 0,4% et 2% sont faibles.



a. Projection des individus sur F1F2. Figure 15. ACP, campagne printemps 2002.

b. Projection des variables sur F1F2.

Témoin

0,4%

3.1.2 Campagne effectuée en été 2002

Les résultats de l'analyse en composantes principales des données issues de la campagne menée en été 2002 sont représentés ci-dessous (Figure 16). L'étude se limite à l'interprétation des deux premiers facteurs représentant 76,52% de l'inertie totale, ce qui est un pourcentage acceptable sur un ensemble de six facteurs générés par l'ACP.

La typologie des variables révèle une opposition entre la variable relative à l'activité de la leucine aminopeptidase d'une part, et les variables production brute et respiration d'autre part. Les variables chlorophylle-a et matière organique sont corrélées positivement à l'axe F2. L'analyse des coordonnées de ces variables et de leur contribution à la définition des axes confirme ces tendances. En revanche, la variable phéopigment est mal représentée sur ce plan factoriel car elle est principalement définie par F3 (76%). A ce titre, nous n'en tiendrons pas compte lors de l'interprétation du plan relatif à la projection des individus.

La typologie des individus montre une opposition selon la concentration en effluent testée le long de l'axe F1 : les essais "témoin" et les essais contenant respectivement 2%, 10% et 25% d'effluent ont des coordonnées négatives sur cet axe par opposition aux essais contenant 50% et 70% d'effluent qui ont des coordonnées positives sur cet axe. En conséquence, les biofilms exposés à 50% et, plus

Chloro-a

MO

Respiration

Prod. Brute

-1

1-1 1

F2

F1

PhéoLeu-amp

Chloro-a

MO

Respiration

Prod. Brute

-1

1-1 1

F2

F1

Chloro-a

MO

Respiration

Prod. Brute

-1

1-1 1

F2

F1

PhéoLeu-amp

50%

2%

-2.6

2.5-2.8 3.8

10%

F1 (55,19%)

F2 (24,21%)

Concentrations en % d’effluent

Témoin

0,4%

50%

2%

-2.6

2.5-2.8 3.8

10%

F1 (55,19%)

F2 (24,21%)

Concentrations en % d’effluent



particulièrement, 70% d'effluent se caractérisent par l'activité de la leucine aminopeptidase la plus élevée et, inversement, par les activités de production primaire et de respiration les plus faibles. Nous pouvons également noter une ordination des essais "tests" en fonction de la concentration sur F1 et une ordination de l'ensemble des essais "témoin", "test-2%", "test-10%" et "test-25%" en fonction de la concentration selon F2. Enfin, nous noterons la position particulière des points représentant les essais contenant 10% d'effluent ; leurs coordonnées, ainsi que leur contribution à la définition des axes montrent que ces points sont fortement liés à F2 et qu'ils sont, à ce titre, caractérisés par des teneurs en chlorophylle-a et en matière organique élevées.

a. Projection des individus sur F1F2. Figure 16.ACP, campagne été 2002.

b. Projection des variables

Cette analyse montre que les biodescripteurs a priori retenus permettent de

différencier les essais "tests" en fonction de la concentration en effluent, ce qui se traduit par une ordination des points selon F1 : l'augmentation de la concentration en effluent conduit à une augmentation de l'activité leucine aminopeptidase et une diminution des activités respiratoire et photosynthétique, notamment en présence de 50 et 70% d'effluent.

Enfin, la disposition des individus le long de F2 révèle une stimulation de la croissance globale et, plus particulièrement, de la croissance algale, des biofilms "tests" par rapport aux biofilms témoins jusqu'à 25% d'effluent.

Chloro-a

Phéo

MO

Leu-amp

Respiration

Prod. Brute -1

1-1 1

F2

F1

Chloro-a

Phéo

MO

Leu-amp

Respiration

Prod. Brute -1

1-1 1

F2

F1

2 %

10 %

25 %

50%

70%

-2.5

2.7-1.9 3.7

Témoin

F2 (31,80%)

F1 (44,72%)

Concentration en % d’effluent

2 %

10 %

25 %

50%

70%

-2.5

2.7-1.9 3.7

-2.5

2.7-1.9 3.7

Témoin

F2 (31,80%)

F1 (44,72%)




3.1.3 Campagne effectuée en hiver 2002

Les résultats de l'analyse en composantes principales des données issues de la campagne menée en hiver 2002 sont représentés ci-dessous (Figure 17). Les biofilms sont caractérisés vi-à-vis d'une variable biologique supplémentaire ; il s'agit de l'activité de la β-D-glucosidase.

L'interprétation de l'analyse en composantes principales se limite à l'interprétation des deux premiers facteurs représentant 78,9 % de l'inertie totale, ce qui est un pourcentage acceptable sur un ensemble de six facteurs générés par l'ACP.

La typologie des variables montre que toutes les variables ont des coordonnées positives par rapport à l'axe F1. L'analyse de leurs coordonnées et de leur contribution à la définition de F1 indique que cet axe est principalement lié aux variables production brute et respiration qui contribuent respectivement à sa définition à hauteur de 81% et 77%. Les variables masse organique et chlorophylle-a sont moins bien représentées sur ce plan car elles sont définies par F1 et F3. Enfin, la variable leucine aminopeptidase est positivement et fortement corrélée à l'axe F2 et la variable β-D-glucosidase est liée aux deux axes (F1 et F2).

La typologie des individus montre une ordination des essais "tests" en fonction de la concentration sur F1 et sur F2. Les points représentant les essais "test-50%" et "test-70%" sont les plus fortement et négativement corrélés à l'axe F1 ; ces points sont donc caractérisés par les plus faibles valeurs de production brute et de respiration. Par ailleurs, parmi les essais "tests", les points représentant les essais contenant 70% d'effluent sont les seuls individus ayant des coordonnées positives sur F2 ; les biofilms exposés à 70% d'effluent sont donc caractérisés par l'activité de la leucine aminopeptidase la plus élevée.

L'ordination des points selon F1 et F2 montre que les biodescripteurs retenus permettent de différencier les essais "tests" (présence d'effluent) en fonction de la concentration en effluent. D'une part, l'augmentation de la concentration en effluent conduit à une diminution des activités respiratoire et photosynthétique notamment en présence de 50% et 70% d'effluent. D'autre part, l'augmentation de la concentration en effluent conduit à une augmentation de l'activité leucine aminopeptidase ; celle-ci est plus nette lorsque le biofilm est exposé à 70% d'effluent. Mais, dans tous les cas, l'activité de la leucine aminopeptidase des biofilms "tests" reste inférieure à celle des biofilms "témoin". Quant à l'activité β-D-glucosidase, celle-ci étant liée aux deux axes, le lien avec la typologie des individus est difficile à établir.



a. Projection des individus sur F1F2.Figure 17. ACP, campagne hiver 2002.

b. Projection des variables sur F1F2. (Absence de la variable "phéopigments" du fait de valeurs négatives)

3.2 Analyses de variance

3.2.1 Effet de la concentration sur la structure du biofilm

La croissance globale (masse organique) des biofilms n'est pas inhibée par la présence de l'effluent quelle que soit la saison (Figure 18). Par ailleurs, une comparaison des essais "tests" aux essais "témoins" montre que le développement du biofilm est significativement stimulé à partir d'une concentration en effluent de 10% (Test de Bonferroni : p < 0,05), sauf en hiver où aucun effet significatif n'est observé. En été comme en hiver, la masse organique des biofilms est maximale lorsque les biofilms sont exposés à une concentration en effluent comprise entre 10 et 25%. Les concentrations en effluent testées au printemps ne permettent pas de situer cet optimal car la masse organique augmente continuellement avec la concentration en effluent.

La croissance de la communauté algale, évaluée par la teneur en chlorophylle-a, est significativement stimulée au printemps, lorsque les biofilms sont exposés à 10% et 50% d'effluent, et en été lorsque les biofilms sont exposés à 2%, 10% et 25% d'effluent (Figure 19). Par ailleurs, une teneur moyenne maximale en chlorophylle-a est observée lorsque les biofilms sont exposés à une concentration en effluent comprise entre 10 et 25% selon la saison. Ce résultat rejoint celui observé précédemment vis-à-vis de la masse organique. En hiver, la croissance algale des biofilms est significativement inhibée par rapport au témoin en présence de 50% et

Leu-amp

β-Gluc

Chloro-aMO

Respiration

Prod. Brute

-1

1-1 1

F1

F2

Leu-amp

β-Gluc

Chloro-aMO

Respiration

Prod. Brute

-1

1-1 1

-1

1-1 1

F1

F2

2 %

10 %

25 %

50%

70%

-2.5

2.7-1.9 3.7

Témoin

F2 (31,80%)

F1 (44,72%)


2 %

10 %

25 %

50%

70%

-2.5

2.7-1.9 3.7

-2.5

2.7-1.9 3.7

Témoin

F2 (31,80%)

F1 (44,72%)




70% d'effluent A cette saison, les conclusions sont toutefois à considerer avec prudence car l'hypothèse d'égalité des variances n'est vérifiée (test de Levene significatif), ce qui, en toute rigueur, n'autorise pas l'application de ce test.

Figure 18. Réponses du biofilm vis-à-vis de sa masse organique en fonction de la concentration en effluent testée et des saisons.

Figure 19. Réponses du biofilm vis-à-vis de la teneur en chlorophylle-a en fonction de la concentration en effluent testée et des saisons. Comparaison au témoin par le test de Bonferroni: * : p <0,05 ; ** p < 0,001. Concentrations testées au printemps : 0 ; 0,4 ; 2 ; 10 et 50%. Concentrations testées en été : 0 ; 2 ; 10 ; 25% ; 50% et 70%. Concentrations testées en hiver : 0 ; 10 ; 25% ; 50 et 70%.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Témoin 0,4% 2% 10% 25% 50% 70%

Printemps 2002 Eté 2002 Hiver 2002

*

*

*

**

*

**

MO

en

mg/

cm2

% volumique d'effluent

0

5

10

15

20

25

Témoin 0,4% 2% 10% 25% 50% 70%Printemps 2002 Eté 2002 Hiver 2002

*

*

**

***

*

Chl

oro-

a en

µg/

cm2




Le calcul de l'indice autotrophique (IA), défini comme le ratio "biomasse / teneur en chlorophylle-a", indique que les communautés autotrophes et hétérotrophes sont équilibrées dans les essais témoins (100 < IA < 400) sauf dans le cas de la campagne d'essais menée en été 2002. L'indice autotrophique, supérieur à 400, suggère une dominance des organismes hétérotrophes éventuellement associés à des matières détritiques (FAYOLLE, 1998). La teneur en phéopigments dans cet essai "témoin" traduit une accumulation de cellules algales sénescentes. En outre, le ratio moyen "chloro-a/(chloro-a+phéo)" est égal à 0,71 ce qui est faible au regard des valeurs observées par ailleurs. L'accumulation de cellules algales sénescentes dans le témoin pourrait s'expliquer par un appauvrissement du milieu en éléments nutritifs. Cet appauvrissement est en effet moins à craindre dans le cas des essais "tests" car l'effluent contient des éléments favorables au développement des organismes (silice, ions ammonium, ions phosphates...).

La comparaison des indices autotrophiques des essais "témoins" et des essais "tests" montre que les valeurs diminuent lorsque la concentration en effluent augmente jusqu'à ce que cette dernière atteigne un minimum de 10 à 25% selon les campagnes. Ce résultat corrobore l'hypothèse précédemment émise quant à la stimulation de la croissance de la communauté algale. Au-delà de ces concentrations la valeur moyenne de l'indice autotrophique augmente, ce qui signifie que la composante hétérotrophe domine.

Figure 20. Indice autotrophique en fonction de la concentration en effluent testée et des saisons. Comparaison au témoin par le test de Bonferroni: * : p <0,05 ; ** p < 0,001. Concentrations testées au printemps : 0 ; 0,4 ; 2 ; 10 et 50%. Concentrations testées en été : 0 ; 2 ; 10 ; 50% et 70%. Concentrations testées en hiver : 0 ; 10 ; 50 et 70%.

0

100

200

300

400

500

600

700

800


Indi

ce A

utot

roph

ique




3.2.2 Effet de la concentration sur le métabolisme du biofilm

La production primaire brute (activité photosynthétique) du biofilm est significativement stimulée en présence de 10% d'effluent au printemps (Figure 21). Cette activité est significativement inhibée en été en présence de 70% d'effluent, ainsi qu'en hiver en présence de 50% et 70% d'effluent. Toutefois, Les conclusions relatives aux mesures de l'activité photosynthétique hivernale sont à considérer avec prudence car la condition d'égalité des variances, nécessaire à l'application des ANOVA, n'est pas respectée.

L'activité respiratoire moyenne des essais "test" diminue lorsque la concentration en effluent augmente, et ceci, quelle que soit la saison (Figure 22). De même, un effet significatif et négatif est observée lors de chaque campagne d'essai lorsque les biofilms sont exposés à 50% d'effluent. En été, l'activité respiratoire est significativement inhibée en présence de 10% d'effluent (p < 0,05). A cette saison, l'inhibition est fortement significative (p < 0,001) aux concentrations supérieures. En hiver, la présence de 10% d'effluent entraîne un effet significatif et stimulant sur l'activité respiratoire du biofilm.



Figure 21. Production brute en fonction de la concentration en effluent testée et des saisons.

Figure 22. Respiration en fonction de la concentration en effluent testée et des saisons Comparaison au témoin par le test de Bonferroni: * : p <0,05 ; ** p < 0,001. Concentrations testées au printemps : 0 ; 0,4 ; 2 ; 10 et 50%. Concentrations testées en été : 0 ; 2 ; 10 ; 25% ; 50% et 70%. Concentrations testées en hiver : 0 ; 10 ; 25% ; 50 et 70%.

0

50

100

150

200

250

300


*

***

**


Pro

duct

ion

brut

e en

mg0

2 /h/m

2

0

10

20

30

40

50

60


**

*

** **

**

*

*


Res

pira

tion

en m

g02 /h

/m2



Le ratio "production brute/respiration" (PB/R) a été défini par ODUM (1957) comme un indice visant à évaluer le niveau d'autotrophie/hétérotrophie d'un biofilm. Le ratio PB/R est inférieur à 1 lorsque la composante hétérotrophe tend à dominer et supérieur à 1 lorsque la composante autotrophe tend à dominer.

Dans le cadre de nos essais, le calcul de cet indice confirme les tendances précédemment observées sur les variables mesurées ou calculées (Tableau 15), c'est-à-dire :

au printemps : l'activité photosynthétique et la croissance de la communauté algale périphytique sont stimulées en présence de 10% d'effluent ;

en été : l'activité photosynthétique et la croissance de la communauté algale périphytique sont inhibées en présence de 70% d'effluent ;

en hiver : l'activité photosynthétique et la croissance de la communauté algale périphytique sont inhibées en présence de 50 et 70% d'effluent.

Chlorophylle-a Indice autotrophique Production brute Production brute /Respiration

Printemps Max : 10% Effet (+) : 10 et 50% Effet (-) : aucun

AI ~ 200 : Témoin AI ~ 200 : 0,4% et 2% IA ~ 100 : 10% 100 <IA <200 : 50%

Max à 10% Effet (+) à 10% Effet (-) : aucun

PB/R = 4 : témoin PB/R = 5 : 2% PB/R = 6 : 10% PB/R = 7 : 50%

Eté Max: 25% Effet (+) : 2 à 25% Effet (-) aucun

AI ~ 500 : Témoin 200 <IA <300 : 2 à 25% AI ~ 450 : 50% AI ~ 650 : 70%

Max : 10% Effet (+) : aucun Effet (-) : 70%

PB/R = 3 : témoin PB/R = 3 : 2% PB/R = 5 : 10% PB/R = 6 : 25% PB/R = 6 : 50% PB/R = 2 : 70%

Hiver Max à 25% Effet (+) : aucun Effet (-) : 50 et 70%

AI ~ 200 : Témoin 200 <IA <300 : 10 et 25% AI ~ 450 : 50% AI ~ 570 : 70%

Max : 10% Effet (+) : aucun Effet (-) : 50 ; 70%

PB/R = 5 : témoin PB/R = 5 : 10% PB/R = 5 : 25% PB/R < 2 : 50% PB/R < 1 : 70%

Tableau 15. Effets sur la chlorophylle-a, la production brute et le ratio PB/R. Légende. Effet (+) : effet stimulant ; effet (-) effet inhibiteur ; ND : non déterminé. Max : maximum. Rappels : Concentrations testées au printemps : 0 ; 0,4 ; 2 ; 10 et 50%. Concentrations testées en été : 0 ; 2 ; 10 ; 25% ; 50% et 70%. Concentrations testées en hiver : 0 ; 10 ; 25% ; 50 et 70%. IA < 100 : dominance des autotrophes ; IA > 400 : dominance des hétérotrophes. PB/R > 1 : dominance des autotrophes ; PB/R < 1 : dominance des hétérotrophes.



Une comparaison des indices autotrophiques et des ratios PB/R conduit aux mêmes tendances lorsque nous concluons à une dominance de la composante autotrophe. En revanche, lors de la campagne d'été, le biofilm exposé à 50% d'effluent a un indice autotrophique supérieur à 400 mais un ratio PB/R égal à 6. Du point de vue structurel, le biofilm est dominé par la composante hétérotrophe [FAYOLLE, 1998] mais du point de vue fonctionnel l'activité photosynthétique est importante [ODUM, 1957]. Cette opposition pourrait s'expliquer par une accumulation de nécromasse, inclue dans la mesure de la masse organique totale et donc, indirectement, dans le calcul de l'indice autotrophique.

L'activité de la leucine aminopeptidase du biofilm testé au printemps est

significativement stimulée aux plus faibles concentrations en effluent (0,4% et 2%). En hiver, l'activité est dix fois plus élevée qu'aux deux autres saisons. Elle est significativement et fortement inhibée en présence de 10%, 25% et 50% d'effluent mais l'effet à 70% d'effluent est non significatif.

Figure 23. Activité de la leu-amp en fonction de la concentration en effluent testée et des saisons Comparaison au témoin par le test de Bonferroni: * : p <0,05 ; ** p < 0,001. Concentrations testées au printemps : 0 ; 0,4 ; 2 ; 10 et 50%. Concentrations testées en été : 0 ; 2 ; 10 ; 50% et 70%.Concentrations testées en hiver : 0 ; 10 ; 50 et 70%.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Témoin 0,4% 2% 10% 25% 50% 70%0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

Printemps 2002 Eté 2002 Hiver 2002 (axe secondaire)

* *

*

*

** ****


Pro

duit

form

é en

nm

ole

/h /

cm2



3.3 Synthèse des effets observés en bio-essais

Au cours de cette partie, nous présenterons une synthèse des effets de la concentration en effluent observés sur les différents biodescripteurs périphytiques. Dans ce cadre, nous tenterons de mettre en exergue l'intérêt et la complémentarité des analyses en composantes principales et des analyses de variance. Enfin, au-delà de toutes considérations relatives à l'effet de la concentration en effluent, nous nous intéresserons aux influences de la concentration sur les interactions entre les communautés algales et bactériennes.

3.3.1 Effet de la concentration en effluent

A l'exception des effets relatifs aux activités respiratoires mesurées en hiver, les tendances préalablement mises en évidence par les ACP sont ensuite confirmées par les ANOVA (Tableau 16). Toutefois, comme nous pouvons le voir dans le tableau de synthèse, il est évident que les analyses de variance affinent et complètent les observations issues des ACP. Afin d'illustrer notre propos, considérons l'effet de la concentration en effluent sur la croissance globale et algale des biofilms testés au printemps (deux premières lignes du tableau). L'ACP suggère un effet stimulant de l'effluent lorsque sa concentration est égale à 10% ; les ANOVA confirment assurément cette observation mais révèlent également un effet bénéfique d'une exposition à 10% d'effluent vis-à-vis de ces deux biodescripteurs.

Quant aux analyses multivariées, elles permettent une description graphique de l'effet d'un traitement vis-à-vis de l'ensemble des variables considérées, ce qui n'est pas envisageable par simple lecture du tableau de données notamment lorsque la concentration en eflluent a un effet bénéfique sur certains biodescripteurs et négatif sur d'autres. Dans le cadre de nos essais, les analyses en composantes principales permettent d'affirmer que l'ensemble des biodescripteurs analysés permet de distinguer l'effet des différentes concentrations en effluent testées quelle que soit la saison d'étude. Par ailleurs, la sensibilité des biodescripteurs est telle que la distinction des traitements effectués au printemps en présence de 0%, 0,4% et 2% est possible.

La présentation synthétique des résultats nous permet de souligner l'évolution de la sensibilité des biofilms en fonction des saisons. Dans le cadre de nos essais, c'est-à-dire en tenant compte du choix des biodescripteurs périphytiques et des caractéristiques de l'effluent testé, la sensiblité des biofilms est supérieure en hiver (les concentrations les plus faibles n'ont cependant pas été testées). Cette différence est très probablement expliquée, au moins en partie, par l'évolution saisonnière de la composition spécifique des biofilms [VIS et al., 1998 ; GRIFFITH et PERRY, 1995].



0,4 % 2 % 10 % 25 % 50 % 70 % ACP

MO Chloro-a Leu-amp Respiration

Printemps 2002

Prod. brute

MO : 10% et 50% Chloro-a : 10% Leu-amp : ? Respi. : 50% Prod. brute : 10%

MO Chloro-a Leu-amp Respiration

Eté 2002

Prod. brute

MO : 50% Chloro-a : 25% Leu-amp : 50% et 70% Respi. : 50% et 70% Prod. brute : 50% et 70%

MO Chloro-a Leu-amp

β-Gluc Respiration

Hiver 2002

Prod. brute

MO : ? Chloro-a : ? Leu-amp β-Gluc : ? Respi. : 50% et 70% Prod. brute : 50% et 70%

Tableau 16. Synthèse des effets observés en fonction des concentrations testées. Légende. MO : masse organique ; Chloro-a : Chlorophylle-a ; β-Gluc : β-D-glucosidase ; Leu-amp ; Leucine aminopeptidase ; cellule grisée : concentration non testée ; flèche montante, effet positif ; flèche descendante, effet inhibiteur ; rond barré, effet nul ; point dinterrogation : effet non déterminé. "?" : variable mal représentée sur l'ACP.

Nous pouvons noter que l'activité photosynthétique est supérieure au

printemps et ceci, quelle que soit la concentration testée (Figure 21). Cette saison, propice au développement de la communauté algale pourrait justifier cette tendance. De même, l'activité respiratoire est globalement supérieure en été (Figure 22). Ces deux observations corroborent les résultats de SHELDON et TAYLOR (1982) qui observent, en canaux artificiels, une diminution du ratio PB/R à la fin de l'été, associé à une augmentation de la température et de l'activité respiratoire périphytique. ACUÑA et al. (2004) constatent également une augmentation de l'activité respiratoire à la fin de l'été dans le cas de biofilms colonisés in situ sur substrats artificiels. Ces derniers attribuent également le déclin de la communauté algale (croissance et activité photosynthétique) au développement intensif de la végétation des berges qui limite l'exposition des biofilms à la lumière.

Nous supposons que le biofilm collecté en été contient une accumulation de biomasse sénescente liée au déclin des cellules algales situées au niveau des couches inférieures du biofilm. La teneur en phéopigments du biofilm collecté en été est de 2,58 µg/cm2 alors qu'elle est inférieure à 0,4 µg/cm2 au printemps et en hiver, ce qui tend à corroborer cette hypothèse. En parallèle, l'augmentation de température à cette



saison, 23°C dans la Meurthe et dans nos bio-essais, favorise très certainement les activités microbiennes liées à la décomposition de la matière organique. Les biofilms collectés n'ayant pas été caractérisés vis-à-vis de leur capacité de biodégradation préalablement aux essai, cette seconde hypothèse est plus difficilement justifiable.

3.3.2 Interactions entre les communautés algales et bactériennes

Comme nous venons de voir, les bio-essais permettent de conclure sur les effets de la concentration d'un effluent complexe sur une communauté périphytique. Il est également intéressant d'évoquer l'interaction entre les communautés bactériennes et algales suggérée par les corrélations, ou anti-corrélations, entre l'activité de la leucine aminopeptidase et les variables impliquant la communauté algale.

