N° d'enregistrement

au C.N.R.S. %4-cÂ-

THESE DE DOCTORAT D'ETAT ES SCIENCES NATURELLES

présentée

A LA FACULTE DES SCIENCES

DE PARIS

par

Josette T A N"G U y

pour obtenir"

.LE GRADE DE DOCTEUR ES - SCIENCES

Sujet de la Thèse: QUELQUES ASPECTS DU METABOLIS~Œ DES COMPOSES PHENOL1QUES

CHEZ LES Nicotiana HYPERSENSIBLES AU VIRUS DE LA MOSAIQUE

DU TABAC SOUCHE COMMUNE •

Soutenue le

O.R.S.T.O.M.

PARIS

1970

Avant-Propos

Ce travail·a pu être réalisé au Laboratoire de Biochimie de la res~s'

tance de l'Office de la Recherche Scientifique et Technique Outre-Mer, grâce àson Directeur Général, Monsieur le Professeur G. CAMUS, qui a bien voulu, enoutre, nous faire l'honneur d'assumer la présidence de notre jury.

Monsieur C. MARTIN, Directeur de Recherche à l'Institut National dela Recherche Agronomique, et notre Dirècteur scientifique à l'ORSTOM a orientéinitialement ce travail. Depuis 1965, il n'a cessé de le suivre, de nous faireprofiter de ses vastes connaissances, de ses critiques et de ses suggestions.Il nous a toujours accueillie avec bienveillance et n'a jamais hésité à nous alcorder une aide matérielle précieuse. Qu'il trouve ici l'expression de notreplus profonde gratitude.

Madame J. POLONSKY, Directeur de Recherche au Centre National de laRecherche Scientifique, Monsieur le Professeur L. HIRTH président du ComitéTechnique de Phytopathologie et Zoologie de l'ORSTOM, ont bien voulu s'intéres'ser à notre travail et faire partie du jury de notre thêse. Nous les prionsd'agréer tous nos remerciements.

Nous voudrions également exprimer notre v~ve reconna~ssance au Doc­teur J.B. HARBORNE qui nous a accueillie dans son laboratoire de l'Universitéde Liverpool et nous a fait partager ses nombreuses connaissances sur la chi­mie des phénols.

Nous tenons à associer à ces remerciements Monsieur M. MEIFFREN quia guidé nos premiers pas dans le domaine de la recherche et n'a cessé depuisnotre entrée à l'ORSTOM de nous prodiguer ses nombreux conseils.

Nous voulons remercier de façon toute particuliêre Monsieur M. GALLE'qui nous a fourni toutes les plantes utilisées au cours de nos recherches, etdont la collaboration précieuse fut sans doute l'un des facteurs déterminantsde la réalisation de ce travail.

Notre gratitude est également acquise à Madame M. HARDY dont les conseils techniques nous ont été fort précieux, et à Madame J. ROUVEROT qui a ap­porté à l'exécution de ce travail une aide efficace et dévouée.

Nous remercions également }~demoiselle Y. ROUSSEL pour ses conseilsrelatifs à la rédaction et à la réalisation de ce mémoire.

Enfin, nous remercierons tous nos amis et collêgues desS.S.C. deBondy pour l'ambiance de cordiale sympathie qu'ils ont contribué à faire régneet sans laquelle ce travail n'aurait pu être mené à bien.

-,2 -

..

Sommaire

l n t r 0 duc t ion .................................................................................. , .. 7

Chapitre Pre mie r

HISTORIQUE .................................................................... Il .. 9

19

12

1215

16

10Les composés en CG' C6 - Cl, CG - C2 ou dérivésde l'acide benzoique •...........................Les composés en CG - C3 ou dérivés de l'acidecinnamique ..

1.- Les acides cinnamiques ......•2.- Les coumarines......... • •.....

B -

C - Composés en CG - C3 - CG ou flavonoides ..•••.•••••••••..

III.Accumulation des substances phénoliques chez lesplantes en réponse à des blessures causées aussibien par des agents pathogènes que par des facteursmécaniques ..

l. Généralités 9II. Classification des composés phénoliques) inventaire

de ceux identifiés dans le tabac • . . • • . . • . . . • . • . . . . . . . • . . . . . • • . 10

A-

Cha pit r e 2 l

MATERIEL ET TECHNIQUES ANALYTIQUES 20

l. Matériel végétal ..II. Méthodes générales d'étude des composés aromatiques

2020

~ 3 -

Identification de ces combinaisons

Séparation des combinaisons (hétérosides et esters)

22

22

22222222

23

2324

24

242425

25

25

2526

26

2021

Solvants .Révélation des chromatogrammes

Généralités .Acides-phénols, coumarinesFlavonols .

Acides-phénols, coumarinesFlavonols .

Chromatographie sur papier

Hydrolyse acide . • . • • • • . . . . . • .•••.•.Hydrolyse alcaline .••.•.•.•.•••••••.••.Hydrolyse enzymatique ••..•••••••....•..••Extraction et purification des aglycones

Séparation des aglycones

Identification des aglycones

ab

ab

abC

},- Les

abcd

},-

2.-

3.-

Généralités .Préparation des extraits .Hydrolyses des extraits initiaux. Séparation etidentification des aglycones ••.•.•..•..•••••.••.•.

différents types d'hydrolyse •••••....

E

ABC

D -

III.Dosage des composés phénoliques

a Réactif de Folin et Ciocalteub Solution aqueuse de Naz C0 3

2. - Mode opératoire .••...••••••...•

Principes .Dosage global des composés phénoliques

1.- Réactifs .

Comparaison des Rf avec ceux des produitsde référence .Purification des substances phénoliques .•..••...•Identification des produits isolés .•...•••••

262727

27

30

31

3132

32

3232

32

Réalisation des spectres ••••.•••...•.••••Identification des produits résultant de1 'hydrolyse

ab

},-

2.­3.-

AB

Dosage des différents composés après séparationet purification par chromatographie sur papier

C -

},­

2.-Utilisation du réactif des phénolsEtablissement des courbes d'étalonnage

33

3333

- 4 -

Cha pit r e 3

ETUDE, EVOLUTION QUALITATIVE DES COMPOSES PHENOLIQUESDANS DES Nicotiana xanthi N.C., INFECTES A 20 ET 30 OcPAR LE VIRUS DE LA MOSAIQUE DU TABAC SOUCHE COMMUNE.EXAMEN DU COMPORTEMENT DE CES SUBSTANCES DANS DES TABACSVIROSE S DE LA VARIETE Samsun .....................•................

1. Résultats expérimentaux35

35A -

B -

Identification des polyphénols présents dans lesfeuilles saines de Nicotiana xanthi n.c ..••••••.••.•.••••

1.- Dérivés de l'acide cinnamique •.•.•••.•...••.••..•.••2.- Flavonosides· .3.- Conclusions .

Evolution qualitative des composés phénoliques dansles feuilles nécrosées de Nicotiana xanthi n.c.,infectés à 20 Oc par le virus de la mosaïque dutabac .

35

353942

42

}.-

2.-

3.-

Identification des aglycones présents dansles hydrolysats d'extraits initiaux de feuil-les de Nicotiana xanthi n.c.virosées à 20 Oc ......•.Etude des combinaisons (hétérosides et esters)apparaissant dans les feuilles nécrosées deNicotiana xanthi n.c., infectés à 20 Oc parle virus de la mosaïque du tabac •.•.••••••.•••••••••

a - Dérivés de l'acide cinnamique •••••.••••.••..••.•b - Dérivés de l'acide benzoïque •••••••.•.•.•.•..••.c Substances non encore identifiées apparais-

sant sur les chromatogrammes réalisés à par-tir d'extraits de feuilles nécrosées •.••••.•••••

Conclusions

45

48

4959

60

61

C - Etude des polyphénols dans des Nicotiana xanthi n.c.virosés à 30 Oc par le virus de la mosaïque du tabac •••...

D - Evolution qualitative des composés phénoliques dansles feuilles inoculées de Nicotiana xanthi n.c.soumis à des transferts thermiques •••••..•••••.•••••••••.

1.- Transfert thermique de 20 à 30 Oc ........•.•........2.- Transfert thermique de 30 à 20 Oc ............••...•.

E - Etude des composés phénoliques dans des feuillesvirosées de Nicotiana tabacum variété Samsun •.••...•••.•..

II. Discussion, interprétation des résultats

- 5 -

61

62

6262

62

63

Cha pit r e 4

EVOLUTION QUANTITATIVE EN FONCTION DU TEMPS DES CO}ŒOSESPHENOLIQUES DANS DES Nicotiana xanthi N.C., INFECTES A20 ET 30 Oc PAR LE VIRUS DE LA MOSAIQUE DU TABAC .•..•••.•..•..•.•• 69

1. Résultats expérimentaux 69

A -

B -

Evolution des teneurs en phénols totaux et enprincipaux phénols au cours de l'infectionvirale à 20 Oc du Nicotiana xanthi n.c ...•..•••.....••••••

1.- Ph_énols totaux .2. - Principaux phénols .

a - Acides chlorogéniques .•....••••••..••.•••.••....b - Rutine, nicotiflorine .c - Acides p-coumaryl et férulylquiniques .••••••.•••d - Férulylglucose, scopoline ....•.•••••....••.•••.•

3.- Conclusions

Evolution des teneurs en phénols totaux et en prin­cipaux phénols au cours de l'infection virale à30 0 C du Nicotiana xanthi n. c. . .

1.- Phénols totaux .••••.•.......•...............•.•..•••2.- Principaux phénols .3.- Conclusions .

70

7070

70707071

86

86

868695

C - Evolution quantitative des composés phénoliquesdans des tabacs virosés de la variété Xanthi n.c.soumis à des transferts thermiques •••••.••••••.•.•.••••••

1.- Transfert thermique de 20 à 30 Oc2.- Transfert thermique de 30 à 20 Oc

il. Discussion, interprétation des résultats

95

95

110

120

Rés u m é Con c lus 1 0 n s G é n é r ale s 122

..

Réf é r e n ces b 1 b 1 i 0 g r a p h 1 que s 127

Introduction

Le Nicotiana tabacum xanthi n.c. inoculé avec le virus de la mosai­que du Tabac souche commune, réagit à partir de 13-14 Oc par des lésions lo­cales nécrotiques (9]). Rapidement après l'inoculation, les cellules danslesquelles sont produits les nouveaux virions sont détruites, la multiplica­tion s'arrête et l'infection reste localisée. C'est le phénomène de l'hyper­sensibilité. Entre 29 et 30 Oc le virus envahit l'ensemble de la plante saufle méristème apical, et la nécrose de la feuille inoculée est remplacée parun simple jaunissement. Dans ce cas, le déroulement de l'infection virale estle même chez un hôte sensible, le Nicotiana tabacum variété sanmun par exempleque chez un hôte hypersensible. Il y a généralisation du virus dans la plante.Les propriétés biologiques des particules virales synthétisées à 30 Oc chez unhôte hypersensible ne se différencient pas de celles produites à 20 Oc chez unhôte sensible comme le Nicotiana samsun.

Les travaux entrepris dans le laboratoire (92), montrent que l'arrêtde la multiplication virale chez un hôte hypersensible, n'est pas dû comme leprétendait une théorie devenue classique à la formation d'une barrière de cel­lules mortes isolant l'ARN infectieux dans une zone restreinte de l'hôte, maisà un autre processus. Il existe dans les cellules vivantes situées autour de lanécrose d'hypersensibilité des éléments dotés de pouvoir infectieux mais inca­pables dans certaines conditions (20 OC) d'imposer leur information génétiqueaux cellules qui les hébergent. Une simple élévation de température (30 Oc -35 OC) permet au virus de diriger sa propre replication et donc de provoquerla synthèse de ses protéines (replicases, protéine du manteau) en utilisant" lessystèmes métaboliques de l'hôte (nucléotides, acides aminés, ATP formé par lemétabolisme intermédiaire). Il devient alors capable d'envahir les tissus del'hôte (infection systémique) comme il le fait chez un individu sensible quelleque soit la température.

Le matériel génétique du virus de la mosaique du Tabac est de l'ARN.Il est présent à l'état de polynucléotides à simple chaîne (monocaténaire). Ildoit exister des mécanismes permettant à l'ARN infectieux monocaténaire de seperpétuer. Si l'on affecte une polarité (+) à l'ARN infectieux d'un virus, lacellule infectée doit pouvoir reproduire des molécules douées de même signe dansla descendance. La replication ne pouvant évoluer que selon une polarit~ anti­parallèle vis-à-vis de la chaîne d'ARN parentale, on peut donc concevoir que lebrin (+) ne puisse être repliqué directement. Dans un premier temps on a recons­titution d'un intermédiaire à double chaîne (ARN - ARN) dite forme replicative

- 7 -

(7,97). Il Y a synthèse d'un brin (-) au contact d'un brin (+) de la manièresuivante

ARN (+) ---> ARN (+-).

Dans un second temps, on synthétise des brins de polarité (+) en re­pliquant des brins de polarité (-)

ARN (+-) ~ ARN (+) (144).

L'enzyme catalysant la formation du brin (+) à partir de la forme re­plicative est l'ARN replicase (8,65 , 145). Il peut également exister un secondenzyme qui catalyse la production du brin (-) à partir de la forme (+) (143).

L'ARN viral (+) joue le rôle d'ARN messager, donc de matrice, et doitcontenir l'information génétique des replicases et de la protéine du manteau.

Les examens faits au microscope électronique (93) sur des cellulesvivantes avoisinant les lésions nécrotiques à 20 oC, ne permettent pas de mettreen évidence des particules virales complètes. Par contre, il est observé trèsfréquennnent un matériel de structure irrégulière. Lors du retour à 30 oC, ce ma­tériel a tendance à disparaître, et on observe de nombreux bâtonnets (V.M.T.)ainsi que des structures qui seraient des formes incomplètes de virus.

Il peut exister dans les cellules infectées à 20 Oc un mécanisme blo­quant l'une ou l'autre des différentes étapes conduisant au virion complet. Laperturbation pourrait se situer au niveau de l'ARN replicase. La mise hors-cir­cuit de l'enzyme proviendrait soit de la répression de sa synthèse, .soit del'inhibition de son activité. Ce processus pourrait être réalisé grâce à un mé­tabolite produit par le N.xanthi n.c. virosé à 20 oC. Cette substance pourraitêtre thermolabile, ou sans être sensible à la température l'enzyme nécessaireà sa synthèse serait inhibé ou détruit aux températures supérieures à 29 oC.

Les composés phénoliques étant selon certains auteurs (40) impliquésdans les processus biochimiques conduisant à l'expression du phénomène d'hyper­sensibilité au virus, il nous a paru intéressant d'étudier les variations su­bies par ces substances au cours de l'hypersensibilité et de voir s'il existeun lien entre métabolisme des phénols hypersensibilité et température.

Un rappel de nos principales connaissances concernant les phénolsidentifiés jusqu'à ce jour dans le tabac, et l'accumulation de tels composéscomme une réponse non spécifique à différents types d'agressions, précèdera ladescription du matériel et des techniques, utilisés au cours de ces recherches.

Les bases théoriques et techniques-étant établies, nous ahorderonsl'étude des composés phénoliques dans les Tabacs sains de la variété xanthin.c., puis les variations subies par ces substances au cours de la réactiond'hypersensibilité et lors de la généralisation du virus dans la feuille inocu­lée. Ce chapitre comportera également une analyse de l'évolution CLualitative desphénols dans des Tabacs virosés de la variété samsun.

La dernière partie du travail sera consacrée à une étude des phénols~

effectuée en fonction du temps, dans les N.xanthi n.c. infectés à 20 et 30 Ocpar le virus de la mosaïque du Tabac. Elle permettra ainsi de résoudre le pro­blème du rôle des composés phénoliques dans la formation des lésions localesnécrotiques~ et donc de la réaction d'hypersensibilité.

- 8 -

Chapitre Pre mie r

HISTORIQUE

Dans une première partie, nous avons cherché à faire une mise aupoint aussi précise que possible de nos connaissances actuelles sur les subs­tances phéno1iques. Il nous a semblé intéressant de donner une classificationde ces composés, et de dresser un inventaire de ceux qui jusqu'à présent ontété identifiés dans le tabac. La plupart de ces études ont été effectuées surdes tabacs cultivés à l'étranger et particulièrement sur des tabacs f1ue-cured.

l - GENERALITES •

Les composés phéno1iques sont caractérisés par la présence dans leurmolécule d'un ou de plusieurs noyaux benzéniques simples ou accolés. Parmi cessubstances on rencontre des composés simples mais aussi des polymères de massemoléculaire élevée comme les tanins condensés et la lignine. Ces substances ren­ferment rarement un seul groupement fonctionnel, ce qui justifie le terme deI po1yphéno1s" ou de substances "po1yphéno1iques". La fonction phénol est souventassociée à d'autres groupements fonctionnels comme le groupement carboxyle(-COOR). Les phénols sont dans leur grande majorité engagés dans des combinai­sons esters ou hétérosides. La plupart des hétérosides sont des O-hétérosides,la liaison se faisant entre le groupement hydroxyle du noyau (ou ag1ycone) et lafraction réductrice de l'ose. Les esters résultent de la combinaison du groupe­ment carboxyle d'un acide-phénol avec un hydroxyle alcoolique.

- 9 -

II - CLASSIFICATION DES CCMPOSES PHENOLIQUES.INVENTAIRE- DE CEUX IDENTIFIES DANS LE TABAC.

Ces diverses substances peuvent être réparties en trois grands grou­pes. Cette classification rend compte des théories actuellement admises sur labiosynthèse de ces composés. Elle s'établit de la manière suivante:

A - les composés en Cp C6 - Cl' C6 - Cz ou dérivés de l'acide benzoique (1)

B - les composés en C - C3 ou dérivés de l'acide cinnamique (II, III)6

C - les composés en C - C - C6 ou f1avonoïdes (IV) .6 3

~o

ml

A - Cam pas é s 8 n

d 8 l' a cid 8

C6 • C6 - Cl' C6 - C2 a u d é r i v é s

b 8 n z a i q U 8 (tableau 1).

-la -

TAe,LEAU l

FORMULt~ OE,'i PRINC\PAUX PHENOl!» eN c 6 ,C6-C1 ~T CE, _ C2,InENTlFIE.S

DANS LE T~BAC SEt

aCHs

OH OH OCH~

gcaïac.al m _cré sol l,l,3.trimé tho x)' benzene

CHO

OH

CHO CO-CHa

p_ani sai déhyde D_hydroxyacétophénone

HO C\-\:l,- CH== Cl-\~ HO CH:=: CH-CH 3

eugé nol isoeugénol

HO

R

COOHR : R':: H- ë.lc'uje p. hydroxybenzoïqueR =0H1 R' = H - acide pro tocatéchiqLle

R ::: OCH) 1 R' =H- aride van·l\tiqu~

R =R' = 0 CH 3 ,=-acid{2 syringiquC2.

CH~-COOH HO CH~-COOl-

ac.ide

p.nydroxyphénylat:~ tiqueëlc.ide.

m. hydrollyphpnylatét ique

CH~-COOH

OH

ëlci de

o. hydro xyphpn ylaœkiquE'

Les études faites par YANG et WENDER en 1962 (151) sur le tabac et lafumée de cigarette ont permis de mettre en évidence les acides méta- et para­hydroxybenzoique, protocatéchique, vanillique, et ortho-, méta-, et para-hydro­xyphénylacétique.

Il est probable que de telles substances proviennent de la transfor­mation par pyrolyse ou par voie chimique des polyphénols présents dans le tabacvert.

c i n n a mi que.

B - Cam pas é sen

del'a cid e

o u d é r i v é s

. Ce groupe englobe les acides cinnamiques et les coumarines. Dans' cesdernières substances, la chaîne en C3 est sous forme d'hétérocycle oxygéné. Onpeut considérer que les différentes coumarines dérivent des acides cinnamiquesortho-hydroxylés.

Les acides cinnamiques possèdant une double liaison, peuvent existersous deux formes isomères, acide cis-cinnamique et l'acide trans-cinnamique.Comme le montrent les formules suivantes, seules les formes cis sont suscepti­bles de se cycliser pour donner les coumarines.

.iiu:'lde c.is _ dnnamique acide trans_ cinnamiquQ

1.- Les acides cinnamiques (tableau II).

Certains acides hydroxycinnamiquesont été identifiés à l'état libredans le tabac sec, et dans le tabac flue-cured. En 1962, YANG et WE1~ER (151)ont identifié dans le tabac et la fumée de cigarette les acides para-coumarique,férulique, caféique, sinapique, l'acide méiilotique (acide ortho-hydroxyphényl­propionique) et l'acide phlorétique (acide para-hydroxyphénylpropionique). Cer­tains de ces acides ont été observés dans les feuilles de tabac vert: l'acidemélilotique par GEISSMAN et HINREINER en 1952 (53), l'acide caféique parWILKINSON et coll. en 1954 (146), SHIROYA et coll. en 1955 (128) et REID en 1956(I 10) •

-- 12 -

TABLEAU 1[

fORMULES DE5 PRiNCIPAUX DERIVE'i DE l'A(IDE (INNAt'\IQUE

HO C H:=CH-COOH R'

R

R,: R': H j acide? p _c.oumariqu~R= OH. R' = H ; êiH:"lde caféique.R::. 0 [H5r R';::. H; ac.idE? férulique.R ::: R':: OCH 3 ,; aCIde s",napique

R~ OH" R' =H; aCIde mÉ'1 ilotique

R :: H/ R' =OHi a[·ld~ ph\aritiquE

HO

HO

HO

CH==CH-COO3

4

4­

H0 '1--:5::---""/

CH=:CH-COO

at:ide chlorogéniquEJou

acide caféyl_ 3 quinique

acide néo thlorogé niqueou

adde caféyl _ 5 qu·mique

Les dérivés hydroxylés de l'acide cinnamique se rencontrent dans la. plante verte sous forme de combinaisons. Ces complexes sont le plus souvent des

depsides constitués par l'union d'un dérivé de l'acide cinnamique avec l'acidequinique. De toutes les combinaisons c'est l'acide chlorogénique (ester de l'a­cide caféique et de l'acide quinique) qui est quantitativement le plus important.Sa présence dans le tabac semble avoir été observée dès 1884 par SAVERY (122)quî isole un acide "tobacotannique". GORTER en 1909 (54) démontre la présence decet acide dans de nombreux végétaux dont le Nicotiana tahacum 1., cet auteur con­clue que ce polyphénol donne naissance par hydrolyse aux acides caféique et qui­nique. La structure de ce composé a été proposée par FREUDENBERG en 1920 (48),puis établie par FISHER et DANGSCHAT en 1932 (45). Elle correspond à celle del'acide caféyl-3 quinique. Avec le développement des techniques chromatographi­ques l'acide chlorogénique a été observé dans le tabac par un grand nombre d'au­teurs comme ROBERTS et HOOD en 1951 (113), REID en 1956 (110), MARTIN en .. 1958(90) et JACOBSON en 1961 (75).

En 1951 ROBERTS et WOOD (113) mettent en évidence par chromatographiesur papier trois substances réagissant positivement avec le réactif de l'acidechlorogénique. L'existence d'isomères possibles de cet acide avait été envisagéepar un certain nombre d'auteurs. Il faut attendre 1953 pour que CORSE (31) isoled'un extrait de pêches un isomère auquel il donne le n0m d'acide néochlorogéni­que et pour lequel il précise la structure (acide caféyl-5 quinique). En 1958SONDHEIMER (130) sépare par chromatographie sur silice, à partir de grains decafé, une substance qu'il nomme ''bande 510". Sa structure fut élucidée parSCARPATI et ESPOSITO en 1963 (126), elle est celle de l'acide caféyl-4 quinique.Il est admis à l'heure actuelle qu'il n'existe que trois isomères possibles del'acide chlorogénique : l'acide caféyl-3 quinique ou chlorogénique, l'acide ca­féyl-4 quinique ou'~ande 510", et l'acide caféyl-5 quinique ounéochlorogénique.

D'autres combinaisons de l'acide caféique avec l'acide quinique ont étéidentifiées ainsi l'acide isochlorogénique. Ce composé serait un mélange de plu­sieurs composés comme les acides dicaféyl-4, 5 quinique, dicaféyl-3, 4 quiniqueet dicaféyl-3, 5 quinique [CORSE et coll. en 1965 (32~. L'acide dicaféyl-l, 4quinique ou cynarine a été également observé dans l'artichaut par PANIZZI etSCARPATI en 1954 (105). Ces substances n'ont pas été observées dans le tabac.

Il est possible d'envisager par analogie avec l'acide chlorogénique etses isomères l'existence possible de dérivés similaires formés à partir des au­tres acides hydroxycinnamiques comme les acides para-coumarique et férulique.De tels depsides ont été décrits, en particulier les acides férulylquiniques.Ceux-ci ont été mis en évidence dans les grains verts de café par PICTET etBRANDERBENGER en 1960 (108) et LENTNER et DEATHERAGE en 1959 (86). CORSE et coll.(33) ont en 1962 déterminé la structure du depside le plus important c'est-à-·.dire de l'acide férulyl-3 quinique. L'acide para-cournarylquinique a été trouvédans le thé, les pommes et les poires par CARTHRIGHT et coll. en 1955 (27).HILLIAMS en 1958(148) a montré qu'il existait deux isomères de cet acide dansles pommes vertes à cidre de la variété "Yarlington Hill". HASLAM et coll. en1961 (67) ont donné au depside le plus abondant la structure de l'acide para­coumaryl-3 quinique.

D'autres combinaisons de ces acides ont été identifiées en particulierles esters du glucose (para-coumaryl-l glucose, férulyl-l glucose, caféyl-l glu­cose) par HARBORNE et COR~~R en 1961 (63) dans les feuilles de Raphanus sativus,

- 14 -

les pétales de Petuniq hybrida etd~ntirrhinummajus.

Dans le cadre du tabac REID en 1956 (110) puis JEAN et REID en 1959(76) identifient dans les extraits de feuilles de tabacs flue-cured les acideschlorogénique, néochlorogénique, mais ils observent également la présence dedeux autres depsides qui pourraient être les acides para-coumarylquiniques.WEAVING en 1958 (142) détecte ces mêmes composés dans un extrait de tabac flue­cured. RUNECKLES en 1963 (117) a observé l'acide néochlorogénique et l'acidepara-coumarylquinique dans des disques foliaires de tabac, et grâce aux étudesfaites à l'aide de marqueurs il a montré que les feuilles de ces plantes sontcapables de synthétiser les acides férulyl et para-coumarylquiniques à partirdes acides cinnamiques correspondants. RUNECKLES et WOOLRICH en 1963 (118) ontmontré que si l'on fournissait à ces feuilles de tabac les acides férulique etpara-coumarique il y avait formation des esters du glucose et des glucosides.En 1965 ZANE et coll. (154) identifient dans le tabac de cigarette les acidescaféyl-3, caféyl-4, caféyl-5 quiniques, les acides férulyl et para-coumarylqui­niques, le férulylglucose et le caféylglucose.

2.- Les coumarines (tableau III).

Certains auteurs ont identifié la scopolétine à l'état libre dans laplanta verte. MIZUKAMI en 1951 (96) a extrait cette coumarine à partir de raci-

TABLE.AU TIr

FOR~ULES DES PR\N[ IPAUX DERIVES DE lA [OUMAR1~E (AC,LYCON E~)

R:'

HO

R: H_ umbeltiférone

R:: OH _ Qsc:ulél:ine

R ': OCH 3 _ sc:opolétine

R:: 0 (H 31 R'= OH _ fraxétineR =H, R' =OH -- daphnétine

..

- 15 "'"

nes et AKAIKE en 1955 (1) à partir d'un extrait de feuilles. YANG et coll.l'ont identifiée en 1958 (150) dans les tabacs turcs air-cured et flue-cured.DIETERMAN et col. en 1959 (37) ont mis en évidence dans des tabacs semblablesla présence d'esculétine.

Le tabac vert contient des hétérosides dont le plus important est lascopoline (glucoside-7 scopolétine), sa présence dans le tabac a été établie parREID en 1956 (110). SARGENT et SKOOG en 1961 (121) ont mis en évidence dans descals et des racines de tabac la présence d'autres dérivés de la scopolétine com­me le gentiobioside-7, le primeveroside-7. La cichoriine ou glucoside-7 esculé­tine a été identifiée par RUNECKLES en 1962 (115) dans le Nicotiana tabacum L.Ce glucoside semble être la seule forme de combinaison de l'esculétine dans legenre Nicotiana •.

c - Cam pas é s e n a u fla von a ide s

(tableauxIV et V).

Les substances appartenant à ce groupe sont caractérisées par unestructure commune en C6- C3- C6 dans laquelle deux cycles benzéniques sont re­liés par un élément en C3 différent selon la nature des flavonoïdes. Elles peu­vent se répartir en trois familles

1. Les flavones, flavonols et composés voisins,- flavones,

flavonols,isoflavones,flavanones,flavanonols,flavanes.

2. Les chalcones, dihydrochalcones et aurones.

3. Les anthocyanes.

Les composés présents dans le tabac appartiennent à la première et àla dernière famille et sont essentiellement des flavonols et des anthocyanes.Les principales combinaisons sont les hétérosides de la quercétine et du kaemp­férol. Le principal hétéroside de la quercétine est la rutine (rhamno-glucoside­3 quercétîne). C'est le polyphénol quantitativement le plus important dans letabac après les acides chlorogéniques. Le premier à avoir observé la rutine dansle tabac fut certainement CHARAUX en 1924 (28), elle fut ensuite isolée de cetteplante par HASEGAWA en 1931 (66) et NEUBERG et KOBEL en 1936 (99). Ce polyphénola été bien isolé sur des chromatogrammes par ROBERTS et WOOD en 1951 (113),SHIROYA et coll. en 1955 (128) et AKAlKE en 1955 (1).

L'isoquercitrine ou monoglucoside-3 quercétine a été identifiée dansdes tabacs verts par KURILO en 1937 (85). REID en 1956 (110) a également signé­lé la présence de ce glucoside dans le tabac. Les hétérosides du kaempférol sontmoins abondants bien que WADA en 1952 (140) ait signalé la présence du rhamno­glucoside-3 kaempférol dans les fleurs de Nicotiana sylvestris et que WATANABE

•- 16 -

TABLEAU 1Y

FORMULE5 DES DIffERENTS TYPES DE 5U~5TAN(E~ RPPARTENANT AUX fLAVONOïDES

flavonol

isof\avo ne

/Ilo

flavanone

~C

/'OHH~

flCl\lane

anthOCYëlne

1 \o

flavanonol

chateone.

~ 3'

~C=CH-< B >..~/ 6' 'j'C .

"oaurone

)C~-<B~H",

1\o

dihydrochalcone

et WENDER (141) l'aient détecté dans les appendices floraux du Nicotiana taba­cwn.

TABLEAU V

FORMULES DES DEUX AGLYCOWES PRE5rNT5 DANS LE TABAC

A L'ETAT D' HETERD51DE5

HO )/ "OH

C\ \o

OH

R:: H _ kal! mpférolR :: 0 H _ qUE rr:~1:ine

- - 18 -

III - ACC1JMULATION DES SUBSTANCES PH:EmLIQUESCHEZ LES PlANTES EN REP<:NSE A DES BLESSURESCAUSEES AUSSI BIEN PAR DES AGENTS P.A'I'HC.GENESQUE PAR DES FACI'EI.JRS MOCANIQLTES.

Le phénomène d'accumulation des phénols dans les plantes est observédans le cas d'attaque d'agents pathogènes [ANDREAE en 1948 (4), MARTIN en 1958(90), KUC et coll. en 1956 (84D ou de blessures [JOHNSON et SCHALL en 1952(77), LIEBERMAN et coll. en 1959 (87) et AKAZAWA et coll. en 1960 (2B •

Dans le cadre du. tabac, BEST détecte en 1936 (15), puis isole en 1944(16) à partir des racines de tabacs virosés un corps qu'il identifie à la sco­polétine, mais il est en fait probable que ce composé soit le glucoside de lascopolétine, c'est-à-dire la scopoline [MARTIN en 1958 (90)1 • Ce dernier montreune accumulation de scopoline, d'acide chloro~énique dans [e Nicotiana samsunvirosé avec le virus de la mosaïque du Tabac lMARTIN en 1958 (90)1. SEQUEIRA etKELMAN en 1962 (127) mettent en évidence ce même processus dans le cas d'un ta­bac infecté par Pseudomonas solanacearum. HAMPTON et coll. en 1964 (59) obser­vent la formation de deux substances fluorescentes différentes de la scopolineet de l'acide chlorogénique, dans les tissus foliaires d'un Nicotiana tabacuminfecté avec le virus de la mosaïque du Tabac. Ces deux composés apparaissentau moment de la formation des nécroses d'hypersensibilité, et s'accumulent au­tour des lésions locales. Ces substances sont absentes dans un tabac développantune infection systémique. Elles pourraient être identiques ~ celles qui s'accu­mulent lors de l'infection d'un Nicotiana tabacum par Collectotrichum destruc­tivum [YU et HAMPTON en 1964 (153)] . Ces composés sont absents dans les tabacssains et il est à noter que ce dernier pathogène induit également des lésionslocales nécrotiques.

Ce phénomène d'accumulation est à rapprocher de celui constaté dansdes tabacs carencés en certains éléments minéraux. LOCHE en 1966 (88) a mis enévidence une accumulation de polyphénols (chlorogéniques, rutine, scopoline)'dans des tabacs carencés en azote et en soufre. Ces carences se traduisent parl'apparition de deux substances particulières possédant des caractères à la foispolyphénolique et aminé. Les essais d'identification lui ont permis de penserque ces corps pourraient être des complexes entre un dérivé et l'acide cionami­que (acide caféique, acide trihydroxycinnamique ou esculétine) et un ou plusieursacides aminés.

L'accumulation peut alors apparaître comme une réponse non spécifiqueà différents types d'agressions.

- 19 - ..

Cha pit r e 2

MATERIEL ET TECHNIQUES ANALYTIQUES

I - .MATERIEL VEGErAL.

Nous utilisons soient de jeunes Nicotiana xanthi n.c., soient desNicotiana tabacum samsun cultivés en serre, au stade où il possèdent 3-4 feuil­les entièrement développées.

