Rapport de Méthodologiemaignien/doc/... · Laboratoire de Microbiologie des Environnements...

Année Universitaire 2014 - 2015

UNIVERSITE)DE)BRETAGNE)OCCIDENTALE)U.F.R. Sciences et Techniques

MASTER'Biologie'et'Santé'Spécialité)Microbiologie)Fondamentale)et)Appliquée)

Master'2'5'Recherche'

Laboratoire d’Accueil :

Laboratoire de Microbiologie des Environnements Extrêmes (LM2E)

Institut de la Corrosion

Tuteurs pédagogiques:

Loïs MAIGNIEN

Nicolas LARCHE

Rapport de Méthodologie

Analyse comparative de trois

techniques d’extraction d’ADN à

partir de biofilms d’aciers inoxydable

Florian Trigodet

2

Table'des'Matières'

Introduction'................................................................................................................................................'3)

Matériels'and'Méthodes'.........................................................................................................................'4)Préparation'des'coupons'd’aciers'inoxydables'..........................................................................................'4'Collecte'des'biofilms'............................................................................................................................................'5'Acquisition'du'potentiel'électrochimique'....................................................................................................'5'Filtration'..................................................................................................................................................................'5'Extraction'de'l’ADN'..............................................................................................................................................'6'Extraction)au)Phénol>Chloroforme)................................................................................................................................)6)Kit)MoBio)PowerSoil)et)kit)MoBio)PowerBiofilm)....................................................................................................)7)

Qualité'......................................................................................................................................................................'7'Quantité'...................................................................................................................................................................'7'Diversité'...................................................................................................................................................................'7'

Résultats'et'discussion'............................................................................................................................'9)Qualité'and'quantité'............................................................................................................................................'9'Diversité'................................................................................................................................................................'10'

Conclusion'.................................................................................................................................................'12)

Bibliographie'............................................................................................................................................'12)

Annexes'......................................................................................................................................................'13)

Table des Figures

Figure 1. Suivi temporel du potentiel électrochimique. ...................................................................... 3)

Figure 2. Shematic representation of the potential acquisition system.. ............................................. 5)

Figure 3. Shéma du système de filtration. ........................................................................................... 6)Figure 4. Concentration d’ADN par coupon d’acier inoxydable et par protocole d’extraction. ......... 9)

Figure 5. Electrophorèse sur gel d’agarose (8%) des produits de PCR.. ........................................... 10)

Figure 6. Concentration de l’ADN des produits de PCR et distribution de la taille parmi les

échantillons.. .............................................................................................................................. 10)

Figure 7. Non-metric Multidimensional Scaling (NMDS) des triplica d’extraction.. ....................... 11

Liste des Tableaux

Tableau 1. Mix PCR pour 21 échantillons, un contrôle positif et négatif. .......................................... 8)

Tableau 2. Résu&ltats des concentrations d’ADN donnés par le PicoGreen et le NanoDrop. ........... 9)

3

Introduction L'Institut Français de la corrosion basé à Brest, en France, travail à la fois sur la corrosion

atmosphérique et dans l’eau de mer. Ils développent à la fois des projets appliquées et

fondamentaux dans ces domaines ainsi que des expertises pour les professionnels touchés par des

problèmes de corrosion.

En sachant que toute surface immergée dans l'eau de mer sera confronté à la formation d’un

biofilm, et que la réaction de corrosion est une perte d’électron, les métaux immerges sont non-

seulement des surfaces colonisables mais peuvent aussi servir de donneur d’électrons (Beech &

Sunner, 2004; Hamilton, 2003). On peut, donc facilement imaginer que les microorganismes

peuvent agir sur la corrosion en favorisant la sortie d'électrons du métal.

Proportionnellement à l'intérêt économique de la corrosion en eau de mer, on sait peu de chose sur

l'action de micro-organismes sur la corrosion. L'acier inoxydable, qui n’est pas affectées par la

corrosion, est quand même affecté électro-chimiquement par la présence d'un biofilm. En effet un

acier inoxydable immergé dans l'eau de mer se dépolarisera. Pour un acier simple, il en résulterait

le début d’une corrosion et de perte d'électrons. Mais pour l'acier inoxydable, la dépolarisation,

également appelé ennoblement (Mollica & Trevis, 1978), reste stable dans le temps (Figure 1.)

Figure 1. Suivi temporel du potentiel électrochimique. Dépolarisation, ou ennoblement observé vers les 2 jours pour une température de 30°C. L’écart type est présenté par la surface bleu clair.

0 1 2 3 4 5 6 7

−0.2

0.0

0.2

0.4

Time [days]

Pote

ntia

l [V/

SCE]

−10

010

2030

Tem

pera

ture

(°C

)Temperature

Ennoblement

4

La cinétique de l'ennoblissement est fortement liée à la cinétique de formation du biofilm, et avec

l'utilisation d'eau de mer stérile, l'ennoblissement est toujours présent, mais moindre (Bardal et al.,

1993). Une autre observation intéressante faite par l'institut de la corrosion est qu'au-dessus d'une

certaine température d’eau pour un emplacement donnée (38 ° C à Brest), l'ennoblissement

ressemble à celle de l'eau de mer stérile tandis qu'un biofilm est toujours présent. Ce seuil de

température diffère selon la géographie: plus faible pour de l'eau de mer plus froide (Suède).

Aussi, l’intérêt pour les environnements d'eau profonde a permis la participation du LM2E

(laboratoire de microbiologie des environnements extrêmes), plus particulièrement sur l'écologie

microbienne de biofilm sur de telles surfaces, encore peu connu (Meier et al., 2013)

Au cours de l'été dernier, une première tentative d’approche écologique des biofilms et leur

structure dans le temps pendant l'ennoblissement a été réalisée. Cela avait entraîné la mise en place

d’un protocole de production et récole de biofilm basée sur ce qui a été fait au début de l'année

2014 à Singapour par un institut partenaire à l’institut de la corrosion (communications

personnelles). Bien que les résultats de cet été ne sont pas encore disponibles, le projet

méthodologique mettra l'accent sur l'extraction d'ADN qui est une étape clé, en particulier pour ce

type de biofilm sur l’acier inoxydable qui n’est pas bien connue et qui possède des biomasses

variable selon l’environnement (Acuna et al., 2006; Guezennec et al., 1998). Le rendement, la

qualité et la diversité de l'ADN extrait avec trois méthodes différentes seront évalués. Ces trois

méthodes sont l'extraction phénol-chloroforme, le kit commercial MoBio PowerBiofilm et le kit

MoBio PowerSoil. Les concentrations d'ADN sont mesurées à la fois au PicoGreen et NanoDrop, et

la diversité évalué avec l’ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis).

