Réaction Ac-AgEt ses appllications pratiques

Caractéristiques générales de la réaction AcAg.

La liaison AgAcPour qu’il y ait une liaison, il faut une « complémentarité stérique » entre le paratope de l’Ac et l’épitope de l’Ag.Complémentarité stérique : complémentarité conformationnelle, représentation dans l’espace.

Complémentarité entre l’épitope et le paratope : La cristallographie aux rayons x permet de définir une structure 3D d’une molécule. A partir de cette technique on a pu définir la structure d’un Ac. Aux régions hypervariables, les AA vont se lier aux Ac (comme une mâchoire). Cela concerne que quelques AA, tout le reste est plus ou moins une « charpente ».Il y a bcp de forces de répulsions, les liaisons intermoléculaires sont faibles => énergie de liaison faible. Si l’épitope correspond bien à l’épitope alors il n’y a que des forces d’attraction et pas de forces de répulsions. Alors les forces d’attractions sont optimales et l’énergie de liaison est bcp plus importante.

La bonne complémentarité entre paratope et épitope entraîne la formation du Complexe Immun.Paratope et Epitope peuvent se déformer légèrement pour permettre la formation du CI.

Forces impliquées : Ici, il s’agit de liaisons de faibles énergies (et non de liaisons covalentes !). Ces liaisons sont dues à plusieurs forces, établies entre AA hypervariables et épitope.

Force électrostatiques : qui s’établies entre groupement chimiques ionisées de charges opposées.Forces issues des liaisons hydrogènes : issues de liaisons entre atomes de charges +, comme H, et des atomes de charges -, comme O ou N. l’interaction avec H est d’autant plus forte qu’il y a exclusion des molécules d’eau.Forces issues des interactions hydrophobes : liées à des groupements apolaires (de nombreux AA sont hydrophobes ex : AA aromatiques, tyrosine, phénylalanine, …). Se sont ces interactions qui représentent les forces les plus importantes dans le CI. => composante majeure de l’énergie de liaison entre épotipe et paratope.Forces de VanDerWaals : crées par les interactions des nuages électroniques des atomes.

Ces 4 types de forces sont attractives ce qui entraînent et maintiennent la formation du CI.

Affinité : Elle caractérise la force de cette liaison. Affinité = forces attractives + forces répulsivesComment se mesure-t-elle ?Elle se définit par réaction chimique : Ac+AgAc-AgCette réaction est réversible, le complexe peut se dissocier.Cette réaction peut aussi se définir par des constantes cinétiques avec : k = constante cinétique d’association k’ = ‘’ ‘’ de dissociationA l’équilibre, la vitesse d’association = vitesse de dissociation. On établit alors une constante d’association de l’équilibre KA :

KA = [Ac-Ag]eq / [Ac]eq x [Ag]eq

Vitesse d’association:Va = k[Ac][Ag]Vitesse de dissociation :Vd = k’ [Ac-Ag]A l’équilibre, Va = Vd

k[Ac][Ag] = k’ [Ac-Ag]KA = [Ac-Ag]eq / [Ac]eq x [Ag]eq => k/k’On peut aussi établir une constante de dissociation à l’équilibre KD:

KD = 1/KA

L’unité de KA est L/mol, et pour KD c’est le mol/L.Quand il y a une bonne affinité alors KA est élevé. On dispose d’Ac dont KA=1010 L/mol.Bonne affinité : 103 < KA <1010 L/mol.

Avidité : Pour avoir une bonne affinité :utilisation d’Ac monoclonaux. C’est-à-dire un seul type d’Ac donc un seul paratope.Quand on utilise du sérum polyclonal avec des Ag multivalents (cad plusieurs épitopes) : on parle d’avidité car on mélange plusieurs Ac différents capables de reconnaître plusieurs épitopes différents. nAc + mAg nAc-mAg appelé “complexe multimoléculaire”.