Trois jours avant l'inoculation,les plantes sont placées dans des sal­les où la température est de 20 ou 30 oC. Dans ces chambres climatisées, la tem­pérature est constante à! 1 oC, l'humidité relative est de 70 %, et les tabacssont soumis à un éclairement de 8000 lux pendant les 16 heures ~e photopériode.

Le virus de la mosaique du Tabac (préparation purifiée en suspensiondans l'eau) est inoculé mécaniquement sur la face supérieure de feuilles ayantterminé leur croissance. Le nombre de lésions par feuille est approximativementsitué entre 100 et ISO.

II - MEITHODES GENERALES D'ElUDEDES CCMPOSES PHENOLIQUES.

A - G é n é raI i tés .

L'étude des composés phénoliques a bénéficié tout particulièrement dudéveloppement de la chromatographie sur papier. Ces composés se séparent sur pa-

- 20 -

pier dans de bonnes conditions et un nombre limité de solvants est suffisatlt~

Ces corps sont également faciles à mettre en évidence, le plus souvent en fai­sant appel à leur fluorescence en lumière ultraviolette. Il est enfin possibled'identifier un composé inconnu à partir de microquantités mises en oeuvre surpapier.

Les phénols n'existent pas à l'état libre dans les végétaux, leur pré­sence dans les extraits provient la plupart du temps d'une hydrolyse totale oupartielle, pendant les opérations d'extraction. Ils se rencontrent essentielle­ment dans la nature sous forme de combinaisons avec les glucides'ho-hétérosides,faisant intervenir des liaisons acétals de type éther-oxyde -C-O-y-. Dans lecas des acides phénols les combinaisons sont le plus souvent des esters avec desliaisons -CO-O-ç-.

Il est toujours préférable de commencer l'étude des composés phénoli­ques d'un matériel végétal inconnu, par l'identification des aglycones libéréspar hydrolyse acide ou alcaline, ou parfois même enzymatique (le mot aglyconedésigne la fraction non glucidique des hétérosides et la fraction phénoliquedes esters).

l'identification des compo-

simple, puisque à une même substance, ildifférents types de combinaisons. Ellenature de la liaison unissant l'aglycone

Cette opération est la pluscorrespondre dans un tissu donnéégalement nous renseigner sur lafraction non phénolique.

Les problèmes à résoudre pour conduire àphénoliques d'un matériel végétal sont:sés

peutpeutà la

- l'extraction à partir du matériel végétal,l'hydrolyse et la séparation des aglycones,

- la séparation des différents types de combinaisons,- l'identification de ces combinaisons.

B - Pré par a t ion des e x t rai t s

Les feuilles de tabacs à analyser sont pesées, puis broyées à raisonde un gramme de poids frais pour deux volumes de méthanol, en présence de sablede Fontainebleau relavé. Le broyat est centrifugé à froid et le culot lavé plu­sieurs fois avec du méthanol. Les surnageants sont ensuite réunis.

Le méthanol entraînant les chlorophylles , il est nécessaire de leséliminer par de l'éther de pétrole. Pour cela, l'extrait est concentré sous vi­de au moyen d'un évaporateur rotatif à 30 oC. Le jus étant rendu aqueux, leschlorophylles sont extraites à l'aide d'éther de pétrole. Les solutions ainsidébarassées des chlorophylles sont mises à sec et reprises avec du méthanol con­tenant 50 % d'eau (à raison d'un ml de méthanol à 50 % pour un gramme de poidsfrais) •

- 21 -

c - H Y d r 0 l Y s e s d 8 S 8 X t r a i t s i n i t i a u x.

S é p a r a t ion 8 t i d 8 n t i f i c a t ion d e s

a g l Y C 0 n 8 s.

1.- Les différents types d'hydroZyses.

a. Hydrolyse acide: L'hydrolyse acide est effectuée pour rompre les liaisons-ç-O-ç- qui interviennent dans les O-hétérosides. Elle est réaliséeen milieu H Cl N, sous réfrigérant à reflux, au bain-marie bouillantpendant un temps qui peut varier de 30 minutes à une heure.

L'hydrolyse acide peut être également utilisée pour rompre les liai-sons esters, mais plusieurs transformations dont il faut tenir compte peuvent seproduire. Ainsi un certain nombre d'acides cinnamiques tout particulièrementl'acide para-coumarique tendent à se décomposer dans de telles conditions. Laformation d'escùlétine à partir de l'acide caféique est accélérée, comme cellede la coumarine à partir de l'acide ortho-cournarique. Ce type d'hydrolyse en­traîne également une importante lactonisation de l'acide quinique. Il est sou­vent préférable de scinder les divers esters cinnamiques par une hydrolyse al­caline.

b. Hydrolyse alcaline: L'hydrolyse alcaline des esters des acides phénolsest faite en milieu Na OH N, à la température du laboratoire pendant4 heures, sous atmosphère d'azote. Pour étudier les produits résul­tant de cette hydrolyse, il est nécessaire de repasser en milieu aci­de. Cette opération est réalisée à l'aide d'une solution d'acidechlorhydrique concentré dans un bac d'eau glacée afin d'éviter unehydrolyse acide.

c. Hydrolyse enzymatique: L'hydrolyse enzymatique est réalis~e à l'aide d'unepréparation commerciale de S-glucosidase. Cet enzyme hydrolyse spéci­fiquement les liaisons Bentre une molécule de glucose et un aglyco­ne. Le traitement est effectué dans un tampon acétate de sodium(pH = 4,5) à température ambiante pendant un temps qui peut varier dequelques minutes à plusieurs heures. L'hydrolyse est arrêtée par ad­dition de quelques gouttes d'alcool éthylique, puis par chauffage aubain-marie bouillant durant une minute. La solution est alors filtrée,mise à sec à 45 Oc et reprise par de l'éthanol à 50 %.

d. Extraction et purification des aglycones : Les aglycones sont extraits deshydrolysats acides et alcalins à l'aide de solvants non misciblescomme l'acétate d'éthyle ou l'éther éthylique. Nous avons préféréutiliser l'éther éthylique, car ce solvant n'entraîne pas les nom­breux produits d'oxydation des phénols. La couche éthérée est alorsmise à sec puis reprise par de l'alcool éthylique. Si l'on veut sé­parer uniquement les acides-phénols, on doit purifier l'extrait éthé­ré par une solution aqueuse de bicarbonate de sodi.um à 5 p _ 100. Lesacides se transforment en sels solubles dans l'eau, les autres phénols

- 22 -

"

restent dans la couche éthérée. La couche bicarbonatée est ensuiteacidifiée et les acides-phénols sont à nouveau extraits par de l'é~

ther éthylique. Cette purification n'est pas toujours totale, car sila solution de bicarbonate est trop alcaline, les phénols ayant uncaractère acide faible passent partiellement en milieu aqueux, inver­sement si la couche bicarbonatée n'est pas suffisamment alcaline lesphénols restent en partie dans là couche éthérée initiale obtenueaprès hydrolyse.

2.- Séparation des agLycones.

La séparation des aglycones se fait par chromatographie sur papierWhatman nO 1 en descendant. Les solvants employés diffèrent. selon le groupe del'aglycone.

a. Acides-phénols, coumarines: Les acides benzoïques cinnamiques et les cou­marines sont séparés dans les mêmes conditions.

Un certain nombre de solvants sont utilisés, en particulier le tolu­ène acétique. Ce solvant proposé par BATE-SMITH (12) est constitué

par la phase organique du mélange toluène 4, acide acétique l, eau 5. Avant lachromatographie, le papier doit être équilibré 24 heures avec la phase aqueusedu mélange. Le temps de développement est de 4 heures. Les acides para-coumari­que, férulique, sinapique, vanillique, syringique, salicylique et les coumarinescomme l'umbelliférone et la scopolétine migrent dans ces conditions.'

Les séparations sont faites également par chromatographie à deux dimen­sions en utilisant pour la première direction le butanol acétique (couche supé­rieure du mélange butanol 4, acide acétique l, eau 5) ou le butanol éthanol (bu­thanol 4, éthanol l, eau 2). Dans la deuxième dimension on utilise de l'acideacétique à 2 ou à 10 %.

Le butanol acétique a été proposé par PARTRIDGE (107) pour la sépara­tion des sucres, puis appliqué pour la séparation des flavonoïdes par BATE-SMITH(10). Ce solvant doit être renouvelé très souvent car le vieillissement entraî­ne une estérification et par voie de conséquence une modification des Rf' Dansla seconde direction on emploie un solvant légèrement acide pour éviter des traî­nées de spots et ainsi permettre de meilleures séparations. La concentration enacide peut varier de 2 à 15 %, les Rf sont d'autant plus élevés que la concen­tration est plus forte. Dans les solvants aqueux les isomères cis et trans desacides cinnamiques sont séparés (147).

La méthode qui permet une meilleure résolution des différents acidesphénols (benzoïques et cinnamiques) et des coumarines apparaît être celle adop­tée par IBRAHIM et TOWERS (74). Elle consiste à effectuer une chromatographie àdeux dimensions, en utilisant pour la première direction la couche supérieuredu mélange benzène 6, acide acétique 7, eau 3. Le papier ne doit pas être équi­libré avec la phase aqueuse de ce mélange, cette opération provoquant des traî­nées de spots. Dans la deuxième direction, on utilise le mélange suivant: for­miate de sodium 10, acide formique l, eau 200. Le front de ce solvant est assezirrégulier, mais ceci ne perturbe pas les séparations. Les isomères cis et transsont séparés dans ce solvant aqueux. Il est prudent de ne pas chauffet un telchromatogramme.

- 23 -

b. Flavonols: Le butanolacétique est également employé pour la séparation deces aglycones, mais le solvant le plus spécifique est le Forestal.Ce solvant·proposé initialement par BATE-SMITH (11) pour la sépara­tion des anthocyanidines, est préparé en mélangeant de l'acide acéti­que 30, de l'eau 10, et de l'acide chlorhydrique concentré 3.

3.- Identification des agZycones.

a. Généralités: L'identification des aglycones (acides .phénols, coumarines,flavonols) se fait par comparaison des Rf et des réactions coloréesavec des produits de référence. La plupart de ces marqueurs sont dis­ponibles commercialement, à l'exception toutefois de l'acide mélilo-tique. Cet acide a été isolé et purifié d'hydrolysats acides et enzy­matiques d'extraits de feuilles de deux Légumineuses [Dipteryx odora­ta~ GZiricidia sepium (55)]. Ces plantes nous sont parvenues deTrinidad (Antilles Anglaises) grâce au Docteur GRIFFITHS. La détec­tion sur les chromatogrammes se fait par examen de leur fluorescence

oen lumière de Wood (3660 A). Le caractère acide que possèdent un grandnombre de phénols est largement utilisé. Ces substances présententune modification de structure et donc de fluorescence et de colora­tion en ultraviolet quand on passe en milieu alcalin. Le procédé dedétection le plus simple consiste à exposer le chromatogrfu~e aux va­peurs d'une solution concentrée d'ammoniaque et à l'examiner sous lalumière ultraviolette. On peut également pulvériser une solution à10 % de Na Z C0 3 •

b. Acides-phénols, coumarines : Leur mise en évidence peut se faire en utilisantdiverses réactions comme celle de copulation avec des sels de diazo­nium (para-nitraniline diazotée, acide sulfanilique diazotée-benzi­dine diazotée). Les différents acides-phénols donnent des colorationscaractéristiques qui varient en fonction du pH.

La para-nitraniline nous a donné les meilleurs résultats. Ce réactifest préparé selon le mode opératoire donné par SWAIN (133). On mélange au momentde l'emploi, 5 ml de para-nitraniline à 0,5 % dans l'acide chlorhydrique 2 N,0,5 ml de nitrite de sodium à 5 %, et, 15 ml.d'acétate de sodium à 20 %. Chaqueacide donne, après pulvérisation de ce réactif, différentes colorations. La pul­vérisation d'une solution aqueuse à 20 % de carbonate de sodil@ modifie ces co­lorations.

Plusieurs précautions doivent être prises ; il ne faut pas exposer lechromatogramme aux vapeurs d'ammoniaque avant sa pulvérisation, et la premièrepulvérisation doit être légère.

D'autres réactions sont également utilisées comme celle d'HOEPFNER(72). Cette réaction de nitrosation a surtout été décrite pour la caractérisa­tion de l'acide caféique et des acides-phénols et coumarines possédant deux hy­droxyles adjacents. Elle peut également être employée avec succès pour la révé­lation d'un grand nombre d'autres composés comme les acides para-coumarique,férulique, sinapique, vanillique et la scopolétine. Le chromatogramme est d'a­bord pulvérisé avec du nitrite de sodium à 1 % dans l'acide acétique à 10 %. Lescolorations sont ensuite modifiées par pulvérisation de soude normale.

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La coumarine est facilement détectée sur un chromatogramme après pul­vérisation d'une solution aqueuse à 5 % de soude. Le chromatogramme est exposéquelques minutes aux radiations ultraviolettes. La coumarine apparaît alors sousforme d'une tache jaune fluorescente.

c. Flavonols: Les substances réagissent avec le chlorure d'Àluminium par for­mation d'un complexe jaune en lumière visible, et prenant une fluores­cence jaune sous la lumière de Wood.

o - S é par a t ion des cam b i n ais 0 n s

(h été ras ide s e t est ers).

1.- Chromatographie sur papier.

a. Solvants: Le couple de solvants de base utilisé pour séparer les nombreuxcomposés phénoliques présents dans l'extrait initial non hydrolyséest le butanol acétique et l'acide acétique dilué. Ces solvants serévèlent satisfaisants pour séparer les flavonosides, mais ne donnentpas de résultats suffisants pour les différentes combinaisons d'unmême acide cinnamique (dérivés du glucose, esters de l'acide quini­que). Il a donc été nécessaire de trouver un ou plusieurs solvantscapables de bien les séparer. Les solvants utilisés, en particulierle butanol éthanol (butanol 4, éthanol 1, eau 2) et le butanol ammo­niaque (phase organique du mélange: butanol J, ammoniaque 2 N J),sont ceux proposés par HARBORNE et CORNER (63). Les dérivés des aci­des cinnamiques et du glucose ont des Rf plus élevés que ceux des es­ters de l'acide quinique dans le butanol éthanol et dans le butanolammoniaque tandis que, c'est l'inverse dans le butanol acétique. Cessolvants sont employés pour la première direction, l'acide acétiquedilué étant utilisé dans le second d~veloppement. Ces différents com­posés possèdant une double liaison peuvent exister sous deux formesisomères cis et trans qui se transforment facilement l'une dans l'au­tre et sont séparées par chromatographie sur papier dans un solvantaqueux.

Les nombreuses combinaisons d'un même acide cinnamique sont égalementbien séparées par chromatographie bidimensionnelle utilisant en première direc­tion le mélange butanol 14, pyridine 3, eau J et le système méthyle isobutylecétone J4, acide formique 3, eau 2 pour la deuxième dimension. Le butanol pyri­dine donne le même type de séparation que le butanol éthanol ou le butanol mmno­niaque. Le butanol pyridine et la méthyle isobutyle cétone donnent des valeursde Rf irrégulières en fonction des conditions, en particulier ces valeurs ne sontpas les mêmes en chromatographie descendante et en chromatographie ascendante.

L'emploi de ces différents solvants permet une bonne résolution desnombreuses combinaisons des acides cinnamiques.

- 25 -

b. Révélation des chromatogrammes: La détection des nombreuses combinaisonsse fait à l'aide de leur fluorescence sans réactif, puis après expo­sition aux vapeurs d'ammoniaque ou après pulvérisation d'une solu­tion aqueuse à 10 % de Na2 C0 3 • Dans les conditions alcalines les es­ters de l'acide caféique prennent une fluorescence jaune, ceux du fé­rulique apparaissent verts, tandis que les esters de l'acide p-couma­rique fluorescent en violet. Les flavonosides possèdant un ou plu­sieurs résidus glucidiques fixés en position 3 de l'hétérocycle cen­tral sont bruns en ultraviolet. Les dérivés de la quercétine devien­nent jaunes après exposition aux vapeurs d'ammoniaque, tandis queceux du kaempférol apparaissent verts.

E - 1 den tif i c a t ion d e ces C 0 m b i n ais 0 n 5.

Pour identifier ces combinaisons (hétérosides et esters) il est né­cessaire de comparer leurs Rf dans les différents solvants et leurs fluorescen­ces avec ceux des produits de référence. Après avoir été isolées et purifiéespar chromatographie sur papier, les substances sont identifiées par la considé­ration de leur spectre d'absorption, et par l'étude des produits résultant deleur hydrolyse.

1.- Comparaison des Rf avec ceux des produits de référence.

Il est difficile de comparer un Rf expérimental aux valeurs signaléesdans la littérature étant donné la difficulté d'obtenir des Rf reproductibles.Il devient indispensable d'opérer sur chaque chromatogramme par comparaison avecdes produits de référence. Comme la majorité de ceux-ci ne sont pas disponiblescommercialement (exceptions faites pour les acides chlorogénique,

isochlorogénique, la rutine) il est nécessaire de les isoler de plantes oùils ont été signalés.

Le para-coumaryl-I glucose est isolé d'~n extrait de pétales d'Antir­rhinum majus (63), le férulyl-I glucose et le caféyl-I glucose sont obtenus depétales de Petunia hybrida (63), tandis que l'acide para-coumaryl-3 quinique estextrait de pommes vertes à cidre (148). C'est à partir de grains verts de caféde la variété robusta (33) (86) (130) que les acides férulyl-3, et caféyl-5 qui­niques sont isolés et purifiés.

Si l'on ne dispose pas de marqueurs, la considération des valeurs re­latives de Rf par rapport à celles des corps voisins, peut présenter un intérêtindéniable, car il existe une relation entre les valeurs des Rf et la structurechimique des composés. Ce problème a été discuté par BATE-SMITH et WESTALL (14)et par BATE-SMITR (13). En considérant la fonction

1RH ::: log (Rf - 1)

ces auteurs constatent une relation linéaire de ~ en fonction du nombre de OHet de résidus glucidiques pour un même groupe de substances.

ROBERTS et coll. (119), HARBORNE (60) en étudiant la migration d'un

- 26 -

certain nombre de flavonoïdes dans un solvant alcoolique (butanol acétique) etdans un solvant aqueux, ont pu dégager un certain nombre de conclusions qui peu­vent jouer un grand rôle dans l'identification de ces composés. Ces déductionspeuvent être étendues à toutes les substances phénoliques. Elles sont les sui­vantes :

1. Une augmentation du nombre de OH phénolique diminue le Rf aussi biendans un solvant alcoolique (butanol acétique) que dans un solvant aqueux.

2. La méthylation des hydroxyles augmente le Rf dans les deux types desolvants. Un composé possèdant un groupe ortho-dihydroxylé à un Rf plus basdans un solvant alcoolique d'une substance ayant deux hydroxyles non adjacents.

3. La glucosidification augmente le Rf dans un solvant aqueux, mais lediminue dans un solvant alcoolique.

D'autre part, la considération des Rf des dérivés de l'acide cinnami­que dans des solvants comme le butanol éthanol ammoniaque et le butanol pyridi­ne permet pour un même acide cinnamique de savoir si l'on est en présence d'unester du glucose ou dtun dérivé de l'acide quinique.

Les variations des Rf des diverses combinaisons de l'acide cinnamiqueen fonction de la nature et du nombre de substituants dans un solvant alcooli­que et dans un solvant aqueux, sont illustrées par la figure 1.

Ces considérations sont intéressantes, mais pour obtenir une identifi­cation rigoureuse, il est nécessaire d'identifier chaque substance, pour cela,il est nécessaire de l'isoler à l'état pur.

2.- Purification des substances phénoliques.

L'isolement à l'état pur d'un composé phénolique est fait par chroma­tographie sur papier. Dans la majorité des cas, nous déposons la solution à ana­lyser sur toute la longueur d'une feuille Whatman nO 3. si le papier est tropépais et n'assure pas un fractionnement suffisant nous utilisons du papier What­man nO 2.

Après séparation dans le solvant approprié on découpe les bandes et onles élue le plus souvent avec de l'éthanol contenant 30 % d'eau. Si la bande con­tient plusieurs pigments nous purifions à nouveau dans un autre solvant. Il estsouvent nécessaire de recommencer l'opération plusieurs fois. Ces différentesopérations conduisent à l'isolement à l'état pur des substances phénoliques. Pa­rallèlement à ces divers fractionnements, il est indispensable de réaliser unechromatographie bidimensionnelle qui permet de situer à chaque instant, l'étatd'avancement de la purification.

Ces produits sont utilisés dans la liqueur d'élution ou dans de l'étha-nol.

3.- Identification des produits isolés.

a. Réalisation des spectres d'absorption L'opération est délicate car le sol-vant extrait du papier certaines impuretés. Pour éliminer l'effet deces impuretés, il est nécessaire de traiter une feuille de papier com­me un chromatogramme proprement dit mais sans déposer la solution àanalyser. Après élution, nous avons donc une solution contenant unique-

~ 27 -

LEGENDE

en pointillé : déri\J~s du glu cos~E'n hachuré : dérivé.s de l'acide. quinique

oeg = o. eoumary'_1 glucosl?peg = p. cQumëlryl_1 gluc.os2Feg = Férul~'-1 glucosesig = sinapyl_1 glucosecag = caféyl -1 9'ucos~

pcrul: = p. coumë)r~'_1 rhamnoglucosE'ccg2n = o. coumaryL 1 genl:\obiose

C89'!n =caféyl -1 genl:iob\osl!pc.q:::t adde p. coumaryl _ 3 quiniQuefeq :: acide féruh}\ _3 qu'lniqueI:aq = acide caFéyl_'3·· quinique

sépara~ion des "Isomères ci~. el I:rans. dans le solvantaqueux ( 1 = i S'amère trans ; 2. = isomère cis)

•• '---"-'-~------"._-"---,-.--,-- --,---_•._._'_._._ -.",-- ------.- _.,- ._"'- -,-,-- -_,_.__ ._ - '1

~111

.1

0:1

., 0-1Spct de départ

w'----:~:p

FIG. 1 VAR!f\TlONS DES RF DE5 DI\lER<;ES COMBINA\SON5 DE L'ACIDE. ClNNAtll110LHEM'fONtTIOM DE LA NATURE ET DU NOMBf\ê DE SUf:>5TITUf-lNT5, DI:;N5DANS UN SOLVAN T ALCOOLIQUE (BUTANOL ETHf-\NOl) ET DANS UN.5DLVANT A9UEUX.

ment les impuretés du papier et c'est par rapport à cette solution quenous traçons le spectre de la substance phénolique.

Les spectres sont tracés dans l'éthanol. Il faut toujours définir lanature du solvant utilisé et comparer les spectres des corps à étudier, à ceuxdes produits de référence préparés dans les mêmes conditions.

Le spectre est tracé en milieu neutre et en milieu alcalin. L'additiond'un alcali permet d'obtenir le spectre de l'ion phénolate différent de celui duphénol libre.

L'usage de différents sels minéraux comme le chlorure d'Aluminium (AlC1

3), l'acétate de sodium (Na OAc), l'acide borique (H

3B0 3 ), en produisant des

déplacements dans les spectres permettent de localiser un certain nombre de fonc­tions, et d'avoir une idée'sur la structure de la substance.

Prenons comme exemple un flavonol dont la structure s'établit de lamanière suivante :

Ce flavonol a 'une structure mésomère s'établissant sous les trois for­mes suivantes :

( al

0-

Lb)

- 28 -

0'"

( C )

Ces composés absorbent dans deux régions du spectre ultraviolet, d'unepart entre 310 et 380 m~ (Bande 1), d'autre part entre 240 et 275 m~ (Bande II).

La bande l correspond à la structure b (79) elle fait intervenir laconjugaison entre le noyau B et le groupement CO de l'hétérocyc1e central. Labande II correspond à la structure a et fait intervenir la conjugaison avec lenoyau A.

Si le composé possède un OH libre en position 5 ou 3 il est capablede donner avec le groupe CO un complexe en présence d'aluminium utilisé sousforme de Al C1

3• La formation d'un tel complexe entraîne un mouvement bathochro­

mique du spectre. Les hydroxyles en 3 et 5 n'interviennent pas de façon identi­que, avec la position 3 le complexe est plus stable et le déplacement plus im­portant.

Si la substance possède un groupement ortho-dihydroxy1é, elle est ca­pable de former un complexe de ché1ation avec l'acide borique et ainsi d'entraî­ner un mouvement bathochromique du spectre.

Avec l'acétate de sodium, l'alcalinité du milieu est moins grande etseules les fonctions phénols ayant un caractère acide fort seront ionisées enparticulier le OH en 7. On doit alors observer un mouvement bathochrome de labande II. Si cet hydroxyle est engagé dans une liaison hétérosidique ce mouvementbathochrome n'apparaît pas.

Les spectres des acides cinnamiques et des coumarines ne diffèrent pasprofondément, cependant les acides cinnamiques existant sous forme d'isomèrescis et trans ont sur le pic principal à 310-330 m~ un épaulement (62). Cet épau­lement dépend de l'importance relative de ces deux isomères.

Dans tous les cas l'étude des spectres des différentes substances phé­no1iques a permis de dégager un certain nombre de conclusions :

1. L'hydroxy1ation de la molécule entraîne un mouvement bathochrome dansla position du maximum absorbant à la plus grande longueur d'onde. Dans le casdes f1avono1s cela entraîne un mouvement hypsochrome de la band~ II.

2. La méthy1ation et la glucosidification ont des effets similaires setraduisant par un mouvement hypsochrome.

Nous devons également constater que l'ionisation du groupement carbo­xyle d'un acide-phénol (acides benzoïque cinnamique) a un effet hypsochrome surle spectre. Ce fait est très utile pour distinguer les acides-phénols de leursesters (acide féru1ique ~À 1 l' + 18 m~, féru1y1-1 glucose ~À 1 l' + 50 m~).a ca ~ a ca ~

Le chlorure d'Aluminium est utilisé en solution alcoolique à 5 %. L'al­calinité est obtenue par NaOH 2N.

Il est à noter que certains phénols se décomposent rapidement en mi­lieu alcalin. En présence de Al C1 3 ' il est indispensable de garder le pH entre4 et 6 afin d'éviter la cassure du·comp1exe métallique formé.

Comme toujours, on doit préparer dans les mêmes conditions la solutionde référence par rapport à laquelle le spectre est tracé.

- 29 -

b. Identification des produits résultant de l'hydrolyse: On étudie la res~s­

tance de ces combinaisons aux hydrolyses acide alcaline et enzymati­que. On caractérise ainsi la nature des liaisons intervenant dans cha­cune d'elles.

On opère dans les mêmes conditions que pour les hydrolyses des extraitsinitiaux mais avec des temps plus courts. L'identification de l'aglycone ne posepas de difficultés, il est extrait par l'éther éthylique éventuellement aprèsréacidification dans le cas d'une hydrolyse alcaline. L'extrait éthéré est misà sec repris par de l'éthanol et chromatographié dans les solvants spécifiquesdes aglycones. L'identification peut être complétée par la réalisation de sonspectre d'absorption en ultraviolet.

Pour identifier la fraction non phénolique intervenant dans la combi­naison, il est indispensable d'éliminer l'acidité du milieu dans le cas d'unehydrolyse acide. Nous employons la méthode proposée par HARBORNE et SHERRAT (64).Ce procédé consiste à former le chlorhydrate de la di-n-octylméthylamine et àl'extraire par le chloroforme dans lequel il est soluble. Les sucres et l'acidequinique restent en solution aqueuse. L'amine est utilisée en solution aqueuseà 10 % dans le chloroforme. La couche aqueuse est purifiée deux à trois foisavec la solution chloroformique de l'amine, puis rincée une dernière fois avecle chloroforme. Cette couche aqueuse est trouble et il est nécessaire de la fil­trer avant de la mettre à sec sous vide. Le résidu est repris par de l'eau etchromatographié.

Le butanol acétique, le mélange isopropanol 7, butanol l, eau 2, et lesystème isopropanol 6, ammoniaque 3, eau 1 ou celui contenant de l'éthanol del'ammoniaque et de l'eau (20, 1,4), sont utilisés dans la séparation de l'acidequinique.

La révélation de cet acide (26) est obtenue en pulvérisant d'abordune solution saturée de méta-périodate de sodium étendue de 2 volumes d'eau,pu~s après 20 minutes une solution constituée par le mélange suivant :

Nitroprussiate de sodium ....•Pip~razine .......•...........Eau .••.•.•••.•.•.•••.•...•.••Ethano 1 .

50 mg50 mg

2 ml10 ml.

Les taches apparaissent après passage du chromatogramme pendant 10 m~­

nutes dans une étuve à 100 oC.

L'acide quinique donne une tache orangée.

Les sucres sont séparés dans le butanol acétique et le mélange acéta­te d'éthyle 2, pyridine l, eau 2.

La révélation des glucides peut se faire avec différents réactifs com­me le phtalate d'aniline (106). Sa composition est· la suivante :

Aniline .Acide phtalique ..••••.•••••..n-butanol .Ether .Eau ..............•........•..

- 30 -

9,1516

490490

20

mlgmlmlml.

Les feuilles sont plongées dans ce mélange et mises à sécher à 110 Ocpendant 5 minutes. La sensibilité de la révélation est augmentée par examen deschromatogrammes en lumière ultraviolette. Pendant les opérations de chromatogra­phie et d'élution, conduisant au produit pur, il peut y avoir entraînement àpartir du papier soit de sucres, soit de substances transformées en sucres parhydrolyse acide. Le nombre, la nature de ces sucres dépendent de la nature dupapier et du solvant. Les solvants contenant un acide minéral semblent conduireà une formation plus importante de sucres. Nous devons donc réaliser simultané­ment à ces manipulations les mêmes opérations mais à partir de papier blanc etcomparer les résultats obtenus.

Nous avons également utilisé un autre révélateur des sucres afin dedistinguer les pentoses des autres sucres réducteurs. La révélation s'effectueaprès trempage dans le mélange suivant :

1,3 ml d'aniline dans 50 ml d'acétone,Ot6 ml d'acide phosphorique dans 20 ml d'acide acétique et 30 ml d'acétone.

Les deux solutions sont mélangées au moment de l'emploi. Les colora­tions sont révélées par passage des chromatogrammes dans une étuye chauffée à100 oC.

Les pentoses apparaissent en brun-rouge sur fond jaune, tandis que lesautres sucres réducteurs apparaissent en brun jaune.

III - roSAGE DES CCMPOSES PHENOLlQUES.

A - P r i n c i p e s

Le dosage utilise la grande oxydabilité des substances phénoliques.Le réactif utilisé est un mélange de phosphomolybdate et de tungstate de sodiumqui est réduit lors de l'oxydation des phénols en milieu alcalin en un mélangede bleus de tungstène et de molybdène. La coloration produite (absorption~axi­

male comprise entre 725 et 750 m~) est proportionnelle aux taux de composés phé­noliques. La composition de ce réactif a été établie par FOLIN et DENIS (47)tpuis modifiée par FOLIN et CIOCALTEU (46). Cette méthode est également appliquéeaux composés séparés et purifiés par chromatographie sur papier. Dans tous lescas on compare à une gamme étalon préparée dans les mêmes conditions que le do­sage proprement dit t ce qui nécessite l'utilisation de produits de référence.Pour l'estimation quantitative des phénols totaux t la courbe standard est éta­blie avec de l'acide chlorogénique t ce composé étant quantitativement le plusabondant dans le tabac.

... 31 -

B - Dos age g lob a 1 d 8 S C 0 m p 0 s é s P h é n 0 l i que S

Cette méthode de dosage reposant sur le pouvoir réducteur des phénolsa été proposée et utilisée par un grand nombre d'auteurs comme ROSENBLAT etPELUSO (114), PRO (109), BRAY et THORPE (19), SMIT, JOSLYN et Lill(TON (129),JOHNSON et SCHAAL (78) et SWAIN et HILLIS (134). Certains utilisent le réactifde Folin et Denis, d'autres comme BRAY et THORPE celui de Folin et Ciocalteu.Nous avons préféré utiliser ce dernier car le réactif de Folin et Denis consti­tué par un mélange de tungstate de sodium et d'acidephosphomolybdi~ueprovo~ue

souvent la formation de précipités. Tl est alors nécessaire de filtrer et unepartie de la coloration se trouve perdue. Les résultats sont alors moins repro­ductibles.

1.- Les réactifs.

a. Réactif de Folin et Ciocalteu: Un mélange contenant 100 g de tungstatede sodium (Na 2W0 4- 2H20), 25 g de molybdate de sodium (Na 2Mo0 4- 2H 2 0) ,700 ml d'eau, 50 ml d'acide phosphorique à 85 % et 100 ml d'acidechlorhydri~ue concentré, est mis à bouillir sous réfrigérant à refluxpendant la heures. Après ce délai, 150 g de sulfate de li thi,um, 50 mld'eau et ~uelques gouttes de brome sont aj outés •. Le mélange est alorschauffé à 100 oC, de façon à éliminer l'excès de brome. La li~ueur

est mise à refroidir, diluée à un litre, puis filtrée. Elle est con­servée au frigidaire dans une bouteille bien fermée.

b. Solution aqueuse de Na2 C0 3 : Elle est faite en dissolvant 20 g de Na2C03dans100 ml d'eau.

2.- Mode opératoire.

Une prise d'essai convenable de la solution à doser étant faite, oncomplète à la ml avec de l'eau. Après addition d'un ml du réactif de Folin­Ciocalteu, il est ajouté 3 minutes plus tard 2 ml de la solution aqueuse deNa2 C0 3 à 20 %. Après chaque réactif, il est nécessaire de bien agiter les tubesafin d'obtenir une solution homogène. La prise d'échantillon ne doit pas conte­nir plus de 0,5 ml de méthanol.

Les tubes sont mis au bain-marie b~uillant pendant une minute, puison laisse refroidir. Après avoir dilué à 25 ml avec de l'eau, les densités op­tiques sont mesurées à 725 m~ une heure après la fin des opérations avec unspectrophotomètre Unicam 500.

Les lectures sont faites par rapport à un blanc ou témoin, ne conte­nant que de l'eau additionnée des réactifs.

Les résultats sont établis à l'aide d'une courbe étalon obtenue en dis­solvant 100 mg d'acide chlorogéni~ue dans un litre d'eau (100 ~g/ml). Cet acideest d'abord dissous dans un minimum d'éthanol. Les teneurs en phénols totauxsont alors exprimées en mg d'acide chlorogénique par 100 g de poids frais.