Afin de faciliter la compréhension de nos propos, nous rappelons que l'activité de la leucine aminopeptidase est généralement associée aux bactéries hétérotrophes. Elle permet l'hydrolyse de certains polymères en monomères directement assimilables par les bactéries du fait de leur masse moléculaire moins élevée. Par ailleurs, selon la théorie de CHRÓST (1991), plus amplement présentée dans la suite du document (cf Partie 2, chapitre 3), la synthèse et le fonctionnement de la leucine aminopeptidase sont stimulés par la présence de composés organiques de fortes masses moléculaires. Inversement, en présence de composés organiques de faibles masses moléculaires la synthèse et le fonctionnement de l'enzyme sont inhibés. Le lien avec la composante algale est le suivant : le développement de la communauté algale s'accompagne de la biosynthèse d'exudats algaux organiques de faibles masses moléculaires, alors que le déclin de la communauté algale entraîne la libération de composés organiques de fortes masses moléculaires, tels que les constituants cellulaires [SABATER et ROMANI, 1996 ; AINSWORTH et GOULDER, 2000a]. Le modèle de LOCK et al. (1984) suggère l'utilisation des composés algaux par les bactéries hétérotrophes au sein des biofilm épilithiques.

Les analyses en composantes principales relatives aux campagnes d'essai menées en été et en hiver suggèrent une absence de corrélation entre les variables "leucine aminopeptidase" d'une part, et "production brute" et chlorophylle-a" d'autre part : l'angle formé par les vecteurs qui les représentent sur le cercle de corrélation est proche de 90°. La campagne menée au printemps suggère une corrélation entre l'activité de la leucine aminopeptidase et la teneur en phéopigment. Aux autres saisons, la variable "phéopigments" est non représentée ou mal représentée.

Le calcul du coefficient de corrélation de Pearson entre la variable relative à l'activité de la leucine aminopeptidase et les variables impliquant la communauté algale (chlorophylle-a, production brute et phéopigments) permet de confirmer l'interprétation globale et graphique des ACP :



quelle que soit la saison, l'activité de la leucine aminopeptidase est négativement corrélée à la teneur en chlorophylle-a (p < 0,05). Elle est également systématiquement négativement corrélée à la production brute, même si en hiver la corrélation (négative) est non significative ;

au printemps et en été, l'activité de la leucine aminopeptidase est positivement corrélée à la teneur en phéopigments (p < 0,05) ; pas de données de phéopigment en hiver.

En conclusion, ces observations vont dans le sens de la théorie énoncée par CHRÓST (1991) sur le mode de régulation de l'activité de la leucine aminopeptidase. La croissance et l'activité de la communauté algale, qui se manifestent par une augmentation de la teneur en chlorophylle-a et de l'activité photosynthétique (production brute), ont pour conséquence d'inhiber la synthèse et/ou l'activité de la leucine aminopeptidase. Inversement, la sénescence de la communauté algale, qui se manifeste par une augmentation de la teneur en phéopigments, stimule la synthèse et/ou l'activité de la leucine aminopeptidase.

3.4 Perspectives d'amélioration des bio-essais

Dans la perspective d'optimiser les bio-essais, au cours de la dernière campagne d'essai, nous nous sommes intéressés aux trois points suivants :

la variabilité spatiale du périphyton colonisé in situ afin de déterminer si un échantillonnage amélioré pourrait améliorer l'homogénéité des réplicats et, par conséquent, d'en réduire le nombre.

la comparaison des biofilms en sortie du cours d'eau et des biofilms témoins en fin d'essai, ceci afin d'évaluer ce que nous appellerons par la suite "l'effet incubation" ; cette comparaison inclut aussi le stress de "manipulation".

le suivi des activités photosynthétique et respiratoire au cours des essais afin d'évaluer l'effet de la durée d'exposition sur la réponse des biofilms.

Ces différents essais sont successivement présentés dans les paragraphes qui suivent.

3.4.1 Variabilité spatiale du biofilm colonisé in situ

En fin d'essai, toutes campagnes et tous traitements confondus, les coefficients moyens de variation sont compris entre 15 et 20%, à l'exception de ceux



relatifs à la teneur en chlorophylle-a et à la teneur en phéopigments qui atteignent respectivement 30 et 75% au printemps et en été. Selon notre avis, cette variabilité reste acceptable sauf dans le cas des phéopigments. Toutefois, une amélioration du dispositif de collecte pourrait limiter la variabilité spatiale de la colonisation des biofilms collectés en vue des essais et, indirectement, réduire la variabilité entre les réplicats des bio-essais. Les analyses statistiques portent sur les biofilms collectés uniquement dans le but d'être caractérisés et non pas testés.

Sachant que notre dispositif de collecte des biofilms in situ, se compose de quatre séries de douze lames de verre (Photo 21), il n'est pas exclu que la variabilité des réplicats observée en fin d'essai soit en effet liée à la variabilité des substrats colonisés préalablement sélectionnés pour les essais. Afin de vérifier cette hypothèse, lors de la dernière campagne d'essai, nous nous sommes intéressés à la variabilité spatiale du biofilm colonisé in situ selon un découpage de la zone de collecte amont/aval d'une part, et haut/bas d'autre part (Photo 21). Cette démarche a aussi pour objectif de déterminer si un échantillonnage stratifié aléatoire serait préférable à un échantilonnage aléatoire, ce qui permettrait, le cas échéant, d'améliorer notre mode d'échantillonnage. Selon nos conclusions, une réduction du nombre de réplicats pourrait être envisagée pour augmenter le nombre de concentrations testées ou, plus simplement, pour alléger les essais.

Photo 21. Dispositif de collecte du biofilm en milieu naturel : 4 séries de 12 lames.

Ecoulement

Bas amont

Haut amont Haut aval

Bas aval

L'homogénéité de la colonisation du biofilm in situ est étudiée par la

caractérisation de quatre substrats colonisés (lames de verre) aléatoirement prélevés dans chaque zone du dispositif de collecte : haut/aval, bas/aval, haut/amont et bas/amont (cf Photo 21). L'homogénéité de la colonisation du biofilm est évaluée vis-à-vis de la masse organique, de la teneur en chlorophylle-a et en phéopigments, ainsi que de l'activité des enzymes leucine aminopeptidase et β-D-glucosidase. Les activités de production et de respiration n'ont pas pu être mesurées du fait du lancement des bio-essais, le matériel étant commun.



Les données sont traitées par une analyse en composantes principales afin de déterminer les ressemblances et les oppositions éventuelles entre les zones de colonisation (Figure 24).

a. Projection des individus sur F1F2. Figure 24. ACP, colonisation in situ, hiver 2002.


Les variables biologiques sont toutes corrélées au facteur F1, il s'agit d'un

effet "taille" : certains individus se caractérisent par des valeurs faibles pour l'ensemble des variables, alors que d'autres individus se caractérisent par des valeurs fortes pour l'ensemble des variables. L'axe F2 semble opposer les variables leucine aminopeptidase et masse organique d'une part et, les variables phéopigments, β-D-glucosidase et chlorophylle-a d'autre part. En réalité, une étude plus détaillée des coordonnées montre que toutes les variables sont davantage liées à F1 qu'à F2 à l'exception de la leucine aminopeptidase.

Le groupe d'individus de la zone "haut/aval" s'oppose à celui de la zone "bas/amont" selon F1 : la masse organique, en phéopigments, en chlorophylle-a, ainsi que l'activité de la β-D-glucosidase, sont plus élevées dans la zone "haut/aval" que dans la zone "bas/amont". De même, le groupe d'individus de la zone "bas/aval" s'oppose à celui de la zone "haut/amont" selon F2 : l'activité de la leucine aminopeptidase est plus faible dans ce dernier secteur.

L'analyse en composantes principales met en évidence un regroupement des individus, c'est-à-dire des échantillons, selon les "zones" étudiées. En conséquence, nous suggérons de procéder à un échantillonnage aléatoire et stratifié en prélevant le

Leu-amp

β-GlucChloro-a

Phéo

MO-1

1-1 1 Leu-amp

β-GlucChloro-a

Phéo

MO-1

1-1 1

HamontHamont

Hamont

Hamont

Haval

Haval

Haval

Haval

Bamont

Bamont

Bamont

Bamont

Baval

Baval

Baval

Baval-1.6

2-1.8 4.2

F2

F1

HamontHamont

Hamont

Hamont

Haval

Haval

Haval

Haval

Bamont

Bamont

Bamont

Bamont

Baval

Baval

Baval

Baval-1.6

2-1.8 4.2

F2

F1



même nombre de lames dans chaque zone. Une étude de la variabilité de la colonisation au sein de chaque zone permettrait de fixer le nombre d'échantillons.

Le lien entre la typologie des individus et celle des variables ne permet pas d'expliquer ces regroupements ou oppositons observés. Néanmoins, nous pouvons noter que la dispersion des échantillons des deux séries de lames placées en aval du dispositif est supérieure à celle des échantillons des deux séries de lames placées en amont. Ce résultat soulève la question suivante : ne serait-il pas préférable d'utiliser quatre dispositifs de collecte contenant une série de douze lames au lieu d'un dispositif contenant quatre séries de douze lames ?

A présent, afin d'expliquer les regroupements et oppositions entre les quatre

zones du dispositif de collecte, des analyses de variance sont effectuées. La normalité de la distribution des données est vérifiée par le test de Shapiro et l'égalité des variances est contrôlée par le test de Levene. Une analyse de variance à deux facteurs montre que l'interaction des effets "haut/bas" et "amont/aval" est non significative (p > 0,05). Les effets sont donc étudiés par une analyse de variance à un facteur (ANOVA-1). Les résultats sont présentés ci-après (Tableau 17).

L'effet du positionnement "haut/bas" est significatif dans le cas des variables impliquant la communauté phototrophe. Cet effet est sans aucun doute lié à la différence d'exposition à la lumière entre les deux séries de lames placées en haut et les deux séries de lames placées en bas du dispositif de collecte. Ce résultat pouvait être prévisible mais nous avions pris soin de limiter la distance entre les lames du haut et celles du bas (< 7 cm). En revanche, nous n'expliquons pas l'effet "amont/aval". Attention, le traitement de ces données permet de se prononcer sur la significativité de la différence vis-à-vis d'un biodescripteur et non sur la signification écologique de cette différence.

Composantes périphytiques impliquées

ANOVA-1 Effet "haut/bas"

ANOVA-1 Effet "amont/aval"

Masse organique Hétérotrophes Autotrophes NS S*

Chlorophylle-a Phototrophes S** NS

Phéopigments Phototrophes NS NS

Leucine aminopeptidase Hétérotrophes NS S**

β-Glucosidase Hétérotrophes Phototrophe S* NS

Tableau 17. Evaluation de l'homogénéité spatiale de la colonisation in situ des biofilms.

Afin d'aller plus loin dans notre démarche visant à expliquer l'hétérogénéité

spatiale de la colonisation du biofilm sur notre dispositif de collecte, une détermination



de la composition taxonomique des diatomées a été confiée au bureau d'études Bi-eau (Angers). L'identification des diatomées a été effectuée sur des échantillons moyens correspondant aux quatre zones définissant notre dispositif de collecte.

L'analyse montre que les espèces Rhoicosphenia abbreviata (RABB), Eolimna minima (EOMI), Cocconeis placentula Ehrenberg (CPLA) et Achnanthes minutissima (AMIN) sont majoritairement représentées dans les quatres zones du dispositif de collecte. Elles représentent, dans ces zones, 71 à 84% des taxons identifiés. Le pourcentage relatif de ces espèces est détaillé ci-dessous (Tableau 18).

RABB Aval Amont

Haut 39% 37%

Bas 58% 50%

EOMI Aval Amont

Haut 14% 17%

Bas 21% 14¨% Rhoicosphenia abbreviata [Bi-Eau, 2004]

CPLA Aval Amont

Haut 20% 8%

Bas 3% 9%

AMIN Aval Amont

Haut 2% 5%

Bas 2% 4% Cocconeis placentula [Bi-Eau, 2004]

Tableau 18. Abondance relative en % des taxons majoritaires des biofilms colonisés in situ.

En conclusion, il est difficile d'expliquer la variabilité de certains biodescripteurs par une différence de composition des biofilms ; toutefois, ces données confirment la nécessité de procéder à un échantillonnage aléatoire stratifé.

Enfin, nous pouvons noter que l'abondance relative de l'espèce la plus représentée au sein des quatre zones du dispositif de collecte, Rhoicosphenia abbreviata (RABB), est supérieure dans les deux séries de lames inférieures.

3.4.2 Etude de l'effet "incubation"

Les effets potentiels de la concentration en effluent s'ajoutent au stress dû au changement des "conditions de vie" des organismes. Pour cette raison, nous nous intéressons ici à l'effet "incubation", par comparaison des caractéristiques des biofilms au moment de leur collecte dans le cours d'eau et des caractéristiques des biofilms "témoins" en fin d'essai.



Avant essai Masse org. mg/cm2

Chloro-a µg/cm2

Phéopigments µg/cm2

Ratio "Chloro/(chloro+Phéo)" IA

Printemps 2002 n = 8

1,04 ± 0,18 CV = 18%

12,24 ± 2,06 CV = 17%

0,23 ± 0,14 CV = 61%

0,98 ± 0,01 CV = 1%

85 ± 11 CV = 13%

Eté 2002 n = 18

1,36 ± 0,13 CV = 10

13,91 ± 3,6 CV = 26%

2,58 ± 0,59 CV = 23

0,83 ± 0,04 CV = 4

107 ± 16 CV = 15

Hiver 2002 n = 16

1,55 ± 0,28 CV = 18%

9,42 ± 4,24 CV = 45%

0,36 ± 0,36 CV = 99%

0,97 ± 0,02 CV = 2%

201 ± 100 CV = 49%

Fin d'essai Masse org. mg/cm2

Chloro-a µg/cm2

Phéopigments µg/cm2

Ratio "Chloro/(chloro+Phéo)" IA

Printemps 2002 Témoin : n = 6

1,22 ± 0,18 CV = 15

4,97 ± 1,88 CV = 38

2,44 ± 0,66 CV = 27

0,66 ± 0,12 CV = 18

269 ± 80 CV = 30

Eté 2002 Témoin : n = 5

1,17 ± 0,32 CV = 28

2,47 ± 0,82 CV = 33

1,04 ± 0,46 CV = 45

0,71 ± 0,06 CV = 9

492 ± 117 CV = 24

Hiver 2002 Témoin : n = 6

1,92 ± 0,37 CV = 19%

9,46 ± 0,72 CV = 8%

0,10 ± 0,03 CV = 31

0,99 ± 0,00 CV = 0,25

204 ± 42 CV = 21

Tableau 19. Caractérisation des biofilms collectés et des biofilms "témoins" en fin de période d'essai. Légende. n : nombre de réplicats ; CV ; coefficient de variation ; Chloro : Chlorophylle-a ; Phéo : phéopigments ; Masse org. : masse organique ; IA : indice autotrophique ;

Les résultats montrent que l'effet de l'incubation se manifeste clairement au niveau de la communauté algale au printemps et en été. En fin d'essai, la teneur en chlorophylle-a est deux fois plus faible au printemps et cinq fois plus faible en hiver. L'effet est particulièrement net sur la communauté périphytique testée en été ; initialement caractérisée par la dominance de la composante autotrophe, la communauté périphytique est ensuite caratérisée par la dominance de la composante hétérotrophe. Par ailleurs, l'évolution du ratio "chlorophylle-a/(chlorophylle-a + phéopigments)" confirme l'accumulation de cellules algales sénescentes dans les biofilms "témoins" testés au printemps et en été : initialement proche de 1, il est ensuite d'environ 0,7.

La sénescence de la communauté algale dans les essais témoins pourrait intuitivement surprendre. D'une part, la manipulation des biofilms lors de la mise en oeuvre des bio-essais conduit irrémédiablement à la remise en suspension des matières déposées à la surface des biofilms ; d'autre part, le système d'éclairage artificiel du dispositif expérimental est, a priori, plus favorable au développement de la communauté algale que les conditions de colonisation in situ. En effet, les biofilms sont prélevés dans un canal étroit (7 m), où l'eau est légèrement colorée et les berges particulièrement végétalisées à la fin de l'été, ce qui limite l'exposition des biofilms à la lumière.



La sénescence de la communauté algale soulève la question suivante : ne serait-il pas préférable de réduire le temps d'essai afin de réduire les effets inhérents au dispositif et au protocole expérimentaux ? Mais cette première question en entrâine une seconde : si l'effet de la durée d'exposition est réduite quelle devient la pertinence des biodescripteurs structurels globaux dont le temps de réponse est supérieur à celui des biodescripteurs fonctionnels ?

3.4.3 Effet de la durée d'essai sur la réponse des biofilms

En théorie, la durée des bio-essais devrait respecter un temps d'adaptation des organismes et tenir compte de l'épuisement du milieu d'essai en éléments nutritifs. Dans notre cas, la durée des bio-essais a été définie par cohérence au temps d'exposition des biofilms à l'effluent fixé dans le cas des essais menés en canaux artificiels, c'est-à-dire environ deux semaines. Pour pallier une éventuelle carence en éléments nutritifs, un renouvellement hebdomadaire des milieux a été réalisé. Afin de contrôler la pertinence de nos choix (durée d'essai), un suivi des activités photosynthétique et respiratoire a été effectué lors de la dernière campagne d'essai (hiver 2002). Ces mesures ont l'avantage d'être "non destructives" et de représenter l'activité globale des biofilms.

Les résultats relatifs au suivi de la production primaire brute sont très clairs. Il n'existe peu ou pas de différence entre les traitements après deux jours d'essai. En revanche, à partir du cinquième, la distinction entre les différents traitements est de plus en plus manifeste. Les mesures effectuées le 8è jour et le 14è jour conduisent par ailleurs aux même conclusions.

Les résultats relatifs au suivi de l'activité respiratoire montrent également qu'au bout de deux jours d'essai, la réponse des biofilms est comparable quel que soit le traitement. A partir du cinquième jour d'essai, la distinction entre les essais devient possible. Cependant, au vu des intervalles de confiance, les conclusions ne seraient pas identiques au huitième et au quatorzième jour d'essai. Dans le premier cas, les effets sont négatifs et significatifs en présence de 50 et 70% d'effluent ; dans le second cas, l'effet de l'effluent à 50% est non significatif. La modification de la durée d'essai, au vu de ces résultats, est une décision difficile car des mesures intermédiaires auraient peut-être donné lieu à des conclusions différentes. Enfin, l'effet de la durée du traitement est très probablement fonction de la saison et de la charge trophique du cours d'eau.

En conclusion, les résultats des bio-essais montrent que les traitements peuvent être différenciés dans les conditions expérimentales qui sont les nôtres. Cependant, il est vrai qu'une éventuelle carence en éléments nutritifs dans les essais témoins constitue une source de confusion. En effet, la stimulation de la croissance algale en présence de 10% et 25% d'effluent au printemps et en été est très vraisemblablement liée à la présence d'éléments nutritifs dans l'effluent mais cet effet



est peut être amplifié par une carence éventuelle en éléments nutritifs dans les essais témoins. Aussi, suggérons-nous de diminuer la durée d'essai à une semaine et/ou de suivre la consommation en éléments nutritifs. La meilleure solution, serait d'envisager une circulation du milieu avec un renouvellement partiel.

Figure 25. Suivi de la production brute primaire dans les bio-essais en mgO2/h/m2 (hiver 2002).

Figure 26. Suivi de la respiration dans les bio-essais en mgO2/h/m2 (hiver 2002).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

2 4 6 8 10 12 14 16

Témoin 10% 25% 50% 70% Durée d'essai (jours)

Pro

duct

ion

brut

e en

mg/

h/m2

0

5

10

15

20

25

30

35

2 4 6 8 10 12 14 16

Témoin 10% 25% 50% 70% Durée d'essai (jours)

Res

pira

tion

en m

g/h/

m2









N, P et Si Rappel. Articulation des différents essais.

Canaux artificiels (Chapitre 3)

Campagne principale18/08-20/09/02



Durée de l'essai 34 jours 33 jours 33 jours Concentrations testées (% vol. d'effluent) 0 ; 10 ; 25 ; 50% 0 ; 25% 0 ; 10%

Réplicats de canaux aucun 2 réplicats 2 réplicats Prélèvements avant injection en jours T17, T20, T23 T16, T19, T23 T16, T19, T22

Injection T23 jour T23 T22 Prélèvements après injection en jours T24, T25, T30, T34 T24, T25, T29, T31, T33 T24, T25, T29, T31, T33

Caractérisation

Masse organique Chlorophylle-a Densité bactérienne Leu-aminopeptidase β -D-glucosidase Diversité eubactéries Diversité pigmentaire Diversité algale

Masse organique Chlorophylle-a Densité bactérienne Leu-aminopeptidase β -D-glucosidase Diversité eubactéries - -

Masse organique Chlorophylle-a - Leu-aminopeptidase β -D-glucosidase Diversité eubactéries - -

Rappel. Essais en canaux artificiels : concentrations testées et temps de prélèvement. Tx : xème jour d'essai



Rappel. Déroulement des essais en canaux artificiels.

Rappel. Déroulement des essais en canaux artificiels et variables biologiques mesurées.

Jours d’essai

T0 Mise en route des canaux et positionnement des substrats

T1

T17

T20

T23

Enrichissement (N, P, K, Si) et ensemencement


T24

Injection de l'effluent

T30

T34


Collecte du biofilm dans l'eau des canaux (brosse à dent)

Homogénéisation des suspensions(mixeur)

Chlorophylle-a

Constitution d'un échantillon moyen par canal

Activités enzymatiques hétérotrophes

Biomasse totale

Diversité des diatomées Diversité de la communauté bactérienne

Diversité p igmentaire

Dénombrement bactérien


Partie 2. Chapitre 3. Réponse du périphyton exposé à l'effluent en canaux artificiels.

Ce chapitre est consacré à l'exploitation, à l'interprétation et à la discussion des résultats relatifs aux trois campagnes d'essais menées en canaux artificiels. L'objectif de ces trois campagnes, ainsi que la justification des concentrations en effluent testées sont exposés dans les paragraphes qui suivent.

Compte tenu de la question centrale de notre étude, l'évaluation de l'effet de la concentration d'un effluent complexe sur une communauté périphytique, la démarche idéale aurait été de reprendre celle précédemment appliquée dans le cadre des bio-essais. Cela nous aurait conduit à tester plusieurs concentrations en effluent d'une part, et à effectuer des réplicats de canaux d'autre part. Toutefois, sachant que le dispositif expérimental a été conçu et mis au point (résultats non présentés) dans le cadre de nos travaux, il n'était pas envisageable de multiplier les canaux artificiels avant même de définir le protocole d'essai et d'identifier les éventuelles améliorations à apporter, que ce soit au niveau de la méthode ou du dispositif expérimental.

En conséquence, et sachant que notre dispositif se limite à quatre canaux, notre choix a été de tester, dans un premier temps, l'effet de trois concentrations en effluent et de conserver un canal comme témoin. Afin que l'interprétation de nos données puisse néanmoins être renforcée par l'application d'un traitement statistique, des réplicats intra-canal ont été effectués lors de chaque série de prélèvements (cf matériels et méthodes). Les concentrations en effluent testées au cours de cette campagne sont égales à 10%, 25% et 50% d'effluent. Elles ont été fixées par cohérence avec celles testées en bio-essais mais, ne connaissant pas la sensibilité de notre dispositif expérimental à ce stade de l'étude, nous n'avons pas testé de plus faibles concentrations. Néanmoins, suite aux améliorations que nous énoncerons en conclusion de notre rapport, visant à réduire la variabilité naturelle du dispositif, de plus faibles concentrations pourront être testées ultérieurement. Dans un second temps, deux autres campagnes d'essais ont été menées dans l'unique but de confirmer les résultats de la première campagne en effectuant, cette fois-ci, deux réplicats de canaux (deux canaux "test" et deux canaux "témoins"). Aussi, avons-nous testé, une nouvelle fois, l'effet d'une concentration de 10% en effluent puis l'effet d'une concentration de 25% en effluent.

Ce chapitre se compose d'une partie introductive au cours de laquelle nous exposerons le mode de traitement des données. Nous présenterons ensuite les résultats de la campagne d'essais principale, la première, en nous intéressant à la caractérisation des biofilms colonisés dans les canaux sur substrats artificiels avant l'injection de l'effluent, ainsi qu'à l'évolution de leur caractéristiques structurelles et fonctionnelles suite à l'exposition à l'effluent. Enfin, nous verrons que les campagnes d'essais complémentaires confirment les effets précédemment observés.

Pour conclure, sachant que la première campagne d'essai est la plus importante, notre discussion se limitera volontairement à cette campagne.



1. Mode de traitement des données

1.1 Calcul de l'indice autotrophique La structure globale du biofilm est classiquement évaluée au moyen de

l'indice autotrophique (IA), défini comme le ratio "Masse org. / teneur en chorophylle-a". Cet indice permet de mettre en avant le ratio entre les organismes autotrophes et hétérotrophes. Son interprétation doit tenir compte du mode de mesure de la masse organique. Celui-ci intègre les organismes vivants mais aussi la nécromasse, les composés organiques et tout autre dépôt de matière organique.

