BIOCHIMIE, 1974, 56, 1315-1322.

Purification et dtude de la phosphatase acidc lutoidique du latex d'He ,ea brasiliensis.

Jean-Louis JACOB and Nicole SONTAG. Laboratoire de Biochimie de l 'Institut Francais du Caoutchouc,

42, rue Scheffer, 75016 Paris.

(25-7-197~).

Summary. - - The lutoidic serum of Hevea brasiliensis latex contains an acid phospha- tase (EC 3.1.3.2), very stable. It was important to kno'w the characteristics of the enzyme which can be implied with other phosphatases in the regulation of rubber synthesis. Next we isolated and completely purified it. Its molecular weight is estimated to he about 90 000-100 000. The utilisation of para-nitrophenylphosphate and phosphoenolpyruvate by this phosphatase which hydrolyses only phosphate monoesters, is particularly good. The optimum pH of this enzyme is around 5,5. Its Km value for para-nitropenylphosphate at lhis pH is 0,11 raM, but increases to 1 mM at pH 7,0. Ca2+, Na +, K +, sodium tartrate, dinitro-2,4-phenol, iodoacetamide and sodium citrate have no influence on the enzyme reaction. Orthophosphate, at physiological concentration, and inorganic pyrophosphate are competitive inhibitors. Zn2+, FNa, sodium arseniate, Cu2., lIg'-'~, but chiefly Mo4+ and W6+, are incompetitive inhibitors. The Ki value of these effectors has been mesured. Mg2÷ which has no effect on para-nitrophenylphosphate or NADP hydrolysis, acts as an inhibitor to'wards ATP hydrolysis. This ATP protection seems to be efficient since the cofactor is always found in the cytoplasmic serum of latex which contains in any case some free lutoi'dic acid phosphatase.

INTRODUCTION.

La pr6sence d 'act ivi t6s phosphatases dans le latex d'Hevea brasilie~tsis est connue depuis long- temps [1]. Leur r61e n6gatif sur l ' anabol isme iso- pr6nique a pu 6tre montr6 [2, 3, 4]. Pour pr6ciser ce ph6nom6ne, il 6tait impor tan t de conna i t re plus par t icu l i6rement ces enzymes, et pour cela de les isoler, afin d '6vi ter toute in terf6rence pouvant fausser les r6sultats concernan t leurs caract6ris- tiques. Une de ces hydrolases, la 2 '-nucl6otidase a 6t6 mise en 6vidence [4, 5] dans le s6rum cytoplas- mique, puts purifi6e [6] ; une autre phosphatase acide, peu sp6cifique (E.G. 3.1.3.2) existe dans les lutoides [7], par t icules monomembrana i re s assi- mil6es h des lysosomes v6g6taux [81 ; il 6tait donc n6cessaire de i '6 tudier arian de ce rner 6galement son inf luence m6taboliqne au sein du latex.

MATI~RIEL ET MI~THODES.

Matdriel vdgdtal.

Le latex d'h6v6a est r6colt6 en C6te d ' Ivo i re par saign6e de l 'arbre, dans des flacons de poly6thy- 16n.e en,tour6s de glace et exp6di6s le jour m6me, par avion, dans un r6cipient i so therme h 0°C. Le latex est r6cept ionn6 ving-quatre heures plus tard

au labora to i re de Paris ; il est alors centrifug6 durant 90 minutes, h 38 000 × g. Les lutoides sont lav6s avec une solution de manni to l 0,3 M, puts lys6s darts une solution fi 0,2 p. cent de Tr i ton Xl14. Apr6s centr i fugat ion (30 mn h 20 000 × g, le s6rum lu to id ique est pr61ev6. It peut 6tre utilis6, soit imm6diatement , soit lyophil is6 et conserv6 h - - 30°C.

Produits ulilisds.

Le Sephadex G200 et le DEAE Sephadex A 50 ont 6t6 pr6par6s selon les techniques [9, 10] pro- pos@s par le fabr iquant : Pha rmac ia F ine Che- micals (Uppsala, Suede). Le para-n i t roph6nylphos- phate et le b i s -paran i t roph~nylphospha te ont 6t6 fournis par Touzard et Matignon, t o u s l e s autres substrats phosphoryl6s , le cy tochrome C et les enzymes, par Boehr inger Mannheim GmbH (Mann- feim, Allemagne) ; le bleu dextran, le sulfate d 'am- monium purifi~ grade 1 et le diazo bleu B, par Sigma Chemical Compagny (St-Louis, Mo., U.S.A.), le d im6thylpropioni t r i le , par Koch Light Labora- tor ies (Colnbrook, Bucks, Angleterre) , l ' ac ry lamide et le ~-N'-m6thyl6ne bis-acrylamide, par Eas tman 's Organic Chemicals (Rochester, N.Y., U.S.A.), le naphtal6ne noir dix B, par Curr Ltd (Londres, Angleterre) et l ' a -naphtyl phosphate acide, par Calhiochem (Los Angeles, U.S.A.).