- 32 -

C - Dos age d e fi d i f f é r e n t fi C 0 m p 0 fi é fi a p r è s

fi é par a t ion e t pur i fic a t ion par

c h rom a t 0 g r a phi e sur p api e r

1.- Utilisation du réactif des phénols.

L'estimation quantitative des composés phénoliques au moyen du réac­tif de Folin et Ciocalteu après séparation et purification par chromatographiesur papier a été utilisée avec succès par KEITH et coll. (80» Mc CALLAetNEISH (95), YAMABA et CARDINI (149), VAN s~mRE (139» ASEN et EMSWELLER (5»RUNECKLES (117) et FELDMAN et HANKS (42).

On dépose 500 à 1000 ~l d'un extrait de tabac sur toute la largeurd'une feuille de papier Whatman nO 2. Après séparation dans un solvant convena­ble, la bande est repérée sous UV) découpée en petits carrés puis éluée avec del'éthanol à 80 %. Chaque éluat est filtré) concentré sous vide au moyen d'unévaporateur tournant. L'extrait est amené à sec) repris par un volume appropriéd'eau. C'est à partir de cette solution aqueuse que les prises d'essais conve­nables sont faites. Les opérations sont ensuite semblables à celles réaliséessur l'extrait direct.

La scopoline ne possèdant aucun hydroxyle libre ne réagit pas avec leréactif de Folin-Ciocalteu. Il est alors nécessaire de rompre par hydrolyse aci­de la liaison hétérosidique afin de libérer la scopolétine et de la doser. Unehydrolyse acide effectuée dans un milieu HCl N pendant 35 minutes à 100 Oc sousréfrigérant à reflux provoque l'hydrolyse totale du glucoside.

Les acides chlorogéniques) férulylquiniques et para-coumarylquiniquesont séparés dans le butanol éthanol. Le férulyl-l glucose subit deux purifica­tions (une première dans le butanol éthanol et une seconde dans le butanol acé­tique). La rutine) la nicotiflorine et la scopolétine sont purifiées à l'aided'un solvant aqueux comme l'acide acétique à 2 %.

Le solvant peut extraire certaines des impuretés du papier, ces impu­retés pouvant réagir avec le réactif des phénols. Pour éliminer ces interféren­ces) on traite une feuille Whatman nO 2 comme un chromatogramme) mais sans dépo­ser de solution. On obtient après élution une solution contenant les impuretésdu papier. Cet a~trait nous servant de blanc on y ajoute les réactifs et on di­lue à 25 ml avec de l'eau. C'est par rapport à ce témoin que sont lues les den­sités optiques des éluats.

2.- Etablissement des courbes d'étalonnage.

Les témoins servant à établir les courbes étalons sont traités dansles mêmes conditions que les échantillons de tabac (chromatographie) élution,dosage). Ces témoins sont d'abord dissous dans une quantité minimum d'éthanol,puis dilués avec de l'eau à la concentration désirée (généralement 100 mg/l00ml) c'est-à-dire 100 ~g/IOO ~l). On dépose alors sur du papier Whatman nO 2 desvolumes croissants de solution témoin de 25 à 200 ~l représentant 25 à 200Ug deproduit pur. Les courbes sont linéaires jusqu'à la concentration de 200 ~g dans -

~ 33 -

25 ml (8 ~g/ml). Les blancs sont également constitués par des solutions conte­nant les impuretés du papier et dans lesquels on ajoute les réactifs et que l'ondilue à 25 ml avec de l'eau.

Les courbes standard obtenues in vitro et après élution des spotssont peu différentes (2 %), sauf pour la rutine. Avec cette dernière substancele rendement ne dépasse pas 70 % et semble due à la difficulté d'éluer ce poly­phénol.

Tous nos résultats sont exprimés en fonction du poids frais, car nousavons remarqué que les variations de teneur en matière sèche n'étaient pas s~­

gnificatives dans nos conditions expérimentales.

La figure 2 représente les courbes standard.

-.34 -

optiques

FIG. 2 COURBES D'ETALONNAG~

acide para_ ccuo'ëlrique.~ -.---.-

acide para _t:oumar~l_"3~---_.-

0.50

0:10

ï3C idE caFé~l_ 3t ---....

add2 ·férufyf_3tJ, ------.

qUJn\que

. .qUlnlque.

. .qum Ique

s conc.~ntrations en f9/m 1.

o~o

i')

5l:0pDlét:ine- ~-- ---

ruti ne..v

c:on~entrai:.ia~ en f 91 ml.

Cha pit r e 3

ETUDE,EVOLUTION QUALITATIVE DES COMPOSES

P H E NOL l QUE S DAN S LES Nicotiana xanthi N.C. l N F E C TES

A 20 Oc et 30 Oc PAR LEV l RUS DEL A M 0 SAI QUE

DU TABAC SOUCHE COMMUNE. EXAMEN DU

COMPORTEMENT DE

TABACS VIROSES

CES SUBSTANCES DANS

DEL A V A RIE T E samsun .

DES

. l - RESULTATS EXPERIMENTAUX.

Nicotiana xanthi n.c.

Ide n tif i c a t ionA -

p r

d e

é S 8 n t S dan s

d 8 S

1 8 S

pol y P h é

f 8 U i 1 1 8 S

n ols

sai n 8 S

1.- Dérivés de Z'acide cinnamique.

Les acides chlorogéniques dont l'ensemble constitue la majeure partiedes polyphénols présents dans les feuilles saines de tabac, peuvent être sépa­rés en différents isomères (A, B, C) par chromatographie à deux dimensions surpapier Whatman nO l, en utilisant ~~ solvant organique comme le butanol acéti­que en première direction, et l'acide acétique à 2 % en seconde dimension.

La comparaison des Rf dans de nombreux solvants avec ceux des pro­duits de référence, l'examen des fluorescences en lumière de Wood, la considé­ration des spectres d'absorption en ultraviolet, et l'étude des produits prove­nant des hydrolyses acides et alcalines nous permettent de conclure à la pré­sence de l'acide caféyl-3 quinique ou acide chlorogénique, de l'acide caféyl-5quinique ou acide néochlorogénique, et de l'acide caféyl-4 quinique ou "bande510" de SONDHElMER dans les feuilles non infectées de Nicotiana xanthi n.c.

... 35 -

Ces polyphénols sont d'abord séparés par une chromatographie linéairedans le butanol éthanol. Les bandes sont examinées sous la lumière de Wood,éluées avec de l'éthanol contenant 30 % d'eau, puis purifiées par chromatogra­phie bidimensionnelle dans le solvant de PARTRIDGE et l'acide acétique à 2 %.

Leurs spectres établis avec un spectrophotomètre unicam 800, en milieuneutre et alcalin sont identiques, et présentent les mêmes maximums d'absorptionque les échantillons de référence (tableau VI, figure 3). Les composés absorbentdans deux deux régions du spectre ultraviolet; nous observons un premier maxi­mum à 245 m~ et deux autres à 302 m~ et 328 m~. La double absorption dans cettedernière région est due aux deux isomères cis èt trans. Ces trois maximums, sur­tout ceux comprÏs entre 300 m~ et 330 m~, se déplacent vers les grandes longueursd'onde en milieu alcalin (380 m~). Leurs Rf et leurs fluorescences en lumièreultraviolette correspondent à ceux des marqueurs (tableau VI) .

Tableau VI - Rf' fluorescences et spectres d'absorptiondans l'ultraviolet des composés A, B et C.

Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol

Appellation , en UV +NH 3 .à .95 0. (mll) ..

BEW BAW BArn BPW+ KFW AA2""Àmax À-min L1À-max

(alcali)

A 36 45 1 26 35 62-77 Jaune-vert 245, (302) ,328 265 + 52B 40 50 1 30 40 57-72 Jaune-vert 245, (302) ,328 265 + 52C 42 57 1 30 40 57-72 Jaune-vert 245,(302),328 265 + 52

---------------Marqueurs :

ide chlorogé-que (commerce) 42 57 1 30 40 57-72 Jaune-vert 245, (302) ,328 265 + 52

ide néochlo-,génique (café) 36 45 1 26 35 62-77 Jaune-vert 245, (302) ,328 265 + 52

nde 510"afé) 40 50 1 30 40 57-72 Jaune-vert 245, (302) ,328 265 + 52

Solvant$utilisés :

. BEW ~ butanol, éthanol, eau, 4,1,2 .• BAW = butanol, acide acétique, eau, 4,1,5 (phase organique).

BArn = butanol, ammoniaque 2N, l,l, (phase organique).BPW = butanol, pyridine, eau, 14,3,3.KFW = isobutyl méthylcétone, acide formique, eau, 14,3,2.ME = acide acétique à 2 %.

* Séparation des isomères cis et trans dans le solvant aqueux.+ Chromatographie en ascendant.

- 36 -

densi~é optiqu~)

6

4 I---------i-----+-----i------t------t------\-------i

2 I------!-----+-----+-----+------I-----+-----I

o I------+-----+------J-------+------f------t-------i

: y\ /V ,/1\ \.\, ~--- " \ \\\\" ,," '" '

'..... -', ",/, ,/

.2. I------+------+-----"""""=:---+ ~-'-='·-=-..c-=_=-=-=-'"""..:....-----t------\.----;-----\----""1

-~--f-- ~~ \,_,0 '-- -..L .L- --L ....!- L- -L.:',~ ~'w_

225 2.50 275 !OO 325 ~50 400 450

longueur d 'onde (m~)

FIG. 3_ SPECTRES D'ABSORPTION DU COMPOSE A

dans E. 't: OH 95- Et OH = éthano\--------- dans Et. OH 95'~ + Na OH

L'hydrolyse alcaline réalisée en milieu Na OH N pendant une heure àla température du laboratoire, et sous atmosphère d'azote, libère pour chaquecomposé les acides caféique et quinique (Tableau VII). Ces derniers produitssont également identifiés dans les hydrolysats acides effectués en milieu HCI N,sous réfrigérant à reflux à 100 oC, pendant 35 minutes.

Tableau VII - Caractéristique physiques des produitsdécelés dans les hydrolysats de A, B et C.

Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Coloration dans leen UV +NH 3 visible.

Aglycone BAW BEW TAW BzAW Naf AA2Réactif IP-nitranili-

d'Hoepfner +ne Na2

C0 3

de A 78 66 3 Il 32-66,50 30-63 Vert-jaune Rouge brique Brunde B 78 66 3 Il 32-66,50 30-63 Vert-jaune Rouge brique Brunde C 78 66 3 11 32-66,50 30-63 Vert-jaune Rouge brique Brun

------------Marqueur

ide caféique 78 66 3 Il 32-66,50 30-63 Vert-jaune Rouge brique Brun

Rf .x 100 dans les solvants Coloration avecraction non nitroprussiate-pipérazinehénolique BAW IBW IAmW EAmw

. . . . . . . . ~ . . .. . . . . . ~ .

de A 20 17 65 56 Jaune-orangede B 20 17 65 56 Jaune-orangede C 20 17 65 56 Jaune-orange

-------------Marqueur

ide quinique 20 17 65 56 Jaune-orange

. . . . . . ~ .

Solvants utilisés :

TAW: =BzAW =Naf =IBWIAmW =EAmW =

toluène, acide acétique, eau, 4; 1,5 (phase organique).benzène, acide acétique, eau, 6,7,3 (phase organique).formiate de sodium, acide formique, eau, 10,1,200.isopropanol, butanol, eau, 7,1,2.isopropanol, ammoniaque, eau, 6,3,1.éthanol, ammoniaque, eau, 20,1,4.

.,. 37 -

L'identification de l'acide caféique est confirmée par l'analyse spec­trale (figure 4) en milieu neutre et alcalin.

/ '\ -L/ :\ "

1 \

1 /\\

\

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\\

1 \,\

l'1 \

1 \, -~

..\

V/

\\, \, "

1\-- .... ) \.... \... /' ... " 1\ \J' ... ,,-- .... ..- \

\J..... _-..".

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\\

\

\\~

"- \

N,450350 400

longUEur d'ondg tm r)3253002752.-50

)-022'5

cl En saé optiquE'L'O

'.2.

1·4

1·0

FIG. 4 5PE'E.TRE 0' ABSORPTION DE l'AGlYCONE DU COMPOSE A

...dans E. t. OH ~ 95°

dans E -\:. OH à 95<1 + NaDH

. - 38 -

2.- Flavonosides.

Le polyphénol quantitativement le plus abondant dans les feuilles deNicotiana xanthi n.c après les acides chlorogéniques semble être la rutine (FI)ou rhamnoglucoside-3 quercétine.

La substance repérée en lumière de Wood après développement linéairedans l'acide acétique à 2 % est éluée avec de l'éthanol à 80 %, puis purifiéepar développement bidimensionnel dans le butanol acétique et l'acide acétiqueà 2 %.

Après une hydrolyse acide réalisée sur le produit pur en milieu HCI Nà 100 Oc pendant 30 minutes, l'aglycone est extrait par de l'éther éthylique. Laphase éthérée est mise à sec, reprise par de l'alcool à 95°~ puis chromatogra­phiée dans le Forestal ou elle donne un spot de Rf 0,42 correspondant à celui dela quercétine. Dans le butanol acétique le Rf est de 0,71. La couche aqueusechromatographiée dans le solvant de Partridge met en évidence du glucose (Rf =0,18) et du rhamnose de Rf = 0,37.

Deux autres flavonosides (F2 et F3 ) distincts de la rutine sont pré­sents dans les extraits foliaires. Ces deux composés apparaissant bruns comme larutine en ultraviolet, ont donc leur hydroxyle en position 3 de l'hétérocyclecentral non libre.

Les méthodes de purification étant les mêmes que celles adoptées pourFI, la substance F2 donne par hydrolyse acide un aglycone dont les Rf dans leForestal et le butanol acétique sont respectivement de 0,58 et de 0;86 et coin­cident avec ceux du kaempférol. Les sucres apparaissant dans la phase aqueusesont le glucose et le rhamnose.

L'hydrolyse acide effectuée sur F3 libère de la quercétine et du glu­cose. Cette substance est rapidement scindée par la B-glucosidase (20 minutes),alors que les hétérosides FI et F2 résistent à une telle hydrolyse.

Les caractéristiques physiques des polyphénols FI' F2 et F3 ainsi quecelles des produits provenant de leurs hydrolyses acides sont résumées dans letableau VIII.

- 39 -

Tableau VIII - Propriétés chromatographiques des composés Fi, F2 et F3 ainsi quecelles des produits décélés dans leurs hydrolysats acides.

I. Rf x 100 dans les Fluorescences sous Fluorescences soussolvants •. ultraviolet. ultraviolet +AlC1 3

:traits initiauxBAW BEW .AA2 .Sans réactif . '. . -tNH 3 Seul .. .. +NH 3

Fi 42 55 35 Brun Jaurie Jaune JauneF2 52 64 41 Brun Vert Jaune VertF 3 59 70 22 Brun Jaune Jaune Jaune

~------------

1arqueur ..Itine 42 53 55 Brun Jaune Jaune Jaune

. . ...

2. Rf x 100 dans les Fluorescences sous Fluorescences sous

rdrolysats acides solvan ts. ultraviolet .ultraviolet +AlC1 3.phase éthérée BAW Forestal

sans +NH 3réactif Seul +NH 3

de Fi 71 42 Jaune- Jaune Jaune Jaunede F2 86 58 Jaune Vert Jaune Vertde F3 71 42 Jaune Jaune Jaune Jaune

------------------~arqueurs :

uercétine 71 42 Jaune Jaune Jaune Jauneaempférol 86 58 Jaune Vert Jaune Vert

Rf x 100 dans les solvants Colorations avec~phàse aqueuse'

BAW APW~ Phtalate d'aniline .Aniline .phosphorique

de ~ 18 28 Brun Brun-jaune1 37 49 Brun-;rouge Brun-jaune

de F2 18 28 Brun Brun-jaune37 49 Brun-rouge Brun-jaune

de F3 18 28 Brun Brun-jaune----------------arqueurs :

ucose 18 28 Brun Brun~jaune

amnose 37 49 Brun-rouge Brun-jaune. . . . , . ~ . • • • • , k • ... ........._. -' '.' '- "..... - "- 'o. - ~ - • .~ . . . . . . .

*APW = acétate d'éthyle, pyridine, eau, 2,1,2 ~phase organique).

- 40 -

Les mesures spectrales, comme le montre le tableau IX, établies surF2 et sur son aglycone ne permettent pas à la différence de FI et de F3 de met­tre en évidence un déplacement bathochrome de la bande l après addition d'acideborique, ce qui confirme la structure monohydroxylée du noyau B.

Tableau IX - Analyse spectrale des flavonosidesprésents dans les feuilles de Nicotiana xanthi n.cen milieu neutre, puis après addition de sels minéraux.

Spectres dans éthanol à 95° (m]..!)

Appellation Milieu neutre +AlCl 3 L. +NaOAc. +H 3 B0 3 +NaOH1

Bande II Bande l Bande l Bande II Bande.I Bande II

avonosides :

FI 258 362 367,400 269 378 415F 2 267 354 347,396 272 354 400F 3 258 360 365,399 268 383 420

--------------

rqueur :

.tine 258 362 367,400 269 378 415

;lycone :

de F l 257 375 360,428 264 389 Instablede F2 2.68 368 348,419 276 368 Instablede F 3 257 375 360,428 264 389 Instable

---------------

lrqueurs :

lercétine 257 375 360,428 264 389 Instablelempférol 268 368 348,419 276 368 Instable

Les spectres d'absorption de FI et de F2 ainsi que ceux de leurs aglycones, enmilieu neutre, puis additionnés des différents sels minéraux, sont donnés parles figures 5,6,7 et 8.

CeS résultats nous permettent de conclure à la présence du rhamnoglu­coside-3 kaempférol (F 2) ou nicotiflorine et de l'isoquercitrine (F 3) ou mono­glucoside-3 quercétine, en plus de la rutine, dans les extraits de feuillessaines de N.tabacum xanthi n.c.

- 41 -

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FIG.G.5PI:CTRE5 D'ABSORPTION DE L'AGLYCONE DE F1 EN MILlEU NEUTRE.

PUIS ADDITIONWE DES OIFFERENTS SELS MINERAU~

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F\G. 7 SPECTRES D'ABSORPTION DE F2.

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FIG.8_sPECTRES D'ABSORPTION DE: L'AGLYCONE DE: F2 EN MillEU NEUTREPUIS ADDITlO~NE DES DIFFERE"NTS .sELS MINERAUX.

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dans E 't. OH ;;; <;J;" of- Na OAc.

.................... : dans Et'OH à95°+ H:sB03_NaOAc.

3.- Conclusions.

Les principaux polyphénols présents dans les feuilles de Nicotianaxanthi n.c sont les acides chlorogéniques et la rutine ou rhamnoglucoside-3quercétine. Les acides chlorogéniques sont au nombre de trois: l'acide caféyl­3 quinique ou chlorogénique, l'acide caféyl-4 quinique ou "bande 510", et l'aci­de caféyl-5 quinique ou néochlorogénique. Les feuilles de ces tabacs renfermentégalement d'autres flavonosides comme la nicotiflorine (rhamnoglucoside-3 kaemp­férol) et l'isoquercitrine (glucoside-3 quercétine). Ces composés se retrouventdans les feuilles saines de Tabacs de la variété samsun.

Il y a cependant une différence concernant un dérivé du cinnamiquela scopoline (monoglucoside-7 scopolétine). Cette coumarine dont nous reviendronssur la détermination dans le paragraphe suivant, est toujours décelée dans desextraits de feuilles des Tabacs de la variété samsun, mais est absente ou enquantité extrêmement faible dans ceux des Tabacs de la variété xanthi n.c.

Les formules des principaux polyphénols identifiés dans les feuillessaines des Tabacs des variétés xanthi n.c et samsun sont données dans le tableauX.

La figure 9 représente un chromatogramme à deux dimensions (butanoléthanol, acide acétique à 2 %) d'un extrait de feuilles saines de Nicotianaxanthi n.c.

B - E v 0 l u t i 0 n q u a l i t a t i v 8 d 8 S C a m p 0 s é s

P h é n a l i q U 8 S d a n s l 8 S f 8 U i l l 8 S

n é c r 0 s é 8 S d 8 Nicotiana xanthi n.c. i n f 8 C t é S à

2D.°C P a r l 8 V i r u S d 8 l a m a S a i q U 8 d u

T a b a c S o u c h 8 C 0 m m u n 8.

Le simple examen sous ultraviolet d'un chromatogramme réalisé à par­tir d'un extrait initial de feuilles nécrosées à 20°C de N.xanthi n.c, montreque, l'hypersensibilité de ce Tabac à l'égard du virus de la mosaique du Tabac,s'accompagne d'une énorme accumulation, et d'une importante production de'compo­sés phénoliques (135).

Etant donné la diversité des combinaisons apparaissant lors de la for­mation des lésions locales nécrotiques dans les feuilles virosées à 20 oC, nousavons préféré commencer l'étude de ces substances par l'identification des agly­cones libérés par des hydrolyses acides, alcalines et enzymatiques.

- 42 -

TABLEAU XFORMULE5 OES PRINCIPAUX [OMP05E5 PHENOllOUE5

rD ENTI FIES DANS LES FHlill ES SAINES DE JIiCDtiana I:abarum.VARIETES Xanthi TI.C. et: Jam.5un

1/ dérivés. de t'acide c.innamique

HO CH=CH-COO

acide chtorogéniqueou

ac.ide caféyl- 3 QuiniquE'

acide néoc.hlorogéniQueou

acide c.afÉyl-5 quinique HO~-

HO

4

HO sCH==CH-COO

HO

HO4­

CH== CH-COO

H

bande_"510'/ou

acide cafévL 4 qUlnlque

2. _ Flavonoside5

HO

OH

HO OH..

R:OH; rutine cu rhamnoglucoside_3 quercétine

R =H nicotif-lDr'ln~ ou rhamnc91ucoside _3 k~mpféro\

R

OH

j,oquerci trinQ ouglu (oside _ 3 querrétine

obCHsOH

1

OH

LEGENDE

A acide caféy\_ 5 quiniqLlE' ou néochlorogénique

B acide caféyl _4 qUlnJque ou bande \\510"

C acide caf2~1 -:5 qUlnlque ou chlorogéni9ue

Ft; rhamnogluCD5"ide _:3 quercÉl:ine DU rutine

F2.: rhamnoglucoside _ 3 kaempFérol ou nicoriflor',ne

F3: rnonoqlucoside _ 3 quercél:ine ou iSDqufrcitrine

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1

0.1

1

t 0·1spol: dQ. c{epa"t

AA~__--'7~

r:IG.9~CHROMATOGRAMr..,E'A DEUX DIMEN!!lIQN5 (I;!UTANOl EH..IANOL_ACIOf

A CET 10 UE A 2. "'/" ) D' UNE XTRA(T DE FEU ILL fS 5 AIN. ES DE

N/cotiana Xanl"hi ". c.

1.- Identification des aglycones présents dans les hydrolysats d'extraitsinitiaux de feuilles de N.xanthi n.c virosées à 20 oC.

La considération des Rf avec ceux des produits de référence dans dessolvants comme le toluène acétique, le benzène acétique, le butanol acétique,le formiate de sodium, et l'acide acétique à 2 %, l'examen des fluorescences enultraviolet et des colorations dans le visible après pulvérisation de réactifsspécifiques, ont permis d'identifier dans les hydrolysats acides de feuilles né­crosées de N.xanthi n.c, 108 heures après inoculation par le VMT : les acidescaféique, férulique, para-coumarique, ortho-coumarique, vanillique, mélilotiquela scopolétine, l'esculétine et des flavonols comme la quercétine et le kaemp­férol.

Les acides para-hydroxybenzoique, gentisique, sinapique et la coumari­ne sont également détectés sur les chromatogrammes réalisés à partir de telshydrolysats, mais cependant en moins grande quantité. Ces phénols ne sont qu'àl'état de traces (exceptions faites pour l'acide caféique, l'esculétine, la quer­cétine et le kaempférol) dans les hydrolysats des Tabacs sains correspondants.Les hydrolyses acides sont faites en milieu HCI N, sous réfrigérant à reflux,à 100 Oc durant une heure.

Les hydrolyses enzymatiques réalisées à l'aide d'une préparation com­merciale de S-glucosidase et effectuées à la température ambiante pendant 6 heu­res sur des extraits de feuilles nécrosées de Nicotiana xanthi n.c, libèrent lesacides caféique, férulique, ortho-coumarique, sinapique, mélilotique, vanilliquepara-hydroxybenzoique, gentisique, la scopolétine, la coumarine, l'esculétine etla quercétine.

La coumarine décelée sur les chromatogrammes pourrait provenir de laforme cis de l'acide ortho-coumarique (acide coumarinique). Cet acide possèdantun OH en ortho de la chaîne carbonée se cyclise spontanément en coumarine de lamanière suivante :

COOH

ac.ide 0_ cDumarlqu r

COOH

aride cDumarmlque c.Dumarlne

Sur la plupart des chromatogrammes faits à partir d'hydrolysats acideset enzymatiques apparaissent des substances non encore identifiées (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10). Un certain nombre d'entre elles (2,3,4,5,6,7) prennent des fluores­cences en lumière de Wood, et des colorations dans le visible après pulvérisation

- 45 -

des réactifs des phénols, comparables à celles données par les acides féruliqueet sinapique. Ces composés ne sont jamais décalés dans les hydrolysats d'extraitsinitiaux de plantes saines.

La substance que nous avons appelé 1 n'est détectée que dans quelqueshydrolysats acides d'extraits foliaires de N.xanthi n.c, en particulier dans ceuxdes Tabacs ayant séjourné à 20 Oc entre 108 heures et 156 heures. Ce produits'isomérise dans un solvant aqueux en deux isomères cis et trans, et présente lesmêmes caractéristiques que celles données par l'acide caféique, en particulier ildonne une coloration rouge brique avec le réactif d'Hoepfner. Nous avons identi­fié un composé semblable dans les hydrolysats acides de grains de café des varié­tés robusta et arabica.

L'hydrolyse alcaline n'apparaît libérer que les acides caféique, féru­lique et para-coumarique. Les hydrolysats basiques renferment également de lacoumarine; cette dernière substance peut provenir de l'acide ortho-coumarique.La cyclisation doit se produire lors du passage en milieu acide, par additionde HCl 2N.

Les Rf dans les différents solvants, les fluorescences en lumière deWood, et les colorations produites après pulvérisation de réactifs, des nombreuxaglycones identifiés dans les hydrolysats, sont résumés dans le tableau XI.

Les figures 10,11, représentent des chromatogrammes à deux dimensionsdans le benzène acétique et le formiate de sodium, d'hydrolysats acide et enzy­matique de feuilles nécrosées de N.tabacum variété xanthi n.c infectés à 20 Ocpar le virus de la mosaïque au Tabac.

A la suite de ce travail, nous pouvons penser que de nombreux aglyco­nes doivent être liés au glucose par une liaison f3, et que certaines des combi­naisons existantes dans les extraits non hydrolysés de feuilles nécrosées deN.xanthi n.c soient des O-glucosides.

- Essai d'identification du composé 1

Cette substance ne peut être considérée comme un produit de transfor­mation de l'acide caféique car il n'apparaît pas dans tous les hydrolysats ou cedernier acide est détecté. Il peut être cependant considéré comme un ortho-diphé­nol dérivé de l'acide cinnamique car il donne une réaction positive avec le réac­tif d'Hoepfner et isomérise dans un solvant aqueux en deux formes cis et trans.

Si l'on considère la migration des acides benzoiques ortho-dihydroxy­lés comme l'acide protocatéchique (acide dihydroxy-3,4 benzoique) et l'acideortho-pyrocatéchique (acide dihydroxy-2,3 benzoique), dans le benzène acétiqueet le formiate de sodium (74), il est à noter que c'est l'acide possèdant deuxhydroxyles adjacents en position ortho du groupement carboxyle (acide ortho-pyro­catéchique) qui possède le Rf le plus élevé dans le benzène acétique. Les vites­ses de migration sont semblables pour les deux acides dans le formiate de sodium.

-46 -

Tableau XI - Caractéristiques chromatographiques des acides -phénols et des coumarinesdétectés dans les hydrolysats acides et enzymatiques de N.xanthi n.cvirosés à 20 oC.

. . . . . .

Rf x 100 dans les solvants Fluorescences Colorations avec

Appellationen UV + NH 3

BAW BEW TAW BzAW NaF M2 p-nitraniline p-nitraniline Réactif+Na2 CO 3 d 'Hoepfner.

Icide caféique 78 66 3 11 32-66 30-63 Vert-jaune Jaune-vert Brun RougeLcide férulique 84 72 40 64 28-70 38-65 Bleu-violet Rose Bleu-vert Jàune~cide p-coumarique 88 75 10 31,50 42-70 42-70 Violet Jaune Bleu Vert~cide sinapique 80 70 24 60 20-68 35-65 Vert Rose Bleu-gris Jaune~cide O-coumarique 85 77 35 45 50 55 Jaune-vert Jaune Violet~cide mélilotique 88 80 50 52 79 75 Jaune Violet~sculétine 75 70 1 7,5 33 41 Vert-jaune Jaune-brun Brun Rouge:;copolétine 83 75 35 38,5 31 47 Violet Jaune Bleu-gris Orange;oumarine 90 75 80 81 75 75 Jaune" Violet\cide vanillique 88 80 34 62 56 62 Jaune-orange Violet Jaune\cide?-hydroxybenzoique 90 83 6 31 63 66,50 Jaune-Vert Rougekide gentisique 80 66 2 15 69 65 Bleu-vert Gris Gris-blanc Brun

86 10 29 33-67 34-60 Vert-Jaune Jaune-brun Brun Rouge

2 79 17 41 56 Bleu Brun-rouge Bleu-gris Orange

3 81 26 43 56 Bleu Brun-rouge Bleu-gris Orange

4 81 47 34,50 50 Bleu Brun-rouge Bleu-gris Orange

5 71 15 3,50 4,50 Bleu Brun-rouge Bleu-gris Orange

6 71 32 4 4,50 Bleu Brun-rouge Bleu-gris Orange

7 88 32,55 Vert-Bleu Jaune Gris-bleu

8 82 85 70 70 Violet Jaune

9 85 80 60 75 Violet Jaune Brun-rouge

10 39 59 Violet Jaune

..........

- 47 -

en po', n l:.iHéE'n hac.huré

. LEGENDE

dé rivés. de \ 1ae:" de c..'Jnnamiquedérivé'i de l'acide be.nzoïque

sc. 0.: Sc.opo'É1:. i nl~es; ::. E'~c.ulétine

c = ac.ide caféïQu~.co = coumarine

ae ide..

pc: :: pëlra.coumartque

F - ~c.ide f~l"'ul ique.-;;lc..ide

. .s = .5tnaplque

oc .::. ac.ida ortho _c:oumariqur?me = acide mélilol::iqueva :: acide van't1lique.pah::: acid~ para _ bydro"X~ benzoïquege. .::. acide ge nt i li ique

(Ie.~ isomèrQ.s cis e-t trans dES acidec:. cinnamiquE?s 51?

sépara.nL dan:) le formiate: de sodium)

.- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

G GG

G

.. 0.11Spoc de. dâpart:..

No..F

FIG.10 CHROMPtTOGRAMME A DEUX Olr-1ENSION~ (BE.N~ÉNE At:ËïIOUE_

fORMIATE DE SODIUM) D'UN HYDRDLY.5AT ACIDE DE FEUILLES Vl\\OS~ECf>A 20" C DE N/ctJé/ana Xanthi n.c. ( X.V.MT. "DS h à 2..0·C )

_ _____________________ '_ _ _ _ _ _ _ _ 4

G GG

GG

. 1

No..F• 0.1

l'OpOt de. de':part

FIG.11- CHROMATOGRAMME A DEUX DIMENSIONS (BENZËNE ACtTICJUE -FORMIATE DE SODIUM) D'UN HYDROLY5AT ENZYMATIOUE

Cf3_GLUCOSIDASE) DE FEU\llES VIROSËES A 2.0 o C OC NicaCt"elna Xanthi n.'

(X.V.MT. 10~hà200[)

COOH

dei de pro~ocatéchique

COOH

OH

acide o. pyrocatéchique

L'application de ces données à nos deux substances ortho-dihydroxylées(composé 1, acide caféique) peut nous permettre d'envisager deux structures pos­sibles pour le composé 1 (structure a, structure b).

OH

sf:.rud:.ure ( a)

COOH

H

OH

structure ( b)

COOH

Le tableau XLI nous donne la structure des principaux acides-phénolset coumarines dans les hydrolysats de feuilles virosées à 20 Oc de N.xanthi n.c.

2.- Etude des combinaisons (hétérosides et esters) apparaissant dans Les feuiL­Les nécrosées de Nicotiana xanthi n.c infectés à 2DoC par Le virus de Lamosaique du Tabac.

L'infection à 20 Oc d'un Nicotiana xanthi n.c par le virus de la mosai­que du Tabac, se traduit par une importante augmentation des acides chlorogéni­ques (chlorogénique, néochlorogénique,"bande 510") et des flavonosides (rutine,nicotiflorine, isoquercitrine), et conduit à une accumulation et à une productiond'un grand nombre de composés phénoliques.

- 48 -

V\R05E A 20 0( PAR LE' VIRUS DE LA HOSAIQUE ou TABAC 50UCHE' COMMUNE.

su b~l::anc.es

nonphéno lique.~

COUMARINES

~~)=o coumarine

ACIDES BEN20ïtiJUE5 ACIDES CI N NAMlQU E~

rnonohydroxy\6es'acidep. hydroX''y ben zoi'gue

~C.OOli

~OH acide. o_tDumarique

~COOH

1 ~ acide m~1 i la\: iqueOl-i

~C.OOH

l'toM at:Ïete p- toumarique.

HO~

HO~O1Z5~ulétine

di hydroxy\ées

H'f)COJ" "scapol étineHO h =0 ~

:~~1 • • •~ aCIde gEnt 151qUe.

HOM~ cOOH

1 .....::: aclde caréiqueHO

trihydrox)I\ -Ifesacide. .sinapique

a. Dérivés de l'acide cinnamique L'utilisation de solvants comme le butanoléthanol, le butanol pyridine et le butanol ammoniaque, permet de mettreen évidence dans des extraits de feuilles nécrosées, la présence d'aci­des cinnamiques sous forme de dérivés du glucose et de l'acide quini­que.