Matériels and Méthodes Préparation*des*coupons*d’aciers*inoxydables*

Des coupons originaux de 10x15cm en acier inoxydable ont été découpées en coupons de 10x5cm

et des trous de 4 mm ont été forés pour être suspendu par une tige de titane relié à un système

d'acquisition du potentiel électrochimique. Les bords ont ensuite été poli et toutes les plaques

plongées dans une solution d'acide nitrique à 20% pendant 20 minutes, rincé à l'eau et à l'éthanol.

Ils sont ensuite recouverts d'une feuille d'aluminium, une fois séché, puis autoclavé en cycle sec. 4

échantillons ont été préparés, un triplica et un contrôle.

5

Collecte*des*biofilms*

Les coupons d’acier inoxydable ont été mis dans un bac avec un débit d'eau de mer continu et

renouvelé et la température réglée à 30 ° C. Ils ont été laissés pendant une semaine.

Le tampon a été préparé suivant les étapes suivantes: 3,025 g de Tris trihydrate et 4,38 g de NaCl

dissous dans 300 ml de H2O, pH ajusté à 7,6 avec du HCl 1 M. Le volume est ensuite complété à

500 ml avec de l’eau Milli-Q. Stérilisation par autoclavage. Quatre aliquots (trois réplica et un

contrôle) de 100ml dans des pots stériles de 120ml.

Après une semaine, les coupons en acier inoxydable ont été retirés un par une cuve où ils ont été

plongés. Des spatules stériles ont été utilisées pour frotter doucement les biofilms de chaque côté

des plaques en acier inoxydable, et à l'aide du tampon. Cette collecte se fait à proximité d’un bec

bunsen. Ce tampon contenant les éléments du biofilm a ensuite été placé dans la glace pour le

stockage durant le transport.

Acquisition*du*potentiel*électrochimique**

Le système d'acquisition du potentiel

électrochimique est effectué en utilisant un EPC

(Embedded Personal Computer) relié à un boîtier

électrique spécialement conçu à partir duquel les

trois tiges de titane et l'électrode de référence sont

également connectées. L'EPC a été programmer

pour des mesures toutes les 30min (Figure 2.).

Filtration**

Le système de filtration (Figure 3.) a été créé

réaliser trois filtrations en même temps.

Les pinces à filtre, les supports de filtres et les

filtres sont stérilisés par autoclavage. Parmi les

100 ml de tampon, 50 ml sont utilisés pour une

filtration, donc deux filtres sont utilisés pour une

filtration complète. Tout a été fait sous une hotte à

flux laminaire et les cryotubes où les filtres ont été

placés après la filtration ont été stocké à -80 ° C.

Figure 2. Représentation shématique du système

d’acquisition du potentiel electrochimique. L’EPC correspond à un system portatif et automatisé programmable. Les mesures de potentiels sont effectuées toute les 30min. Le potentiel électrochimique est mesuré entre une électrode de référence de chlorure d’argent (Ag, AgCl) et les tiges de titane auquel les plaques sont accrochées. Le boitier électrique permet la connexion des tiges de titan et l’électrode de référence.

6

Extraction*de*l’ADN*

L’extraction de l'ADN a été faite en utilisant le kit MoBio PowerBiofilm, le kit MoBio PowerSoil et

le protocole phénol-chloroforme du laboratoire modifié. Un demi-filtre a été utilisé pour chaque

extraction.

Les contrôles négatifs sont:

- Plaque d'acier inoxydable sans biofilm, raclés avec une spatule

stérile (appelé A).

- Le filtre d'une filtration avec le tampon TBS seul (appelé B).

- le tampon seul (appelé C).

- Extraction avec rien d'autre que les réactifs associés aux différents

protocoles (appelé D)

Extraction*au*Phénol?Chloroforme**

Un demi-filtre est placé dans un Eppendorf de 2 ml avec des billes

de verre de 0.1mm et 1 ml de tampon de lyse (TE-Na-1X, 10%,

10% Sarkosyl SDS). Bead-beating pendant 1 min et de

centrifugation pendant 5 min à 14 000 rpm. Le surnageant est

collecté et un quick-spin fait pour enlever les billes de verre

restantes. Le surnageant est ensuite ajouté à un Eppendorf de 2 ml

contenant 1 ml de phénol-chloroforme-alcool isoamylique (PCI).

Mélanger doucement par inversion pendant 45 secondes.

Centrifugation pendant 15 min à 14 000 rpm et 4 ° C. Le

surnageants (phase aqueuse) est transféré dans un Eppendorf de 2

ml contenant 1 ml de chloroforme. Puis centrifugé pendant 15 min à

14 000 rpm à 4 ° C et le surnageant (phase aqueuse) est transféré

dans un nouvel Eppendorf de 2 ml. 40 µl d’acétate de sodium 3M,

pH 5,2, sont ajoutés ainsi que 0,7 volume d'isopropanol glacé. Les

tubes sont ensuite placé pendant 1 heure à -20 ° C. Centrifugation pendant 20min à 14 000 rpm et 4

° C. L’ADN est nettoyé avec 0,5 ml 70% éthanol glacé. Centrifugation pendant 5 min à 14 000 rpm

à 4 ° C. Le culot est séché à l’aide du speed-vac, à température moyenne. Le culot est repris avec

100 µl de TE-1X.

Les déchets de chloroforme et PCI sont jetés dans la bouteille appropriée, ainsi que des éléments

contaminés (gants, Eppendorf) sont placés dans le conteneur approprié.

Figure 3. Shéma du système de

filtration. Seringue luer lock stérile de 60ml (A), adaptateur luer lock femelle (B), support de filtre 25mm (C), Seringue luer lock stérile de 2,5ml (D), bouchon en caoutchouc percé (E), fiole à vide (F).

7

Kit*MoBio*PowerSoil*et*kit*MoBio*PowerBiofilm*

Un demi-filtre par échantillon est également utilisé. L'extraction a été effectuée selon les

instructions du fabricant dans les deux cas.

Qualité*

La des extractions a été mesuré à l’aide du spectrophotomètre NanoDrop 1000 (Thermo Scientific,

Wilmington, DE, USA). L’ absorbance de l’ADN est mesurée à 260 nm, et celle des protéines ou

du phénol est mesurée à 280 nm. Il est alors possible de mesurer la qualité ou la pureté de

l'extraction en utilisant le ratio 260/280, qui doit être compris aux alentour de 1,8. Les limites de

détection varient de 2 ng / µl jusqu'à 3700ng / µl pour l’ADN double brin d’après le fabricant.

1 microlitre de chaque extraction a été placé dans le spectrophotomètre. Chaque trois mesures, de

l'eau a été utilisée pour vérifier l'étalonnage. Les blancs ont été fait deux fois avec de l'eau Milli-Q

et du tampon TE respectivement pour les extractions phénol-chloroforme et kit.