Dans le cadre de nos conditions expérimentales et de la nature de l'effluent testé, l'apport de matière organique peut être négligé. Quant à la nécromasse, le dosage des phéopigments (forme dégradée de la chlorophylle-a) permet d'estimer la part des cellules algales sénescentes mais le mode de dénombrement des bactéries ne conduit pas à la distinction des cellules vivantes, endommagées ou mortes.

Selon FAYOLLE (1998), une communauté périphytique dominée par les algues est caractérisée par un indice autotrophique inférieur à 100. Inversement, une dominance des organismes hétérotrophes éventuellement associés à des matières détritiques se traduit par un indice supérieur à 400. Lorsque l'indice est compris entre 100 et 400, les deux communautés sont équilibrées.

1.2 Détermination des paramètres de cinétique des activités enzymatiques : KM et Vm Nous rappelons que la réaction de catalyse enzymatique porte sur la

dégradation d'un substrat en produit. La réaction suit généralement la loi de MICHAELIS-MENTEN [SINSABAUGH et al., 1997].

L'activité des enzymes leucine aminopeptidase et β-D-glucosidase est évaluée par la mesure de la vitesse d'apparition du produit issu de la réaction. Les mesures se font à la concentration saturante en substrat.

La détermination expérimentale de la concentration saturante s'effectue par la mesure de l'activité enzymatique à différentes concentrations en substrat. L'exploitation de ces données permet également le calcul des paramètres caractéristiques de la cinétique de la réaction. Il s'agit de la vitesse maximale de la réaction (Vm) et de la constante de MICHAELIS (Km) ; Vm a la dimension d'une concentration par unité de temps et Km a la dimension d'une concentration.



La vitesse maximum correspond à la vitesse observée lorsque l'enzyme est saturée en substrat, elle représente les capacités maximales de l'enzyme. La constante de MICHAELIS correspond à la concentration du substrat pour laquelle la vitesse atteint la moitié de la vitesse maximum. Elle définit l'affinité de l'enzyme pour le substrat : une diminution de la constante de MICHAELIS reflète une augmentation de l'affinité de l'enzyme pour le substrat.

Les paramètres cinétiques Km et Vm peuvent être déterminés graphiquement en traçant la relation 1/V = f(1/[S]) avec V la vitesse de réaction et [S] la concentration en substrat. Cette relation est en théorie linéaire et, selon l'équation de MICHAELIS et MENTEN, sa pente est égale au ratio Km/Vm. Elle coupe l'axe des ordonnées à la valeur de 1/Vm et l'axe des abscisses à la valeur de (-1/Km).

Lorsqu'une baisse d'activité est observée, l'étude simultanée de ces deux paramètres permet de déterminer si l'inhibition de la réaction est compétitive ou non :

Une inhibition compétitive se traduit par une valeur de Km inchangée et une chute du Vm ; l'agent inhibiteur se fixe en dehors du site actif de l'enzyme [PELMONT, 1995].

Une inhibition non compétitive peut se traduire par un Vm constant et une augmentation du Km ; l'agent inhibiteur se fixe en dehors du site actif de l'enzyme [PELMONT, 1995].

Une inhibition non compétitive peut aussi se traduire par une diminution des deux constantes Vm et Km ; ce phénomène peut être lié à la dégradation des enzymes synthétisées [SINSABAUGH et al., 1997].

1.3 Analyses multivariées et analyses de variance

Les données ont fait l'objet d'analyses multivariées (AFC, ACP, co-inertie), d'une part, et d'analyses de variance d'autre part.

Des analyses en composantes principales (ACP) sont effectuées pour le traitement des données biologiques relatives à la caractérisation du périphyton et pour le traitement des données physico-chimiques relatives à la caractérisation du milieu d'essai. Nous rappelons que ces analyses permettent de visualiser les regroupements ou oppositions entre les individus sur un plan factoriel, ainsi que les corrélations ou anti-corrélations linéaires entre les variables sur un cercle de corrélation (cf chapitre 2 et annexe).

Des analyses factorielles des correspondances (AFC) sont effectuées pour le traitement des données relatives à la composition et à la structure de la communauté bactérienne périphytique. Ce type de technique est adapté à l'analyse d'un tableau de contingence, c'est-à-dire d'un tableau d'effectifs obtenu en croisant les modalités de



deux variables qualitatives définies sur n individus. Dans ce cas, les espèces présentes ne sont pas traitées comme des variables mais comme les modalités de la variable "espèce". De même, les données en colonne ne sont plus traitées comme des individus mais comme les modalités de la variable "relevé". Comme l'ACP, l'analyse factorielle des correspondances a pour but de réduire la dimension des données en conservant le plus d'information possible : recherche préalable de deux plans de projection qui passent aussi près que possible des nuages des points lignes d'une part et des points colonnes d'autre part. Elle permet de visualiser les regroupements ou oppositions entre lignes d'une part et colonnes d'autre part sur les plans factoriels correspondants. La distance du khi2 définit la ressemblance entre deux lignes ou entre deux colonnes. L'AFC conduit à la mise en évidence d'une typologie des lignes, une typologie des colonnes et d'un lien entre ces deux typologies. Ce dernier point s'obtient par la superposition des deux plans factoriels. Contrairement à l'ACP, cette représentation simultanée est universellement acceptée car les objets sont de même nature (classes d'individus) [ESCOFIER et PAGES, 1998].

Des analyses de co-inerties (AFC/ACP ou ACP/ACP) sont ensuite appliquées afin de coupler les données biologiques aux données physico-chimiques. Dans certains cas, la simple analyse graphique des ACP et AFC permet de supposer que les variations physico-chimiques expliquent les variations biologiques lorsqu'une ordination des individus est observée selon la même logique dans les deux analyses. Cependant, en toute rigueur, l'espace factoriel n'étant pas le même, il paraît nécessaire de vérifier l'existence d'une ordination des individus selon les variables biologiques d'une part, et les variables physico-chimiques d'autre part, au sein d'un espace factoriel commun. L'analyse de co-inertie permet d'identifier la structure commune contenue dans un couple de tableaux et d'analyser par la suite la partition de ces individus au sein de cette structure commune.

L'étude des variables indépendamment les unes des autres est ensuite réalisée pour l'ensemble des quatre canaux par des analyses de variance (ANOVA) à un et/ou deux facteurs contrôlés. Ces analyses ont pour objectif d'évaluer la significativité des effets observés lors de l'interprétation graphique des analyses multivariées.

Une analyse de variance à deux facteurs (temps & concentration) est préalablement effectuée (ANOVA-2). Lorsque l'interaction est non significative (p ≥ 0,05), l'effet de la concentration est étudié indépendamment. Si l'interaction est significative, l'effet "concentration" est alors étudié à chaque temps de prélèvement (ANOVA-1). Le test de post-occurrence appliqué pour une comparaison des moyennes deux à deux est le test de Bonferroni. Les comparaisons sont effectuées entre un canal "test" et le canal témoin.

Les analyses de variance présentées dans ce chapitre sont réalisées après vérification de la normalité de la distribution par application du test de Shapiro. Si les données brutes ne satisfont pas cette condition initiale leur log10 est alors calculé. De même, l'égalité des variances est contrôlée par application du test de Levene. Si cette



seconde hypothèse n'est pas vérifiée les analyses de variance seront néanmoins effectuées mais les conclusions seront à considérer avec prudence.

Enfin, l'étude des corrélations linéaires entre variables est réalisée par application du coefficient de Pearson.

Les analyses multivariées sont effectuées à l'aide du logiciel ADE-4 version 2001 [http//pbil.univ-lyon1.fr/ADE4 ; THIOULOUSE et al., 1997] et les analyses univariées à l'aide du logiciel Statistica 6.0 (StatSoft Inc., 2001).

2. Campagne d'essai principale

Cette campagne a pour objectif d'évaluer la réponse de communautés périphytiques colonisées en canaux artificiels pendant 23 jours puis exposées, dans ces mêmes canaux, à différentes concentrations en effluent (10%, 25% et 50% v:v) pendant 11 jours.

Les réponses des communautés périphytiques sont estimées par la mesure des effets de la perturbation sur l'évolution de paramètres structurels et fonctionnels : la biomasse totale (masse organique), la biomasse algale (chlorophylle-a), la densité bactérienne (dénombrement au DAPI), la diversité pigmentaire (HPLC), la diversité diatomique, la diversité eubactérienne (DGGE) et, enfin, les activités des enzymes leucine aminopeptidase et β-D-glucosidase. Ces variables biologiques sont utilisées comme biodescripteurs de l'intensité de la perturbation chimique étudiée.

Au cours de l'essai, les biofilms ont été collectés et caractérisés à différents intervalles de temps avant l'injection de l'effluent (T17, T20, T23) et après son injection (T24, T25, T30, T34). La fréquence de prélèvement post-injection a été fixée de manière à permettre l'observation des effets immédiats et des effets différés.

Nous rappelons que "Tx" désigne le "xème jour d'essai". Le dénombrement bactérien n'a pas été fait à T20 et T25 pour des questions de temps. Pour la même raison, les analyses portent sur le traitement de trois réplicats intra-canal (n=3) et non de cinq réplicats (n=5). Les analyses relatives à la composition des communautés algale et bactérienne ont été effectuées sur un échantillon moyen (cf matériels et méthodes).



Temps de prélèvement en jours

T17 T20 T23 T24 T25 T30 T34

Biomasse totale n=5 n=5 n=5 n=5 n=5 n=5 n=5

Biomasse algale n=5 n=5 n=5 n=5 n=5 n=5 n=5

Abondance bactérienne n=3 ND n=3 n=3 ND n=3 n=3

Diversité pigmentaire n=1 n=1 n=1 n=1 n=1 n=1 n=1

Diversité bactérienne n=1 ND ND n=1 ND n=1 n=1

Leu-aminopeptidase n=5 n=5 n=5 n=5 n=5 n=5 n=5

Bio

desc

ript

eurs

β-D-Glucosidase n=5 n=5 n=5 n=5 n=5 n=5 n=5

Tableau 20. Synthèse des analyses effectuées et du nombre de réplicats intra-canal (n).

Absence d'effluent Présence d'effluent

Dans cette partie, consacrée à la présentation des résultats de la campagne d'essai principale, nous aborderons successivement :

les caractéristiques physico-chimiques du milieu d'essai avant injection de l'effluent ;

les caractéristiques des communautés périphytiques avant l'injection de l'effluent ;

les réponses des communautés périphytiques suite à l'injection de l'effluent.

2.1 Caractéristiques physico-chimiques initiales du milieu d'essai Les caractéristiques physico-chimiques du milieu d'essai présentées ci-

dessous correspondent à la caractérisation de l'eau de la ville introduite dans les canaux (Tableau 21). Les analyses ont été effectuées sur des échantillons prélevés dans la colonne d'eau 24h après la mise en route des canaux. Ce temps correspond à la période fixée pour la déchloration de l'eau (cf Déroulement de l'essai).

pH Cond.

µS/cm CT

mg/L COT mg/L

Cl- mg/L

NO3-

mg/LNO2

-

mg/LNH4

+

mg/LPO4

3-

mg/LSO4

2-

mg/LCa2+

mg/LNa+ mg/L

Mg2+ mg/L

K+ mg/L

Si mg/L

7 470 40,90 <0,5 13,5 5,4 ND ND ND 33,5 80,3 11,2 5,2 1,4 4 Tableau 21. Caractéristiques physico-chimiques de l'eau du réseau introduite dans les canaux. Légende. ND : non détectable.



A l'issue de la durée attribuée à la déchloration de l'eau, le milieu est enrichi en nitrates (KNO3), en phosphates (KH2PO4) et en silice (SiO2Na2O.5H2O). Cet enrichissement correspond à un apport de 3 mg/L de nitrates, de 0,8 mg/L de phosphates et de 7 mg/L de silice. Les paramètres modifiés à l'issue de cet enrichissement sont présentés ci-dessous (Tableau 22).

pH Cond.

µS/cm NO3

-

mg/LNH4

+ mg/L

PO43-

mg/L Ca2+

mg/LNa+

mg/LK+

mg/LSi

mg/L8.7 560 21 0,1 0,60 68 24 11 6,5

Tableau 22. Modifications des caractéristiques physico-chimiques de l'eau du réseau introduite dans les canaux suite à son enrichissement en Si, N et P.

L'eau du milieu d'essai, c'est-à-dire l'eau du réseau introduite dans les canaux

déchlorée puis enrichie (N-NO3, P-PO4, Si), est alcaline et bien minéralisée (Tableau 22). Le milieu est riche en sels nutritifs, les teneurs en nitrates et phosphates correspondent à des milieux mésotrophes. En revanche, la teneur en carbone organique dissous est inférieure à 0,05 mg/L.

2.2 Caractéristiques physico-chimiques du milieu d'essai juste avant l'injection de l'effluent dans les canaux "tests" Les caractéristiques physico-chimiques de l'eau prélevée dans les quatre

canaux après 23 jours de colonisation, c'est-à-dire 23 jours d'essai, sont indiquées ci-après (Tableau 23). L'effluent est introduit dans les canaux "tests" juste après le prélèvement de ces échantillons.

Les teneurs en carbone organique dissous et en phosphates sont inférieures aux limites de détection des appareils de mesure (respectivement 0,5 mg/L et 0,1 mg/L). En début d'essai, la teneur en ions orthophosphates est pourtant de 0,6 mg/L (Tableau 22) et devient inférieure à la limite de détection dès le 17ème jour de colonisation (données non présentées). Par ailleurs, les analyses physico-chimiques du milieu d'essai mettent en évidence une baisse de la teneur en silice, en ammonium et en nitrates supérieure dans les canaux 2 et 3. Les teneurs initiales, juste après enrichissement, étaient de 6,6 mg/L de silice, 0,13 d'ammonium et 21 mg/L de nitrates.



T23 pH Cond. µS/cm

CT mg/L

Cl-

mg/LNO3

-

mg/LNO2

-

mg/L NH4

+

mg/L SO4

2-

mg/L Ca2+

mg/LMg2+

mg/L Na+

mg/L K+

mg/L Si mg/L

Canal 1 8.5 497 29.67 89.6 15.6 0.04 0.17 40.1 49.3 6.32 25.6 12.3 5.5

Canal 2 8.4 467 25.73 76.4 14.1 <0,01 0.15 39.4 52.4 6.13 25.5 12.3 2.9

Canal 3 8.4 460 25.66 85.5 13.9 <0,01 0.15 38.0 49.8 6.35 25.9 12.0 3.3

Canal 4 8.4 522 32.03 86.8 17.7 0.06 0.18 39.9 54.7 6.24 25.9 12.1 5.2

Tableau 23. Caractéristiques physico-chimiques de l'eau du milieu d'essai dans les canaux après 23 jours de colonisation (T23). Remarque : les teneurs en carbone organique dissous et en phosphates ont été dosées mais elles sont inférieures aux limites de détection des appareils de mesure (respectivement 0,5 mg/L et 0,1 µg/L).

En conclusion, les ions phosphates sont rapidement utilisés et/ou stockés par les micro-organismes. Par ailleurs, les teneurs en azote inorganique (N-NH4 et N-NO3), sensiblement plus faibles dans les canaux 2 et 3, suggèrent une consommation légèrement plus importante de ces éléments nutritifs par les micro-organismes et, indirectement, un taux de croissance du biofilm supérieur. Cette hypothèse est confirmée par la diminution de la teneur en silice, plus importante dans les canaux 2 et 3, pourrait traduire un développement des diatomées, algues siliceuses, supérieur dans ces canaux.

Enfin, une attention particulière peut être apportée à l'apparition de nitrites (NO2

-) dans les canaux 1 et 4. La présence de nitrites peut être expliquée par une perturbation des processus biologiques impliqués dans la transformation des composés azotés.

2.3 Caractérisation biologique des biofilms juste avant l'injection de l'effluent dans les canaux "tests"

Lors de cette campagne d'essai, l'inoculum a été introduit en une seule fois après l'enrichissement du milieu (N, P, Si). Il correspond à une concentration finale en chlorophylle-a dans chaque canal de 29 µg/L. Selon la classification des Agences de l'Eau (2000), les milieux considérés oligotrophes à mésotrophes se caractérisent par une teneur en chlorophylle-a brute des micro-organismes phytoplanctoniques allant de 10 à 60 µg/L.



2.3.1 Structure globale du biofilm avant injection de l'effluent

La structure globale du biofilm préalablement à l'injection de l'effluent, c'est-à-dire à l'issue d'une période de colonisation de 23 jours, est présentée ci-après (Tableau 24 ; Figure 27). Les biofilms sont caractérisés vis-à-vis de la biomasse totale (masse organique), de la biomasse algale (chlorophylle-a) et de la densité bactérienne (dénombrement DAPI). La teneur en phéopigments n'est pas systématiquement présentée car la mesure de ce paramètre a conduit à l'acquisition de plusieurs valeurs négatives que nous n'expliquons pas. Notons que dans le cadre des bio-essais, aucune valeur négative n'a été trouvée.

T23 IA Masse org.

mg/cm2 (n=5)

Chloro-a µg/cm2 (n=5)

Bactéries 109 cell/ cm2

(n=3)

Chloro-a µg/mgMO

(n=5)

Bactéries 109cell/mgMO

(n=3) Canal 1 312 ± 60 2.09 ± 0.16 6.93 ± 1.58 6.53 ± 0.60 3.32 ± 0.75 3.29 ± 0.50 Canal 2 105 ± 11 1.56 ± 0.05 14.93 ± 1.24 7.36 ± 0.59 9.56 ± 0.92 4.64 ± 0.49 Canal 3 95 ± 12 1.93 ± 0.23 20.61 ± 4.10 8.39 ± 2.01 10.64 ± 1.59 4.58 ± 1.42 Canal 4 217 ± 12 1.19 ± 0.22 5.50 ± 1.06 7.93 ± 0.48 4.61 ± 0.25 6.58 ± 1.75

Tableau 24. Structure globale du biofilm avant injection du polluant (T23) dans les quatre canaux. Légende. Masse org ou MO : masse organique ; chloro-a : chlorophylle-a ; cell : cellule ; n : nombre de réplicats intra-canal.

Le calcul de l'indice autotrophique met en évidence une dominance de la composante autotrophe dans les canaux 2 et 3. Dans les canaux 1 et 4, les composantes autotrophe et hétérotrophe du biofilm sont également représentées. Cette observation est cohérente avec la teneur en chlorophylle-a des biofilms des canaux 2 et 3 où elle est nettement supérieure à celle des canaux 1 et 4.

La masse organique des biofilms est comprise entre 1,12 à 2,09 mg/cm2, ce qui correspond à des valeurs courramment observées dans des milieux mésotrophes à eutrophes [BIGGS, 1996b]. La teneur en chlorophylle-a, comprise entre 5 et 20 µg/cm2, est également caractéristique de ce type de milieux [BIGGS, 1996b ; DODDS et al., 1998]. Enfin, la densité bactérienne, comprise en 6,5 et 8,3 x 109 cell/cm2, correspond aussi à des milieux mésotrophes à eutrophes [L.S.E, données internes].



Figure 27. Structure globale du biofilm avant injection du polluant (T23). Légende. MO : masse organique ; chloro-a : chlorophylle-a ; cell : cellule.

0

5

10

15

20

25

Canal 1 : AI = 312 Canal 2 : AI = 105 Canal 3 : AI = 95 Canal 4 : AI = 217

Chloro-a (µg/cm2)

Effectif bactérien (109 cell/cm2)

Chloro-a (µg/mgMO)

Effectif bactérien (109 cell/mgMO)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Masse organique (mg/cm2)

Les biofilms des canaux 1 et 3 se distinguent par une masse organique

comparable et significativement supérieure à celle des deux autres biofilms. Au cours de la discussion des résultats nous nous intéresserons au biofilm du

canal 1. Il se caractérise par la teneur en masse organique moyenne la plus élevée et, inversement, par les teneurs massiques en chlorophylle-a et en cellules bactériennes significativement les plus faibles au vu des intervalles de confiance.

2.3.2 Identification des diatomées avant injection de l'effluent

Dans la suspension périphytique utilisée pour l'ensemencement des canaux artificiels les espèces Diatoma ehrenbergii (71%), Achnanthes minutissima (11%) et Nitzschia palea (6%) représentent 89% des effectifs parmi les quinze taxons identifiés.

Dès la deuxième semaine de colonisation dans les canaux expérimentaux, l'identification taxonomique des diatomées périphytiques développées sur les substrats artificiels montre une dominance des espèces Achnanthes minutissima (AMIN) et Diatoma ehrenbergii (DEHR). Cette seconde espèce est toutefois nettement moins représentée (Tableau 25 ; Photo 22).



Compte tenu de la faible abondance relative des autres taxons, nous nous limitons volontairement à la présentation de la richesse spécifique (nombre d'espèces diatomiques identifiées), ainsi qu'aux données relatives aux deux espèces dominantes.

canal 1 canal 2 canal 3 canal 4 Durée de colonisation (jours) 17 23 17 23 17 23 17 23

Nombre d'espèces 10 7 8 5 9 2 11 3 % AMIN 82.50 96.79 96.06 98.26 93.77 98.50 96.31 95.26 % DEHR 10.00 1.98 1.48 0.99 2.99 1.50 0.98 4.49

Tableau 25. Achnanthes minutissima et Diatoma ehrenbergii avant injection

Photo 22. Espèce Achnanthes minutissima Observations des diatomées dans le canal témoin (à gauche) et dans le canal 1 (à doite) à T23 [Photos :L. LAINE, J.C. DRUART, 2003].

2.3.3 Diversité pigmentaire avant injection de l'effluent (HPLC)

Les analyses pigmentaires effectuées à l'issue d'une période de 23 jours de colonisation confirment un développement de la communauté algale supérieure dans les canaux 2 et 3. La teneur totale en pigments photosynthétiques dosés est respectivement de 20 µg/cm2 et 26 µg/cm2 dans les canaux 2 et 3 et de 9 µg/cm2 et 7 µg/cm2 dans les canaux 1 et 4.

Les concentrations en fucoxanthine et diadinoxanthine, pigments caractéristiques des diatomées et majoritairement représentés dans nos canaux, augmentent entre le 17ème et le 23ème jour de colonisation quel que soit le canal, ce qui suggère un développement continu des algues diatomiques. Inversement, les



concentrations en lutéine et chlorophylle-b, pigments caractéristiques des algues vertes, diminuent sauf dans le biofilm du canal 1 où elles restent globalement constantes et plus élevées que dans les trois autres canaux. La teneur en lutéine est de 2,2 mg/m2 dans le canal 1 et inférieure à 0,5 mg/m2 dans les trois autres canaux. Enfin, le dosage de la zéaxanthine met en évidence l'absence de cyanobactéries dans les biofilms des quatre canaux.

2.3.4 Composition de la communauté eubactérienne avant injection de l'effluent (DGGE)

L'homogénéité de la composition de la communauté eubactérienne dans les biofilms est estimée par le calcul de l'indice de similarité de Sorenson (Tableau 26). L'indice de Sorenson est égal à 1 lorsque la composition spécifique de deux communautés est identique ; il est égal à 0 lorsque la composition des deux communautés est strictement différente (cf Partie 1, chapitre 3).

Le calcul de l'indice de Sorenson permet de conclure à l'homogénéité de la composition de la communauté eubactérienne des biofilms colonisés dans les quatre canaux. Néanmoins, nous pouvons noter que les indices de similarité impliquant le biofilm du canal 1 sont légèrement inférieurs (0,75 à 0,85). L'exploitation du gel DGGE montre que ce biofilm comprend douze génotypes différents ; il se distingue des trois autres biofilms par l'absence de trois génotypes non représentés et, inversement, par la présence d'un génotype spécifique à ce biofilm.

Nous rappelons que nous associons un génotype, ou type de séquences, à une espèce eubactérienne et que l'analyse par PCR-DGGE se limite à la détection des espèces prépondérantes dans la communauté (cf Partie 1, chapitre 3).

T17 canal 1 canal 2 canal 3 canal 4 canal 1 1 0,85 0,75 0,80 canal 2 1 0,92 0,96 canal 3 1 0,96 canal 4 1

Tableau 26. Calcul de l'indice de Sorenson dans les quatre canaux avant injection de l'effluent.

2.3.5 Activités enzymatiques du biofilm avant injection

Les mesures d'activité des enzymes sont fréquemment exprimées en nombre de molécules de produit formé par heure et par unité de surface, notamment dans le cas d'un biofilm. Ces mesures constituent une indication de la capacité potentielle des biofilms à hydrolyser certains composés organiques.



Dans les paragraphes qui suivent, les résultats seront également présentés par unité de biomasse et par unité de cellule bactérienne ; dans ce dernier cas, le terme "d'activité spécifique" sera utilisé. L'utilisation de ces différents modes d'expression des résultats apporte parfois un éclairage sur la proportion de cellules vivantes et de cellules métaboliquement actives.