Accumulation des acides férulylquiniques, production de férulyl-l,glucose et à un moindre degré de férulyl-I gentiobiose.

Les bandes qui correspondent à ces substances sont séparées après dé­veloppement dans le butanol éthanol, puis éluées avec de l'éthanol à 70 %. Unepurification finale est obtenue par chromatographie à deux dimensions avec lecouple de solvants de base (butanol acétique-acide acétique à 2 %).

La formation des lésions locales nécrotiques fait apparaître pour l'a­cide férulique deux types d'esters: un ester de l'acide quinique (D), et des es­ters du glucose comme le férulyl-I glucose (G) et le férulyl-I gentiobiose (H).

Les spectres d'absorption sont similaires et présentent trois maximums:le premier entre 235m~et 24Om~et les deux autres à 295m~et 33Om~ (Tableau XIII) •Leurs mobilités très différentes dans le butanol éthanol, le butanol pyridine etle butanol ammoniaque permettent de bien les distinguer. Les isomères cis ettrans sont séparés par un solvant aqueux. Le composé D est en réalité comme lemontre le tableau XIII, un mélange de trois isomères (D, D'et DI!) ; le plus im­portant étant D. La co-chromatographie de ce dernier avec de l'acide férulyl-3quinique n'a donné qu'un seul spot dans les différents solvants. Par "analogieavec les acides monocaféylquiniques, il est probable que D' soit l'acide férulyl­4 quinique et DI! l'acide férulyl-5 quinique. L'hydrolyse alcaline de ces depsideseffectuée dans les mêmes conditions que celle adoptée pour les acides chlorogéni­ques libère les acides férulique et quinique (Tableau XIII) .

Le produit G dont le comportement chromatographique est le même que ce­lui du férulyl-I glucose isolé de Petunia hybrida, est scindé en acide féruliqueet en glucose par une hydrolyse réalisée en milieu NaOH N, à la température dulaboratoire, pendant une heure. L'aglycone et le sucre sont identifiés après trai­tement du composé avec une préparation commerciale de S-glucosidase. Le tempsd'hydrolyse est de deux heures.

Les composés phénoliques (D,G) peuvent être également rompue par unehydrolyse réalisée en milieu Hel N durant 30 minutes, à 100 oC, sous réfrigérantà reflux.

L'acide férulique et le glucose sont aussi décelés dans les hydrolysatsalcalins ou acides de la substance H. Les conditions d'hydrolyse sont les mêmesque celles utilisées pour D et G. Les données spectrales, l'examen des fluores­cences en lumière de Wood et des produits détectés dans les hydrolysats, mais sur­tout l'étude des valeurs des Rf dans les nombreux solvants, nous permettent avecUne assez grande précision d'attribuer à ce phénol une structure de férulyl-Igentiobiose.

Les Rf, les fluorescences, et les spectres d'absorption en milieu neu­tre et alcalin des dérivés de l'acide férulique, ainsi que les caractéristiquesphysiques de leurs produits d'hydrolyse sont réunis dans le tableau XIII.

Les spectres d'absorption des composés D et G et de l'aglycone apparais­sant dans leurs hydrolysats alcalins sont donnés par les figures 12, 13 et 14.

- 49 -

Tableau Xill. - Caractéristiques chromatographiques et spectroscopiquesdes composés D, G, li et de leurs produits d'hydrolyse.

I. Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol à 95 0ünjJ)

Extraits en UV + NH 3Initiaux BEW BAW BArn BPH KFH AAE À max À min 6À max

(alcali)

D 49 65 3 35 50 63-72 Vert 235,(295),325 263 + 46D' 46 60 3 35 50 63-72 Vert 235,(295),325 263 + 46Dl! 44 58 3 32,5 48 70-81 VertG 69 55 19 62 30 65-75 Vert 240, (300) ,330 263 + 50H 34 29 - 15 23 70-82 Vert 235, (300) ,327 263 + 53

------------

rqueurs :

ide férulyl-3inique (café) 49 65 3 35 50 63-72 Vert 235,(295),325 263 + 46rulyl-1 glu-se (Petuniabrida) 69 55 19 62 30 65-75 Vert 240, (300) ,330 263 + 50

2. Rf x 100 dans les solvants Colorations Spectres dans éthanol 95 0

rdrolysats. (m )aglycone BAW BEW TAW BzAW NaF AA2 UV + NH

IP-nitrani-line + 6À maxlNa2 C0 3

À max À min (alcali'.

de D 84 72 40 64 28-70 38-65 Bleu-violet Bleu-vert 235,(294),322 258 + 18de D' 84 72 40 64 28-70 38-65 Eleu-violet Bleu-vert 235,(294),322 258 + 18de Dl! 84 72 40 64 28-70 38-65 Bleu-violet Bleu-vert ,

"

de G 84 72 40 64 28-70 38-65 Bleu-violet Bleu-vert 235,(294),322 258 + 18de H 84 72 40 64 28-70 38-65 Bleu-violet Bleu-vert,---------

queur :

deulique 84 72 40 64 28-70 38-65 Bleu-violet Bleu-vert 235,(294),322 258 + 18

Fractions non Rf x 100 dans les solvants Colorations

phénoliques BAW APW IB\-l IArnW EAmW Nitroprussiate Phtalate Anilinepiperazine d'aniline phosphorique

de D 20 17 65 56 Jaune-orangede D' 20 17 65 56 Jaune-orangede D" 20 17 65 56 Jaune-orangede G 18 28 Brun Brun-jaunede H 18 28 Brun Brun-jaune

--------------lueurs ~

le quinique 20 17 65 56 Jaune-orange:le glucose 18 28

1

Brun Brun-jaune-

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"350 400 450

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FIG _ 12 SPECT R E5 0" ABSOR.PT ION OU CDMPO St D

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----: dans E -t:. OH .95"

E. -\;. OH 9," + Na OH

cl'è!osité opb'que

2.75 300 ~25 '3'50 400 4'50longueur d J ond2 ~ mjA )

SPECTRES D'ABSDRPT\ON DE' LA SUBSTANCE G-

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--------= dans El:: OH 9~o+NélOH

'550~oo275 400 450longueur d'onde (MjA)

FIG.14.sPEtTRE'5 O'A5,SORPTION DE L' Ar,LYCON~ DES COMPOSf$ D ET G

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dgnsH:é optique1'0

---- = dans Et OH 95°

-- -------- ""' dans Et OH 95° + Na OH

Les vitesses de migration des différents esters de l'acide féruliquedans le butanol éthanol et l'acide acétique à 2 % sont illustrées par la figure15.

- Accumulation d'acide para-coumaryl-3 quinique

Les nécorses d'hypersensibilité s'accompagnent de l'accumulation d'uncomposé E, qui fluoresce en violet sous la lumière de Wood après exposition auxvapeurs ammoniacales, et dont les Rf et les maximums d'absorption (23Om~, 292m~

et 312m~) dans le spectre ultraviolet correspondent à ceux de l'acide para-couma­ryl-3 quinique (tableau XIV) .

Les méthodes de purification employées, sont les mêmes que celles uti­lisées dans l'isolement des acides chlorogéniques ou férulylquiniques.

Tableau XIV - Rf' fluorescence, spectre d'absorptionen ultraviolet du composé E.

Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol 95° (m]J)

ppellationen UV + NH 3

BEW BAW BArn BPW KFW M2 À max À min M max(alcali)

E 54 72 9 39 56 68-80 Violet 230,(292) ,312 250 + 50-----------rqueur :

idecoumaryl-3inique 54 72 9 39 56 68-80 Violet 230,(292) ,312 250 + 50DIurne)

Par hysrolyse alcaline, nous mettons en évidence de l'acide para-coumarique etde l'acide quinique (voir tableau XV).

- 51 -

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AA fJJ --------;;>--

0.1

Î ().-1

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FIG.15 VITESSE'5 DE MIGRATION DES DIFFE.RE.NTS e.5TE"RS UE L:'ACIDEFERUL\QUE DANS lE BUTANOL ETI-lANOL ET L'ACIDE ACETIOUE A 2·,.

o : dtide férul!Jl_ 3 quiniqueD': ar.ide! férulyl _4 q uiniqul?0": ëlcide f-prul\)I_5 quiniqll~

G: férufyl_1H: féru 1~1_1

glucosegen ~ iD biDS~

Tableau XV - Caractéristiques physiques des produitsdécelés dans l'hydrolysat basique de E.

Rf x 100 dans les solvants Coloration Spectres dans éthanol 95° (mjJ)Aglycone en UV + NH 3

BAW BEH TA\J BzAW NaF ME À max À min 6À max(alcali)

de R 88 75 10 31 ,5 42-70 42-70 Violet 228, (292) ,310 247 + 25------_._---

,rqueur ··idecoumar~que 88 75 10 31,5 42-70 42-70 Violet 228, (292) ,310 247 + 25

Rf x 100 dans les solvants Coloration avec'raction non phénolique

BA\o1 IBW IAmW EAmW Nitroprussiate-pipérazine

de E 20 17 65 56 Jaune-orange-----------------------

.rqueur ··ide quinique 20 17 65 56 Jaune-orange

Les spectres d'absorption du composé E et de son aglycone sont donnés par lesfigure 16 et 17.

- Apparition de l'acide ortho-coumarique sous formede combinaisons avec le glucose (esters, glucoside),production d'un dérivé de l'acide mélilotique.

Les propriétés chromatographiques et spectroscopiques comparées à cel­les données par HARBORNE et CORNER (63), et l'examen des substances détectéedans les hydrolysats nous permettent d'envisager dans des feuilles virosées à20 Oc de Nicotiana xanthi n.c l'existence de l'ortho-coumaryl-l glucose, del'ortho-coumaryl-l gentiobiose et du mélilotoside(S-glucoside de l'acide ortho­coumarique).

L' ortho-coumaryl-l glucose (1) et l' ortho-coumaryl-l gentiobiose (J)ont des Rf dans le butanol éthanol respectivement de 0,74 et de 0,57 et prennentune fluorescence jaune au contact des vapeurs d'ammomiaque (voir tableau XVI).

Les produits (T, J) sont isolés et purifiés par développement linéairedans le butanol éthanol suivie d'une chromatographie bidimensionnelle dans le bu-

- 52 -

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25'0 '2.75 300 350 400 4501angueur d'ande (m14)

r=ïG:16 5P Eer RE S D' ABSOR PTiON OU C.OMPO'E E

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dans E + 0 H 95" +- ~J., DH

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FIG .iT.sPEeTRES

350 400 -q·SO

longuE'ur d'onde (ml-'-)DU COMPOSE E

525:soo2.75

O' Ae"SDRPTION DE L'AC,LYCONE

den si té opflque

-02.25 2.S'O

·fO

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·6

---- - dans E i:. OH 950

----- - --- = dan5 E t OH g~. +- Né! OH

tanol éthanol et l'acide acétique à 2 %.

L'hydrolyse acide étant réalisée sous réfrigérant à reflux, en milieuH Cl N pendant 30 minutes à 100 oC, l'aglycone est extrait par de l'éther éthyli­que. La couche éthérée mise à sec, reprise par de l'éthanol puis chromatographiéedans les solvants spécifiques des acides-phénols révèle un spot qui correspondà celui de l'acide ortho-coumarique. Ces combinaisons sont rompues par une hydro­lyse enzymatique (B-glucosidase). Le traitement est effectué sur une période de5 à 6 heures. Le rendement est meilleur dans le cas d'une hydrolyse enzymatique,le milieu acide favorisant la transformation de l'acide ortho-coumarique en cou­marine.

Nous avons pu mettre en évidence la présence d'une substance (K) dontle Rf dans le butanol éthanol est approximativement de 0,65 et celui dans l'aci­de acétique voisin de 0,66. Ce produit invisible en lumière de Wood même aprèspulvérisation des réactifs spécifiques des phénols, est très rapidement hydroly­sé (20 minutes) par la B-glucosidase.

Le Rf de ce glucoside dans l'acide acétique à 2 % coïncide avec celuidonné par KLEINHOFS et coll. (82) pour le mélilotoside (S-glucoside de l'acideortho-coumarique). La considération de toutes ces données et le fait que cettesubstance a dans le butanol éthanol un Rf intermédiaire entre ceux de l'ortho­coumaryl-I glucose et de l'ortho-coumaryl-I gentiobiose (valeurs que nous pou­vons comparer et rapprocher de celles données par HARBORNE et CORNER (63) pourles dérivés similaires de l'acide caféique et du glucose), nous permettent depenser que nous sommes là, en présence du S-glucoside de l'acide ortho-coumari­que.

Sur de tels chromatogrammes, il apparaît un composé L invisible en lu­m1ere ultraviolette, très rapidement scindée (30 minutes) par le B-glucosidase,en acide mélilotique et en glucose. Le Rf de L dans le butanol éthanol se situeentre 0,60 et 0,70 et est proche de 0,70 dans le solvant aqueux.

Le tableau XVI, rassemble les propriétés physiques de ces diversescombinaisons ainsi que celles des produits détectés dans leurs hydrolysats.

La figure 18 schématise un chromatogramme à deux dimensions (butanoléthanol, acide acétique à 2 %) de ces nombreuses combinaisons.

- Production de caféyl-I glucose.

Sur certains chromatogrammes réalisés à partir d'extraits de feuillesprésentant des lésions locales nécrotiques, 108 heures ou 144 heures après ino­culation, il apparaît un composé (M) dont la .fluorescence en lumière de Wood vi­re au jaune après exposition aux vapeurs anmoniacales.

Ce corps isolé par chromatographie dans les solvants cités plus haut(butanol éthanol, butanol acétique, acide acétique à 2 %), se comporte de la mê­me façon que le caféyl-I glucose isolé de Petunia hybrida.

Le composé absorbe dans deux régions du spectre ultraviolet ; nous ob­servons un premier maximum à 250m~ puis deux maximums à 305m~ et 334m~ . L'acidecaféique et le glucose sont identifiés dans les hydrolysats (acides alcalins etenzymatiques).

53 -

Tableau XVI - Propriétés des substances I~ J, K~ Let des produits décelês dans les hydrolysats.

1. Rf x 100 dans les solvants Fluorescences Spectres dans éthanolExtraits Initiaux en UV + NH

395° (m )

BEW BAW BArn BPW KFW MEAppellationÀmax Àmin f',Àmax

alcali

l 74 72 35 69 33 71-79 Jaune-vert 230, 327 260 + 60J 57 - 14 34 33 86 Jaune-vertK 65 - - - - 66 -L 70 - - - - 70

-------------------aleurs données par dansARBORNE-CORNER l'eau-coumaryl-l glucose 76 75 40 - - 79 Jaune 228, (277) ,325 - + 62

-coumaryl-l gentio-iose 55 45 12 - - 87 Jaune 230, (277) ,327 - + 62

aféyl-l glucose 63aféyl-l gentiobio- 46l.ose-glucoside du 55aféïque

2. Rf x 100 dans les solvants ColorationsHydrolysats

a-aglycones BAW BEW TA\i BzAW NaF ME UV +NH3

p-nitraniline p-nit rani line+ Na

2C0 3

- .

de l 85 77 35 45 50 55 Jaune-vert Jaune Violetde J 85 77 35 45 50 55 Jaune-vert Jaune Violetde K 85 77 35 45 50 55 Jaune-vert Jaune Violetde L 88 80 50 52 79 75 - Jaune Violet

-------------------

arqueurs :

cide O-coumarique 85 77 35 45 58 55 Jaune-vert Jaune Violetcide riiélilotique 88 80 50 52 79 75 - Jaune Violethydrolysats deiptery:;c odorat)

b- Fraction non Rf x 100 dans les solvants Colorations.

phénolique BAW APW Phtalate d'aniline Aniline phosphorique

de l 18 28 Brun Brun-jaunede J 18 28 Brun Brun-jaunede K 18 28 Brun Brun-jaunede L 18 28 Brun Brun-jaune

-------------------arqueur :

lucose 18 28 Brun Brun-jaune

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1

Af\:L -----..lJI..>.. 1

t.. 0.11Spot de d~pad:.

FIG.18 VITESSE'S DE MIGRATION DE'i DERIVES DU GLUCD~E DES AI:\DE'S

O.C:OUMARIQUE ET MELILDTIQUE DAN5 LE BUTANOL ETHANOLET L'ACIDE ACEÎIOUE A 2.%

o.

1: o. cOllmoryl_ -1 glucose. r. . n . r n 1\ m ;;;\ r vi _ 1 0 ~ nt jobi0 S !?

K: fi -glucoside de \'ë7c.'tde o. coumarique.L:;3 - cdur.osiae de !'-ac.ide melilotique

Toutes ces données réunies dans le tableau XVII, et illustrées par lafigure 19, correspondent à. celles. du caféyl-l glucose.

Tableau XVII - Rf' fluorescences, spectres d'absorption du dérivéde l'acide caféique et du glucose, et caractéristiqueschromatographiques de ses produits. d'hydrolyse.

1. Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol 95°Extraits en UV + NH 3 (m )

InitiauxBEW BAW BArn BPW KFW ME

Àrnax Àmin 6Àmax(alcali)

M 63 50 8 54 20 60-70 Jaune-vert 250,305,335 265 + 66._---------------[arqueur :

:aféyl-l glucose 63 50 8 54 20 60-70 Jaune-vert 250,305,335 265 + 66:Petunia hybrida)

.

2. Rf x 100 dans les solvants Colorations

Hydrolysats BAW BEW TAW BzAW NaF M2 UV+NH p-nitrani- p-nitrani- Réactifa. aglycone line line d'

+ Na CO Hoepfner

de M 72 66 3 11 32-65,5 30-63 Ver~-jaune Jaune-brun Brun Rouge------------

Marqueur :

Acidecaféique 72 66 3 11 32-65,5 30-63 Vert-jaune Jaune-brun Brun Rouge

Rf x 100 dans les solvants Colorationsb.· Fraction non

phénoliqueBAW APW Phtalate d'aniline Aniline phosphorique

de M 18 - 28 Brun Brun-jaune----------------

Marqueur :

Glucose 18 28 Brun Brun-jaune

- 55 -

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2S0 2.75 ~oo ~50 400 44,)0

Jongut?ur d' onde ( mJA')

FIG. 19 SPECTRES D'AB50RPTION DE LA SUBSTANCE M

----::;---- ---- =

dans

- Apparition de dérivés de la coumarine

L'examen de chromatogrammes d'extraits de feuilles virosées à 20 Ocde Nicotiana tabacum variété xanthi n.c, révèle la présence d'une substance ap­pelée N qui f1uoresce en violet en lumière de Wood, et dont les produits d'hydro­lyse (acide et enzymatique) sont la scopo1étine et le glucose. Ce glucoside, trèsrapidement hydrolysé par la B-g1ucosidase (30 minutes), a dans son spectre d'ab­sorption en ultraviolet deux maximums importants à 227mw et 338~, et deux au­tres maximums secondaires à 25Om~et 287 m~. Les Rf dans les différents solvantsenvisagés correspondent à ceux donnés par HARBORNE (61). Il s'agit surement dela scopo1ine ou glucoside-7 scopo1étine.

La scopo1ine est la plupart du temps accompagnée d'une substance (0)apparaissant en violet en lumière ultraviolette et qui donne du glucose et de lascopo1étine par hydrolyse acide ou enzymatique. L'hydrolyse enzymatique réaliséeà l'aide d'une préparation de 6-g1ucosidase est effectuée à la ternpérature am­biante durant 4 heures.

La substance 0 absorbe dans deux régions du spectre ultraviolet à226m~ et 34Om~ et possède un épaulement à 29Om~. La considération de toutes cesdonnées nous permet de conclure à l'identité de ce composé avec le gentiobiose­7 scopo1étine.

Les propriétés chromatographiques et spectroscopiques de ces dérivésde la scopo1étine sont rassemblées dans le tableau XVIII et illustrées par lesfigures 20 et 21.

- 56 -

Tableau XVIII - Rf' fluorescences et spectres d'absorptiondans l'ultraviolet des substances N et 0s'accumulant dans des Tabacs de lavariété xanthi n.c virosés à 20 oC.

I. Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol 95° (mll)Extraits en UV ._-

Initiaux BEW BAW BAm BPW KFW AA2 À max À min 6À max

,ppellation (alcali)

N 56 47 35 45 15 77 Violet 227,250,287,338 306 + 40 30 24 - 10 20 86 Violet 226,290,340 307 + 4

2. Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol 95° (mll)lydro lysa t s en UV

aglycone BAW BEW TAW BzAW NaF AA2 À max À min 6À maxl. (alcali)

de N 83 75 35 38,5 31 47 Violet 229,253,300,346 307 + 46de 0 83 75 35 38,5 31 47 Violet

.._-----------

farqueur :

;copolétine 83 75 35 38,5 31 47 Violet 229,253,300,346 307 + 46. -

Rf x 100 dans les solvants Colorationsl. Fraction non

phénolique BAW APW Phtalate d'aniline Aniline phosphorique

de N 18 28 Brun Brun-jaunede 0 18 28 Brun Brun-jaune

.._--------------

farqueur :

aucose 18 28 Brun Brun-jaune

- 57 -

densité optique2.-0

1·'0 +-----+------t------jr-------t------j-----t-----

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,long UEur d onde (mft)

FI G. fO SPECTRES D'ABSORPTION DE LA .5UB5TAf\JCE N

dans E t OH 95 D

denslb? optique

'350 400 L.

longueur d/on~2 ~ mt-t)300. 2752.50

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1·6

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FIG. 21 SPl";,(ïRE'::l D'ABSORPTION Of l'AGLYCONE DU COMPOSE N

____ = dan5 E ~ OH 95 0

--- --- - = dans Et OH 91)° -1- N!) DH

Un corps de fluorescence vieux rose que nous avons appelé P, virantau Jaune ivoire avec les vapeurs ammoniacales visible à la lumière de Wood surles chromatogrammes, est scindé en esculétine et en glucose par une hydrolyseacide ou enzymatique. Les Rf et les fluorescences de ce produit sont totalementdifférents de ceux de l'esculine (glucoside-6 esculétine) du commerce, mais coin­cident avec ceux donnés par HARBORNE (61) pour la cichoriine ou glucoside-7 escu­létine. Tous ces résultats correspondent aux caractéristiques physiques de lacichoriine et sont rassemblés dans le tableau XIX et la figure 22.

Tableau XIX - Caractéristiques physiques du composé P.

Rf x 100 dans les solvants Fluorescence Spectres dans éthanol 95° (m]J))pellation en UV + NH

3BEW BAW BArn BPW KFW AA2 À max ~ min /:,~ max

(alcali)

P 56 46 8 45 12 68,50 Jaune-ivoire 228,255,290,345 310 + 50

Rf x 100 dans les solvants Colorationsrdrolysats

aglycone BAW BEW BzAW NaF AA2 UV + NH p-nitraniline p-nitraniline Réactif+ Na 2 C0 3 d'Hoepfner

de P 75 70 7,50 33 41 Vert-jaune Jaune-brun Brun Rouge-brique-----------

lrqueur :

;culétine 75 70 7,50 33 41 Vert-jaune Jaune-brun Brun Rouge-brique

Fraction non Rf x 100 dans les solvants Colorations

phénolique BAW APWPhtalate d'aniline Aniline phosphorique

de P 18 28 Brun Brun-jaune---------------Lrqueur :

.ucose 18 28 Brun Brun-jaune

- 58 -

"350 400 4-50\ongu!?ur d'onde (mp)

~oo2.752.50

densité oÇ)tique

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2.·0

1·6

F'lCi.2.2. .sPEC.TRE~ 0' ABSORPTION DU COMPOSE P

----= daM é 1. OH 95 U

-------- = dans E 1: OH 9'.5° ... NaCH

b. Dérivés de l'acide benzoïque: Un composé appelé Q dont les Rf comme letableau XX, dans le butano1 éthanol et l'acide acétique, sont approxi­mativement de 0,65 et de 0,85 et qui renferme dans ses hydro1ysats a­cides et enzymatiques de l'acide vani11ique et du glucose est présentsur les chromatogrammes d'extraits de feuilles nécrosées de N.xanthin.c. Ce produit hydrolysé en 30 minutes par une préparation commercia­le de 8-g1ucosidase ne peut être mis en évidence par les réactifs desphénols. Nous pensons qu'il pourrait s'agir là du S-glucoside de l'a­cide vinillique.

L'acide gentisique provient en grande partie d'un composé que nousavons nommé R, dont la vitesse de migration de l'ordre de 0,30 dans le butano1éthanol est approximativement de 0,85 dans l'acide acétique à 2 %. Du glucoseest identifié dans la phase aqueuse de ses hydro1ysats acides.

Tableau XX - Propriétés des dérivés des acides benzoïqueset du glucose identifiés sur des chromatogrammesd'extraits de feuilles de N.xanthi n.c virosés à 20°C.

Extraits Initiaux 2. Hydro1ysats

Rf x 100 dans a. b. Rf x 100 dansles solvants Ag1ycones Rf x 100 dans les solvants Fraction non les solvants

phéno1iquepellation BE~.;r ME BAIV' BEW BzAW NaF AAE

BAW APW

Q 65 85 de Q 88 80 52 79 75 de Q 18 28R 30 85 de R 80 66 15 69 65 de R 18 28

------------- ------------Marqueurs : Marqueurs

Acide Glucose 18 28vanillique 88 80 52 79 75Acidegentisique 80 66 15 69 65

La substance Q a été mise en évidence de façon fortuite par é1utionaprès développement linéaire dans le butano1 éthanol d'une zone située sur leschromatogrammes entre la bande contenant le féru1y1-1 glucose et celle renfer­mant la scopo1ine. Le dérivé de l'acide gentisique est situé sur un tel chroma­togramme entre la ligne de départ et le féru1y1-1 gentiobiose. Les différentsé1uats sont alors chromatographiés en utilisant du butano1 éthanol en premièredirection et de l'acide acétique à 2 % en seconde dimension. Sur ces chromato­grammes divers secteurs sont découpés, é1ués puis hydrolysés. Par ces diverstatonnements nous sommes arrivés à délimiter les zones approximatives de migra-

- 59 -

tian de ces substances dans les solvants organique et aqueux.

c. Substances non encore identifiées apparaissant sur les chromatogrammesréalisés à partir d'extraits de feuilles nécrosées: La formation de lésions

locales nécrotiques s'accompagne également d'une production importantede substances fluorescent en ultraviolet après exposition aux va-peurs ammolùacales, ou après pulvérisation d'une solution aqueuse à10 % de carbonate de sodium.

Les principaux composés appelés (S, T, V, W, X et Y) sont d'abord sé­parés par une chromatographie linéaire dans le butanol éthanol, puis subissentune dernière purification par une chromatographie bidimensionnelle dans le buta­nol éthanol et l'acide acétique à 2 %.

Les divers produits donnant une réaction positive avec le réactif deFolin-Ciocalteu, sont réductrice, et doivent posséder au moins un hydroxyle phé­nolique libre.

Le composé S s'isomérise dans un solvant aqueux en deux substances SIet S2 (SI~ Si), absorbe à 225m~ et 32Om~ dans l'ultraviolet, il n'est attaqué nipar la B-glucosidase ni par la soude. Les produits apparaissant dans les hydro­lysats acides n'ont pu être identifiés avec une grande certitude. Notons la gran­de mobilité du composé Sdans un solvant organique comme le butanol ammoniaque(migration similaire à celle observée pour la scopoline).

La substance T se transforme partiellement et d'une façon irréversibleen V. La réaction est spontanée et se produit d'une manière identi~que pour laconversion de V en W. Ces réactions interviennent également après hydrolyse aci­de ou enzymatique des produits.

Quant aux composés X et Y décelés sur les chromatogrammes il provien­nent d'une hydrolyse acide ou enzymatique (B-glucosidase) de W, et par conséquentdes substances T et V.

Le tableau XXI rassemble leurs Rf dans les solvants et leurs fluores­cences en ultraviolet ainsi que leurs colorations dans le visible après révéla­tion avec des réactifs comme la p-nitraniline et le nitrite de sodium.

Tableau XXI - Caractéristiques chromatographiquesde S, T, V, W, X et Y.

Rf x 100 dans les solvants Colorations

)ellation BEW BAW BAW BPW KFW BzAW NaF AAE UV+NH p-nitraniline Réactifd'Hoepfner

60 57,5 40..

45 33 60-82S - 58-80 Bleu - -T 65,5 55 - - - - 64 62 Bleu - -V 58,5 50 20 53 18,5 - 30 26 Bleu - -W 77 80 60 82 - 15 4,50 3 Bleu Bleu-gris OrangeX 81 81 74 85 - 47 35 50 Bleu Bleu-gris Orangey 85 84 82 85 - 26 44 56,50 Bleu Bleu-gris Orange

- 60 -

Les pos~t~ons des composés (8, T, V, W, X et Y) sur un chromatogrammeà deux dimensions dans le butanol éthanol et l'acide acétique à 2 %, sont illus­trées par la figure 23.

Les Rf des produits W, X et Y dans le benzène acétique et le formiatede sodium montrent que ces derniers correspondant aux composés 2,3,4,5, et 6identifiés dans les hydrolysats acides ou enzymatiques d'extraits initiaux defeuilles nécrosées à 20 Oc de Nicotiana xanthi n.c.

3.- Conclusions.

La formation de lésions locales nécrotiques s'accompagne d'une accumu­lation de flavonosides (rutine, nicotiflorine et isoquercitrine), d'acides chlo­rogéniques (acides caféyl-4 quinique, caféyl-5 quinique, caféyl-3 quinique), d'a­cide para-coumaryl-3 quinique, d'acides férulylquiniques tout particulièrementd'acide férulyl-3 quinique. Ces derniers composés ne sont qu'à l'état de tracesdans les Tabacs sains de la variété xanthi n.c. L'hypersensibilité se traduitpar la production de caféyl-I glucose, d'ortho-coumaryl-I glucose mais surtoutde férulyl-I glucose et de scopoline (glucoside-7 scopolétine). Elle conduit àla formation de substances renfermant du glucose et dont la partie phénoliqueest soit un acide benzoïque (acides vanillique, gentisique, para-hydroxybenzoï­que) soit un dérivé de l'acide cinnamique (acides sinapique, mélilotique et orthocoumarique). L'acide ortho-coumarique semble être présent dans les feuilles né­crosées sous la forme de l'ortho-coumaryl-I glucose, de l'ortho-coumaryl-I gen­tiobiose et du mélilotoside (B-glucoside de l'acide ortho-coumarique). La forma­tion des nécroses d'hypersensibilité fait également apparaître des phénols commela cichoriine (glucoside-7 esculétine), le férulyl-I gentiobiose, le gentiobio­side-7 scopolétine et des composés non encore identifiés mais présentant entreeux des analogies de structure, et qui possèdent certaines des propriétés des a­cides férulique et sinapique.

Les formules des principaux dérivés de l'acide quiniqueet du glucose,caractéristiques de l'infection virale à 20 Oc du Nicotiana tabacum variétéxanthi n.c, sont illustrées par le tableau XXII.

La figure 24 schématise un chromatogramme à deux dimensions dans lebutanol éthanol et l'acide acétique à 2 %, d'un extrait de feuilles de N.xanthin.c virosées à 20 oC, par le virus de la mosaïque du Tabac souche commune.

Nicotiana xanthi

pol Y p h é n 0 l sC - E t u d e des

N.C v i r 0 s é s à

dan s

30 Ocdes

par l 8

v i rus d e l a m 0 sai q u 8 d u T a bac .

L'infection du N.xanthi n.c à 30 Oc par le virus de la mosaïque duTabac souche coramune, conduit à une diminution importante des acides chlorogéni­ques et des flavonosides. Elle ne s'accompagne ni d'une accumulation des acidespara-coumaryl et férulylquiniques, ni de la production des dérivés faisant in­tervenir une ou plusieurs molécules de glucose et une molécule d'acide cinnami­que ou benzoïque apparaissant lors de la formation des nécroses d'hypersensibili­té. Les substances 8, T, V, W, X et Y dont les structures n'ont pu être détermi-

- 61 -

G

GG G

f spo~ de ~'~rl:-.FI G.~3_V1TE5SESDE MI()RATIOt~ DANS LE BUTANOl E'THANOL ~T L'ACIDE.

ACFTI OUE' A II % OES SUB5TAN Cf5 1N[ONNUE5 DEC[ LE ES DAN 5 onEXTRAITS DE fEUIllES \/IQOSFES A 20"C DE N.Xanthl n.c.

R

TABLEAU AXlL

FOR MULES DES PR\NCIPAUX DfF\IVE5 DE L'AC.\ DE <;lU 1NII;7UE ET DU 6LUC05E

':" ACCUMULAtiT DRN5 LES fEUillES VIROSEES A 2.0° Co DU NiC'otiana xanfhi o.c.

V dérivt?s de l'ac·lde qui nique

HO CH==CH-COO

R::: H - acide parël_coumaryL 3 qLliniquE'R :: OCH 3 aci de férulyL 3 quiniquQ

2) dérivés du gl u case~) coumari ne~

5

R == OH cichnriimz ou glucoside_7 esculetineI=? = OCH 3 scopoiine ou g\uco,!)ide -7 scopolétine

oCH-t OH

OH

(,

~--OCH~...

H

genl:iobioside -7 s;copofétine

b) d~rivé.s. de ,'acide c.innamique

H

CH~OH

OHR=-OCH 3 FÉrulyl_1 glucoseR :::. 0H_ caféyL 1 glucos;:

o. c:oul11ëlryL1 gluCOSE!

OH

OH

13. glucc~ide de l'ac.ide o.coumar·lque

OH

fi. g\ucDside de l'acide mé\ i loUque

CH~OH

OCHa

OH

__---'~ F~ rulyl_ 1 gEnflobios"O-CO-CH==: CH

r-----OCH~

OH

OH

C) dérIvés da l' .a1c.ide benzoïque

o CüOH

R:: H.ft - g\uco5",de de \'adde p.hydroxy0l:!nzoïl

R= OCI1 3°1'. gluco!;ld\? de ('acide vanilliqul!

