présentée à l'université deMontpellier II...

ACADÉMIE DE MONTPELLIER

UNIVERSITÉ MONTPELLIER II

_.. SCIENCES ET TECHNIQUffi DU lANGUEDOC -

THESE

présentée à l'université de Montpellier II Scienceset Techniques du Languedoc

pour obtenir le diplôme de DOCfORAT

SPÉCIALITÉ: GÉNÉTIQUE DES POPULATIONS

Formation Doctorale: Parasitologie

Éco e Doctorale: BSIAE

COMPARAISON4DES

PROPRIÉTÉS BIOLOGIQUES DE DIFFÉRENTS

CLONFS NATURELS DE TRYPANOSOMA (SCHIZOTRYPANUM) CRUZI,. .

CHAGAS, 1909, AGENT DE LA MALADIE DE CHAGAS

par

Laurent Jean-Pierre

SOL tenue le 6 MA/ 1994 devant le Jury composé de :

M. BOUIX G., Professeur, Université Montpellier Il

M. FRÉZIL J.-L., Directeur de Recherche, A>RSrOM, Montpellier

M. PRÉC/GOUT É., Maître de conférence, Université Montpellier 1

M. TIBAYRE~C M., Directeur de Recherche,ORSrOM, Montpellier

M. DE/-CAS E.. , Ma~tre 'de conférence, Université Lille Il

Comparaison des propriétés biologiques de

différents clones naturels de

Trypanosoma (schizotrypanum) cruzi,

Chagas, 1909,

agent de la maladie de Chagas.

REMERCIEMENTS

Les premiers remerciements iront à mes parents. Sans leur aide

financière, il m'aurait été impossible de parvenir à la fin de ce travail.

Réfléchir à la métacyclogenèse de Trypanosoma cruzi et faire attention à

son fric personnel, c'est comme rassembler Goldenberg et la mère Denis

dans le même pétrin (avec tout le respect que je leur dois) ; peut-être

un peu comique, sûrement même un peu risible, mais quel sport de

passer de l'un à l'autre. Pour m'avoir aidé dans ce sport, je remercie,

aujourd'hui, mes parents avec énàrmément de respect et de sincérité.

Pour pouvoir commencer et finir ce travail, il fallait qu'il y ait un

travail. Mes remerciements vont directement à Michel Tibayrenc, mon

chef de labo, mon directeur de thèse, mon pourvoyeur de post-doc et

bien sûr membre du jury.

Le Grand Zym (c'est lui!) m'a allègrement bousculé sur les rails de la «

zymodémologie » ; je fus bercé à coup de zymodèmes, clones, clonets,

génotypes, clonalité, déséquilibre de liaison, etc. (assez, assez!). Je vous

l'avoue: je suis maintenant totalement obsédé.

Mon' terrain de manœuvre fut la cime de l'ORSTOM, j'entends le 2°

étage. Directement sous la verrière, comme une plante dans une serre

(que c'était bon!), j'ai frotté mes feuilles avec tous les joyeux drilles de

cette partie du monde (Place de l'Amérique) : Alexis, Pascal2 (G. et M.),

Bruno, Christian2 (B. et P.), Stephane, Trimôsse, Issa, Anne-Laure, Kasia,

Brigitte, Susana (jHolà!), Souha, Françoise2 (G. et M.D.), Malika, Johanne,

Frédérique2 (T. et B.), Lorena, Marta, Ari, Jaimie, Jean-Loup, Denis,

Estelle, Christelle, Frédéric (Yaaaa) et, JiCé, Marna, Monique, Sébastien,

Luc, Sylvie, Christine, Saïd, Jean-Pierre, Janis, Dalila et leur bande....

C'est dans ces mêmes hauts plateaux que j'ai rencontré nia cholita

préférée, Marie-Pierre. Je lui donne tout mon amour.

Je remercie les membres du Jury, M. Frézil (ou monsieur le patron,

présentement, de la tribu du 2° étage de l'ORSTOM), M. le Professeur

Bouix (vice-président de l'Université de Montpellier II), M. Précigout

(Hou! le rapporteur), M. Dei-Cas (rapporteur) ainsi que mon directeur de

thèse, d'avoir eu la bienveillance de lire, de critiquer et de m'écouter

présenter ce travail.