Quantité*

La concentration d'ADN a été mesuré en utilisant le kit Quant-iT ™ PicoGreen® ADNdb,

Invitrogen. Il est composé du réactif PicoGreen®, tampon TE 20X, et de l'ADN Lambda standard à

100 µl / ml. Le réactif PicoGreen® ADNdb est une marqueur d'acide nucléique fluorescent utilisée

pour quantifier l'ADN double brin, il doit être protégé de la lumière. De l'eau Milli-Q stérile est

également nécessaire. Les résultats sont lus avec le lecteur de plaque Infini 200 PRO (Tecan Group

Ltd, Männedorf, Suisse).

La gamme étalon d’ADN lambda est préparée en réalisant une série de dilutions en cascade avec

un facteur deux et avec du tampon TE fournie (lui-même dilué à 1X). Elle va de 1 ng / µl jusqu'à

0.017µg / ml. Les extraits d'ADN doivent être dilués pour entrer dans la gamme de détection qui se

situe entre les valeurs de concentrations de la gamme étalon. Les échantillons ont donc été dilués

avec un facteur 10. Une dilution au 200ème du PicoGreen® est également fait.

Une plaque de 96 demi-puits (100 µl) ont été utilisés et remplis avec 50 µl de PicoGreen® dilué

avec une pipette multicanaux et 50 µl d’'ADN extrait dilué.

Les déchets au PicoGreen® sont a jeter dans le conteneur approprié (déchets SybGreen®)

Diversité*

La diversité a été évaluée avec la technique d’ARISA (Automated intergénique ribosomal Spacer

Analyse). Les deux gènes d’ADNr hautement conservées, qui sont l’ADNr 16S et l’ADNr 23S, sont

séparés l’un de l’autre un espace transcrit intergénique (intergenic transcribed spacer - ITS). Il

présent une grande variabilité due au fait que c’est une région non codante. Cette variabilité agit sur

8

la longueur de ce fragment qui est par conséquent diffèrent d’une espèce à l'autre. La migration de

ces fragments sur un gel peut ensuite être transformées en pics d'absorbance sur un

électrophérogramme. Chaque profil est spécifique à un échantillon.

Avant cette analyse, une amplification par PCR des ITS bactériens est nécessaire. Les amorces PCR

utilisées sont: ITSF (5'-GTC GTA ACA AGG TAG GCC TA-3 ') et ITSReub (5'-GCC AAG GCA

TCC ACC- 3') avec une position respective de 1423 à 1443 pour les ADNr 16S et 23-38 pour

l’ADNr 23s (Cardinale et al., 2004). La température d’hybridation a été fixée à 56 ° C et 36 cycles

ont été effectués. Le mélange de PCR est présenté dans le tableau 1.

Les produits de PCR ont ensuite été mis à migrer sur gel d'agarose à 8% en utilisant 5 µl du

mélange: 1 µl de tampon de charge (6X) et 5 µl de produit de PCR. 3 µl de marqueur d'ADN (100

pb, Promega, Madison, WI) ont été utilisés comme marqueur de poids moléculaire. Le BET est

ajouté au gel préalablement à sa polymérisation et agit comme un agent intercalant de l'ADN et un

marqueur fluorescent. La migration a été effectuée pendant 30 minutes à 100V. Une photo du gel a

été fait avec le Trans-illuminateur. Un contrôle positive bactérien (Thermosipho sp) a été utilise

pour la PCR.

Pour l’ARISA, le kit ADN Agilent 7500 (Agilent Technology, Tokyo, Japon) a été utilisé selon les

instructions du fabricant avec 1 µl de produit de PCR dans une puce ADN LabChip 7500. L'analyse

a été effectuée avec le bioanalyseur Agilent 2100. 9 des 12 puits disponibles ont été utilisés pour les

trois extractions et leurs triplica.

La détection des pics a été fait avec les seuils suivants: 0,8 pour la pente, 5 pour l’aire, 20 pour la

hauteur, et 0,5 pour la largeur.

Une matrice d'observation a été

construite sur la base de la

concentration et de la longueur

des fragment détectés: il s’agit

d’une matrice avec les

échantillons en lignes, chaque

taille de fragment en colonne et

la concentration comme valeur.

Deux matrices de distance

(binaire Jaccard et Bray-Curtis)

ont ensuite été calculées en

utilisant le package Vegan de R et représentés par les deux NMDS (non-metric multidimensional

scaling). Figure 7.

Tableau 1. Mix PCR pour 21 échantillons, un contrôle positif et négatif.

Réactifs [ ]° initiale [ ]° finale Vol. unitaire

Nbr de tubes +1

MIX total

Eau / / 18,18

23

436,32

Tp 5x avec MgCl2 / / 5 120

dNTP 40 mM - 10 mM each

0,8 mM 0,5 12

Amorce F 100µM 0,4µM 0,1 2,4

Amorce R 100µM 0,4µM 0,1 2,4

Go Taq 5U/µL 0,024U 0,12 2,88

ADN / /

1 /

Vol. final 25 576

9

Résultats et discussion Qualité*and*quantité*

Selon le fabricant du spectrophotomètre NanoDrop 1000, les limites de détection sont de 2 ng/µl

jusqu'à 3700ng/µl pour l’ADN double brin, mais les résultats entre 2 ng/µl et 10 ng/µl sont

néanmoins considérés comme hors de la gamme et inexactes. Étant donné que les valeurs ne

dépassent jamais 4,3 ng/µl avec un minimum de 0,9 ng/µl (Tableau 2.), ils ne ont pas été considérés

comme les valeurs réelles de concentration. Par conséquent, la qualité n'a pas été évaluée. Ce ne est

pas une surprise que les valeurs de concentration d’ADN soient basses pour des échantillons

environnementaux qui peuvent avoir une faible biomasse.

Les résultats du PicoGreen® sont à l’inverse utiles et sont représentés sur la Figure 4. et Tableau 2.

Tableau 2. Résultats des concentrations d’ADN donnés par le PicoGreen et le NanoDrop.

Phénol-Chloroforme MoBio PowerSoil MoBio PowerBiofilm Confidence

Plate 1 2 3 1 2 3 1 2 3 PicoGreen (ng/µl) 0,0156 0,0141 0,0113 0,0495 0,0432 0,0636 0,1322 0,1541 0,2114 ± 0,0095

NanoDrop (ng/µl) 1,6 0,9 1,1 2,7 1,6 2 4,3 1,6 3 2 to 10

Figure 4. Concentration d’ADN par coupon d’acier inoxydable et par protocole d’extraction. Extraction au Phénol-Chloroforme (rouge), le kit MoBio PowerSoil (vert) et le kit MoBio PowerBiofilm (bleu).