OH

LEGENDE

en pointillé': dérivés- d2 l'e>cide cinnamique.en hachuré: Flavonosides

A atide c.aféyl_S QUlnlQue ou néochlorogéniqueB ,;)cide caF élJL4 qU"1n ique ou ->ban de 510"

c : acide c:aFéyl_ '3 qUlnlQue ou chlorogénique0": acidE' férul~l_ 5 qui niqu e'

0.1: ë)cide férulyl_4 qUlnlque

D :ëJcide férutyl_5 quiniqul:?o :l3cid~ Férui~I_3' qUlnlqul?E : Cll:ide para_ c.oumaryl_ 3 qUlnique

M ": caféyl _ 1 gluCOSE?G : férulyl- 1 glucose1 : ortho_ cQumary 1_1 glucos e

H : f~rul'Yf_1 genHDbios2

J : Drl:ho_ cDumaryl_1 gentiobioseK : j3.qluc.oside de l'acide ortho_coumarique.L =;3.glucoside de l'ac.ide mélilot"lqueN : glucoside _ 7 scopolétin2' ou scopoline.p : gfutoside_7 I?sc:ulétine ou cil:hor'line

o : gentiobias"lde -7 scapatétineol\J :fj- g\ucosidlZ de Vdcide vanÎ !liqueR : glucoside de ['acide gent.isiquliF1 : rhamncglu cos ide _:5 que rcéc·\ ne ou rut ineri : rhômhDglucos i dl2 _ 3 kaem pférol ou "nÎcotifl orin e

F3 : monog\ucoside - 3 qUl?rcétine cu isoquercitrine

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - -- - ---

(@"'i':d" '.':~::

gG8

1

Î 01spoE:. 00 d~t-.

,p-'p..~ ---------=;>-~

Flû.24-.CHROMAT0l3RAMME A DEUX DtMENSI ONS (BUTANDL ÉTHANOL - AriDE ActTq

A 2 %) D'UN EXTRAIT DE r:'EUILlES VIROSÉES A 20°C DE Nlcotiaha Yanl

(x. V. M T. 1DB h à !.o· c) n.

nées, ne sont jamais décelées sur les chromatogrammes d'extraits de feuilles v~­

rosées à 30 Oc de N.xanthi n.c.

0 - E v 0 l u t i 0 n q u a l i t a t i v 8 d 8 S C o m p 0 s é s

P h é n 0 l i q U 8 S d a n s l 8 S f 8 U i l l 8 S i n 0 c U ...l é 8 S d 8 Nicotiana xanthi n.c s 0 u m i s à d 8 S

t r a n s f 8 r t s t h 8 r m i q U 8 S .

1.- Transfert thermique d? 20 Oc à 30 oC.

Nous avons constaté que lorsque des feuilles nécrosées sont soumisesà un transfert thermique de 20 Oc à 30 Oc ce qui permet la généralisation du vi­rus, il y a une baisse énorme des acides caféyl, para-coumaryl, férulylquiniquesde tous les flavonosides, et une disparition brutale des substances comme lascopoline, le férulyl-] glucose, l'ortho-coumaryl-l glucose, le férulyl-l gentio­biose, le gentiobioside-7 scopolétine, le caféyl-l glucose, l'ortho-coumaryl-lgentiobiose et de tous les glucosides renfermant un acide-phénol. Les produitsS, T, V, W, X et Y disparaissent progressivement au cours du séjour à 30 oC.

2.- Transfert thermique de 30 Oc à 20 oC.

si la plante est inoculée à 30 oC, laissée 36 heures ou 48 heures àcette température puis transférée à 20 oC, nous voyons apparaître des lésionslocales de 5 à 6 mm sur la feuille inoculée. Les Tabacs sont alors capables d'ac­cumuler les acides chlorogéniques, para-coumaryl et férulylquiniques, les flavo­nosides, et de synthétiser les nombreuses substances caractéristiques de l'hyper­sensibilité (glucosides et esters du glucose. de.s dérivés des acides cinnamiqueet benzoique).

E - E t u d 8 d 8 S c 0 m p 0 S é s P h é n 0 l i q U 8 a dan s.

d 8 S f 8 U i l l 8 S v i r 0 S é 8 S d 8 Nicotiana tabacwn

var i été samsun.

Comme MARTIN (90) l'avait déjà souligné, l'infection de cette varié­té de Tabac par le virus de la mosaique du Tabac, se traduit par une augmenta­tion des teneurs en acides chlorogéniques et à un moindre degré en scopoline.

L'infection virale s'accompagne également d'une accumulation de tousles flavonosides (rutine, nicotiflorine, isoquercitrine) et de l'acide para­coumaryl-3 quinique.

Nous n'avons jamais observé sur les chromatogrammes d'extraits defeuilles virosées de Nicotiana samsun, la présence des nombreuses substancescaractéristiques des nécroses d'hypersensibilité à 20 Oc du Nicotiana xanthin.c.

- 62 -

La figure 25 représente un chromatogramme réalisé à partir d'un ex­trait de feuilles virosées de Nicotiana tabacum variété samsun.

II - DISCUSSION.INI'ERPREI'ATlOO DES RESULTATS.

Il apparaît à la suite de ces exper~ences que, d'une part la multi­plication du virus, d'autre part la température, affectent le rnétabo1isme desphénols dans les feuilles de Nicotiana xanthi n.c. Une température de 30 Oc enmême temps qu'elle supprime la résistance d'un hôte hypersensible inhibe la syn­thèse des composés phéno1iques.

A l'examen des résultats, il nous semble également que le métabolismedes composés phéno1iques dans un N.santhi n.c virosé à 30 Oc est différent decelui existant dans un Nicotiana samsun inoculé avec le virus de la mosaique duTabac. Ces deux Tabacs pourraient réagir différenment à l'égard du virus dans lecas d'une infection systémique. Les observations cytologiques faites à l'aidedu microscope électronique (123) montrent que l'infection à 32 Oc d'un Tabac hy­persensible semblent provoquer des altérations cytologiques comparables, maisavec deux différences : le Nicotiana tabacum xanthi n.c renferme plus de virionsintranucléaires et les altérations des noyaux des jeunes feuilles infectées sontmoins durables que chez le Tabac de la variété samsun. La multiplication viralepourrait être plus importante dans le cas du Nicotiana xanthi n.c virosé à 30 Ocpar voie de conséquence l'utilisation des système métaboliques de l'hôte, cequi entraînerait une accumulation moindre en phénols.

Les perturbations qui interviennent dans les diverses étapes de lasynthèse aromatique doivent être plus importantes dans les feuilles infectéesà 20 Oc d'un Nicotiana xanthi n.c que dans celles d'un Nicotiana samsun, puis­qu'elles se traduisent dans les premières par l'accumulation et la productionde substances jamais décelées dans les feuilles virosées d'un Tabac de la varié­té samsun.

La biogénèse des composés aromatiques apparaissant comme fortementstimulée durant la réaction d'hypersensibilité du Nicotiana tabacum variété xan­thi n.c à l'égard du virus de la mosaique du Tabac, il est indispensable de ré­sumer brièvement cette voie biosynthétique. D'abord élucidée par DAVIS dans lesmicro-organismes (36) puis établi chez les végétaux supérieurs (50,51,52) elles'est révélée être identique dans les deux cas et à permis de mettre en évidencele rôle fondamental des sucres dans l'élaboration du noyau aromatique.

Les substances phéno1iques peuvent provenir de la dégradation du glu­cose par deux voies: celle de l'acide shikimique, celle de l'acétate. La plusimportante paraît être celle de l'acide shikimique. Elle tire son origine de lacondensation d'un composé à 4 atomes de carbone appartenant au cycle oxydatif desphospho-pentoses (érythrose-4 phosphate) et d'une unité à 3 atomes de carbone

- 63 -

---'-,-,--'_._-------_.- --'---- -- - -- - -- - "- - - - -~--,_._.,----- - -- - - - - -

1

1]

~...

::~W'."". ~'.'..

l:--~ 01lspd:. de. &hdrt:

FIG.25.C.HROMATOGRAMME' BIDIMENS!DNNEl (bUTANOL E·!1·1ANOt._ .c, .. p·.'.

ACETlOUE A 20/.) D'UN EXTRAIT DE FEUILLEeS VIRDSEES DEN/coéiana SatnstJn

Erylhrose-4- P

Acide cél:o-~

désoxY-3 phO~phO-7 glucoheptonic

t___~ ~Q::H(, ." H

0"'" H'OHA 'cl ..J~h d6H ..CI e Ut:. y 1\)-5 qum'qu~

liOOH

~OOH

-o-P ------------......H:ù

G\ucose NF\OPH~ TABLEAU XXflL NADPt-l~

t NADP~ NADPG\ucose-S-P '- ~6-P-~lvconolactone._--?>Acide 6-P-~luconique.- -~~I:,-__-7'"Pen\:.o:

l ~-G.~Rah., 6'.p_~~énabe. J.~ck~~l'\.o.-.>""

Frud.ose-6-P

At~P..Qno\ pyruvique.

lAcide

pyrwique.

l.AciEyl-Co A }

1 ~Acide~Maltnyl-Co A .. benzoïques

Acide'Ohydrollycinnamiques. ,..Li~nine,

cO\Jn,,~,Jes ~Acid% benwïqu<>s

NHt.1

CH~..-CH-c.oOH CHa,-CO-eOOH

O~OPhènylalanine Acide

phènylpyruvique

Acide':) H v H~

benzoïgue~ !H~ O~:CH

Ac.ide déhydro-5 shikimiqueNADPH~-.jt

NADP~Ieoot{

~fA>~~~~pHo~J~ cH~

J...Acide shikimiqœ ~cide. pho~?

\ €no\pynJVI~\

V

J?OH Jt~~ COOH'c/

Hy: )rHHC'c~H, dH

Acide préphéniqLleVOIES BIOSVNTHETICU E. S PROBA BLES CON DUI5ANT AUX COMPOSES

PHENOllQU~S t:HEZ LE.S VEGETAUX SUPERIEUR~

CH=CH-COOH

O~~----Acide.­

cinn;;lmique.

Flavonoïcles.

formée à partir de la voie glyco1ytique (acide phospho-éno1pyruvique) (50,51,152). Il Y a formation de l'acide déhydroshikimique qui est réduit en acide shi­kimique. Par divers intermédiaires dont l'acide préphénique (voir tableau XXIII)l'acide shikimique donne la phénylalanine (52, 94). Par désarnination de ce subs­trat (83), il y a formation des nombreux acides hydroxycinnamiques (95,98,111,119,120), du noyau B et des atomes de carbone de l'hétérocyc1e central des f1a­vonoïdes (29,56,57,58,137). La voie acétate interviendrait pour fournir le noyauA des f1avonoïdes (17,56,138) et pour la synthèse de certains acides benzoïques.Il y aurait utilisation de l'acéty1-coenzyme A et du ma1ony1-coenzyme A commeintermédiaires. Dans ce cas, la synthèse des phénols rappe1erait celle des acidesgras. Les coumarines dérivent des acides cinnamiques par cyc1isation d'un méta­bolite intermédiaire possédant un hydroxyle situé en position ortho de la chainecarbonée (6,21,22,23,131,132). La plupart de ces auteurs ont montré que les cou­marines sont synthétisés sous forme de glucosides, et que les produits hydroxy­cinnamiques, intermédiaires dans leurs biosynthèses, existent sous forme de glu­cosides de phénols.

Ainsi, les différentes réactions conduisant à la formation de la scopo­1ine (glucoside-7 scopo1étine) dans les feuilles de Tabacs de la variété Hicks(132) sont résumées par le schéma suivant:

- 64 -

mél:hy\at'Ion glucos-.Fica~ion

\-\o~"COO~>CH'O~,COOl<1;'O~" COOH~yla\anine, ..,~ I/:I./. 1~

He HO R-O1 lI. lIt

t- hydroxlJlat ion

R=glucose~ trans _ c:is~ isomèris~tion

CH~O:rcol' "

R-o .....:: 0 ..:0"V

lac.;de ca Fi ique liacide f~ru lique m ëH: ide tral1i_ 91 ucos'ldnFpru liquel'Sl acide crans. hydro"y_2,glucosl?_4- / mé.~hD'X~_5 / cinnamlqueV sc.opDline /"ill ~co po IGl: ine .

Le processus de formation de la scopolétine dans des tissus de Tabaccultivés in vitro et proposé par FRITIG (49) est différent du précédent. Pource dernier, la synthèse préalable et rapide de la scopolétine exclut l'interven­tion d'un glucoside intermédiaire comme l'acide trans-glucosido-férulique, Lascopoline proviendrait de la glucosidification de la scopolétine libre, D'autrepart, la méthylation précède la cyclisation et doit se faire lorsque les substi­tuants sur le noyau aromatique sont en place,

Les feuilles et les tissus de Tabac cultivé in vitro peuvent avoirpour la scopoline des voies biosynthétiques différentes.

Les acides benzoïques pourraient être également synthétisés à partir del'acide shikimique ou provenir d'une B-oxydation des acides cinnamiques corres­pondants (9).

- 65 -

La stimulation de la biosynthèse des composés phénoliques dans lesfeuilles nécrosées de Nicotiana tabacum variété xanthi n.c se présente surtoutcomme l'activation des réactions de glucosidification) de méthylation et ortho­hydroxylation.

l'infection virale à 20 Ocxanthi n.c est l'accumulationd'esters du glucose. Cet apportà des enzymes utilisant comme(34,149). De telles réactionsdésintoxication car l'adminis­leur rapide conversion en ces

Glucosidification Une des caractéristiques ded'un Tabac hypersensible de la variétéde phénols sous forme de glucosides etde glucose pourrait être réalisé grâce

glucose de l'uridine diphosphate glucoseêtre considérées comme des mécanismes dede phénols aux plantes saines) résulte endu glucose (18)63)117)118).

donneurpeuventtrationdérivés

Par ailleurs, il a été montré (116) que les esters du glucose commele cinnamyl-l glucose et le para-coumaryl-l glucose peuvent être considérés dansles feuilles de Nicotiana tabacum variété Delcrest comme des intermédiairesdans la biosynthèse des acides para-coumaryl et caféylquiniques. Ces dérivés duglucose sont plus facilement incorporés dans les depsides du quinique que lesacides libres (acides cinnamique,para-coumarique).

Méthylation: La formation des lésions locales nécrotiques s'accompagne égale­ment d'une stimulation des réactions de méthylation (production desdérivés de la scopolétine, des acides férulique sinapique et vanilli­que). Ce phénomène doit être la conséquence dé l'activation de la mé-

thyltransférase. Cet enzyme assurerait le transfert du groupement méthyle proba­blement sous forme de la S-adénosylméthionine (43,44)69,79,71).Les réactions de méthylation pourraient se dérouler de la manière suivante :

ATP 'fo Méthionin2..S-Ad~nosylméthionine+ Phosphate + Pyrophosphate

S_Adéna.ylmé~hianine... ArOHI.~L Adi?nasylhomory,tpÎno-tArOCH3

Mé thy/transférase.

AT P -= Adénosine tripho.sp hate

Ar :oN oyau benzénique

- 66 -

Ortho-hydroxylation: La présence de composés ortho-hydroxylés (acides ortho­coumarique, mélilotique) dans les feuilles nécrosées de Nicotianaxanthi n.c montre que l'hydroxylation de l'acide cinnamique peut sefaire également et exclusivement en position ortho de la chaîne car­bonée.

Les données relatives à la biosynthèse de ces substances (20,24,39,73,81) peuvent être résumées selon la séquence suivante

R=g/ucos.e

1lIII.

1 acide trans_cinnëlmOlque IIacide o_cDumariquE' ID" fi.glucoside de

l'acide D. cDumarique lSJ.fio g\uccs'Idt" de \'adde coumarom·,que

V iJcide cou marinique . VI coumarine VJIac.ide cis_c.innamique.

\œIdihydrocD.um.,rine lXacide méliJotique Xj3.glucoside dl'

l'acide mélilotique

- 67 -

Cette augmentation d'activité dans la synthèse des phénols, n'est qu'une conséquence de l'activation du cycle des phospho-pentoses, c'est-à-dire dela stimulation des enzymes appartenant à ce cycle, en particulier des deux dé­shydrogénases spécifiques (glucose-6 phosphate, 6-phosphogluconate déshydrogé­nase). Cette voie oxydative fournirait l'érythrose-4 phosphate et le NADPH2(nicotinamide adénine, dinucléotide phosphate) nécessaires à l'élaboration desnoyaux benzénique et indolique. Le coenzyme est nécessaire à la réduction del'acide déhydro-5 shikimique en acide shikimique et à la transformation de lacoumarine en dihydrocoumarine.

Si l'on considère les mécanismes contrôlant la biosynthèse des phénols,ceux-ci sont communs à toutes les voies biogénétiques et font intervenir deuxprocessus; d'abord la répression ou l'induction des systèmes enzymatiques, puisl'inhibition des activités enzymatiques par des métabolites de la chaîne biosyn­thétique. Dans ce dernier type de régulation, il y a intrication d'inhibitionssuccessives par des produits de la réaction (68,83,155) assurant une auto-régu­lation par un contrôle dit !là réaction" (feed-back control). L'accumulation denombreux phénols dans les tissus virosés à 20 Oc du N.xanthi n.c pourrait êtreprovoquée par la perte des propriétés régulatrices de ces enzymes allostériquesinvoqués dans leur chaîne biosynthétique.

- 68 -

Cha p ~ t r e 4

Nicotiana xanthi

LE VIRUS

EVOLUTION

TEMPS DES

QUANTITATIVE EN FONCTION DU

COMPOSES PHENOLIQUES DANS DES

N.C l N F E C TES A 20 Oc E T 30 Oc PAR

DE LA MOSAIQUE DU TABAC.

l - RESULTATS EXPERIMENTAUX.

Nous avons vu dans le chapitre précédent que l'hypersensibilité duNicotiana xanthi n.c à l'égard du virus de la mosaïque du Tabac souche commune,s'accompagne d'une accumulation de phénols, tout spécialement d'acide férulyl­3 quinique, et de la production de nombreux dérivés du glucose en particulierde férulyl-l glucose et de scopoline.

L'inhibition par la température de la réaction nécrotique d'hypersen­sibilité permettant au virus de se généraliser dans la plante hôte, se traduitégalement par la disparition de ces substances.

Les travaux entrepris dans le laboratoire ont montré que l'arrêt dela multiplication du virus à 20 Oc n'était pas dû comme on le croyait antérieu­rement à la formation d'une barrière de cellules mortes, mais bien à un arrêtdes processus métaboliques qui conduisent le~ cellules vivantes à produire denouveaux virions ; en plaçant les plantes à 30 Oc on lève donc ce pouvoir inhi­biteur de la multiplication virale.

Il nous a donc paru intéressant de rechercher les liens, s'il en exis­te, entre métabolisme des phénols, répression de la synthèse virale et tempéra­ture. Nous avons alors procédé en fonction du temps à une estimation quantita­tive des phénols totaux, puis à des dosages séparés des principaux phénols pu­rifiés par chromatographie sur papier (acide chlorogéniques, rutine et nicoti­florine, acide para-coumaryl-3 quinique, acide férulylquiniques, férulyl-l glu­cose, scopoline) dans les feuilles saines et virosées à 20 Oc et 30 Oc des Ta­bacs de la variété xanthi n.c.

Les méthodes expérimentales ont été décrites dans le chapitre deux.

- 69 -

Les résultats sont donnés en mg par 100 grammes de poids frais pourles phénols totaux, et en ~g par gramme de poids frais pour les diverses subs­tances séparées et purifiées par chromatographie. Enfin, précisons que nos ré­sultats sont également exprimés pour les phénols totaux, les acides chlorogé­niques et les flavonosides en % de la teneur du témoin.

Par exemple, pour l'acide chlorogénique nous aurons

teneur en acide chlorogénique de la plante maladex 100

teneur en acide chlorogénique de la plante sa~ne

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1.- Phénols totaux.

L'infection à 20 Oc du Nicotiana tabacum variété xanthi n.c par le vi­rus de la mosaïque du Tabac conduit à une augmentation des composés phénoliquestotaux (tableau XXIV, figures 26, 27). L'accroissement est considérable lors deséjours compris entre 60 heures et 120 heures à 20 oC. Ce phénomène diminue pro­gressivement et à partir d'un temps de 204 heures à 20 oC, les plantes sainestémoins renferment plus de phénols totaux que lés Tabacs infectés correspondants(136).

2.- Principaux phénols.

a. Acides chlorogéniques Comme nous le voyons (tableau XXV, figures 28, 29)les Tabacs virosés qui séjournent à 20 Oc entre 60 et 144 heures aprèsinoculation, ont des teneurs en acides chlorogéniques beaucoup plusélevées que les Tabacs sains correspondants (elles peuvent être plus

du double 108 heures après inoculation). A partir d'un temps de 168 heures à20 oC, l'augmentation est moins importante, et les mesures établies sur dès Ta­bacs récoltés en février 1968 ont montré que ces acides subissaierlt une certainediminution par rapport aux mêmes substances contenues dans les plantes sainestémoins.

b. Rutine, nicotiflorine: Les courbes enregistrées avec la rutine et la n~co­

florine (tableau XXVI et figures 30,31) sont similaires à celles éta­blies pour les acides chlorogéniques. L'accumulation est considérablepour des Tabacs ayant séjourné à 20 Oc entre 60 heures et 120 heures.

Les teneurs en ces flavonosides peuvent être le double 72 heures après inocula­tion dans les feuilles virosées à 20 Oc de N.xanthi n.c.

c. Acides para-coumaryl et férulylquiniques: Le Nicotiana xanthi 'n.c inoculéavec le virus de la mosaïque du Tabac, réagit à 20 oC, en accumulant

- 70 -

l'acide para-coumaryl-3 qu~n~que mais surtout les acides férulylquini­ques tout particulièrement l'acide férulyl-3 quinique.

Après examen des résultats rassemblés dans le tableau XXVII et illus­trés par la figure 32, la teneur en ce dernier acide paraît être maximale aucours d'un séjour de lOS heures à 20 Oc après inoculation (120 ~g par grammede poids frais), elle décroît ensuite tout en restant relativement élevée (70 ~g

par gramme de poids frais).

L'acide para-coumaryl-3 quinique semble surtout s'accumuler dans lesfeuilles nécrosées de Nicotiana xanthi n.c ayant séjourné à 20 Oc entre 60 etlOS heures après inoculation, puisqu'il atteint une teneur voisine de 100 ~g pargramme de poids frais (tableau XXVIII et figure 33).

d. Férulyl-l glucose et scopoline: Le férulyl-1 glucose et la scopoline nesont jamais détectés dans les extraits de feuilles saines de N.xanthin.c. Le férulylglucose commence à apparaître (tableau XXIX et figure34), dans les Tabacs virosés ayant passé 72 heures à 20 Oc après ino-

culation par le virus, c'est-à-dire lorsque les lésions locales sont très nette­ment apparentes. La scopoline est synthétisée un peu avant, car elle est identi­fiée dès 4S heures après l'inoculation (voir tableau XXX et figure 35).

La teneur en férulylglucose augmente régulièrement et est maximalepour des séjours à 20 Oc compris entre 120 et 156 heures (75 ~g par gramme depoids frais). Quant à la scopoline, son maximum semble être atteint dans uneplante malade ayant passé lOS heures à 20 Oc après inoculation (50 ~g par grammede poids frais).

- 71 -

EVOLUTION DES TENEURS EN PHENOLS TOTAUXET EN PRINCIPAUX PHENOLS AU COURS DE

L~INFECTION VIRALE A 20 Oc DUNicotiana xanthi n.c.

- Phénols totaux (tableau XXIV, figures 26 et 27) ;- Acides chIorogéniques (tableau XXV, figures 28 et 29) ;- Flavonosides (rutine, nicotiflorine) (tableau XXVI, figures 30 et 31)- Acides férulylquiniques (tableau XXVII, figure 32) ;- Acide para-coumarylquinique (tableau ~III, figure 33) ;- Férulyl-l glucose (tableau XXIX, figure 34) ;- Scopoline (tableau XXX, figure 35).

En trait plein

En pointillé

plantes saines • • février 1968, 0 0 avril 1968.

plantes virosées ~----Â février 1968,x-------x Avril 1968.

X.V.S.

X.V.M.T.

Nicotiana xanthi n.c, sain, à l'état gégétatif.

Nicotiana xanthi n.c, virosé, à l'état végétatif.

- 72 -

TABLEAU XXIV

Evolution des teneurs en phénols totaux au cours de l'infection viraleà 20 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en mg d'acide chlo­rogénique par 100 grammes de poids frais).

Février 1968 Avril 1968~

XVS - 24 h à 20 Oc 100 71 ,25XVMT - 24 h à 20 Oc 78,75 62,50

XVS - 30 h à 20 Oc 71,25XVMT - 30 h à 20 Oc 77 ,50

XVS - 36 h à 20 Oc 71,25XVMT - 36 h à 20 Oc 87,50

XVS - 48 h à 20 Oc 78,75 71,25XVNT - 48 h à 20 Oc 100 95

XVS - 54 h à 20 Oc 71,25XVMT- 54 h. à 20 Oc 100

XVS - 60 h à 20 Oc 93,75 71 ,25XVl1T - 60 h à 20 Oc 150 100

XVS - 66 h à 20 Oc 71,25XVMT- 66 h à 20 Oc 100

XVS - 72h à 20 Oc 115 71 ,25XVMT - 72h à 20 Oc 153,75 107,50

XVS - 84 h à 20 Oc 95 75XVMT - 84 h à 20 Oc 132,50 115

XVS - 96 h à 20 Oc 93,75 75XVMT - 96 h à 20 Oc 128,75 115

XVS - 108 h à 20 Oc 86,25 75XVMT - 108 h à 20 Oc 128,75 118,75

XVS - 120 h à 20 Oc 93,75 71 ,25XVMT - 120 h à 20 Oc 128,75 107,50

XVS - 132 h à 20 Oc 93,75 71 ,25XVMT- 132 h à 20 Oc 118,75 100

XVS - 144 h à 20 Oc 78,75 71,25XVMT - 144 h à 20 Oc 102,50 90

XVS - 156 h à 20 Oc 78,75 75XVMT- 156 h à 20 Oc 90 90

XVS - 168 h à 20 Oc 75XVMT- 168 h à 20 Oc 90

- 73 -

(suite du tableau XXIV)

xvs - 180 h à 20 Oc 107,50 75XVMT- 180 h à 20 Oc 118,75 87,50

XVS - 192 h à 20 Oc 90 75XVMT - 192 h à 20 Oc 93,75 80

XVS - 204 h à 20 Oc 75XVMT- 204 h à 20 Oc 65

XVS - 216 h à 20 Oc 107,50 75XVMT- 216 h à 20 Oc 71,25 67,50

- 74 -

Pheno\s totaux

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FIC·2.7 TENEUR EN PHENOLS TOTAUX DES Tl;'SU.s MALADE'S/ EXPRIMEE

EN POUCENTAGE DE LA TENEUR DU TEMOIN.

TABLEAU XXV

Evolution des teneurs en acides chlorogéniques au cours de l'infectionvirale à 20 Oc deNicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en ~g pargramme de poids frais).

Février 1968 Avril 1968

XVS - 24 h à 20 Oc 145 100XVMT - 24 h à 20 Oc 107,50 85

XVS - 30 H à 20 Oc 95XVMT - 30 h à 20 Oc 120

XVS - 36 h à 20 Oc 95XVMT - 36 h à 20 Oc 125

XVS - 48 h à 20 Oc 150 95XVMT - 48 h à 20 Oc 215 137,50

XVS - 54 h à 20 Oc 100XVMT- 54 h à 20 Oc 150

XVS - 60 h à 20 Oc 165 95XVMT - 60 h à 20 Oc 320 170

XVS - 66 h à 20 Oc 95XVMT - 66 h à 20 Oc 185

XVS - 72h à 20 Oc 200 95XVMT - 72h à 20 Oc 350 207,50

XVS - 84 h à 20 Oc 130 100XVMT- 84 h à 20 Oc 292,50 232,50 _

XVS - 96 h à 20 Oc 130 95XVMT - 96 h à 20 Oc 270 215

XVS - 108 h à 20 Oc 145 100XVMT- 108 h à 20 Oc 300 250

XVS - 120-h à 20 Oc 122,50 95XVMT - 120 h à 20 Oc 230 215

XVS - 132 h à 20 Oc 115 100XVMT- 132 h à 20 Oc 200 192,50

XVS - 144 h à 20 Oc 100 100XVMT - 144 h à 20 Oc 165 180

XVS - 156 h. à 20 Oc 130 100XVMT- 156 h à 20 Oc 180 150

XVS - 168 h à 20 Oc 100XVMT- 168 h à 20 Oc 130

XVS - 180 h à 20 Oc 130 100XVMT- 180 h à 10 Oc 115 122,50

- 75 -

(suite du tableau XXV)

xvs - 192 h à 20 Oc 122,50 95XVMT- 192 h à 20 Oc 100 120

XVS - 204 h à 20 Oc 95XVMT - 204 h à 20 Oc 115

XVS - 216 h à 20 Oc 122,50 95XVMT - 216 h à 20 Oc 87,50 107,50

- 76 -

9 En fL9 1 9 de poids frai~

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FIG. 29 TENEUR EN ACIDES CHLDR06ENIQUES DE.S il55U5 MALADE~

EXPRIMEE E.N POURCENTAGE DE LA TENEUR DU TEMOIN.

TABLEAU XXVI

Evolution des teneurs en rutine et nicotiflorine au cours de l'infectionvirale à 20 Oc du" Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en Vg par gram­me de poids frais).

Février 1968 Avril 1968

xvs - 24 h à 20 Oc 68,75 46,25XVMT - 24 h à 20 Oc 46,25 35

xvs - 30 h à 20 Oc 43,75XVMT - 30 h à 20 Oc 48,75

XVS - 36 h à 20 Oc 43,75XVMT - 36 h à 20 Oc 48,75

xvs - 48 h à 20 Oc 53,75 41,25XVMT - 48 h à 20 Oc 75 57,50

XVS - 54 h à 20 Oc 43,75XVMT - 54 h à 20 Oc 71 ,25

XVS - 60 h à 20 Oc 62,50 41,25XVMT - 60 h à 20 Oc 107,50 80

XVS - 66 h à 20 Oc 41,25XVMT- 66 h à 20 Oc 80

XVS - 72h à 20 Oc 90 . 43,75XVMT - 72h à 20 Oc 213,75 90

xvs - 84 h à 20 Oc 62,50 43,75XVMT- 84 h à 20 Oc 151 ,25 98,75

XVS - 96 h à 20 Oc 62,50 43,75XVMT- 96 h 0 20 Oc 151 ,25 90

XVS - 108 h à 20 Oc 57,50 43,75XVMT - 108 h à 20 Oc 151 ,25 102,50

XVS - 120 h à 20 Oc 53,75 43,75XVMT- 120 h à 20 Oc 90 80

XVS - 132 h à 20 Oc 53,75 43,75XVMT- 132 h à 20 Oc 85 71 ,25

XVS - 144 h à 20 Oc 53,75 43,75XVMT - 144 h à 20 Oc 75 71 ,25

XVS - 156 h à 20 Oc 48,75 46,25XVMT - 156 h à 20 Oc 62,50 73,76

XVS - 168 h à 20 Oc 43,75XVMT - 168 h à 20 Oc 53,75

- 77 -

(suite du tableau XXVI)

xvs - 180 II à 20 Oc 48,75 43,75XVMT - 180 hà 20 Oc 53,75 48,75

xvs - 192 II à 20 Oc 53,75 43,75XVMT - 192 II à 20 Oc 50 48,75

xvs - 204 h à 20 Oc 43,75XVMT - 204 h à 20 Oc 48,75

XVs - 216 h à 20 Oc 57,50 43,75XVMT - 216 h à 20 Oc 46,25 43,75

78 -

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EVOLUTION DES TENEUR.~ EN RUT1NE ET NICOTIFLDR\NE" DE

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FIC:; • 31 TENEUR EN RUTINE ET EN NICOT1'flORtNE DES "15SU~

MALADE~, E"PRIMEE EN POURCENTAC:>E DE LA TENEUR OU TEMOIN

TABLEAU XXVII

Evolution des teneurs en acides férulylquiniques au cours de l'in­fection virale à 20 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs expriméesen ~g par gramme de poids frais).

Février 1968 Avril 1968

xvs - 24 h à 20 Oc 7,50 10XVMT - 24 h à 20 Oc 25 23,75

xvs - 30 h à 20 Oc 10XVMT- 30 h à 20 Oc 40

xvs - 36 h à 20 Oc 10XVMT - 36 h à 20 Oc 40

xvs - 48 h à 20 Oc 10 10XVMT - 48 h à 20 Oc 55 53,75

xvs - 54 h à 20 Oc 10XVMT - 54 h à 20 Oc 63,75

xvs - 60 h à 20 Oc 10 10XVMT- 60 h à 20 Oc 70 n,50

xvs - 66 IL à 20 Oc 10XVHT - 66 h à 20 Oc n,50

xvs - 12 h à 20 Oc 10 10XVMT - 12 h à 20 Oc 80 82,50

xvs - 84 h à 2.0 Oc 10 10XVMT- 84 h à 20 Oc 80 87,50

xvs - 96 h à 20 Oc 10 10XVMT- 96 h à 20 Oc 85 87,50

xvs - 108 h à 20 Oc 10 10XVMT- 108 h à 20 Oc 120 110

xvs - 120 h à 20 Oc 10 10XVHT - 120 h à 20 Oc 90 92,50

xvs - 132 h à 20 Oc 10 10XVMT - D2 h à 20 Oc 73,75 92,50

xvs - 144 h à 20 Oc 10 10XVMT - 144 h à 20 Oc 70 92,50

xvs - 156 h à 20 Oc 10 10XVMT - 156 h à 20 Oc 67,50 82,50

XVS - 168 h à 20 Oc 10XVMT - 168 h à 20 Oc 82,50

- 79 -

(suite du tableau XXVII)

xvs - 180 h à 20 Oc 13,75 10XVMT- 180 h à 20 Oc 62,50 77,75

XVS - 192 h à 20 Oc 10XVMT- 192 h à 20 Oc 77 ,50

XVS - 204 h à 20 Oc 10XVMT - 204 h à 20 Oc 77 ,50

XVS - 216 h à 20 Oc 13,75 10XVMT - 216 h à 20 Oc 62,50 77 ,50

- 80 -

Ac i des ~ru l ':} Iqu'miques

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apparitiol1 m;acro5cDpique de la nÉcrQs;e

~IG.32, EVOLUTION DES TENEURS EN ACIDES FERULY1.QUINIÇUES

AU COURS DE L'INFECTION VIRALE A 2.0·' DUN/"Cocian~ J(.;>nthin.cPPtR LE' '1IRUS OE LA MOSA/'OUE DU rABAC

TABLEAU XXVIII

Evàlution des teneurs en acide para-coumarylquinique au cours de l'in­fection virale à 20 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en ~g

par gramme de poids frais).