2.3.51 Activité de la leucine aminopeptidase

L'activité de la leucine aminopeptidase du biofilm développée dans le canal 1 est nettement supérieure à celle des biofilms colonisés dans les autres canaux qu'elle soit exprimée par unité de surface, de biomasse ou de cellules bactériennes (Tableau 27).

Le biofilm du canal 2 présente l'activité surfacique la plus faible mais son activité massique et spécifique est comparable à celle des biofilms des canaux 3 et 4. La capacité potentielle d'hydolyse du biofilm est, en conséquence, plus faible mais elle ne s'explique pas par une différence d'abondance bactérienne.

L'activité leucine aminopeptidase des biofilms des canaux 3 et 4 est comparable qu'elle soit exprimée par unité de surface, de biomasse ou de cellules bactériennes.

T23 Aminopeptidase

nmol/h/cm2 (n=5)

Aminopeptidase nmol/h/ mgMO

(n=5)

Aminopeptidase nmol/h/109 cell

(n=3)


(n=3) Canal 1 65,42 ± 5.23 31,37 ± 2.88 10,14 ± 1.76 6.53 ± 0.60 Canal 2 33,17 ± 3.33 21,16 ± 1.44 4,71 ± 0.85 7.36 ± 0.59 Canal 3 40,80 ± 1.15 21,37 ± 2.91 5,16 ± 1.48 8.39 ± 2.01 Canal 4 41,49 ± 7.79 24,91 ± 3.54 5,21 ± 1.49 7.93 ± 0.48

Tableau 27. Activité aminopeptidase avant injection du polluant (T23) dans les canaux expérimentaux. Légende. MO : masse organique ; cell : cellule ; n : nombre de réplicats intra-canal.

2.3.52 Activité de la β-D-glucosidase

L'activité de l'enzyme β-D-glucosidase (Tableau 28) est inférieure à celle de la leucine aminopeptidase. Bien que cette comparaison ne soit pas adaptée aux objectifs qui sont les nôtres, elle révèle néanmoins que la nature et la concentration des composés organiques (substrats potentiels) présents dans la matrice des biofilms sont plus adaptées à la stimulation de la synthèse et de l'activité de l'enzyme leucine aminopeptidase.



T23 Glucosidase nmol/h/cm2

(n=5)

Glucosidase nmol/h/mgMO

(n=5)

Glucosidase nmol/h/109 cell

(n=3)


(n=3) Canal 1 18.18 ± 1.95 8.72 ± 1.03 2.88 ± 0.60 6.53 ± 0.60 Canal 2 4.95 ± 0.49 3.17 ± 0.33 0.67 ± 0.05 7.36 ± 0.59 Canal 3 10.29 ± 1.36 5.34 ± 0.57 1.36 ± 0.60 8.39 ± 2.01 Canal 4 11.13 ± 2.87 9.21 ± 1.21 1.59 ± 0.44 7.93 ± 0.48 Tableau 28. Activité β-D-Glucosidase avant injection du polluant (T23) dans les canaux expérimentaux. Légende. MO : masse organique ; cell : cellule ; n : nombre de réplicats intra-canal.

Les tendances communes entre l'activité de la leucine aminopeptidase et l'activité de la β-D-glucosidase sont les suivantes :

le biofilm du canal 1 présente l'activité surfacique et spécifique la plus élevée.

l'activité surfacique et spécifique la plus faible est observée dans le canal 2.

En revanche, l’activité massique de la β-D-glucosidase est supérieure dans les canaux 1 et 4 où les biofilms se caractérisent par une composante hétérotrophe plus représentée (valeur de l'indice autotrophique), une épaisseur plus faible (observation visuelle) et un pourcentage de masse organique plus élevé. Dans ces biofilms, le pourcentage de masse organique est égal à 15% de la masse sèche totale alors qu'il est égal à 10% dans les biofilms des canaux 2 et 3.

2.4 Traitement des données avant injection de l'effluent

Sachant que nous travaillons sur un biofilm, le traitement des données biologiques se limite ici aux résultats exprimés par unité de surface. De même, cette partie ne traite pas des résultats relatifs à la composition de la communauté eubactérienne ; le nombre d'analyses préalable à l'injection de l'effluent (un seul prélèvement) ne justifie pas la nécessité d'une telle approche. Aussi, l'interprétation de ces données par le coefficient de similarité de Sorenson nous semble suffisante.

Comme nous l'avons exposé au cours du premier point de ce chapitre, les données sont initialement traitées par des analyses multivariées (ACP), ceci afin d'observer les ressemblances et oppositions entre les biofilms des quatre canaux vis-à-vis de l'ensemble des biodescripteurs. Ces analyses permettent également la visualisation des corrélations et anti-corrélations entre les variables biologiques. Enfin, un traitement statistique (ANOVA) sera appliqué afin de quantifier les effets observés



et de se prononcer sur leur significativité. Nous ferons de même pour l'analyse des corrélations entre variables (coefficient de Pearson).

2.4.1 Traitement graphique des données avant injection de l'effluent

2.4.11 Analyse en composantes principales des données biologiques

Une analyse en composantes principales (ACP) est réalisée sur l'ensemble des biodescripteurs : la masse organique, la chlorophylle-a, l'effectif bactérien, ainsi que les activités de la leucine aminopeptidase et de la β-D-glucosidase. Les données sont issues des mesures effectuées le 17ème jour et 23ème jours de colonisation des biofilms dans les canaux artificiels. Nous nous intéresserons successivement à la typologie des variables biologiques et à la typologie des individus, ce qui nous permettra d'interpréter les axes factoriels (F1, F2...) et de conclure. Les variables biologiques correspondent aux biodescripteurs mesurés et énoncés ci-dessus. Quant aux individus ils désignent les échantillons analysés et se caractérisent chacun par le couple "canal/temps" noté "C(1 à 4) Tx" ; Tx étant le temps de colonisation, ou la durée d'essai, exprimé en jour.

L'interprétation de l'analyse en composantes principales se limite à l'étude du plan factoriel engendré par les deux premiers facteurs F1 (66%) et F2 (21%) dont le pourcentage d'inertie cumulé permet d'expliquer 87% de la variance totale (Figure 28).

La typologie des variables révèle que toutes les variables étudiées ont des coordonnées positives sur F1 (cf cercle de corrélation). ESCOFFIER et PAGES (1998) définissent cette tendance comme un effet "taille" : certains individus possèdent des valeurs fortes pour l'ensemble des variables alors que d'autres possèdent des valeurs faibles pour l'ensemble des variables.

Par ailleurs, la typologie des variables semble suggérer une opposition, par rapport au second facteur (F2), entre les variables de structure (chlorophylle-a, masse organique, effectif bactérien) d'une part, et les variables relatives aux activités enzymatiques (Leu-aminopeptidase et β-D-glucosidase) d'autre part. Cependant, la variable "biomasse" est seulement définie à 1% par l'axe F2 et la variable "effectif bactérien" est principalement définie par F1 et F3. En conséquence, vis-à-vis de l'axe F2, il est plus juste de retenir uniquement l'opposition entre la variable de structure "chlorophylle-a" et les variables d'activités enzymatiques (aminopeptidase et glucosidase).

La typologie des individus montre une séparation selon le temps par rapport à l'axe F1, ce qui traduit une croissance globale des biofilms quel que soit le canal considéré. Quant à l'axe F2, il conduit à la distinction des canaux 1 et 4, d'une part, et des canaux 2 et 3 d'autre part.



Interprétation de l'axe F1. Les points C4T17 et C1T23 s'opposent par rapport à cet axe. Par ailleurs, ils contribuent le plus fortement à sa définition (54%) et possèdent les coordonnées les plus fortes sur cet axe. A l'exception de la teneur en chlorophylle-a, après 17 jours de colonisation (T17) le biofilm du canal 4 présente les plus faibles valeur de masse organique, d'effectif bactérien et d'activités enzymatiques. Inversement, les valeurs les plus élevées sont observées après 23 jours de colonisation (T23) dans le canal 1. Ces deux points reflètent parfaitement l'effet de "taille" précédemment évoqué. En conséquence, l'axe F1 peut être interprété comme l'axe du développement et de l'activité de la communauté hétérotrophe.

Interprétation de l'axe F2. Les points C1T17 et C3T23 ont les coordonnées les plus fortes sur F2 et s'opposent sur cet axe. Ils sont respectivement définis à 44% et 56% par F2 qui, au vu du cercle de corrélation peut être interprété comme l'axe de la croissance de la communauté algale.

a. Projection des individus sur F1F2 (85% de l'inertie totale).


Figure 28. Analyse en composantes principales des données biologiques avant injection de l'effluent. Légende : β-Gluc : β-D-Glucosidase ; Leu-amp : Leucine aminopeptidase ; Chloro-a : chlorophylle-a ; MO : masse organique ;Eff. bactérien : effectif bactérien ; Tx : xè jour d'essai.

En conclusion, cette analyse met en évidence une croissance des biofilms quel

que soit le canal, de T17 à T23 ; celle-ci est mise en évidence par les flèches pour

Chloro-a

MO

Leu-ampβ-Gluc

Eff. bactérien-1

1-1 1

Chloro-a

MO

Leu-ampβ-Gluc

Eff. bactérien-1

1-1 1-1

1-1 1

C1T17

C2T17 C3T17

C4T17

C1T23

C2T23

C3T23

C4T23

-1.8

2.2-3 3.6 F2

F1

C1T17

C2T17 C3T17

C4T17

C1T23

C2T23

C3T23

C4T23

-1.8

2.2-3 3.6

C1T17

C2T17 C3T17

C4T17

C1T23

C2T23

C3T23

C4T23

-1.8

2.2-3 3.6

-1.8

2.2-3 3.6 F2

F1



illustrer l'évolution des individus le long de l'axe F1, axe préalablement interprété comme un axe de croissance globale.

Enfin, la répartition des individus le long de l'axe F2, axe interprété comme un axe de la croissance algale, traduit une divergence entre les canaux 1 et 4 d'une part (coordonnées négatives), et les canaux 2 et 3 d'autre part (coordonnées positives). La teneur en chlorophylle-a est plus élevée dans ce second groupe. Ce résultat confirme les observations précédemment émises (indice autotrophique).

2.4.12 Variabilité inter-canal vis-à-vis de chaque biodescripteur

La variabilité inter-systèmes est estimée pour chaque variable par le calcul du coefficient de variation exprimé en pourcentage ; cette approche est classique [CAQUET et al., 2001]. Le calcul des coefficients de variation ne se limite pas aux variables exprimées par unité de surface, ceci afin de voir si des tendances nettes se dégagent en fonction du mode d'expression des données.

A l'exception des variables impliquant l'effectif bactérien, où nous nous sommes limités à la caractérisation de trois réplicats, les coefficients de variations sont calculés à partir des cinq réplicats prélevés et analysés dans chaque canal. La formule appliquée est la suivante : (moyenne tous canaux confondus/écart type tous canaux confondus)*100. Notons que ce mode de calcul porte sur la variabilité totale, c'est-à-dire intra- et inter-canal. Néanmoins, la variabilité intra-canal étant faible, la variabilité totale est essentiellement expliquée par la variabilité inter-canal.

Les résultats tendent à montrer une diminution de la variabilité inter-canal dans le temps pour l'ensemble des variables (Figure 29; Figure 30 ; Figure 31).

Figure 29. CV (%) inter canal à T17. Figure 30. CV (%) inter canal à T20. a b c d e f g h i j k

0

20

40

60

80

100

120

CV

(%)

a b c d e g h0

20

40

60

80

100

120

CV

(%)



Figure 31. CV (%) inter canal à T23.

Légende des graphes en boîtes (25-75%) : a- Chlorophylle-a en µg/cm2 b Chlorophylle-a en µg/g masse organique c- Masse organique (MO) en mg/cm2 d- Aminopeptidase en nmol/h/cm2 e- Aminopeptidase en nmol/h/mg de MO f- Aminopeptidase en nmol/h/109 cellules bact.g- Glucosidase en en nmol/h/cm2 h- Glucosidase en en nmol/h/ mg de MO i- Glucosidase en en nmol/h/109 cellules bact. j- Effectif bactérien en nb de cellules/cm2 k- Effectif bactérien en nb de cellules/mgMO

▪ Valeur médiane %75-%25 ٱ* Valeur extrême

a b c d e f g h i j k0

20

40

60

80

100

120

CV

(%)

2.4.2 Traitement statistique des données biologiques avant injection de l'effluent : ANOVA

Des analyses de variance sont effectuées sur les variables biologiques afin de déterminer si les communautés périphytiques développées dans les quatre canaux expérimentaux sont significativement différentes. Le cas échéant, le test de Bonferroni est appliqué pour une comparaison des moyennes deux à deux. Ces comparaisons sont effectuées entre les biofilms "tests" développés dans les canaux destinés à recevoir l'effluent (canaux 1, 2 et 3) et celui développé dans le canal témoin (Tableau 29).

Il apparaît que les différences entre les canaux "tests" et le canal "témoin" tendent clairement à diminuer dans le temps, si l'on considère le nombre d'effets significatifs entre les temps de prélèvement T17 et T23. Cette conclusion confirme celle précédemment avancée à l'issue du calcul des coefficients de variation.

Le jour de l'injection de l'effluent, c'est-à-dire le 23ème jour d'essai (T23), la différence entre les quatre canaux est non significative vis-à-vis de l'abondance bactérienne exprimée par unité de surface ou par unité de biomasse (p > 0,05). Il en est de même pour l'activité leucine aminopeptidase exprimée par unité de cellule bactérienne (Tableau 29). Les analyses de variance (ANOVA-1) effectuées sur les autres paramètres montrent que les différences entre les quatre canaux sont significatives (p < 0,05).



Prélèvement T17 Prélèvement T20 Prélèvement T23

Variables n C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 Chloro-a (µg/cm2) 5 S** S** S** S** S** S** NS S* S**

Chloro-a (µg/mgMO) 5 NS S** S** S* S** S** S* S** S** MO (mg/cm2) 5 S** S** S** S** S** S** S* NS S* Leu-amp (nmol/h/cm2) 5 S** S** S** S** NS S** S* NS NS Leu-amp (nmol/h/mgMO) 5 S* NS S* S** S** NS NS S* S* Leu-amp (nmol/h/cell.) 3 S** S** S** - - - NS NS NS β-Gluc (nmol/h/cm2) 5 S** NS S** S** S** NS NS S* NS

β-Gluc (nmol/h/mgMO) 5 S* NS NS S** S** NS NS S** S**

β-Gluc (nmol/h/cell.) 3 S** S** S** - - - NS S* NS Eff. bactérien (cell./cm2) 3 S* NS NS - - - NS NS NS Eff. bactérien (cell./mgMO) 3 S** S** S** - - - NS NS NS

Tableau 29. Quantificationde la différence entre les canaux "test" et le canal témoin C4 (ANOVA-1 & test de Bonferroni). Légende : β-Gluc : β-D-Glucosidase ; Leu-amp : Leucine aminopeptidase ; Chloro-a ; Chlorophylle-a ; cell. : cellule ; MO : masse organique ; n: nombre de réplicats ; Tx : xè jour d'essai : (-) variable non mesurée ; NS : non significatif ; S : significatif : * : p < 0,05 ; ** : p < 0,001 (Bonferroni).

En conclusion, compte tenu de cette variabilité inter-canal avant l'injection de l'effluent, l'effet de la concentration en effluent ne peut pas être déterminé par comparaison des canaux "tests" au canal témoin.

Pour répondre à ce problème, nous nous sommes inspirés de l'approche retenue par certains auteurs dont l'étude consiste à suivre en milieu lotique l'évolution d'une activité enzymatique suivant un gradient longitudinal (amont-aval). Les résultats d'activités enzymatiques sont alors exprimés sous la forme d'un taux d'évolution spatiale [AINSWORTH et GOULDER, 1998 ; AINSWORTH et GOULDER, 2000a]. Dans notre cas, l'évolution suivie est une évolution temporelle. Ainsi, il nous semble pertinent de travailler à partir d'un taux d'évolution temporelle. Pour chaque variable, celui-ci est défini comme le ratio entre la valeur au temps "Tx" et la valeur au temps "T23" qui détermine la situation de référence avant injection de l'effluent. Des analyses de variance sont effectuées sur ces données transformées afin de quantifier les tendances préalablement observées au moyen des analyses multivariées.



2.5 Réponses des communautés périphytiques exposées à différentes concentrations en effluent L'effluent est introduit dans les canaux 1, 2 et 3, définis comme les canaux

"tests", à raison d'une concentration volumique finale de 50, 25 et 10% d'effluent. Le canal 4 est conservé comme canal témoin. Cette opération est effectuée juste après la série de prélèvements effectuée le 23ème jour d'essai (T23), qui, nous venons de le voir, peut être considéré comme le jour de "référence". La réponse des communautés périphytiques soumises à ces différentes concentrations en effluent est évaluée après 1, 2, 7 et 11 jours d'exposition, ce qui correspond aux 24, 25, 30 et 34ème jours d'essai (T24, T25, T30 et T34).

Au cours de cette partie, consacrée à l'évaluation de l'effet de différentes concentrations en effluent sur les comunautés périphytiques développées dans les canaux artificiels, le traitement des données suit la même progression que celle précédemment adoptée pour la présentation des résultats précédant l'injection de l'effluent. Aussi, procèderons-nous à des analyses multivariées pour une représentation graphique des résultats tenant compte de l'ensemble des variables puis à un traitement statistique des données exprimées en taux d'évolution (ratio Tx/T23).

2.5.1 Evolution de la structure globale des communautés périphytiques

Suite à l'injection de l'effluent, l'indice autotrophique moyen du biofilm développé dans le canal 1 (50% d'effluent) évolue de 300 à 400 et l'indice autotrophique moyen du biofilm développé dans le canal 3 (10% d'effluent) varie de 101 à 72 (Figure 32).

Bien qu'on ne puisse l'affirmer avec rigueur, à ce stade de nos réflexions, il convient de supposer que la composante hétérotrophe du biofilm du canal 1, exposé à 50% d'effluent, se développe au détriment de la composante autotrophe et tend à dominer (IA ≥ 400). Par ailleurs l'évolution de la composante autotrophe du biofilm du canal 3, exposé à 10% d'effluent, se développe au détriment de la communauté hétérotrophe et tend à dominer (IA ≤ 100).



Figure 32. Evolution de l'indice autotrophique.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

17 20 23 24 25 30 34Durée d'essai (jours)

canal 1 (50%) canal 2 (25%) canal 3 (10%) canal 4 (témoin)

Indi

ce A

utot

roph

ique

(AI)

Effluent

2.5.2 Evolution de la composition des communautés de diatomées

L'identification des diatomées montre que l'espèce Achnanthes minutissima reste majoritairement représentée quel que soit le canal considéré bien que son développement semble affecté par la présence de l'effluent. D'une part, l'abondance relative de cette espèce augmente uniquement dans le canal témoin et, d'autre part, elle diminue lorsque la concentration en effluent augmente (Tableau 30).

Dans le canal 1 (50% d'effluent), la richesse spécifique du biofilm chute de 7 à 3 et ne s'accompagne pas du développement d'une espèce en quantité suffisante pour qu'elle soit prise en compte dans l'analyse taxonomique. En d'autres termes, l'évolution de la richesse spécifique est uniquement due à une disparition d'espèces. Dans ce même canal, l'abondance relative de l'espèce Diatoma ehrenbergii (DEHR) augmente et, inversement, l'abondance relative de l'espèce Achnanthes minutissima (AMIN) diminue. Bien que ces variations soient faibles (5%) les modifications physico-chimiques du milieu favorisent probablement le développement de l'espèce Diatoma ehrenbergii au détriment de l'espèce Achnanthes minutissima.

Dans le canal 3 (10% d'effluent) et le canal témoin l'évolution temporelle de la composition des communautés diatomiques des biofilms se caractérise par le développement des espèces Cymbella minuta et Diatoma vulgaris. L'abondance relative de ces espèces est cependant très faible (< 1%).



Dans le canal 2 (25% d'effluent), la richesse spécifique diatomique du biofilm augmente de 5 à 9 et ne s'accompagne pas de la disparition d'espèces initialement identifiées et prises en compte.

T23 T34 canal 1 canal 2 canal 3 canal 4

7 3 5 9 2 4 3 4 Nombre d'espèces 96,79 92,00 98,26 97,30 98,50 98,25 95,26 98,00 % AMIN

1,98 7,50 0,99 0,98 1,50 1,00 4,49 1,00 % DEHR

Tableau 30. Achnanthes minutissima et Diatoma ehrenbergii avant injection (T23) et après 11j d'exposition (T34).

2.5.3 Evolution de la diversité pigmentaire

Parmi les indices de diversité, l'indice de Shannon (H') et l'indice de Simpson (D) sont les plus fréquemment utilisés pour rendre compte de la structure des communautés. Le calcul de ces indices nécessite la connaissance de la richesse spécifique et de l'abondance des espèces représentées. Dans le cas de l'analyse pigmentaire, l'abondance ne se traduit pas par un effectif mais par la concentration en un pigment donné. L'indice de Shannon donne plus d'importance au nombre de pigments et à l'équité de leur distribution alors que l'indice de Simpson donne plus d'importance aux concentrations les plus élevées.

H’ = – ∑

i=1

i=n p i

ln p i

D = ∑ i=1

i=n pi

2

pi= ni/N avec N la concentration pigmentaire totale et ni la concentration du pigment i

Dans le cadre de cette étude, les pigments analysés étant présents dans tous

les biofilms, l'indice de Simpson nous semble plus adapté à l'étude de nos résultats (Figure 33).

Les résultats montrent une dominance pigmentaire dans les biofilms exposés à 10 et 25% d'effluent. L'analyse pigmentaire montre qu'il s'agit d'une augmentation de la concentration en fucoxanthine, pigment caractéristique des diatomées.



Dans le cas des biofilms du canal témoin et du canal exposé à la plus forte concentration en effluent (50%), l'étude de l'évolution de l'indice de Simpson couplée à celle de l'évolution de la concentration pigmentaire totale (données non présentées) suggère :

une stabilité de la communauté algale du biofilm témoin : augmentation de la concentration pigmentaire totale et stabilité de l'indice de Simpson.

un arrêt de la croissance du biofilm exposé à 50% d'effluent : stabilité de la concentration pigmentaire totale et de l'indice de Simpson.

Ces résultats confirment l'hypothèse d'un effet inhibiteur de la concentration en effluent lorsque celui-ci est présent à 50%. Par ailleurs, l'augmentation de la teneur totale en pigments du biofilm exposé à 10% d'effluent dans le canal 3 (26 µg/cm2 à 61 µg/cm2) tend à confirmer un effet stimulant de l'effluent à cette concentration sur le développement de la communauté algale.

Figure 33. Evolution de l'indice de Simpson en fonction de la durée d'essai en jours.

0.2

0.3

0.3

0.4

0.4

0.5

0.5

0.6

0.6

T17 T20 T23 T24 T25 T30 T34Durée d'essaiD canal 1 (50%) D canal 2 (25%) D canal 3 (25%) D canal 4 (témoin)

Indi

ce d

e S

imps

on

Effluent

2.5.4 Evolution de la composition des communautés eubactériennes

2.5.41 Effet de l'effluent sur la richesse spécifique

La richesse spécifique de la communauté eubactérienne est estimée par le nombre de bandes DGGE (nombre de génotypes). Celle-ci diminue dans les canaux



contenant l'effluent alors qu'elle reste stable au cours du temps dans le biofilm témoin (Figure 34).

La représentation simultanée de l'effectif bactérien total (DAPI) et de la richesse spécifique eubactérienne montre que, dans les canaux contenant de l'effluent, la richesse spécifique diminue alors que l'effectif bactérien augmente. Aussi, pouvons-nous supposer que certaines espèces parviennent à s'adapter et se développent au détriment des espèces les plus sensibles à la présence de l'effluent. Toutefois, cette approche ne permet pas de dire si les espèces se développant en présence de l'effluent étaient initialement présentes ou non. Par "initialement présentes" il faut comprendre "initialement détectée". Pour cela, l'analyse de la composition spécifique est nécessaire et fait l'objet du paragraphe suivant.

0.0E+00

5.0E+09

1.0E+10

1.5E+10

2.0E+10

17 23 24 30 340

5

10

15

canal 1 (50%) - abondancecanal 1 (50%) - richesse spécifique

0.0E+00

5.0E+09

1.0E+10

1.5E+10

2.0E+10

17 23 24 30 340

5

10

15


0.0E+00

5.0E+09

1.0E+10

1.5E+10

2.0E+10

17 23 24 30 340

5

10

15


0.0E+00

5.0E+09

1.0E+10

1.5E+10

2.0E+10

17 23 24 30 340

5

10

15

canal 4 (témoin) - abondancecanal 4 (témoin) - richesse spécifique

Figure 34. Évolution du nombre d'espèces et de l'effectif bactérien (nombre de cellules/cm2). Légende : l'effectif bactérien est représenté sur l'axe principal (gauche)et le nombre d'espèces sur l'axe secondaire (droite).

