RÉGULATION DES GÈNES DE L’HÔTE PAR LES MICROARN …
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JIMMY VIGNEAULT-EDWARDS RÉGULATION DES GÈNES DE L’HÔTE PAR LES MICROARN DÉRIVÉS DE L’ÉLÉMENT TAR DU VIH-1 Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en Biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.) FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC 2013 © Jimmy Vigneault-Edwards, 2013
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JIMMY VIGNEAULT-EDWARDS
RÉGULATION DES GÈNES DE L’HÔTE PAR LES
MICROARN DÉRIVÉS DE L’ÉLÉMENT TAR DU VIH-1
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Biologie cellulaire et moléculaire
pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2013
© Jimmy Vigneault-Edwards, 2013
i
I. Résumé
Les microARN (miARN) sont des acides ribonucléiques (ARN) endogènes,
d’environ 19 à 24 nucléotides (nt), produits lors du clivage d’une structure d’ARN en forme
de tige-boucle par la ribonucléase III (ARNase III) Dicer. Il a été rapporté que le virus de
l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), en période de latence dans les
lymphocytes T CD4+, produit un court transcrit d’ARN appelé « Trans-Activation Response
element » (TAR) et que celui-ci est sujet au clivage par Dicer, ce qui génère deux miARN
fonctionnels, soit miR-TAR-5p et miR-TAR-3p. Il a donc été suggéré que les miARN
dérivés de TAR pourraient jouer un rôle dans la latence du VIH-1. L’objectif, au cours de
ma maîtrise, était de déterminer le rôle potentiel de ces miARN dans la régulation de
l’expression des gènes de l’hôte en utilisant les cellules en culture J-lat et Jurkat exprimant
miR-TAR-5p et miR-TAR-3p de manière stable. Suite à cela, une analyse protéomique
grande échelle iTRAQ a été effectuée pour tenter de faire la lumière sur le rôle potentiel des
miARN dérivés de l’ARN TAR du VIH-1.
En conclusion, il a été montré que la majorité des protéines d’intérêts sont
réfractaires à une régulation génique par les miARN. Par contre, ceci ne supporte pas l’idée
que ces miARN ne possèdent aucun rôle, d’où l’importance des résultats protéomiques qui
ont montré que plusieurs protéines sont potentiellement régulées par les miARN viraux.
ii
II. Avant-propos
J’aimerais remercier les membres de ma famille qui m’ont toujours supporté au
cours de ma vie et dans les divers choix que j’ai pu effectuer. Je remercie tout
particulièrement mon père Romulus qui m’a inculqué les précieuses valeurs que je possède
aujourd’hui et qui font l’homme que je suis. Merci Mulus ! Je remercie aussi tous mes
précieux amis qui m’ont toujours encouragé : Simon, Guillaume, Anthony, Marc-André,
Charles, Emy, Bertrand et Édith.
Je remercie aussi la gang de karaté Shotokan Sainte-Foy et Gilles : vous êtes pour
moi une deuxième famille. Peu importe l’endroit où je serai plus tard, vous serez toujours
dans mon cœur.
Finalement je remercie toute l’équipe du laboratoire avec qui j’ai travaillé : Patrick,
de m’avoir accueilli dans ton laboratoire; Patricia, Hélène, Aurélie, Geneviève et Marjorie,
vous m’avez écouté, conseillé, consolé, encouragé et… botté le cul ! Je remercie aussi
Dominique Ouellet pour ses précieux conseils et pour le matériel qu’elle a préparé au cours
de son doctorat, ainsi que Lise-Andrée Gobeil et Jésus Jérôme Lacroix qui, par leurs
expérimentations, ont permis l’élaboration de mon projet de maîtrise.
Vitam Impendere Vero
iii
Je dédie ce mémoire à mon père Romulus…
iv
III. Table des matières
I. Résumé ................................................................................................................................... i
II. Avant-propos .......................................................................................................................ii
III. Table des matières............................................................................................................. iv
IV. Liste des figures et tableau ................................................................................................ v
V. Abréviations ......................................................................................................................vii
Chapitre 1.................................................................................................................................. 1
Introduction .............................................................................................................................. 1
1.1 La voie des microARN ...................................................................................................... 1
1.1.1 Historique et découverte............................................................................................. 1
1.1.2 Définition et caractéristiques des miARN................................................................. 2
1.1.3 La voie des miARN .................................................................................................... 4
1.1.3.1 La transcription des gènes de miARN ............................................................... 5
1.1.3.2 Le complexe Microprocesseur............................................................................ 5
1.1.3.2.1 La ribonucléase III Drosha .......................................................................... 6
1.1.3.2.2 Le cofacteur DiGeorge syndrome Chromosomal Region 8 (DGCR8) ..... 7
1.1.3.3 L’export du pré-miARN au cytoplasme par l’Exportin-5 ................................ 8
1.1.3.4 La ribonucléase III Dicer .................................................................................... 9
1.1.3.5 Le cofacteur « TAR RNA-Binding Protein » (TRBP) ..................................... 11
1.1.3.6 Le cofacteur « Fragile X Mental Retardation Protein » (FMRP) .................. 12
1.1.3.7 Le complexe effecteur ....................................................................................... 13
1.1.3.7.1 Les protéines Argonautes (Ago) ............................................................... 13
1.1.3.7.2 Les complexes ribonucléoprotéiques contenant des miARN (miRNP) . 14
1.2 Les miARN et les virus ................................................................................................... 15
1.2.1 Aperçu général .......................................................................................................... 15
1.2.1.1 Les virus à ADN et leurs miARN .................................................................... 16
1.2.2 Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) ................................ 16
1.2.2.1 La biologie du VIH-1 ........................................................................................ 16
1.2.2.2 Le cycle réplicatif du VIH-1 ............................................................................. 18
1.2.2.2.1 La primo-infection ..................................................................................... 18
1.2.2.2.2 La phase de latence clinique ...................................................................... 18
1.2.2.2.3 La phase SIDA ........................................................................................... 19
1.2.3 Le VIH-1 et la voie des miARN .............................................................................. 19
1.2.3.1 Changement du profil d’expression des miARN cellulaires relié à l’infection
au VIH-1 ......................................................................................................................... 19
1.2.3.2 Le ciblage du VIH-1 par des siARN exogènes ............................................... 21
1.2.3.3 Le ciblage du VIH-1 par la voie des microARN ............................................. 22
1.2.3.4 Les miARN dérivés du VIH-1 .......................................................................... 24
v
1.2.3.5 Les miARN de TAR.......................................................................................... 26
1.3.1 Hypothèse .................................................................................................................. 27
1.3.2 Objectif de recherche ................................................................................................ 27
Chapitre 2................................................................................................................................ 29
Régulation des gènes de l’hôte par les miARN dérivés de l’élément TAR du VIH-1 ...... 29
2.1 Matériels et méthodes ...................................................................................................... 29
2.1.1 Amplification des gènes par PCR ............................................................................ 29
2.1.2 Clonage moléculaire ................................................................................................. 29
2.1.3 Transformation des bactéries compétentes ............................................................. 31
2.1.4 Amplification de l’ADN plasmidique ..................................................................... 31
2.1.5 Analyse de restriction et séquençage ....................................................................... 32
2.1.6 Maintien en culture des cellules HEK 293 et Jurkat .............................................. 32
2.1.7 Transfection des cellules HEK 293 par précipitation au phosphate de calcium ... 33
2.1.8 Essais des gènes rapporteurs .................................................................................... 34
2.1.9 Lyse des cellules Jurkat et détection des protéines d’intérêt par
immunobuvardage .............................................................................................................. 34
2.1.10 Essai de protection aux ARNases («RNase protection assay»;RPA) ................. 36
2.1.11 Analyses protéomiques par spectrométrie de masse ............................................ 37
2.2 Résultats............................................................................................................................ 38
2.2.1 Essais de régulation génique par les miARN dérivés de l’élément TAR
du VIH-1 ............................................................................................................................. 43
2.2.2 Induction à la Prostratine des cellules J-lat et immunobuvardage ......................... 48
2.2.3 Analyse des lignées de cellules Jurkat exprimant le shTAR de manière stable ... 50
2.2.3.1 Détection des miARN libérés dans les cellules Jurkat-shTAR ...................... 50
2.2.3.2 Analyses par immunobuvardage de type western ........................................... 52
2.2.3.3 Analyses protéomiques iTRAQ des Jurkats stables ........................................ 54
2.2.3.3.1 Résultats de l’analyse protéomique iTRAQ ............................................. 54
2.2.3.3.2 Analyses bio-informatiques des nouvelles cibles potentielles ................ 58
Chapitre 3................................................................................................................................ 61
Discussion générale ................................................................................................................ 61
Chapitre 4................................................................................................................................ 75
Conclusion et perspectives .................................................................................................... 75
Bibliographie .......................................................................................................................... 78
IV. Liste des figures et tableau
Figure 1. Représentation schématique de la voie des miARN .............................................. 5
vi
Figure 2. Structure des domaines de la ribonucléase de classe II Drosha ............................ 7
Figure 3. Structure des domaines de la ribonucléase de classe III Dicer............................ 10
Figure 4. Modèle du clivage catalytique des précurseurs de miARN par Dicer ................ 10
Figure 5. Présentation schématique de l’emplacement des différents miARN dérivés du
génome du VIH-1 ................................................................................................................... 24
Figure 6. Séquence et conformation de l’ARN TAR du VIH-1 .......................................... 26
Figure 7. Schéma de la voie de l’apoptose dans les cellules humaines .............................. 40
Figure 8. Sites de liaison potentiels pour les miARN miR-TAR-5p et miR-TAR-3p dans
les ARNm potentiellement régulés, en relation avec l’analyse protéomique iTRAQ ...... 43
Figure 9. Validation fonctionnelle des sites de liaison aux miARN de l’ARN TAR du VIH-
1 dans les ARNm de facteurs pro-apoptotiques ................................................................... 44
Figure 10. Validation fonctionnelle des sites de liaison aux miARN de l’ARN TAR du
VIH-1 présents dans le 3’UTR de l’ARNm de BBC3/Puma .............................................. 46
Figure 11. Validation des sites de liaison potentiels (BS) aux miARN de TAR dans le
3’UTR de Procaspase-8 ......................................................................................................... 47
Figure 13. Expression protéique des différentes cibles potentielles de miR-TAR-5p/3p dans
les cellules exprimant l’ARN TAR et induites à la Prostratine ........................................... 50
Figure 14. Détection des miARN libérés dans les Jurkat-shTAR ....................................... 51
Figure 15. Expression protéique des différentes cibles potentielles de miR-TAR-5p/3p
dans les cellules Jurkat exprimant le shTAR de manière stable ........................................ 53
Figure 16. Résultats de l’analyse protéomique iTRAQ des cellules Jurkat-shTAR cl.1 ... 54
Figure 17. Résultats de l’analyse protéomique iTRAQ des cellules Jurkat-shTAR cl.3 ... 57
Figure 18. Résultats de l’analyse protéomique iTRAQ des cellules Jurkat-shTAR cl.4 ... 58
Figure 19. Sites de liaison des miARN miR-TAR-5p et miR-TAR-3p dans les ARNm
étant potentiellement régulés, en relation à l’analyse protéomique iTRAQ ...................... 60
Tableau 1. Séquence des différents oligonucléotides d’ADN utilisés pour le clonage
moléculaire des cibles de miR-TAR-5p/3p .......................................................................... 30
vii
V. Abréviations
ADN Acide désoxyribonucléique
Ago « Argonaute »
ARN Acide ribonucléique
ARNm ARN messager
ARNdb ARN double brin
ARNsb ARN simple brin
ARNt ARN de transfert
A. thaliana Arabidopsis thaliana
C. elegans Caenorhabditis elegans
CHS « Chalcone synthase »
DGCR8 «DiGeorge syndrome critical region 8»
DGS «Di George syndrome»
DUF «Domain of unknown function»
DsRBD «Double-stranded RNA binding domain»
EBV «Epstein-Barr Virus»
HSV-1 «Herpes simplex virus 1»
HTLV-1 «Human T Lymphotropic Virus 1»
iARN Interférence à l’ARN
kDa Kilodalton
LTR «Long terminal repeat»
mg Milligramme
miARN MicroARN
miRNP «MicroRNA ribonucleoprotein complex»
ng Nanogramme
nt Nucléotides
PAZ PIWI-Argonaute-Zwille
Pré-miARN Pré-microARN
PC8 Pro-Caspase-8
PCR «Polymerase chain reaction»
PRR «Proline-rich region»
PTGS «Post-transcriptional gene silencing »
RAKE «RNA-primed Array-based Klenow Enzyme»
RISC «RNA-induced silencing complex»
RLUC «Renilla Luciferase»
RNase Ribonucléase
RPM Révolutions par minute
shRNA «Short hairpin RNA»
siRNA «Small interfering RNA»
TAR «Trans-activating response»
μg Microgramme
UTR «Untranslated region»
VIH-1 Virus de l’immunodéficience humaine de type
1
Chapitre 1.
Introduction
1.1 La voie des microARN
1.1.1 Historique et découverte
Ce fut en 1990 qu’un premier cas d’interférence à l’ARN a été découvert, et ce sans
même le savoir encore. Les travaux de Napoli et al. [1] consistaient à étudier la biosynthèse
des anthocyanes, un pigment naturel produit chez les feuilles du pétunia leur conférant une
couleur pourpre. Les chercheurs ont démontré que la chalcone synthase (CHS) est l’enzyme
limitante dans la formation des anthocyanes du maïs [1]. L’équipe de Napoli a décidé de
surexprimer le gène CHS chez le pétunia afin de déterminer son importance dans la
synthèse biochimique de cette fameuse couleur pourpre. Les chercheurs ont été stupéfaits
de voir que l’expression du transgène ne donnait pas une couleur pourpre comme attendu,
mais plutôt une couleur blanche caractéristique d’une absence d’anthocyane. Les analyses
effectuées sur ces plantes ont montré qu’il y avait une réduction de 50 fois du niveau des
ARN messagers (ARNm) du transgène. Ces résultats démontraient que l’introduction d’un
transgène chez la plante engendre à la fois l’inhibition de l’expression du gène endogène et
du transgène; les chercheurs ont nommé ce phénomène « co-suppression » [2, 3].
En 1991, l’équipe de Wightman et al. [4] ont découvert un élément de régulation
dans la région 3’ non-traduite (3’UTR) de l’ARNm de lin-14 (un gène important dans le
développement de C. elegans) et que l’élimination de celui-ci engendre une augmentation
du niveau de la protéine lin-14p [4]. En fait, cette régulation est médiée par lin-4, un court
2
transcrit d’ARN ciblant le 3’UTR de l’ARNm lin-14 via sept sites de liaison différents, qui
engendre une diminution de la traduction de cette protéine d’un facteur de 10 alors que le
niveau de son ARNm reste toujours stable [5, 6].
L’équipe de Fire et al. (1998) ont ensuite déterminé qu’un ARN double brin est
beaucoup plus efficace pour médier l’interférence à l’ARN que les brins sens et anti-sens
pris individuellement ou en combinaison. Ils ont aussi démontré que le phénomène
d’interférence à l’ARN est un processus s’effectuant de manière post-transcriptionnelle [7,
8]. L’année suivante, Hamilton et Baulcombe (1999) ont découvert que l’agent effecteur clé
de la régulation post-transcriptionnelle (« posttranscriptional gene silencing », PTGS ) est
un court transcrit d’ARN d’environ 25 nt et que celui-ci assure la spécificité de la
régulation par un appariement ARN anti-sens : ARNm [9].
C’est en octobre 2001, lorsque trois équipes de recherche indépendantes ont publié leurs
travaux sur les petits ARN régulateurs endogènes dans la revue Science, qu’il y eu un
consensus pour nommer ces petits ARN interférant endogènes, d’une longueur de 19-24 nt,
microARN (miARN) [10-12].
Dix ans plus tard, la recherche sur les miARN est toujours aussi actuelle, que ce soit
sur les mécanismes par lesquels ils médient leurs actions, leurs rôles dans le
développement, leurs liens avec les maladies humaines ou leurs diverses interactions avec
les virus. C’est pourquoi j’ai consacré mes travaux de maîtrise à l’étude des interactions
entre ceux-ci et les virus, plus particulièrement avec le Virus de l’Immunodéficience
Humaine de type 1 (VIH-1).
1.1.2 Définition et caractéristiques des miARN
3
Les miARN sont reconnus pour jouer un rôle important dans la régulation des gènes
chez les plantes et les animaux. Tous les différents miARN identifiés à ce jour sont
répertoriés dans miRBase (site web : http://www.mirbase.org). La plus récente version du
site (miRBase version 19.0, août 2012) montre l’existence de plus de 2042 miARN chez
l’humain, de 1281 miARN chez la souris, de 368 miARN chez C. elegans et de 338
miARN chez A. thaliania [13-15].
Les miARN sont de petits ARN non-codants, d’une longueur de 19 à 24 nt, qui sont
reconnus pour jouer un rôle crucial dans la régulation d’une multitude de processus
cellulaires, notamment l’apoptose, la différentiation neuronale, l’hématopoïèse, la
prolifération cellulaire et la tumorigénèse [16].
Les miARN sont exprimés de différentes manières, soit constitutives, temporelles et
spatiales. Par exemple, chez C. elegans, les miARN miR-13b-1 et miR-13b-2 sont
identiques, mais sont exprimés dans le système nerveux et dans le groupe muscles/intestins
respectivement. Tout au long du développement de C. elegans, les membres de la famille
let-7 sont exprimés de manières différentes. Leur expression temporelle particulière joue
d’ailleurs un rôle crucial dans chacun des stades du développement du nématode [16-18].