Février 1968 Avril 1968

xvs - 24 hà 20 Oc 7,50 12,50XVMT - 24 hà 20 Oc 27,50 22,50

XVS - 30 h à 20 Oc 12,50XVMT - 30 h à 20 Oc 31,25

XVS - 36 h à 20 Oc 12,50XVMT - 36 h à 20 Oc 50

XVS - 48 h à 20 Oc 10 12,50XVMT - 48 h à 20 Oc 63,75 65

XVS - 54 h à 20 Oc 12,50

lfVMT - 54 h à 20 Oc 76,25'1

XVS - 60 h à 20 Oc 10 12,50XVMT - 60 h à 20 Oc 81,25 82,50

XVS - 72 h à 20 Oc 10 12,50XVMT - 72 h à 20 Oc 93,75 100

XVS - 84 h à 20 Oc 10 12,50XVMT - 84 h à 20 Oc 81,25 100

XVS - 96 hà 20 Oc 10 12,50XVMT - 96 h à 20 Oc 75 100

XVS - 108 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT - 108 h à 20 Oc 81,25 106,25

XVS - 120 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT - 120 h à 20 Oc 63,75 88,75

XVS - 132 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT - 132 h à 20 Oc 57,50 76,25

XVS - 144 h à 20 Oc 10 12,50XVMT - 144 h à 20 Oc 57,50 76,25

XVS - 156 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT- 156 h à 20 Oc 52,50 76,25

XVS - 168 h à 20 Oc 12,50XVMT - 168 h à 20 Oc 70

XVS - 180 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT - 180 h à 20 Oc 52,50 70

~ 81 -

(suite du tableau XXVIII)

xvs - 192 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT - 192 h à 20 Oc 46,25 65

XVS - 204 h à 20 Oc 12,50XVMT - 204 h à 20 Oc 65

XVS - 216 h à 20 Oc 13,75 12,50XVMT - 216 h à 20 Oc 46,25 65

- 82 -

· Acide p_coumar~/_3 qUlnlquE.

Qen )J- 9 tg de poid, frais

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96724Bf~ iapp arÎ bon mac.roscoplque de \a nécrose

EVOLUTION DES TE'NEUR5 EN ACIDE PARA._COUMARYL_3 ÇUIN\QUEAU [OURS DE L'INFECTION VIRALE A 2..0o C DU Nicot.iana xant.hin.

e

PAR LE V/RU':! DE LA MOSA\QUE DU TABAC

TABLEAU XXIX

Evolution des teneurs en férulylglucose au cours de l'infection viraleà 20 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en ~g par gramme depoids frais) .

Février 1968 Avril 1968

XVS - 24 h à 20 OcXVJ.vIT - 24 h à 20 Oc

XVS - 48 h à 20 OcXVMT - 48 h à 20 Oc

XVS - 60 h à 20 OcXVMT - 60 h à 20 Oc 10

XVS - 72h à 20 OcXVMT - 72h à 20 Oc 25 25

XVS - 84 h à 20 OcXVJ.vlT - 84 h à 20 Oc 37,50 40

XVS - 96 h à 20 OcXVMT - 96 h à 20 Oc 43,75 56,25

XVS - 108 h à 20 OcXVHT - 108 h à 20 Oc 52,50 68,75

XVS - 120 h à 20 OcXVMT - 120 h à 20 Oc 62,50 72,50

XVS - 132 h à 20 OcXVMT - 132 h à 20 Oc 67,50 72,50

XVS - 144 h à 20 OcXVMT - 144 h à 20 Oc 70 72,50

XVS - 156 h à 20 OcXVMT - 156 h à 20 Oc 75 68,75

XVS - 168 h à 20 OcXVMT - 168 h à 20 Oc 62,50

XVS - 180 h à 20 OcXVMT - 180 h à 20 Oc 62,50 58,75

XVS - 192 h à 20 OcXVMT - 192 h à 20 Oc 62,50 56,25

XVS - 216 h à 20 OcXVMT - 216 h à 20 Oc 52,50 56,25

-,83 -

Q~n f-S/g de. poids frais

50

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apparition macroscopiquE de la nécrose

1

144 168 1~2. 216

te.mps Q. n heures à 20° C.

FIB.34 EVOLUTION DES TENEURS EN FERULYL _1 GLUCOSEAU COURS DE L'INFECTION VIRALE A.2DoC DUNicot/ana ){anCh/n.e.. PAR lEVIRUS DELAMD5AïoUEDU TABAC. •

TABLEAU XXX

Evolution des teneurs en scopoline au cours de l'infection viraleà 20 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en ~g par grammede poids frais).

Avril 1968

xvs - 36 h à 20 OcXVMT - 36 h à 20 Ocxvs - 48 h à 20 OcXVMT - 48 h à 20 Oc 13,75

xvs - 54 h à 20 OcXVMT - 54 h à 20 Oc 15

xvs - 60 h à 20 OcXVMT - : 60 h à 20 Oc 17,50

xvs - 66 h à 20 OcXVMT - 66 h à 20 Oc 20

xvs - 72h à 20 OcXVMT- 72h à 20 Oc 25

xvs - 84 h à 20 OcXVMT - 84 h à 20 Oc 35

xvs - 96 h à 20 OcXVMT - 96 h à 20 Oc 35

xvs - 108 h à 20 OcXVMT - 108 h à 20 Oc 47,50

xvs - 120 h à 20 OcXVMT - 120 h à 20 Oc 45

xvs - 132 h à 20 OcXVMT - 132 h à 20 Oc 45

xvs - 144 h à 20 OcXVMT - 144 h à 20 Oc 45

xvs - 156 h à 20 OcXVMT- 156 h à 20 Oc 37,50

xvs - 168 h à 20 OcXVMT - 168 h à 20 Oc 35

xvs - 180 h à 20 OcXVMT - 180 h à 20 Oc 32,50

xvs - 192 h à 20 OcXVMT - 192 h à 20 Oc 32,50

- 84 -

(suite du tableau XXX)

XVS 204 h à 20 OcXVMT - 204 h à 20 OcXVS 216 h à. 20 OcXVMT - 216 h à 20 Oc

- 85 -

32,50

32,50

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apparition macroscoplqul1 e a necrose

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te.mps e.n heures; ~ 20"'c

EVOLUTION DE.S TENEURS eN S(OPDL~ï/NE' AU COURS DE L'INfECTIONVIRALE A 2.0'" Co DU NI'coL"iana ;XéJncni n.c.. PAR LE V/RUS DE..LA MQSA/DUE DU TABAC..

3.- Conclusions.

L'accumulation et la production de composés phénoliques dans les feuil­les des Tabacs de la variété xanthi n.c virosées à 20 Oc par le virus de la mo­saïque du Tabac souclle commune semblent être postérieures, à l'apparition de lanécrose. Celle-ci commence à apparaître dès 36 heures après inoculation dans nosconditions expérimentales. Les différences à 20 Oc entre plantes saines et mala­des deviennent importantes quand les symptômes sont nettement apparents, c'est­à-dire quand la synthèse du virus est pratiquement achevée, et que l'hypersensi­bilité est acquise. Ces variations maximales entre 60 heures et 156 heures ten­dent ensuite à s'estomper pour la plupart des composés phénoliques.

B - E v 0 l u t i o n d e 5 t 8 n e urs e n p h é n o l s

t o t a u x e t e n p r i n c i p a u x P h é n 0 l 5 a u

c o u r 5 d e l • i n f 8 C t i o n v i r a l e à 3D Ocd u Nicotiana xanthi n.c

1.- Phénols totaux.

Après exàmen des résultats résumés dans le tableau XXXI et illustréspar les figures 36, 37, 38 et 39, nous constatons que l'infection virale à 30 Ocdu N.tabacum variété xanthi n.c conduit à une importante diminution des teneursen phénols totaux. Cette réduction (de 10 à 30 %) est surtout observée dans desTabacs malades ayant séjourné à 30 Oc entre 36 heures et 156 heures après inocu­lation. Ce phénomène diminue progressivement, et, à partir d'un temps de 180heures à 30 oC, la plupart des plantes virosées ont des teneurs en phénols to­taux supérieures à celles des Tabacs témoins.

2.- Principaux phénols.

L'infection ne fait apparaître ni le férulyl-1 glucose ni la scopolineet ne s'accompagne pas de l'accumulation des acides para-coumaryl et férulylqui­niques.

Les courbes obtenues avec les acides chlorogéniques (tableau XXXII,figures 40, 41, 42, et 43) et les flavonosides (tableau XXXIII, figures 44,45,46, et 47) sont semblables, et mettent en évidence une diminution considérabledes teneurs en ces polyphénols dans les plantes malades lors de séjours à 30 Occompris entre 36 et 156 heures.

La baisse que nous observons pour les acides caféylquiniques dans unNicotiana xanthi n.c virosé à 30 Oc et ayant passé 72 heures à 30 Oc à cette tem­pérature après inoculation, atteint par rapport à la plante saine témoin une va­leur voisine de 40 %. Dans les mêmes conditions, la diminution que nous consta­tons pour les flavonosides est sensiblement de même ordre (30 à 40 %).

A partir d'un temps de séjour de 204 heures à 30 Oc après inoculationpar le virus, les Tabacs malades renferment des quantités d'acides chlorogéniques

- 86 -

et de flavonosides plus élevées que les plantes saines correspondantes (tauxd'augmentation pouvant atteindre 20 %).

Les dosages établis en mai 1969 ont également mis en évidence une cer­taine diminution des acides chlorogéniques mais surtout des flavonosides (rutineet nicotiflorine) dans les plantes saines témoins au cours d'un séjour à 30 oC.

87 -

EVOLUTION DES TENEURS EN PHENOLS TOTAUXET EN PRINCIPAUX PHENOLS AU COURS DE

L'INFECTION VIRALE A 30 Oc DUNicotiana xanthi n.c.

- Phénols totaux (tableau XXXI, figures 36,37,38 et 39) ;- Acides chI orogéniques (tableau XXXII, figures 40,41,42, et 43)- Flavonosides (tableau XXXIII, figures 44,45,46, et 47).

En trait plein

En pointillé

plantes saines. • mai 1969, 00 février 1970"

plantes virosées .À.-- .À. mai, 1969 )(-----xfévrier 1970

- 88 -

TABLEAU XXXI

Evolution des teneurs en phénols totaux au cours de l'infection viraleà 30 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en ~g d'acide chlo­rogénique par 100 grammes de poids frais).

Mai 1969 Février 1969

xvs - 30 h à 30 Oc 90XVMT - 30 h à 30 Oc 90

xvs - 36 h à 30 Oc 96,25 70XVHT - 36 h à 30 Oc 96,25 66,25

xvs - 48 h à 30 Oc 96,25 53,75XVMT - 48 h à 30 Oc 78,75 46,25

xvs - 54 h à 30 Oc 92,50 53,75XVHT- 54 h à 30 Oc 78,75 45

xvs - 60 h à 30 Oc 101 ,25 80XVHT - 60 h à 30 Oc 83,75 61,25

xvs - 72 h à 30 Oc 103,75 61,25XVMT - 72 h à 30 Oc 82,50 53,75

xvs - 84 h à 30 Oc 83,75 61,25XVHT- 84 h à 30 Oc 70 41,25

xvs - 96 h à 30 Oc 95 66,25XVMT - 96 h à 30 Oc 76,25 42,50

"xvs - 108 h à 30 Oc 87,50 75XVMT - 108 h à 30 Oc 57,50 55

xvs - 120 h à 30 Oc 85 66,25XVHT- 120 h à 30 Oc 67,50 53,75

xvs - 123 h à 30 Oc 96,25XVHT- 123 h à 30 Oc 71,25

xvs - 144 h à 30 Oc 87,50 71 ,25XVMT - 144 h à 30 Oc 82,50 58,75

xvs - 156 h à 30 Oc 82,50 75XVHT - 156 h à 30 Oc 82,50 63,75

xvs - 168 h à 30 Oc 83,75 53,75XVMT - 168 h à 30 Oc 90 53,75

xvs - 180 h à 30 Oc .91,25 70XVHT - 180 h à 30 Oc 103,75 58,75

xvs - 192 h à 30 Oc 82,50 61,25XVHT- 192 h à 30 Oc 98,75 80

- 89 -

(suite du tableau ~XI)

XVS - 204 h à 30 Oc 71 ,25 66XVMT - 204 h à 30 Oc 90 70

XVS - 216 h à 30 Oc 71 ,25 53,75XVMT - 216 h à 30 Oc 96.25 53.75

XVS - 240 h à 30 Oc 80XVMT - 240 h à 30 Oc 90

XVS - 288 h à 30 Oc 70XVMT - 288 h à 30 Oc 75

XVS - 336 h à 30 Oc 98,75 52,50XVMT - 336 h à 30 Oc 90 53,75

XVS - 384 h à 30 Oc 96,25 62,50XVMT - 384 h à 30 Oc 110 68

XVS - 408 h à 30 Oc 87,50XVMT - 408 h à 30 Oc 80

XVS - 432 h à 30 Oc 92.50XVMT - 432 h à 30 Oc 90

XVS - 456 h à 30 Oc 82,50 62,50XVMT - 456 h à 30 Oc 95 63,75

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phénols totaux

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Q en mgl10D 9 de poids frais

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temps en heures à 30°C.

FIG.36 EVOLUTION DE~ TENEURS rN PHENOL!) TOTAUX AU COURS DE L'INFEtTlON

VIRALE A 30° C DU Nicoêian;l Xélnthln~PAR LE" VIRUS DE LA MD5Aïlf}UE'

DU TABAC.

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~I G. 37 TENEUR FN PHENOLS TOTAU~ DES TISSUS MALADES EXPRIMEE

EN POURCENTA6E DE' LA TENEUR OU TEMOIN

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FIG.3S EVOLUTION DES TENEURS EN PHE NOL5 TO'Hm" AU COUBIi DE' L'INFECTIONVIRALE A .30" C DU N/t:()l"iana Xanrhi n.~. PAR. lE' VIRUS

DE LA MaSAI QUE' ou TABAl:..

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FIG.39 TENEUR EN PHENOLS TOTAUX DES TISSUS MALADES EXPRIMËE

EN POUR.CENTA&E DE LA ïENEUf.\ DU TEMDIN.

TABLEAU XXXII

Evolution des teneurs en acides chlorogéniques au cours de l'infectionvirale à 30 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en llg pargramme de poids frais).

Mai 1969 Février 1969

xvs - 30 h à 30 Oc 75XVMT - 30 h à 30 Oc 75

XVS - 36 h à 30 Oc 75 85XVMT- 36 h à 30 Oc 52,50 78,75

xvs - 48 h à 30 Oc 81,25 78,75XVMT - 48 h à 30 Oc 50 53,75

xvs - 54 h à 30 Oc 65 83,75XW'rr - 54 h à 30 Oc 43,75 55

XVS - 60 h à 30 Oc 65 75XVMT - 60 h à 30 Oc 43,75 42,50

xvs - 72 h à 30 Oc 61 ,25 87,75XVMT- 72 h à 30 Oc 40 50

XVS - 84 h à 30 Oc 57,50 75XVMT - 84 h à 30 Oc 41,25 50

XVS - 96 h à3Ù Oc 57,50 82,50XVMT - 96 h à 30 Oc 32,50 50

XVS - 108 h à 30 Oc 60 87,50XVMT - 108 ft à 30 Oc 33,75 58,75

xvs - 120 h à 30 Oc 56,25 66,25XVMT - 120 h à 30 Oc 37,50 50

XVS - 123 h à 30 Oc 57,50XVMT - 123 h_ à 30 Oc 28,75

XVS - 144 h à 30 Oc 46,25 75XVMT- 144 h à 30 Oc 37,50 50

XVS - 156 h à 30 Oc 56,25 82,50XVMT - 156 h à 30 Oc 52,50 60

XVS - 168 h à 30 Oc 50 83,75XVMT - 168 h_à 30 Oc 46,25 87,75

- OcXVS - 180 h à 30 48,75 71 ,25XVMT- 180 h à 30 Oc 46,25 55

XVS - 192 h à 30 Oc 50 71 ,25XVMT - 192 hà 30 Oc 60 85

- 91 -

(suite du tableau XXXII)

xvs - 204 h à 30 Oc 52,50 67,50XVMT - 204 h à 30 Oc 45 87,75

XVS - 216 h à 30 Oc 52,50 67,50XVMT - 216 h à 30 Oc 57,50 \02,50

XVS - 240 h à 30 Oc 45XVMT - 240 h à 30 Oc 52,50

XVS - 288 h à 30 Oc 57,50 71 ,25XVMT - 288 h à 30 Oc 57,50 87,75

XVS - 336 h à 30 Oc 46,25 67,50XVMT- 336 h à 30 Oc 56,25 85

XVS - 384 h à 30 Oc 46,25 71 ,25XVMT - 384 h à 30 Oc 53,75 82,50

XVS - 408 h à 30 Oc 45XVMT - 408 h à 30 Oc 53,75

XVS - 432 h à 30 Oc 50XVMT - 432 h à 30 Oc 60

xvs - 456 h à 30 Oc 57,50 76,25XVMT - 456 h à 30 Oc 60 87,75

- 92 -

Acides chlorogéniquesde poi ds f rai'iQ en

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FIG.+O EVOLUTION OES TENEURS EN ACIDES CHLOrOGENIQUES P.U COURSDE L'INFECT/ON VIRALE' A 30°C. DU N/collana Xanthi n.c. ...PAR LE' VIRUS DE LA MOSA/QUE" DU TA6AC.

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FIG.41.TENEUR EN ACIDES CHLDROGENIOUES DES il5Stl5 MALADE.SEXPRIMEE EN POURCENTAGE DE' LA TE'NE'UR DU TEMDIN

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EVOLUTION DES TENEURS EN ACIDES CHLDRDGENIDUES AU COllR':> DEL' INt='E'CTIDN VIRAl~ A 3D" C DU N/cofJùnêl :Xanthi n.c'. PAR

LE VIRUS DE LA MOSAïQUE:. DU TABAC.

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FI G. 43

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TENEUR E.N ACIDES CHLOROGENIÇ.>UE.5 DES TISSUS MALADf5

EXPRIMEE EN POURC.ENTAGE DE LA TE.NEUR DU TE'MOIN.

TABLEAU XXXIII

Evolution des teneurs en rutine et nicotiflorine au cours de l'infec­tion virale à 30 Oc du Nicotiana xanthi n.c (teneurs exprimées en ~g

par gramme de poids frais).

Mai 1969 Février 1969

xvs - 30 h à 30 Oc 75XVMT- 30 h à 30 Oc 75

xvs - 36 h à 30 Oc 82,50 45XVMT- 36 h à 30 Oc 63,75 30

xvs - 48 h à 30 Oc 78,75 43,75XVMT - 48 h à 30 Oc 53,75 37,50

xvs - 54 h à 30 Oc 67,50 40XVMT- 54 h à 30 Oc 43,75 30

xvs - 60 h à 30 Oc 67,50 38,75XVMT - 60 h à 30 Oc 36,25 30

xvs - 72h à 30 Oc 55 53,75XVMT - 72h à 30 Oc 33,75 32,50

xvs - 84 h à 30 Oc 56,25 43,75XVMT - 84 h à 30 Oc 36,25 30

xvs - 96 h à 30 Oc 51,25 43,75XVMT - 96 h à 30 Oc 32,50 27,50

XVs - 108 h à 30 Oc 51 ,25 l.5XVMT - 108 h à 30 Oc 28,75 35

XVS - 120 h à 30 Oc 51,25 37,50XVMT- 120 h à 30 Oc 32,50 22,50

xvs - 123 h à 30 Oc 55XVMT - 123 h à 30 Oc 32,50

xvs - 144 h à 30 Oc 43,75 42,50XVMT - 144 h à 30 Oc 37,50 30

xvs - 156 h à 30 Oc 42,50 47,50XVMT - 156 h à 30 Oc 40 36,25

xvs - 168 h à 30 Oc 43,75 38,75XVMT - 168 h à 30 Oc 40 38,75

xvs - 180 h à 30 Oc 42,50 42,50XVMT - 180 h à 30 Oc 42,50 36,25

xvs - 192 h à 30 Oc 40 40XVMT - 192 h à 30 Oc 46,25 47,50

- 93 -

(suite du tableau XXXIII)

xvs - 204 h à 30 Oc 33,75 36,25XVHT - 204 h à 30 Oc 37,50 43,75

XVS - 216 h à 30 Oc 40 40XVHT - 216 h à 30 Oc 43,75 38,75

XVS - 240 h à 30 Oc 32,50XVMT - 240 h à 30 Oc 36,25

XVS - 288 h à 30 Oc 41,25 40XVMT - 288 h à 30 Oc 41 ,25 40

XVS - 336 h à 30 Oc 42,50 38,75XVMT - 336 h à 30 Oc 50 38,75

XVS - 384 h à 30 Oc 40 47,50XVMT - 384 h à 30 Oc 40 53,75

XVS - 408 h à 30 Oc 33,75XVMT - 408 h à 30 Oc 41 ,25

XVS - 432 h à 30 Oc 33,75XVHT - 432 h à 30 Oc 36,25

XVS - 456 h à 30 Oc 32,50 45XVMT - 456 h à 30 Oc 40 55

-,94 -

50

Rutine., Nicoéiflorine

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5

48 72 120 144 1GB 19! 2ibt\!mps en hfure~ a 30° C

FIG.44 EVOLUTION DES TENEUR~ EN RUTINE ET NICOTIFLDRINE" AU COURSDE L'INfECTION VIRALE A 3D· C OU N/cot"iana Xanthi n.c.PAR LE VIRUS DE LA M05l~ïQVE OU TA6/~C. '

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ma~ade 100sam

tabac

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Fr G. 45 TE'N EUR EN RUTlNE ET NtCOTIFLDRINE DES TI5!1U5 M ALADE~'E XPR 11'1 EE EN POU RC.E rJTAGE DE LA TEN~UR OU TE.i"lD1 N

"u~ine, Nicotiflorine

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FIG.46 EVOLUTION DES TENEURS E.N RUTINE E.T NlrOTIFLORINE AU COURS

DE L'INFECTION VIRALE A 30°C. DU Nic'Dtiana X~nt;,i n. C.

PAR LE VIRUS DE LA MQ~A'l9UE DU rA~AC

[

!:.Q.ne ur ~ 'Jma~ôdE' 100sam

1 !

FIG. 47

1 4- 5 c; 7 Q 9 w .." 12. '1'3 14 '5 16 1'7 18

temps en jours à 30 0 C.

TENE.UR EN RUTINE ET NIC01"lF'LORINE DE~ TIS5US MALADE..5

EXPRIMEE EN POURCENTAGE DE L A TENEUR OU TEMOIN

\9

3.- Conclusions.

L'inhibition de la synthèse des polyphénols (acides chlorogénique,flavonosides) dans les feuilles virosées à 30 Oc d'un Nicotiana xanthi n.c aucours d'une période de temps comprise entre 36 et 156 heures après inoculationsemble liée à une production importante de particules virales.

L'évolution de la quantité de virus dans un hôte hypersensible à 30 Oca été étudié en particulier par MARTIN et GALLET(90). Ces derniers ont montré queles 96 premières heures correspondent à une synthèse abondante de virus dans lafeuille inoculée. Nos expériences semblent montrer que lorsque cette dernièreest terminée, la formation des pol)~hénols reprend et est même stimulée puisqueles teneurs en ces substances dans les feuilles malades sont supérieures à cellesdes feuilles saines témoins. Il n'y a cependant jamais production ou accumulationdes nombreuses substances apparaissant lors de la formation des lésions localesnécrotiques.

Au cours de sa multiplication, le virus doit détourner à son profitles métabolites qui interviennent directement ou indirectement dans la biosyn­thèse des phénols ; lorsque le taux de virus atteint son maximum dans les feuil­les infectées, les métabolites de l'hôte peuvent être de nouveau utilisés dansla chaîne de réaction menant aux composés phénoliques

c - E v 0 l u t i 0 n q u a n t i t a t i v e d e s c o m p 0 5 é s

p h é n 0 l i q u e 5 d a n s d e s T a b a c s v i r 0 s é s

d 8 l a V a r i é t é xanthi n.c s oum i s à d e s

t r a n s f e r t s t h e r m i q u e s .

1.- Transfert thermique de 20 Oc à 30 oC.

Après un séjour à 20 Oc qui permet le déclenchement de la réactionnécrotique d'hypersensibilité, les plantes sont placées dans une enceinte à 30 Occe qui amène l'extension du virus dans la feuille inoculée à partir des particu­les virales situées dans les cellules périphé~iques aux cellules nécrosées.

Des dosages effectués en fonction du temps à partir du transfert à30 oC, montrent que l'inhibition par la température de la réaction d'hypersensi­bilité, permettant au virus de se généraliser dans la plante hôte, se traduitaussi par une baisse de tous les phénols accumulés ou produits dans des Tabacsde la variété xanthi n.c virosés à 20 oC.

En effet, les résultats obtenus dans ce type d'expérience mettent enévidence lors du transfert à 30°C : une diminution du contenu des phénols totaux(tableaux XXXIV, XXXV, figures 48, 49, 50, et 51), une baisse considérable desteneurs en acides chlorogéniques (tableaux XXXVI, XXXVII, figures 52,53,54, et55) et en flavonosides (tableau XXXVIII, figures 56, et 57), une chute spectacu­laire des acides para-coumarylquiniques (tableaux XXXIX, XL, figures 58, et 59),

- 95 -

des acides férulylquiniques (Tableaux XLI, XLII, figures 60 et 61), et une dimi­nution rapide de la scopoline et du férulylglucose (tableaux XLIII, XLIV, XLV,figures 62, 63, et 64).

Le férulyl-I glucose n'est plus décelé qu'à l'état de traces dans desTabacs nécrosés de la variété xanthi n.c subissant un transfert de 84 heures à30 Oc après une inoculation et un premier séjour de 108 heures à 20 oC. L'évolu­tion est similaire pour la scopoline.

Les feuilles de Tabacs de la variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc etprésentant après 108 heures à cette température 100 à 150 lésions locales voi­ent leurs teneurs en acides caféylquiniques et en flavonosides décroître de 40 %par rapport aux plantes saines témoins, au cours d'un transfert de 144 heuresà 30 oC.

De tels Tabacs renferment des quantités d'acides para-coumaryl et fé­rulylquiniques voisines de 30 vg par gramme de poids frais, alors qu'elles s'é­lèvent respectivement à 137,50 et 81 Vg par gramme de poids frais dans un Nico­tiana xanthi n.c inoculé à 20 Oc et laissé 108 heures à cette température. Labaisse observée dans les teneurs en tous les phénols se manifeste dès un trans­fert de 48 heures à 30 oC. Elle est d'autant plus importante que le séjour àcette température est plus long, et doit correspondre à une synthèse accéléréede particules virales (cette dernière étant déclenchée par le transfert à 30 OC).

Ces résultats ne font que confirmer ceux obtenus lors de l'infectionvirale à 30°C du Nicotiana tabacum variété xanthi n.c.

~ 96

EVOLUTION DES TENEURS EN PHENOLS TOTAUXET, EN PRINCIPAUX PHENOLS DANS DES N.xanthi

N.C INFECTES A 20 Oc PUIS SOUMIS AUN TRANSFERT THERMIQUE A 30 oC.

- Phénols totaux (tableaux XXXIV, XXXV, figures 48,49,50 et 51) ;- Acides chlorogéniques (tableaux XXXVI, XLXVII, figures 52,53,54, et 55)- Flavonosides (tableau XXXVIII, figures 56 et 57) ;- Acides p-coymarylquiniques (tableaux XXXIX, XL, figures 58 et 59)- Acides férulylquiniques (tableaux XLI, XLII, figures 60 et 61) ;- Scopoline (tableaux XLIII, XLIV, figures 62 et 63) ;- Férulylglucose (tableau XLV, figure 64).

0------.00

En trait plein plantes saines • • Tabacs témoins laissés 72 h à 20 Ocpuis transférés à 30 Oc (janvier 1969)

Tabacs témoins laissés 108 h à 20 Ocpuis transférés à 30 Oc (février 1969).

En pointillé plantes virosées A ---Â

x----- ---x

- 97 -

Tabacs inoculés et laissés 72 h à 20 Ocpuis transférés à 30°C (janvier 1969)

Tabacs inoculés et laissés 108 h à 20°Cpuis transférés à 30°C (février 1969).

TABLEAU x.x.,'{IV

Evolution des teneurs en phénols totaux dans des Tabacs de lavariété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 72 heures à cettetempérature, puis transférés à 30 Oc (teneurs exprimées en mgd'acide chlorogénique par 100 grammes de poids frais).

Janvier 1969

XVS - 72 h à 20 oc 73,75XVHT - 72 h à 20 oC 107,50

xvs - 72 h à 20 oC puis 36 h à 30 oc 72,50XVHT - 72 h à 20 oC puis 36 h à 30 oc 95

XVS - 72 h à 20 oC puis 48 h à 30 oc 72,50XVHT - 72 h à 20 oC puis 48 h à 30 oC 97,50

XVS - 72 h à 20 oC puis 54 h à 30 oC 82,50XVHT - 72 h à 20 oC puis 54 h à 30 oC 91,25

XYS - 72 h à 20 oC puis 60 h à 30 oC 82,50XV1'1T - 72 h à. 20 oC puis 60 h à 30 OC 93,75

XVS - 72 h à 20 oC puis 72 h à 30 oC 73,75À"VHT - 72 h à 20 oC puis 72 h à 30 oC 80

r:vS - 72 h à 20 oC puis 84 h à. 30 oC 82,50XVET - 72 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 91,25

xvo' - 72 h à 20 oC puis 96 h à 30 oC 78,75, û

XVHT - 72 h à 20 oC puis 96 h à 30 oC 57,50 ..

XVS - 72 h à 20 oC puis 108 h à 30 oc 86,25XVMT- 72 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 60

XVS - 72 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 86,25XVNT - 72 h à 20 cC puis 120 h à 30 oC 57 ,50

XVS - 72 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 75XVNT - 72 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 50

- 98 -

oen mg 1 100 9 . poids Fra',s

Phénols f:-ci:aux

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4-81

71.i 1 1

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I:.emps Qn heure., il 30(lC 1

:aprés. un sejour de. 72 heures à 20°C

FIG.4S. E:VOLUTION DES T~NE'URS EN PHE.NOLS TOrAUX DANS LES TABAC~

DE LA VARIETE :J..anfhl n.c. INOCULE.S A 2.0°C ET LAISSES 7!. HEURESA [EiTE TEMPERATUR.E PUIS TRANFERE5 A 30°C

[teneur 0/. Jrnclade ~OO

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Phénols ~ol:au:x

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48 96 -1to 144temps en neureli. à 30°(,apnb un séjour de 72 fleurec; à 20° C

FI G. 49. TENEUR EN PHE"NOLS T01'AU" DES TISSUS MALADES, EXPRIMEE

EN POUR.CENTAGE.. DE LA TEN.EUR DU TEMOIN,

TABLEAU XJ:YiV

Evolution des teneurs en phénols totaux dans des Tabacs de lavariété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 108 heures à cettetempérature, puis transférés à 30 Oc (teneurs exprimées en mgd'acide chlorogénique par 100 grammes de Poids frais).

l"évrier 1969

xvs - 108 h à 20 oC 91 ,25XVHT - 100hà20 oc 142,50

xvs - 108 h à 20 oC puis 48hà30 oC 90XVhT - 108 h à 20 oC puis 48 11 à 30 oc 125

ms - 108 h à 20 oC puis 60hà30 oC 96,25XVHT - 108 h à 20 oC puis 60hà30 OC 113,75

xvs - 108 h à 20 oC puis 72 h à 30 OC 100XVl1'f - 108 h à 20 oC puis 72 h à 30 oC 103,75

ms - 108 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 96,25XVMT - 108 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 96,25

ms - 108 h à 20 oC ptûS 96 h à 30 oC 100XVHT - 108 h à 20 oC puis 96 h à 30 oC 80

xvs - 10S h à 20 oC puis 10811à30 oC 92,50XVHT - 108 h à 20 oC puis 108 h à 30 CC 70

ms - 108 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 96,25À"VHT - 108 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 67,50

x.vs - 108 h à 20 oC puis 132 h à. 30 oC 96,25XVHT - 108 h à 20 oC puis 132 h à 30 oC 67,50

xvs - 108 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 92,50À\n'Œ - 108 11 à 20 oC puis 144 h à 30 oC 65

xvs - 108 h à 20 oC puis 156 h à 30 oC 92,50XV11T - 108 h à 20 oC puis 156 h à 30 oC 53,75

xvs - 108 h à 20 oC puis 168 h à 30 oC 91 ,25XVHT - 10S h à 20 oC puis 168 h à 30 oC 53,75

- 99 -

Qen mg /"100 g_ poids frais

--- --- ---Phénols totaux

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FIG.50

48 7E. g6 110 1.q..q 168

temps en neure~ ~ 30·C aprés unséjour de 10Bheurt') .32.0-(.

EVOLUT10rv DES TENEUR~ EN PHEN DLS TOTAUX DANS DES TABAC.SDE LA VARIE1E Xanthi n.c. INOCULES A ~OoC ET LAISSE'5 108 HEUIŒSA CETTE TEM Pl:RATURE PUIS TRAN5FfRE5 A 3 DOC ..

Phénols totaux...... .... ....... ... ...........

...... .......................

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l:abëlc sam10C +--------------'~,,-----------------

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Î. -106 h à 20"e

48 72. 9& no 1lfJt \68

temps en neure'i à 3Q"c.. dprés un séjour de '1oaheure< à 10·C.

TE NEUR EN Pt1ENC LS TOTAUX DéS T 15 SUS MA LADES ~XPR\ NEEEN POURCFNTAG.E DE LA TENEUR DU TEHOIN.