2.5.42 Effet de l'effluent sur la composition spécifique

L'analyse des gels DGGE suite à l'exposition à l'effluent montre que le nombre de bandes initialement représentées diminue d'autant plus fortement que la concentration en effluent est élevée. En revanche, dans le biofilm témoin, aucune disparition d'espèces n'est constatée (Figure 35).



Figure 35. Evolution des bandes détectées : persistance et apparition.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Canal 1 (50%) Canal 2 (25%) Canal 3 (10%) Canal 4 (témoin)

Nb de bandes à T17 Nb de bandes à T34 Nb de bandes apparues entre T24 et T34

Nom

bre

de b

ande

s D

GG

E

La ressemblance des canaux du point de vue de la composition spécifique est à présent examinée au moyen de l'indice de Sorenson. Nous rappelons que celui-ci est égal à 1 lorsque la composition spécifique des communautés comparées deux à deux est identique. Cet indice est calculé entre chaque canal "test" et le canal témoin (Tableau 31).

Canal 1 (50%) Canal 2 (25%) Canal 3 (10%)T24 0,92 0,80 0,80 T30 0,63 0,56 0,82 T34 0,53 0,60 0,70

Tableau 31. Calcul de l'indice de Sorenson entre les canaux "test" et le canal témoin.

Le calcul de l'indice de Sorenson montre que la ressemblance entre les canaux "tests" et le canal témoin diminue dans le temps après injection de l'effluent. Par ailleurs, la composition spécifique des communautés change d'autant plus que la concentration en effluent est forte.



2.6 Traitement des données après l'injection de l'effluent

2.6.1 Traitement graphique des données après l'injection de l'effluent

Dans un premier temps, nous intéresserons au traitement des données biologiques relatives à la masse organique, l'effectif bactérien, la teneur en chlorophylle-a et aux activités enzymatiques ; il s'agit de variables continues. Enfin, dans un second temps, nous nous concentrerons sur le traitement des données biologiques relatives à composition et à la structure des communautés eubactériennes.

2.6.11 Traitement des variables biologiques continues

Une analyse en composantes principales (ACP) centrée et normée est réalisée sur les variables biologiques continues. Une analyse de co-inertie ACP/ACP est ensuite réalisée pour effectuer un couplage de ces variables biologiques avec les variables physico-chimiques de l'eau des canaux. L'objectif est d'évaluer si l'évolution des variables biologiques peut être expliquée par l'évolution des variables physico-chimiques.

2.6.111 ACP : traitement des données biologiques

L'analyse en composantes principales des données biologiques continues se limite à l'étude du plan engendré par les deux premiers facteurs de l'analyse (Figure 36). D'une part, le diagramme des valeurs propres associées à ces composantes principales montre une forte décroissance entre la deuxième et la troisième valeur, ce qui justifie le fait de ne retenir que les deux premiers facteurs. D'autre part, le pourcentage d'inertie cumulée par ces deux facteurs permet d'expliquer 75% de la variance totale et ce pourcentage est largement acceptable sur un total de cinq facteurs.

La typologie des variables montre qu'elles ont toutes des coordonnées négatives sur l'axe F1, ce qui traduit un effet "taille" : certains individus ont des valeurs fortes pour l'ensemble des variables alors que d'autres ont des valeurs faibles pour l'ensemble des variables. A ce titre, l'axe F1 pourrait être interprété comme l'axe de développement du biofilm. La contribution des variables à la définition des axes F1 et F2, ainsi que leurs coordonnées sur ces axes montrent que les variables "leu-aminopeptidase" et "effectif bactérien" sont fortement corrélées à F1. La variable "β-glucosidase" est, quant à elle, davantage liée à F2.

Enfin, l'axe F2 semble opposer les variables de structure "chlorophylle-a" et "matière organique", qui ont des coordonnées négatives sur cet axe, aux activités "Leu-



aminopeptidase" et "β-glucosidase" qui ont des coordonnées positives sur cet axe. Bien qu'il soit fort tentant de conclure à une anti-corrélation entre ces deux types de variables (structure/activité), l'étude de leurs coordonnées sur F1 et F2 montre qu'une telle conclusion serait abusive. En effet, les variables "chlorophylle-a" et "matière organique" sont autant liées à l'axe F1 qu'à l'axe F2 et ne caractérisent, en conséquence, aucun axe en particulier. Nous pouvons cependant observer que l'angle formé par les vecteurs représentant les variables "masse organique" et "chlorophylle-a" sur le cercle de corrélation suggère une corrélation positive entre ces deux variables. Une analyse statistique sera effectuée ultérieurement afin de vérifier la significativité de cette observation (coefficient de Pearson).

La typologie des individus montre que l'allure générale des courbes liant chaque canal en fonction de son évolution temporelle est similaire pour les quatre canaux. Si cette observation laisse supposer que les quatre canaux ont une évolution comparable, il est en revanche intéressant de noter que la dispersion des points selon les axes F1 et F2 diffère selon les canaux. La dispersion des individus représentant les canaux 4 (témoin) et 3 (10% d'effleunt) est supérieure le long de l'axe F1, précédemment défini comme étant un axe de "développement". Par ailleurs, la présence de l'effluent, quelle que soit sa concentration, entraîne une partition des canaux selon F2, axe lié à la variable β-glucosidase. D'une part, le canal témoin est le seul canal pour lequel tous les individus ont des coordonnées positives sur F2. D'autre part, la veille de l'injection de l'effluent (T23), tous les individus ont également des coordonnées positives sur cet axe.

Enfin, la représentation des trois réplicats sur le plan factoriel F1F2 montre une variabilité des réplicats supérieure dans le cas des canaux 3 (10%) et 4 (témoin).

En conclusion, cette analyse montre une partition des individus (couple "canal/temps") en fonction de la présence/absence de l'effluent selon F2, c'est-à-dire en fonction de la variable "β-glucosidase" : la présence de l'effluent entraîne une diminution de l'activité β-D glucosidase. Une distinction des canaux est également visible en fonction de la concentration en effluent selon l'axe F1 : la dispersion des individus le long de cet axe suggère un développement global des biofilms (structure et activités) supérieur dans le canal 4 (témoin) et, plus particulièrement, dans le canal 3 contenant 10% d'effluent. En conséquence, les variables biologiques étudiées permettent une discrimination des canaux en fonction de leur traitement. Enfin, la dispersion des réplicats intra-canal est inférieure dans le cas des biofilms exposés à 25% et 50% d'effluent : la croissance des biofilms augmente la dispersion des résultats. Selon notre point de vue, ce constat reflète les difficultés techniques d'échantillonnage des biofilms les plus denses et non l'hétérogénéité spatiale de la colonisation intra-canal. En effet, au cours du temps, les biofilms forment un tapis uniforme au sein duquel le prélèvement des substrats colonisés est plus complexe.



a. Projection des individus sur le plan F1F2.

b. Cercle des corrélations entre variables.

T23

T24

T30

T34

T23

T24

T30

T34

T23

T24

T30

T34

T23

T24

T30

T34-2.5

2.7-4.5 2.5

C4 : Témoin C3 : 10% C2 : 25% C1 : 50%

F1-F2 (75.18%)

F1

F2T23

T24

T30

T34

T23

T24

T30

T34

T23

T24

T30

T34

T23

T24

T30

T34-2.5

2.7-4.5 2.5

C4 : Témoin C3 : 10%

F1-F2 (75.18%)

F1

F2

C2 : 25% C1 : 50%

c. Graphe des valeurs propres.

Eff. bactérien

Leu-amp.

β-Gluc.

MOChloro-a

-1

1-1 1

F1

F2

Eff. bactérien

Leu-amp.

β-Gluc.

MOChloro-a

-1

1-1 1

F1

F2

Eff. bactérien

Leu-amp.

β-Gluc.

MOChloro-a

-1

1-1 1

-1

1-1 1

F1

F2 45.49 %

29.69 %

12.97 %9.18 %

2.67 %

45.49 %

29.69 %

12.97 %9.18 %

2.67 %

Figure 36. Analyse en composantes principales des données biologiques. Légende : β-Gluc : β-D-Glucosidase ; Leu-amp : Leucine aminopeptidase ; Chloro-a : chlorophylle-a ; MO : masse organique ; Eff. bactérien : effectif bactérien ; Tx : xè jour d'essai.



2.6.112 ACP : traitement des données physico-chimiques

L'analyse en composantes principales des données physico-chimiques se limite à l'étude du plan engendré par les deux premiers facteurs de l'analyse dont le pourcentage d'inertie cumulée permet d'expliquer 95,62% de la variance totale.

La typologie des variables révèle une opposition très nette selon l'axe F1 entre les variables caractéristiques de l'effluent (chlorures, ammonium, calcium, potassium, sodium et conductivité) et les variables "nitrates", "magnésium" et"pH". La contribution de ces variables à la définition de F1, ainsi que leurs coordonnées sur cet axe montrent qu'elles sont fortement corrélées à F1. Les variables "carbone total", et, plus particulièrement, "silice" sont, quant à elles, davantage liées à F2.

La typologie des individus révèle une ordination des canaux à partir du 24ème jour de colonisation (T24), le lendemain de l'injection de l'effluent, selon l'axe F1 en fonction de la concentration en effluent. Par ailleurs, l'évolution temporelle des caractéristiques physico-chimiques montre une évolution de l'ensemble des canaux selon F2, ce qui traduit une baisse de la teneur la silice et en carbone total, notamment dans le canal 3 contenant 10% d'effluent. L'évolution de la teneur en silice, favorable au développement des diatomées, suggère un développement de ces organismes supérieur dans le canal 3.

En conclusion, cette analyse montre que la présence de l'effluent n'empêche pas le développement de la communauté algale diatomique (consommation de la silice). Par ailleurs, la diminution de la teneur en silice, notamment dans le canal contenant 10% d'effluent, nous conduit à nous interroger sur une éventuelle carence en silice. En fin d'essai, la concentration en silice est comprise entre 1 et 3 mgSi/L (Tableau 32). Selon BRÉMOND et PERRODON (1979), la teneur en silice nécessaire au développement des diatomées est de 5 mg SiO2/L, soit 0,24 mgSi/L. Au vu de ces valeurs, même en fin d'essai, la teneur en silice dans nos canaux serait suffisante.

mg/L NO3

- NH4+ Si Ca Na Mg K

T23 15,6 0,17 5,5 49,3 25,6 6,3 12,3 Canal 1 T34 7,4 10,8 3,5 3478 4216 4,2 94,5 T23 14,1 0,15 2,87 52,4 25,5 6,1 12,3 Canal 2 T34 7,7 7,2 1,5 2382 2860 4,8 68,8 T23 13,9 0,15 3,27 49,8 25,9 6,3 12,0 Canal 3 T34 11,0 0,77 0,97 883 1158 6,4 33,3 T23 17,7 0,18 5,2 54,7 25,9 6,2 12,1 Canal 4 T34 10,9 0,20 2,5 51,1 33,9 5,8 9,9

Tableau 32. Evolution des éléments nutritifs entre T23 et T34.



a. Projection des individus sur F1F2.

b. Cercle des corrélations

c. Graphe des valeurs propres.

Figure 37. Analyse en composantes principales des données physico-chimiques. (1) : caractéristiques de l'effluent

0

8.80 12

79.72%

15.91%

0

8.80 12

0

8.80 12

79.72%

15.91%

1

pH

Conduct.

Cl-NO3-Ca

Mg

NaK

Si

NH4

CT-1

-1 1

(1)

1

pH

Conduct.

Cl-NO3-Ca

Mg

NaK

Si

NH4

CT-1

-1 1

(1)

T23T23

T24

T24

T24

T23 T24

T23

T30

T30

T30

T30

T34

T34

T34

T34

-2.9

2.1-4.6 3.7

C4 : Témoin

C3 : 10%

C2 : 25%

C1 : 50%

F2

F1

Augmentation de la concentration en effluent

T23T23

T24

T24

T24

T23 T24

T23

T30

T30

T30

T30

T34

T34

T34

T34

-2.9

2.1-4.6 3.7

-2.9

2.1-4.6 3.7

C4 : Témoin

C3 : 10%

C1 : 50%

C2 : 25%

F2

F1

Augmentation de la concentration en effluent



2.6.113 Co-inertie: couplage des données biologiques et physico-chimiques

Ce type d'approche vise à mettre en relation l'information contenue dans deux ou plusieurs tableaux [DOLEDEC et CHESSEL, 1994 ; CHESSEL et HANAFI, 1996 ; CHESSEL et al., 2003].

Dans le cas présent, qui est la situation la plus courante, il s'agit d'étudier le lien qui existe entre les données décrivant les individus (couple "canal/temps") vis-à-vis des caractéristiques biologiques du biofilm et les données décrivant ces mêmes individus vis-à-vis des caractéristiques physico-chimiques du milieu d'essai. L'objectif est de voir si l'évolution des variables biologiques peut être expliquée par l'évolution des variables physico-chimiques.

Préalablement à l'analyse de co-inertie, l'existence d'une co-structure significative entre les deux tableaux (biologie/physico-chimie) est vérifiée par application du test de permutation de Monte-Carlo où les lignes des deux tableaux sont permutées simultanément. Mille permutations aléatoires sont effectuées et montrent l'existence d'une co-structure significative (p<0,05). Enfin, les résultats de la co-inertie sont étudiés par la représentation simultanée sur un plan factoriel des individus (couples "canal/temps") positionnés vis-à-vis des données biologiques d'une part, et des données physico-chimiques d'autre part (

Figure 38). Une flèche relie les deux positions. Le début de la flèche correspond à l'ordination des individus selon les données biologiques et la fin de la flèche à l'ordination des individus selon les données physico-chimiques. A titre d'exemple, dans le cas du canal témoin C4, il apparaît qu'aux temps de prélèvements T30 et T34, la composition physico-chimique du milieu est proche alors que les biofilms diffèrent fortement vis-à-vis des variables biologiques étudiées.

L'analyse de co-inertie met en évidence une opposition selon l'axe F1 des quatre canaux avant l'injection de l'effluent (T23) et du canal témoin d'une part, et des canaux contenant 25% et 50% d'effluent d'autre part. Cette opposition se vérifie vis-à-vis des données biologiques (début de la flèche) et des données physico-chimiques (fin de la flèche). Le canal contenant 10% d'effluent se distingue de ces deux groupes.



T23

T24T30

T34

T23T24

T30

T34

T23

T24

T30

T34

T23

T24

T30

T34

-2.8

2.1-1.7 2

F2 (21%)

F1 (78%)

C4 : TémoinC3 : 10%

Figure 38. Analyse de co-inertie ACP/ACP entre les données "biologiques" (origine de la flèche) et "physico-chimiques" (fin de la flèche).

2.6.12 Traitement des données biologiques issues de l'analyse DGGE

Une analyse factorielle des correspondances (AFC) est réalisée afin de déterminer si la structure de la communauté eubactérienne permet de discriminer les quatre canaux en fonction du traitement, c'est-à-dire de l'exposition des biofilms à une concentration donnée en effluent étudié : 0, 10, 25 et 50% volumique.

Une analyse de co-inertie AFC/ACP est ensuite réalisée pour effectuer un couplage des données biologiques et environnementales. L'objectif est de vérifier si les variations physico-chimiques du milieu liées à l'injection de l'effluent expliquent les variations de structure de la communauté eubactérienne.

C2 : 25%C1 : 50%

1-Tous les canaux avant l’injection de l’effluent & Canal témoin2- Canaux contenant 25% et 50% d’effluent

1

2

T23

T24T30

T34

T23T24

T30

T34

T23

T24

T30

T34

T23

T24

T30

T34

-2.8

2.1-1.7 2

F2 (21%)

F1 (78%)

C4 : TémoinC3 : 10%C1 : 50% C2 : 25%

1-Tous les canaux avant l’injection de l’effluent & Canal témoin2- Canaux contenant 25% et 50% d’effluent

1

2



2.6.121 Analyse factorielle des correspondances

L'analyse factorielle des correspondances se limite à l'étude du plan engendré par les deux premiers facteurs dont le pourcentage d'inertie cumulée permet d'expliquer 53% de la variance totale(Figure 39). Ce pourcentage est faible mais il est acceptable compte tenu des seize facteurs générés par l'analyse.

Le premier facteur (F1) ordonne les canaux selon la concentration en effluent. Il oppose le canal témoin et le canal contenant 10% d'effluent (coordonnées négatives) aux canaux contenant 25% et 50% d'effluent (coordonnées positives). Les individus C1T30, C1T34 d'une part, et C4T30, C4T34 d'autre part contribuent à la définition de cet axe à la hauteur de 75%. Ces individus étant caractérisés par la plus forte concentration d'une part, et l'absence d'effluent d'autre part, cet axe peut être défini comme l'axe de la concentration en effluent. Le second facteur (F2) ordonne clairement le canal témoin selon le temps mais cette tendance est moins nette pour les autres canaux. Cet axe est donc moins bien interprétable.

Enfin, la dispersion des individus est d'autant plus forte que la concentration en effluent est élevée. Une représentation en ellipse montre clairement cette tendance mais, dans le souci d'alléger le document, celle-ci n'est pas présentée.

En conclusion, cette analyse montre une séparation des individus (couple "canal/temps") en fonction de la concentration en l'effluent selon F1. En d'autres termes, le suivi de la structure de la communauté eubactérienne permet une discrimination des canaux selon leur traitement. Enfin, il apparaît que la communauté est d'autant moins stable que la perturbation est forte.



a. Projection des individus sur F1F2 (52.9%).

a. Graphe des valeurs propres.

29.4%

23.5%

14.8%

52.9% of the total inertia29.4%

23.5%

14.8%

52.9% of the total inertia

C1T17

T24

T30

T34

C2T17

T24

T30

T34

C3T17

T24T30

T34

C4T17

T24

T30

T34

-0.9

0.7-0.7 1.3

C4 : Témoin C3 : 10%

Figure 39. Analyse factorielle des correspondances (DGGE).

2.6.122 Co-inertie: couplage des données DGGE et physico-chimiques

Comme il a été dit précédemment, dans la partie bibliographique de ce rapport consacrée à la DGGE, le couplage de deux tableaux nécessite une pondération des lignes identiques. Dans le cas d'une co-inertie AFC/ACP, cela revient à effectuer une AFC à pondération uniforme ou à effectuer une ACP normée dont la pondération des lignes est issue de l'AFC. Les deux approches ont été testées et conduisent aux même conclusions. Les résultats présentés ici sont obtenus avec une pondération uniforme de l'AFC.

L'analyse de co-inertie met en évidence une ordination des canaux que ce soit d'un point de vue physico-chimique ou d'un point de vue biologique (Figure 40). Par ailleurs, dans les canaux contenant les plus fortes concentrations en effluent (25% et 50%), l'analyse montre que composition et la structure de la communauté eubactérienne évoluent de T30 à T34 alors que les caractéristiques physico-chimiques du milieu restent comparables. Dans le canal témoin, la structure de la communauté bactérienne reste stable de T30 à T34.

En conclusion, l'existence d'une partition commune des individus vis-à-vis de F1 aux temps T30 et T34 permet d'expliquer l'évolution de la composition et de la structure de la communauté eubactérienne par l'exposition des biofilms à différentes

C2 : 25% C1 : 50%

Conc. en effluentAbsence d’effluent

F2 (23.5)

F1 (29.4%)

C1T17

T24

T30

T34

C2T17

T24

T30

T34

C3T17

T24T30

T34

C4T17

T24

T30

T34

-0.9

0.7-0.7 1.3

C4 : Témoin C3 : 10% C2 : 25% C1 : 50%

Conc. en effluentAbsence d’effluent

F2 (23.5)

F1 (29.4%)



concentrations en effluent. Par ailleurs, dans le cas du biofilm exposé à 10% d'effluent, l'effet n'est visible qu'après 11 jours d'exposition (T34), ce qui était déjà visible sur l'analyse factorielle des correspondances.

Figure 40. Co-inertie AFC/ACP des données "biologiques" (flèche) et des données physico-chimiques (point).

T17

T24

T30

T34

2.6.2 Traitement statistique des données biologiques continues après injection de l'effluent : ANOVA

Comme il a été dit en conclusion du paragraphe relatif à l'étude de la variabilité inter-canal avant l'injection de l'effluent (T23), les effets de la concentration en effluent sont évalués à partir du taux d'évolution temporelle. Celui-ci est défini comme le ratio entre la valeur d'une variable donnée au temps "Tx" et la valeur de cette même variable au temps "T23". Le temps de prélèvement T23 détermine la situation de référence car il précède l'injection de l'effluent.

T17

T24

T30

T34

T17

T24

T30

T34

T17T24

T30T34

-2.2

1.8-1.3 1.9

C4 : Témoin

C3 : 10% C2 : 25%

C1 : 50%

Concentration en effluent

T17

T24

T30

T34

T17

T24

T30

T34

T17

T24

T30

T34

T17T24

T30T34

-2.2

1.8-1.3 1.9

-2.2

1.8-1.3 1.9

C4 : Témoin

C3 : 10% C2 : 25%

C1 : 50%

Concentration en effluent



2.6.21 Effet sur la biomasse totale (masse organique)

Le traitement statistique des données porte sur le taux d'évolution de la masse organique (Tx/T23) mais, afin que le lecteur ait un aperçu de l'évolution de la masse organique des biofilms, celle-ci est graphiquement représentée (Figure 42 ;Figure 43).

L'interaction du temps et de la concentration en effluent est non significative (ANOVA-2 ; p > 0,05) sur le taux d'évolution de la masse organique. Il en est de même pour l'effet de la concentration en effluent (ANOVA-1 ; p > 0,05).

En conclusion, la concentration en effluent n'a pas d'effet significatif sur le taux d'évolution de la masse organique. En conséquence, l'augmentation de l'indice autotrophique de 300 à 400 du biofilm exposé à 50% d'effluent ne peut pas être attribuée à une augmentation plus importante de la masse organique dans ce canal. De même, la diminution de l'indice autotrophique de 101 à 72 du biofilm exposé à 10% d'effluent ne peut pas être expliquée par une baisse de la masse organique. Ces évolutions sont donc probablement liées à l'évolution de la teneur en chlorophylle-a.

Figure 41. Taux d'évolution de la masse organique (Tx/T23).

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

24 25 30 34


Taux

d'é

volu

tion

(Tx/

T23)

Jours d'essai



Figure 42. Evolution de la masse organique en mg/cm2.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

17 20 23 24 25 30 34Durée d'essai (jours)


Effluent

Mas

se o

rgan

ique

en

mg/

cm2

2.6.22 Effet sur la biomasse algale (teneur en chlorophylle-a)

L'interaction du temps et de la concentration en effluent est significative (ANOVA-2 ; p < 0,05). L'effet de la concentration en polluant est examiné à chaque temps de prélèvement (ANOVA-1).

L'effet de la concentration en effluent est significativement négatif sur le taux d'évolution de la biomasse algale du biofilm développé dans le canal 1 (50% d'effluent) par rapport au taux d'évolution du biofilm témoin aux temps de prélèvement T30 et T34, c'est-à-dire après 7 et 11 jours d'exposition (Figure 43).

L'augmentation de l'indice autotrophique du biofilm exposé à 50% d'effluent (300 à 400) laissait supposer un développement de la composante hétérotrophe au détriment de la composante autotrophe. A présent, cette hypothèse peut être confirmée car l'effet de la concentration en effluent est non significatif sur le taux d'évolution de la masse organique mais significativement négatif sur le taux d'évolution de la teneur en chlorophylle-a. La diminution de l'indice autotrophique du biofilm exposé à 10% d'effluent (101 à 72), laissait supposer un développement de la composante autotrophe au détriment de la composante hétérotrophe. Dans ce cas, le taux d'évolution de la teneur en chlorophylle-a ne permet pas de confirmer cette hypothèse : aucun effet significatif par rapport au témoin n'est mis en évidence que ce soit sur le taux d'évolution de la masse organique ou le taux d'évolution de la chlorophylle-a (Figure 43).

En conclusion, nous confirmons un effet significatif et inhibiteur d'une concentration en effluent de 50% sur le taux d'évolution de la communauté algale, ceci après une semaine d'exposition du biofilm. En revanche, l'effet stimulant d'une



concentration de 10% en effluent sur la croissance de la communauté algale n'est pas confirmé par l'étude du taux d'évolution de la teneur en chlorophylle-a.