1316 J.-L. Jacob and N. Sontag.

Matdriel utilis&

Les centr i fugat ions ont 6t6 r6alis6es sur une ul t racentr i fugeuse Spinco L 50 ou Sorvall RC2B. Les dosages enzymatiques et colorim6triques ont 6t6 effeetu6s avec un spectrophotom6tre Jobin et Yvon, type Maroc I,I coupl6 h u n enregis t reur Beckman 10 pouces. Les colonnes utilis6es pour les s6parations sur gel et l ' appare i l h gradient Mixer GM-1 sont fabriqu6s par Pharmac ia F ine Chemicals. Les fract ions d '~lut ion ont 6t6 r6cup6- r6es par un collecteur LKB Radirac. Les 61ectro- phor6ses ont 6t6 faites ~ l 'a ide d 'un apparei l << Polyanalyst >> Buehler.

Contr6le de la purification. A chaque 6tape de la purif icat ion, l 'activit6 phos-

phatasique a 6t6 mesur6e de la manibre suivante : Dans une cure de spectrophotombtre de 3 m l e t de 1 cm d'6paisseur, on in t rodui t , pour un volume r6act ionnel de 1 ml, 100 !M de tampon ac6tate 1 M

pH 5,5, et une aliquote de s6rum contenan t de 0,004 ~ 0,015 unit6 de phosphatase acide. La r6ac- t ion .est d6marr6e par l ' add i t ion de 20 ~moles. de parani t roph6nylphosphate , puts bloqu6e par 2 ml de KOH 1N aprbs 2 mn d ' incuba t ion ; la format ion du para-n i t roph6nol est mesur6e ~ 400 nm [11].

Les prot6ines sont dos6es par mesure de l 'absor- bance ~ 260 et h 280 nm, en ut i l i sant les coeffi- ci.ents d6finis par Warburg et Chris t ian [12].

L'unit6 d'aetivit6 est la quanti t6 d 'enzyme qui hydrolyse 1 ~mole de para-n i t roph6nylphosphate par minu te darts les condi t ions d6crites. L'activit6 sp6cifique est exprim6e par mi l l igramme de pro- t6ines.

Les 61ectrophorbses sur gel de polyacry lamide ont 6t6 r6alis6es selon des m6thodes d6]~ d6crites [6, 13].

METHODES UTILISEES LORS DE L'ETUDE DES CARAC- TERISTIQUES DE LA PHOSPHATASE ACIDE.

Incubation.

L'6tude de ]a phosphatase acide a 6t6 r6alis6e par incuba t ion h 28°C dans des pi t lul iers bouch6s, con tenan t 0,2 M de tampon en presence de para- n i t roph6nylphosphate ou d 'un autre substrat phos- phoryt6. Des pr616vements ~ 30 secondes, 6, 12 et 18 minutes sont effectu6s sur chaque 6chant i l lon ; les r6actions sont bloqu6es par KOH 1 N dans le seul cas du dosage du para-n i t roph6nol [11] ou par addi t ion de 0,2 ml de CIO~H 6 M, par mil l i l i t re dans tes autres cas ; la solut ion est alors neutra- lis6e par KOH 6 M ; le perchlorate de potassium form6 est 61imin6 par centr i fugat ion ; les diff6rents dosages sont effectu6s sur le surnageant .

Dosage du para-nitrophdnol.

Est imat ion directe en mil ieu basique h 400 nm N i l .

Dosage du phosphate fibre.

La m6thode de Chen et al [14] a 6t6 utilis6e.

Dosage enzymatique.

Le NAD a 6t6 dos6 selon la m6thode de Klingen- berg [I5], I 'ADP et I'AMP selon la m6thode de Adams [16] et I 'ATP selon la m6thode de Lam- precht et T:rantschold [17].

DHermination du poids moldcu[aire.

Le poids mo16culaire a 06 estim6 par fi l tration sur colonne de Sephadex G 200 [6, 18].

RI~SULTATS EXP]~RIMENTAUX.

1. Purification de la phosphatase acide.

Le tampon utilis6 au cours de la purit~cation cont ient : t r i6 thanolamine 100 mM, EDTA 10 mM, mercaprto6thanol 10 mM ; il est ajust6 h pH 7,0.

Etape 1 : 70 g de s6rum lutoidique lyophilis6 sont dissous dans du tampon /t 4°C. Le volume est ajust6 h 700 ml, puts compl6t6 par 14 ml d 'une solution de (NH4)2 SO 4 satur6e. Au m61ange refroi- di dans un bain glace-sel et agit6 6nergiquement , on ajoute 1,65 fois le volume ini t ia l de m6thanol h - - 3 0 ° C . La suspension est centrifug6e pendan t 10 mn h 10000 × g. Le surnageant est 6cart6, le pr6cipit6 est lyophilis6 puts mis en suspension h l 'aide d 'un Potter dans envi ron 350 ml d'eau. La suspension .est centrifug6e h 0°C pendan t 10 mn h 15 000 × g. Le pr6cipitfi est 6cart&

Etape 2 : aux 350 ml du surnageant , on ajoute 6,1 ml de CI2Mn 1M, puts du (NH~) 2 SO4, jusqu'h 35 p. cent de saturat ion. La suspension est centr i - fug6e h 0°C, 15 mn h 15 000 × g. Le pr6cipit6 est 6cart6, du (NH4) 2 SO4 est ajout6 au surnageant jusqu'~ 57 p. cent de saturat ion. La suspension est Iaiss6e en repos 30 mn, puts centrifug6e ~ 0°C, 15 mn h 15 000 × g. Le surnageant est 6cart6, le pr6cipit6 est dissous avec de l'.eau et le volume ajust6 de manibr.e "~ ohtenir 7,5 mg de prot6ines par mill i l i tre.