Phenol.Chloroform MoBio.PowerSoil MoBio.PowerBiofilm

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

1 2 3 1 2 3 1 2 3Plates

DN

A co

ncen

tratio

n (n

g/µl

)

10

Le kit d'extraction d'ADN MoBio PowerBiofilm a clairement le meilleur rendement d’extraction de

l'ADN tandis que l’extraction avec le kit MoBio PowerSoil et phénol-chloroforme montrent un

rendement relativement faible.

Diversité*

Les résultats de la PCR sur le gel sont présentés sur la Figure 5. Les deux contrôles PCR (positif et

négatif) attestent que la PCR a fonctionné correctement. Les trois extractions d'ADN présentent des

produits de PCR de tailles attendues (environ 1000 pb). Et les quatre contrôle négative d’extraction

pour chaque protocoles on fonctionnés puisque rien n'a été révélé.

Les électrophérogrammes Arisa ont été recueillies avec le logiciel 2100 Expert, Agilent technology.

Les pics détectés en fonction des seuils minimaux définie précédemment et leur concentration ont

été rassemblées en un seul tableau et traitées par R. Un histogramme de la concentration et de la

taille des fragments par échantillon a été fait avec le package ggplot2 de R (Figure 6.). Cette figure

montre que les tailles des fragments sont très diverses pour l’extraction au phénol-chloroforme et le

kit MoBio PowerBiofilm. Aussi, leur concentration est relativement élevée par rapport aux produits

de fragment PCR de l’extraction avec le kit MoBio PowerSoil.

Les profiles donnée par la distribution des tailles et la concentration des fragments est représentatif

de la diversité extrait. Deux calculs de bêta-diversité (binaire-Jaccard et Bray-Curtis) ont été

réalisées et sont présenté par des NMDS (Figure 7.). L'indice binaire Jaccard ne prend en compte

que le facteur de présence / absence évaluant ainsi ce qui est présent ou non. Inversement, l'indice

de Bray-Curtis estime la concentration de l'ADN, par conséquent, donner un poids à chaque pic,

chaque longueur de fragment. Le NMDS avec l’indice binaire Jaccard ne montre pas de distinction

claire entre tous les échantillons (les cercles représentent la zone de confiance de 95%). La

Figure 5. Electrophorèse sur gel d’agarose (8%) des produits de PCR. (M) marqueur de taille, (T+) contrôle positive, (T-) contrôle négative pour la PCR et les extractions, (PC) phénol-chloroforme, (PS) kit MoBio PowerSoil, (PB) kit MoBio PowerBiofilm.

Figure 6. Concentration de l’ADN des produits de PCR et distribution de la taille parmi les échantillons. Le bleu clair correspond aux fragments les plus petits et le bleu foncé pour les fragments les plus grands. La concentration d’ADN est donnée en ng/µl.

M"

M"

T+"

T%"

PC#(1

)#PC

#(2)#

PC#(3

)#

PS#(1

)#PS#(2

)#PS#(3

)#

PB#(1

)#PS#(2

)#PS#(3

)#

T,PC

##(1)#

T,PC

##(2)#

T,PC

##(3)#

T,PC

##(4)#

T,PS##(1)#

T,PS##(2)#

T,PS##(3)#

T,PS##(4)#

T,PB

##(1)#

T,PB

##(2)#

T,PB

##(3)#

T,PB

##(4)#

Phenol−Chloroform MoBio PowerSoil MoBio PowerBiofilm

0

10

20

1 2 3 1 2 3 1 2 3Plates

DN

A co

ncen

tratio

n (n

g/µl

)

300

600

900

Size

11

présence/absence des différents ITS est donc une donnée relativement similaire entre les extractions

et dans trois réplica. Le second NMDS montre un résultat complètement différent puisque les points

du kit MoBio PowerBiofilm sont groupés tandis que les points du kit MoBio PowerSoil sont plus

dispersés et pour l’extraction phénol-chloroforme encore plus. Cela signifie que, en termes de

diversité de l'ADN extrait et amplifié par PCR, le kit MoBio PowerBiofilm représente la plus

méthode la plus reproductible, au moins parmi les autres techniques d'extraction d’ADN testé ici.

Néanmoins les réplica ne sont pas place les uns trop loin des autres, mais plutôt les uns dans les

autres, Il n'a rien de surprenant puisque le premier NMDS démontre un lien étroit entre toutes les

extractions. Ainsi, l'abondance des fragments est responsable des différences observées dans le

second NMDS.

(a)

(b)

Figure 7. Non-metric Multidimensional Scaling (NMDS) des triplica d’extraction. Indice binaire Jaccard (a), et Bray-Curtis (b). Les surfaces grises relient les extractions faites sur la même plaque d’acier inoxidable. Les ellipses correspondent à l’aire de confiance à 95%. Extraction au Phénol-Chloroforme (rouge), le kit MoBio PowerSoil (vert) et le kit MoBio PowerBiofilm (bleu).

−2.0 −1.5 −1.0 −0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

−0.5

0.0

0.5

NMDS1

NM

DS2

Arisa

Distance metric: Jaccard

−2 −1 0 1

−0.5

0.0

0.5

NMDS1

NM

DS2

Arisa

Distance metric: Bray

Stainless Steel PlatesPhenol−ChloroformMoBio PowerSoilMoBio PowerBiofilm

−2 −1 0 1

−0.5

0.0

0.5

NMDS1

NM

DS2

Arisa


−2 −1 0 1

−0.5

0.0

0.5

NMDS1

NM

DS2

Arisa


Stainless Steel PlatesPhenol−ChloroformMoBio PowerSoilMoBio PowerBiofilm

12

Conclusion Finalement, le kit d'extraction d'ADN MoBio PowerBiofilm a extrait l'ADN avec le meilleur

rendement, et est le plus reproductible au moins après amplification des ITS. Alors que toutes les

extractions étaient assez similaires pour la diversité en terme de présence / absence des ITS de

différents longueurs, leur abondance étaient plus élevés et, surtout, reproductible avec le kit MoBio

PowerBiofilm.

Il faut garder à l’esprit que l'abondance relative des individus pour un environnement est très

importante et peut avoir une signification écologique. L'amplification par PCR induit beaucoup de

biais, dont l'abondance relative des séquences initialement présentes dans l'échantillon d'ADN

extrait. Si une extraction ne fournit pas toujours la même information sur les abondances relatives,

ont peut passer à coté d’informations sur qui est dominant et qui est rare. L'étude d'un biofilm

implique potentiellement un suivi temporel de sa formation, ainsi la présence et l'abondance d'une

unité écologique particulière peuvent avoir une action en termes de concurrence, de coopération, de

substrats utilisés et de métabolites produits. Compte tenu de ces conséquences, l'extraction de

l'ADN avec le kit MoBio PowerBiofilm semble le plus convenir pour ces extractions d'ADN de ces

biofilms particuliers. Pour améliorer ces résultats, plus de trois réplica par extractions pourrait être

fait, en particulier pour la réalisation des NMDS. Cela permettrait alors de confirmer ou de remettre

en question les résultats actuels. Le kit MoBio PowerBiofilm a d’ailleurs été comparé à des

techniques automatisés ou semi-automatisés qui présentent un niveau de reproductibilité plus élevé

et une diversité aussi élevé pour un coût similaire ou inférieur (Oldham et al., 2012).