L’avidité se caractérise par une constante d’association KA qui donne toujours KA>>KA1 ;KA2. Le complexe est plus stable du fait des différents Ac qui se lient à l’Ag.

Remarque KA : Cette constante dépend du nombre d’Ac capables de reconnaître des déterminant antigéniques différents. Elle dépend également des conditions physico-chimiques du milieu cad pH, Temp°C et force ionique du milieu. En faisant varier ces conditions, on stabilise ou on fragilise le CI.

Spécificité des AcReprésente la capacité d’un Ac à discriminer 2 déterminants antigéniques semblables en se liant à eux avec une affinité différente.

Ici on considère que l’Ac est bien spécifique de c déterminant antigénique car grande différence d’affinité entre les deux déterminants antigéniques.

Les Ac monoclonaux sont dit bcp plus spécifiques pour un Ag donné que pour les sérums polyclonaux.Il peut y avoir des réactivités croisées car les Ac produits pour un Ag1 peuvent reconnaître des déterminants antigéniques de d’autres Ag. Ces problèmes de réactivités croisées se posent quand un Ag possède des déterminants antigéniques similaires ou semblables. Donc avec le même sérum polyclonal on peut avoir une affinité élevée KA1 avec Ag1 et une autre affinité KA2 pour l’Ag Ag2. Il faut alors vérifier et contrôler si le sérum est bien spécifique des Ag. Pour les Ac monoclonaux la spécificité est meilleure car il y a un seul type d’Ac donc le problème des réactivité croisée est moindre.

Détection des réactions AgAc

Présentation généraleAc : outil de reconnaissance spécifique ; il faut être capable de détecter le CI.

Détection visible à l’œil nu : Agglutination : Elle concerne les Ag insolubles ou particulaires.Précipitation : L’Ag est solubles mais le CI formé précipite.

Complexe Immun non visible à l’œil nu : On utilse des révélateurs pour mettre en évidence le CI.

Marquage : marquage soit de l’Ag soit de l’Ac. Il existe trois types de marquages : fluorescent « immunofluorescence », radioactif « radioimmunologie », enzymatique « immunoenzymologie ».Utilisation du complément Neutralisaiton de l’activité enzymatique : Bloquer l’activité enzymatique d’un Ac notamment du type toxique (quand il y formation du CI, il y a perte de l’activité toxique).

Les réactions d’AgglutinationPrincipe :

Les réactions d’agglutinations sont la conséquences d’Ac agglutinant sur un Ag particulaire permettant ainsi la formation de ponts spécifiques entre les particules ce qui constitue un réseau visible sous forme d’amas.

Conditions nécessaires à l’agglutination : Les particules généralement utilisées sont chargées + ce qui entraîne une répulsion. Or pour former un réseau il faut former des liaisons afin de rapprocher les particules. Ces liaisons > forces de répulsions. Ces forces de répulsions sont reliées à un potentiel (zêta) :

ζ = σ / D x racine carrée de μavec σ = charge électrique des particulesavec D = constante d’électricitéavec μ = force ionique du milieuCe potentiel traduit les force de répulsions entre les particules.Il existe de sAc qui agglutinent facilement à des particules et d’autres qui ont plus de difficultés, ce sont les Ac non-agglutinants. Les Ac agglutinants sont souvent des immunoglobulines du types IgM, et les non-agglutinants sous souvent du type IgG. Ce qui permet de dire que si les Ac sont, ou non, agglutinant et la valence (IgM = 10 ; IgG = 2).Les Ig masquent les chargent électriques à la surface des particules (surtout IgM car elles sont plus grosses). On peut également agir sur la force ionique du milieu en augmentant la concentration en ions (plus la force ionique augmente plus zêta diminue).La température joue une rôle important. L’augmentation de la Temp°C = agitation moléculaire. Cette agitation favorise la rencontre Ac/Ag.L’agglutination est plus rapide à températures élevées qu’à températures froides. Dans de cas on parle « d’Ac chauds ». Il existe des Ac froids qui agglutinent davantage à 4°C qu’à 37°C. En effet l’agitaiton moléculaire peut rompre les liaisons entre les particules.