Etape 3 : la solution de prot6ines est t r a i t& avec 50 p. cent de son volmne par une suspension de bentoni te dans de l 'eau (36 mg/ml) . Le m61ange est agit6 vigoureusement pendan t 10 mn, puts cen- trifug$ ~ 0°C, pendan t 15 inn ~ 15 000 × g, le pr6- cipit6 est 6cart&

Etape 4 : les prot6ines du surnageant sont pr6- cipit6.es par addi t ion de (NH)_~SO,~ jusqu'h 45 p.

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

L a p h o s p h a t a s e acide du la tex d'hdvda. 1317

cent de saturat ion. La suspension est centrifug6e /i 0°C, 15 ran, h 15 000 × g, le pr6eipit6 est 6cart6. Du (NH4)eSO 4 est dissous darts le surnageant jus- qu'h 57 p. eent de saturat ion. La suspension est laiss6e au repos 60 ran, puis centrifug6e h 0°C, 15 mn, h 15 000 × g ; le surnageant est 6cart6, le pr6cipit6 est dissous avec un m i n i m m n de volume de tampon con tenan t 50 mM de G1Na ; la solution est dialys6e h 4°C contre ce tampon pendan t 15 heures.

Etape 5 : les prot6ines du dialysat sont fix6es sur une colonne (2,5 × 40 cm) de DEAE Sepha- dex A 50, 6quilibr6 avec du tampon de dialyse.

I Froctlon5 ~ ~ ~ r~cuper~es ] ~o '.~-

==

'~ 1( 0,10

0 50 100 150 200 250 300 VOLUME 13" ELUTION { rnl ) Fz6. 1. - - Purification de la phosphatase acide par

chromatographie sur gel de DEAE-Sephadex A-50.

l in6aire de 50 h 150 mM de C1Na. Les fract ions les plus actives sont rassembl6es.

Etape 8 : les prot6ines sont pr6cipit6es par addi- t ion de (NH4)~SO 4 jusqu'h 80 p. cent de saturat ion, le pH est stabilis6 h 7,0 par addi t ion de HC1 2N. La suspension est laiss6e au repos pendan t 3 heures, puis centrifug6e 15 mn h 15 000 × g, 0°C. Le surnageant est 6cart6, le pr6cipit6 est dis- sous avec 400 ,d de tampon contenant 200 mM de C1Na. La solution est filtr6e sur une colonne (1,5 × 90 cm) de Sephadex G 200 6quilibr6 puis ,$1u6 avec du tampon de dissolution. Les 5 fract ions les plus actives sont rassembl6es. Les prot6ines sont pr6ci- pit6es par addi t ion de (NH4)eSO 4 jusqu'h 80 p. cent de saturat ion, le p H e s t stabilis6 h 7,0 par addi t ion de HCI 2N. La suspension est laiss6e au repos 12 heures, h 0°C, puis eentrifug6e, 15 mn h 15 000 × g. Le surnageant est 6cart6, le pr6cipit6 est dis- sous clans 3 ml d'eau.

Le tableau I r6sume l 'ensemble des r6sultats obtenus. Les 61ectrophor6ses (fig. 2) r~alis6es avec

÷

Elles sont ensuite 61u6es avec un gradient con t inu et l in6aire de 50 h 200 mM de C1Na (fig. 1). Les fract ions contenant l 'activit6 enzymat ique sont rassembl6es.

Etape 6 : les prot6ines sont pr6cipit6es par addi- t ion de (NH4)eSO 4 jusqu'h 80 p. cent de saturat ion, le pH est stabilis6 h %0 par add i t ion de HCI 2N. La suspension est centrifug6e /~ 0°C, 15 mn h 15 000 × 9, apr6s un repos de 3 heures. Le surnageant est 6cart6, le pr6cipit6 est dissous avec 500 ~1 de tampon con tenan t 200 mM de CINa. La solution est filtr6e sur une colonne (1,5 × 90 cm) de Sephadex G 200 6quilibr6 pu is 61u6 avec du tampon compl6t6 avec 200 mM de C1Na. Les f ract ions les plus actives sont rassembl6es, puis dialys6es ~ 4°C pendan t 15 heures, contre ce tampon con tenan t 50 mM de G1Na.

Etape 7 : les prot6ines du dialysat sont fix6es sur une colonne (1,0 × 10 cm) de DEAE Sephadex A 50, 6quilibr6 avec du tampon de dialyse. Elles sont ensui te 61u6es avec un gradient cont inu et

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

A B

FI•. 2. - - Mise en ~oidence par dlectrophorbse sar gel de polyacr!llamide de la phosphatase acide purifide.

(AI R6v61ation de l'activit6 enzyrnatique (substrat : tt naphtylphosphate).

(B) R6v61ation des prot6ines (m6thode utilisant le naphtal6ne noir dix B).

la solution enzymat ique purifi6e mont ren t une seule bande d'activit6 et une seule bande de pro- t6ine correspondante , conf i rmant la puret6 de la phosphatase acide obtenue par eette m6thode.

1 3 1 8 J . -L . Jacob a n d N. Son tag .

TABLEAU I.

Puri f icat ion de la phosphatase acide du latex d ' H e v e a b r a s i l i e n s i s : les di[[~rentes ~tapes de l'op~ration.