Bibliographie Acuna, N., Ortega-Morales, B. O. & Valadez-Gonzalez, A. (2006). Biofilm colonization dynamics and its influence on the corrosion resistance of austenitic UNSS31603 stainless steel exposed to Gulf of Mexico seawater. Mar Biotechnol 8, 62–70. Bardal, E., Drugli, J. M. & Gartland, P. O. (1993). The behaviour of corrosion-resistant steels in seawater: A review. Corros Sci, Advances in Corrosion and Protection Proceedings of the International Conference to mark the 20th Anniversary of the UMIST Corrosion and Protection Centre 35, 257–267. Beech, I. B. & Sunner, J. (2004). Biocorrosion: towards understanding interactions between biofilms and metals. Curr Opin Biotechnol 15, 181–186. Cardinale, M., Brusetti, L., Quatrini, P., Borin, S., Puglia, A. M., Rizzi, A., Zanardini, E., Sorlini, C., Corselli, C. & Daffonchio, D. (2004). Comparison of Different Primer Sets for Use in Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis of Complex Bacterial Communities. Appl Environ Microbiol 70, 6147–6156. Guezennec, J., Ortega-Morales, O., Raguenes, G. & Geesey, G. (1998). Bacterial colonization of artificial substrate in the vicinity of deep-sea hydrothermal vents.

Fems Microbiol Ecol 26, 89–99. Hamilton, W. A. (2003). Microbially Influenced Corrosion as a Model System for the Study of Metal Microbe Interactions: A Unifying Electron Transfer Hypothesis. Biofouling 19, 65–76. Meier, A., Tsaloglou, N.-M., Mowlem, M. C., Keevil, C. W. & Connelly, D. P. (2013). Hyperbaric biofilms on engineering surfaces formed in the deep sea. Biofouling 29, 1029–1042. Mollica, A. & Trevis, A. (1978). Comptes rendus du 4e Congrès International de la Corrosion Marine et des Salissures. — Proceedings of the 4th International Congress on Marine Corrosion and Fouling. 14—18 Juin 1976/Antibes — Juan-les-Pins, France. —544pp. Boulogne (France): Centre de Recherches et d’Etudes Océanographiques (73, rue de Sèvres). 1977. F. Fes. 480.—. Int Rev Gesamten Hydrobiol Hydrogr 63, 842–842. Oldham, A. L., Drilling, H. S., Stamps, B. W., Stevenson, B. S. & Duncan, K. E. (2012). Automated DNA extraction platforms offer solutions to challenges of assessing microbial biofouling in oil production facilities. AMB Express 2, 60.

13

Annexes

Table des annexes

)

Extraction'Phénol5Chloroforme'.........................................................................................................'14)

Protocole'kit'MoBio'PowerSoil'...........................................................................................................'14)

Protocole'kit'MoBio'PowerBiofilm'...................................................................................................'15)

Protocole'Picogreen'kit'Quant5iTTM'PicoGreen®'..........................................................................'15)

Protocole'de'la'PCR'................................................................................................................................'17)

Protocole'kit'Agilent'7500'...................................................................................................................'18)

Résultats'complet'de'PicoGreen'et'NanoDrop'..............................................................................'19)

Résultats'd’ARISA'complémentaires'................................................................................................'19)

Bon'de'commandes'................................................................................................................................'21)

Estimation'des'coûts'..............................................................................................................................'25)

Cahier'de'laboratoire'.............................................................................................................................'29)

14

Extraction Phénol-Chloroforme Lyse cellulaire

> A l’aide d’une pince stérile, placer un demi-filtre dans un tube de 2mL remplis de billes de verre 0,1mm et de 1mL de tampon de lyse (Tris-HCl – EDTA- NaCl)

> Ajouter 100µL de SDS 10% et 100µL de Sarkosyl 10%. > Mettre au Bead-Beating, ou les attacher par du scotch horizontalement et vortexer pendant 10-

15min. > Récupérer 1 mL de solution dans un nouveau tube de 2mL, en prenant garde à récupérer le

moindre de billes possibles. > Centrifuger rapidement et reprendre 1 mL dans un nouveau tube de 2mL

Extraction de l’ADN

> Ajouter 1 mL de PCI, puis agiter sans vortexer pendant 45 secondes. > Centrifuger à 14000 rpm pendant 15min à 4°C. > Récupérer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de 2mL. Répéter cette extraction au PCI si il y a beaucoup de débris au niveau de l’interface

> Ajouter 1 mL de Chloroforme, puis agiter sans vortexer pendant 45 secondes. > Centrifuger à 14000 rpm pendant 15min à 4°C. > Récupérer la phase acqueuse supérieure.

Précipitation de l’ADN

> Ajouter 40 µL de solution d’Acétate de sodium 3M, pH 5,2. > Ajouter 0,7 volumes d’isopropanol glacé (-20°C) > Placer les tubes 1h minimum à -20°C (possibilité de laisser overnight) > Centrifuger pour récupérer le culot d’ADN 14000 rpm pendant 20min à 4°C. > Re-suspendre le culot avec 0,5 mL d’ethanol froid à 75%. > Centrifuger à 14000 rpm pendant 5 minutes à 4°C. > Laisser sécher le culot à l’air libre, ou au speed vac pendant 10min à température moyenne. > L’ADN est repris dans 100µL de TE (1X) > L’ADN peut être conservée à 4°C.

Protocole kit MoBio PowerSoil (selon les instructions du fabricant)

Récupération du filtre et lyse cellulaire

> A l’aide d’une pince stérile, placer un demi-filtre dans un tube PowerBead > Vortexer rapidement et doucement pour mélanger > Ajouter 60µL de solution C1 et vortexer brièvement. > Placer les tubes sur un vortex horizontal de type « bead beat », ou les attacher par du scotch

horizontalement et vortexer. Vérifier qu’ils sont bien accrochés, et vortexer à puissance maximale pendant 10-15min.

> Centrifuger les tubes à 10 000g pendant 30s. T°C ambiante. Extraction d’ADN

> Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2mL, rempli de 250 µL de solution C2. Vortexer rapidement pendant 5s puis laisser 5min à 4°C.

> Centrifuger les tubes à température ambiante pendant 1 min à 10000g

15

> Transférer le surnageant (600µL max) dans un nouveau tube de 2 mL, rempli de 200µL de solution C3. Vortexer brièvement puis laisser 5min à 4°C.