Les différents types d’agglutination : Il faut que l’Ag soit particulaire. Cet Ag peut-être naturellement particulaire (comme les Ag A,B,O porté sur les hématies). Dans ce cas, il y a « Agglutination Active ».Il existe aussi des Ag que l’on a rendu particulaire = Ag que l’on fixé volontairement sur une particule (ex billes de latex). Dans ce cas il s’agit d’une « Agglutination Passive ».

Exemple d’agglutination directe : Détermination des groupes A,B,O = on veut mettre en évidence une particularité sur les hématies => technique qualitative.Détermination de la quantité d’Ac contenu dans un sérum => technique quantitative. Travail effectué en microplaques.

Application : Ac antiSalomnelles et antiBrucella.Titre du Sérum = quantité d’Ac présent dans le sérum qui correspond à l’inverse de la plus grande dilution du sérum pour laquelle on observe encore une réaction d’agglutination.Exemple d’agglutination active indirecte : Ac non- agglutinant : ne provoque pas d’agglutination spontanée =>souvent des IgG. On utilise des « artifices » afin d’obtenir des réactions d’agglutination. => Ajouter au milieu réactionnel des macromolécules qui vont réaliser des ponts fixés à des molécules voisines.

On crées des ponts artificiels entre les Ig. On utilise souvent du sérum d’Albumine provenant de Bœuf (SAB). Il existe aussi du Dextran et du Ficoll qui ont la même fonction que la SAB.Remarque : Hydrolyse partielle de l’Ag Parfois avec des IgM il n’y a pas d’agglutination. L’utilisation d’enzymes protéolytiques qui vont couper certaines parties de l’Ag sont responsables de la non agglutination. Exemple d’agglutination Passive : Au départ l’Ag est soluble puis on le rend particulaire en le fixant sur un support spécial (ex bille de latex ou hématies). Or les hématies ne sont pas antigéniquement neutres. Il faut alors vérifier que les hématies n’agglutinent pas spontanément avec les Ac utilisées. De plus les hématies sont fragiles ; elles s’hémolysent très facilement : on utilise du formol pour les rendre plus stables (en plus de les garder à +4°C).L’Ag choisit peut se fixer très facilement sur les hématies, par simple contact ou réaction chimique. Les billes de latex présentent un autre avantage : antigéniquement neutre et très peu fragiles. L’agglutination sera pourtant plus sensible et plus simple avec les hématies plutôt qu’avec les billes de latex.

Exemple : Recherche du facteur rhumatoïde : Polyarthrite rhumatoïde = maladie auto-immune ( IgM anti Fc IgG).

Les réactions d’agglutination sont donc très faciles à mettre en œuvre et peu coûteuses, en générale. Elles sont appliquées dans de nombreux domaines (notamment microbiologie, sérologie, alimentair et biotechnologie).

Réactions de précipitationPrincipe :

Réactions qui mettent en jeu des Ac spécifiques et des Ag solubles. Il se forme un réseau multimoléculaires entre les Ac et les Ag et qui, dans certaines conditions, peut devenir insoluble et précipite. Contrairement à la réaction d’agglutination, ce n’est pas des particules mais des protéines ou des polyosides.C’est donc le CI qui devient insoluble. C’est peut-être sa taille qui en est à l’origine. Remarque : Il existe des Ac qui précipite et d’autres qui ne précipitent pas. C’est-à-dire que tous les cI ne sont pas précipitables.