Une particularité intéressante des miARN est leurs différents niveaux d’expression
au sein des cellules, qui peuvent varier de 1 000 molécules/cellule jusqu’à 50 000
molécules/cellule [19]. Il est à noter que les miARN peuvent réguler de manière synergique
les ARNm, c’est-à-dire qu’ils peuvent lier un ARNm pour inhiber sa traduction. Un seul
miARN peut réguler jusqu’à quelques centaines d’ARNm différents [20, 21]. Un ARNm
donné peut être régulé par plusieurs microARN différents, ce qui permet une régulation fine
et complexe de l’expression génique. L’importance accordée aux miARN provient de leur
4
abondance, leur diversité et leur fort pouvoir de régulation sur l’ensemble du transcriptome
au sein des cellules du corps humain.
1.1.3 La voie des miARN
La formation des miARN matures (19-24 nt) nécessite plusieurs étapes successives.
Elles consistent (i) en la transcription des gènes de miARN, principalement par l’ARN
polymerase II, (ii) au clivage de ces ARN structurés en tige-boucle par l’ARNase III
Drosha, (iii) à l’export vers le cytoplasme par l’Exportin-5, (iv) au clivage par l’ARNase III
Dicer, et (v) à l’insertion des miARN matures dans des complexes effecteurs contenant des
protéines de la famille Ago qui permettent la régulation des ARNm (Figure 1). Ces
principales étapes sont présentées ici, dans le détail, pour bien comprendre cette voie de
régulation génique.
1.1.3.1 La transcription des gènes de miARN
Plusieurs modèles ont été proposés pour décrire la transcription des gènes de
miARN. Premièrement, il a été soupçonné que l’ARN polymérase III est l’enzyme qui
génère les miARN primaires, car elle médie également la synthèse d’autres petits ARN
non-codants, tels les ARN de transfert (ou transfert RNA; tRNA) et les petits ARN
nucléaires U6 (ou small nuclear RNA; snARN). D’ailleurs, certains miARN se retrouvent à
l’intérieur de gènes contenant des régions riches en séquence Alu et transcrits par l’ARN
polymérase III [22]. Cependant, il a été démontré plus tard que la majorité des pri-miARN
sont engendrés par l’ARN polymérase II. C’est pourquoi les pri-miARN portent la même
signature que les ARNm de la cellule, soit une extrémité 5’ 7-méthyl-guanosine et une
5
Figure 1. Représentation schématique de la voie des miARN. Les gènes de miARN sont
transcrits par l’ARN polymérase II pour former des miARN primaires (pri-miARN). Situé
au noyau, le complexe microprocesseur composé de Drosha et DGCR8 clive ces pri-
miARN précurseurs de miARN (pré-miARN). Ces pré-miARN sont ensuite transportés au
cytoplasme par l’Exportin-5 pour être clivés par un complexe formé de Dicer et TRBP et
ainsi former un duplex miARN:miARN*. Après un processus de sélection du brin effecteur,
le miARN mature est incorporé dans un complexe contenant des ribonucléoprotéines
(miRNP) afin de réprimer l’ARNm. Figure tirée intégralement de Ouellet et al.[23]
queue poly (A) en 3’ [24, 25]. Certains Pri-miARN sont transcrits à l’intérieur d’un
regroupement de miARN (« cluster ») qui, lors du clivage par Drosha, engendre plusieurs
miARN matures différents. Les miARN peuvent aussi se retrouver à l’intérieur d’introns,
où ils sont appelés « mirtrons ». Ceux-ci sont excisés par le spliceosome, tout comme les
introns des ARNm codants, pour engendrer directement un pré-miARN qui ne nécessite pas
de clivage préalable par la ribonucléase III Drosha [26, 27].
1.1.3.2 Le complexe Microprocesseur
6
Constitué de l’ARNase III Drosha et de son cofacteur DGCR8, le Microprocesseur
assure le clivage initial du pri-miARN et engendre le précurseur de miARN (pré-miARN),
le substrat reconnu par Dicer pour former un miARN mature.
1.1.3.2.1 La ribonucléase III Drosha
L’ARNase Drosha est une endoribonucléase III de classe II qui a initialement été
clonée et caractérisée par l’équipe de Wu et al. [28]. Ceux-ci ont étudié cette protéine pour
son importance dans la biosynthèse des précurseurs des ARN ribosomaux (pré-ARNr). Ils
ont établi que Drosha est une protéine se situant principalement dans la fraction nucléaire
des cellules et qui possède un poids moléculaire de 160 kDa [28]. Drosha est constituée de
plusieurs domaines : deux domaines RNase III (RIIIDa et RIIIDb), un domaine de liaison
de l’ARNdb (dsRBD) (à l’extrémité C-terminale), un domaine riche en proline (PRR) et un
domaine riche en arginine/sérine (RS) (à l’extrémité N-terminale) [29] (Figure 2). Drosha
initie la première étape de la maturation des pri-miARN en miARN fonctionnels en
convertissant les pri-miARN en précurseurs de miARN (pré-miARN). Lee et al. [30] ont
observé qu’en diminuant l’expression de Drosha par iARN, il y a une accumulation de pri-
miARN au noyau et une diminution des niveaux de pré-miARN et miARN matures. Des
études ont démontré que Drosha est incorporée dans trois différents complexes protéiques,
soit un complexe de très haut poids moléculaire possédant une activité RNase non-
spécifique, un complexe de ~440 kDa possédant une faible activité endoribonucléasique et
un complexe de ~650 kDa, dont DGCR8 fait partie, qui possède la plus grande activité
catalytique dans la formation de pré-miARN [31, 32]. Il est à noter que seules Drosha et
7
DGCR8 se retrouvent dans le complexe de 650 kDa et qu’elles seules sont nécessaires au
bon fonctionnement du Microprocesseur.
Du côté structural, en raison de la structure en forme d’hélice de l’ARN double-brin,
le domaine « RNase III Domain a » (RIIIDa) clive le pri-miARN sur le brin 3’, tandis que
le domaine « RNase III Domain b » (RIIIDb) clive à l’extrémité 5’, ce qui engendre une
structure en tige-boucle ayant un bout protubérant de 2 nt en 3’, ce qui est caractéristique
des coupures médiées par les RNases III) [32].
Figure 2. Structure des domaines de la ribonucléase de classe II Drosha. Drosha
possède deux domaines d’interactions protéine-protéine en position N-terminale, soit un
domaine riche en Proline ainsi qu’un domaine Sérine-Arginine (RS). En C-terminale, il y a
deux domaines catalytiques RNase III (RIIIa & RIIIb) ainsi qu’un domaine de liaison à
l’ARNdb (dsRBD). Tirée d’un article de revue publié par Carmel et Hannon [29].
1.1.3.2.2 Le cofacteur DiGeorge syndrome Chromosomal Region 8
(DGCR8)
DGCR8 a tout d’abord été étudiée pour son rôle dans la maladie qui lui a valu son
nom, le syndrome de DiGeorge. Dans cette maladie, la plupart des patients montrent une
délétion dans le chromosome 22q11 pouvant aller jusqu’à 1.5 Mégabase (Mb) et qui est
appelée DGCR (DiGeorge syndrome Chromosomal Region). Les chercheurs ont identifié
les gènes présents dans ce segment délété-- qui engendre les phénotypes documentés chez
les patients atteints de la maladie --, notamment le gène codant pour la protéine DGCR8.
Cette protéine possède deux domaines de liaisons à l’ARN double-brin (« double
strand RNA Binding Domain »; dsRBD) ainsi qu’un domaine WW, qui médie les
interactions protéine-protéine en se liant à un domaine riche en proline (« Proline Rich
8
Region »; PRR), comme celui que possède Drosha (Figure 1) [33]. DGCR8 a plus tard été
étudiée pour son importance dans la biogenèse des miARN : elle agit comme cofacteur de
Drosha pour le clivage des pri-miARN [32, 34]. Celle-ci reconnaît la jonction d’ARN
simple-brin et double-brin du transcrit primaire et sert d’ancrage moléculaire permettant à
Drosha d’exercer son activité catalytique à environ deux tours d’hélice alpha de la jonction
ARNsb-ARNdb [35].
1.1.3.3 L’export du pré-miARN au cytoplasme par l’Exportin-5
Une fois le travail de Drosha ayant formé le pré-miARN, celui-ci est dirigé vers le
cytoplasme, où il est pris en charge par la ARNase III Dicer. Pour ce faire, la cellule a
recourt au transport actif utilisant le gradient de Ran-GTP qui est présent entre le noyau et
le cytoplasme. L’Exportin-5, qui est un membre de la famille des transporteurs nucléaires
Karyopherine β, a été démontré comme étant l’unique transporteur des pré-miARN vers le
cytoplasme [36, 37]. Exportin-5 est nécessaire à la régulation initiée par les pré-miARN
endogènes et par les ARN en tige-boucle (ou short hairpin RNAs; shRNAs) exogènes, mais
non pour les siARN, qui, eux, ne nécessitent pas de transport actif vers le cytoplasme pour
médier leurs effets [37].
L’export médié par l’Exportin-5 est considéré comme étant l’étape limitante dans la
biosynthèse des miARN, car son niveau d’expression influence directement la quantité de
miARN matures générés au cytoplasme. En effet, lorsque les cellules HeLa sont traitées
avec des siARN ciblant Exportin-5, il y a une baisse générale d’environ 40-60% des
miARN matures dans la cellule ainsi qu’une accumulation des pré-miARN au noyau [38].
Inversement, l’efficacité des miARN est grandement augmentée lorsqu’il y a une
9
surexpression de ce transporteur nucléaire au sein des cellules [39]. Il est à noter que la voie
de l’Exportin-5 est saturable, c’est-à-dire qu’en transfectant un plasmide surexprimant des
shARN, ceux-ci entreront en compétition avec l’export des pré-miARN endogènes,
diminuant du coup la formation des miARN matures endogènes [39].
1.1.3.4 La ribonucléase III Dicer
La forme humaine de la ribonucléase III Dicer a été découverte grâce à des
expériences de double hybride chez la levure visant à identifier les principales protéines
interagissant avec l’enzyme 5-lipoxygénase (5LO). Un ADNc ayant beaucoup d’homologie
à l’ARNm codant pour la protéine K12H4.8 de C. elegans, qui possède des motifs ARNase
III et un domaine de liaison à l’ARNdb, a été identifié [40] et nommé Dicer en raison de
son homologie avec la protéine du même nom identifiée chez la drosophile [41]. La
protéine Dicer contient 1912 acides aminés et a un poids moléculaire de 218 kDa. Celle-ci a
la capacité de lier l’ADNdb et de le cliver pour générer de petits fragments d’ARNdb [41-
43].
Dicer possède plusieurs domaines fonctionnels, soit un domaine ATPase/hélicase
avec un motif DExH dans la portion N-terminale de la protéine, un « Domain of Unknown
Function 283 » (DUF283), un domaine PIWI-Ago-Zwille (PAZ) et deux domaines
ARNase III couplés à un domaine « dsRBD » dans sa portion C-terminale [29, 42, 43]
(Figure 3).
10
Figure 3. Structure des domaines de la ribonucléase de classe III Dicer. Dicer possède
un domaine hélicase et un domaine de fonction inconnue (Domain of Unknown Function
283 ; DUF283) en position N-Terminale ainsi qu’un domaine central PIWI-Argonaute-
Zwille (PAZ). En C-terminale, Dicer possède deux domaines RNase III, dont un domaine
non fonctionnel indiqué avec un X, ainsi qu’un domaine de liaison à l’ARNdb. Tirée
intégralement d’un article de revue publié par Carmel et Hannon [29].
Il a été démontré que le domaine PAZ de Dicer reconnaît les pré-miARN via son
interaction avec les 2 nt protubérants en 3’ sur l’ARNdb générés par Drosha. Une
dimérisation intramoléculaire de Dicer regroupe ensuite ses deux domaines ARNase III à
proximité l’un de l’autre afin de cliver l’ARN deux tours d’hélice α plus loin. Ce clivage
donne naissance à un ARNdb, d’environ 21 à 23 paires de bases, montrant une extrémité
phosphate en 5’ ainsi qu’une extrémité protubérante de 2 nt hydroxylée en 3’ [44, 45]
(Figure 4).
Figure 4. Modèle du clivage catalytique des précurseurs de miARN par Dicer. Le
domaine PAZ de la ribonucléase III Dicer reconnaît l’extrémité 5’-phosphate ainsi que
l’extrémité 3’-hydroxyle exhibant 2 nt protubérants. L’architecture entre les domaines
catalytiques et le domaine PAZ serait la cause de la formation d’ARNdb de 22 nucléotides.
Tirée intégralement d’un article de revue publié par Carmel et Hannon [29].
11
Il a été montré par des études génétiques que Dicer est cruciale au développement
chez les mammifères, ce qui a été démontré à l’aide d’expériences effectuées sur des souris
déficiences en Dicer qui décédaient au stade embryonnaire [46, 47]. Des cellules souches
embryonnaires de souris dont le gène dcr-1 avait été supprimé demeuraient toujours
viables. Après analyses, ces cellules ont montré une forte déficience au sein de la biogénèse
des miARN, ce qui engendre une altération majeure de la différenciation cellulaire. Celle-ci
peut être rétablie par une ré-expression de Dicer, sous forme recombinante, dans ces
cellules [46]. Il est aussi rapporté que plusieurs cas de cancer proviennent d’une
dérégulation du niveau d’expression de Dicer : une diminution de son expression dans les
carcinomes du poumon n’étant pas à petites cellules [48], ainsi qu’une augmentation de son
expression dans les adénocarcinomes de prostate et dans les lésions précurseurs
d’adénocarcinomes de poumons [49, 50]. Ceci montre l’importance d’une fine régulation
de l’expression de Dicer pour conserver l’homéostasie cellulaire.
1.1.3.5 Le cofacteur « TAR RNA-Binding Protein » (TRBP)
Le cofacteur TRBP a été caractérisé en 1991 par l’équipe de Gatignol et al.[51]. Ils
ont montré que celui-ci agit de manière synergique avec la protéine virale Tat en se liant à
l’élément TAR du VIH-1 afin de transactiver le promoteur « Long terminal repeat » (LTR)
et d’accroître la transcription du génome viral. TRBP possède trois domaines de liaisons à
l’ARNdb (dsRDB) et est présent sous deux isoformes dans les cellules, soit : TRBP1 et
TRBP2, qui a 21 acides aminés de plus que l’isoforme 1. Présentement, TRBP a été
montrée comme jouant un rôle cellulaire via au moins trois différents mécanismes : par
l’augmentation de la transcription des ARN contenant l’ARN viral TAR, et ce,
12
indépendamment de l’inhibition de PKR [52]; par la formation d’un hétérocomplexe avec
la protéine PKR empêchant son autophosphorylation et ainsi la phosphorylation du facteur
de transcription « eukaryotic Initiation Factor 2 alpha » (eIF2α) par celle-ci [53, 54]; et par
son interaction avec Dicer comme cofacteur dans la voie de l’iARN [55, 56]. De plus, une
étude protéomique récente a montré que TRBP interagit avec 160 protéines intracellulaires
jouant des rôles dans la synthèse protéique, la transcription de l’ADN ainsi que la
prolifération cellulaire [57].
TRBP a été identifiée, par spectrométrie de masse, par son interaction avec la
ribonucléase III Dicer via son troisième domaine (dsRBD) en C-terminal [55]. Il a été
montré que le complexe TRBP•Dicer interagit avec la protéine Argonaute 2 (Ago2) et que
TRBP est un cofacteur requis dans le processus de transfert d’un siARN de Ago2 vers
Dicer pour son clivage protéolytique [55].
1.1.3.6 Le cofacteur « Fragile X Mental Retardation Protein » (FMRP)
Une perte d’expression du gène FMR1 (« Fragile Mental Retardation 1 »), qui
engendre une perte d’expression de la protéine FMRP (« Fragile X Mental Retardation
Protein »), est l’agent étiologique menant au syndrome du X fragile, cause la plus fréquente
de retards mentaux non liés à un héritage génétique [58-60]. FMRP est une protéine
associée aux polyribosomes possédant un domaine de liaison à l’ARN et est reconnue
comme étant un régulateur négatif de la traduction des ARNm [58, 61]. Dernièrement,
notre équipe a découvert un rôle de FMRP au sein de la voie de l’iARN. Il a été montré que
FMRP est capable de prendre en charge des miARN issus du clivage de Dicer, ce qui
facilite la formation du complexe miARN:ARNm cible [62], et que la forme phosphorylée
13
de FRMP se dissocie de Dicer, ce qui suggère un mécanisme moléculaire de l’assemblage
des miARN sur leurs cibles [63].
1.1.3.7 Le complexe effecteur
1.1.3.7.1 Les protéines Argonautes (Ago)
Durant les dernières années, les protéines Argonaute ont été largement étudiées chez
différents organismes, dont S. pombe, C. elegans, D. melanogaster et certains mammifères
[64]. Chez l’humain, il existe huit membres de la famille AGO séparés dans deux sous-
familles, quatre PIWI et quatre « eukaryotic Initiation Factor 2C /Argonaute»
(eIFC2/AGO). Tous les membres de la famille AGO possèdent une même structure en
domaines, soit un motif PAZ dans le centre de la protéine et un motif PIWI à l’extrémité C-
terminale. Les gènes Ago sont situés sur différents chromosomes et sont exprimés
différemment au sein de l’organisme : les quatre protéines Ago (Ago1-2-3-4) sont
exprimées de manière ubiquitaire dans les différents tissus adultes, alors que les protéines
Piwi se concentrent pour la plupart au niveau des testicules [65]. Il a été démontré que les
quatre protéines Ago sont en mesure de lier les miARN et les siARN, mais que seul Ago2
possède une activité catalytique. Des analyses cristallographiques chez Pyrococcus furiosus
ont démontré que le domaine Piwi d’Ago2 se replie pour former une structure analogue au
domaine catalytique de l’ARNase H, lui conférant ainsi son activité catalytique de clivage
[66, 67]. Le domaine PAZ, quant à lui, jouerait le même rôle que pour Dicer, c’est-à-dire
qu’il reconnaîtrait les 2 nt protubérants à l’extrémité 3’ des pré-miARN pour les incorporer
au complexe effecteur. Des études ont montré qu’Ago2 seule est nécessaire à la répression
14
d’un ARNm et que les miARN ne servent que de guide pour apporter le complexe
répresseur vers l’ARNm cible [68].