> Centrifuger les tubes à température ambiante pendant 1 min à 10000g > Transférer le surnageant (750µL max) dans un nouveau tube rempli de 1200µL de solution C4.

Vortexer brièvement Rétention de l’ADN sur colonne et précipitation

> Transférer environ 675 µL de surnageant dans un tube avec colonne Spin Filter et centrifuger pendant 1 min à 10000 g à température ambiante.

> Eliminer le surnageant, et remettre 675 µL re centrifuger etc… x2 > Ajouter 500 µL de la solution C5 et centrifuge à température ambiante pendant 30s à 10000g > Eliminer le liquide passé. Re-centrifuger à température ambiante pendant 1 min à 10000g > Déplacer le filtre dans un nouveau tube de 2 mL. Ajouter 100µL de la solution C6. Centrifuger

à température ambiante pendant 30s à 10000g.

Protocole kit MoBio PowerBiofilm (selon les instructions du fabricant)

Récupération du filtre et lyse cellulaire

> A l’aide d’une pince stérile, placer un demi-filtre dans un tube PowerBead > Ajouter 350µL de solution BF1, 100µl de BF2 et vortexer brièvement. > Placer les tubes sur un vortex horizontal de type « bead beat », ou les attacher par du scotch

horizontalement et vortexer. Vérifier qu’ils sont bien accrochés, et vortexer à puissance maximale pendant 10-15min.

> Centrifuger les tubes à 10 000g pendant 30s. T°C ambiante. Extraction d’ADN

> Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2mL, rempli de 100 µL de solution BF3. Vortexer rapidement pendant 5s puis laisser 5min à 4°C.

> Centrifuger les tubes à température ambiante pendant 1 min à 10000g > Transférer le surnageant (450µL max) dans un nouveau tube de 2 mL, rempli de 900µL de

solution BF4. Vortexer brièvement puis laisser 5min à 4°C. Rétention de l’ADN sur colonne et précipitation

> Transférer environ 650 µL de surnageant dans un tube avec colonne Spin Filter et centrifuger pendant 1 min à 10000 g à température ambiante.

> Eliminer le surnageant, et remettre 675 µL re centrifuger > Ajouter 650 µL de la solution BF5 et centrifuge à température ambiante pendant 1min à 10000g > Eliminer le liquide passé. Ajouter 650 µL de la solution BF6 et centrifuge à température

ambiante pendant 1min à 10000g > Eliminer le liquide passé. Re-centrifuger à température ambiante pendant 2 min à 10000g > Déplacer le filtre dans un nouveau tube de 2 mL. Ajouter 100µL de la solution BF7. Centrifuger

à température ambiante pendant 30s à 10000g.

Protocole Picogreen kit Quant-iTTM PicoGreen®

1. Préparation des réactifs : . - Préparation du tampon TE : Dans un tube Falcon 50ml, diluer 20 fois la solution mère de TE

16

20X, stérilement pour ainsi obtenir du tampon TE 1X. Ajuster le volume à préparer en fonction de la manipulation à réaliser. Cas n°1 : Pour un volume final de 40 ml : 2 ml de TE 20X + 38ml d’eau milliQ stérile. Cas n°2 : Pour un volume final de 20 ml : 1 ml de TE 20X + 19ml d’eau milliQ stérile. - Préparer la gamme étalon : À partir du tube de Lambda DNA à 100 µg/ml fourni dans le kit, préparer une 1ère dilution à 2 µg/ml (soit une dilution de la solution mère au 1/50ème) dans un microtube 1,5ml. Cas n°1 : Pour un vol. final de 500µl, prélever 490µl de TE1X et 10µl de lambda DNA 100µg/ml. Cas n°2 : Pour un vol. final de 250µl, prélever 245µl de TE1X et 5µl de lambda DNA 100µg/ml. À partir de ce tube à 2 µg/ml, réaliser les 7 points de gamme, en série de dilution en cascade au demi. Penser à annoter vos microtubes 1,5ml et à bien vortexer entre chaque dilution. Cas n°1 : 250µl TE1X + 250µl ADN Cas n°2 : 125µl TE1X + 125µl ADN - Préparation des échantillons : il est important que les échantillons mesurés se situent dans la gamme étalon. Diluer vos échantillons à quantifier par exemple, au 1/100ème dans du TE 1X. Si les échantillons sont très peu concentrés, il est évident que la dilution est inutile. Cas n°1 : 100µl d’échantillon/puits sont nécessaires. Soit pour des mesures en dupliquat, préparer un volume d’échantillon dilué minimum de 250µl : 2,5µl d’ADN pur dans 247,5µl de TE 1X. Cas n°2 : 50µl d’échantillon /puits sont nécessaires. Soit pour des mesures en dupliquat, préparer un volume d’échantillon dilué minimum de 125µl : 1,25µl d’ADN pur dans 123,75µl de TE 1X. - Préparation de la solution de Picogreen : Diluer la solution mère fourni dans le kit, au 1/200ème dans du TE 1X. Attention, protéger le tube de la lumière, et le recouvrir avec de l’aluminium. Cas n°1 : Préparer un volume de 10ml, soit 50µl de picogreen pur dans 10ml de TE1X. Cas n°2 : Préparer un volume de 5ml, soit 25µl de picogreen pur dans 5ml de TE1X. 2. Préparation de la plaque : 1 vol. de solution de picogreen* pour 1 vol. d’ADN. - Verser la solution de picogreen diluée fraîchement préparée, dans une boite de pétri stérile (ou un réservoir pour multicanaux) - Distribuer dans un premier temps, le picogreen avec une pipette P200 multicanaux, dans tous les puits de la microplaque, à hauteur de : 100 µl de picogreen pour une plaque à puits classiques 50µl de picogreen pour une plaque demi-puits - Déposer ensuite, la gamme étalon en duplicat (au minimum) à l’aide d’une pipette P200 simple, selon votre plan de plaque : 100 µl d’ADN pour une plaque à puits classiques 50µl d’ADN pour une plaque demi-puits - Penser à faire des témoins négatifs « Blanc » exempt d’ADN. - Déposer vos échantillons dilués ou non, selon votre plan de plaque : 100 µl d’échantillon pour une plaque à puits classiques 50µl d’échantillon pour une plaque demi-puits - Recouvrir la plaque avec un film adhésif en aluminium. - Homogénéiser au vortex brièvement la plaque, puis centrifuger quelques secondes afin de faire redescendre les éventuelles gouttelettes. 3. Lecture au lecteur de microplaques TECAN Infinite200Pro - Allumer l’ordinateur, puis le lecteur de microplaques (interrupteur à l’arrière de l’appareil) - Ouvrir le logiciel IControl (icône sur le bureau) - Ouvrir la méthode désirée « Quantification picogreen - puits classiques » ou « Quantification picogreen - demi puits » Paramètres de la méthode définir : seul le type de plaque change dans ces 2 méthodes ; Plan de plaque = sélection des puits à mesurer Agitation « shaking » 5sec. mode