[PRÉSENTATION]

SOMMAIRE

texte

RÉSUMÉ français

RÉSUMÉ anglais

HISTORIQUE

Rappels du chapitre

GÉNÉRALITÉS

Données épidémiologiques

Clinique et pathologie

Le parasite

Cycle biologique

Développement chez l'hôte mammifère

Développement chez le vecteur

Variabilité et Épidémiologie

Rappels du chapitre

INTRODUCTION

Modèle génétique

Hypothèse de travail

p.viii

p. i x

p. 1

p. 4

p. 5

p. 6

p. 8

p.ll

p.12

p.13

p.14

p.16

p.l?

p.19

Rappels du chapitre

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Bases génétiques

Caractérisation isoenzymatique

Clonage

Croissance des épimastigotes

Différenciation cellulaire

L'infection expérimentale

La résistance au complément

Analyse statistique

Rappels du chapitre

RÉSULTATS

Description des résultats

Génétique

Biologie

Cinétique de culture

Différenciation

Résistance au complément

Infection in vivo

i i

p.21

p.22

p.23

p.24

p.25

p.28

p.31

p.34

p.36

p.38

p.39

p.42

p.44

p.45

p.47

i i i

Analyse statistique

Conformité à la loi normale p.49

Comparaisons des moyennes p.52

Corrélation entre biologie et génétique p.57

Analyse des données

Analyse en composantes principales

Classification automatique

Analyse discriminante

Rappels du chapitre

DISCUSSION

Discussion principale

Virulence et Métacyclogenèse

Temps de doublement


Rappels du chapitre

CONCLUSIONS et PERSPECTIVES

BIBLIOGRAPHIE

p.60

p.65

p.66

p.69

p.70

p.74

p.75

p.76

p.78

p.79

p.82

Généralités

Figure nO l :

Figure n02

TABLES ET

FIGURES

Phases et formes cliniques du mal de

Chagas

Formes parasitaires existantes chez

l'hôte vertébré

Formes parasitaires de culture existantes

chez le vecteur

Schéma du cycle naturel domestique de

Trypanosoma cruzi

Photographies de vecteurs et d'hôtes

sylvestres de Trypanosoma cruzi

iv

p. 6

p. 9

p.l0

p.ll

p.12

Matériel et Méthodes

Les origines géographique et biologique

des 16 stocks

Courbe d'une cinétique de multiplication

cellulaire de Trypanosoma cruzi

. p.22

p.2?

v

Résultats

Description des résultats

Table n02 : Présentation des variables avec leurs unités p.39

et les abréviations

Génétique

Table n03 :

Figure n07

Figure n08

Matrice des distances génétiques de Jaccard p.4D

Dendrogramme p.4D

Réseau de Wagner p.41

Biologie

Table n04 : Résultats de toutes les variables

biologiques mesurées

Cinétique de culture

p.42

p.46

Mesures de la reproductibilité de croissance p.43

et de différenciation in vitro

Sensibilité au complément

Table n06: Mesures de la reproductibilité de la

sensibilité au complément

Infection in vivo

Mesures de la reproductibilité des

caractéristiques de l'infection in vivo

p.47

Analyses statistiques

Conformité à la loi normale

vi

Valeur de Dobs pour les 8 variables p.51

Cornparaison des moyennes

Figure n09 :

Table n09 :

Présentation des courbes de distribution

des fréquences

Présentation des calculs statistiques

Répartition des différentes modalités

pour les variables qualitatives

Analyse de la variance à un critère de

classification

p.52

p.53

p.53

p.54

Corrélation entre biologie et génétique

Matrice des corrélations p.59


Analyse en composantes principales (A.C.P.)

Table n012 . Inertie des axes de l'A.C.P. p.62.

Figure nO ll Schéma expliquant la Figure nO ll p.62

Figure n012 Cercles de corrélations de l'A.C.P. p.63

Figure n013 Graphes de l'A.C.P. en deux dimensions p.64

Figure n014 Graphes de l'A.C.P. en trois dimensions p.65


vii

Dendrogramme biologique p.66

Analyse discriminante

Graphe de l'analyse discriminante. p.68

(RÉSUMÉS J

viii

RÉSUMÉ

Trypanosoma cruzi, agent de la maladie de Chagas, est un parasite très

variable pour beaucoup de paramètres biologiques (36). De plus, les

populations naturelles du parasite présentent une structure c10nale (82).

L'étude présentée ici a pour hypothèse de travail que les divergences

phylogéniques, existant entre clones naturels de T. cruzi, ont un impact

important sur la biodiversité de ce parasite.

8 paramètres biologiques (notamment le comportement en culture in vitro

et infectiosité chez la souris) ont été mesurés sur 16 stocks appartenant

à 3 clones majeurs (ensemble de génotypes c10naux ubiquistes définis sur

la base de 15 systèmes enzymatiques) (83).