1.1.3.7.2 Les complexes ribonucléoprotéiques contenant des miARN
(miRNP)
Une fois que la ribonucléase III Dicer a effectué son activité catalytique de clivage
et formé un duplex de miARN, il se forme un complexe effecteur de nature
ribonucléoprotéique autour de ce duplex : les complexes ribonucléoprotéiques contenant
des miARN (miRNP). Les rôles fonctionnels de ce complexe sont de recevoir le duplex
miARN : miARN*; de déterminer le brin effecteur (miARN mature) ainsi que le brin
passager (miARN*); de reconnaître l’ARNm à réguler avec le brin effecteur et d’inhiber sa
traduction ou le diriger vers les « processing-bodies » (p-bodies) (foci cytoplasmiques où se
trouvent l’activité ribonucléasique de Ago2 ainsi que des ARNm non traduits [69]), où il
sera stocké et, éventuellement, dégradé [16]. La ségrégation des deux brins de miARN est
de nature thermodynamique, c’est-à-dire que le brin dont l’énergie d’appariement avec son
complément est la plus faible en 5’ est sauvegardé, tandis que l’autre brin est dégradé [70].
Chez les mammifères, la majorité des complexes miRNP engendre une répression
traductionnelle de l’ARNm cible. Du moins, c’est ce que l’on croyait initialement : des
études de biopuces à ADN ont montré que certains miARN peuvent réduire
considérablement le niveau de leurs ARNm cibles [71]. C’est le cas, notamment, de miR-
196, qui se lie avec sa cible HOXB8 de manière parfaitement complémentaire (à
l’exception d’un G :U) et engendre sa dégradation [72].
15
La régulation d’un ARNm par un miARN nécessite un appariement parfait dans la
partie 5’ du miARN avec sa cible. Cette région est appelée « seed » et est constituée des
nucléotides 2-7 [73].
Une question persiste toujours : quelle est la composition protéique exacte de ce
complexe effecteur ? Un complexe de ~150 kDa à 500 kDa possédant une activité nucléase
catalytique a été isolé à partir de cellules de Drosophile et est appelé RISC [74]. Quant au
complexe miRNP, il partage plusieurs caractéristiques avec le complexe RISC [75],
notamment la présence d’un petit ARN non-codant guide (miARN), la ribonucléase III
Dicer et Ago2.
1.2 Les miARN et les virus
1.2.1 Aperçu général
La première interaction ayant été reconnue entre les miARN et les virus a été
découverte chez les plantes. Celles-ci utilisent la voie de l’interférence à l’ARN (iARN)
afin de se protéger contre les virus en ciblant leur génome et en engendrant leur dégradation
[9]. Ce système de défense serait aux plantes ce que le système immunitaire est aux
humains, c’est-à-dire que les plantes auraient évolué en produisant ces petits ARN afin de
protéger leur génome de tout remaniement possible de la part des virus. Par contre,
l’évolution étant ce qu’elle est, certains virus ont développé des stratégies afin de contrer
l’iARN, et ce, par l’entremise de protéines virales suppressives de l’iARN [76-78].
Il a été montré que certains génomes viraux sont la cible de miARN endogènes et
que, vice-versa, certains virus produisent des miARN aptes à cibler différents gènes de
l’hôte. De plus, certains virus produisent des miARN qui ciblent leur propre génome, ce qui
16
régule leur réplication au sein de la cellule hôte. Différents exemples seront présentés dans
les prochaines sections.
1.2.1.1 Les virus à ADN et leurs miARN
Le virus Epstein-Barr (EBV) est un virus Herpes oncogène infectant l’humain et
présent dans ~15% des lymphomes à grandes cellules B [79]. Il a été rapporté initialement
que le virus EBV exprimait cinq miARN à partir de deux régions différentes de son
génome [80]. Par contre, les cellules utilisées lors de ces études étaient infectées avec la
souche B95-8, qui contient une délétion de 12 kb dans la région BamH1. Celle-ci a été
rapportée, plus tard, comme étant une région contenant la majorité des microARN d’EBV
[79]. Depuis, plus de 140 miARN ont été découverts chez les virus Herpes, dont 25 chez le
virus EBV [81, 82].
Quant au virus herpès humain de type 8 « Kaposi's sarcoma-associated
herpesvirus » (KHSV), il semble capable de produire 12 pré-miARN pouvant former un
total de 17 miARN matures différents [83]. Il a été montré que les miARN produits chez
HSV1-2 et MDV1-2, membres de la famille des herpèsvirus, sont les seuls ARN produits
au cours de la latence et servent au maintien de celle-ci dans les cellules infectées [84].
1.2.2 Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1)
1.2.2.1 La biologie du VIH-1
En 1981, il a été rapporté que cinq individus montrant des syndromes de pneumonie
combinés à une déplétion de lymphocyte T se sont présentés dans des hôpitaux de Los-
Angeles afin d’y recevoir des soins appropriés. Plusieurs groupes de recherche se sont
17
intéressés à ces patients, car il avait été découvert qu’un rétrovirus, le « Human T
Lymphotrophic Virus 1 » (HTLV-1), était en mesure d’infecter les cellules T et qu’un
rétrovirus présent chez les chats (FeLV) induisait, quant à lui, une immunodéficience
similaire à celle observée chez ces patients. Il était soupçonné qu’un rétrovirus de la famille
HTLV, encore inconnu de la communauté scientifique, pouvait être impliqué [85].
C’est en 1983 que l’agent étiologique du SIDA a été isolé, à partir d’un ganglion
lymphatique, par le Dr. Luc Montagnier et qu’il a été analysé par microscopie électronique
par la Dre. Françoise Barré-Sinoussi, qui se virent décerner le prix Nobel de médecine pour
leur découverte du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) [85, 86]. Il a
été montré que les cellules permissives à l’infection in vivo sont principalement les cellules
exprimant à leur surface la molécule CD4, tels les lymphocytes T CD4+, les monocytes et
les macrophages. Il existe aussi différents réservoirs mineurs, notamment les cellules CD8+,
les cellules B, les cellules « Natural Killer » (NK) et les cellules dendritiques (pour une
revue détaillée, voir [87]).
Pour ce qui est de l’épidémiologie du VIH-1, en 2009, on estimait que le nombre de
personnes nouvellement infectées dans l’année se situait à 2,6 millions, pour un total de
33,3 millions de personnes vivant avec le VIH sur la planète. Le rapport 2010 d’ONUSIDA
dresse un bilan plus positif que par les années antérieures :
« La croissance globale de l’épidémie mondiale de SIDA semble s’être stabilisée. Le
nombre annuel de nouvelles infections du VIH recule régulièrement depuis la fin des
années 1990 et l’on note une diminution du nombre de décès liés au SIDA grâce à un
élargissement et à une intensification significatifs de l’accès au traitement antirétroviral au
cours des dernières années. Bien que le nombre de nouvelles infections ait diminué, leurs
niveaux généraux demeurent élevés et le nombre de personnes vivant avec le VIH
augmente dans le monde du fait de la réduction significative de la mortalité. »
18
(Tiré du Rapport ONUSIDA 2010)
http://www.unaids.org/globalreport/Global_report_fr.htm)
1.2.2.2 Le cycle réplicatif du VIH-1
1.2.2.2.1 La primo-infection
Le mode d’infection du VIH-1 le plus fréquent est par transmission sexuelle via les
muqueuses génitales. Le virus se lie aux cellules de Langerhans (cellules dendritiques),
présentes au niveau de l’épithélium urogénital, via la lectine DC-SIGN qui lie de manière
spécifique la protéine virale gp120. Cette interaction est utilisée comme vecteur par le virus
afin de le rapprocher des cellules CD4+ présentes au niveau des ganglions lymphatiques et
de les infecter [88].
Une fois le virus pénétré à l’intérieur des cellules et intégré à leur génome, une
réplication massive de celui-ci produit une multitude de virions pouvant, à leur tour,
infecter d’autres cellules. Au pic de la production, on dénombre un niveau d’ARN viral en
circulation sanguine pouvant aller jusqu’à 5 millions de copies par ml [89]. Cette grande
production de virus a pour conséquence, directe ou indirecte, de diminuer les lymphocytes
T CD4+
dans l’organisme [89]. Après deux à quatre semaines de production virale intense,
il y a un retour spontané du niveau de production virale dû à la réponse immunitaire
primaire au VIH-1. Pendant tous les stages de l’infection, le virus procède à un taux de
réplication minimal et il est possible de trouver le matériel génétique du virus dans les
cellules T CD4+ en tout temps.
1.2.2.2.2 La phase de latence clinique
19
Intervient ensuite la phase de latence clinique, ou asymptomatique, qui se traduit par
une charge virale plasmatique à son minimum et correspondant, après qu’il ait infecté une
multitude de lymphocytes CD4+, à l’entrée du virus dans son cycle de latence. Au cours de
cette phase, qui peut durer plusieurs années, il y a une diminution progressive du nombre de
lymphocytes T CD4+ circulant qui est inversement proportionnelle à la charge virale
plasmatique. Il existe donc un équilibre dynamique entre la mort cellulaire des cellules
infectées, le taux de renouvellement de ces cellules et la charge virale [89, 90].
1.2.2.2.3 La phase SIDA
Le stade clinique de la phase SIDA est atteint lorsque la concentration des
lymphocytes CD4+ circulants est inférieure à 200 cellules/µl. Cette perte de cellules
immunitaires est due à l’intensification de la réplication virale dans l’organisme, ce qui
engendre la mort des cellules infectées et favorise l’apparition de maladies opportunistes
s’avérant, éventuellement, mortelles chez les individus infectés.
1.2.3 Le VIH-1 et la voie des miARN
1.2.3.1 Changement du profil d’expression des miARN cellulaires relié à
l’infection au VIH-1
Toute modification de l’environnement d’une cellule engendre une cascade
signalétique menant à un remaniement génomique et à un changement du profil
d’expression génique. C’est le cas du VIH-1 qui, lors de l’infection au sein des cellules
hôtes, les reprogramme à son avantage. Étudiant cette question à l’aide de leur méthode
« RNA-primed Array-based Klenow Enzyme » (RAKE), l’équipe de Kuan-Teh Jeang a
20
observé une baisse importante des miARN dans les cellules HeLa transfectées avec le
plasmide infectieux pNL4-3 [91], ce qui supporte l’idée que le VIH-1 affecte
considérablement le profil d’expression génique des cellules qu’il infecte. L’équipe a
obtenu des résultats semblables en faisant appel à des sujets humains infectés à divers
degrés, c’est-à-dire une diminution majeure des miARN, et ce, peu importe le stade de
l’infection virale [92].
Des analyses plus détaillées ont permis d’identifier une baisse des niveaux
d’expression du regroupement, ou « cluster », de miARN miR-17/92 chez les cellules
infectées par le VIH-1. Ce regroupement de miARN est connu pour réguler l’expression de
« P300/CBP-associated factor » (PCAF), une protéine cellulaire agissant comme cofacteur
dans la transactivation du VIH-1 par la protéine virale tat. Donc, lorsque le virus infecte
une cellule, il y a une diminution du regroupement de miARN miR-17/92 qui engendre, du
même coup, une augmentation du facteur PCAF favorisant la réplication virale [93].
Lors de l’infection par le VIH-1, une quantité considérable de protéines virales Tat
est relâchée par les cellules infectées et circule librement dans le sang. Celle-ci est capable
de passer la barrière hémato-encéphalique pour ainsi atteindre les neurones et diminuer
l’expression du miARN miR-128a. Ce miARN est responsable de la régulation de
« Synaptosomal-associated protein 25 » (SNAP25), une protéine nécessaire aux échanges
vésiculaires entre les neurones. Cette dérégulation des échanges entre les neurones serait
l’une des causes de la dégénération neuronale observée chez les personnes infectées par le
VIH-1 [94]. D’ailleurs, les patients atteints du VIH peuvent développer, au cours du stade
final d’infection, divers troubles neurologiques pouvant mener à la démence. En effet, des
neurotoxines libérées par le virus et une réponse immunitaire soutenue des macrophages et
21
des cellules microgliales au cours de l’infection peuvent entraîner une encéphalite menant à
la démence. Il a été montré chez ces patients qu’une multitude de miARN subissent un
changement d’expression [95], dont miR-21 [96] et miR-219 [95, 97] qui, paradoxalement,
sont exprimés à la hausse en comparaison à des sujets sains.
Le miARN miR-21 est induit dans les neurones par une stimulation continue du
récepteur « N-methyl-D-aspartic acid » (NMDA), un procédé excitotoxique actif dans
l’infection par le VIH-1 ainsi que d’autres maladies neurodégénératives. L’équipe de Fox et
al. [96] ont montré que l’ARNm codant pour la protéine « Myocyte-specific enhancer
factor 2C » (MEF2C) est ciblé par miR-21, ce qui engendre une baisse d’expression dans
les neurones. MEF2C est un facteur de transcription important dans le système nerveux
central et sa perte serait l’une des causes des troubles neurodégénératifs, tels « HIV-
associated dementia » (HAD) et « HIV-associated neurocognitive disorders » (HAND)
[96]. Quant à miR-219, il semble médier les dysfonctions neurocomportementales de la
schizophrénie, dans lesquelles les récepteurs NMDA jouent un rôle de médiation [97], et il
est surexprimé chez les patients HIV/ « Major depressive disorder » (MDD) [95].
Pour finir, il a été montré qu’une fois les cellules dendritiques ayant été en contact
avec des agents pathogènes tels que le VIH-1, il y a une augmentation importante du niveau
de miR-155. Celui-ci diminue l’expression du facteur de transcription de la lectine
« Dendritic Cells-specific intercellular adhesion molecule-3 grabbing non-integrin » (DC-
SIGN), une protéine essentielle à l’adhésion de surface des pathogènes sur les cellules
dendritiques, en régulant négativement l’expression du facteur de transcription PU.1 [98].
1.2.3.2 Le ciblage du VIH-1 par des siARN exogènes
22
Se basant sur l’activité antivirale des plantes grâce aux siARN produits dans leurs
cellules, plusieurs laboratoires se sont lancés dans la course thérapeutique contre le VIH à
l’aide de siARN spécifiques. Ainsi, plusieurs siARN ont été produits afin de contrer
l’infection au VIH-1 [99]. Les premières cibles ont été les gènes essentiels au VIH-1, soit :
la protéine structurale gag [100], les facteurs d’infection vif et nef [101] ainsi que la
protéine responsable de la régulation post-transcriptionnelle, rev [102]. En plus d’avoir
ciblé d’autres gènes du VIH-1 (nef, tat, gag, vif, env) [99, 103, 104], certains groupes ont
ciblé des protéines cellulaires importantes au cycle du VIH-1. D’abord i) à l’entrée du VIH-
1 dans les cellules via les co-récepteurs CCR5 et CXCR4 [105, 106]; ensuite ii) à l’étape de
pré-intégration au niveau du complexe Arp2/3, qui est responsable de la polymérisation de
l’actine impliquée dans le transport du VIH-1 vers le noyau [107], au niveau de « poly
(ADP-ribose) polymerase-1 » (PARP-1), enzyme nucléaire requis pour l’intégration du
VIH-1[108]; puis iii) au niveau transcriptionnel, en ciblant les protéines essentielles à la
transcription du LTR par l’ARN polymérase II, soit cycline T1, CDK-9 et SPT5 [109, 110]
Cependant, il reste encore beaucoup de chemin à parcourir afin d’augmenter
l’efficacité de tels traitements, les siARN n’étant que transitoires chez les cellules humaines
et leurs effets n’étant que temporaires. De plus, le virus est capable d’échapper à la voie
d’interférence à l’ARN par divers moyens (pour références, voir [111] ), rendant ainsi la
thérapie encore plus compliquée.
1.2.3.3 Le ciblage du VIH-1 par la voie des microARN
La première évidence du ciblage du VIH-1 par la voie des microARN vient d’une
étude effectuée en 2005 par l’équipe de Hariharan et al. [112]. Des analyses bio-
23
informatiques ont identifié 5 microARN pouvant cibler une région conservée dans le
génome du VIH-1. Elles ont confirmé la présence de ces miARN au sein des lymphocytes
T par biopuces [112]. Deux de ces miARN, soit miR-29a et miR-29, ont été confirmés
comme pouvant moduler le VIH-1 en régulant l’expression du gène Nef [113, 114]. La
protéine virale Nef est essentielle à la progression de l’infection virale du VIH-1, car celle-
ci est exprimée précocement dans le cycle viral et déclenche le relâchement des virions qui
engendrent l’infection persistante du VIH-1 [115].