~tapes

Non trait6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. M6thanol V X 1,65 . . . . . . . . . . . . . . 2. ( N H 4 ) , , S O , 35 % - 5 7 % . . . . . . . . . . 3. B e n t o n i t e i ' . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4. (NH 4) .,SO 4 45 Yoo - 65 % . . . . . . . . . . 5. DEAE Sephadex A 50 . . . . . . . . . . . . . 6. Sephadex G 200 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7. DEAE Sephadex A 50 . . . . . . . . . . . . . 8. Sephadex G 200 . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Activit~ Prot6ineSmg to~le

50 120 16 492 7 625 14 371 3 575 10 237

667 I 7 125 439 I 5 225

29,51 ~ 325 9,9 1 551 7,2 1 398 3 ,2 65g

Activit6 r6cup6r6e

p. cent

87 62 43 31 14

9

Purili- cation

5,7 8,7

32,4 36,1

239,3 470,9 589,7 627,2

Activit6 sp6cifique

U/mg

0,329 1,884 2,863

10,682 11,892 78,730

155,400 194,160 205,700

2. ETUDE DE QUELQUES PROPRII~TI~S DE LA PHOS- PHATASE ACIDE.

Stabilit~ de l 'enzyme.

L a p h o s p h a t a s e a c i d e pur i f i6e , d i s s o u t e d a n s de l ' e a u e t c o n s e r v 6 e h 4°C, ne p r 6 s e n t e p a s de p e r t e d ' a c t i v i t 6 a p r b s 3 m o i s d.e s t o c k a g e . Le c h a u f f a g e

TABLEAU II .

Stabilit6 thermique de la phosphatase acide.

Temp6rature °C

30 39 51 60 69 78 88 94

Vitesse (Unit6s arbitrairesl

0,57 0,57 0,57 o ,57 U ,53 0,18 0,03 0,03

Inactivation %

0 0 0 0

11 70 95 95

Les solut ions enzymat iques sont plongdes dans un ba in-mar ie , h la t emp6ra tu re indiqu6e, pendan t 3 mi- nutes, puis refroidies dans la glace avan t dosage de l 'act ivi t6 par incuba t ion h 28°C.

p e n d a n t 3 m n n e p r o v o q u e p a s d ' i n a c t i v a t i o n jus - q u ' h 60°C ( t a b l e a u H) .

Energie d' activation.

Des i n c u b a t i o n s o n t 6t6 e f f e c t u b e s h d i f f 6 r e n t e s t e m p 6 r a t u r e s e n t r e 1,5 e t 50°C ; les v i t e s s e s c o r r e s - p o n d a n t e s n o u s o n t p e r m i s de d 6 t e r m i n e r u n e 6 n e r g i e d ' ac . t iv~ t ion d.e 12,26 K c a t mot-~ (fig. 3).

Poids moldculaire.

Sa v a l e u r a 6t6 e s t i m 6 e e n t r e 90 000 et I00 000, p a r f l t r a t i o n s u r gel de S e p h a d e x G 200 (fig. 4).

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

LOG V

31 32 33 34 35 36

10 -4 T

Fro. 3. - - Log de la vitesse e n fonction de l'inoerse de la lemp6ratnre absolue (T) pour d~lerminer l'6ner- gie d'actioation.

1,9 Ve/Vo

1,8 ~ m e C

1,7

1,E

1,5 ~ - No[ate d~shydrog~nose

\ 3,4 - Phosphotose

1,3 ~ ~ - Aldotose d~shydrog~nase

d~shydrog~nese 1,;

1,1 dextran

1 1 lo 4 ~1o s 1.1o 6

POIDS [40L ECULAIRE

FIe. 4. - - Ddtermination du poids mol6culaire de la

~ hosphatase acide par [illration sur gel de Sephadex 200.

Analgse des produits de la r6action.

Le p a r a - n i t r o p h 6 n y l p h o s p h a t e h y d r o l y s 6 l i b ~ r e d u p a r a n i t r o p h ~ n o l ,et d u p h o s p h a t e e n q u a n t i t ~ 6 q u i v a l e n t e ; n o u s a v o n s 6 g a l e m e n t v6rif i~ la sto6- c h i o m 6 t r i e de la r 6 a c t i o n a v e e le N A D ~ ( t a b l e a u

L a p h o s p h a t a s e acide du la tex d'h~vda. 1319

I I I ) ; les r6sultats obtenus pr6sentent une bonne concordance. I1 faut remarquer que, daBs ces con- di t ions d'exp6r~ence off la quanti t6 de produi ts form6s est tr6s faible par rappor t h la concentra- t ion de substrat, la vitesse es.t l in6aire en fonct ion du temps.

pho6nolpyruvate est par t icu l ibrement bien utilis6. Le NADP, dont l 'hydrolyse en NAD est souvent le fait de phosphatases basiques [193, peut 6tre consid6r6 comme un substrat assez r6actif de cette phosph.atase acide. Le coenzyme A lui-m6me est attaqu6, ce qui peut avoir, daBs certaines condi-

TABLEAU III.

Inf luence du temps d' incnbation sur la formation des produits d 'hydrolyse du para-ni trophdnylphosphate et du NADP.