Il existe une forte corrélation entre les distances génétiques (divergences

phylogéniques), entre les clones, et les différentes caractéristiques

biologiques ainsi qu'une discrimination significative à 93% entre d'un côté

le c10net 39 et de l'autre côté le groupe 19-20 bien qu'au sein de chaque

clone, la diversité biologique reste notable.

Ce travail souligne l'intérêt du cadre de génétique des populations dans

l'étude de la variabilité génétique des microorganismes, et confirme

l'utilité du concept de clone majeur en microbiologie.

ix

Summary

Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas'disease, exhibits considerable

variability for many biological parameters (36). Moreover, its natural

populations showh a basically clonai structure (82).

The working hypothesis taken in the present study is that the phylogenetic

divergences accumulated among T. cruzi natural clones have a major

impact on the biodiversity of the parasite.

16 stocks belonging to 3 majo"r clones (ubiquitous clonai genotypes

characterized by 15 isozyme loci) (83) were compared for 8 different

biological parameters, mainly culture behaviour and virulence in mice.

There is a strong correlation between the genetic distances (phylogenetic

divergences) among the clones on the one hand, the various biological

parameters on the other hand.

Despite of this correlation, within each clonai genotype, the biological

diversity remains notable, which suggests that clonai evolution is not the

only parameter involved in T. cruzi 's biodiversity.

This work emphasizes the interest of the population genetics framework

for studying microbial biodiversity, and confirms the usefulness of the

concept of major· clone in microbiology.

( HISTOIRE J

Histoire 1

HISTOIRE

« En 1907, nous fûmes chargés, par le directeur Dr. Oswaldo Gonçalves

Cruz, de réaliser une campagne antipaludique pour les services de

construction de Estrada de Ferro Central do Brasil, dans la région

septentrionale de l'état de Minas Gerais ».

Cette phrase, écrite par Carlos Chagas en 1909, est l'introduction à

l'étude exceptionnelle d'un nouveau protozoaire parasite de l'homme (24).

La campagne prophylactique antipaludéenne fut progressivement

délaissée pour l'étude d'un insecte hématophage, le « barbeiro », attaquant

l'homme lors de son sommeil. Celui-ci se trouvait en grande quantité et

représentait une nuisance si considérable qu'il pertubait l'extention des

chantiers. Carlos Chagas eut le mérite de pressentir qu'il était

transmetteur d'un parasite quelconque (55).

Disséquant l'intestin postérieur de cet hémiptère (actuellement connu

comme Panstrongylus megistus), il découvrit «un grand nombre de

flagellés avec des caractères morphologiques de crithidias »

(épimastigotes).

Deux années durant, Carlos Chagas, aidé de son ami et directeur

Oswaldo Cruz, fit une étude exhaustive de ce nouveau parasite :

Trypanosoma cruzi, Chagas, 1909. L'étiologie, l'aspect clinique, le

Histoire 2

comportement pathogène, l'existence d'hôtes intermédiaires, d'hôtes

réservoirs et de vecteurs de ce protozoaire : tout fut passé en revue par ce

spécialiste du paludisme.

Au cours de ses recherches, trois faits l'ont marqué:

1/ un cycle évolutif très particulier ;

2/ l'observation, chez le marmouset Callithrix penicillata, infecté

expérimentalement, de « trypanosomes [ ... ] de morphologie

entièrement différente de n'importe quelles espèces connues du

genre Trypanosoma »;

3/ un mode de reproduction schizogonique.

Toutes ces différences justifiaient, pour lui, la création d'un nouveau

genre. Trypanosoma cruzi devint Schizotrypanum cruzi (24).

En 1911, Vianna (50) montrait que le seul mode de reproduction dans

l'hôte vertébré « est la scission binaire du stade leishmanial »

(amastigote).

En 191 2, Delanoë et Delanoë montraient que les schizontes observés par C.

Chagas, ne faisaient pas partie du cycle évolutif de s. cruzi mais

appartenaient à un nouveau protozoaire parasite, Pneumocystis carinii.

En 1913, Brumpt (50) démontrait que le développement du trypanosome se

finissait dans l'intestin postérieur. /1 montrait donc que la transmission

Histoire 3

se fait par contamination, le parasite transmis se trouvant dans les fèces.

Il contredisait C. Chagas supposant une transmission par inoculation.

L'hypothèse de Brumpt fut confirmé sans ambiguïté par Dias en 1934.