En 2007, l’équipe de Huang et al. [116] ont montré que des microARN cellulaires
pouvaient inhiber la réplication virale latente au sein des lymphocytes CD4+ primaires. Un
regroupement de cinq miARN cellulaires incluant miR-150, miR-223, miR-28, miR-125b
et miR-382, a été montré comme pouvant cibler l’extrémité 3’ des ARNm viraux. Les
chercheurs ont découvert que ces miARN, en comparaison aux cellules en réplication virale
dites activées, sont enrichis dans les cellules CD4+ latentes, ce qui suggère un rôle majeur
dans le maintien de la latence du VIH-1 [116, 117]. Les transcrits viraux ciblés par la voie
des microARN sont amenés vers les p-bodies pour y être éventuellement dégradés. Ceci a
été démontré en immunoprécipitant les complexes de répression et en examinant les
différents ARNm qui y étaient associés [116]. D’ailleurs, l’inhibition de la formation des p-
bodies, réalisée à l’aide de siARN régulant à la baisse l’expression des protéines qui les
composent, est associée à une recrudescence de la réplication virale [114, 118].
Il a été montré auparavant que les monocytes sont des cellules aptes à l’infection du
VIH-1, mais que celui-ci ne peut s’y répliquer qu’une fois ces cellules différenciées en
macrophages par l’augmentation de la cycline T1 [119]. L’équipe de P. Rice et al. [119] ont
montré que le microARN miR-198 régule à la baisse l’expression de la cycline T1 dans les
24
monocytes. Or, une fois que les monocytes se différencient en macrophages, il y a une
diminution de moitié de l’expression de miR-198, ce qui engendre une forte augmentation
de la cycline T1; c’est à partir de ce moment que le virus commence à produire des virions.
La réplication virale du VIH-1 est fortement dépendante de l’expression de la cycline T1,
celle-ci étant un cofacteur essentiel de la protéine trans-activatrice tat. Leur étude suggère
donc un rôle de miR-198 dans le contrôle de la réplication virale dans les monocytes par
l’entremise de la répression de la cycline T1 [119].
1.2.3.4 Les miARN dérivés du VIH-1
Tout a commencé en 2004, lorsque l’équipe de Bennasser et al. [120] ont démontré
que le génome du VIH-1 pouvait être une source de miARN. Ceux-ci ont identifié cinq
structures en tige-boucle au sein du génome du VIH-1 pouvant engendrer une dizaine de
miARN [120]. Jusqu’à maintenant, des miARN de trois de ces structures ont été confirmés
(Figure 5).
Figure 5. Présentation schématique de l’emplacement des différents miARN dérivés
du génome du VIH-1. Le génome du VIH-1 contient trois structures arborant des tiges-
boucles pouvant être clivées par Dicer pour engendrer des miARN, i.e. les miARN de TAR
(miR-TAR-5p et miR-TAR-3p), le miARN de NEF (miR-N367) ainsi que le miARN HIV-
miR-H1 présent dans la région 3’-« long terminal repeat » (LTR). Tirée intégralement de
Narayanan et al. [121].
25
En 2002, l’équipe d’Omoto et al. [122] ont montré qu’une portion d’environ 500 nt
du gène de Nef interfère avec la transcription du VIH-1. Deux ans plus tard, ceux-ci ont
découvert que ce phénomène était dû au miARN miR-N367, découvert chez des cellules T
MT-4 infectées de manière permanente par la souche HIV IIIB. De plus, ils ont montré que
miR-N367 diminue la transcription virale à des niveaux différents : soit au niveau post-
transcriptionnel, en régulant à la baisse l’expression de la protéine accessoire Nef [123]; et
au niveau transcriptionnel, en interférant avec le promoteur via le NRE de la région U3 du
5’LTR, ce qui empêche l’ARN polymérase II de transcrire cette région [124].
Le miARN viral HIV1-miR-H1 provient d’une structure en tige-boucle de 81 nt
située en amont des deux sites « Nuclear Factor κB » (NF-κB) dans le 3’LTR du VIH-1.
Celui-ci engendre le clivage du 12ième
exon du gène « Apoptosis Antagonizing
Transcription Factor » (AATF), causant ainsi la dégradation de son produit. Une perte
d’expression de ce facteur est accompagnée d’une réduction de la viabilité des cellules,
ainsi que d’une diminution de certaines protéines, telles Dicer, « B-cell lymphoma 2 » (Bcl-
2), c-myc et « Prostate apoptosis response-4 » (Par-4) [125]. Ce miARN aurait donc un
effet antagoniste à celui exercé par les miARN anti-apoptotiques de TAR [121]. Il est à
noter que le HIV-miR-H1 pourrait diminuer l’expression du miARN cellulaire miR-149,
qui cible le gène viral Vpr, favorisant ainsi l’expression de ce dernier. De plus, une étude
récente a démontré que, parmi un groupe de sujets étudié [126], ce miARN montre une
grande diversité en termes de séquence. Des mutations ou délétions dans son pré-miARN
pourraient donc engendrer différents miARN pouvant être responsables, du moins en partie,
de la diversité de la pathogénicité du VIH-1 dans la population [126].
26
1.2.3.5 Les miARN de TAR
Des analyses de délétions de la région LTR (Long Terminal Repeat) du VIH-1 ont
permis d’identifier la région d’ARN structuré TAR comme étant la séquence régulatrice
responsable de l’activité de la protéine virale tat. Cet élément structuré est situé en aval du
site d’initiation de la transcription (nucléotides +1 à +59) et est présent en 5’ de tous les
transcrits du VIH-1 (Figure 6). En l’absence de tat, il y a un avortement de la transcription
par l’ARN polymérase II, engendrant la formation de courts transcrits viraux, tandis qu’en
présence de tat, il y a un recrutement de divers facteurs d’élongation, telles la kinase
« Cyclin-Dependent Kinase 9 » (CDK-9) et la cycline T1, permettant la transcription de
long-transcrits viraux essentiels pour la réplication du VIH-1 [127].
Figure 6. Séquence et conformation de l’ARN TAR du VIH-1. Le court transcrit de
TAR, position +1 à +59, se replie sur lui-même pour former une structure en tige-boucle
qui est sujette au clivage de la ribonucléase III Dicer. Tirée intégralement de Ouellet et
al.[128]
27
Plus récemment, notre équipe a démontré que l’ARN en tige-boucle TAR, dont la
structure est très similaire aux précurseurs de miARN, pouvait être reconnu par la
ribonucléase III Dicer et clivé en miARN fonctionnels [128, 129]. Il a été démontré que les
miARN de TAR peuvent jouer un rôle dans le remodelage de la chromatine au niveau du
LTR du VIH-1 en recrutant une histone déacétylase HDAC-1, ce qui suggère un rôle de ces
miARN dans la régulation de la transcription du VIH-1 [129]. De plus, il a été découvert
que ces miARN régulent l’expression de certaines protéines de la voie de l’apoptose, telles
« Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group
1 » (ERCC1) et « Radiation-inducible immediate-early gene IEX-1 » (IER3), afin de
protéger les cellules infectées de la mort cellulaire programmée [130].
1.3 Hypothèse et objectif de recherche
1.3.1 Hypothèse
Les résultats présentés dans ce mémoire ont été obtenus dans le cadre d’un projet de
recherche déjà en cours au laboratoire. Sachant que le VIH-1 possède une région d’ARN
structuré appelée TAR, qui est présente à l’extrémité 5’ de tous les transcrits viraux, et que
celle-ci a été montrée comme précurseur de la ribonucléase III Dicer dans la formation de
miARN viraux, l’hypothèse de recherche de mes travaux de maîtrise était la suivante :
L’ARN TAR du VIH-1 libère des miARN qui peuvent réguler une multitude d’ARNm
de la cellule hôte via la reconnaissance de sites de liaison situés dans la région 3’ non-
codante de ces messagers.
1.3.2 Objectif de recherche
28
Lors de la dernière décennie, il a été montré que plusieurs virus produisent des
miARN (voir section 1.2). Cependant, il reste encore beaucoup à faire avant de pouvoir
apprécier leur juste contribution au cours de l’infection du VIH-1. L’objectif de mes
travaux de maîtrise était donc d’identifier les ARNm des cellules hôtes pouvant être
ciblés par les miARN dérivés de l’élément TAR du VIH-1.
Afin d’y parvenir, j’ai effectué i) des essais de régulation génique utilisant des gènes
rapporteurs luciférases, ii) des immunobuvardages de type Western sur des cellules J-lat ou
transfectées, ainsi qu’ iii) une analyse protéomique à grande échelle de cellules Jurkat
exprimant l’élément TAR du VIH-1.
29
Chapitre 2.
Régulation des gènes de l’hôte par les miARN dérivés de
l’élément TAR du VIH-1
2.1 Matériels et méthodes
2.1.1 Amplification des gènes par PCR
Les réactions PCR ont été préparées en mélangeant 150 ng d’ADNc, amplifiés à
partir d’ARN total isolé de cellules Jurkat, 50 pmol de chaque oligonucléotides, 2.5 mM de
chaque nucléotide, 4 µl de tampon concentré 5X, 2.0 µl de la polymérase Phusion (New
England Biolabs) et de l’eau milliQ à 50 µl. Les réactions ont été soumises aux cycles
« Polymerase Chain Reaction » (PCR) suivants : un cycle de dénaturation initial de 30 s à
98oC; 35 cycles d’amplification de 10 s à 98
oC, 30 s à 55
0C et de 30 s à 72
oC; un cycle final
de 10 min à 72oC. Les oligonucléotides utilisés pour l’amplification de la région 3’UTR des
ARNm Procaspase-8 (PC8) et de Puma sont présentés dans le Tableau 1.
2.1.2 Clonage moléculaire
Les vecteurs d’expression psiSTRIKE et psiCHECK ont été obtenus chez Promega.
La séquence de l’ARN TAR a été clonée dans le vecteur psiSTRIKE selon le protocole de
la compagnie.
Les régions 3’UTR de Procaspase-8 et de Puma, amplifiées par PCR, ont été
clonées dans les sites de restrictions Xho1 et Not1 (New England Biolabs) en aval du gène
rapporteur Rluc dans le vecteur psiCHECK. De plus, des gènes rapporteurs ont été créés
30
dans le vecteur psiCHECK, où des sites de liaisons (binding sites; BS) aux miARN issus de
l’ARN de TAR ont été insérés, en 3 copies contiguës (3xBS), en aval du gène rapporteur
Rluc.
Tableau 1. Séquence des différents oligonucléotides d’ADN utilisés pour le clonage
moléculaire des cibles de miR-TAR-5p/3p. Les oligonucléotides pour PUMA et
Procaspase-8 ont été synthétisés à la plate-forme de séquençage du CRCHUL par Ronald
Maheux. Les oligonucléotides de Diablo et Procaspase-10 ont été synthétisés par Invitrogen
et APAF-1 par IDT (Integrated DNA technologies). APAF-1, « Apoptotic Peptidase
Activating Factor 1 »; BS, « Binding Site » (site de liaison) ; PUMA, « p53 Upregulated
Modulator of Apoptosis »; UTR, « UnTranslated Region » (région non-traduite).
Les réactions de ligation ont été préparées en mélangeant 100 ng d’ADN du vecteur
psiCHECK, digéré par les enzymes de restriction Xho1/Not1, avec un ratio molaire de 1:3
31
du produit PCR ou avec des oligonucléotides d’ADN appariés. Le mélange a été incubé
pendant 5 min à 42oC, avant l’ajout d’un µl du tampon de réaction 10X (500 mM Tris-HCl,
100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP, pH 7,5) et d’un µl de l’enzyme « T4 DNA
ligase » (Roche). La réaction de ligation s’est déroulée pendant 3 h à TP.
2.1.3 Transformation des bactéries compétentes
Une fois la réaction de ligation complétée, 50 µl de bactéries E. coli DH5α (F-
(80dlacZ M15) (lacZYA-argF) U169hsdR17(r-m+) recA1 enA1 relA1 deoR) compétentes
ont été incubées avec 10 µl de la réaction de ligation pendant 20 min à 4oC, pendant 38 s à
42oC, puis pendant 2 min à 4
oC. Un (1) ml de milieu Lysogeny broth (LB) a ensuite été
ajouté. Ce mélange a été incubé pendant 60 min à 37oC sous une légère agitation de 250
révolutions par minute (RPM). Les bactéries ont ensuite été centrifugées pendant 3 min à
594 g, étalées sur un pétri contenant un milieu d’agar avec 50 µg/ml d’ampicilline et
incubées 16 h à 37oC.
2.1.4 Amplification de l’ADN plasmidique
Les colonies ayant passé sous la sélection de l’ampicilline ont été piquées, inoculées
dans 4 ml de milieu LB contenant 50 µg/ml d’ampicilline, et incubées à 37oC pendant 15 h
sous agitation à 250 RPM. Au terme de cette incubation, les bactéries ont été recueillies par
centrifugation afin d’en extraire l’ADN plasmidique à l’aide du « QIAGEN plasmid
miniprep kit » (Qiagen®
). Ce protocole se traduit en trois étapes, soit : i) la préparation du
lysat de bactéries dans un tampon alcalin; ii) l’adsorption de l’ADN sur la membrane
Qiagen®
de silice; iii) le lavage et l’élution de l’ADN plasmidique. La concentration
32
d’ADN purifié a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre en prenant la mesure de
l’absorbance à 260 nm.
2.1.5 Analyse de restriction et séquençage
Afin de vérifier l’insertion des inserts dans les vecteurs d’expression, des analyses
de restrictions ont été réalisées. L’ADN des constructions a ainsi été soumis à une digestion
par des enzymes de restriction, selon le même protocole qu’à la section 2.1.1, puis analysé
par une électrophorèse sur gel d’agarose afin de déterminer le poids moléculaire des
fragments de digestion. Par la suite, l’ADN des plasmides montrant le patron de digestion
attendu a été séquencé par la plate-forme protéomique du Centre de génomique de Québec
afin de vérifier l’intégrité des séquences d’ADN d’intérêt et leur insertion dans les vecteurs
d’expression, assurant ainsi que ces vecteurs ne comportaient aucune mutation pouvant
compromettre les expériences futures.
2.1.6 Maintien en culture des cellules HEK 293 et Jurkat
Les cellules HEK 293 ont été cultivées dans un milieu DMEM supplémenté avec
10% de sérum bovin fœtal (FBS) décomplémenté, 10 mM de pyruvate de sodium, 1mM de
glutamine, 100 µg/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine. Quant aux cellules
Jurkat exprimant l’ARN TAR du VIH-1 du plasmide psiSTRIKE, elles ont été cultivées
dans un milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 10 mM de pyruvate de sodium,
puis maintenues sous sélection à l’antibiotique G418 (400 µg/ml).
33
2.1.7 Transfection des cellules HEK 293 par précipitation au phosphate
de calcium
Les transfections des cellules HEK 293 ont été effectuées selon un protocole élaboré
au laboratoire. Un jour avant la transfection, les cellules ont été déposées dans des plaques
à 24 puits pour atteindre une confluence de 80% ou moins au moment de la transfection.
Tel que présenté à la section 2.1.6, 0.5 ml de milieu DMEM supplémenté a été ajouté pour
éviter que les cellules sèchent et, 1 heure avant la transfection, le milieu a été changé pour
du frais. En même temps, dans des tubes eppendorf stériles, ont été mélangés 2,5 µl de
CaCl2 (2,5 M), 100 ng d’ADN de vecteur psiCHECK contenant notre gène rapporteur
d’intérêt, ainsi qu’une quantité croissante (0,25 ng 250 ng) d’ADN de vecteur
psiSTRIKE contenant des séquences en tige-boucle Neg, TAR ou Rluc; le volume étant
ajusté à 25 µl avec de l’eau MilliQ. Toujours en même temps, dans d’autres tubes
eppendorf, a été mélangé 25 µl du tampon HEPES 2X (HEPES 50 mM, NaCl 140 mM,
Na2HPO4 1,5 mM, pH 7,05 ajusté avec du NaOH 2 N et complété avec de l’eau MilliQ).
Après une incubation d’une (1) min, la solution d’ADN-CaCl2 a été ajoutée à la solution
d’HEPES goutte à goutte tout en insufflant, avec l’embout d’une pipette de verre, des
bulles d’air pour favoriser la formation de précipités. Après une attente d’une (1) min, 50 µl
du mélange a été ajouté doucement sur le dessus des cellules et la plaque a été agitée avec
précaution afin de mélanger le milieu et l’ADN précipité (T0 de transfection). Les cellules
ont ensuite été placées dans un incubateur, dont l’atmosphère était humidifiée à 37oC avec
5% de dioxyde de carbone (CO2), pour une durée de 6 h. Ensuite, le milieu avec l’ADN
précipité a été changé pour 0,5 ml de milieu frais, et la plaque a été retournée dans
34
l’incubateur pour une durée totale de transfection de 24 h ou de 48 h (T24 ou T48 de
transfection).
2.1.8 Essais des gènes rapporteurs
Les cellules ont ensuite été récoltées aux fins d’analyses et lavées avec 1 ml de PBS
(Phosphate Buffered Saline) stérile (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 • 2
H2O, 1,76 mM KH2PO4, pH ajusté à 7,4 avec HCl 1 N et complété avec de l’eau MilliQ).
Puis, les cellules ont été lysées dans 100 µl de tampon de lyse 1X (Passive lysis buffer)
(Promega) et la plaque a été agitée pendant 15 min à la température de la pièce (TP) afin de
bien compléter leur lyse . Le lysat des cellules a ensuite été homogénéisé à la pipette et 15
µl ont été prélevés et déposés dans une plaque à 96 puits pour les essais enzymatiques
luciférase. Ces derniers se sont déroulés comme suit : la plaque est entrée dans l’appareil
« Microliter plate luminometer » (Dynex) où 2 produits ont été ajoutés à un intervalle fixe
de 10 sec dans les puits, soit : 100 µl de « Luciferase Assay Reagent II » (LARII)
(Promega) et 100 µl de solution « Stop and Glow » (Promega). Après ce processus, les
résultats ont été affichés, ainsi que les différents ratios luciférase/luciférine. Les résultats
ont ensuite été analysés statistiquement par un test de t de Student's, et les différences ayant
une probabilité inférieure à 5% (i.e. une valeur de p<0,05) ont été considérées comme
significatives.