17

orbital, amplitude 1mm - Pause « wait » 5sec. Fluo. excitation 485nm/ émission 535nm, gain fixe 91, nbre de flash 25, z-position A1 - Charger votre plaque à l’intérieur de l’appareil : pour ouvrir (et refermer) le clapet, appuyer sur le bouton situé dans le coin en haut à droite, de l’appareil. - Cliquer sur « Start » représenté par l’icône flèche verte. La mesure démarre et une page Excel s’ouvre automatiquement pour afficher les résultats. - Mettre en forme si besoin vos résultats de mesure (document Excel : mise en page, calcul de moyenne, écart type, etc ...) et enregistrer le fichier sur l’ordinateur (dossier personnel à créer) ou sur une clé USB. 4. Analyse des résultats - Soustraire la valeur de fluorescence des témoins « Blanc » à tous les échantillons. - A partir des valeurs des différents points de gamme, générer la droite étalon (graphique « nuage de points », puis ajouter une courbe de tendance) : intensité de fluorescence Picogreen (RFU) en fonction de la concentration d’ADN (µg/ml). - Déterminer la concentration des échantillons avec l’équation de la droite étalon. Attention, ne pas oublier les facteurs dilutions !

Protocole de la PCR

Composition du Master Mix :

Réactifs [ ]° initiale [ ]° finale Vol. unitaire

Nbr de tubes +1

MIX total

Eau / / 18,18

23

436,32

Tp 5x avec MgCl2 / / 5 120

dNTP 40 mM - 10 mM each

0,8 mM 0,5 12

Amorce F 100µM 0,4µM 0,1 2,4

Amorce R 100µM 0,4µM 0,1 2,4

Go Taq 5U/µL 0,024U 0,12 2,88

ADN / /

1 /

Vol. final 25 576

- Préparer le mélange réactionnel dans un tube eppendorf de 1,5 ml.

- Ajouter la Taq polymérase en dernier.

- Répartir 24µl de mélange réactionnel dans chaque tube de PCR de 0,2ml.

- Ajouter 1µl d’ADN.

Le témoin positif de PCR est de l’ADN extrait d’une souche de Thermosipho sp.

Le témoin négatif est de l’eau mQ stérile.

18

Le programme de PCR était de 36 cycles, avec une température d’hybridation de 56°C.

Marqueur de taille utilisé : Ladder 100bp G5711%Promega%%

Protocole kit Agilent 7500*Préparation du « Gel-Dye Mix » : - Laisser le DNA Dye Concentrate (Bleu) et le DNA gel matrix (Rouge) s’équilibrer à température ambiante pendant 30 min. - Mettre 25µl de DNA Dye Concentrate (Bleu) dans le tube de DNA gel matrix (Rouge). - Bien vortexer la solution et centrifuger pour faire descendre les gouttes au fond du tube. Transférer dans un tube à filtre « spin filter ». - Centrifuger à 1500 g +- 20% (soit environ jusqu’à 6000 rpm sur la centrifugeuse ayant un rayon horizontal effectif de 4 cm depuis le centre du rotor jusqu’au bout inférieur du tube) pendant 15min. Protéger la solution de la lumière (aluminium autour du tube) et stocker à +4°C. Nettoyage de la machine (avant et après chaque analyse) - Déposer 350µl d’eau Milli-Q dans le puit marqué de la puce de nettoyage (electrode cleaner). - Placer cette puce dans le bionalyser Agilent 2100 pendant 5min. - Retirer cette puce et laisser sécher 2min les électrodes avant l’analyse. Dépôt du Gel-Dye Mix - Laisser le Gel-Dye Mix, les échantillons et les Markers à température ambiante pendant 30min avant utilisation. - Mettre une nouvelle puce à ADN (DNA Chip) dans la station d’amorçage de la puce. - Déposer 9µl de Gel-Dye Mix dans le puits marqué . - Mettre la seringue dans son support et tirer sur le piston de la seringue jusqu’à 1ml. - Visser la seringue dans le support de la puce ( ! ne pas oublier de mettre le chronomètre sur 30 sec). - Enfoncer le piston de la seringue jusqu’au clip (le piston reste enfoncé grâce au clip). - Attendre exactement 30 sec et relâcher le clip (en appuyant sur la gâchette du clip). - Attendre 5 sec et tirer doucement le piston à la position 1ml. - Ouvrir la station d’amorçage et déposer 9µl de Gel-Dye Mix dans le puits marqué G. Dépôt des Markers - Déposer 5µl de Markers (Vert) dans les puits de 12 échantillons et dans le puits « échelle ». Tous les puits doivent être remplis. Dépôt du marqueur (Ladder) et des échantillons - Déposer 1µl de DNA Ladder (jaune) dans le puits marqué - Dans chacun des 12 puits destinés aux échantillons, déposer 1µl d’échantillons (déposer 1µl d’eau Milli-Q dans les puits qui ne seront pas utilisés). - Vortexer la puce 1min à 2400rpm (vortex adapté aux puces Agilent). - Placer la puce dans le bionalyser Agilent 2100 et lancer l’analyse dans les 5min.

19

Résultats complet de PicoGreen et NanoDrop

Résultats d’ARISA complémentaires

%%

Phénol-Chloroforme MoBio PowerSoil MoBio PowerBiofilm

Plate 1 2 3 1 2 3 1 2 3 PicoGreen (ng/µl) 0,0156 0,0141 0,0113 0,0495 0,0432 0,0636 0,1322 0,1541 0,2114

NanoDrop (ng/µl) 1,6 0,9 1,1 2,7 1,6 2 4,3 1,6 3

Extraction controle A B C D A B C D A B C D PicoGreen (ng/µl) 0,0035 0,0015 0,0009 0,0015 0,0048 -0,0006 -0,0017 -0,0007 0,0032 -0,0002 -0,0011 -0,0013 NanoDrop (ng/µl) 1,9 5,4 1,3 0,8 2,7 2,4 1,8 3 1,3 3,8 1,7 2

20

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Bon de commandes

Devis n° WDW19795 du 18/07/2014

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22

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373D6 Ancienne réf.Fisher<<<Marque FISHERBRAND 08100240

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11859122 Balance portable top pan Scout Pro SPU123 1 384,75 384,75EA. % TVA 20.00

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balance portable Scout Procellule de mesure verrouillable pour transportsécuriséalimentation piles ou secteurkit de densité en optionpoids de calibrage fourni pour modèles 120g,200g, 400g et 600g.précision 1 mgreproductibilité ±0,003 gcalibrage externebalance portablelongueur x profondeur x hauteur 190 mm x 190 mmx 110 mmétendue de pesée 120 glinéarité ±0,003 gLivré : avec masse de calibrage 100 g

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Net

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Prix'réel'

(€)'

Sample'preparation' ) ) ) ) )

Nitric)acid)70%)438073>

500ML)135,50) Sigma>Aldrich) 400ml) 108,40)))

Tris)HCl) T3253>1kg) )237,50) Sigma>Aldrich) 3,025)g) 0,71)))

Sodium)Acetate)trihydrate) )S8625>1kg' )63.40) Sigma>Aldrich) 20,4g))) 1,29)))

Sodium)Chloride)(1Kg)) 71382>1KG) 75,71) Sigma>Aldrich) 4,38)g) 0,33)))

Biofilm'collection'')) )) )) )) ))

Récolteur) de) cellules,) lame)

19)mm,) manche) de) 180)mm.)