Substrats

Dur6e de la r6daction PNPP : 3 mM NADP : 3 mM

mn PNP form6 Pi form6 NAD [orm~ Pi form6

mM mM mM mM

6 0,160 0,154 0,065 0,059 12 0,335 0,301 0,131 0,114 18 0,485 0,459 0,179 0,187

Incubation en tampon ac6tate 0,2 M pH 5,5.

Inf luence du pH.

C.ett.e phosphatase pr6sente un max imum d'act i- vit6 & pH 5,5 (fig. 5) : elle est donc de type aeide.

i Tampon Tampon

z ~3

2 ,

l •

e ~

4 5 6 7 8 pH

Fro. 5. - - Actit~itd de la phosphatase acide en fonc- tion du pH.

Sp~eificitd de £enz!tme.

La phosphatase acide lib6re le phosphate d 'une grande vari6t6 d'esters monophosphor iques (tableau IV), mats ne pr6sente pas d'activit6 dies- terase. L 'ATP est attaqu6 plus rap idement que I'ADP et I'AMP et, d 'une mani6re @n6rale, les nucl6otides monophosphates sont plus f a iblement hydrolys6s que les di ou tr iphosphates. Le phos-

tions, une grande impor tance dans la synth6se du caoutchouc [20].

Affinit~ pour diff~rents substrats.

Les valeurs du Km de la phosphatase acide ~t pH 5,5 : pour le para -n i t roph6nylphospha te 0,11 mM .(fig. 6), I 'ATP 0,13 mM et le N, ADP 0,20 raM, n e sont pas tr6s diff6rentes ; par contre, le Km du para-n i t roph6nylphosphate h pH 7,0 att.eint une valeur de 1 mM.

cn 6 + O, 25mM de / Pyrophosphote /A de sodium

5 /

Q] /

• ~ / + 0,25 mM / / ~ dede Phosphote

3 / sodium /

2 oin

- 5 5 ,/[P.PP] C,/n~.I Fro. 6. - - Activitd de la phosphatase acide en [auc-

tion de la concentration en para-nitrophdnylphosphate, en prdsence ou non de pyrophosphate on de phospbate de sodium.

Inf luence de quelques effecteurs sur l'activit~ phosphatasique.

Le phosphate et le pyrophosphate sont des inhi- bi teurs comp6titifs (fig. 6).

BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 10.

1 3 2 0 J.-L. Jacob and N. Sontag.

C o m m e l es p h o s p h a t a s e s en g 6 n 6 r a l [21], l ' e n -

z y m e 6 t u d i b e est t r b s i n h i b 6 e p a r de f a i b l e s c o n c e n .

t r a t i o n s de t u n g s t a t e o u de m o l y b d a t e ( t a b l e a u V).

Le m e r c u r e , le f l u o r u r e e t l ' a r s e n i a t e de s o d i u m , le

c u i v r e et le z i n c , s o n t 6 g a l e m e n t i n h i b i t e u r s . P a r

c o n t r e , le s o d i u m , le p o t a s s i u m , le c a l c i u m et le

m a g n 6 s i u m , r e s t e n t s a n s e i fe t s u r le f o n c t i o n n e -

m e n t de l ' e n z y m e , de m 6 m e q u e le t a r : r a t e et le

c i t r a t e de s o d i u m , le 2 - 4 , d i n i t r o p h 6 n o l et l ' i o d o - a c 6 t a m i d e .

Cas particulier de l'hydrolyse de I'ATP en prd- sence de magnesium.

E n 6 t u d i a n t l ' i n f l u e n c e d u m a g n 6 s i u m , n o u s

a v o n s r e m a r q u 6 q u ' e n p r 6 s e n c e d u c a t i o n , la

v i t e s s e d ' h y d r o l y s e de I ' A T P 6ta i t p l u s f a i b l e q u e

TABLEAU IV.

Vitesse d'hydrolyse relative par la phosphatase acide de diff~rents substrats.

Substrats 3 mM

Para-n i t rophdnylphospha te . . . . . . . . . . . . . . . F rue tose- t ,6 -d iphospha te . . . . . . . . . . . . . . . . . Fruc tose-6-phosphate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glueose-6-phosphate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 phosphogluconate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ribose-5-phosphate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E ry th rose -4-phospha te . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Acide 2-phosphogiyc6rique . . . . . . . . . . . . . . . Acide 3-phosphoglyc~rique . . . . . . . . . . . . . . . Phospho~nolpyruva t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DL glye6rald6hyde phospha te . . . . . . . . . . . . 3-glye6rophosphat e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aeide 2,3-diphosphoglycdriqu e . . . . . . . . . . . . Aeide phosphoglyeol ique . . . . . . . . . . . . . . . . . Phosphos6rine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Thiamine py rophospha te . . . . . . . . . . . . . . . . . Uridine diphosphoglucose . . . . . . . . . . . . . . . . Pyr idoxa l -5 ' -monophosph ate . . . . . . . . . . . . . : B is -para -n i t rophdnylphospha te . . . . . . . . . . .