Figure 43. Taux d'évolution de la teneur en chlorophylle-a (Tx/T23). * : p < 0,05. Effet significatif par rapport au témoin.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

24 25 30 34Durée d'essai (jours)

canal 1 (50%) canal2 (25%) canal 3 (10%) canal 4 (témoin)

Taux

d'é

volu

tion

de la

chl

orop

hylle

-a (t

x/T2

3)

Figure 44. Evolution de la teneur en chlorophylle-a en µg/cm2.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

17 20 23 24 25 30 34Durée d'essai (jours)canal 1 (50%) canal 2 (25%) canal 3 (10%) canal 4 (témoin)

Chl

orop

hylle

-a e

n m

icro

g/cm

2

Effluent



2.6.23 Effet sur l'effectif bactérien

Préalablement à l'injection de l'effluent (T23), la différence des biofilms développés dans les quatre canaux est non significative vis-à-vis de la densité bactérienne (Tableau 29). Par conséquent, la transformation des données en taux d'évolution n'est pas nécessaire. Aussi, traiterons-nous les données telles que présentées sur la figure qui suit (Figure 45).

L'interaction du temps et de la concentration en effluent est non significative (ANOVA-2 ; p > 0,05). En conclusion, les effets de la concentration en effluent sur l'effectif bactérien sont non significatifs.

Figure 45. Evolution de l'effectif bactérien en nombre de cellules par unité de surface.

0.00E+00

2.00E+09

4.00E+09

6.00E+09

8.00E+09

1.00E+10

1.20E+10

1.40E+10

1.60E+10

1.80E+10

2.00E+10

17 23 24 30 34Durée d'essai (jours)


Nom

bre

de c

ellu

les/

cm2

Effluent

2.6.24 Effet sur l'activité de la leucine aminopeptidase

L'interaction du temps et de la concentration en effluent est significative (ANOVA-2) sur le taux d'évolution de l'activité de la leucine aminopeptidase. L'effet de la concentration en effluent est donc examiné à chaque temps de prélèvement (Figure 46).

L'analyse de variance met en évidence un effet significatif et inhibiteur de l'effluent sur l'activité leucine aminopeptidase dans le cas des biofilms exposés à une concentration de 50% et de 25% en effluent (canaux 1 et 2). Cet effet n'est pas immédiat, il est observé aux temps de prélèvement T30 et T34, soit après 7 et 11 jours d'exposition. L'analyse montre également un effet significatif et stimulant de l'effluent



dans le cas du biofilm exposé à une concentration de 10% en effluent (canal 3). Cet effet est significatif dès le lendemain de l'injection (T24) et après 7 jours d'exposition (T30) mais non significatif après 2 jours d'exposition (T25).

En conclusion, l'effet de la concentration en effluent sur le taux d'évolution de l'activité de la leucine aminopeptidase est négatif après une semaine d'exposition aux concentrations les plus élevées, c'est-à-dire 25 et 50%. A 10% d'effluent, nous retiendrons un effet stimulant qui ne persiste pas dans le temps : il est fortement significatif le lendemain de l'injection, significatif au bout d'une semaine, et non significatif après 11 jours d'exposition.

Figure 46. Taux d'évolution de l'activité leucine aminopeptidase (Tx/T23). * : p < 0,05 ; ** : p < 0,001. Effet significatif par rapport au témoin.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

24 25 30 34


Taux

d'é

volu

tion

(Tx/

T23)

Durée d'essai (jours)

2.6.25 Effet sur l'activité de la β-D-glucosidase

L'interaction du temps et de la concentration en effluent sur le taux d'évolution de l'activité β-D-glucosidase est significative (ANOVA-2). L'effet de la concentration en effluent est donc examiné à chaque temps de prélèvement (Figure 47).

L'analyse de variance met systématiquement en évidence un effet fortement significatif et inhibiteur (p < 0,001), par rapport au biofilm témoin, dans le cas des biofilms exposés à 50% et 25% d'effluent (canaux 1 et 2). L'analyse montre également un effet fortement significatif et inhibiteur dans le cas du biofilm exposé à 10% d'effluent (canal 3) le deuxième jour d'exposition (T25). Par la suite, l'effet diminue (T30) puis il devient non significatif (T34).



En conclusion, l'effet de la concentration en effluent sur le taux d'évolution de l'activité de la β-D-glucosidase des biofilms est fortement significatif et négatif aux concentrations les plus élevées, c'est-à-dire 25 et 50%. A 10% d'effluent, l'effet n'est pas immédiat et non persistant.

Une comparaison de ces observations à celles précédemment faites dans le cas de l'activité de la leucine aminopeptidase montre qu'une exposition des biofilms à 25% et 50% d'effluent entraîne également des effets inhibiteurs et fortement significatifs sur ces activités. Toutefois, ces effets n'apparaissent qu'après une semaine d'exposition dans le cas de la leucine aminopetidase alors qu'ils sont immédiats dans le cas de la β-D-glucosidase.

Figure 47. Taux d'évolution de l'activité de la β-D-Glucosidase (Tx/T23). * : p < 0,05 ; ** : p < 0,001. Effet significatif par rapport au témoin.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

24 25 30 34Durée d'essai (jours)canal 1 (50%) canal 2 (25%) canal 3 (10%) canal 4 (témoin)

Taux

d'é

volu

tion

(Tx/

T23)



2.6.3 Traitement graphique et analyses de variance : confrontation des résultats

Les résultats de l'analyse en composantes principales et ceux des analyses de variances peuvent être comparés en apportant des réponses ou des éléments de réponse à la question suivante : les biodescripteurs permettent-ils de distinguer l'effet des différents traitements ?

L'analyse en composantes principales permet une discrimination des biofilms "tests" (présence d'effluent) en fonction de la concentration en effluent. Cette discrimination serait expliquée par les variations de l'activité de la leucine aminopeptidase et par la densité bactérienne. L'ACP permet également de distinguer les essais "tests", menés en présence d'effluent, de l'essai "témoin" mené en l'absence d'effluent. Cette distinction serait, cette-fois, liée aux variations de l'activité de la β-D-glucosidase.

Les analyses de variance ne permettent pas de distinguer l'effet de la concentration vis-à-vis de l'ensemble des variables et des temps d'exposition. Même la lecture d'un tableau récapitulatif des effets observés (Tableau 33) permet difficilement de conclure sur la capacité des biodescripteurs à distinguer les différents traitements. Cela dit, l'effet de l'effluent sur les variables chlorophylle-a, leucine aminopeptidase et β-D-glucosidase diffère selon la concentration d'une part, et la durée dexposition d'autre part.

En conclusion, que les données soient traitées par ACP ou par ANOVA, les variables relatives aux activités enzymatiques semblent plus favorables que les variables de structure (biomasses totale et algale, effectif bactérien) pour la distinction des différents traitements (variation de la concentration en effluent).



T24 T25 T30 T34 Temps de prélèvement Caractérisation de l'effet 1 jour 2 jours 7 jours 11 jours Durée d'exposition

Masse org. NS

Chloroplylle-a Négatif Différé Persistant

Eff. Bactérien NS

β−Gluc Négatif Immédiat Persistant

Canal 1

Négatif Différé

Persistant Leu-amp

Masse org. NS Chloroplylle-a NS

Eff. Bactérien NS

Leu-amp Négatif Différé Persistant

Canal 2

β−Gluc Négatif Immédiat Persistant

Masse org. NS Chloroplylle-a NS Eff. Bactérien NS

Leu-amp stimulant Immédiat Canal 3

β−Gluc Négatif Différé Non persistant

Tableau 33. Tableau récapitulatif des ANOVA.



3. Campagnes d'essais complémentaires Les deux campagnes présentées dans cette partie ont été réalisées dans le but

de confirmer les tendances observées lors de la première campagne en effectuant, cette fois-ci, des réplicats de canaux (deux canaux "tests" et deux canaux "témoins". Dans ce contexte, nous avons testé l'effet d'une concentration de 25% d'effluent puis de 10% d'effluent.

Pour des raisons de temps, le nombre de biodescripteurs suivis a dû être réduit dans le cas de ces deux campagnes. Ainsi, la diversité pigmentaire n'a pas été évaluée. La diversité taxonomique a été examinée sur certains échantillons mais non quantifiée compte tenu de la dominance d'Achnanthes minutissima. La densité bactérienne a été suivie lors des essais menés en présence de 25% d'effluent. Sachant que les résultats ont confirmé ceux de la première campagne, l'effet en présence de 10% d'effluent n'a pas été contrôlé par la suite. En revanche, le suivi de la composition de la communauté eubactérienne a été conservé, ceci afin de valider l'intérêt de ce biodescripteur. Les autres biodescripteurs sont la masse organique, la teneur en chlorphylle-a, ainsi que l'activité des enzymes leucine aminopeptidase et β-D-glucosidase.

Nous avons choisi de limiter l'interprétation de ces résultats à des analyses multivariées (ACP et AFC), ceci afin de contrôler la cohérence des tendances précédemment observées au vu de l'ensemble des variables.

Les résultats de l'analyse en composantes de la deuxième campagne (2 canaux "test-25%" et 2 canaux "témoins") reposent sur l'interprétation du plan factoriel engendré par les deux premiers facteurs représentant 86% de l'inertie totale sur un total de cinq facteurs (Figure 48). La projection des individus (couple "canal/temps") montre une partition des canaux en fonction de la présence ou de l'absence de l'effluent selon F1. Après injection de l'effluent, les canaux "tests" ont des coordonnées positives sur F1. L'analyse de variables montrent que l'activité enzymatique des biofilms développés dans les canaux "tests" est plus faible mais la masse organique est supérieur à celle des témoins. Nous confirmerons ainsi l'effet négatif de 25% d'effluent sur les activités enzymatiques.

Les résultats de l'analyse en composantes de la troisième campagne (2 canaux "test-10%" et 2 canaux "témoins") reposent sur l'interprétation du plan factoriel engendré par les deux premiers facteurs représentant 70% de l'inertie totale sur un total de quatre facteurs (Figure 48). La typologie des individus revèle un regroupement des canaux "test" qui se caractérise par des coordonnées positives sur F1 et négatives sur F2. Par comparaison aux essais "témoins", il ressort de cette analyse une activité plus faible de la β-D-glucosidase mais une augmentation temporelle continue de l'activité de la leucine aminopeptidase, de la masse organique et de la chlorophylle-a. Ces



résultats confirment l'effet inhibiteur sur l'activité β-D-glucosidase et l'effet stimulant sur l'activité de la leucine aminopeptidase de 10% d'effluent.

Les analyses factorielles des correspondances confirment les observations

précédentes : la présence de l'effluent modifie la stabilité de la communauté eubactérienne (Figure 49). En effet, la représentation sous forme d'ellispes montre que la dispersion des point est supérieure dans les canaux "tests". Enfin, nous noterons qu'en présence de l'effluent, les deux canaux "tests" n'évoluent pas de manière comparable.

a. Exposition à 25 % d'éffluent b. Exposition à 10% d'effluent Figure 48. ACP des données biologiques des campagnes complémentaires en canaux artificiels.

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4. Discussion

Nous discuterons successivement des caractéristiques des biofilms avant l'injection de l'effluent, ce qui nous conduira à évoquer la variabilité inter-canal constatée, et des réponses des biofilms exposés à différentes concentrations en effluent.

Préalablement au développement de ces points, nous souhaitons faire état de nos réflexions quant à l'évolution générale de la colonisation des biofilms dans les quatre canaux artificiels. Ces réflexions reposent en grande partie sur des observations visuelles mais nous tenterons d'argumenter nos propos sur la base de nos résultats et des données bibliographiques relatives aux processus de colonisation des biofilms.

Enfin, comme il a été annoncé en introduction de ce chapitre, la discussion se limite volontairement à la campagne d'essai principale car les essais suivants avaient uniquement pour objectif de confirmer certains points de la première campagne.

4.1 Colonisation des biofilms dans les canaux artificiels avant injection de l'effluent Un suivi visuel de la colonisation des biofilms dans les quatre canaux a

clairement montré que le développement des biofilms des canaux 2 et 3 a été plus rapide que celui des canaux 1 et 4. En d'autres termes, les biofilms des canaux 2 et 3 ont été plus rapidement visibles à l'œil nu. En revanche, dans tous les cas, l'évolution visuelle temporelle des biofilms était identique : initialement d'un vert très clair, les biofilms sont ensuite parsemés des colorations brunes qui apparaissent par "taches" et se densifient au cours du temps. Cette tendance est très nette dans le canal 3 (Photo 23).

Canal 4 (IA = 217) Canal 3 (IA = 95) Photo 23. Etat de la colonisation des biofilms dans les canaux expérimentaux à T23.



Du fait de ces observations visuelles, nous nous sommes intéressés au taux de croissance globale des biofilms (masse organique), ainsi qu'au taux de croissance de la composante algale (chlorophylle-a). Ces taux ont été calculés à partir du 17ème jour de colonisation jusqu'au 23ème jour (Figure 50).

Figure 50. Taux d'évolution de la masse organique et de la chlorophylle-a dans les canaux expérimentaux avant injection de l'effluent (Tx/T17).

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Les résultats montrent clairement que le taux de croissance est plus élevé dans

le canal 4, que ce soit vis-à-vis de la biomasse totale ou algale. Pourtant, à l'issue d'une période de 23 jours de colonisation, ce biofilm possède la masse organique la plus faible. En conséquence, l'association de ces deux observations soulève la question suivante : la colonisation du biofilm du canal 4 a-t-elle été initiée plus tardivement ?

Afin d'apporter des éléments de réponse à cette question, nous nous intéressons à présent à la colonisation des biofilms dans les différents canaux. Préalablement, nous argumenterons sur la nécessité de cette démarche.

4.1.1 Importance de la phase de colonisation vis-à-vis de la réponse des biofilms à un stress chimique

Nos essais sont menés sur des biofilms en phase exponentielle de croissance. Au cours de cette phase, le biofilm constitue un assemblage particulièrement



dynamique du fait d'interactions multiples entre les organismes, la matrice et le milieu d'essai [MARSH et BOWDEN, 2000]. Ces interactions ont un rôle dans l'attachement des cellules et contrôlent, indirectement, la dynamique de succession des espèces c'est-à-dire la composition du biofilm. Dans le cadre d'une étude visant à évaluer les effets d'un polluant sur une communauté périphytique, la composition spécifique est un point important car la sensibilité des biofilms varie en fonction des espèces qui le composent.

Enfin, dans des conditions d'écoulement et de niveau trophique identiques, une différence de cinétique de colonisation peut aussi conduire à des biofilms d'épaisseurs différentes. L''épaisseur de la matrice polysaccharidique, qui augmente au cours du temps, agit comme une barrière de diffusion et limite les échanges avec la colonne d'eau [LOCK et al., 1984]. Ainsi, la matrice du biofilm permet aux organismes de mieux résister aux agressions extérieures, telle qu'une perturbation chimique [MARSH et BOWDEN, 2000 ; SABATER et al., 2003]. Par ailleurs, les interactions intra et inter-spécifiques se complexifient lorsque l'épaisseur du biofilm augmente et les processus de régulation internes deviennent progressivement plus importants que les facteurs externes du milieu. Les organismes sont ainsi protégés contre les variations du milieu environnant [WATANABE et al., 1988].

4.1.2 Colonisation du biofilm dans le canal 1

Le biofilm du canal 1 se caractérise par la teneur en masse organique moyenne la plus élevée et, inversement, par les teneurs massiques en chlorophylle-a et en cellules bactériennes significativement les plus faibles.

Selon notre point de vue, la teneur en masse organique, supérieure dans ce biofilm, ne peut pas s'expliquer par un développement plus important des communautés bactériennes et algales. Cette conclusion est d'ailleurs cohérente avec l'évolution des paramètres chimiques : les teneurs en azote inorganique et en silice dans la colonne d'eau diminuent moins fortement dans le canal 1 que dans les autres canaux. Cela dit, à ce stade de notre réflexion, nous devons modérer nos conclusions car celles-ci reposent, en ce qui concerne la communauté algale, uniquement sur le dosage de la silice et de la chlorophylle-a. Effectivement, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que le biofilm de ce canal soit le siège d'un développement d'algues non siliceuses contenant de plus faibles quantités en chlorophylle-a. Le dosage des pigments photosynthétiques montre d'ailleurs la présence d'algues vertes en quantités supérieures dans ce biofilm. Enfin, ces observations pourraient aussi s'expliquer par l'accumulation de masse organique non vivante, tels que des composés extra-cellulaires, ou la présence de micro-organismes non étudiés.



4.1.3 Colonisation du biofilm dans le canal 4

Dans la bibliographie, la colonisation initiale des substrats est très généralement attribuée aux communautés bactériennes qui tend à faciliter l'adhésion des cellules algales [STEINMAN et PARKER, 1990 ; WOLFAARDT et CLOETE, 1992

SABATER et ROMANI, 1996]. L'adhésion des premières cellules colonisatrices est favorisée par le "conditionnement" des substrats vierges par un film de matière organique [CHARACKLIS et al., 1989a ; MARSH et BOWDEN, 2000 ; WINPENNY, 2000] et par la rugosité du substrat. L'inégalité d'une surface engendre, en effet, des micro-cavités au sein desquelles les cellules pionnières sont protégées et parviennent ainsi à se développer [PICIOREANU, 2000].

Dans le cadre de nos essais, la différence de colonisation observée dans le canal 4 ne peut pas s'expliquer par le contenu en matière organique ou par la rugosité de nos substrats artificiels qui, initialement, est identique. Toutefois, dès le début de l'essai, le contenu en carbone total a suscité notre intérêt ; celui-ci diminue moins dans le canal 4 que dans canaux 2 et 3.

Le carbone étant essentiellement sous forme minérale, la chute du carbone dans les canaux peut être attribuée :

au dégazage du dioxyde de carbone (CO2) dissous du fait de la teneur plus faible en CO2 atmosphérique : l'eau des canaux s'enrichit en oxygène et s'appauvrit en CO2.

à la précipitation de calcaire (CaC03) ; celle-ci est d'ailleurs visible à l'œil nu après la collecte du biofilm par brossage (Photo 24).

Ce dernier point est primordial car la précipitation de calcaire sur les substrats vierges augmente la rugosité des substrats, ce qui, nous venons de le voir, facilite l'adhésion des premières cellules colonisatrices. Lors des opérations de collecte des biofilms, nous avons d'ailleurs pu constater que le brossage des lames (substrats artificiels) prélevées dans les canaux 2 et 3 était plus long. Le biofilm semblait mieux fixé au substrat.

Notre hypothèse est la suivante : la précipitation de calcaire semble moins importante dans les canaux 1 et 4, ce qui pourrait expliquer une plus faible rugosité des lames et, par conséquent, des conditions micro-environnementales moins propices à la colonisation des substrats.

Cette hypothèse a été confirmée par l'analyse de lames issues des canaux. Les lames prélevées dans les canaux 2 et 3 semblaient contenir un dépôt plus important que les des canaux 1 et 4. Ceci est confirmé par la détermination des pourcentages de masse minérale dans les biofilms. Ceux-ci sont plus élevés dans les biofilms des canaux 2 et 3 (90% de la masse sèche totale) que dans les biofiolms des canaux 1 et 4



(85% de la masse sèche totale). La présence d'un dépôt de calcaire a été mise en évidence par mise en contact avec de l'acide acétique (réaction effervescente).

Photo 24. Dépôt de calcaire visible sur les lames après brossage du biofilm.

4.1.4 Colonisation des biofilm dans les canaux 2 et 3

Préalablement à l'injection de l'effluent, les biofilms des canaux 2 et 3 sont dominés par la composante autotrophe alors que les biofilms des canaux 1 et 4 ne sont pas caractérisés par la dominance de la composante autotrophe ou hétérotrophe.

Ce point doit être considéré avec intérêt car le milieu d'essai est initialement pauvre en carbone organique dissous (< 0,5 mg/L) et la communauté algale représente une source importante de matière organique dissoute pour les bactéries [SABATER et ROMANI, 1996]. Les essais menés par SOBCZAK (1996) en canaux artificiels montrent que de la teneur en carbone organique dissous dans la colonne d'eau est un facteur déterminant sur le développement des biofilms durant les premiers jours de colonisation mais qu'il s'avère moins influent lorsque la communauté algale commence à s'établir. A ce stade de colonisation, les organismes hétérotrophes utilisent les composés sécrétés par les algues ou issus de la lyse cellulaire [SABATER et al., 2002]. Les essais de JONES et LOCK (1993) confirment également le rôle essentiel de la communauté autotrophe dans le fonctionnement du biofilm lorsque celui-ci se développe dans un milieu pauvre en carbone organique dissous.

Dans le cadre de nos essais, la dominance de la composante algale n'entraîne pas de différence significative sur le développement de la communauté bactérienne en termes de densité ou de composition spécifique. Cependant, nous ne pouvons pas



exclure l'influence de ces interactions "algues-bactéries" sur des paramètres fonctionnels, tels que les activités enzymatiques.

Pour expliquer la teneur en chlorophylle-a, nettement supérieure dans les canaux 2 et 3, nous nous sommes intéressés aux spécificités de ces canaux. Ils ont pour caractéristiques communes d'être placés au centre de la pièce et, de ce fait, d'être encadrés par les deux autres canaux. Ainsi, il est envisageable qu'ils bénéficient d'un éclairage différent (qualitativement et quantitativement) de celui des canaux 1 et 4 situés à proximité d'un mur. Cependant, les mesures d'intensité lumineuse, effectuées à l'aide d'un Luxmètre placé à la surface de l'eau, ne révèlent aucune différence significative des flux reçus. L'hypothèse de l'influence de l'intensité de la lumière sur l'hétérogénéité de la teneur en chlorophylle-a dans les différents canaux est donc à rejeter. Nous avons également envisagé l'influence de la température de l'eau circulant dans les canaux. La différence de température est inférieure à 1°C et nous semble trop faible pour induire autant de différence au niveau de la biomasse algale, même si, les températures les plus basses sont observées dans l'eau des canaux 2 et 3 du fait de leur positionnement sous les climatiseurs. En conclusion, nous justifierons la différence de colonisation de la communauté algale dans les biofilms des canaux 2 et 3 par la précipitation de carbonate de calcium qui augmente la capacité de fixation des premières cellules bactériennes. La colonisation des algues est ensuite facilitée par la présence de la matrice polysaccharidique formée par l'activité des bactéries initialement fixées [STEINMAN et PARKER, 1990 ; WOLFAARDT et CLOETE, 1992].

Les canaux 2 et 3 se distinguent aussi par un pourcentage de masse organique par rapport à la masse sèche de l'ordre de 10% alors qu'il est de 15% dans les canaux 1 et 4. En d'autres termes, les biofilms visuellement les plus denses possèdent un pourcentage de matière organique plus faible. Nous supposons que la croissance du biofilm et, notamment de sa composante algale, tend à modifier les conditions hydrodynamiques à proximité des substrats augmentant ainsi le dépôt (piégeage) des particules minérales en suspension [BATTIN et al., 2003] notamment celles dues à la précipitation du calcaire et celles apportées par l'inoculum. Les quantités de matière minérale apportées par l'inoculum n'ont pas été quantifiées mais elles ont été suffisantes pour endommager les pompes et nécessiter un nouvel aménagement.

4.1.5 Variabilité de la colonisation inter-canal

Les résultats tendent à montrer une diminution de la variabilité inter-canal dans le temps pour l'ensemble des variables. Ces résultats rejoignent ceux de LOWE et al. (1996). Ces auteurs constatent que les variations inter-canal observées lors de la colonisation du périphyton en canaux artificiels diminuent au cours du temps et deviennent négligeables dès la quatrième semaine. Une corrélation négative significative est mise en évidence entre le coefficient de variation inter-canal et le nombre de cellules algales.



Enfin, il est intéressant de constater que l'hétérogénéité inter-canal est inférieure (CV ≤ 20%) dans le cas des variables impliquant la communauté bactérienne (activité de la leucine aminopeptidase et densité bactérienne). Sachant que la composition de la communauté eubactérienne est par ailleurs homogène dans les quatre canaux, ce dernier point peut s'expliquer par le fait que le stade mature des communautés bactériennes périphytiques soit atteint plus rapidement [LIU et al., 1993]. Quant à la variabilité inter-canal relative à la communauté algale, c'est-à-dire à la teneur en chlorophylle-a, les coefficients de variation atteignent 60%. D'après les résultats de LOWE et al. (1996), ce pourcentage, particulièrement élevé, nous incite à suggérer une augmentation de la durée de la colonisation dans les canaux préalablement à l'injection de l'effluent. Ces auteurs montrent, en effet, que plus la communauté algale se développe (augmentation du nombre de cellules), plus les variations inter-canal diminuent vis-à-vis de ce biodescripteur (CV < 6% à partir de la quatrième semaine).

4.2 Composition des biofilms avant injection de l'effluent La composition de la communauté eubactérienne périphytique développée

dans les canaux étant homogène, nous nous attachons ici à la composition de la communauté algale.