Conditions nécessaires à la précipitation : Il y a différents milieux possibles pour la précipitation : liquide ou « solides » (= gélifié). Les concentrations en Ag et en Ac sont déterminantes.Il existe différentes techniques pour déterminée la quantité du précipité : en milieu liquide on peut analyser le résultat via un dosage de Kjeldahl pour mesurer l’azote qui est directement proportionnelle au précipité (cf . Biochimie) ; par néphélométrie ; par turbidimétrie ; …

Il y a augmentation de la quantité de précipité en fonction de la quantité d’Ag. Puis un plateau quand la quantité de précipité est maximal. Puis la quantité de précipité diminue.Quand il y a un excédant d’Ac, il n’y a en fait quasiment pas de réseau moléculaire. Puis à l’équivalence, tout les Ac sont reliés aux Ag = réseau macromoléculaire. On parle ici de « concentration optimale ». Puis il y a un excédant de précipité = bcp d’Ag vont rester insolubles mais quelques rares CI ne vont pas former de réseau.

Avant tout réaction de précipitation il faut définir les concentrations optimales entre Ac et Ag pour avoir le maximum de précipité (ordre de grandeur de la concentration : entre 1 à 10µg/mL).Il existe d’autres techniques plus sensibles.

Supports de réactions de précipitations :

Milieu Liquide : « Ring test ». Apparition d’un anneau blanchâtre si présence d’Ag spécifique aux Ac utilisés. Techniques qualitative, on voit à l’œil nu. Peut-être quantitative si on utilise un spectrophotomètre.

Milieu « Solide » : Gel d’agar ou d’agarose. Agar = mélange de 2 polysaccharides : agaropeptine + agrose. L’agaropeptine a bcp de groupement polaires par rapport à l’agarose. Avantage : ils sont chimiquement neutres ; ils sont visqueux à partir de 50°C, se gélifient à une température < 50°C. Or à 50°C, on peut incorporer des protéines, sans qu’elles soient dénaturés ; ils sont transparents. Ces gels sont maintenus à 7<pH<8,6. La concentration en agarose est d’environ 0,5 à 2%. Un gel, une fois solidifier peut-être comparer à une éponge. Ce qui est soldie c’est l’agarose avec l’eau. On peut alors faire diffuser les réactifs au travers des mailles de l’éponge. On établit alors un gradient de concentration.

Une diffusion se caractérise par une « vitesse de diffusion ». Elle dépende de la taille et de la masse de la molécule.Conséquences : Dans le gel, à l’intérieur des mailles, si l’ac et l’Ag forment le CI et le réseau macromoléculaire alors il y a formation d’un précipité. Cette précipitation va stopper la diffusion et il sera visible à l’œil nu.Remarque : ces réactions sont très spécifiques mais peu sensibles car il faut des concentrations optimales.

Principales techniques de d’immunoprécipitation en milieu gélifié : Ouchternoly :diffusion double.

Diffusion Simple : technique d’immunoprécipitation en milieu gélifié pour laquelle un des constituant est incluse dans le gal à concentration constante.Technique de Mancini : technique de diffusion radiale. C’est une méthode quantitative pour faire un dosage.

Plus la quantité d’Ag est importante, plus le diamètre du cercle de précipitation sera grand. D² = α [Ag] + β

C’est la surface qui est proportionnelle à la concentration.Il s’agit d’une technique bidimensionnelle.

Immunodiffusion après accélération dans un champs électrique : cf principe de l’électrophorèse.Les deux diffusions précédentes se font suivant un gradient de concentration. Ici la diffusion va se fire sui te à l’établissement d’un champ électrique dans le gel. Le gel va être relié à un générateur de tension.Diffusion Simple, ou la technique de Laurel : Des Ac sont introduits dans le gel. Méthode de dosage. On fait des trous dans le gel du côté + ou – en fonction de la charge de l’Ag. La charge de l’Ag varie en fonction du milieu, cad du pH, cf Biochimie.Ici on sait que pHi(Ac)~8,6, il faut donc que le pH du gel soit à 8,6 pour que les Ac ne migrent pas. C’est une diffusion unidimensionnelle, le cercle (= le puit) s’étend en forme de « fusée ». Onconsidère que la hateur de la fusée et proportionnelle à la concentration :

h = α [Ag] + β

Diffusion double: ici les Ac et les Ag migrent.Cette technique s’applique plutôt dans le milieu médical (ex Candidose).Il s’agit d’une technique plus rapide qu’Ouchternoly.