2.1.9 Lyse des cellules Jurkat et détection des protéines d’intérêt par
immunobuvardage
35
Les cellules Jurkat stables ont été lysées selon le protocole suivant : les cellules ont
tout d’abord été centrifugées 5 min à 214 g, puis le culot de cellules a été resuspendu avec 1
ml de PBS et recentrifugé afin de laver les cellules. Le tampon de lyse iTRAQ (20 mM
HEPES, 100 mM NaCl, 7 M urée, 4% CHAPS, 0,01 % SDS, 1 mM PMSF (Sigma), un
cocktail d’inhibiteurs de protéases (« complete EDTA-free » de ROCHE) pH 7,4 ajusté
avec du NaOH 1 N) a ensuite été ajouté. La lyse des cellules a été complétée par sonication
3 x 10 s (Output control aligné à 3) dans le bain sonicateur (Branson SONIFIER 450), en
respectant des pauses de 1 min sur glace entre les rondes de sonication. Le mélange a
ensuite été conservé sur glace pendant 20 min et vortexé à toutes les 5 min afin de bien
dénaturer les protéines. Le lysat a été clarifié par une centrifugation de 30 s à 16 000 g et
les protéines contenues dans le surnageant ont été dosées selon la méthode de Bradford en
utilisant différentes concentrations d’albumine sérique bovine (« Bovine Serum Albumine »;
BSA) comme standard. Du tampon de chargement (0,2 volume) contenant du bleu de
bromophénol a été ajouté aux extraits protéiques, qui ont été incubés à 95oC pendant 5 min
afin de dénaturer les protéines. Les extraits de protéines dénaturées ont été déposés dans les
puits d’un gel de polyacrylamide 10% et une électrophorèse a été réalisée à 20 mA pendant
90 min. Les protéines ont ensuite été transférées sur une membrane Amersham Hybond-P
(GE Healthcare) sous un courant continu de 100 V pendant 2 h à 4oC.
La membrane a été bloquée pendant 1 h dans un tampon « Tris Buffered Saline »
(TBS) (0,2 M Tris-HCl et 1,37 M NaCl pH 7,5 contenant 5 % de lait et 0,1% de Tween
(Sigma-Aldrich)) afin de réduire ses liaisons non spécifiques à des anticorps. La membrane
a ensuite été incubée en présence de différents anticorps primaires dans les conditions
suivantes : Anti-Procaspase-8 (Cell Signaling) (dilution 1/1000, incubation pendant 16h à
36
4oC) ; Anti-GADPH (Affinity Bio Reagents) (dilution 1/4000, incubation pendant 1 h à
TP); Anti-Dicer AKA8.4 (Provost et al. [42]) (dilution 1/1000 (FBS 10% dans TBS-
Tween), incubation pendant 16h à 4oC) ; Anti-B23 (Santa Cruz) (dilution 1/2000,
incubation pendant 2 h à TP) ; Anti-Aiolos (Santa Cruz) (dilution 1/250, incubation
pendant 1 h à TP) ; Anti-Ikaros (Santa Cruz) (dilution 1/5000, incubation pendant 1 h à
TP); Anti-Actine (Sigma) (dilution 1/2000, incubation pendant 1 h à TP); Anti-AGO2
(Abnova) (dilution 1/1000, incubation pendant 16 h à 4oC). Par la suite, les membranes ont
été lavées 3 x 10 min avec une solution de TBS-Tween et incubées avec l’anticorps
secondaire -- anti-mouse (1/30,000) ou anti-lapin (1/10,000), dépendamment de la
provenance de l’anticorps primaire utilisé -- pendant 1 h à TP, puis couplées à la
« Horseradish Peroxidase » (HRP). Les membranes ont été lavées à nouveau 3 x 10 min
avec la solution de TBS-Tween. Les complexes protéines - anticorps primaire - anticorps
secondaire ont ensuite été révélés avec le système « Enhanced Chemiluminescence Plus
Western Blotting Detection System » (GE Healthcare), permettant ainsi la détection des
protéines d’intérêt selon leur poids moléculaire sur un film (CL-X posureTM
FILM). Le film
a par la suite été scanné, puis l’image résultante a été traitée avec Adobe Illustrator afin de
faire une figure.
2.1.10 Essai de protection aux ARNases («RNase protection assay»;RPA)
Les expériences de RPA ont été réalisées par Dominique Ouellet et sont décrites plus
précisément dans Ouellet et al. [128]. Brièvement, les petits ARN (< 200 nt) ont été extraits
des différents clones des cellules Jurkat en utilisant la trousse d’isolation miRVana
(Ambion/Life technologies). Les analyses RPA ont été effectuées en incorporant des
37
nucléotides radiomarqués à des amorces d’ARN complémentaires aux nucléotides -5/32 et
33/59 de la région TAR du VIH-1, puis les amorces radiomarquées ont été hybridées avec
1-2 µg de petits ARN pendant 16 h à 54oC. Le mélange a ensuite été traité avec l’ARNase
A/T1 (Ambion) pendant 35 min à 37oC, puis il a été précipité à l’éthanol. Les ARN
protégés ont été resuspendus dans un tampon de chargement, séparés sur un gel dénaturant
PAGE (15%) et visualisés par autoradiographie.
2.1.11 Analyses protéomiques par spectrométrie de masse
Des échantillons de protéines des diverses lignées de cellules Jurkat, exprimant
l’ARN TAR du VIH-1 de manière stable, ont été soumis pour analyse protéomique à
grande échelle à la plate-forme protéomique du Centre de génomique de Québec, situé au
centre de recherche du CHUQ. Quatre clones différents de cellules Jurkat ont été envoyés
pour analyse, soit les Jurkat-shNEG (exprimant un shNeg contrôle à un niveau élevé), les
Jurkat-shTAR cl.1 (exprimant le shTAR à un niveau faible), les Jurkat-shTAR cl.3
(exprimant le shTAR à un niveau élevé), et les Jurkat-shTAR cl.4, qui eux n’expriment pas
le shTAR (Figure 14). Les termes shTAR et shNEG (« short-hairpin TAR/NEG ») ont été
utilisés à titre nominatif pour désigner une tige-boucle d’ARN contenant la région TAR du
VIH-1 et une tige-boucle contenant une séquence d'ARN qui cible une séquence délétée du
gène Rluc (NEG). Un spectromètre de masse QSTAR® XL de type « quadrupole-time-of-
flight » (AB SCIEX), couplé à un système de séparation des peptides « High performance
liquid chromatography- Liquid chromatography/Mass spectrometry and liquid
chromatography/Tandem Mass spectrometry » (HPLC-LC-MS/MS) (AB SCIEX), ont été
utilisés pour la quantification relative des protéines à l’aide du réactif iTRAQTM
.
38
Brièvement, après la dénaturation, la réduction, l’alkalination et la digestion, chaque
échantillon de peptides a été modifié avec un réactif iTRAQ®
distinct. Les échantillons
modifiés ont ensuite été mélangés ensemble pour être analysés par LC-MS/MS. Les
peptides identiques dérivés des différents échantillons possèdent une masse identique, mais
comme avec l’analyse MS/MS les ratios de l’intensité du signal du groupe reporteur
indiquent les ratios de la quantité des peptides présents, ceux-ci ont pu être utilisés afin de
déterminer la quantité relative des peptides dans les différents échantillons. Pour plus de
détails, se référer aux articles [131-133]. Les résultats obtenus, qui étaient sous la forme de
fichiers Excel, ont été exprimés sous la forme de ratios d’abondance relative des peptides
analysés dans les Jurkat-shTAR clones 1,3 et 4, en comparaison aux Jurkat-shNeg.
2.2 Résultats
Tel que discuté à la section 1.3, notre équipe a démontré que l’élément TAR du
VIH-1 est reconnu par la ribonucléase III Dicer et clivé pour produire des miARN [128]. Il
a été montré par des essais de retard sur gel (electrophoretic mobility shift assay; EMSA)
que Dicer, lorsqu’incubé in vitro avec la région d’ARN structuré TAR et marqué au 32
P, est
apte à la lier et à la cliver pour générer des fragments d’ARN de ~23 à 24 nt. La présence
de ces miARN a été confirmée in vivo par une analyse de transfert Northern dans les
cellules T CD4 + infectées pendant 48 h de la souche du VIH-1 VSV-G-pseudotyped (clone
NL4-3). Des essais de protection aux ARNases (« RNase protection assay »; RPA) ainsi
que des analyses d’élongations d’amorces (« Primer extension ») ont permis de déterminer
la séquence consensus de miR-TAR-5p et 3p. De plus, des analyses structurelles de TAR
ont été effectuées afin de déterminer les éléments favorisant l’activité ribonucléasique de
39
Dicer. Il a été montré que, comparativement à une extrémité de 2 nt, une extrémité
protubérante de 10 nt en 3’ de TAR diminue grandement l’efficacité de clivage par Dicer.
Ces résultats suggèrent que lorsqu’il y a une extension de l’extrémité 3’ de TAR, tel que vu
dans l’élongation du 5’ LTR du VIH-1, une forte diminution de l’activité de clivage par
Dicer aurait lieu. Finalement, il a été montré, par des essais luciférases avec des gènes
rapporteurs, que les miARN produits du clivage de TAR sont fonctionnels et libérés de
manière asymétrique, ce qui favorise la formation de miR-TAR-3p sur miR-TAR-5p. Pour
de plus amples détails, voir Ouellet et al. [128].
Dans l’optique de poursuivre ce projet, il fallait donc, afin de découvrir leur rôle,
identifier les cibles potentielles de ces miARN viraux.
Des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire avaient démontré
l’efficacité des miARN de TAR à réguler à la baisse l’expression du gène rapporteur
Renilla Luciferase (Rluc) couplé à 3 exemplaires du site de liaison (3XBS), qui est présumé
présent dans la région 3’UTR de l’ARNm de Procaspase-8 de cellules humaines en culture
(résultats non-publiés). Dès lors, des analyses bio-informatiques ont été réalisées dans le
but d’identifier d’autres protéines de la voie apoptotique pouvant réguler l’ARNm par les
miARN de TAR (miR-TAR-5p et miR-TAR-3p), ce qui a été fait à l’aide de l’algorithme
de « RNA Hybrid » (http://bibliserv.techfak.unibielefeld.de/rnahybrid/). Les cibles les plus
prometteuses de la voie de l’apoptose sont présentées en jaune à la Figure 7. L’appariement
entre les miARN et les différents ARNm-cibles, l’énergie libre de liaison (∆G) ainsi que la
position des différents sites de liaison aux miARN sont schématisés, pour chacune des
cibles de la voie de l’apoptose, à la Figure 8. D’autres ARNm d’intérêt pour le projet y sont
aussi schématisés.
40
Figure 7. Schéma de la voie de l’apoptose dans les cellules humaines. Les ARN
messager (ARNm) potentiellement régulés par les miARN miR-TAR-5p et miR-TAR-3p
sont affichés en jaune. Il est à noter que tous les ARNm cibles potentiels présentés
(Procaspase-8, Procaspase-10, APAF-1, Diablo et « BCL2 Binding component 3 » (BBC3),
aussi connu sous le nom de PUMA) exercent une activité pro-apoptotique. AIF,
« Apoptosis-inducing factor »; APAF-1, « Apoptotic Peptidase Activating Factor 1 »;
Apo2/TRAIL, « Apo2 ligand or tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing
ligand »; DD, « Death Domain »; FADD, « Fas-Associated protein with Death Domain »;
FasL, « Fas Ligand »; IAP, « Inhibitor of Apoptosis Protein »; PARP, « Poly (ADP-ribose)
polymerase »; PUMA, « p53 Upregulated Modulator of Apoptosis »
41
42
43
Figure 8. Sites de liaison potentiels pour les miARN miR-TAR-5p et miR-TAR-3p
dans les ARNm potentiellement régulés, en relation avec l’analyse protéomique
iTRAQ. Des sites de liaisons potentiels (BS) pour les miARN dérivés de l’élément TAR du
VIH-1, i.e. miR-TAR-5p/3p, ont été déterminés par analyses bio-informatiques pour les
ARNm codant Procaspase-8 (A), APAF-1 (B), Procaspase-10 (C), Diablo (D), « BCL2
Binding Component 3 » (BBC3) (E), Nucléophosmine B23 (F), Aiolos (G) et Ikaros (H).
Les flèches sur l’ARNm désignent les sites de liaison potentiels (BS) pour miR-TAR-5p
(en vert) et miR-TAR-3p (en bleu). Les barres présentes sur le duplex miARN:ARNm
représentent la région seed du miARN. L’appariement miARN: Site de liaison ainsi que le
« Minimal free energy » (MFE) ont été déterminés avec l’algorithme « RNA Hybrid »
(http://bibliserv.techfak .unibielefeld.de/rnahybrid/).« Binding Site », BS; « Minimal Free
Energy », « kilocalorie per mole » (kcal/mol); MFE; « Messenger RNA », mRNA;
« Nucleotide », nt; « Open reading frame », ORF; « Untranslated Region », UTR.
2.2.1 Essais de régulation génique par les miARN dérivés de l’élément
TAR du VIH-1
Une validation expérimentale de ces prédictions bio-informatiques a ensuite été
faite à l’aide d’un système de gènes rapporteurs bien établi au laboratoire. Pour ce faire, le
vecteur d’expression psiCHECK a été utilisé dans lequel il est possible d’insérer la
séquence d’un site de liaison d’intérêt en 3 exemplaires (3XBS) en aval du gène rapporteur
Renilla luciferase (Rluc), ainsi que le vecteur psiSTRIKE, dans lequel a été insérée la
séquence de l’élément TAR du VIH-1.
44
Les différents ARNm-cibles des composantes impliquées dans la voie de l’apoptose
ont d’abord été étudiés. Des cellules humaines HEK293 en culture ont été co-transfectées
avec 50 ng de vecteur psiCHECK, qui exprimait un gène rapporteur couplé à 3 exemplaires
du site de liaison présumé des miARN de TAR (3XBS), et 250 ng de vecteur psiSTRIKE-
TAR, qui exprimait quant à lui l’ARN TAR en tige-boucle (shTAR). Le niveau d’activité
des gènes rapporteurs Rluc et Firefly luciferase (Fluc) a ensuite été mesuré, afin de
documenter les effets régulateurs des miARN dérivés de TAR (Figure 9). Les résultats sont
exprimés en % d’expression de Rluc et normalisés par le niveau d’activité de Fluc.
Figure 9. Validation fonctionnelle des sites de liaison aux miARN de l’ARN TAR du
VIH-1 dans les ARNm de facteurs pro-apoptotiques. Des cellules HEK293 ont été co-
transfectées avec le vecteur psiSTRIKE (250 ng) (Promega), exprimant le shTAR, et le
vecteur rapporteur psiCHECK (50 ng), dans lequel le gène rapporteur Rluc était couplé à
un site de liaison aux miARN de l’ARN TAR présent en 3 copies (3xBS) pour les
différents ARNm-cibles. Les résultats représentent les valeurs d’activité luciférase
normalisées de Rluc/Fluc et expriment en % la valeur obtenue avec un shNEG, qui a été
utilisé dans les différentes cibles pour contrôler la normalisation. Le vecteur psiSTRIKE-
Rluc a été utilisé comme contrôle positif (n=1, en duplicata).
45
Les résultats obtenus pour les ARNm-cibles Diablo (Figure 8D), Procaspase-10
(Figure 8C) et APAF-1 (Figure 8B) montrent des régulations plutôt faibles par le shTAR,
qui atteignent un maximum de 20 % pour la protéine Diablo. L’ARN tige-boucle Rluc
(shRluc) (contrôle positif) induit quant à lui une très forte inhibition (~95%) de l’expression
du gène rapporteur Rluc sous ces conditions. Étant donnée la faible régulation observée
dans le cas de Diablo, Procaspase-10 et APAF-1, ceux-ci ont été laissés de côté pour
analyses ultérieures.
Plutôt que de passer par l’entremise de sites de liaisons (3XBS, à la Figure 9), le
3’UTR de BBC3/Puma, qui avait été cloné au laboratoire, a été utilisé directement pour une
analyse du gène rapporteur Rluc. Des cellules HEK293 ont été co-transfectées avec 50 ng
de vecteur psiCHECK, qui exprimait Rluc couplé au 3’UTR de BBC3/Puma, et une
quantité croissante de vecteur psiSTRIKE-TAR (de 0,25 ng à 250 ng d’ADN plasmidique),
afin de documenter l’effet dose-dépendance de la répression par les miARN (Figure 10).
La régulation à la baisse du gène rapporteur Rluc, conférée par le 3’UTR de
BBC3/Puma, atteint environ 20% (Figure 10), suggérant une régulation possible de
l’ARNm de BBC3/Puma par les miARN du VIH-1.
Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire suggéraient que le site de liaison
présumé aux miARN de TAR du VIH-1, présent dans la région 3’UTR de l’ARNm codant
pour la Procaspase-8 (Figure 8A), était fortement réprimé (~95%) dans le système de gène
rapporteur Rluc (résultats non-publiés). Cela incitait à approfondir ces résultats afin
46
Figure 10. Validation fonctionnelle des sites de liaison aux miARN de l’ARN TAR du
VIH-1 présents dans le 3’UTR de l’ARNm de BBC3/Puma. Des cellules HEK293 ont
été co-transfectées avec le vecteur psiSTRIKE (Promega) (de 0,25 à 250 ng), qui exprimait
le shTAR, et le vecteur rapporteur psiCHECK (50 ng), dans lequel le gène rapporteur Rluc
était couplé au 3’UTR de l’ARNm BBC3/Puma. Les résultats représentent les valeurs
d’activité luciférase normalisées de Rluc/Fluc et expriment en % la valeur obtenue avec un
shNEG, qui a été utilisé dans les différentes cibles comme contrôle pour la normalisation.
Les résultats sont exprimés comme étant la moyenne ± l’erreur standard (n=3, en
duplicata). *p<0,05 comparé au Jurkat-shNEG (test de t de Student's).
d’étudier sa régulation à son endroit d’origine dans le 3’UTR de l’ARNm Procaspase-8.
Des cellules HEK293 ont donc été co-transfectées avec 50 ng de vecteur psiCHECK, qui
exprimait Rluc couplé au 3’UTR de Procaspase-8, et une quantité croissante de vecteur
psiSTRIKE-TAR (de 0,25 ng à 250 ng d’ADN plasmidique), afin de documenter l’effet
dose-dépendance de la répression par les miARN (Figure 11).
Les résultats obtenus montrent une régulation maximale, conférée par le 3’UTR de
Procaspase-8 (Figure 11), d’environ 40% du gène rapporteur Rluc, suggérant un rôle
47
potentiel pour les miARN dérivés de l’élément TAR du VIH-1 dans la répression de la
Procaspase-8.
Figure 11. Validation des sites de liaison potentiels (BS) aux miARN de TAR dans le
3’UTR de Procaspase-8. Des cellules HEK293 ont été co-transfectées avec le vecteur
psiSTRIKE (Promega), qui exprimait le shTAR (de 0,25 ng à 250 ng), et avec une
construction reporteur faite avec le vecteur psiCHECK (Promega), dans lequel le gène
rapporteur RLUC était couplé avec le 3’UTR de l’ARNm de Procaspase-8 (50 ng). Une
construction exprimant un shNEG a été utilisée comme contrôle pour la normalisation. Les
résultats sont exprimés comme la moyenne ± l’erreur standard (n=4, en duplicata). *p<0,05
comparé au Jurkat-shNEG (test de t de Student's)
Par la suite, il a été vérifié si les miARN de TAR peuvent réguler les régions 5’UTR et
codantes de l’ARNm de la Procaspase-8, qui ont donc été clonées et insérées en aval du
gène rapporteur Rluc dans le vecteur psiCHECK. Les essais luciférase ont montré que la
région principalement régulée par les miARN de TAR est principalement le 3’UTR de
Procaspase-8, qui subit une régulation à la baisse d’environ 40 %, alors que la région
codante (« Open Reading Frame »; ORF) ne subit qu’une baisse légère de ~14 %et que la
*
48
région 5’ UTR ne subit aucun effet de régulation (Figure 12). Ayant montré que les miARN
dérivés de TAR régulent le gène rapporteur Rluc, il fallait ensuite déterminer le niveau de
protéine dans des cellules les exprimant.
Figure 12. Validation fonctionnelle des sites de liaison aux miARN de l’ARN TAR du
VIH-1 présents dans les diverses régions de l’ARNm de Procaspase-8. Des cellules
HEK293 ont été co-transfectées avec le vecteur psiSTRIKE (Promega), qui exprimait le
shTAR (250 ng), et avec une construction reporteur faite avec le vecteur psiCHECK
(Promega), dans lequel le gène rapporteur RLUC était couplé avec le 3’UTR, l’ORF et le
3’UTR de l’ARNm de Procaspase-8 (50 ng). Une construction exprimant un shNEG a été
utilisée comme contrôle pour la normalisation. Les résultats sont exprimés comme la
moyenne ± l’erreur standard (n=1, en duplicata, pour 5’UTR; n=3, en duplicata, pour
l’ORF; n=4, en duplicata, pour le 3’UTR). « Open Reading Frame », ORF; « Untranslated
Region », UTR. *p<0,05 comparé au Jurkat-shNEG (test de t de Student's)
2.2.2 Induction à la Prostratine des cellules J-lat et immunobuvardage
Après avoir validé la fonctionnalité des miARN de TAR dans la régulation du
3’UTR de Procaspase-8, a été testée leur capacité à réguler à la baisse l’expression
endogène des protéines d’intérêt. À cette fin, des cellules Jurkats, qui contenaient le
provirus du VIH-1 à l’état latent et retournaient en phase de réplication active par induction
*
*
*
*
49
à la Prostratine (10 µM) [134, 135], ont été utilisées. Il a été montré qu’en phase de latence,
les cellules infectées produisent une grande quantité de courts transcrits d’ARN TAR [136],
qui peuvent être clivés par Dicer pour générer des miARN [128, 129]. Donc, lors de
l’induction à la Prostratine (10 µM) pendant 6 à 24h, une perte de répression des ARNm
par les miARN devait avoir lieue, le VIH-1 retournant en phase de réplication active et
produisant par là de longs transcrits, qui sont moins susceptibles d’être clivés par Dicer. La
Figure 13 montre les différents patrons d’expression protéique, obtenus par des analyses
d’immunobuvardage, d’extraits protéiques préparés à partir de cellules J-lat traitées à la
Prostratine. Ces résultats montrent que, contrairement à ce qui était attendu, il y a eu une
diminution de l’expression des protéines Aiolos et Procaspase-8 après 24 h d’induction,
tandis que l’expression des protéines B23 et Ikaros semble avoir augmenté. De plus, il est à
noter qu’après une induction de 24 h, une nouvelle bande protéique est apparue au-dessus
d’Aiolos, ce qui laisse croire à l’expression d’un variant différent. Ces résultats montrent
donc que la Prostratine, en plus d’induire la réplication virale, semble jouer un rôle sur
divers facteurs cellulaires et nucléaires pouvant favoriser l’infection au VIH-1. Des
analyses plus poussées devront être effectuées afin de déterminer les causes exactes de ces
changements du niveau d’expression des protéines d’intérêt.
2.2.3 Analyse des lignées de cellules Jurkat exprimant le shTAR de
manière stable
Ces résultats ont incité à élargir le spectre des études et à monitorer l’ensemble du
protéome pouvant être affecté par les miARN de TAR. Pour ce faire, ont été comparées des
cellules Jurkat, exprimant de manière stable différents niveaux de shTAR (clones 1 à 4), à
50
une lignée exprimant un shNEG. Ces lignées ont toutes été produites au laboratoire par le
Dr. Dominique L. Ouellet, au cours de son doctorat, et congelées à -150oC pour des
utilisations futures. Pour effectuer la comparaison, les lignées ont donc été décongelées et
mises en culture, dans un milieu DMEM supplémenté, en présence de 400 µg/ml de G418,
afin de maintenir la sélection des cellules exprimant les ARN shTAR ou les shNEG.
Figure 13. Expression protéique des différentes cibles potentielles de miR-TAR-5p/3p
dans les cellules exprimant l’ARN TAR et induites à la Prostratine. Les cellules J-lat
ont été induites à la Prostratine (10 µM) ou non pour une durée de 6 h ou de 24 h, pour
ensuite être récoltées et lysées. Des extraits protéiques (50 µg) ont été préparés et séparés
sur du gel polyacrylamide SDS, puis analysés par immunobuvardage (IB) avec les
anticorps anti-Aiolos, anti-Procaspase-8, anti-Ikaros et anti-Nucléophosmine (NPM)/B23.
L’anti-GAPDH a été utilisé comme contrôle de chargement des protéines. « KiloDalton »,
kDa
2.2.3.1 Détection des miARN libérés dans les cellules Jurkat-shTAR
Dominique L. Ouellet a procédé à l’élaboration de ces lignées Jurkat stables afin
d’obtenir un modèle cellulaire simple pour l’étude des rôles des miARN dérivés de TAR.
Une fois la sélection effectuée, qui s’est faite sous pression négative à l’aide du G418 (400
51
µg/ml), il fallait déterminer si elles produisaient bien les miARN dérivés de TAR, soit miR-
TAR-5p et miR-TAR-3p. À l’aide de la technique par protection aux ARNases (RPA), il a
été montré que les cellules Jurkat shTAR cl. 1-2-3 produisent ces miARN (Figure 14). Par
contre, le clone 4, pour une raison encore inconnue, ne produit pas de miARN. Le shNEG,
qui, par manque de complémentarité avec l’amorce radiomarquée, ne peut s’hybrider avec
elle, n’apparaît pas par autoradiographie.
Figure 14. Détection des miARN libérés dans les Jurkat-shTAR. Les petits ARN (< 200
nt) ont été isolés des cellules Jurkat-shTAR cl.1 à cl.4, ainsi que le shNEG, puis analysés
par RPA. Les ARN protégés ont été séparés sur du gel dénaturant PAGE (15%) et
visualisés par autoradiographie. La colonne « probe only – Rnase » et la colonne « Probe
only + RNase » ont été utilisées comme contrôles. Les colonnes « 21 nt » et « 23 nt » ont
été utilisées comme échelles moléculaire. Tirée et modifiée des expériences effectuées par
Dominique L. Ouellet.
L’analyse des lignées de cellules Jurkat par « RNase protection assay » (RPA),
réalisée par le Dr. Dominique L.Ouellet, indique ceci : (i) la lignée Jurkat-shTAR cl.1
exprime de faibles niveaux du shTAR; (ii) la lignée Jurkat-shTAR cl.2 l’exprime
modérément; (iii) la lignée Jurkat-shTAR cl.3 l’exprime fortement; (iv) la lignée Jurkat-
52
shTAR cl.4 ne l’exprime pas du tout; et (v) la lignée Jurkat-shNeg l’exprime, elle-aussi,
fortement . Par la suite, la lignée Jurkat-shTAR cl.4 a donc été utilisée comme un contrôle
négatif (aucune production de miARN), ainsi que la lignée produisant le shNEG (miARN
ciblant une région délétée de Rluc). Les Jurkat-shTAR cl.1 et cl.3 ont elles-aussi été
utilisées afin de montrer l’effet dose-dépendance des miARN sur le protéome.
2.2.3.2 Analyses par immunobuvardage de type western
Les cellules ont été lysées, après 5 semaines de croissance, afin de recueillir des
extraits protéiques pouvant servir, à la plate-forme protéomique du Centre de génomique de
Québec, à des analyses par immunobuvardage de type western ainsi qu’à une analyse de
type iTRAQ.
Aucune différence notable du niveau d’expression des protéines n’a été observée
entre les différents clones à l’exception de la protéine Procaspase-8, qui est sous-exprimée,
comparativement au Jurkat-shTAR cl.4 et à shNeg (Figure 15), dans les Jurkat-shTAR cl.1
et cl.3. Ces résultats suggèrent que, dans ce modèle cellulaire, les niveaux d’expression de
Procaspase-8 sont effectivement régulés par les miARN de TAR .
2.2.3.3 Analyses protéomiques iTRAQ des Jurkats stables
2.2.3.3.1 Résultats de l’analyse protéomique iTRAQ
En parallèle aux analyses par immunobuvardage effectuées dans la section 2.2.3.1, un
échantillon de protéines a été envoyé, pour chaque lignée Jurkat, à la plate-forme
protéomique du Centre de génomique de Québec, où des analyses, faites à l’aide d’un
spectromètre de masse et d’un système de séparation des peptides HPLC (LC/MS/MS), ont
53
Figure 15. Expression protéique des différentes cibles potentielles de miR-TAR-5p/3p
dans les cellules Jurkat exprimant le shTAR de manière stable. Les cellules Jurkat
stables ont été mises en culture, dans un milieu DMEM supplémenté de G418 (400µg/ml)
pour une durée totale de 4 semaines. Quatre types de cellule ont été mis en culture : 3
clones exprimant le shTAR à divers niveaux (Jurkat-shTAR cl.1 : +/-, Jurkat-shTAR cl.3 :
++, Jurkat-shTAR cl.4 : - ) et un Jurkat-shNEG exprimant une séquence sans aucune
similitude avec le shTAR. Les cellules ont été récoltées et lysées selon le protocole décrit à
la section 2.1.6, puis les protéines ont été séparées sur un gel de polyacrylamide « Sodium
dodecyl sulfate » (SDS) et analysées par immunobuvardage (IB) avec les anticorps suivant :
anti-Dicer (A), anti-Aiolos (B), anti-Procaspase-8 (C), anti-Ago2, anti-
Nucléophosmine/B23 et anti-Ikaros (D). L’anti-GAPDH et l’anti-Actine ont été utilisés
comme contrôle de chargement des protéines sur le gel. Ces résultats sont représentatifs de
3 analyses par IB.
54
été réalisées à l’aide du réactif iTRAQ pour la quantification relative des protéines
cellulaires . Les résultats ont été obtenus en rapportant le niveau d’expression des protéines
détectées dans les cellules Jurkat-shTAR (clones 1,3 et 4) à leur niveau d’expression dans
les cellules Jurkat-shNEG.
La Figure 16 montre le rapport entre la lignée Jurkat-shTAR cl.1, qui présente très peu de
miARN produits, et le shNEG. Il est intéressant de constater que seulement 12 protéines
sont statistiquement exprimées, de manière différentielle, avec une valeur P (« P value »)
inférieure à 0.05. Ceci supporte l’idée, étant donné le faible taux de miARN produits, qu’il
y a très peu de différences entre ces deux échantillons.
Figure 16. Résultats de l’analyse protéomique iTRAQ des cellules Jurkat-shTAR cl.1.
Les cellules Jurkat ont été mises en culture dans un milieu DMEM supplémenté de G418
(400µg/ml) pour une durée totale de 4 semaines. Quatre types de cellules ont été mis en
culture : 3 clones exprimant l’ARN en tige-boucle de TAR (shTAR) à divers niveaux
(Jurkat-shTAR cl.1 : +/-, Jurkat-shTAR cl.3 : ++, Jurkat-shTAR cl.4 : - ) et un shNEG
exprimant une séquence sans aucune similitude avec le shTAR. Les cellules ont été
récoltées et lysées selon le protocole décrit à la section 2.1.6. Cinquante (50) µg de chaque
échantillon a été analysé par la plate-forme protéomique du Centre de génomique de
Québec. Les résultats présentent les rapports d’expression des peptides analysés entre les
cellules Jurkat-shTAR cl.1 (sample 1) et les cellules Jurkat-shNEG (sample N). valeurs en
vert : sous-exprimées; valeurs en rouge : surexprimées. Seules les protéines montrant une
différence d’expression statistiquement significative (p<0,05) ont été incluses dans le
tableau. Elles ont été placées en ordre décroissant d’expression en présence de l’ARN TAR.
« p value » (pVal)
55
La Figure 17 montre le rapport entre la lignée Jurkat-shTAR cl.3, qui produit en
grande quantité les miARN dérivés de TAR, et le shNEG. En tout, 41 protéines y sont
montrées comme statistiquement exprimées de manière différentielle, parmi lesquelles 20
sont sous-exprimées. Ces protéines jouant différents rôles importants au niveau cellulaire, il
sera intéressant, dans de futures expériences, de voir leurs implications dans l’infection et la
latence du VIH-1.
La Figure 18 montre quant à elle le rapport entre la lignée Jurkat-shTAR cl.4, qui
avait été montrée comme ne produisant aucun miARN (Figure 14), et le shNEG. Y est
observable que 25 protéines, dans ce rapport, ont été statistiquement exprimées de manière
différentielle, parmi lesquelles 22, comparativement au shNEG, ont été surexprimées dans
le clone 4. Ce résultat laisse entrevoir l’effet des miARN produits par le shNEG sur la
cellule.
Une fois ces résultats obtenus, il fallait chercher, parmi les messagers des protéines,
ceux ayant des sites de liaisons aux miARN miR-TAR-5p et 3p, le but étant de trouver les
protéines pouvant être directement régulées par les miARN et pousser l’étendue de nos
recherches.
2.2.3.3.2 Analyses bio-informatiques des nouvelles cibles potentielles
Les résultats obtenus par les analyses protéomiques des lignées de cellules Jurkat-
shTAR montrent que le niveau d’expression de plusieurs protéines cellulaires est altéré par
l’expression des miARN dérivés de l’élément TAR du VIH-1. L’analyse bio-informatique
des ARNm codant pour les protéines qui sont régulées à la baisse chez le clone 3 et qui
56
57
Figure 17. Résultats de l’analyse protéomique iTRAQ des cellules Jurkat-shTAR cl.3.
Les cellules Jurkat ont été mises en culture dans un milieu DMEM supplémenté de G418
(400µg/ml) pour une durée totale de 4 semaines. Quatre types de cellules ont été mis en
culture : 3 clones exprimant l’ARN en tige-boucle de TAR (shTAR) à divers niveaux
(Jurkat-shTAR cl.1 : +/-, Jurkat-shTAR cl.3 : ++, Jurkat-shTAR cl.4 : - ) et un shNEG
exprimant une séquence sans aucune similitude avec le shTAR. Les cellules ont été
récoltées et lysées selon le protocole décrit à la section 2.1.6. Cinquante (50) µg de chaque
échantillon a été analysé par la plate-forme protéomique du Centre de génomique de
Québec. Les résultats présentent les rapports d’expression entre les cellules exprimant le
Jurkat-shTAR cl.3 (sample 3) et les cellules exprimant le shNEG (sample N). valeurs en
vert : sous-exprimées; valeurs en rouge : surexprimées. Seules les protéines montrant une
différence d’expression statistiquement significative (p<0,05) ont été incluses dans le
tableau. Elles ont été placées en ordre décroissant d’expression en présence de l’ARN TAR.