Corning.)100)

734>1526) 189,55))) VWR) 4) 8,92)))

Pot) de) prélèvement) conique)

120) ml) PP) bouchon) à) vis)

stérile.)300)

216>0861) 53,89) VWR) 4) 0,72)))

Filtration'')) )) )) )) ))

Fioles) à) vide) avec) olive) en)

verre)215>1018) 110,1) VWR) 3) 110,10)))

Bouchons,) en) caoutchouc,)

coniques,)série)européenne.)25)217>0119) 48,20))) VWR) 3) 5,78)))

X3) pince) a) bouts) plats) inox.))

Millipore))11714474) 51,12))) Fisher) 3) 51,12)))

Support) de) filtre) seringue) pc)

25mm)1)*)Sartorius®)x12)611>0689) 60,35))) VWR) 12) 60,35)))

X100) mb) polycarb.) 0.22μ)

25mm) membrane)

polycarbonate)isopore®)

10712381) 167,07))) Fisher) 10) 16,70)))

Cryotubes) clearline) 2) ml) jupe)

cap)externe)stérile)x)1000)390459) 130) Dutscher) 10) 1,30)))

26

X100) seringue) plastipak) 2,5ml)

luer)lock.))11793313) 27,65))) Fisher) 3) 0,81)))

X60) seringue) plastipak) 3p)

50ml)luer)lock.)Bd®))10636531) 51,57))) Fisher) 10) 8,59)))

X25) coupleur) luer) femelle)

nylon.)Coleparmer.))11726148) 8,86))) Fisher) 3) 1,06)))

Extraction' )) )) )) )) ))

' Phenol5Chloroform'

' extraction')) )) )) )) ))

Lysing)Matrix)B)116911100)

>)100x2)315,00)

MP)

biomedicals)7) 22,05)))

Microtubes)2)ml) S1620>2700) 20,4) Starlab) 21) 0,86)))

1000μl) Pointes) à) filtre)

graduées.)x960)S1122>1830) 46,5) Starlab) 39) 1,89)))

200μl)Pointes)à)filtre)graduées.)

x960)S1120>8810) 45) Starlab) 8) 0,14)))

Chloroforme)RPE)1L) 438)601) 5,5) Carlo)erba) 7ml) 0,04)))

Phenol) >) chloroform) >) isoamyl)

alcohol)mi)24:25:1)

77619>

500ML))215,00) Sigma)Aldrich) 7ml) 3,01)))

Isopropyl)alcohol))W292907>

1L)39,00) Sigma>Aldrich) 7ml) 0,27)))

Ethanol) absolu) anhydre) RPE)

ACS)1l)4)146)072) 5,05) Carlo)erba) 3,5ml) )0,01)

L>Sarkosyl) L5125>100G) )51,40) Sigma>Aldrich) 70mg) 0,03)))

Sodium)Dodecyl)Sulfate,)500)g) L4390) )311,50) Sigma>Aldrich) 70mg) 0,04)))

' MoBio'PowerSoil' )) )) )) )) ))

Powersoil) DNA) extraction) Kit)

(50))12888>50) 266) Ozyme) 7) 37,24)))


x960)S1120>8810) 45) Starlab) 28) 0,48)))



27

' MoBio''PowerBiofilm')) )) )) )) ))

PowerBiofilm) DNA) Isolation)

Kit)(50))24000>50) 529,20))) Ozyme)) 7) 74,06)))




x960)S1120>8810) 45) Starlab) 21) 0,36)))

Quality' )) )) )) )) ))

10µl) Pointes) graduées) extra)

longues)>)Refill)S1110>3700) 21,8) Starlab) 34) 0,77)))

Quantity' )) )) )) )) ))

X100)plaque)ha96)ps)noir)tc)st)) 10759334) 442,4) Fisher) 1) 44,24)))



Pipette) BD) Advantage) pour)

culture) cellulaire)25)ml)+)7)ml)

BD)Falcon)x)200)

356525) 52,94) Dutscher) 1) 0,26)))


x960)S1120>8810) 45) Starlab) 46) 0,78)))

Quant>iT) PicoGreen®) dsDNA)

Assay)Kit,)1)ml.)x)200)10545213) )554,00) Fisher) 21) 58,17)))


longues)>)Refill)S1110>3700) 21,8) Starlab) 8) 0,18)

Diversity')) )) )) )) ))




x960)S1120>8810) 45) Starlab) 24) 0,41)))


longues)>)Refill)S1110>3700) 21,8) Starlab) 87) 1,97)))

Go)Taq.)2500U) M8306) 350) Promega) 28U) 3,94)))

28

100)bp)DNA)Ladder)250µl) G2101) 74) Promega) 6µl) 1,76)

Barrettes)de)8)tubes)pcr))0,2ml)

sans)bouchons)*125)I1402>3500) 38,50) Starlab) 3) 0,92)

Barrettes) de) 8) bouchons)

domes)*125)I1400>0810) 10,90) Starlab) 3) 0,26)

Kit) DNA) 7500) (pour) ARISA))

x300)5067>1506) 285)

Agilent)

Technologies))9) 8,55)))

Agarose,) Bioreagent,) for)

molecular)biology)A9539>100g) 79,8) Sigma>Aldrich) 8g) 6,38)))

Amorce)ITSF)(5’>GTC)GTA)ACA)AGG)TAG)CCG)TA>3’)) Eurogentec) ) 1,33)))

Amorce)ITSReub)(5‘>GCC)AAG)GCA)TCC)ACC>)3’)) Eurogentec) ) 0,98)))

dNTP)Mix,)200μl) U1511) 25) Promega) 12µl) 1,43)))

Gants)en)nitrile,)taille:)large)1)*)

100)pce)112>2373) 9,1) VWR) ½) 4,55)))

)) )) )) )) )) ))

''' '' '' 'Total' 661,49'''

29

Cahier de laboratoire

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