Vilesse relative

100 12 2 5

27 10,5

o 27 38 81 15,5 11,5 25

8 ,5 15,5

0 0

19 0

Substrals 3 mM

Ad6nos ine-2 ' -monophosphate . . . . . . . . . . . . . Ad~nos ine-3 ' -monophosphate . . . . . . . . . . . . . Ad6nosine-5 ' -monophosphat e . . . . . . . . . . . . . Addnosine-5 ' -diphosphate . . . . . . . . . . . . . . . . Ad6nosine-5 ' t r iphosphate . . . . . . . . . . . . . . . . Ad6nosine-2' , 5 ' -d iphosphate . . . . . . . . . . . . . Ad6nosine-3' , 5 ' -d iphosphate . . . . . . . . . . . . . Ad6nosine-3' , 5 ' -monophospha te . . . . . . . . . . Nicotinamide ad6nine dinuch!otide phospha te Nicot inamide ad6nine dinuel~!otide phos-

pha te r6duit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Coenzyme A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Guanos ine -3 ' -monophospha te . . . . . . . . . . . . . Guanos ine-5 ' -monophospha te . . . . . . . . . . . . . Guanosine-2 ' , 5 ' -d iphosphate . . . . . . . . . . . . . Guanosine-3 ' , 5 ' -d iphosphate . . . . . . . . . . . . . Gu anosine_5'- t r iphosphate . . . . . . . . . . . . . . . . Cyt id ine-3 ' -monophosphate . . . . . . . . . . . . . . . Ur id ine-5 ' -monophospha te . . . . . . . . . . . . . . . Uridine-5 ' - t r iphosph at e . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Vitesse relative

1 7 7

15,5 42 19 14

0 39

18 40

4 0

17 21 46 18,5

2 20

Les i ncuba t i ons son t r~alis~es h 28°C, en t a m p o n ac6tate 0,2 M, h pH 5,5.

TABLEAU V.

Influence de quelqnes effecteurs sur le fonctionnement de la phosphatase acide.

Para-nitro- ph6nylphos

phate mM

0,14 h 20 0,14 h 20

2O 2O 20 2O 2O 2O 20

2O 2O 2O 20 20 2O

lnhibiteurs

Py rophospha te sodium . . . . . . . . Phospha t e sodium . . . . . . . . . . . .

W 6~ (Tungs t a t e de sodium) . . . . Mo ~+ (Molybdate d ' ammonium) . Hg ~+ (Chlorure mercur iqde) . . . . Cu ~÷ (Sulfate de cuivre) . . . . . . . Zn ~-+ (Chlorure de zinc) . . . . . . . F luorure de sodium . . . . . . . . . . . Ars6niate de sodium . . . . . . . . . .

Ca ~+ (Chlorure de calcium) . . . . . Mg ~ (Chlorure de m a g n e s i u m ) . . Citrate de sod ium. , . . . . . . . . . . . Ta r t r a t e de sodium . . . . . . . . . . . D in i t ro -2 ,4 -phdno l . . . . . . . . . . . . Iodoac6tamide . . . . . . . . . . . . . . . .

Coneen tration de

l ' inhibileur

2 ,5 10 -4 M 2,5 10 -4 M

0 h i 10-6M 0 h 7 10 -7 M

• fi 1 10 -4 M 0 h l 10-:~ M 0 h 3 10-3 M 0 h 5 10 -~ M 0 h 1 10 -'2 M

0 h 3 10-aM 0 h l 10-~M 0 h 5 10-u M 0 h 5 10-~ M 0 h l 10-~M 0 h l 10-~M

Les i ncuba t i ons on t 6t6 r6alis6es h 28°C en pr6sence de

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Ki fi pH 5,5

6,9 10 -'~ M 1 , 8 10 -~ M

1 , 8 10 -7 M 2,1 10-7 M 9 ,0 10 -6 M 4 ,5 10 -~ M 6,2 10 -4 M 4 ,0 10 -~ 1 , 0 10 -3

Type de l'inhibltion

Comp~!titive Comp6ti t ive

Non eomp6ti t ive Non comp6ti t ive Non eompdti t ive Non compdtil ive Non eomp6ti t ive

M Non comp6ti t ive M Non comp6ti t ive

Sans influence Sans influence Sans influence Sans influence Sans influence Sans influence

0,2 M de t a m p o n acdtate h pH 5,5.

La p h o s p h a t a s e acide du la tex d'hdvda. 1321

celle du t6moin sans magn6sium (tableau VI). Le ph6nombne ne se p rodui t ni avec 1.e parani t roph6-

TABLEAU VI.

Inf luence de la concentration du magnesium sur la vitesse d'hydrolyse de rATP.

Substrat

ATP 0,5 mM

Maga6sium mM

0 0,1 1

10

Vitesse Inhibition A D0/t0 mn p. cent

0,168 0,144 14,3 0,085 49,5 0,020 88,1

Irmubation h 28°C en pr6sence de 0,2 M de tampon ae6tate h pH 5,5.

nylphosphate , ni avec le NADP. La cause exacte de cette act ion est ce r ta inement tr~s complexe. Nous pouvons, cependan t ind iquer que le magn6sium sembl.e, dans ce cas, se compor te r comme un inhi-

TABLEAU VII.

Influence de 1 mM de magnesium sur la vilesse d 'hydrolyse de I'ATP.

ATP mM

0,2 0,5 1,0

Vitesse

T6moin A DO/t0 mn

0,125 0,190 0,240

+ t raM Mg A DO/t0 mn

0,042 0,100 o,150

Inhibition p. cent

66,4 47,4 37,5

Incubation h 28°C en tampon acetate 0,2 M h pH 5,5.

b i leur comp6ti t i f (tableau VII) ; cette inf luence peut 6tre due h une carence en ATP provenan t de la fo rmat ion du chelat ATP-Mg, lui-m6me, moths bien utilis6 que I'ATP.