TABLEAU xxxn

Evolution des teneurs en acides chlorogéniques dans des Tabacs dela variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 72 heures à cettetempérature, puis transférés à 30 Oc (teneurs données en ~g pargramme de poids frais).

Janvier 1969

XVS - 72 h à 20 oC 97,50XVET - 72 h à 20 oC 195

XVS - 72 h à 20 oC puis 36 h à 30 oC 103,75xvur - 72 h à 20 oC puis 36 h à 30 oc 135

XVS - 72 h à 20 oC puis 48 h à 30 oC 10"1,25XIIE'!' - 72 h à 20 oC puis 48 h à 30 oC 128,75

xvs - 72 h à 20 oC puis 54 h à 30 oc 105XVN'I' - 72 h à 20 oC puis 54 h à 30 oC 107,50

XVS - 72 h à 20 oc puis 60 h à 30 oC 105À"Vl'l'l' - 72 h à 20 oC puis 60 h à 30 OC 110

XVS - 72 h à 20 oC puis 72 h à 30 oC 101,25XVI1T - 72 h à 20 oC puis 72 h à 30 OC 93,75

xvs - 72 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 103,75XVNT - 72 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 80

l.'VS - 72 h à 20 oC puis 96 h à 30 oC 96,25XVNrr - 72 h à 20 oC puis 96 h à 30 oC 53,75

xvs - 72 h à 20 oC puis 108 h à 30 OC 105XVHT - 72 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 46,25

Y:VS - 72 h à 20 oC puis 120 h à 30 OC 112,50XVNT - 72 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 46,25

XVS - 72 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 101,25XVKrr _ 72 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 46,25

- 100 -

Q. e.n fA- 9 / g. poids ~ra·'t

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50

Acides chlorogénique.s

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EVOLUTI1"'J DES TENEUP.5 E:N A.C.IDE5 CHLDROGENIOUES DANS LES

TA~ACS DE LA VARIETE xanthI fIl.c. 1NOCULES A 2D°C. ET LAISS,EÇ72 HE'URES A EErTE TEMPER.ATURE POI~ TRANSFERËS A :30° C

t12 h à 20D C

J="J G.52

1f. 96 1~O 14~

te.mps -Qn heures à 30°Co)prés un séjour de. 72 heure<:. à 20°C.

Acides; chlorogéniques

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48 72. 96 1~o 1«-l::~mps en heures à 30" c..apr e~ un sejour de 72heurec; à 20°C.

FIG.53. TEN.EUR. EN AClDE~ CHlDR OGEN IÇlUF:.5 DE.5 TI55U5 NAlADJ::SJEXP RIMEE EN POURCENTA~E DE LA TE'NEU R DU TEMOI N

TABLEAU XXXVII

Evolution des teneurs en acides chlorogéniques dans des Tabacs dela variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 108 heures à cettetempérature, puis transférés à 30 Oc (teneurs données en ~g pargramme de poids frais).

Février 1969

xvs - 10S h à 20 oC 142,50XVHT - 10S h à 20 oC 355

r:vs - 108 h à 20 oC puis 4S h à 30 oC 152,50XVhT - 108 h à 20 oC puis 48 h à 30 OC 215

XVS - 108 h à 20 oC puis 60 h à 30 oC 142,50XVliT - 108 h à 20 oC puis 60 h à 30 oC 173,75

xvs - 108 h à 20 oC puis 72 h à 30 OC 152,50XVMT - 108 h à 20 oC puis 72 h à 30 OC 167,50

ms - 108 h à 20 oC puis 84 h à 30 oc 150mNT - 108 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 110

ms - 108 h à 20 OC puis 96 h à 30 OC 160XV1~T - 108 h à 20 oC puis 96 h à 30 OC 112,50

ms - 108 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 150XVET - 108 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 107,50

ms - 108 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 152,50XVHT - 108 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 107,50

ms - 108 h à 20 oC puis 132 h à 30 OC 160XV1,~ - 10S h à 20 oC puis 132 h à 30 OC 85

xvs - 108 h à 20 oC puis 144 h à 30 OC 152,50À'WlT - 108 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 96,25

riS - 108 h à 20 oC puis 156 h à 30 oC 152,50XV1~T - 108 h à 20 oC puis 156 h à 30 oC 71,25

riS - 108 h à 20 oC puis 168 h à 30 oC 160XV~T - 108 h à 20 oC puis 168 h à 30 oC 38,75

- 101 -

Q~n p. gl 9 pO'lds frais

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t'10Bh à îO'C.

48 7! 96 no 144 165

temp~ en heure~ ~ 30·C avri'ï un ~éjour de 109 hE'ure~ 8 ~DoC

EVOlur ION DE') TE NEUR ~ EN ACIDES CHlOROGE NI QUFS

DANS DES TABACS DE' LA VARIETE xant.hi n.c.. iNOCULESA 20° C ET lAlSSE5 -108 HEURES A CETTE" TEMPERATUI,EPUIS TRANSFERES A 30°C..

ceneur %

[ mal~de 10~ .sain ~

Acides c.hlorogÉ'niqu~s

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49 72. Q6 '1'20 n4 168temp~ en heures if 30-C aprés un séjour de IOBhFure~ à !.O-c,

FI G .55 TENEUR EN ACIDES CHlOROGENfQUE5 DE5 TISSUS MALPrDE~

EXPRIMEE [: N. POURCENTAGE DE LA TENEUR DU 1É~DlN •

TABLt1\U XXXVIII

Evolution des teneurs en rutine et nicotiflorine dans des Tabacsde la variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 108 heuresà cette température, puis transférés à 30 Oc (teneurs données en~g par gramme de poids frais).

Février 1969

XVS - 108 h à 20 oC 52 ,50XVHT - 102 h à 20 oC 82,50

XVS - 108 h à 20 oC puis 48 h à 30 oc 50XVHT - 108 h à 20 oC puis 48 h à ::SO oc 58,75

A'/S - 108 h à 20 oC puis 60 h à 30 oc 50XVi:iT - 108 h à 20 oC puis 60 h à 30 oc 55

XVS - 108 h à 20 oC puis 72 h à 30 OC 46,25XVHT - 108 h à 20 oC puis 72 h à 30 OC 40

A'/S - 108 h à 20 oC puis 84 h à 30 OC 52,50XVHT - 108 h à 20 oC puis 84 h à 30 OC 46,25

rvs - 108hà20 oC puis 96 h à 30 OC 42,50XVHT - 108 h à 20 oC puis 96 h à 30 OC 32

rvs - 108 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 40XVilIT - 108 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 30

x.vs - 108 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 42,50~1T - 108 h à 20 oC puis 120 h à 30 oC 30

rvs - 108 h à 20 oC puis 132 h à 30 oC 42,50J0n1~ - 108 h à 20 oC puis 132 h à 30 oC 26,25

A'/S - 108 h à 20 oC puis 144hà30 oC 40XVKT - 108 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 26,25

A'/S - 108 h à 20 oC puis 156 h à 30 OC 50XV1~T - 108 h à 20 oC puis 156 h à 30 oC 28,75

x:vs - 108hà20 oC puis 168 h à 30 oC 52,50XVPIT- 108 h à 20 oC puis 168 h à 30 oC 26,25

- 102 -

9e.n }L 9 1 g da poid s frais

Ru èine J Ni cob flori ne

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Î-10B h à 2.0"c.

FIG.56

46 Tl q6 IZU \4~ lU

tempe; r:nheure'i ~ '30·c. ëlprés un~éjour dt -loBheurt5 à '2.0-e.

EVOLU1'ION DE,5 'TENGURS E'N. RUTINE: ET NICOTlflORlNE DAN5DES TABACS DE LA VARIETE xanthi n.c_ INOCULES A 2DoG

ET LAISSES -1De HEURES A CETTE TEMPERATURE purs TR~~SFERES A 30"C

teneur %

[mal,ade 100lsain .:J

Rul:ine. 1 Nicotiflorine

... ~"X,,,

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sa

Flu.57

49 72. _ qo J lIa nif 16 'iltemps lm he.ure~ a 30· c. apn s un séjour à~ 108 neurps ë) 2.0· C.

TE N.EUR EN RUT \ NE ET NICOTIFLORINE DES Tl SSU5 MALADESEXPRIMEE ~~ POURCENTA6E. DE LA TENEUR DU TEMOIN.

TABLE/I.U XXXIX

Evolution des teneurs en acide para-coumarylquinique dans desTabacs de la variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés72 heures à cette température. puis transférés à 30 Oc (teneursdonnées en vg par gramme de poids frais).

Janvier 1969

1.'Vs - 72 h à 20 oc 14XVhT - 72 h à 20 oc 87,50

XVS - 72 h à 20 oC puis 36 h à 30 oc 14XV{'lT - 72 h à 20 oC l-'Uis 36 h à 30 OC 75

xvs - 72 h à 20 oC puis 48 h à 30 oC 14XVHT - 72 h à 20 oC puis 48 h à 30 OC 70

X:VS - 72 h à 20 oC puis 54 h à 30 oc 15XVNT - 72 h à 20 oC puis 54 h à 30 oc 55

iCVS - 72 h à 20 oC puis 60 h à 30 oc 15XV1·1T - 72 h à 20 oC puis 60 h à 30 oC 55

ms - 72 h à 20 oC puis 72 h à 30 oC 14XVlViT - 72 h à 20 oC puis 72 h à 30 oC 52,50

xvs - 72 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 14XVMT- 72 h à 20 oC puis 84 h à 30 oC 50

x.vs - 72 h à 20 oC puis 96 h à 30 oC 14À'lNT - 72 h à 20 oC puis 96 h à 30 OC 40

x.vs - 72 h à 20 oc puis 108hà30 oc 15À-vr;IT - 72 h à 20 oC puis 108 h à 30 oC 40

xvs - 72 h à 20 oC puis 120hà30 oC 15}.'VHT - 72 h à 20 oC puis 120 h à 30 oc 36,25

ms - 72 h à 20 oC puis 144 h à 30 OC 14XVNT - 72 h à 20 oC puis 144 h à 30 oC 30

- 103 -

QQn f9 1 g. poids Fra"5

---Acide p_coumsr!:JI_:3 qu'miqu2

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4B n 96 -1~O 144-

l:-e.m~s en heures à 30° C. J _ 0

C1pres un séjour de 72 hl!.vres a 20 c..

FIG. 58 EVOlUilQti DES TEKEURS EN ACIDE P. COUMARYl_"3 Ç1UI NIÇJ LIE DANS LESTABACS DE LA VARIETE "Xanchi n. c .IN OC ULES A ~O·c. ET LAISS ES

72 HEUR.~S.Pt t:.ETTE TEMPERATURE PUIS TRAl\lFERE~ A '50"c..

TABLEAU XL

Evolution des teneurs en acide para-coumarylquinique dans desTabacs de la variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés lOSheures à cette température, puis transférés à 30 Oc (teneursdonnées en ~g par gramme de poids frais).

Février 1969

XVS - lOS h à 20 Oc 16,25XY'MT - lOS h à 20 Oc SI,25

XVS - lOS h à 20 Oc puis 4S h à 30 Oc 16,25XVMT- lOS h à 20 Oc

pu~s 48 h à 30 Oc 63,75

XVS - lOS h à 20 Oc puis 60 h à 30 Oc 16,25XVMT- lOS h à 20 Oc puis 60 h à 30 Oc 46,25

XVS - lOS h à 20 Ocpu~s 72h à 30 Oc 16,25

XVMT - lOS h à 20 Ocpu~s 72h à 30 Oc 46,25

XVS - lOS h à 20 Oc puis S4 h à 30 Oc 16,25XVMT- lOS h à 20 Oc puis S4 h à 30 Oc 36,25

XVS - lOS h à 20 Ocpu~s 96 h à 30 Oc 16,25

XVMT- lOS h à 20 Ocpu~s 96 h à 30 Oc 36,25

XVS - lOS h à 20 Oc puis lOS h à 30 Oc 16,26XVMT- lOS h à 20 Oc

pu~s lOS h à 30 Oc 36,25

XVS - lOS h à 20 Ocpu~s 120 h à 30 Oc 16,25

XVHT - lOS h à 20 Oc pu~s 120 h à 30 Oc 36,25

XVS - lOS h à 20 Oc puis 132 h à 30 Oc 16,25XVMT - lOS h à 20 Oc puis 132 h à 30 Oc 36,25

XVS - lOS h à 20 Ocpu~s 144 h à 30 Oc 16,25

XVMT- lOS h à 20 Ocpu~s 144 h à 30 Oc 27,50

XVS - lOS h à 20 Oc puis 156 h à 30 Oc 16,25XVMT- lOS h à 20 Oc puis 156 h à 30 Oc 27,50

XVS - lOS h à 20 Ocpu~s 16S h à 30 Oc 16,25

XVMT- lOS h à 20 Oc puis 16S h à 30 Oc 27,50

- 104 -

Ar:ide.. p_coumaryL -3 quiniqu~

QE?n Jl-9/9 poidli fraÎ')

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FI G. 59.

4B 7l. QI) {~O 144 1b&temps ILn h~url1s à 30"Co apré~ un séjour de '""'08 h&Ure5 a 2.0-c:.

EVOLUTION DES TENËUR5 EN ACIDE P_ COUMARVL _3 QUINI~UE

OANS DES TABACS DE LA VARIETE: xanthi n.c.. INOCULES A !D"C.ET LAISSES 10BHEURES A CnTE TEMPERA1URE PUIS TRANSFERESA 30" c..

TABLEAU XLI

Evolution des teneurs en acides férulyl-quiniques dans des Tabacsde la variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 72 heures àcette température, puis transférés à 30 Oc (teneurs données en ~g

par gramme de poids frais).

Janvier 1969

XVS - 72 h à 20 Oc 14XVMT - 72h à 20 Oc 85

XVS - 72h à 20 Oc puis 36 h à 30 Oc 16XVMT- 72h à 20 Oc

pu~s 36 h à 30 Oc 77 ,50

XVS - 72h à 20 Ocpu~s 48 h à 30 Oc 16

XVMT - 72h à 20 Ocpu~s 48 h à 30 Oc 66,25

XVS - 72h à 20 Ocpu~s 54 h à 30 Oc 16

XVMT - 72h à 20 Oc puis 54 h à 30 Oc 62,50

XVS - 72h à 20 Ocpu~s 60 h à 30 Oc 16

XVMT - 72h à 20 Ocpu~s 60 h à 30 Oc 62,50 .

XVS - 72 h à 20 Oc puis 72h à 30 Oc 16XVMT- 72 h à 20 Oc

pu~s 72h à 30 Oc 62,50

XVS - 72h à 20 Oc puis 84 h à 30 Oc 16XVMT- 72 h à 20 Oc puis 84 h à 30 Oc 62,50

XVS - 72h à 20 Oc puis 96 h à 30 Oc 16XVMT- 72h à 20 Oc puis 96 h à 30 Oc 46,25

XVS - 72 h à 20 Ocpu~s 108 h à 30 Oc 20

XVMT - 72 h à 20 Oc puis 108 h à 30 Oc 46,25

XVS - 72h à 20 Ocpu~s 120 h à 30 Oc 20

XVMT - 72h à 20 Ocpu~s 120 h à 30 Oc 42,50

XVS - 72 h à 20 Ocpu~s 144 h à 30 Oc 16

XVMT- 72 h à 20 Ocpu~s 144 h à 30 Oc 32,50

- 105 -

AcidQc; féru ly Lqui ni qUl2s

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temp!:l e.n heure~ à '50 tl C 1

apréli un séjour de 12 hr..urgs à 20°C

FIG. 60. E\10lUTION DES TE.NEURS EN Atl DES FERULYU;,1UINIÇUE:5DANS DE.S TAt;ACS DE'LA VARIETE Xanchi n.c.. II'\lOCULE'S A

20°C. ET LA\ SSES 72. HEU"E~ A CETTE TEMPERATU RE PUISTRANSFr;zRE5 A 3C"C.

TABLEAU XLII

Evolution des teneurs en acides férulylquiniques dans des Tabacsde la variété xanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 108 heuresà cette température, puis transférés à 30 Oc (teneurs données ~g

par gramme de poids frais).

Février 1969

XVS - 108 h à 20 Oc 17,50XVMT - 108 h à 20 Oc 137,50'

XVS - 108 h à 20 Oc puis 48 h à 30 Oc 17,50XVMT - IDS h à 20 Oc puis 4S h à 30 Oc 106,25

XVS - IDS h à 20 Oc puis 60 h à 30 Oc 17,50XVMT - 108 h à 20 Oc

pu~s 60 h à 30 Oc 70

XVS - 108 h à 20 Oc puis 72h à 30 Oc 17,50XVMT - 108 h à 20 Oc

pu~s 72h à 30 Oc 67,50

XVS - 108 h à 20 Oc puis S4 h à 30 Oc 15XVMT- IDS h à 20 Oc

pu~s S4 h à 30 Oc 52,50

XVS - IDS h à 20 Ocpu~s 96 h à 30 Oc 16,25

XVMT- IDS h à 20 Oc puis 96 h à 30 Oc 47,50

XVS - 108 h à 20 Oc puis 108 h à 30 Oc 16,25XVMT- 108 h à 20 Oc puis 108 h à 30 Oc 42,50

XVS - 108 h à 20 Oc puis 120 h à 30 Oc 16,25XVMT - IDS h à 20 Oc

pu~s 120 h à 30 Oc 42,50

XVS - IDS h à 20 Oc puis 132 h à 30 Oc 20XVMT - 108 h à 20 Oc puis 132 h à 30 Oc 40

xvs - 108 h à 20 Ocpu~s 144 h à 30 Oc 20

XVMT- 108 h à 20 Oc puis 144 h à 30 Oc 30

XVS - 108 h à 20 Ocpu~s 156 h à 30 Oc 20

XVMT- IDS h à 20 Oc puis 156 h à 30 Oc 27,50

XVS - 108 h à 20 Ocpu~s 16S h à 30 Oc 21,25

XVMT- 108 h à 20 Oc puis 168 h à 30 Oc 21,25

- 106 -

Qen f9 19 pDids Frais

........ .........Acides Férulylquiniques

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EVOLUTION DES TENEURS EN AC1DE~ fERUL'{LQUIN1~UE5

DANS Of5 TABACS DE: LA VARIETE Xanthi n.c.. INOCULESA 2.0 0

[ ET LAISSES 106 HEURES A [ETTE TEMPERP\TURE'PUIS TRAt\\5FERES A 3D" C

Î-100 h à 20° C

FIG. 61

7'l.1

96 110 14-4 1&9

remps en hE'lJre~ à '30"c.oapre'i un séjour dl! '1DBh~urt:"~ ~ fO"C

TABLEAU XLIII

Evolution des teneurs en scopoline dans des Tabacs de la variétéxanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés 72 heures à cette tempé­rature puis transférés à 30 Oc (teneurs données en ~g par grammede poids frais).

Janvier 1969

XVMT - 72h à 20 Oc 22,50

XVMT - 72h à 20 "c puis 36 h à 30 Oc 18,75

XVMT - 72 h à 20 Oc puis 48 h à 30 Oc 16,25

XVMT- 72 h à 20 Oc puis 54 h à 30 Oc 16,25

XVMT- 72 hà 20 Oc PU1S 60 h à 30 Oc 15

XVMT- 72 h à 20 Oc puis 72 h à 30 Oc 15

XVMT- 72 h à 20 Oc puis 84 h à 30 Oc 13,75

XVMT- 72h à 20 Oc PU1S 96 h à 30 Oc 12,50

XVMT- 72h à 20 Oc puis 108 h à 30 Oc 12',50

XVMT- 72 h à 20 Oc PU1S 120 h à 30 Oc 12,50

XVMT- 72h à 20 Oc puis 144 h à 30 Oc 12,50

- 107 -

SCDp~line

50

----------- - --)l;- - - -)(,- -l(- -1(- -'- -x-- --.c- -- -l!o- - - -~- -- -Il.----l(,-- --'li,

t72.h.à 2.0"C

48 96 -1~O 144temps en he.ure~ cl 30'" C, 0

aprés UI\ séjour de 72heures à ~D C.

FIG. S2. EVOLUTION DES TENEURS EN SC.OPOLtNE DANS Dr;S TABACS

DE LA VARIETE X::Jhthl· n.f.. INOCULES A 2.0 o C ET LA\S5E~

'72. HEURf5 A CETTE TEMPER"TUR~ PUIS TRAN5FERE5 A 30°c..

TABLEAU XLIV

Evolution des teneurs en scopoline dans des Tabacs de la variétéxanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés lOS heures à cette tempé­rature t puis transférés à 30 Oc (teneurs données en Vg par gra­me de poids frais).

Février 1969

XVHT - lOS h à 20 Oc 60

XVMT - lOS h à 20 Ocpu~s 4S h à 30 Oc 43 t 75

XVl1T - lOS h à 20 Ocpu~s 60 h à 30 Oc 33 t 75

XVHT - lOS h à 20 Oc puis 72h à 30 Oc 27 t 50

XVHT- lOS h à 20 Ocpu~s S4 h à 30 Oc 26 t 25

XVHT- lOS h à 20 Oc puis 96 h à 30 Oc 23,75

XVHT - lOS h à 20 Oc puis lOS h à 30 Oc 23,75

XVHT - lOS h à 20 Oc puis 120 h à 30 Oc 23,75

XVHT- lOS h à 20 Ocpu~s 132 h à 30 Oc 22,50

XVHT- lOS h à 20 Oc puis 144 h à 30 Oc 22,50

XVHT- lOS h à 20 Ocpu~s 156 h à 30 Oc 21 ,25

XVMT - lOS h à 20 Ocpu~s 16S h à 30 Oc 16,25

- lOS -

Scopoline

Qen J-L9 19 poids fra"5

50--- ------ -- -......x""'.....

......"'x...

.......... - ----->t- ~ --K---*----x_

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t10Bh. à fO"C

49 9& 100 -144 168temps en heure~ ~ 30·Co

aprés un c;;~jour de 1osheurl!<) ~ lO·C

FI G. S3 EVQlU1101\l DES l"t=NEUR5 EN S[OPDLlNE DANS UF5 TABACSDE LA VAR IETE" Xanth i n. c.. 1N O(UlES A 2D 17 C ET LAI S5 ES108 HEURES A CElTE TE MPE RATURE PUIS TRANSFERES A 30° C

TABLEAU XLV

Evolution des teneurs en férulylglucose dans des Tabacs de la variétéxanthi n.c inoculés à 20 Oc et laissés ]08 heures à cette température,puis transférés à 30 Oc (teneurs données en ~g par gramme de poidsfrais).

Février 1969

XVMT - 108 h à 20 Oc 75

XVMT - ]08 h à 20 Oc puis 48 h à 30 Oc 57,50·

XVMT - 108 h à 20 Ocpu~s 60 h à 30 Oc 30

XVMT - 108 h à 20 Oc puis 72h à 30 Oc 27,50

- 109 -

9e.n fl9 1 9 . poids frais

EVOLUTION DES TENEURS EN FERULYL _1 GLUCOSE DANS LES TABACSDE LA VARIETe Xanth/ n.c. INOCULES A ~o·c ET LAISSES 10BHEUREc.iA CETTE TEMPERATIJRt: PUIS TRAN5FERE~ A 30°C. •

------ -- --5'0

trfOBhà fO"e.

F[G.64

---x...,,,,x_---,c,

... ... ,... ...

48 96 120 144 ~GB

temps Qn heures à .30°c.aprés un séjour de 10B hfVre~ à 20°C

2.- Transfert thermique de 30 Oc à 20 Oc

Après avoir été inoculés à 30 Oc et laissés 36 heures ou 48 heures àcette température, ce qui permet l'extension de l'infection à partir du pointd'inoculation, les N.xanthi n.c sont transférés à 20 oC. Nous voyons alors appa­raître des lésions locales ainsi qu'un début de nécrose de la feuille inoculée.La réaction d'hypersensibilité est déclenchée lors du passage des plantes inocu­lées à 20 Oc ; elle intéresse d'un seul coup la majorité des cellules infectéeset apparaît à un moment faeilement repérable. La nécrose commence à se manifes­ter dans ces conditions expérimentales après quelques heures de séjour à 20 Oc(de 8 à 12 heures).

Pour ce type d'expérience, il est nécessaire que le nombre de pointsd'entrée du virus n'excède pas la centaine, afin que lors du transfert à 20 Ocla feuille présente encore des plages de tissus vivants entre les nécroses quiapparaissent à cette température).

Nous constatons d'après les résultats, résumés dans les tableauxXLVI, XLVII, XLVIII,XLIX, L, LI, LII, et exprimés sous forme de graphiques (fi­gures 65,66,67,68,69,70,71,72,73 et 74) que le transfert à cette température en­traîne une rapide augmentation des phénols totaux, des acides chlorogéniques etdes flavonosides (rutine et nicotiflorine).Il s'accompagne aussi d'une accumulation des acides para-coumaryl et férulylqui­niques (teneurs situées entre 70 et 80 ~g par gramme de poids frais), et enfind'une production de férulyl-l glucose (35 à 40 ~g par grarr@e de poids frais) etde scopoline (20 ~g environ par gramme de poids frais). Ces valeurs concernentun Tabac malade transféré 72 heures à 20 oC.

Ces réactions se manifestent dès un transfert de 36 heures à 20 oC.

Les N.xanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 heures à cette tempé­rature puis séjournant à 20 Oc durant une période de temps de 36 heures voientleurs teneurs en acides chlorogéniques subir une augmentation de 40 %, et cellesdes flavonosides s'élever de 30 %, par rapport aux plantes saines témoins.

La synthèse des acides chlorogéniques et des flavonosides paraît êtreplus importante dans un Tabac infecté ayant passé 36 heures à 30 Oc puis trans­porté à 20 oC, que dans celui inoculé et laissé 48 heures à 30 Oc avant le pas­sage à 20 oC. Ce phénomène est logique puisque dans le dernier Tabac les feuil­les virosées comportent une plus grande proportion de tissus nécrosés, donc decellules mortes .', Ces, feuilles urésentant moins de tissus intacts ont donc un mé­tabolisme amoindri par rapport à celui existant dans les feuilles d'un Nicotianaxanthi n.c laissé seulement 36 heures à 30 oC.

De même le séjour préalable de 36 heures à 30 Oc d 'u~ Tabac de la va':::'--:­riété xanthi n.c avant son transfert à 20 Oc provoque pour les a.cides caféylqui­niques une plus rapide stimulation de synthèse que celle se produisant dans uneplante infectée et laissée à 20 oC. Les symptômes nécrotiques étant plus étenduset apparaissant plus précocement dans le premier Tabac, il est normal que nous yobservions une plus rapide accumulation de ces acides.

- 110 -

Ces résultats viennent confirmer ceux que nous avions obtenus lors dedosages effectués en fonction du temps sur des feuilles saines et nécrosées à20 Oc de N.xanthi n.c. Il indiquent que l'accumulation et la production des nom­breuses substances phénoliques dans les Tabacs de la variété xanthi n.c inoculésà 30 Oc puis transférés à 20 Oc sont déclenchées après l'apparition des lésionslocales nécrotiques, c'est-à-dire une fois l'hypersensibilité acquise.

En effet, dans ces conditions, la nécrose est nettement apparenteaprès 12 heures de séjour à 20 oC, or, les différences que nous observons lorsdu transfert à cette température deviennent importantes entre 36 et 72 heures.

- 111 -

EVOLUTION DES TENEURS EN PHENOLS TOTAUXET, EN PRINCIPAUX PHENOLS DANS DES TABACS DE

LA VARIETE xanthi N.C. INFECTES A 30 OcPUIS SOUMIS A UN TRANSFERT THERMIQUE A

20 Oc (Janvier 1970).

- Phénols totaux (tableau XLVI, figures 65 et 66) ;- Acides chlorogéniques (tableau XLVII, figures 67 et 68)- Flavonosides (tableau XLVIII, figures 69 et 70) ;- Acide p-coumarylquinique (tableau XLIX, figure 71)- Acides férulylquiniques (tableau L, figure 72) ;- Férulylglucose (tableau LI, figure 73)-Scopoline (tableau XLII, figure 74).

• • Tabacs à 20 oC.

trait plein plantes saines 0 "Tabacs laissés 36 h à 30 Oc

En puis transférés à 20 oC.

0Tabacs laissés 48 h à 30 Oc

0transférés à 20 oC.PU1S

A-----..A Tabacs à 20 Oc

En pointillé plantes virosées x- - ----X Tabacs ·inoculés et laissés 36 h à 30 OcPU1S transférés à 20 oC.

11-----8 Tabacs inoculés et laissés 48 h à 30 OcPU1S transférés à 20 oC.

- 112 -

,TABLEAU XLVI

Evolution des teneurs en phénols totaux dans des Tabacs de la variétéxanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 ou 48 heures à cette tempé­rature, puis transférés à 20 Oc (teneurs exprimées en mg d'acide chlo­rogénique pour 100 grammes de poids frais).

Janvier 1970

XVS - 36 h à 30 Oc 71,25XVMT - 36 h à 30 Oc 67,50

XVS - 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 75XVMT - 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 111 ,25

XVS - 36 h à 30 Ocpu~s 48 h à 20 Oc 73,75

XVMT - 36 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 96,25

XVS - 36 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 86,25

XVMT - 36 h à 30 Oc pUJ_s 60 h à 20 Oc 116,25

XVS - 36 h à 30 Ocpu~s 72 h à 20 Oc 82,50

XVMT - 36 h à 30 Oc puis 72 h à 20 Oc 100

XVS - 48 h à 30 Oc 78,75XVMT- 48 h à 30 Oc 66,25

XVS - 48 h à 30 Ocpu~s 36 h à 20 Oc 71,25

XVMT - 48 h à 30 Ocpu~s 36 h à 20 Oc 71,25

VXS - 48 h à 30 Ocpu~s 48 h à 20 Oc 82,50

XVMT - 48 h à 30 Ocpu~s 48 h à 20 Oc 96,25

XVS - 48 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 78,75

XVMT- 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 82,50

XVS - 48 h à 30 Ocpu~s 72h à 20 Oc 73,75

XVMT - 48 h à 30 Oc puis 72h à 20 Oc 82,50

XVS - 36 h à 20 Oc 71 ,25XVMT - 36 h à 20 Oc 93,75

XVS - 48 h à 20 Oc 82,50XVHT - 48 h à 20 Oc 111,25

XVS - 60 h à 20 Oc 90XVMT - 60 h à 20 Oc 131 ,25

XVS - 72h à 20 Oc 82,50XVMT- 72h à 20 Oc 125

- 113 -

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50

'Bppèlri t'ion macrOSCD piqueâ~ la nécrose

qlm mg IAOD 9 poidS Fraiç

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ëI/7par"\tion maao;copiQu~dQ!~ nécr05e

4e 72.hm ps e.n h~ure~

~ 20·C

48 72-temp!i en heures

à ~O" C.t 48

temps en heurl?~

48hà30 0 C ~20"'c..

7i

361\ à 30"[ puis à 20°C 48 h à 3DOC puis à 2.Q''' C.

FI G. 65 EVOLUTIDN DES TENEUR5 EN PHENOLS TO't'AUl DANS DES TABAC.S

DE LA VARIETE Xanthi n,r-. INOC.ULESA 30°C ETLAlSSE"S '3bnu 48 Heurec; A CETT E. TEMPERATURE PUIS TRANSFERES Pt 20°c..,

Phénols tol:.aux

teneurmaladesain

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100J

400tOlba! ~ain

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1oo+-t_a_b_a_c_s_a_m~.",-~_/ _~­--

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apparil:.ion macrosCDpique.de la néc..rose

appar',tioo rnatroscopiquede la néc.rosQ.

35 h à :3O·C pui~ à 2.0-c.

49 7'l

tempJ en heure~a 2.0· C

49 h à 30"'C

48 h à :?lODe pui~ à czo"c.

48 72temv) en heUfPt;

ël20·C.36 h à 30"'C:

49 71tempten heorPs

êJ 2.0 0 C.

Fla.66. Tf.=NEUR· EN PHENOLS TOTAUX DES TISSUS MALADES EXPRIMEEEN PDtJRCENTAG.é: DE LA TENEUR DU TEMOlN

TABLEAU XLVII

Evolution des teneurs en acides chlorogéniques dans des Tabacs dela variété xanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 ou 48 heuresà cette température, puis transférés à 20 Oc (teneurs données ep~g par gramme de poids frais).

Janvier 1970

XVS - 36 h à 30 Oc 107,50XVMT - 36 h à 30 Oc 71 ,25

XVS - 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 107,50XVMT - 36 h à 30 Oc PU1.S 36 h à 20 Oc 180

XVS - 36 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 100XVMT - 36 h à 30 Oc pU1.S 48 h à 20 Oc 171 ,25

XVS - 36 h à 30 Oc PU1.S 60 h à 20 Oc 117,50XVMT - 36 h à 30 Oc PU1.S 60 h à 20 Oc 307,50

XVS - 36 h à 30 Oc puis 72h à 20 Oc 92,50XVMT - 36 h à 30 Oc PU1.S 72h à 20 Oc 262,50

XVS - 48 h à 30 Oc 110XVMT - 48 h à 30 Oc 65

XVS - 48 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 90XVMT- 48 hà 30 Oc PU1.S 36 h à 20 Oc 146,25

XVS - 48 h à 30 Oc PU1.S 48 h à 20 Oc 107,50XVMT - 48 h à 30 Oc PU1.S 48 h à 20 Oc 200

XVS - 48 h à 30 Oc PU1.S 60 h à 20 Oc 107,50XVMT - 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 200

XVS - 48 h à 30 Oc puis 72 h à 20 Oc 85XVMT - 48 h à 30 Oc PU1.S 72 h à 20 Oc 167,50

XVS - 36 h à 20 Oc 90XVMT - 36 h à 20 Oc 128,75

XVS - 48 h à 20 Oc 117,50XVMT- 48 hà 20 Oc 175

XVS - 60 IL à 20 Oc 107,50XVMT - 60 h à 20 Oc 257,50

XVS - 72 h à 20 Oc 117,50XVMT - 72 h à 20 Oc 257,50

- 114 -

Acides c:.hlorogéniques

O~n 1l9/ g ooid!" frais Qen f 9 Ig. Doids frais

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4B 72temps pn heures

à iD· C

apPëlri tian macroHDpiqul?dE' la nécrose

appar'ltion méltroslopiquede la nécr05e

l4~ 72-

tfmps en heurtSà 20°C.