Utilisation des Réactifs marquésDans ce cas là, la réaction Ac-Ag ne peut-être mis en évidence à lo’eil nu. On utilise alors des réactifs marqués :

-radioactifs (isotopes)-fluorescence-enzymatiques

ImmunofluorescenceUn des réactifs est marqué par un fluorochorme = molécule capable d’émettre de la fluorescence après excitation. Pour observer cette réaction, il faut utiliser un miscrosope à fluorescence = capable d’exciter le fluorochrome et de détecter la fluorescence émise.

Le plus souvent c’est l’Ac qui est marqué par le fluorochrome.Fluorochorme = isothicyanate de fluorescence FITC ; dérivés de la rhodamine.Il existe divers techniques de fluorescences :

Immunofluorescence directe : étape de marquage + étape de lavage + étape de révélation, cad observation au microscope à fluorescence.

Inconvénient : la préparation de l’Ac est délicate car les Ac primaires sont coûteux et davantage encore l’ajout de FITC !Avantage : technique très simple car un seul Ac à rajouter et un seul lavage.

Immunofluorescence indirecte : L’Ac primaire n’est pas marqué, on rajoute un Ac secondaire (anti Ac primaire ou anti Isotype) marqué.

Avantage : moins coûteux car il est plus facile de faire des Ac secondaires marqués que des Ac primaires. Méthode plus sensible car il y a amplification du signal entre Ac primaire et Ac secondaire.Inconvénient : méthode plus longue car plusieurs étapes d’incubation et risque de marquage non-spécifique.

Technique du « Sandwich » : Mise en évidence des Ac. Elle consiste dans un premier temps, à fixer des Ac sur un support. Ensuite on fixe l’Ag. Puis « on prend en sandwich » l’Ag avec un second Ac qui lui est fluorescent.

Remarque : Ces techniques d’immunofluorescences sont utilisées soit de manières qualitatives pour mette en évidences des Ac ou des Ag. Mais maintenant de plus en plus quantitatives pour des dosages.

RadioimmunologiePrincipe : utiliser des Ac radiomarqués pour mettre en évidence le complexe Ac-Ag. La molécule la plus souvent utilisées est le Tritium, H3.

ImmunuenzymologiePrincipe : utilisation d’Ac sur lesquels n a fixé une enzyme ce qui va permettre la détection du CI.

Techniques « non-compétitives » : Elle repose sur le même principe que l’immunofluorescence donc elle peut-être directe/indirecte/sandwich.

Exemple directe : le produit P de la réaction enzyme E / substrat S a des propriétés d’absorption donc mise en évidence par spectrophotométrie. On établit ainsi une gamme étalon : on fait varier la quantité d’Ag marqués et on ajoute la même quantité d’Ac secondaires avec l’enzyme E. On détermine la zone de linéarité pour faire le dosage.

Techniques « compétitives » : Faire un compétition vis-à-vis d’Ac fixés sur un support entre l’Ag à doser et un Ag marqué de même spécificité ajouté en quantité commune et en même temps.

La variable ici est le nombre d’Ag marqués. L’absorbance est inversement proportionnelle à la quantité d’Ag. Limite de détection environ 10 ng/L. Les enzymes les plus utilisées sont Phosphatase alcaline, Peroxydase, Beta-galactosidase.

Obtention des Ac

Rappels sur la physiologie de la réponse immunitaireMédiation humorale Médiation cellulaire

Ac spécifiques (sang, sécrétion des muqueuses) = réponse cellulaire-> LB, LT helpers cd4+

-> cellules phagiques (macrophages, polynucléïdes)AcAg = CI qui active le complément et les cellules phagiques. Ci peut aussi « neutraliser » l’Ag (l’Ac se fixe sur la toxine bactéreinne par exemple, et inhibe la toxicité).