4.2.1 Diversité taxonomique

La composition taxonomique des diatomées ne révèle aucune différence majeure du fait de la dominance de l'espèce Achnanthes minutissima. Ce constat rejoint ceux de AMBLARD et al. (1990) et BRUNET (2000).

La nette dominance de cette espèce dans nos canaux se justifie probablement par le caractère pionnier du genre Achnanthes [BIGGS, 2000] qui a été mis en évidence à plusieurs reprises notamment lors d'études menées in situ sur substrats artificiels [SABATER et ROMANI, 1996 ; GUASH et al., 1997]. Le caractère pionnier de cette espèce est probablement lié à sa faible taille, ce qui facilite sa diffusion au travers de la couche limite visqueuse se développant à la surface des supports. Achnanthes minutissima est en effet l'une des plus petites espèces parmi les diatomées. Sa largeur est d'environ 3 à 4 µm et sa longueur de 10 à 15 µm [KRAMMER et LANGE-BERTALOT, 1991]. Selon RUMEAU et COSTE (1988), la taille des diatomées varie de 10 µm pour les plus petites à 500 µm pour les plus grandes.

La dominance d'Achnanthes minutissima s'explique également par son taux de reproduction élevé qui la rend fortement compétitive [WATANABE, 1985 ; Mc CORMICK, 1996]. Le suivi de la colonisation sur substrats artificiels des communautés



épilithiques de diatomées dans la Garonne montre que l'abondance relative d'Achnanthes minutissima peut atteindre 73% et une densité de 637 ± 53 x 103 cellules par cm2 dès la première semaine de colonisation [EULIN, 1997]. Pour information, les diatomées peuvent se reproduisent à l'échelle de l'heure, de la semaine, du mois ou de l'année et le taux de reproduction est généralement fonction de la taille de l'espèce [RUMEAU et COSTE, 1988].

Selon Mc CORMICK (1996) l'abondance d'Achnanthes minutissima est aussi favorisée par son développement sous une forme adnée et sa capacité à former un mucilage qui agit comme de la colle. Les essais de PERTERSON et STEVENSON (1990) menés en canaux artificiels corroborent cette hypothèse. Ils mettent en évidence que le mode de fixation des espèces influe sur leur abondance. Celles qui sont attachées au substrat, notamment par une structure mucilagineuse, sont plus nombreuses.

Du point de vue des caractéristiques chimiques du milieu l'espèce Achnanthes minutissima est associée à des cours d'eau caractérisés par une faible teneur en matière organique [BACKHAUS, 1968]. Selon CHOLNOKY (1968) elle est également caractéristique des milieux bien oxygénés. Enfin, Mc CORMICK et STEVENSON (1989) la retrouvent préférentiellement dans des milieux riches en nitrates et phosphore. Elle semble par ailleurs peu sensible au pH. HYNE (1970) la retrouve préférentiellement dans des milieux dont le pH est alcalin et CHOLNOKY (1968) situe son pH optimal entre 7.5 et 7.8. Enfin, selon l'étude de LOWE (1974), citée par GENTER et AMYOT (1994), sur la tolérance des diatomées d'eau douce au pH, Achnanthes minutissima est présente dans des milieux où le pH est compris entre 6.0 et 8.0 avec un pH optimal situé entre 6.8 et 7.5.

Etant donné la nette dominance de cette espèce, les caractéristiques des autres taxons ne seront pas développées.

4.2.2 Diversité pigmentaire

L'analyse pigmentaire montre que le pourcentage d'algues vertes chute dans le temps quel que soit le canal, sauf dans le canal 1. La distribution des groupes algaux (algues vertes et diatomées) est donc hétérogène dans les quatre canaux.

Enfin, la dynamique de colonisation des espèces algales est par ailleurs inhabituelle. En effet, les algues vertes sont initialement présentes puis disparaissent au profit des diatomées alors que la situation inverse est plus fréquemment observée en milieu naturel [STEINMAN et PARKER, 1990 ; SABATER et ROMANI, 1996] ou en canaux artificiels [AMBLARD et al., 1990]. Cela pourrait s'expliquer, au moins en partie, par le caractère sélectif de l'éclairage artificiel. Bien que le spectre d'émission ait été élargi par l'association de deux tubes fluorescents de qualité différente celui-ci tend à favoriser le développement de la fucoxanthine, pigment caractéristique des diatomées. Inversement le développement de la chlorophylle-b, pigment caractéristique des algues



vertes, n'est pas privilégié. En effet, le spectre d'émission des néons met en évidence un pic d'émission à 550 nm (absorption maximale de la fucoxanthine) et l'absence de pics à 445 et 645 nm (absorption maximale de la chlorophylle-b).

L'hypothèse que nous pouvons avancer est la fixation d'algues vertes contenues dans l'inoculum mais une décroissance de leur abondance relative du fait de la qualité de l'éclairage et de la forte compétitivité d'Achnanthes minutissima.

Plus généralement, nous pouvons nous interroger sur l'influence de l'inoculum, sur la nécessité de le renouveler et sur l'influence de l'échelle temporelle qui est peut être insuffisante pour permettre l'observation d'une succession d'espèces habituelle [HOFFMANN, 1993].

4.3 Effet de la concentration en effluent sur les biofilms

4.3.1 Effet sur la structure et la composition

La masse organique des biofilms soumis à 50% (2,2 à 3,3 mg/cm2), à 25% (2 à 2,5 mg/cm2) et à 10% (2,2 à 3,2 mg/cm2) sont caractéristiques d'un milieu eutrophe contrairement à celle du biofilm témoin qui reste inférieure à 2,1 mg/cm2 et qui est davantage représentative d'une communauté périphytique en milieu mésotrophe [BIGGS, 1996b ; DODDS et al., 1998]. Les teneurs en chlorophylle-a sont caractéristiques des milieux mésotrophes à eutrophes quel que soit le canal [BIGGS, 1996b ; DODDS et al., 1998].

L'évolution de ces paramètres n'est pas plus amplement abordée car leur variation suite à l'injection de l'effluent est moins notable que celle des autres paramètres.

4.3.2 Effet de la concentration sur l'évolution des activité enzymatiques

Bien que les activités des enzymes leucine aminopeptidase et β-D-glucosidase soient utilisées comme biodescripteurs d'une perturbation, et non à des fins analytiques, il nous semble néanmoins nécessaire de nous intéresser aux principes de régulation de ces enzymes. Comme nous le verrons, leurs synthèses, ainsi que leurs activités sont fonction de la nature et de la concentration des composés organiques présents dans le milieu. L'évolution des activités peut s'expliquer par un effet direct sur l'enzyme ou le métabolisme de la cellule bactérienne ; elle peut aussi être la conséquence d'un effet sur la communauté algale du fait de la biosynthèse de composés organiques algaux.



4.3.21 Principes de régulation des activités enzymatiques

L'activité d'une ectoenzyme, c'est-à-dire d'une enzyme liée à la cellule, est le fait de mécanismes agissant sur la synthèse de l’enzyme (transcription et traduction des gènes impliqués dans sa synthèse : ADN ARNm protéine) ou sur sa fonction catalytique. Dans la plupart des cas, la synthèse des enzymes extracellulaires est inductive et non constitutive [SINSABAUGH et al., 1997]. La biosynthèse d'une enzyme est dite "inductive" lorsqu'elle est induite ou inhibée selon les besoins de la cellule par un effet "feedback".

Une fois sécrétée, l'activité d'une ectoenzyme est soumise aux conditions environnementales, tels que le pH ou la température. Lorsque le fonctionnement de l'enzyme est par ailleurs régulé par la concentration en substrat potentiellement dégradable dans le milieu, l'activité de l'enzyme est dite "inductible". Dans ce cas, l'activité de l'enzyme est inhibée lorsque le produit final de la réaction est présent en quantité suffisante. Il s'agit d'une inhibition par excès du produit de la réaction. Inversement, l'activité est induite par la présence de composés de fortes masses moléculaires en l'absence de composés directement et facilement assimilables par les bactéries. L'inhibition de l'activité d'une ectoenzyme par excès du produit final de la réaction est généralement une inhibition compétitive [SINSABAUGH et al., 1997] ; l'agent inhibiteur, ici le produit de la réaction, se fixe sur l'enzyme au même site que le substrat [PELMONT, 1995]. L'inhibition peut être également non compétitive ; le cas le plus fréquent est la présence d'agents inhibiteurs qui altèrent la stabilité de l'enzyme, ce qui a pour conséquence de réduire son activité [SINSABAUGH et al., 1997].

La synthèse et l'activité de l'enzyme leucine aminopeptidase sont inductibles [CHRÓST, 1991]. A ce titre, la présence de composés organiques directement et facilement assimilables par les bactéries entraîne une inhibition de la synthèse de l'enzyme leucine aminopeptidase d'une part, et de son activité d'autre part. Lorsque ce mécanisme s'inverse, l'inhibition est levée ("derepression"). CHRÓST (1991) rappelle cependant que des travaux antérieurs ont montré que, chez certaines bactéries, la présence d'acides aminés, peptides et protéines induisent la synthèse de l'enzyme [LITCHFIELD et PRESCOTT, 1976 ; DAATSELAAR et HARDER, 1974]. Les mécanismes régulant la synthèse de l'enzyme seraient donc peut-être plus complexes. Certaines limites sont peut être à apporter sur la théorie de l'induction/répression proposée par CHRÓST (1991). D'ailleurs, selon GONZALES et ROBERT-BAUDOUY (1996) le fonctionnement de la leucine aminopeptidase est peu connu tant au niveau de sa synthèse (constitutive ou inductive) que de son expression.

Quant à l'activité de l'enzyme β-D-glucosidase, CHRÓST (1991) a expérimentalement démontré l'étroite relation qui existe entre la nature du composé ajouté et la synthèse et/ou l'activité de l'enzyme β-D-glucosidase ; ses travaux reposent sur l'addition de différents composés organiques dans des échantillons prélevés dans la



colonne d'eau d'un lac. Son observation est la suivante : l'ajout de glucose et d'acides aminés tend à réduire l'activité. Inversement, la synthèse et l'activité de l'enzyme (forte affinité de l'enzyme avec le substrat) augmentent suite à un ajout de cellobiose qui est un disaccharide de glucose issu de la dégradation de la cellulose. Ces résultats confirment l'hypothèse précédemment émise par CHRÓST et OVERBECK (1990) : les composés organiques directement et facilement utilisables par les bactéries agissent comme des agents répresseurs et entraînent une inhibition de la synthèse de l'enzyme. En parallèle, la présence de D-glucose, produit final de la réaction catalysée par la β-D-glucosidase, inhibe la vitesse initiale de réaction par diminution de l'affinité de l'enzyme avec le substrat (augmentation du Km). Il s'agit selon les auteurs d'une inhibition compétitive par fixation du D-glucose sur le site actif de l'enzyme.

4.3.22 Evolution des activités enzymatiques suite à un stress

Les bactéries hétérotrophes étant considérées comme les principaux organismes producteurs des enzymes étudiées dans le cadre de ces travaux, la variation d'une activité peut être expliquée par l'influence du stress sur :

l'effectif bactérien [HOPPE, 1991; CHRÓST, 1991] ; l'activité spécifique qui peut être elle-même liée à la taille des cellules

[CHRÓST, 1991 ; AINSWORTH et GOULDER, 2000a] ; la proportion de cellules bactériennes métaboliquement actives

[AINSWORTH et GOULDER, 2000a ; KANG et GOULDER, 1996] ; la présence de composés susceptibles de provoquer l'altération de

l'enzyme ; la nature et la concentration des composés organiques présents dans le

milieu et contrôlant la régulation de la synthèse et de l'activité des enzymes [CHRÓST, 1991 ; MUNSTER, 1991].

4.3.33 Effet de l'effluent sur l'évolution de l'activité leucine aminopeptidase

Préalablement à l'injection de l'effluent, l'activité de la leucine aminopeptidase du biofilm développé dans le canal 1 est singulièrement différente de celle des autres biofilm. En effet, elle est nettement supérieure à celle des biofilms colonisés dans les autres canaux (Tableau 34) et l'effectif bactérien ne permet pas d'expliquer complètement cette tendance. Aussi, nous avancerons les hypothèses suivantes :

un développement et une activité hétérotrophique supérieure [SABATER et ROMANI, 1996] : la valeur de l'indice autotrophique (312) est plus élevée dans ce biofilm ;

une activité enzymatique stimulée du fait d'une production moindre de de composés organiques directement assimilables par les bactéries



(sécrétions algales) ; cette hypothèse suppose également la présence de substrats organiques hydrolysable par cette enzyme ;

une plus forte rétention des enzymes ; la masse organique supérieure dans ce biofilm facilite la rétention des enzymes libres [JONES et LOCK, 1993] ;

une proportion d'algues vertes supérieure : la nature des composés biosynthétisés varie en fonction de l'espèce algale, cela pourrait justifier le comportement particulier de ce biofilm vis-à-vis de l'activité leucine aminopeptidase.

Pour conclure sur le biofilm du canal 1, nous rappelons que la composition spécifique des eubactéries diffère légèrement de celle des autres canaux. Cela dit, nous n'avons pas trouvé de travaux faisant état de la spécificité de cette enzyme vis-à-vis de certaines espèces bactériennes.

Leu-aminopeptidase nmol/h/cm2

(n=5) Leu-aminopeptidase nmol/h/109 cell

(n=3)

T23 T30 T34 T23 T30 T34 Exposition : Exposition : Exposition

:11 jours Exposition :11 jours

7 jours 7 jours Canal 1 65.42 ± 5.23 34.86 ± 2.62 62.71 ± 7.71

10.14 ± 1.76 5.00 ± 1.56 5.18 ± 0.6650% Vm = 144 Km = 32

Vm = 964 Km = 45

Vm = 2014 Km = 714

Canal 2 33.17 ± 3.33

Vm = 148 Km = 46

13.59 ± 1.56

Vm = 752 Km = 178

22.78 ± 4.2125% Vm = 529

Km = 158 4.71 ± 0.85 1.71 ± 0.44 1.75 ± 0.62

Canal 3 10%

40.80 ± 1.15

Vm = 169 Km = 49

56.79 ± 5.58 75.33 ± 7.62

Vm = 1941 Km = 29

Vm = 754 Km = 69

5.16 ± 1.48 6.84 ± 1.3 4.55 ± 0.05

Canal 4 Témoin

41.49 ± 7.79

Vm = 157 Km = 46

38.68 ± 3.84

Vm = 1128 Km = 12

79.91 ± 2.75

Vm = 867 Km = 114

5.21 ± 1.49 4.42 ± 0.15 6.13 ± 0.49

Tableau 34. Evolution de l'activité Leucine aminopeptidase. n : nombre de réplicats ; Tx : temps de colonisation en jours ; cell : cellule bactérienne.

La compréhension des mécanismes impliqués lorsqu'un effet significatif de l'effluent est observé est difficile. Celle-ci nécessiterait d'autres mesures, telles que la détermination de la taille des cellules bactériennes ou le dosage des carbohydrates. Toutefois, le calcul des activités spécifiques (résultats par unité de cellules bactériennes) peut aider à la formulation de certaines hypothèses. Ce type de données doit néanmoins être interprété avec prudence, notamment car la séquestration d'enzymes libres dans la matrice polysaccharidique du biofilm peut se traduire par une



augmentation de l'activité spécifique sans pour autant refléter une réelle évolution de l'activité cellulaire [CHAPPELL et GOULDER, 1995].

Dans le canal 1 (50% d'effluent), l'activité de la leucine aminopeptidase surfacique est comparable à T23 et à T34 mais son activité spécifique est environ deux fois plus faible que dans les autres canaux (Tableau 34). Par ailleurs, à cette concentration, l'effluent n'a pas d'effet significatif sur le taux de croissance de la communauté bactérienne. Sachant que l'activité spécifique est inchangée malgré l'augmentation de la densité bactérienne, il se pourrait qu'une concentration de 50% en effluent altère le métabolisme des bactéries ou la structure des enzymes. Par ailleurs, une concentration de 50% en effluent a un effet significatif et négatif sur le taux de développement de la communauté algale. La sénescence des cellules algales entraîne probablement la présence de composés de masses moléculaires importantes, ce qui devrait stimuler l'activité cellulaire, mais ce n'est pas le cas. En conséquence, l'évolution de cette activité serait plutôt expliquée par un effet sur le métabolisme des bactéries ou sur le fonctionnement de l'enzyme mais la présence d'un agent inhibiteur dans l'effluent n'est pas à exclure. Les variations d'activité peuvent aussi être la conséquence d'une combinaison de plusieurs facteurs.

Par ailleurs, l'activité de l'enzyme leucine aminopeptidase de ce biofilm se caractérise par une constante Vmax qui augmente de T23 à T34 et une constante Km qui diminue de T23 à T34. Ces résultats suggèrent que :

la capacité enzymatique du biofilm est inchangée (activité surfacique identique) ;

l'activité potentielle de l'enzyme augmente (augmentation du Vmax) mais l'affinité de l'enzyme avec le substrat diminue (augmentation du Km).

Dans le canal 3 (10% ) et le canal 4 (témoin), l'activité surfacique augmente alors que l'activité spécifique est comparable. L'augmentation de l'activité surfacique est donc probablement liée à l'augmentation de l'effectif bactérien.

4.3.24 Effet de l'effluent sur l'évolution de l'activité enzymatique de la β-D-glucosidase

Préalablement à l'injection de l'effluent, les différences inter-canal de l'activité de la β-D-glucosidase suivent les mêmes tendances que celle de la leucine aminopeptidase : l'activité est la plus forte dans le canal 1 et la plus faible dans le canal 2 (Tableau 35).

Plus généralement, nous pouvons noter que l'intensité de l'activité de la β-D-glucosidase est trois à sept fois plus faible que celle de la leucine aminopeptidase. Cette observation peut être expliquée par la présence de l'enzyme β-D-glucosidase à de plus faibles concentrations ou par une plus faible activité de l'enzyme. Ce dernier point



peut être la conséquence d'une trop faible concentration en substrats susceptibles d'être décomposés par cette enzyme ou par la présence du produit final de la réaction en quantités suffisantes [SABATER et ROMANI, 1996].

β-glucosidase nmol/h/cm2 (n=5)

β-glucosidase nmol/h/109 cell (n=3)

T23 T34 T23 T34

Exposition : 11 jours Exposition :11

jours Canal 1 (50%)

18.18 ± 1.95 3.04 ± 0.30 Vm = 2807 Km = 174

Vm = 79 Km = 52

2.88 ± 0.60 0.25 ± 0.03

Canal 2 4.95 ± 0.49 Vm = 277 Km = 35

3.82 ± 0.98 Vm = 96 Km = 66

0.67 ± 0.05 (25%) 0.30 ± 0.14

Canal 3 (10%)

10.29 ± 1.36 Vm = 703 Km = 114

13.95 ± 1.25 Vm = 394 Km = 140

1.36 ± 0.60 0.84 ± 0.05

Canal 4 (témoin)

11.13 ± 2.87 Vm = 1909 Km = 112

17.16 ± 1.92 Vm = 640 Km = 168

1.59 ± 0.44 1.34 ± 0.05

Tableau 35. Evolution de l'activité β-D-Glucosidase. n : nombre de réplicats ; Tx : temps de colonisation en jours ; cell : cellule bactérienne.

Suite à l'injection de l'effluent, l'activité spécifique de la β-D-glucosidase chute dans tous les canaux sauf dans le canal témoin, ce qui suggère un effet de la présence de l'effluent sur le métabolisme des bactéries ou sur le fonctionnement de l'enzyme.

Le calcul des constantes Vm et Km montre:

une diminution des deux constantes Vm et km du biofilm exposé à 50% d'effluent, ce qui suggère une inhibition non compétitive ; ce phénomène peut être lié à la dégradation de l'enzyme synthétisée [SINSABAUGH et al., 1997] ;

une diminution de l'activité potentielle (baisse du Vmax) et de l'affinité de l'enzyme avec le substrat (augmentation du Km) ;

une affinité comparable de l'enzyme avec le substrat dans le biofilm contenant 10% d'effluent et dans le biofilm témoin.



4.3.3 Effet de l'effluent sur l'évolution de la relation "structure-activité"

4.3.31 Caractérisation de la relation "structure-activité" avant l'injection de l'effluent

Nous nous limitons ici à l'étude des corrélations entres les variables biologiques exprimées par unité de surface car ce sont les plus fréquemment utilisées dans la bibliographie relative à la caractérisation des biofilms. Elle est effectuée à l'aide du calcul du coefficient de Pearson (cf tableaux en annexe).

Avant injection de l'effluent, dans le cas des biofilms développés dans les canaux 1 et 4 une corrélation positive et significative (p < 0,05) est systématiquement observée entre les variables d'activités enzymatiques et les variables de structure, c'est-à-dire la biomasse, la chlorophylle-a et l'effectif bactérien. De telles corrélations ont été mises en évidence sur des biofilms épilithiques dans le cas de l'activité de la β-D-glucosidase [CHRÓST, 1991 ; CHAPPELL et GOULDER, 1994] d'une part, et de l'activité de la leucine aminopeptidase d'autre part [AINSWORTH et GOULDER 2000a]. Ces résultats suggèrent que les relations "structure-activité" sont moins complexes lorsque le biofilm est moins dense et que la communuté n'est pas dominée par sa composante autotrophe ou hétérotrophe (IA respectivement égal à 312 et 217). Cette hypothèse rejoint celle de SABATER et ROMANI (1996) qui montrent que l'activité de la β-D-glucosidase de biofilms colonisés sur substrats artificiels en milieu oligotrophe n'est plus corrélée aux paramètres de structure lorsque l'âge et la complexité des biofilms augmentent.

Par ailleurs, quel que soit le canal, l'activité β-D-glucosidase est positivement corrélée à chlorophylle-a et à la biomasse. Enfin, lorsque la β-D-glucosidase est à la fois corrélée à la chlorophylle-a et à l'effectif bactérien, la corrélation avec la chlorophylle-a est systématiquement supérieure.

Après injection de l'effluent, les tendances sont les suivantes :

Dans le canal contenant 10% d'effluent (canal 3), avant injection, l'activité leucine aminopeptidase était corrélée à l'effectif bactérien. Ce point est inchangé. Quant à l'activité β-D-glucosidase, la corrélation avec la chlorophylle-a était significative et la corrélation avec l'effectif bactérien était non significative. Après, exposition à l'effluent, la situation inverse est observée.

Dans le canal contenant 25% d'effluent (canal 2), avant injection, l'activité leucine aminopeptidase n'était corrélée à aucun des paramètres structurels étudiés ici. Quant à l'activité β-D-glucosidase, celle-ci était corrélée à l'effectif bactérien et à la chlorophylle-a. Ces deux points sont inchangés suite à l'exposition à l'effluent.



Dans le canal contenant 50% d'effluent (canal 1), avant injection, les paramètres de structure sont positivement corrélés aux paramètres d'activités enzymatiques. Après exposition à l'effluent, seule la corrélation avec l'effectif bactérien est significative.

Enfin, quel que soit le canal, les activités β-D-glucosidase et leucine aminopeptidase sont corrélées uniquement à l'effectif bactérien. Avant exposition, l'activité β-D-glucosidase était systématiquement corrélée à la biomasse et à la chlorophylle-a.


Références bibliographiques

Conclusion générale

Laurence Volatier / Thèse en Sciences et Techniques du Déchet / 2003 / Institut national des sciences appliquées de Lyon 245


Dans le cadre de nos recherches, nous avons évalué les effets potentiels d'un effluent complexe caractérisé par une teneur en sels dissous élevée (essentiellement sous forme de NaCl) sur des communautés périphytiques prélevées in situ (bio-essais) et des communautés périphytiques colonisées au laboratoire (canaux artificiels). Ces effets ont été évalués par la mesure de l'évolution de variables biologiques périphytiques, ce qui nous a permis de conclure sur l'utilisation de ces variables comme biodescripteurs d'une pollution riche en chlorures.

Par ailleurs, les réflexions relatives au développement et à l'application des systèmes expérimentaux conçus et mis au point, nous incitent à nous intéresser, au sein de cette conclusion, aux perspectives d'utilisation des bio-essais pour évaluer l'écotoxicité intrinsèque d'un effluent complexe sur une communauté naturelle et aux perspectives d'amélioration et d'application des essais en canaux artificiels. Enfin, nous nous interrogerons sur l'intégration de ces essais dans la méthodologie d'évaluation de l'écocompatibilité des déchets en scénario de stockage et de valorisation proposée par l'ADEME.

1. Effets d'une pollution riches en sels Les effets de la concentration en effluent ont été présentés et synthétisés

au sein du chapitre consacré à l'interprétation des résultats. En conséquence, seules les principales tendances seront ici rappelées. Dans le cas des bio-essais, nous nous limitons à l'étude des biodescripteurs communs aux canaux artificiels.