DISCUSSION.

La pur t~ca t ion complete 4e la phosphatase acide n6cessite un n ombre impor tan t d '6tapes que seuls une enzyme p.eu labite pouvai t permet t re .

La sp6cificit6 de ce type d 'enzyme est trbs var iable [22~ et assez v a s t e ; elle diff~re beaucoup selon la source dont p rov ien t l 'hydrolase, m6me au sein du r6gne v6g6tal [23, 2~, 25, 26]. La phospha- tase acide lu toidique utilise par t icu l i~rement bien le phospho6nolpyruvate . I1 faut r emarque r qu 'el le n 'a aucune act ivi t6 diest6rase associ6e, cont ra i re-

ment ~ cer ta ines hydrolases vdg6t.ales [24, 25]. Comme la 3-phospho-glyc6rate phosphatase des feuilles de cannes h sucre [25], l'.enzyme du latex hydro lyse un cer ta in nombre de nuc16otides, mats moins eff icacement que la phosphatase acide de feuilles de pots [26]. De m6me que la p lupar t des enzymes de ce groupe, elle ne n6cessite pas de cations act ivateurs et est inhib6e for tement pa r de faibles doses de tungstate et de molybdate [21]. L ' inf luence du magn6sium sur l 'hydro lyse de I 'ATP par la phosphatase ac ide n 'a 6t6 ment ionn6e que ra rement ; il est possible q u e c e ph6nom6ne qui fair in te rven i r le rappor t de concent ra t ion ATP/Mg soit parfois pass6 inaper~u ; toutefois, cer ta ins auteurs notent un.e inh ib i t ion en pr6sence de ce cat ion [27, 28], qui, par contre, n 'a effect ivement aucun effet sur l 'enzyrne de la feuille de pots lorsqu 'e l le uti l ise I 'ATP [26].

I] est trbs impor tan t de rep lacer cette enzyme drans son cadre biologique ; sa local isat ion est in t rapar t icu la i re , mats le cytoplasme en cont ient toujours un peu du fait, notamment , des stress con- s6cutifs h la saign6e de l'arrbre ]ors de la r6colte du latex [29]. Darts ce cas, la phosphatase acide a une influence n6faste puisqu 'e l le tend h ca rence r le mili.eu en mol6cul.es indispensables ~ la synthbse du caoutchouc (ohospho6nolpyruvate , coenzyme A, NADP...). Cependant , un cer ta in hombre de fac- teurs sont capables de f re iner son activit6 ; si le s6rum in t rapar t i cu la i re a u n pH proche de l 'opti- mum de fonc t ionnement de la phosphatase acide [29, 30], celui du s6rum cytoplasmique, voisin de la neutrali t6 [29, 30], en t ra lnera une d iminut ion de l 'activit6, mats aussi de l 'affinit6 enzymatique. D'autre part, le phosphate , dont la concent ra t ion est de l 'o rdre de 10 mM darts le s@um cyto~las- mique [31], est un inh ib i teur efficace, compte tenu de la faible concent ra t ion des prodni t s phospho- ryl6s susceDtibles d'6tre hydrolys6s F32]. L 'ATP est, pa r ailleurs, prot6g6 par ]e magn6sium, dont la concent ra t ion est d ' env i ron 10 mM I32]. Cette pro- tect ion semble par t icu l ibrement efficace, puisque l 'on re t rouve toujours ce cofacteur dans le s6rum cytoplasmique du latex [32], alors oue la p lupar t du temps des produi ts tels que le NA,DP ou 1,e coen- zyme A sont trbs diff ici leme~t d6celables.

Remerciements.

Nous tenons h remercier Mademoiselle B. Velasquez, dont la collaboration technique au cours de ce tra- vail nous a ~t~ d'un grand secours.

R~SUM~.

La phosphatase aeide (EC 3.I.3.2) contenue dans le s~rum lutoidique du latex d'Hevea brasiliensis a ~t~

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eomplbtement purifi6e. Elle est pcu labile. Son poids mol6culairc a ~t~ estim6 entre 90 000 et 100 000. Cette phosphatase qui hydrolyse uniquement tes phospho- monoesters h des vitesses variables, util ise part icu- l iSrement bieu le para-n i t rophdnylphosphate et ]e phospho4nolpyruvate. Son pH opt imum de fonct ionne- ment est sitn6 aux environs de pH 5,5 ; le Km pour le para-ni tro.ph6nylphosphate h cc pH est de 0,11 raM, mais at te int 1 mM h pH 7,0.

Les ions Ca2+, Na ÷, K ÷, le ta r t ra te de sodium, le 2,4-dinitroph~nol, l ' iodoac~tamide et le citrate de so- d ium sont sans in fuence sur la rdaction enzymat ique ; le phosphate inorganique, h des concentrat ions phy- siologiques, et le pyrophosphate sont des inhibi teurs eomp~titifs ; le tungstate, le molybdate, le mercure, le cuiw-e, le zinc, l 'ars6niate et le fluo.rure de sodium, sont des inhibi teurs ineomp4tit ifs. La valeur du Ki de ces effeeteurs a 6t~ mesur6e. Le magnesium, qui n 'est pas n6cessaire au fonct ionnement de l 'enzyme et reste sans effet sur l 'u t i l i sa t ion du para-Bitroph6nylphos- phate ou du NADP, se comporte comme un inhib i teur de l 'hydrolyse de I'ATP. Cette protection de I'ATP semble efficace, puisque l 'on retrouve toujours ce cofacteur dans le s6rum cytoplasmique du latex mal- gr6 la presence constante d'ufle quantit~ plus ou moins impor tan te de p~osphatase acide lutoidique.