« p value » (pVal)
58
Figure 18. Résultats de l’analyse protéomique iTRAQ des cellules Jurkat-shTAR cl.4.
Les cellules Jurkat ont été mises en culture dans un milieu DMEM supplémenté de G418
(400µg/ml) pour une durée totale de 4 semaines. Quatre types de cellules ont été mis en
culture : 3 clones exprimant l’ARN en tige boucle de TAR (shTAR) à divers niveaux
(Jurkat-shTAR cl.1 : +/-, Jurkat-shTAR cl.3 : ++, Jurkat-shTAR cl.4 : - et un shNEG
exprimant une séquence sans aucune similitude avec le shTAR. Les cellules ont été
récoltées et lysées selon le protocole décrit à la section 2.1.6. Cinquante (50) µg de chaque
échantillon a été analysé par la plate-forme protéomique du Centre de génomique de
Québec. Les résultats présentent les rapports d’expression des peptides analysés entre les
cellules exprimant les Jurkat-shTAR cl.4 (sample 4) et les cellules exprimant le Jurkat-
shNeg (sample N). valeurs en vert : sous-exprimées; valeurs en rouge : surexprimées.
Seules les protéines montrant une différence d’expression statistiquement significative
(p<0,05) ont été incluses dans le tableau. Elles ont été placées en ordre décroissant
d’expression en présence de l’ARN TAR. « p value » (pVal)
expriment fortement le shTAR, a de plus permis d’identifier, au sein de certains ARNm,
des sites de liaison potentiellement régulés par les miARN dérivés de TAR. Cinq de ces
protéines se sont démarquées par le niveau d’appariement élevé entre leur ARNm et la
région « seed » des microARN miR-TAR-5p et miR-TAR-3p, soit Exportin-5, SAP-18,
eIF4B, RAD23B et Nucleolin (Figure 19).
59
60
Figure 19. Sites de liaison des miARN miR-TAR-5p et miR-TAR-3p dans les ARNm
étant potentiellement régulés, en relation à l’analyse protéomique iTRAQ. Des sites de
liaisons potentiels (BS) pour les miARN dérivés de l’élément TAR du VIH-1, i.e. miR-
TAR-5p/3p, ont été déterminés par analyses bio-informatiques pour les ARNm codant
Exportin-5 (A), SAP18 (B), « UV excision repair protein RAD23 homolog B » (RAD23B)
(C), « Eukaryotic translation initiation factor 4B » (eIF4B) (D) et Nucleolin (E). Les
flèches sur l’ARNm désignent les sites de liaison potentiels (BS) pour miR-TAR-5p (en
vert) et miR-TAR-3p (en bleu). Les barres présentes sur le duplex miARN:ARNm
représentent la région seed du miARN. L’appariement miARN: Site de liaison et le
« Minimal free energy » (MFE) ont été déterminés avec l’algorithme « RNA Hybrid »
(http://bibliserv.techfak .unibielefeld.de/rnahybrid/).« Binding Site », BS; « Minimal Free
Energy », « kilocalorie per mole » (kcal/mol); MFE; « Messenger RNA », mRNA;
« Nucleotide », nt; « Open reading frame », ORF; « Untranslated Region », UTR
Ces analyses bio-informatiques sont prometteuses, car elles ont montré que ces
protéines possèdent de fortes énergies d’appariement (MFE) avec les miARN dérivés de
l’élément TAR. De futures analyses avec elles seront nécessaires afin de confirmer leur rôle
dans la pathogénicité du VIH-1.
61
Chapitre 3.
Discussion générale
L’objectif de recherche, au cours de cette maîtrise, était de caractériser les ARNm
de l’hôte pouvant être ciblés par les miARN dérivés de l’élément TAR du VIH-1. Il a déjà
été rapporté que plusieurs virus sont aptes à produire des miARN capables de cibler le
génome de la cellule hôte ainsi que leur propre génome (voir section 1.2.1.1). Cette
maîtrise venait appuyer l’ajout du VIH-1 à ce répertoire, car en plus de ceux présentés à la
section 1.2.3.4, il existe probablement d’autres miARN jouant un rôle dans la pathogénicité
du VIH-1. L’équipe de Klase et al. [130] avaient répertorié deux miARN, provenant aussi
de la région TAR du VIH-1, différant à quelques nucléotides près de séquences identifiées
par notre laboratoire [128]. Ces différences pouvaient provenir de la souche de virus
utilisée, du modèle cellulaire ou même des méthodes de séquençage utilisées. Aussi
minimes soient-elles, des différences dans la séquence qui compose la région seed des
miARN viraux peuvent en effet avoir des conséquences importantes sur le répertoire des
ARNm cellulaires pouvant être régulés, entraînant par là des phénotypes totalement
différents pour chaque séquence. Il était donc de mise, pour améliorer la compréhension de
la pathogénèse du VIH-1, (i) d’initier l’étude du rôle des miARN de TAR à l’aide des
séquences qui avaient été élucidées par notre laboratoire, (ii) en plus d’identifier et
caractériser des ARNm-cibles potentiels.
Il était intéressant de constater que dans la phase asymptomatique de l’infection du
VIH-1, seul un court transcrit d’ARN viral, qui provient de la région TAR du VIH-1, est
produit dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Cela menait à penser qu’en phase de
62
latence, le virus produirait un court transcrit d’ARN de TAR qui serait ensuite clivé par
Dicer, en des miARN aptes à réguler plusieurs ARNm de la cellule hôte, établissant ainsi
un contexte favorable à la réplication du VIH-1. Comme il avait été démontré par notre
laboratoire, le court transcrit de TAR, en phase latente du virus, est plus favorable au
clivage de la ribonucléase Dicer qu’une version possédant 10 nt protubérants en 3’ [128],
ce qui suggère qu’en cette phase, une production de miARN dérivés des TAR aurait lieu,
alors qu’une fois engendré le processus d’élongation du 5’LTR du VIH-1, il y aurait une
diminution des miARN produits par Dicer dans les cellules en réplication.
De plus, il avait été montré que le VIH-1 infecte les monocytes, mais n’y entre
jamais en processus de réplication. La très faible expression, voire l’absence de la
ribonucléase Dicer dans ceux-ci les rendrait-elle inaptes à supporter la réplication virale
[119, 137]? Une meilleure compréhension des mécanismes de production des miARN
viraux et de la régulation génique devait permettre de mieux apprécier le rôle et
l’importance des miARN dans la pathogénèse virale.
Des résultats obtenus antérieurement au laboratoire avaient permis de constater, au
sein de cellules infectées par « RNase protection assay » (RPA), la présence de miARN
dérivés de l’élément TAR du VIH-1, miR-TAR-5p et miR-TAR-3p, et de valider leur
fonctionnement dans la voie des miARN, ce qui avait été fait par des analyses de gène
rapporteur [128]. La suite logique du projet consistait donc à découvrir les ARNm pouvant
être ciblés par les miARN dérivés du VIH-1, question de confirmer leur rôle.
L’une des stratégies utilisées, afin de déterminer la régulation potentielle d’un site
de liaison par un miARN, était d’à la fois effectuer, dans un vecteur d’expression
psiCHECK et en aval du gène rapporteur de Renilla luciferase, des essais luciférase avec
63
des constructions contenant 3 fois les sites de liaison au miARN (3XBS), et co-exprimer un
vecteur psiSTRIKE pouvant produire des miARN en grande quantité. Les constructions
contenant trois fois les sites de liaison en répétition ont été utilisées au préjudice de
constructions contenant une seule fois les sites de liaison (telles celles normalement vues in
vivo, par exemple), car cette stratégie, utilisée à des fins qualitatives, permettait une
amplification du signal de répression de la traduction du gène Rluc par les miARN produits.
Des résultats préliminaires avaient montré que la Procaspase-8, l’une des protéines
initiatrices de la mort cellulaire programmée, pouvait être ciblée par les miARN dérivés de
l’élément TAR (résultats non-publiés). L’équipe de Klase et al. ayant montré que certains
miARN dérivés de TAR protègent les cellules infectées de l’apoptose en altérant
l’expression de certains gènes cellulaires [130], il devenait pertinent de vérifier si les
miARN miR-TAR-5p et 3p, découverts dans notre laboratoire, pouvaient eux-aussi
protéger les cellules infectées de la mort cellulaire en diminuant l’expression de protéines
pro-apoptotiques. En utilisant l’algorithme « RNA Hybrid »
(http://bibliserv.techfak.unibielefeld.de/rnahybrid/), un criblage de ces protéines a donc été
effectué afin de déterminer leurs sites de liaison potentiels. De ces analyses, trois protéines
se sont démarquées par leur énergie d’appariement minimale (« Minimal Free Energy »;
MFE) avec miR-TAR-5p et 3p : APAF-1, DIABLO et Procaspase-10 (Figure 8 : (B), (C) et
(D)). Les analyses luciférases subséquentes avec elles n’ont cependant pas donné l’effet
escompté (Figure 9). La régulation maximale de la Rluc ne dépassant pas 20 %, ces
protéines ont été abandonnées du projet. La régulation de 20 % d’une protéine pourrait
avoir un effet considérable au sein des cellules, mais les effets de régulation sur les
constructions contenant les 3XBS, comparativement aux sites de liaison endogènes de
64
l’ARNm, devraient être amplifiés. Pourquoi cette différence ? Les constructions 3XBS sont
faites pour répondre aux caractéristiques d’un site de liaison ayant le meilleur pouvoir de
régulation, c’est-à-dire d’un site de liaison : i) situé dans le 3’UTR au moins à 15 nt du
codon stop; ii) situé loin du centre de longs 3’UTR; et iii) situé proche d’un ou plusieurs
autres sites de liaison aux miARN, de façon à avoir un effet de coopération à la régulation
du gène (voir P.Bartel pour une revue complète [73]).
Pour la suite du projet, étant donné que parallèlement aux 3XBS, un clonage des
3’UTR des ARNm des protéines d’intérêt (BBC3/Puma et Procaspase-8) avait été effectué,
ceux-ci ont donc été utilisés directement plutôt que par l’intermédiaire des sites de liaison
3XBS.
Pour BBC3/Puma, une baisse encore une fois de 20 % de l’expression de la
luciférase avait été observée, et ce, à la plus forte dose de transfection du psiSTRIKE TAR
(250 ng) (Figure 10). Une baisse d’expression de 20% de la luciférase avec une
construction 3’UTR est non négligeable, car si de manière endogène un miARN est apte à
réduire l’expression d’un messager de 20% via son 3’UTR, des variations, aussi infimes
soient-elles, peuvent avoir de grands effets.
BBC3/Puma est une protéine pro-apoptotique membre de la famille Bcl-2, dans la
sous-famille des « BH3-only ». Elle est activée par le gène suppresseur de tumeur p53 et
engendre la mort cellulaire programmée via la dépolarisation mitochondriale et le
relâchement du cytochrome c au cytosol [138, 139]. Une diminution de BBC3 par les
miARN dérivés du VIH-1 devrait donc avoir pour conséquence de protéger les cellules
infectées de la mort cellulaire, liée aux dommages à l’ADN par l’expression de p53, et ainsi
de permettre à l’infection du VIH-1 de se propager dans l’organisme. Cependant, la suite du
65
projet avec BBC3 n’a pas eu lieu, pour cause de limitation dans la possession de
l’anticorps.
Pour ce qui est de Procaspase-8, des constructions avaient été effectuées afin de
montrer ses différentes régions pouvant être régulées par le psiSTRIKE-TAR. Il avait été
observé que les miARN de TAR exercent principalement leur régulation via la région
3’UTR, par une diminution de 40% de l’expression de Rluc (Figure 11). Les miARN
peuvent aussi exercer des effets régulateurs sur la région « Open Reading Frame » (ORF),
malgré l’absence de sites de liaison potentiels pour miR-TAR-5p/3p (Figure 12). Des
expériences supplémentaires seront nécessaires afin de dénombrer le ou les élément(s) de
régulation présent(s) dans cette région.
La Procaspase-8 est l’une des protéines initiatrices de la voie extrinsèque de
l’apoptose classique. Elle agit via des récepteurs de mort cellulaire et le « death-inducing
signaling complex » (DISC) [140]. Il a été rapporté que la mort cellulaire des cellules
infectées par le VIH-1 s’effectue principalement par l’activation de la voie extrinsèque de
l’apoptose, via le clivage protéolytique de la Procaspase-8 [141, 142]. Il appert donc qu’une
diminution de l’expression de la Procaspase-8 pourrait améliorer la survie des cellules
infectées par le VIH-1.
Il est important de considérer qu’un résultat négatif dans les essais de gènes
rapporteurs ne veut pas nécessairement dire que, in vivo, un ARNm ne sera pas régulé par
ces miARN. À l’inverse, un résultat positif demanderait à être confirmé in vivo. Ceci est dû
au fait que les essais sont basés sur l’utilisation de vecteurs d’expression qui diffèrent de
l’expression endogène : les gènes sont exprimés via un promoteur T7, de sorte qu’ils sont
transcrits en très grande quantité, ce qui peut exagérer des réponses ou effets potentiels.
66
C’est pourquoi les résultats provenant de ces essais doivent absolument être confirmés au
niveau des protéines endogènes, afin d’évaluer s’il y a régulation ou non de l’ARNm par
les miARN. Ces essais de gènes rapporteurs ont cependant l’avantage de valider les
interactions ARNm:miARN et la fonctionnalité des sites de liaison présumés des miARN
au sein des ARNm-cibles d’intérêt.
Afin de voir s’il y a une régulation des protéines d’intérêt dans un modèle de
cellules infectées in vivo, une collaboration avec le Dr. Michel Tremblay, de l’axe
d’infectiologie, avait été faite. Celui-ci nous avait généreusement donné des extraits
protéiques de cellules J-lat de la souche 6.3, induites ou non à la Prostratine (10 µM) durant
6 h ou 24 h. Les J-lat sont des cellules de la lignée Jurkat qui ont intégré l’ADN du VIH-1
dans leur génome, mais dont le provirus demeure sous forme latente. L’induction à la
Prostratine induit la réplication virale de 30 à 75 % des cellules via l’activation de la voie
NF-κB [134, 135]. Tel que vu précédemment dans ce mémoire, en réplication virale, il y a
une élongation complète du 5’LTR du VIH-1 et ainsi une possible diminution de la
production des miARN dérivés de TAR, ce qui est dû à la formation de longs transcrits qui
sont moins clivés par Dicer. Avec une forte réplication virale, donc, devrait s’engendrer une
perte de régulation par les miARN dérivés de TAR; une augmentation du niveau
d’expression des protéines potentiellement régulées par la forme latente des J-lat devrait par
conséquent avoir lieu.
Or les résultats obtenus ne concordent pas avec cette hypothèse (Figure 13). Pour
Aiolos et Procaspase-8, après 24h d’induction, il y a une diminution de leur expression, et
pour Aiolos, l’apparition d’une bande plus haute (~62 kDa). Pour Ikaros et
Nucléophosmine/B23, il y a une légère augmentation du niveau de protéines après 6h
67
d’induction, qui redescend un peu après 24h. Deux questions ressortent de cela : pourquoi y
a-t-il une diminution du niveau protéique d’Aiolos et Procaspase-8 ? Et pourquoi une
nouvelle bande apparaît-elle au-dessus d’Aiolos ? Sachant que la Prostratine induit
l’expression de NF-κB via la dégradation d’un de ses inhibiteurs [134], il serait possible
que NF-κB, en plus de se lier aux promoteurs du VIH-1, lie d’autres promoteurs de gènes,
tels des gènes de miARN. Donc, de nouveaux miARN présents au sein des cellules en
réplication lieraient des ARNm, tels Aiolos et de Procaspase-8. Cette liaison pourrait même
masquer un possible effet des miARN dérivés de TAR et ainsi avoir biaisé l’interprétation
de nos résultats.
Cette hypothèse pourrait aussi expliquer les résultats concernant l’apparition d’une
nouvelle bande d’Aiolos, supérieure à celle présente sans induction. Sont connues,
présentement, six isoformes différents pour Aiolos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Il est
donc possible que le facteur nucléaire NF-κB induise l’expression d’une autre isoforme
normalement absente de cette cellule. Il est pourtant étonnant de constater que l’expression
protéique d’Ikaros et NPM/B23 montre un pic d’expression après 6 h d’induction, car
seulement 35% des cellules, après ce temps, sont en réplication [134, 135]. Serait-ce
possible que ces changements soient de faux positifs? Des études plus poussées avec ces
cellules devraient être envisagées afin de mieux comprendre ces phénomènes et de
déterminer si la Prostratine et NF-κB induisent l’expression de gènes autres que ceux du
VIH-1, car cela pourrait brouiller les pistes de futures expériences avec elles.
Aiolos et Ikaros sont des facteurs de transcription qui peuvent se dimériser et qui
ont été montrés comme régulateurs dans le développement et l’homéostasie des
lymphocytes. Ces protéines possèdent six structures « Zing finger » leur conférant la
68
capacité de lier l’ADN ainsi que des domaines de dimérisation [143-145]. Vu leur
importance dans les lymphocytes, une diminution de l’expression de ces facteurs, ou encore
la présence d’un nouvel isoforme au sein des cellules, pourraient expliquer les changements
des patrons d’expression protéique dans les cellules J-lat.