Les bio-essais ont mis en évidence des effets significatifs et stimulants au printemps, ainsi qu'en été, sur la croissance globale des biofilms (masse organique) en présence de 10 à 70% d'effluent, soit de 2,7 à 18,7 g/L de chlorures. A ces deux saisons, l'évolution de la biomasse algale (chlorophylle-a) est systématiquement stimulée en présence de 10 % d'effluent et aucun effet significatif et inhibiteur n'est observé. De même, les effets sur l'activité de la leucine aminopeptidase sont non significatifs ou stimulants. En hiver, les effets sur la croissance globale des biofilms sont non significatifs et aucun effet stimulant n'est observé sur l'évolution de la biomasse algale. En revanche, des effets significatifs et inhibiteurs sont remarqués en présence de 50 et de 70% d'effluent, soit 13,4 et 18,7 g/L de chlorures. De même, les effets sur l'activité de la leucine aminopeptidase sont significatifs et inhibiteurs en présence de 10% à 50% d'effluent, soit de 2,6 à 13,4 g/L de chlorures, et non significatifs en présence de 70%, soit de 18,7 g/L de chlorures.

Les essais en canaux artificiels conduisent à des effets non significatifs sur la croissance globale des biofilms et la croissance de la communauté



bactérienne quelle que soit la concentration en effluent (10% soit 2,6 g Cl-/L ; 25% soit 6,7 g Cl-/L ; 50% soit 13,4 g Cl-/L). Les effets sur la biomasse algale sont non significatifs, sauf après 7 jours d'exposition à 50% d'effluent. Les effets sur l'activité de la β-D-glucosidase sont significatifs et inhibiteurs en présence de 50% et de 70% d'effluent. En présence de 10% d'effluent, les effets sont globalement significatifs et stimulants ou non significatifs. Les effets sur l'activité de la leucine aminopeptidase sont non significatifs ou significatifs et négatifs en présence de 25% et de 50% d'effluent. En présence de 10% d'effluent les effets sont significatifs et stimulants ou non significatifs.

Une comparaison des résultats des bio-essais et des essais en canaux artificiels est délicate du fait de la différence des systèmes et des communautés périphytiques. Néanmoins, il est intéressant de noter l'absence d'effets significatifs et stimulants sur la croissance globale du biofilm et de la communauté algale dans le cas des essais en canaux artificiels.

Plus généralement, en milieu naturel, l'introduction de grandes quantités de sels, notamment sous la forme de chlorures de calcium, est connue comme pouvant altérer les biocénoses animales et végétales [MAGDICH, 1984 ; SILVA et al., 2000]. Selon HART et al. (1991), une eau peut être considérée comme saline si sa teneur en sels dissous totaux est supérieure à 3 g/L. Dans certains milieux, exposés à des teneurs en sels totaux dissous élevées, les communautés végétales et animales ont développé des mécanismes physiologiques et adaptatifs permettant le maintien de leurs teneurs en eau et en sels dissous dans leurs cellules (HART et al., 1991). Bien que l'effet des chlorures soit plus documenté sur les communautés d'invertébrés benthiques, BROCK (1985), cité par SILVA et al. (2000), évoque l'intolérance de nombreuses espèces algales lorsque les teneurs en sels dissous excèdent 10 à 20 g/L. L'altération de l'activité photosynthétique algale en présence de sels a différentes origines possibles [HART et al., 1991]. A titre d'exemple, nous citerons une modification importante des équilibres osmotiques [CROWTER et HYNES, 1977] ou des échanges gazeux [SILVA et DAVIES, 1997 ; SILVA et DAVIES, 1999]. Inversement, un apport salin modéré peut être bénéfique pour les communautés algales du fait du stress osmotique plus faible et de l'apport en sels nutritifs stimulant les activités métaboliques [SILVA et DAVIES, 1999 ; SILVA et al., 2000]. Cette observation est en accord avec les résultats de nos bio-essais. D'un point de vue taxonomique, l'augmentation de la teneur en sels engendre généralement une modification de la composition spécifique des communautés algales benthiques ou planctoniques. Les espèces les plus tolérantes se développent au détriment des espèces sensibles aux sels [DICKMAN et GOCHNAUER, 1978 ; MARCUS et al., 1984]. Les nombreux travaux de J.F PIERRE dans la Meurthe sur plusieurs années confirment ces observations. Quant aux bactéries, l'augmentation de la salinité du milieu entraîne une modification physiologique qui se traduit par une augmentation de



leur contenu cellulaire en sels inorganiques et en composés organiques. Il semblerait que ces adaptations permettent, entre autres, d'éviter l'altération des enzymes (dénaturation). Ce point pourrait expliquer l'absence d'effets significatifs sur la croissance de la communauté bactérienne dans le cadre de nos essais.

2. Pertinence des biodescripteurs étudiés En bio-essais tout comme en canaux artificiels, la pertinence des

biodescripteurs étudiés a été démontrée. Cette conclusion est, en théorie, inhérente à la composition de l'effluent testé mais ces biodescripteurs étant, pour la plupart, déjà communément étudiés pour l'évaluation de perturbations chimiques très variées (pesticides, rejets des stations d'épuration, effluents de papeterie), nos conclusions ne font que confirmer leur intérêt.

En revanche, nos essais en canaux artificiels mettent en évidence l'intérêt de la composition de la communauté bactérienne comme biodescripteur d'une perturbation riche en chlorures. La sensibilité de cette communauté, ainsi que sa capacité à discriminer différents niveaux de perturbation (concentration en chlorures) constituent un atout majeur dans la détection de ce type de pollution et dans l'évaluation de ses effets. A présent, il serait intéressant de valider nos conclusions par des essais menés in situ et de tester la pertinence de ce biodescripteur pour l'évaluation de perturbations d'origine et/ou de nature différentes. Enfin, nous tenons à souligner que l'utilisation de la PCR-DGGE, dans cet objectif, permet de traiter un nombre important d'échantillons et de travailler sur des échantillons congelés immédiatement après leur prélèvement, ce qui limite l'évolution des communautés durant leur transport et offre la possibilité de différer les analyses selon la convenance de l'utilisateur.

Par ailleurs, les résultats des essais en bio-essais et en canaux artificiels confirment l'intérêt d'associer des biodescripteurs structurels, tels que la biomasse totale, algale et bactérienne à des biodescripteurs fonctionnels, telles que les activités de production/respiration ou d'hydrolyse enzymatique. Les descripteurs fonctionnels sont plus spécifiques et répondent rapidement à un stress chimique. Inversement, les paramètres de structure constituent des biodescripteurs globaux résultant de la combinaison de nombreux processus fonctionnels. A ce titre, la réponse d'un biodescripteur fonctionnel ne s'accompagne pas nécessairement d'une modification structurelle de la communauté périphytique. Cette tendance est d'ailleurs très nette dans les bio-essais.



3. Perspectives d'utilisation des bio-essais

Selon notre point de vue, les bio-essais sont de bons outils pour évaluer l'écotoxicité d'un effluent sur une communauté périphytique naturelle prélevée in situ, et de ce fait représentative des espèces d'un site d'étude. L'interprétation de ces essais pourrait, par ailleurs, reposer sur le calcul des concentrations en effluent pour lesquelles l'effet sur les paramètres biologiques suivis (croissance, photosynthèse...) serait de 50%. Il s'agit des concentrations dites "concentrations efficaces ou inhibitrices" entraînant 50% d'effet. Cette approche a d'ailleurs été adoptée par différents auteurs [BLANCK, 1985; GUASH et al., 1997 ; GUASH et al., 1998]. Néanmoins, il est évident que ces essais sont moins adaptés que les tests d'écotoxicité mono-spécifiques "classiques" menés sur des espèces de laboratoire pour la classification des déchets ou des effluents vis-à-vis de leurs caractéristiques écotoxiques intrinsèques. En effet, le fait de travailler sur une communauté naturelle a pour inconvénient de moins bien maîtriser l'état de santé et, plus généralement, "l'histoire" des organismes collectés et soumis aux essais.

Afin de "standardiser" la mise en oeuvre des bio-essais, nous recommandons fortement l'utilisation de substrats artificiels, ceci afin de limiter l'hétérogénéité spatiale de la colonisation des biofilms (cf Partie 1, chapitre 1). De plus, l'utilisation de supports artificiels est particulièrement intéressante lorsque :

la zone d'étude ne permet pas de collecter des substrats naturels de même nature et de même taille en quantité suffisante ;

la stabilité du lit, la hauteur d'eau ou la vitesse du courant ne permettent pas de se déplacer ;

la sensibilité des biofilms est évaluée à différents stades de sa colonisation.

Par ailleurs, la collecte sur substrats artificiels permet un prélèvement dans tous les types de milieux aquatiques et ne limite pas nos essais à l'étude des communautés périphytiques de milieux lotiques d'eau douce.

Les principaux inconvénients des substrats artificiels sont qu'ils nécessitent du matériel supplémentaire, qu'ils imposent davantage d'allers et retours sur le terrain (installation, surveillance, collecte), qu'ils sont sujets au vandalisme et qu'ils ne peuvent pas prétendre remplacer les substrats naturels.

Pour conclure, les bio-essais sont aisément mis en oeuvre et nécessitent du matériel de laboratoire très classique ; les investissements humains et financiers restent modérés. Enfin, nous conseillons de réaliser au minimum deux campagnes : la première au printemps et la seconde en hiver car les peuplements



sont très différents. La réponse des biofilms soumis à un stress chimique est la résultante des réponses des espèces qui le composent. La composition spécifique varie en fonction des saisons et, de ce fait, les réponses des communautés périphytiques diffèrent. Cette différence se ressent non seulement vis-à-vis de chaque biodescripteur mais aussi vis-à-vis de la relation "structure-activité". Par ailleurs, l'évolution de la sensibilité des biofilms en fonction des saisons peut aussi s'expliquer par des états "physiologiques" différents. Dans le cas de la Meurthe, par exemple, la température varie fortement en été et en hiver.

4. Améliorations et utilisations des canaux artificiels L'utilisation des canaux artificiels en écotoxicologie nécessite de

réduire l'hétérogénéité inter-canal car les effets sont fréquemment évalués par référence à un canal témoin. Nous l'avons vu, la variabilité inter-canal n'empêche pas l'interprétation des résultats mais elle la complique.

Pour limiter la variabilité de nos systèmes, nous suggérons les solutions suivantes :

le milieu d'essai doit être commun jusqu'au moment de l'injection de l'effluent [Mc INTIRE et al., 1964 ; HORNER et al., 1990 ; CROSSLAND et al., 1991 ; GENTER et AMYOT, 1994 ; LOWE et al., 1996]. La circulation du milieu entre les différents systèmes a mis en évidence de nombreuses fois la diminution de la variabilité inter-systèmes [CAQUET et al., 2000].

si un réservoir d'alimentation commun est utilisé, il est judicieux de le maintenir sous agitation permanente pour une meilleure homogénéisation du milieu d'essai [REITER, 2001].

la régulation de température permettre une température identique dans tous les canaux ; lorsque l'environnement immédiat est susceptible d'induire des écarts de température entre les systèmes, il est préférable d'opter pour une régulation de l'eau de chaque canal.

l'espace dans lequel est placé le dispositif doit être suffisamment grand pour que les canaux soient loin des murs et puissent bénéficier d'un "environnement" identique.

l'inoculum doit probablement être renouvelé en cours d'essai avant injection du polluant [DUBÉ et CULP, 1996]. En outre, il pourrait être bénéfique de prélever du biofilm dans chaque canal,



de le regrouper et de le redistribuer ensuite dans les quatre canaux pour une homogénéisation du peuplement d'un canal à l'autre.

Notons que LOWE et al. (1996) obtiennent des systèmes très homogènes (CV<6%) dans des rivières artificielles placées à l'intérieur, fonctionnant en circuit ouvert et alimentées par un bac commun recevant de l'eau de rivière.

L'utilisation des canaux artificiels pour étudier certaines propriétés des

écosystèmes naturels nous semble très intéressante (cf Partie 1, chapitre 1). Comme nous l'avons vu précédemment, ils constituent, selon notre point de vue un lien entre deux essais de complexité différente (essais en laboratoire-études in situ, par exemple).

Lorsque les canaux artificiels sont utilisés dans cet objectif, de nombreux auteurs s'interrogent sur leur capacité à simuler une rivière naturelle. Selon CROSSLAND et al. (1991), une rivière artificielle doit contenir les différentes composantes biologiques impliquées dans le fonctionnement des cours d'eau, c'est-à-dire les producteurs primaires, les consommateurs primaires et secondaires, les prédateurs situés au sommet de la chaîne trophique (prédateurs des poissons) et les décomposeurs. Pour DEBUS et al. (1996), les rivières artificielles peuvent "simuler" les conditions naturelles si leur taille et leur complexité sont suffisantes pour assurer le maintien des caractéristiques et des fonctions écologiques fondamentales. Ceci inclut : différents niveaux trophiques, une diversité des habitats suffisante et la mise en place des cycles de matières nutritives. Ce point de vue reprend la notion de complexité biologique préalablement évoquée par CROSSLAND et al. (1991) mais inclut aussi la complexité du biotope ("diversité des habitats"). Selon CARPENTER (1996) la durée de l'essai est l'un des paramètres les plus déterminants sur le réalisme des résultats car elle peut exclure ou altérer certaines propriétés des communautés ou des écosystèmes.

De notre point de vue, le réalisme de l'essai est une notion relative et subjective fonction des critères portant sur la complexité de l'écosystème expérimental artificiellement développé (biotope, biocénose) et des caractéristiques de l'essai. Ces critères sont les suivants :

la complexité du biotope : diversité des habitats au sein des compartiments physiques représentés (sédiment, colonne d'eau) ;

la complexité de la biocénose : représentation des différents niveaux trophiques, diversité des communautés structurelles et fonctionnelles ;

la mise en place des processus fondamentaux des écosystèmes lotiques tels que le recyclage de la matière ;



les caractéristiques des canaux artificiels : longueur, volume, emplacement ;

le mode de fonctionnement des canaux (taux de renouvellement du milieu) et la nature du milieu d'essai ;

la durée de l'essai.

Bien que ces critères soient cités isolément, nous soulignerons l'étroite dépendance de certains d'entre eux. A titre d'exemple, il est évident que la diversité des habitats favorise la diversité de la communauté.

Plus généralement, notre avis est que les systèmes artificiels ne doivent pas être perçus comme une copie du milieu naturel, et ceci, quel que soit leur degré de réalisme. Que les rivières artificielles soient inférieures à 1 m ou supérieures à 500 m, qu'elles contiennent une ou plusieurs composantes biotiques des écosystèmes lotiques, elles n'en demeurent pas moins une représentation simplifiée du milieu naturel. Les conditions expérimentales en systèmes artificiels diffèrent forcément des conditions d'exposition en milieu naturel [SUDERMAN et THISTLE, 2003]. Elles imposent une restriction spatiale importante et simplifient la complexité des conditions de vie des organismes en milieu naturel [FRASER et KEDDY, 1997], ce qui peut engendrer l'émergence de propriétés propres à ces systèmes.

Enfin, la complexité des essais en canaux artificiels est double. Elle provient de la complexité du milieu (biotope et biocénose) et de la difficulté de contrôle des paramètres externes influents sur l'évolution des variables biologiques mesurées. Quatre types de facteurs externes peuvent être distingués :

les facteurs contrôlés et fixés ; les facteurs contrôlés et variables, ce sont généralement les

facteurs dont l'effet est étudié ; les facteurs non contrôlés mais fixes ; les facteurs non contrôlés (connus ou inconnus) et variables dans

l'espace ou dans le temps.

Il est évident que l'augmentation des facteurs non contrôlés est une source de confusion. Plus les essais sont effectués en conditions "réalistes", plus ce risque d'erreur est grand. CRANE et al. (1999) résument cela en expliquant que, dans le domaine de l'écotoxicologie, les scientifiques devraient chercher à concevoir des outils prédictifs aussi simples que possible et aussi complexes que nécessaire. Selon notre point de vue, l'utilisation de canaux artificiels est justifiée lorsque le système expérimental est plus réaliste que les bio-essais de laboratoire et moins complexe à interpréter que les essais in situ.

Ces réflexions conduisent aux questions suivantes :



la taille des systèmes est-elle ou non une garantie de réalisme ? Si oui, quelle est la taille minimale nécessaire ? Pour RODGERS et al. (1996) la taille des canaux doit être suffisante pour étudier les effets des paramètres étudiés. Cette vérité n'aide pas vraiment à dimensionner les systèmes expérimentaux mais elle montre que la taille doit être définie selon des critères spécifiques et propres à l'étude et à ses objectifs.

les données provenant des essais multi-spécifiques ou des essais menés à l'échelle de la communauté peuvent-elles être extrapolées aux écosystèmes naturels avec plus de certitudes que les essais mono-spécifiques ? cette question a été formulée par CAIRNS et PRATT (1993) ;

comment extrapoler les données expérimentales aux écosystèmes naturels sachant que tous les écosystèmes sont différents et, a fortiori, qu'ils ne répondent pas de manière identique à un même stress ?

5. Propositions pour la méthode Ecocompatibilité

Comme il est montré ci-dessus les bio-essais et les essais en canaux artificiels présentent des avantages différents. Pour cette raison, il est difficile d'en éliminer un au profit de l'autre. Dans le cadre de la méthode Ecocompatibilité, l'évaluation des effets sur le périphyton pourrait comprendre deux niveaux : une évaluation systématique au moyen des bio-essais et, dans le cas de scénarios plus complexes uniquement, des essais en canaux artificiels. Dans ce contexte, les essais en canaux artificiels sont incontournables lorsqu'il s'agit :

de scénarios présentant des expositions intermittentes ; de scénarios où l’exposition de l'effluent est couplée à des

variations de régime hydraulique (crues, lâchés de barrage…) ; de scénarios où l’exposition à l'effluent est combinée à des

variations de température (effluents industriels à haute température…) ;

de scénarios qui imposent la prise en compte d'autres composantes abiotiques du système aquatique (sédiment).

Pour ces scénarios, l'étude de l'effet "concentration en effluent" doit être couplée à l'étude d'une ou de plusieurs autres variables dont la réponse est a



priori d'importance. Les canaux artificiels sont également nécessaires pour le suivi des effets sur les processus de colonisation mais aussi pour distinguer les effets immédiats (mortalité directe), des effets différés (remaniement des communautés, récupération…). En d'autre termes, les essais en canaux artificiels sont non seulement plus adaptés que les bio-essais pour l'étude de scénarios plus complexes mais aussi lorsque l'on souhaite une étude plus approfondie des effets.

Pour conclure, nous anticiperons sur la question suivante : les bio-essais ne peuvent-ils pas être adaptés à l'étude de scénarios plus complexes ? Selon notre point de vue, il est vrai que les bio-essais pourraient être améliorés, notamment par la mise en place d'une circulation du milieu (caractéristique fondamentale des milieux lotiques !). Mais, notre réponse est la suivante : l'un des intérêts des bio-essais est précisément leur simplicité de mise en oeuvre.



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WILHEM C., VOLKMAR P., LOHMANN C. et al. A quantitative method based on HPLC-aided pigment analysis to monitor structure and dynamics of the phytoplankton assemblages - A study from lake Meerfelder Maar (Eifel, germany). Archiv für Hydrobiologie, 1991, vol 123, pp. 21-35.

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ZHENG T., HONG H., WANG F. et al. The distribution characteristics of bacterial β-glucosidase activity in Taiwan strait. Marine Pollution Bulletin, 2002, vol 45, pp.168-176.


Annexes.


Annexe 1. Relations "structure-activité"


Avant injection

Canal 1 β-Gluc Leu-amp Biomasse Effectif bactérien Chloro-a

β-Gluc 1 0.99** 0.98** 0.93* 0.96* Leu-amp 1 0.98** 0.93* 0.94* Biomasse 1 0.96* 0.90* Effectif bactérien 1 NS Chloro-a 1 Tableau 36. Corrélations entre variables surfaciques du canal 1 (T17, T23). β-Glc : β-D-glucosidase ; Leu-amp : leucine aminopeptidase ; chloro-a : chlorophylle-a ; * : p < 0.05 ; **p < 0.001 ; NS : corrélation non significative.


β-Gluc 1 NS 0.91* 0.92* 0.93* Leu-amp 1 NS NS NS Biomasse 1 0.94* 0.89* Effectif bactérien 1 0.90* Chloro-a 1 Tableau 37. Corrélations entre variables surfaciques du canal 2 (T17, T23). β-Glc : β-D-glucosidase ; Leu-amp : leucine aminopeptidase ; chloro-a : chlorophylle-a ; * : p < 0.05 ; **p < 0.001 ; NS : corrélation non significative.


β-Gluc 1 0.93* 0.99** NS 0.94* Leu-amp 1 0.92* 0.83* NS Biomasse 1 NS 0.95* Effectif bactérien 1 NS Chloro-a 1 Tableau 38. Corrélations entre variables surfaciques du canal 3 (T17, T23). β-Glc : β-D-glucosidase ; Leu-amp : leucine aminopeptidase ; chloro-a : chlorophylle-a ; * : p < 0.05 ; **p < 0.001 ; NS : corrélation non significative. Canal 4 β-Gluc Leu-amp Biomasse Effectif bactérien Chloro-a

β-Gluc 1 0.99** 1** 0.99** 1** Leu-amp 1 1** 0.87* 0.99** Biomasse 1 0.85* 1** Effectif bactérien 1 0.85* Chloro-a 1 Tableau 39. Corrélations entre variables surfaciques du canal 4 (T17, T23). β-Glc : β-D-glucosidase ; Leu-amp : leucine aminopeptidase ; chloro-a : chlorophylle-a ; * : p < 0.05 ; **p < 0.001 ; NS : corrélation non significative.


Après injection Canal 1 β-Gluc Leu-amp Biomasse Effectif bactérien Chloro-a

β-Gluc 1 0.90** NS 0.80* NS Leu-amp 1 NS 0.83* NS Biomasse 1 NS 0.85* Effectif bactérien 1 NS Chloro-a 1 Tableau 40. Corrélations entre variables surfaciques du canal 1 après exposition. β-Gluc : β-D-glucosidase ; Leu-amp : leucine aminopeptidase ; chloro-a : chlorophylle-a ; * : p < 0.05 ; **p < 0.001 ; NS : corrélation non significative.


β-Gluc 1 NS NS 0.67* 0.73* Leu-amp 1 NS NS NS Biomasse 1 NS NS Effectif bactérien 1 NS Chloro-a 1 Tableau 41. Corrélations entre variables surfaciques du canal 2 après exposition. β-Glc : β-D-glucosidase ; Leu-amp : leucine aminopeptidase ; chloro-a : chlorophylle-a ; * : p < 0.05 ; **p < 0.001 ; NS : corrélation non significative.


β-Gluc 1 0.84* NS 0.98** NS Leu-amp 1 NS 0.81* NS Biomasse 1 NS NS Effectif bactérien 1 NS Chloro-a 1 Tableau 42. Corrélations entre variables surfaciques du canal 3 après exposition. β-Gluc : β-D-glucosidase ; Leu-amp : leucine aminopeptidase ; chloro-a : chlorophylle-a ; * : p < 0.05 ; **p < 0.001 ; NS : corrélation non significative. Canal 4 β-Gluc Leu-amp Biomasse Effectif bactérien Chloro-a

β-Gluc 1 0.98** NS 0.95** NS Leu-amp 1 NS 0.94** NS Biomasse 1 0.77* 0.95** Effectif bactérien 1 0.75* Chloro-a 1 Tableau 43. Corrélations entre variables surfaciques du canal 4 après exposition. β-Gluc : β-D-glucosidase ; Leu-amp : leucine aminopeptidase ; chloro-a : chlorophylle-a ; * : p < 0.05 ; **p < 0.001 ; NS : corrélation non significative.


Annexe 2. Analyse en composantes principales


DELOLME CUBIZOLLES Cecile. L’analyse en composantes principales. Annexe V. In Le traitement des ordures menageres en decharge a la chaux vive. Effets sur les carateristiques physico-chimiques et bacteriologiques des lixiviats Thèse. Gestion et traitement des dechets. Lyon : INSA de Lyon, 1994


Annexe 3. Evaluation de l'Ecocompatibilité des déchets


GRELIER-VOLATIER L., HUGREL C., PERRODIN Y., CHATEAU L. Evaluation de l’écocompatibilité de déchets mis en dépôts ou valorisés en travaux publics : une méthode pluridisciplinaire pour une approche « en scénario ». Revue des Sciences de l’Eau, 2002, vol. 15, n° spécial, 57-66.


Réponse d'une communauté périphytique à un effluent complexe :...

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