BIBLIOGRAPHIE.

1. Archer, B. L., Audley, B. G., Cockbain, E. G. ,~ Mc Swenney, B. P. (1963) Biochem. J., 89, 565-574.

2. Pujarniscle , S. & Ribail l icr , D. (1966) Rev. Gdn. Caout., 43, 226-228.

3. Ribaill ier, D. (1968) Rev. G~n. Caout., 45, 1395- 1398.

4. Jacoh, J. L., Ribaill ier, D. & d'Auzac, J. (1970) Phy- siol. Vdg., 8, 247-262.

5. Jacob, J. L. (1969) C. R. Hebd. Sdances Acad. Sci. Set. D (Paris), 269, 1573-1576.

6. Jacob) J. L. ,& Sontag, N. (1973) Eur. J. Biochem., 40, 207-214.

7. Ribaill ier, D., Jacob, J. L. ~ d'Auzac, J. (1971) Phy- siol. Vdg., 9, 423-437.

8. Pujarniscle , S. (1968) Physiol . Vdg., 6, 27-46. 9. Pharmacia Fine Chemicals (1966) Sepbadex,

Thdorie et prat ique de la f i l t ra t ion sur gel, pp. 1-56, Beckman Hanson AB/Eklunds ~ Va- satryek, Uppsala.

10. Pharmacia Fine Chemicals (1970) Echangeurs d' ions Sephadex : Manuel de travail pour la chromatographie d'dchangeurs d'ions, pp. 1-47, Uppsala.

and N. Sontag.

11. Bessey, O. A., Lo~ry, O. H. a Brock, M. J. (1946) J. Biol. Chem., lCM, 321-329.

12. Layne, E. (1957) in Methods in Enzymol . , (Colo- wick, S. P. et Kaplan, N. O. ed), Vol. III, pp. 451- 484, Academic Press, New York.

Pearse, A. G. E. (1960) His tochemis t ry Theoretical applied, 2 BEd., pp. 998. Little Bro:wn and Co.

Chen, P. S., Jr., Toribara, T. Y. & Warner , H. (1946) Anal. Chem., '28, 1756-1758.

Klingenberd, M. (1963) in Methods of Enzymat i c Analys i s (Bergmeyer, H. U., ed.) pp. 528-538, Academic Press, New York and London.

16. Adams, H. (19'63) in Methods of Enzymat i c Ana- lysis (Bergmeyer, H. U., ed.) pp. 573-580, Acade- mic Press, New York and London.

17. Lamprecht, 'W. a Trautschold, I. (1963) in Melhods of Enzymat i c Analys is (Bergmeyer, H. U., cd.) pp. 543-541, Academic Press, New York and London.

18. Andrews, P. (1965) Biochem. J., 96, 595-606. 19. Nakamoto, T. ~ Wennesland, B. (1960) J. Biol.

Chem., 2,$5, 202-204. 20. Lynen, F. (1969) J. Rubber Res. Inst . Malaya, 21,

389-406. 21. Courtois, J. E. a Perles, R. (19'64) Biochimie G~nd-

rale, Vol. 2, 2nd fast. , p. 383, Masson et Cie, Paris.

22. Barman, T. E. (1969) E n z y m e Handbook, Vol. II, pp. 523-524, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Ne'w York.

23. Baker, J. E. ~ Takeo, T. (1973) Plant. Cell. Physiol . , 14, 459-472.

24. Suzt~ki, T. & Sato., S. (1973) Plant. Cell. Physiol . , 14, 585-594.

25. Randal, D. D. a Tolbert, N. E. (1971) J. Biochem. Chem., 246, 5510-5517.

26. Forti , G., Tognoli, C. a Parisi , B. (1962) Biocbim. Biophys. Acta, fi2, 251-260.

27. Rungie, J. M. a Wiskich, J. T. (1973) Plant. Phy - siol., 51, 1064-1068.

28. Atkinson, M. R. a Polya, G. M. (1967) Austr. J. Biol. Sei., 20, 1069-1086.

29. So uthorn, W. A. (1969) J. Rubber R. Inst . Malaya, 21, 494-512.

30. Ribaill ier, D. (1972) Quelques aspects du rSle des lutoides darts la physiologic et l '~coulement du latex d'Hevea brasil iensis. Action de produits l ib~rant de l'~thyl+ne, Fac. Sci. Abid jan . Th~se de Doctorat d 'Etat (Sci. nat.), A.O. 7716, pp. 107- 109.

31. Rib aillier, D., Jacob, J. L. a d'Auzac, J. (1971) Physiol . Vdg., 9, 423-437.

32. Jacob, J. L. (1970) Physiol . Vdg., 8, 395-411.

13.

14.

15.

BIOCH1MIE, 1974, 56, n ° 10.