Ayant obtenus des résultats préliminaires peu concluants avec les cellules J-lat, il
avait été décidé de se concentrer sur une analyse complète d’un protéome pouvant
potentiellement être régulé par les miARN dérivés de TAR. Dominique L. Ouellet avait
produit, au cours de son doctorat, diverses lignées cellulaires Jurkat, exprimant à différents
niveaux le shTAR (Figure 14), ainsi qu’un shNEG ciblant une région délétée du gène Rluc.
Ce qui était particulièrement intéressant, au sujet de ces lignées, était leur niveau
d’expression du shTAR, qui différait d’un clone à l’autre. En mettant en culture ces
diverses lignées et en comparant le profil protéique des unes avec les autres, il devait donc
être possible d’observer un phénomène dose-dépendance.
Il suffisait, afin de déterminer à large spectre les protéines pouvant être régulées par
les miARN, de mettre les cellules en culture, de les laisser croître et de récolter les
protéines. Une partie des protéines a donc été analysée par immunobuvardage de type
western, tandis qu’une autre a été envoyée à la plate-forme protéomique du Centre de
génomique de Québec pour des analyses par spectrométrie de masse.
Concernant les immunobuvardages faits sur les échantillons, seule la protéine
Procaspase-8 a montré une diminution d’expression pour les lignées Jurkat-shTAR cl.1 et
cl.3, alors que les autres protéines d’intérêt n’ont pas montré de différence d’expression
notable (Figure 15).
69
Pourquoi les résultats des expériences J-lat et des cellules Jurkats exprimant de
manière stable le shTAR ne concordent pas ? L’avantage à utiliser des Jurkats stables au
lieu de cellules J-lat est qu’il y a moins de chance, ainsi, d’obtenir de faux-positifs/négatifs,
leur système de production de miARN étant beaucoup plus simple. Cependant, les cellules
J-lat offrent quant à elles un système qui se rapproche de ce que l’on pourrait apercevoir in
vivo.
L’utilisation d’un simple vecteur d’expression psiSTRIKE, exprimant la tige-boucle
TAR sous pression sélective avec le G418 (400 µg/ml), engendre moins de répercussions
au sein de la cellule que des cellules infectées latentes, car celles-ci, lors de l’induction à la
Prostratine, engendrent une réplication active du virus ainsi qu’une expression de protéines
virales. Ces protéines ont déjà été montrées comme pouvant altérer diverses cascades
signalétiques, ce qui peut mener à diverses maladies. Par exemple, par l’effet « bystander »,
Tat enclenche à elle seule, entre autres, la perméabilisation mitochondriale, le relâchement
du cytochrome c, l’inactivation du cytochrome c oxydase (COX), en plus de contribuer au
sarcome de Kaposi et à la démence associée au VIH [146-148]. Pour cette raison, les
cellules Jurkats stables, qui ont un système plus rudimentaire, ont été utilisées, de façon à
démontrer directement, de cause à effet, le rôle des miARN dans la différence d’expression
du protéome.
Il est intéressant de constater, comparativement au shNEG, que seulement une
douzaine de protéines ont été statistiquement exprimées de manière différentielle dans la
lignée Jurkat-shTAR cl.1 (qui exprime peu le shTAR). Ceci supporte l’idée que, le clone 1
ne produisant que très peu de miARN (Figure 14), il y aurait en conséquence de cela très
peu d’ARNm altérés (Figure 16). Les cellules Jurkat-shTAR cl.3, qui expriment des
70
niveaux plus élevés de miARN (Figure 14), montrent davantage de protéines
différentiellement exprimées (Figure 17), ce qui appuie le concept de dose-dépendance. Les
protéines sous-exprimées ont été scrutées à la loupe, avec l’algorithme « RNA Hybrid »
(http://bibliserv.techfak.unibielefeld.de/rnahybrid/), afin de trouver dans leurs messagers
des sites de liaison potentiels pour les miARN miR-TAR-5p et miR-TAR-3p. Plusieurs de
ces messagers ont montré des sites de liaison possibles aux miARN : c’est le cas pour
SAP18, eIF4B, RAD23B, Nucleolin et Exportin-5 (Figure 19). Quel lien possible ces
protéines ont-elles avec le VIH-1 et la latence ?
Tout d’abord, SAP-18 (Sin3a-associated protein of 18 kD) est une composante
protéique du complexe cellulaire Sin3/HDAC (« Histone deacetylase ») [149]. Les
complexes HDAC sont des modificateurs épigénétiques connus pour affecter la
transcription cellulaire. Il a été montré que SAP-18 fait la liaison entre la protéine virale IN
(Intégrase) et les virions, et que cette association est requise pour la transcription inverse du
génome du VIH-1 dans la cellule hôte [150]. Des études de dominants négatifs du
complexe Sin3a/HDAC ont montré qu’il y avait une diminution de l’association virions-
Intégrase ainsi que du pouvoir infectieux de ces virions [150]. Les résultats protéomiques
obtenus, en rapport au NEG, montrent une diminution de 91,5 % de la protéine SAP-18
dans le clone 3 (Figure 17), ainsi que deux sites de liaison potentiels aux miARN du VIH-1
dans ce messager (Figure 19B). Une diminution de l’expression de SAP-18 pourrait donc
empêcher les virions de réinfecter les cellules latentes de façon à ce qu’elles demeurent
inaperçues du système immunitaire.
RAD23B (« UV excision repair protein RAD23 homolog B ») est une protéine
située au croisement de la réparation par excision de nucléotides (NER; « Nucleotide
71
excision repair ») et de la dégradation des protéines via le protéasome [151]. RAD23B est
identifiée comme étant un facteur impliqué dans la reconnaissance des lésions à l’ADN et
comme récepteur à l’ubiquitine, ce qui la rend habile à gérer les conditions de stress de la
cellule à divers niveaux [151, 152]. Les résultats protéomiques obtenus ont montré, en
comparaison au NEG, une baisse de 51,6 % de RAD23B dans le clone 3 (Figure 17), et les
analyses bio-informatiques montrent que RAD23B possède deux sites de liaison potentiels
aux miARN dérivés de TAR (Figure 19C). De plus, des études effectuées par Klase et
al.ont montré que la protéine ERCC1 (« Excision repair cross complementing-group 1 »)
est sous-exprimée dans les cellules latentes infectées par les miARN dérivés de TAR [130].
La diminution de cette protéine au sein des cellules infectées a pour conséquence
d’engendrer une protection des cellules envers l’apoptose [130]. Or, le rôle de RAD23B est
pratiquement le même qu’ERCC1. Une diminution de RAD23B pourrait donc, elle aussi,
augmenter les chances de survie des cellules infectées. Ces spéculations, afin de confirmer
le rôle de RAD23B dans l’infection au VIH-1, devront être vérifiées dans de futures
analyses.
La protéine eIF4B (« eukaryotic translation initiation factor 4B ») fait partie de la
famille des facteurs d’initiation de la traduction chez les eucaryotes (eIFs; « eukaryotic
translation initiation factors »). Le complexe eIF4, qui contient une hélicase (eIF4A) ainsi
qu’une protéine liant la coiffe de l’ARNm (eIF4E), est assisté par eIF4B en tant que
cofacteur dans le processus d’ouverture (« unwinding ») des structures secondaires de
l’ARN, qui permet au ribosome de s’y placer et de traduire l’ARNm en protéines. Il a été
montré que la diminution d’eIF4B par des siARN engendre une déplétion des polysomes
ainsi qu’une diminution générale de la traduction [153, 154]. Les résultats protéomiques
72
obtenus ont montré, en comparaison au shNEG, une baisse de 77,6 % d’eIF4B dans les
cellules Jurkat-shTAR cl.3 (Figure 17), et les analyses bio-informatiques montrent
qu’eIF4B possède quatre sites de liaison potentiels aux miARN dérivés de TAR (Figure
19D). Les cellules infectées latentes pourraient donc avoir, vu le rôle de cette protéine, un
niveau de traduction inférieur à celui des cellules saines. De futures expériences devront
être effectuées afin de déterminer le rôle précis de cette baisse d’expression d’eIF4B dans la
pathogénicité du VIH-1.
La Nucléoline est une protéine navette (« Shuttling protein ») se situant
principalement au nucléole, un peu au cytoplasme et à la surface des cellules, où elle
facilite l’internalisation des particules du VIH-1 [155]. Il a été découvert que le site apical
SLS2-A7, dans le génome du VIH-1, possède des sites de liaison à la protéine Nucléoline,
et que cette liaison serait impliquée dans divers aspect du cycle de réplication du virus
[156], tels l’assemblement des virions et un bourgeonnement qui résulterait de son
interaction avec la protéine virale Gag [157]. En comparaison au shNEG, une diminution
de 33,4 % de la Nucléoline a été observée dans les cellules Jurkat-shTAR cl.3 (Figure 17),
et celle-ci possède deux sites de liaison potentiels aux miARN de TAR dans son ARNm
(Figure 19E). Une diminution de cette protéine dans les cellules latentes pourrait donc avoir
pour conséquence, par une diminution de la formation de virions infectieux lors de la
latence, de diminuer le pouvoir infectieux du virus.
Il est intéressant de constater qu’Exportin-5 est ciblée par miR-TAR-5p avec un
degré d’appariement presque parfait, c’est-à-dire avec une énergie de liaison de -34.4
kcal/mol. L’export au cytoplasme est considéré comme étant l’étape limitante de la voie des
miARN (voir 1.1.3.3). Il a, de plus, été démontré qu’une conséquence directe de la
73
diminution d’Exportin-5 est une baisse généralisée des miARN matures de 40 à 60 % dans
la cellule [38]. Ainsi, en présence d’une grande quantité de shTAR, une baisse du
transporteur dans les cellules pourrait favoriser la formation de miARN viraux matures au
détriment des miARN endogènes, peu abondants en raison de la saturation du transporteur.
Cette répression des miARN endogènes sur leurs cibles pourrait expliquer la surexpression
observée de 21 protéines dans les Jurkat-shTAR cl.3 (Figure 17). Il serait intéressant
d’analyser plusieurs de ces protéines pour comprendre leur rôle dans la latence du VIH-1.
Afin de déterminer la raison de leur surexpression au sein des cellules exprimant les
miARN de TAR, des analyses de biopuces à ARNm et à miARN pourraient être effectuées.
Cela permettrait d’établir des corrélations miARN:ARNm et de voir s’il y a conservation
des niveaux de miARN matures dans les divers clones, tout en sachant qu’une perte
d’expression de miARN peut engendrer une augmentation de plusieurs protéines.
Tel que discuté dans l’introduction (voir section 1.2.3.1), il a été montré par l’équipe
de Kuan-Teh Jeang qu’il y a une diminution majeure de production de miARN matures
dans les cellules infectées, tant au niveau in vitro, avec des transfections de plasmides
infectieux dans des cellules [91], qu’au niveau in vivo, dans des cellules de patients atteints
du VIH-1[92], et ce, peu importe le stade d’infection. Cette diminution pourrait être causée
par une diminution d’Exportin-5 au sein de ces cellules. Des études plus approfondies de ce
sujet sont de haute importance, car une simple réexpression d’Exportin-5 pourrait changer
considérablement le phénotype observé dans les cellules infectées. Cette piste pourrait donc
être un élément clé d’une éventuelle thérapie chez les patients atteints du VIH-1.
Pour ce qui est du rapport entre la lignée Jurkat-shTAR cl.4 et le shNEG, il est
étonnant de constater qu’autant de protéines aient été surexprimées alors que seulement
74
trois aient été sous-exprimées (Figure 18). La lignée Jurkat-shTAR cl.4 a été montrée
comme n’exprimant pas le shTAR (Figure 14); donc la comparant avec la lignée shNEG, il
est possible que seulement l’effet des miARN de NEG soit observé. En d’autres mots, les
protéines surexprimées dans la lignée 4 pourraient n’être que les protéines sous-exprimées
dans le clone shNEG, ce qui serait dû aux miARN-NEG produits dans ces cellules. Il
faudrait, pour finaliser ces expériences, documenter l’intégration du shTAR dans le vecteur
psiSTRIKE par une analyse de type « Southern », puis refaire des analyses de type
« Northern » afin de confirmer l’absence de production de miARN viraux par la lignée
Jurkat-shTAR cl.4.
Toutes ces hypothèses étant formulées, il reste à planifier de possibles futures
expériences devant permettre de démontrer le rôle précis des miARN dérivés de l’élément
TAR du VIH-1. Ce sera l’objet de la prochaine section.
75
Chapitre 4.
Conclusion et perspectives
Les stratégies employées, afin de vérifier l’hypothèse de recherche, ont permis
d’identifier et de caractériser la régulation de l’expression de la Procaspase-8 par les
miARN dérivés de l’ARN TAR du VIH-1. Il serait pertinent de poursuivre ces travaux en
tentant d’établir un lien entre les miARN de TAR, la Procaspase-8 et la survie des cellules
infectées. Diverses expériences pourraient être réalisées afin de valider le rôle de la
Procaspase-8 dans la pathogénicité du VIH-1 : i) comme il existe une trousse d’analyse
(celle vendue par R&D SYSTEMS®
, par exemple) permettant de déterminer, par
production de fluorochrome, l’activité enzymatique de la Procaspase-8, il serait intéressant
de regarder cette activité en comparant trois types de cellules: des cellules infectées en
réplications, des cellules infectées latentes et des cellules saines; ii) en parallèle à cela, il
serait intéressant d’analyser le taux de mort cellulaire de ces cellules par Annexin V, avec
induction ou non, via différents modes de mort cellulaire : : par activation des récepteurs de
mort cellulaire via Fas Ligand (FasL), par exposition aux UV, par privation de nutriment,
par exposition aux radiations, etc.; iii) il serait intéressant d’analyser la Procaspase-8 par
des immunobuvardages de type « western », ainsi que différentes protéines de la mort
cellulaire programmée, telles Caspase-3, Bid, le cytochrome C, APAF-1 et CAD
(« Caspase-Activated DNase »).
Par la suite, s’il s’avérait que les cellules en latence, comparées aux cellules
infectées et saines, sont protégées de la mort cellulaire, il serait possible d’identifier les
miARN dérivés de TAR responsables en comparant une lignée infectée latente « wild
76
type », une lignée mutante dans la région « seed » des miARN de TAR ainsi qu’une lignée
déplétée en TAR (∆TAR). En reproduisant les expériences de mort cellulaire décrites plus
haut, il serait possible de confirmer le rôle des miARN dérivés de TAR dans la mort
cellulaire au sein des cellules infectées.
Par ailleurs, les expériences faites avec les J-lat ont donné lieu, elles-aussi, à
beaucoup de questionnement qu’il serait intéressant d’approfondir avec différentes
approches. Il serait possible, par exemple, de déterminer le taux de miARN viraux
(« RNase Protection Assay »; RPA) et endogènes (biopuces à miARN) présents dans ces
cellules par une induction à la Prostratine de 6h à 24h, et de vérifier le niveau des ARNm
endogènes (biopuces à ADN). Ces expériences pourraient confirmer la présence de miARN
de TAR et que, sous induction à la Prostratine, il y a une diminution de leur synthèse
permettant aux protéines régulées d’être à nouveau exprimées. De plus, elles pourraient
confirmer que la Prostratine ne joue pas sur l’expression des miARN endogènes de la
cellule en induisant d’autres gènes par la voie de NF-κB. Après ces expériences, les cellules
pourraient être utilisées comme modèles de cellule latente pour les expériences de mort
cellulaire décrites plus haut.
De plus, il serait intéressant de combiner les expériences des J-lat avec la méthode
FACS (« Fluorescence-activated cell sorting »). Ces expériences, à l’aide de l’antigène p24
du VIH-1 produit lors de l’induction à la Prostratine, rendraient possible de concentrer la
population des cellules en réplication. Serait alors possible un ratio de cellules induites/non
induites beaucoup plus élevé et pouvant servir à refaire des analyses de type western avec
les protéines d’intérêt.
77
Les résultats ouvrant le plus de perspectives sont sans aucun doute ceux de la
spectrométrie de masse, qui a été effectuée, encore une fois, avec les différents clones de la
lignée Jurkat stable. L’ARNm de plusieurs protéines sous-exprimées dans les cellules
Jurkat-shTAR cl.3, qui expriment des niveaux élevés de miARN dérivés de TAR,
possèdent des sites de liaison possibles (Figures 19), notamment SAP-18, eIF4B, RAD23B,
Nucléoline et Exportin-5. Cette dernière possède deux sites de liaison à miR-TAR-5p, dont
l’appariement miARN:ARNm, qui a l’énergie libre (∆G), et est la plus favorable de toutes
les cibles potentielles identifiées. Il serait intéressant de vérifier, en comparaison avec des
cellules saines, si ces protéines sont effectivement régulées négativement dans les cellules
infectées, soit en réplication, soit en latence. De plus, par des immunobuvardages de type
« western », il serait intéressant de vérifier, avec le modèle de cellules latentes mutantes ou
déplétées en TAR, s’il y a une modulation possible de l’expression de ces protéines. Une
analyse par biopuces à ARN de la quantité relative de ces différents messagers dans
diverses conditions serait, elle aussi, prometteuse. Afin de s’assurer que la régulation de ces
protéines provient réellement des miARN de TAR, il serait, de plus, pertinent de confirmer
la présence de sites de liaison et leurs fonctionnalités par des études de gènes rapporteurs
Luciférase (Rluc). De telles expériences ouvriraient la porte à de futures analyses du rôle
des différentes protéines sous-exprimées dans la pathogénicité du VIH-1.
Les résultats de ce projet de maîtrise ouvrent donc la possibilité de développer et
d’utiliser une thérapie, à base d’ARN, visant à neutraliser l’action des miARN de TAR
ainsi qu’à compromettre la survie des cellules infectées et la réplication virale, le but étant
de limiter la propagation et la progression du VIH-1.
78
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