Pas de production d’Ac mais production de cellules qui agissent sur l’Ag => cytoxicité cellulaire. Pas de cellules phagocytaires- LT cytotoxiques et LT cd8+

Deux phénomènes spécifiques

Caractéristiques générale de la réponse immunitaire à médiation humoraleOn immunise un animal avec un Ag étranger.Cette réaction immunitaire présente toujours un délai temporel. Elle est transitoire : elle dure peu dans le temps, il arrive un moment où les Ac spécifiques ne sont plus détectables. C’est une production majoritaire d’IgM (et minoritairement d’IgG). L’Ag possède plusieurs épitope différents alrs réponse immunitaire avec plusieurs types d’IgM pouvant reconnaître plusieurs épitopes différents. La production d’Ac se fait un faible quantité.La seconde réaction est immédiate. La production d’Ac est 10 fois plus importante. Ce sont des IgG qui sont produits majoritairement. Cette seconde réponse est maintenue dans le temps. Généralement les Ac produits ici ont une meilleure affinité avec l’Ag.

On montre ici que l’organisme développe une « mémoire immunitaire » entre la première et la seconde immunisation.Le principe de la vaccination repose sur cette « mémoire immunitaire ».

Facteurs de variation de la réponse immunitaireCette réponse immunitaire dépend de la voie d’administration.

-jamais sous voie orale, -voie sous-cutanée,

-intra-péritonéale (dans l’abdomen),-rarement en intra-veineux.

Cette réaction dépend aussi de sa dose.

Utilisation d’un adjuvant : c’est une substance qui est incorporée / injectée en même temps que les Ag et qui va stimuler la réponse immunitaire. Très souvent ce sont des sels inorganiques (hydroxyde d’alumine, phosphate de calcium). Ils ont tendance à piéger les Ag et à les accumuler sur les sites de l’injection. Ceci favorise les réponse immunitaire car il y a une forte concentration à cet endroit. Ce sont aussi des composant bactériens, par exemple les protéines de la paroi des mycobactéries. Ces Ag stimulent fortement les lymphocytes.Exemple : « adjuvant de Freud » = solution antigénique (soluble) + Ag BK (protéine de la paroi des mycobactéreies) + huile de paraffine. L’huile forme une émulsion => l’Ag devient alors particulaire ce qui stimule fortement la réponse immunitaire ( réaction inflammatoire très importante).Remarque : les adjuvants sont totalement interdits en vaccination humaine.

Récupération de sérums polyclonauxOn récupère d’abord le sang que l’on centrifuge pour obtenir le plasma. Puis lors de la coagulaitondu plasma il y a formationd ‘un caillau de fibrine (sans anticoagulant). On récolte alors le sérum (avec toutes les protéines du sérum, cad envrion une centaine). Dans ce sérum ne nous intéresse que les Ac.Purification des Ac : On utilise une colonne de chromatographie.

Chromatographie d’affinité : Liaisons d’affinité = liaisons faibles. La protéine A a une affinité avec Fc des Ig donc la partie Fab pourra nous servir a récupérer les autres protéines. Une élution permet de décrocher les protéines. Variation de la force ioniques ou variation du pH. On récupère tous les Ig que l’on va faire passer sur une seconde colonne. Dans une seconde colonne on fixe des Ag spécifiques qui vont retenir que les Ac spécifiques. Les autres seront évacués. DE même on effectue une élution pour récupérer les Ac spécifiques. On obtient alors notre sérum polyclonal.

Chromatographie sur colonne échangeuse d’ions :

Production d’Ac monoclonauxPrincipe : préparation et obtention de « cellules hybrides » dites « hybridomes » qui sont le résultats de la fusion (forcée) de deux cellules :

-cellule tumorale (myélome)-plasmocyte (LB activé sécrétant des Ac)

Du fait de cette fusion, les hybridomes ont des doubles propriétés :-capables de synthétiser et de sécréter des Ac spécifiques-capables de se multiplier indéfiniment en culture cellulaire in vitro.