FI Ci. 67 EVOLU.T ION DES TENEUR ~ EN ACIDES CHLORD 6ENI QUE5.DANS ilES TABACS DE LA VAR1E.TE Xoenth/ n.c. INOCULESA . 30° C ET LAISSES 36 DU 48 I+EURES A CErTE TEMPERATURE

PUIS TRANjp."ERES A 2.D°C.

~cldes ~hlorcgéniques

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5"D

avvari tion macro~copi que.de la nétrosE'

46 72.tEmps" en hlure~

à ~o·c.

46 7fremp' _en heures

a 20"c..

36 h ~ 30" C pUIS cà 2.0· C

FJG.68 TENEUR EN ACIDES CHLDROGENIQUE5 DES TlS5US MALADES,EXPRIMEE EN POURCENTAGE. DE LA TENEUR DU "TEMOIN.

TABLEAU XLVIII

Evolution des teneurs en rutine et nicotiflorine dans des Tabacs dela variété xanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 ou 48 heures àcette température, puis transférés à 20 Oc (teneurs données en ~g

par gramme de poids frais).

Janvier 1970

xvs - 36 h à 30 Oc 50XVMT - 36 h à 30 Oc 40

xvs - 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 55XVMT - 36 h à 30 Oc

pu~s 36 h à 20 Oc 78,75

xvs - 36 h à 30 Ocpu~s 48 h à 20 Oc 55

XVMT- 36 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 78,75

xvs - 36 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 40

XVMT - 36 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 70

xvs - 36 h à 30 Oc puis 72h à 20 Oc 55XVMT - 36 hà 30 Oc puis 72h à 20 Oc 73,75

xvs - 48 h à 30 Oc 52,50XVMT - 48 h à 30 Oc 42,50

xvs - 48 hà 30 Ocpu~s 36 h à 20 Oc 57,50

XVMT - 48 hà 30 Ocpu~s 36 h à 20 Oc 70

xvs - 48 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 50XVMT- 48 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 70

xvs - 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 42,50XVMT - 48 h à 30 Oc

pu~s 60 h à 20 Oc 65

xvs - 48 h à 30 Ocpu~s 72h à 20 Oc 40

XVMT - 48 h à 30 Ocpu~s 72h à 20 Oc 48,75

xvs - 36 h à 20 Oc 46,25XVMT - 36 h à 20 Oc 52,50

xvs - 48 h à 20 Oc 52,50XVMT - 48 h_ à 20 Oc 66,25

XVs - 60 h à 20 Oc 57,50XVMT - 60 h à 20 Oc 96,25

XVS - 72 fi- à 20 Oc 52,50XVMT - 72 h à 20 Oc 103,75

- 115 -

411 71.temps ~n heure'i

à 2.0" C

QQ.n P.Q/Q poids frais

50

4-B 71temn en hl?uret;

a 20"C

A 20 CI C.

Rul:ine, Nicot:iflorine.

Q(211)1-9/9 poids frils

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./,~o..b.-_...~",~-_-o---Q,

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apparition mël(ro~(Opiquede \a nac.ro se

t3Ghà 30°C

36 ha 300( puis à 2.0"(

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apparitiol'\ mëH.ro,;co piqueda Id nl2cro<;e

4i "72.te.mtH en hl?ureç

à 7.0· C

FIG.69 EVOLUTION DES TEN~UR5 EN RUTI NE eT NICOTI FLDR\ NE DAN"> DES TA~ACS

DE LA'JARISTt=. .;yanth/ n.'-. INOrUL~<; A 30"(. ET LA\SSES 36 H~ures

A CETTE TE'MPERA1URE PUIS TRAN~FERE5 A .f.O"c. ,

teneur %m'a/.adQ"'DD

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Rul:ine 1 NicociFlorine

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,,/ tabèc. Si.:l\n '100'+---~-------

50 50

apparition matyoscoli'iqul1de la nl?croe;,e.

50

apparition ma[rD~c.opl~u2de 1" nécrose

4B 12.rpmP2 En heureç

è 2.0· C

48 11tem R.~ en n2UrQC;

a 2.0"c.t

48 h à 30 6 C

46 71b2mp,; en heurQ.C5

~ J.o"c,

~6 h à 3D D C puH à 2.D"[

FIG. 7.0 'TE.NEUR EN RUTINE ET EtJ N1CClT\FU~RINE DES T\SSU5 MALADESEXPRIMEE "EN POURCE.NTAGE DE LA TENEUR DU TEMDlN

TABLEAU XLIX

Evolution des teneurs en acide para-coumarylquinique dans desTabacs de la variété xanthi n.c, inoculés à 30 Oc et laissés36 ou 48 heures à cette température, puis transférés à 20 Oc(teneurs données en ~g par gramme de poids frais).

Janvier 1970

XVS - 36 h à 30 Oc 10XVMT - 36 h à 30 Oc

XVS - 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 10XVMT- 36 h à 30 Oc PU1.S 36 h à 20 Oc 55

XVS - 36 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 10XVMT - 36 h à 30 Oc PU1.S 48 h à 20 Oc 70

XVS - 36 h à 30 Oc PU1.S 60 h à 20 Oc 12XVMT - 36 h à 30 Oc puis 60 h il 20 Oc 88

XVS - 36 h à 30 Oc PU1.S 72 h à 20 Oc 10XVMT - 36 h à 30 Oc PU1.S 72h à 20 Oc 90

XVS - 48 h à 30 Oc 10XVMT - 48 h à 30 Oc

XVS - 48 hà 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 12XVMT - 48 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 46,25

XVS - 48 h à 30 Oc PU1.S 48 h à 20 Oc 10XVMT - 48 h à 30 Oc PU1.S 48 h à 20 Oc 50

XVS - 48 h à 30 Oc PU1.S 60 h à 20 Oc 10XVMT - 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 70

XVS - 48 h à 30 Oc PU1.S 72h à 20 Oc 12XVMT - 48 h à 30 Oc PU1.S 72h à 20 Oc 75

XVS - 36 h à 20 Oc 10XVMT - 36 h à 20 Oc 55

XVS - 48 h_ à 20 Oc 10XVMT - 48 h à 20 Oc 68

XVS - 60 h à 20 Oc 12XVMT - 60 h à 20 Oc 88

XVS - 72 h à 20 Oc 10XVMT - 72 h à 20 Oc 90

- 116 -

Acide p _ coumaryL 3 quinique

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Q~n J-L9/ 9 pO'ld!o frais Qen}lq 1g poids frais Qen ~ 9 1 9 poids Fra'ts

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: : :49 72

tEmps en heurelià 2. 0' C

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4B 72tempe en heures

li .2..0 oc

'apparition macrosco,iquede L~ n Qcro se

,..,,..48 7'1.

temp§ en heu re~a 2..0°c..

al' pari tian macros cop iquedl! la n~cr~se

A 2.0° C

3Gh à 30"C

3bh à 3DOC puis à. 20°C.

46 h à "30°c..

48 h à 30U C. pui~ a20·C.

FIG. 71 EVOLUTI 0 ri DE5 TENEURS EN AC.t DE P_ CQUNARYL _3 t;TU1N1QUEDAMS DES TABACS DE LA VARIETE X,anthl n.c.. INOC.UU:S A "30°C:ET LAt5~ES 36 ou 4-e HEURES A L.ETTE fiMPERATORE PUIS TRANSFEREe;A 2.00'C.

TABLEAU L

Evolution des teneurs en acides ffru1y1quiniques dans des Tabacsde la variété xanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 ou 48heures à cette température, puis transférés à 20 Oc (teneurs don­nées en ~g par gramme de poids frais).

Janvier 1970

xvs - 36 h à 30 Oc 15XVMT - 36 h à 30 Oc

xvs - 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 10XVMT- 36 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 42,50

xvs - 36 h à 30 Ocpu~s 48 h à 20 Oc 10

XVMT- 36 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 50

xvs - 36 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 15

XVMT - 36 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 87,50

XVS - 36 h à 30 Oc puis 72 h à 20 Oc 10XVMT - 36 h à 30 Oc puis 72 h à 20 Oc 75

xvs - 48 h à 30 Oc 15XVMT - 48 h à 30 Oc

xvs' - 48 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 10XVMT- 48 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 43,75

xvs - 48 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 10XVMT - 48 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 50

xvs - 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 10XVMT- 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 58,75

xvs - 48 h à 30 Oc puis 72 h à 20 Oc 10XVMT- 48 h à 30 Oc puis 72 h à 20 Oc 66,25

xvs - 36 h à 20 Oc 10XVMT - 36 h. à 20 Oc 31,25

xvs - 48 h à 20 Oc 10XVMT - 48 h à 20 Oc 58,75

xvs - 60 h à 20 Oc 15XVMT- 60 h à 20 Oc 78,75

xvs - 72 h à 20 Oc 10XVHT - 72 h à 20 Oc 91,25

- 117 -

9an }'9'9 p~ld~ fra\c;

Acide.s FÉrul~lqu'Jn\que5

Qen fig / 9 poIds fraie; Qen fg/9 poids frais

50 bo

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11

11

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4B 72-temp~ ~n heures

d ~O .. C.

Clpparition ma(ro~(apiql.l\!

de la néc::ro51l

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F/G.7.2 EVOLUTION DES TENEUR5 EN AC.IDES FERULYLIjlUINltfUESDA~S DES TABACS DE LA VARIETE >éanthi n.~. INOCUL.ES A 30·C,ET LAISSES 36 OU 4B HEURE.S A CETTE TEMPERATURE PU\S TRANSFERESA 20° C .

TABLEAU LI

Evolution des teneurs en férulylglucose dans des Tabacs de lavariété xanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 ou 48 heuresà cette température, puis transférés à 20 Oc (teneurs donnéesen ~g par gramme de poids frais).

Janvier 1970

XVMT- 36 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 20

XVMT - 36 h à 30 Ocpu~s 72h à 20 Oc 40

XVMT - 48 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 20

XVHT - 48 h à 30 Ocpu~s 72h à 20 Oc 35

XVMT - 72 h à 20 Oc 30

- 118 -

9Q. n }l9'9 pÔld~ fraica

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.à 2.0" C

apparition rnacfascov'lquede fa n~Cr05l!

48 7'-b/.mp5 ~n he\}re~

8 2.0"c:.

ëlppdri tionrrrt1c.roscopiqul!de la nÉl.roc:.e

48h à '30f1C

FJG·73 EVOLUTION DES TENeURS EN F'ERUlYL_1 GlUCOSE DANS DESTABACS DE LAVARIETE xanthi (\.t. INOCULES A 30°C. ET LAlSSE'i36 OU 48 HEURES A CErTE TEM PE ~ATURE PU!'; TRANSFERECi A 20"c.. ..

TABLEAU L11

Evolution des teneurs en scopoline dans des Tabacs de la variétéxanthi n.c inoculés à 30 Oc et laissés 36 ou 48 heures à cettetempérature, puis transférés à 20 Oc (teneurs données en ~g pargranme de poids frais).

Janvier 1970

XVMT- 36 h à 30 Ocpu~s 36 h à 20 Oc 12,50

XVMT - 36 h à 30 Oc puis 48 h à 20 Oc 13,75

XVMT - 36 h à 30 Oc puis 60 h à 20 Oc 15

XVMT- 36 h à 30 Ocpu~s 72h à 20 Oc 22,50

XVMT - 48 h à 30 Oc puis 36 h à 20 Oc 15

XVMT- 48 h à 30 Ocpu~s 48 h à 20 Oc 16,25

XVMT - 48 h à 30 Ocpu~s 60 h à 20 Oc 21,25

XVMT- 48 hà 30 Ocpu~s 72 h à 20 Oc 15

XVMT - 48 h à 20 Oc 12,50

XVMT- 60 hà 20 Oc 17,50

XVMT- .72 h. à 20 Oc 26,25

- 119 -

Sc:opofine

Qan J-Lg 1 9 poids fral~ Qen~9/q poids frais

5"0 50

9en J!g tg poids frai~

50

48 71t.emps en heures

cl 9..0"C

A 2.0° C.

__~x- ---'j(-- --y----------49 7!

~~mps _en heùreçoB w· c.

apparition macro!)c.ap'iquede. fa néc.rosQ

3éh à 30"C. pui~ à 20"(

-_ ........ ,---.----- ' ....-------45 72.

temp~ en heure.c,a 2.0 D c

appêlri tion ma CT.Oli c.opiqu ede la necrose

48 h à 30°C.

FIG.74 EVOLUTION De~ rENEUR~ EN SCOPOLlNl.: DANS DES TABACSDE. LA 'VARIETE Xanthi' n.c. INOCULf~ A3Do C ET LAIsses 36 ou---4BHE"URE5 A (ET1E TEMPERATURE PUIS TRANSFERES A xo~c.

II - DISCUSSI~~.

INTERPREmTION DES RESULTATS.

Les dosages des composés phénoliques effectués en fonction du tempssur des feuilles saines et vi rosées à 20 Oc de Nicotiana xanthi n.c, ont permisde résoudre le problème du rôle de ces substances dans la formation des lésionslocales nécrotiques. Il n'y a pas accumulation ou production de phénols avantl'apparition des symptômes nécrotiques. Les différences à 20 Oc entre plantessaines et malades deviennent importantes lorsque la synthèse du virus est prati­quement achevée et que l'hypersensibilité est acquise. Ces variations maximalesentre 60 et 156 heures après inoculation pour un N.tabacum variété xanthi n.cinfecté à 20 oC, tendent ensuite à s'estomper pour la plupart des composés phéno­liques.

Les substances phénoliques ne sont pas respondables de la formationdes nécroses, donc de la réaction d'hypersensibilité. La synthèse phénoliquen'apparaît stimulée que par suite d'effets secondaires de l'infection virale.

Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par CABANNE et coll.(25) concernant l'ac tivité de la polyphénoloxydase, chez le Nicotiana xanthin.c infecté à 20 Oc par le virus de la mosaique du Tabac. Ces auteurs ont en ef­fet montré que l'augmentation de l'ac_ tivité enzymatique est postérieure à lanécrose. Ils en concluent que l'augmentation de la polyphénoloxydase n'est pasresponsable de la mort des cellules mais doit être plutôt considérée comme uneréaction secondaire.

L'augmentation de l'activité polyphénoloxydasique et l'accumulationet la production de substances phénoliques sont plutôt les conséquences que lescauses de ce processus. La synthèse de l'oxydase pourrait être déprimée par uninducteur, ce dernier pouvant être l'un des substrats de l'enzyme.•

L'hypothèse suivant laquelle des quinones toxiques résultant de l'oxy­dation des phénols par la polyphénoloxydase seraient capables de tuer les cellu­les malades (41) et ainsi d'arrêter l'infection virale ne semble pas vérifiée •.

Si les composés phénoliques ne peuvent être considérés comme interve­nant directement dans le blocage de la replication de l'ARN viral, il est toute­fois possible que l'inhibition pouvant intervenir dans l'activité de l'ARN re~

plicase soit cependant lié au cycle oxydatif des phospho-pentose. L'accumulationdes phénols n'est qu'une conséquence de la stimulation de cette voie.

Les résultats obtenus par SCALLA et coll. (124) sur la pertubation dumétabolisme du phosphore dans le Nicotiana tabacurn xanthi n.c virosé à 20 Ocont montré que l'apparition des symptômes de la réaction d'hypersensibilité, estprécédée par une diminution de l'incorporation de l'ion.phosphate dans les estersphosphoriques à la lumière et à l'obscurité. Ce ralentissement des phosphoryla­tions ne peut-être causée par une accumulation des produits d'oxydation des phé­nols. Or, la voie des phospho-pentose n'est pas spécialement une voie énergéti­que comme la glycolyse ou le cycle de Krebs, mais elle assure une réserve d'hy­drogène sous une forme active de NADPH 2 utilisable dans des réactions de synthè­se. Il n'est donc pas certain que le cycle des pentoses soit lié à des phospho-

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rylations oxydatives, le NADPH pourraît être également réoxydé par certains pro­cessus non phosphorylants qui fonctionneraient dans les tissus du N.xanthi n.cvirosés à 20 oC.

CROOK et MORGAN (35) ont m~s en évidence chez le chou-fleur, un enzymecatalysant la réduction de l'acide déhydroascorbique par le glutathion réduit.Cet enzyme a été retrouvé chez le pois par 11APSON et GODDARD (89) et dans lesplantules de blé par CONN et VENNESLAND (30). Ces deux dernières équipes de cher­cheurs ont également démontré l'existence d'une NADPH 2 -glutathion réductase syn­thétisant la réduction de glutathion oxydé par le NADPH 2 • ANDERSON et coll. (3)ont démontré la large répartition de ces deux enzymes. Enfin, de très nombreuxvégétaux possèdent une acide ascorbique-oxydase (enzyme catalysant l'oxydationdirecte de l'acide ascorbique). Le transfert des électrons du NADPH 2 à l'oxygènemoléculaire pourrait se faire selon la séquence d'oxyda-réduction suivante:

NASPH + H+ glutation acide acide

C~p+)( OXYdé) déhydro- ascorbique

c:~o2H glutathion ascorbique oxydase

réductase réductase

Jglutathion acideréduit déhydro-

ascorbique

Les observations faites au microscope électronique (125) sur des chlo­roplastes de Nicotiana tabac~~ xanthi n.c au cours de la réaction d'hypersensi­bilité montrent que ces organites possèdent un système lamellaire désorganisé.Ces observations sont en accord avec la diminution de l'intensité de la photo­synthèse observée par OWEN (104) dans le cas d'une infection locale et nécroti­que. Elles correspondent également à une baisse des photophosphorylations. Ladésorganisation au niveau des chloroplastes doit entraîner une baisse dans laformation du ribulose-I,5-diphosphate à partir du ribulose-5 phosphate (cataly­sée par la phosphoribulokinase localisée dans les chloroplastes), et ainsï per­mettre la complète utilisation de ce métabolite dans la voie des phospho-pentose.

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Résumé Conclusions Générales

On sait que chez les végétaux,et tout particulièrement chez le genreNicotiana, l'infection par un virus (virus de la mosaïque du Tabac: V.M.T.)peut provoquer une infection généralisée (cas du Nicotiana tabacum variété sam­sun) ou une réaction dite "d'hypersensibilité" (cas du Nicotiana tabacum varié­té xanthi n.c) se traduisant par des lésions locales nécrotiques au voisinagedirect des points de pénétration du virus.

Les travaux entrepris dans le laboratoire montrent que l'arrêt de lamultiplication virale (V.M.T.) chez un hôte hypersensible comme le Nicotiana ta­bacum variété xanthi n.c, n'est pas dû à une barrière de cellules mortes, caril existe du virus biologiquement actif dans les cellules vivantes situées au­delà de la nécrose, mais à une autre barrière que nous ne sommes pas encore enmesure de définir, telle que ces cellules sont incapables de répondre complète­ment à l'information génétique que possède l'acide ribonucléique viral. L'éléva­tion de température lève cette incapacité.

Les examens au microscope électronique dans certaines conditions descellules vivantes avoisinant les lésions nécrotiques à 20 oC, ne permettent pasd'y mettre en évidence des particules virales complètes. Par contre, il est ob­servé très fréquemment un matériel de structure irrégulière de nature encore in­connue. Lors du retour à 30 Oc ce matériel a tendance à disparaître, et on obser­ve de nombreux bâtonnets (V.M.T.), ainsi que des structures qui seraient des for­mes incomplètes de virus.

Il doit exister dans les cellules infectées à 20 Oc un mécanisme blo­quant l'une ou l'autre des différentes étapes conduisant au virion complet. Laperturbation pourrait se situer au niveau de l'ARN replicase. La mise hors-cir­cuit de l'enzyme proviendrait soit de la répression de sa synthèse, soit de l'in­hibition de son activité. Ce processus pourrait être réalisé grâce à un métabo­lite produit par le Nicotiana tabacum xanthi n.c virosé à 20 oC. Cette substancepourraît être thermolabile, ou sans être sensible à la température l'enzyme né­cessaire à sa synthèse serait inhibé ou détruit aux températures supérieures à29 oC.

Les composés phénoliques étan~ selon certains auteurs impliqués dansles processus biochimiques conduisant à l'expression du phénomène d'hypersensi­bilité au virus, il nous a paru digne d'intérêt d'analyser d'une façon préciseles variations subies par ces substances au cours de l'hypersensibilité, et devoir s'il existe un lien entre métabolisme des phénols, hypersensibilité et tem­pérature.

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Dans une première partie nous avons tenté de faire un inventaire aussipreC1S que possible des composés phénoliques présents dans les Tabacs. Nous avonsainsi montré que les principaux phénols identifiés dans les feuilles saines deNicotiana xanthi n.c (20 Oc - 30 OC) sont les acides chI orogéniques et la rutineou rhamnoglucoside-3 quercétine. Les acides chlorogéniques sont au nombre detrois: l'acide caféyl-3 quinique ou chlorogénique, l'acide caféyl-5 quinique ounéochlorogénique et l'acide caféyl-4 quinique. Les feuilles de ces Tabacs ren­ferment également d'autres flavonosides comme la nicotiflorine (rhamnoglucoside­3 kaempférol) et l'isoquercitrine (monoglucoside-3 quercétine). Ces différentscomposés se retrouvent dans les feuilles de Nicotiana tabacum variété samsun. Ily a cependant une différence concernant la scopoline : ce glucoside de la scopo­létine (glucoside-7 scopolétine) est toujours décelé dans des extraits de feuil­les de Nicotiana tabacum samsun, mais est absent ou en quantité extrêmement fai­ble dans ceux des Tabacs de la variété xanthi n.c.

Les principales modifications métaboliques affectant CEScomposés peu­vent se résumer ainsi :

1.- La formation de lésions locales nécrotiques, se traduit par l'accumulationde flavonosides (rutine, nicotiflorine), d'acides chlorogéniques, d'a­cide para-coumaryl-3 quinique, d'acides férulylquiniques tout particu­lièrement d'acide férulyl-3 quinique. Ces derniers composés ne sontqu'à l'état de traces dans les Tabacs sains de la variété xanthi n.c.L'hypersensibilité s'accompagne de la production de caféyl-l glucose,

d'ortho-coumaryl-l glucose, mais surtout de férulyl-l glucose et de scopoline.Elle conduit à la formation de substances renfermant du glucose et dont la partiephénolique est soit un acide benzoique (acide vanillique, gentisique, para-hydro­xybenzoique) soit un dérivé de l'acide cinnamique (acides sinapique, mélilotiqueortho-coumarique). L'acide ortho-coumarique semble être présent dans les feuil­les nécrosées sous la forme de l'ortho-coumarique-l glucose, de l'ortho~coumaryl­

1 gentiobiose et du mélilotoside (hétéroside de l'acide ortho-coumarique et duglucose). La formation des nécroses d'hypersensibilité fait également apparaîtredes phénols comme la cichoriine (glucoside-7 esculétine), le férulyl-l gentiobio­se, le gentiobiose-7 scopolétine), et des substances non encore identifiées présentant entre elles des analogies de structures et qui possèdent certaines despropriétés des acides férulique et sinapique.

2.- Des dosages effectués en fonction du temps sur des feuilles saines et nécro­sées de Nicotiana tabacum xanthi n.c à 20 Oc montrent que l'accumula­tion des phénols est postérieure à ·1 'apparition de la nécrose. Celle­ci COMuence à apparaître dès 36 heures après l'inoculation dans nosconditions expérimentales. Les différences à 20 Oc entre plantes sai­nes et malades deviennent importantes quand les symptômes sont nette-

ment apparents, c'est-à-dire quand la synthèse du virus est pratiquement achevéeet que l'hypersensibilité est acquise. Ces variations maximales entre 60 et 156heures après inoculation, tendent ensuite à s'estomper pour les acides chlorogé­niques et les flavonosides. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus parCABANNE et coll. concernant l'activité de la polyphénoloxydase chez le Nicotianatabacum variété xanthi n.c infecté~20 Oc par le virus de la mosaique du Tabac.Ces auteurs ont montré en effet une augmentation de l'activité enzymatique aprèsl'apparition des lésions locales. Il en concluent que l'augmentation d'activité

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de la po1yphéno1oxydase n'est pas responsable de la mort des cellules, malS doitêtre une réaction secondaire postérieure à celle-ci.

L'augmentation de l'activité po1yphéno1oxydasique et l'accumulationphéno1ique sont donc plutôt les conséquences que les causes de ce processus. Lasynthèse de l'oxydase pourrait être déréprimée par un inducteur, ce dernier pou­vant être l'un des substrats de l'enzyme.

L'hypothèse suivant laquelle des quinones toxiques résultant de l'oxy­dation des phénols par la po1yphéno1oxydase, seraient capables de tuer les cel­lules malades et ainsi d'arrêter l'infection virale ne semble pas vérifiée.

3.- L'infection du Nicotiana tabacum variété xanthi n.c à 30 Oc conduit à unedinlinution très importante des teneurs en acides ch1orogéniques et enf1avonosides. Elle ne s'accompagne ni d'une accumulation des acidespara-coumary1 et féru1y1quiniques, ni de la pr~duction des nombreusessubstances caractéristiques de l'hypersensibilité. Cette baisse estsurtout importante pour des Tabacs virosés ayant séjourné à 30 Oc en­tre 36 et 156 heures après l'inoculation. A partir d'un temps de 204

heures à 30 oC, les plantes malades renferment des quantités d'acides ch1orogé­nlques et de f1avonosides plus élevées que les plantes saines correspondantes.

Au cours de sa multiplication, le virus doit détourner à son profitles métabolites qui interviennent directement ou indirectement dans la biosyn­thèse des phénols ; lorsque le taux de virus atteint son maximum dans les feuil­les infectées, les métabolites de l'hôte peuvent être de nouveau utilisés dansla chatne de réaction menant aux composés phéno1iques.

Il semble également que le séjour à 30 Oc entraîne chez le Nicotianaxanthi n.c sain, une certaine diminution de la teneur en acides ch1orogéniquesmais surtout en f1avonosides (rutine et nicotif1orine).

Nous avons constaté que si des feuilles nécrosées sont soumises à untransfert thermique de 20 Oc à 30 oC, ce qui permet la généralisation du virus,il y a une baisse importante de tous les composés phéno1iques et une disparitionbrutale des substances comme la scopo1ine , le féru1y1-1 glucose et l'ortllo-cou­mary1-1 glucose. L'inhibition de synthèse des substances phéno1iques doit corres­pondre à une production accélérée de particules virales (cette dernière étantdéclenchée par le retour à 30 OC).

Si la plante est inoculée à 30°C et laissée 36 heures à cette tempé­rature puis transférée à 20 oC, nous voyons apparaître des lésions locales de5 à 6 mm sur la feuille inoculée. Les Tabacs sont alors capables d'accumulerles composés caractéristiques de l'infection virale à 20 oC. Les dosages établisen fonction du temps sur de telles plantes confirment ceux obtenus à partir desN.xanthi n.c virosés à 20 oC. Ils indiquent que l'accumulation et la productiondes phénols sont postérieures à l'apparition des symptômes nécrotiques c'est-à­dire à la réaction d'hypersensibilité.

Il apparaît donc que d'une part, la multiplication du virus, d'autrepart, la température, affectent le métabolisme des phénols dans les feuilles deNicotiana tabacum variété xanthi n.c.

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4.- Le Nicotiana tabacum samsun bien qu'accumulant au cours d'une infection par.le virus de la mosaïque du Tabac, les acides chlorogéniques, les fla­vonosides et l'acide p-coumaryl-3 quinique ne produit ni les acides fé­rulylquiniques, ni les très nombreux composés apparaissant dans un Ni­cotiana tabac~~ variété xanthi n.c virosé à 20 oC. Nous avons aussiconstaté que l'accumulation en scopoline est moindre que dans un Tabacde la variété xanthi n.c.

Le métabolisme des composés phénoliques dans le Nicotiana tabacum xan­thi n.c virosé à 30 Oc est différent de celui existant dans le Nicotiana tabacumvariété samsun. Ces deux Tabacs pourraient réagir différemment à l'égard du virusde la mosaique du Tabac dans le cas d'une infection systémique.

Les observations cytologiques faites à l'aide du microscope électroni­que montrent que l'infection à 32 Oc d'un Tabac hypersensible et celle d'un Ta­bac sensible semblent provoquer des altérations cytologiques comparables, maisavec deux différences : le Nicotiana tabacum xanthi n.c renferme plus de virionsintranucléaires et les altérations des noyaux des jeunes feuilles infectées sontmoins durables que chez le Nicotiana tabacum variété samsun. La multiplicationvirale pourrait être plus importante dans le cas du Nicotiana tabacum xanthi n.cvi rosé à 30 oC, donc l'utilisation des systèmes métaboliques de l'hôte, et parconséquent cela entraînerait une accumulation moindre en phénols.

La stimulation de synthèse des phénols étant un phénomène accompagnantl'infection virale à 20 Oc du Nicotiana tabacum xanthi n.c, on peut penser quela formation de lésions locales nécrotiques s'accompagne de l'activation ducy­cIe des phospho-pentoses, c'est-à-dire, de la stimulation des enzymes apparte­nant à ce cycle, en particulier des deux déshydrogénases spécifiques (glucose-6phosphate, 6-phosphogluconate déshydrogénases). Cette voie oxydative fourniraitl'érythrose-4 phosphate et le NADPH2 (nicotinamide, adénine, dinucléotide phos­phate) nécessaires à l'élaboration des noyaux benzénique et indolique. Le coen­zyme est nécessaire à la réduction de l'acide déhydro-5 shikimique en acide shi­kimique. La dégradation du glucose se ferait préférentiellement par cette voieau dépens de la glycolyse. L'intensité de ce shunt, c'est-à-dire son utilisationpourrait être réglée soit par la vitesse avec laquelle certains termes intermé­diaires seraient susceptibles d'être utilisés dans un métabolisme propre, soitplutôt par les possibilités de réoxydation du NADPH 2 • Parallèlement à cela, ilpourrait s'effectuer des inhibitions enzymatiques de la voie d'Embden-Meyerhofpar certains produits de réaction du cycle des pentoses.

Il n'est pas certain que ce cycle des phospho-pentoses soit lié à desphosphorylations oxydatives, le NADPH2 produit pourraît être réoxydé par certainsprocessus non phosphorylants qùi fonctionneraient dans les tissus du Nicotianatabacum variété xanthi n.c, virosé à 20 oC.

La voie des phospho-pentoses n'est pas spécialement une voie énergéti­que comme la glycolyse et le cycle de Krebs, mais elle assure une réserve d'hy­drogène sous une forme active de NADPH2 utilisable dans les processus des bioxyn­thèses réductives.

L'intervention du cycle des pentoses au dépens d'un métabolisme éner­gétique dans la réaction d'hypersensibilité n'est pas en opposition avec les ré­sultats obtenus par SCALLA et coll. sur la perturbation du métabolisme du phos-

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phore dans le Nicotiana tabacum variété xanthi n.c virosé à 20 oC. Ces auteursont montré que l'apparition des symptômes de la réaction d'hypersensibilité estprécédée par une diminution de l'incorporation de l'ion phosphate dans les es­ters phosphoriques à la lumière et à l'obscurité. Le ralentissement des phospho­rylations ne peut être causé par une accumulation de produits d'oxydation desphénols. Les observations faites au microscope éLectronique sur des chloroplas­tes de Nicotiana tabacum xanthi n.c au cours de la réaction d'hypersensibilitémontrent que ces organites possèdent un système lamellaire désorganisé. Ces ob­servations sont en accord avec la diminution de l'intensité de la photosynthèseobservée par OWEN dans le cas d'une infection locale et nécrotique. Elles corres­pondent également également à une baisse des photophosphorylations. La désorgani­sation au niveau des chloroplastes doit entraîner une baisse dans la formationdu ribulose-1,5-diphosphate à partir du ribulose-S phosphate (catalysée par laphosphoribulokinase localisée dans les chloroplastes), et ainsi permettre la com­plète utilisation de ce métabolite dans la voie des phospho-pentoses.

si les composés phénoliques ne peuvent être considérés COIT@e interve­nant directement dans le blocage de la replication de l'ARN viral, il est toute­fois possible que l'inhibition pouvant intervenir dans l'activité de l'ARN re­plicase soit liée à ce cycle oxydatif des pentoses, l'accumulation des phénolsétant postérieure à la stimulation de cette voie.

Une des conséquences de l'infection virale à 20 Oc du Tabac hypersen­sible est l'accumulation de phénols sous forme de glucosides et d'esters du glu­cose. Cet apport de glucose pourrait être réalisé grâce à des enzymes utilisantcomme donneur glucose de l'uridine diphosphate glucose. De telles réactions sontconsidérées comme des mécanismes désintoxifiants, car l'administration de phé­nols aux plantes résulte en leur rapide conversion en ces dérivés du glucose.

L'hypersensibilité entraîne également l'activation des réactions deméthylation (production des dérivés de la scopolétine, de l'acide férulique, del'acide sinapique et de l'acide vanillique). Ce phénomène doit être la consé­quence de la stimulation de la O-rnéthyltransférase. Cet enzyme assurerait letransfert du groupement méthyle probablement sous forme de la S-adénosylméthioni-ne.

La présence de composés ortho-hydroxylés (acides ortho-coumarique, mé­lilotique) dans les feuilles nécrosées à 20 oC, montre que l'hydroxylation del'acide cinnamique peut se faire dans ce cas aussi bien en position ortho ,queparL' de la chaîne carbonée.

Les mécanismes contrôlant la"biosynthèse des phénols sont communs àtoutes les voies biosynthétiques. Ils font intervenir deux processus: d'abordla répression ou l'induction des systèmes enzymatiques, puis l'inhibition des ac­tivités enzymatiques par des métabolites de la chaîne biosynthétique. Dans cedernier type de régulation, il y a intrication d'!Ï:nhibitions successives par desproduits de la réaction, assurant une auto-régulation par un contrôle dit !làréaction" (feed-back control). L'accumulation de nombreux phénols dans les tis­sus virosés à 20 Oc de Nicotiana tabacum variété xanthi n.c, pourrait être provo­quée par la perte des propriétés régulatrices de ces enzymes allostériques invo­qués dans leur chaîne biosynthétique.

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