Culture in vitro : milieu de culture liquide, 37°c, 5%de CO2, pour les cellules animales et eucaryotes.

Les étapes principales de production d’Ac monoclonauxPour faire un hybridome ont a besoin de cellules tumorales et de plasmocytes. Il faut cependant des plasmocytes spécifiques, par exemples sécrétant des Ac antiActine. Il faut donc immuniser un animal

avec des Ag spécifiques, il va produire un sérum polyclonal composé d’Ac antiActine. Ce qui nous intéresse ce sont les plasmocytes produisant ces Ac. Chez l’animal, ces plasmocytes abondants sont situés dans la rate. Les cellules de la rate s’appellent les splénocytes, donc certains splénocytes sont des plasmocytes.Lorsque l’on a récupéré ces splénocytes on les mélanges avec le myélomes.Le PEG (PolyEthylèneGlyol) a un effet sur les membranes plasmiques, il favorise les contacts cellulaires entre plasmocytes et myélomes. Puis on cultive les cellules in vitro.Lors du mélange il n’y a pas que les hybridomes sérétant les Ac antiActine, il y a aussi ceux produisant les autres Ac.Lors du mélange en tubes toutes les cellules ne s’hybrident pas ! Il reste donc dans chaque puit des hybridomes, des splénocytes et des myélomes.Sachant que les plasmocytes ont une durée de vie de 3-4 jours, au bout d’une semaine il n’y aura plus de plasmocytes non hybridés. Par contre il faut une contrainte, lors de la culture pour empêcher la culture des mylomes non hybridés = sélection négative.Lors de la duplication de l’ADN il faut des précurseurs dans le milieu du type :

-Thymine qui permet de synthétiser la Thymine et la Cytosine (bases Pyrimidiques).-Hypoxanthine qui permet de synthétiser l’Adénosine et la Guanine (bases Puiriques).

On ajoute dans le milieu ces deux précurseurs. L’aport d’Hypoxanthine nécessite une enzyme : la HGPRT (Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transférase).Le mode de sélection des hybridome repose sur cette enzyme. Si il n’y a pas d’enzyme dans le milieu il n’y a pas d’Adénine ni de Guanine. On peut aussi synthétiser les nucléotides à partir des bases Azotés déjà existantes dans la cellules (synthèses des « novo »). Or les hybridomes utilisés sont des HGPRT -.Dans le milieu de sélection on met les deux précurseurs : Hypoxanthine + Thymidine +Aminotpérine qui inhibe la synthèse des « novo ».Donc la synthèse des novo des hybridome va être inhibée, la synthèse via H et T aussi. Donc seuls les hybridomes HGPRT+ grâce aux plasmocytes pourront survivre. On note qu’au bout de 10 jours environ on obtiens que des hybridomes dans les puits de culture.Identification des clones produisant les Ac spécifiques.On recherche quels sont les puits qui possèdent les Ac qui nous intéressent. On prélève le surnagent cad les protéines libérées par les hybridomes. Clonage Objectif : isoler une unique cellule dans un puit pour que cette cellule se multiplie pour donner une population cellulaire. La méthode utilisée et celle de la dilution limite. Dilution Limite : dilutions choisies de telle sorte qu’après ces dilutions il n’y ait soit 1 soit 0 cellule dans les puits. On laisse incuber 15j pour que les cellules se développent Puis on recherche les clones qui possèdent les Ac mococlonaux voulus.Production d’Ac monoclonaux en masse. Cf. poly

Avantage Ac m / Ac p:1 seul type de reconnaissance bcp plus importante pour les mococloanaux que les polyclonaux. Bcp moins de risques d’activités croisées. De plus la sélection des Ac est faite avec une meilleure affinité, pour être la plus spécifique = >outils de reconnaissance très spécifique !!Par contre coût et fabrication sont des inconvénients.