C. Chagas, en 1913, revint au premier nom qu'il avait donné au parasite:

Trypanosoma cruzi (50). Le terme Schizotrypanum fut conservé comme

sous-genre différenciant ce parasite des autres espèces connues de

trypanosomes. Ce n'est que dans les années cinquante que le nom de

Trypanosoma cruzi fut définitivement adopté : la multiplication

intracellulaire du stade amastigote ne fut plus considérée comme un

phénomène extraordinaire dans le genre Trypanosoma.

En 1914, Maggio et Rosembusch (50) observaient qu'un très grand nombre

de Triatoma in fes tans, le Triatominae le plus répandu sur le territoire

argentin, se trouvaient infestés par Trypanosoma cruzi.

Peu à peu, des études épidémiologiques, d'abord au Brésil et en Argentine

puis partout ailleurs en Amérique du sud, montraient l'étendue de la

maladie et la diversité des hôtes et des vecteurs possibles.

Pendant plus de trente années, rien à part des études épidémiologiques, ne

vint compléter les connaissances du parasite et de la maladie, en grande

majorité révélées par le travail de C. Chagas.

Histoire 4

Rappels des éléments importants du chapitre

1909 : Carlos Chagas publie la découverte d'un nouveau parasite

protozoaire de l'homme, au Brésil : Trypanosoma cruzi.

1911 : La seule forme de multiplication chez l'hôte vertébré est le

stade amastigote (Vianna).

1913 : La transmission se fait par contamination, le parasite étant

dans les fèces du vecteur (Brumpt).

1960 : Cette trypanosomiase touche toute l'Amérique latine; 7

millions de personnes sont estimées infectées par T. cruzi (O.M.S.).

[ GÉNÉRALITÉS J

Généralités 5

GÉNÉRALITÉS

Données épidémiologiques

La trypanosomiase sud-américaine ou mal de Chagas est une

anthropozoonose grave, répandue dans 17 pays d'Amérique latine.

En 1991, l'Organisation Mondiale de la Santé estimait que 100 millions de

personnes étaient exposées à l'infection et 16 millions infestées par le

parasite (7).

D'une région d'endémie à l'autre, certains paramètres présentent une

grande hétérogénéité :

• les taux de prévalence (7) : dans certaines collectivités de

Bolivie et du Paraguay, la prévalence peut dépasser 60% ; au Pérou

elle ne dépasse pas 12 %.

• les modes de transmission (7) : ils peuvent de différents

types. Le parasite peut être transmis par contamination par un

vecteur ou par transmission congénitale : apparemment, l'infection

n'aurait pas de conséquence sur le déroulement de la grossesse. La

transmission par transfusion sanguine est de plus en plus importante

: en Bolivie, jusqu'à 63% d~s donneurs. de sang étaient séropositifs en

1990 ; les contaminations par greffes d'organes parasités et par voie

orale (pour les animaux mangeurs de réduves) sont des voies de

Figure n01 : Phases et formes cliniques du Mal de Chagas (réf.32)("Esquema geral e a historia natural da doença de Chagas humana", Dias J.C.P., 1984)

Contamination par Trypanosoma cruz;

Formes cliniqueschroniques bénignes

évolutionbénigne

>---3.1 Mort 1

1évolution maligne !:.

(cardiopathie grave)··:;::H···············································....•........................................................:

~---~ 1 Mort 1

Forme chroniqueindéterminée

permanente (guérison??)

1 1traitement

Guérison ...~---r

Généralités 6

contamination qui restent rares.

• les caractéristiques du parasite (voir page 8).

• les caractères clinico-pathologies (voir rubrique Clinique

et Pathologie page 6 et 7)

• les vecteurs : le parasite est transmis par trois principaux

genres de vecteurs : Panstrongylus, Rodnius et Triatoma ; la

susceptibilité de ces vecteurs est différente d'une espèce à

l'autre.

• les hôtes réservoirs: déjà en 1972, Hoare recense plus de

100 espèces de mammifères (50). On en recense aujourd'hui près de

150 espèces (7).

Considérée traditionnellement comme une endémie rurale, la maladie

de Chagas s'étend peu à peu aux régions urbaines, principalement par les

transfusions sanguines. Plus que toute autre parasitose, cette maladie est

liée au développement socio-économique.

Clinique et pathologie

L'évolution de la maladie est très variable. Chez l'homme, elle se

divise, généralement, en 3 phases (cf. Figure n01) :

• la phase aiguë, de courte durée, se caractérise par un état de

malaise général et par des phénomènes inflammatoires qui

Généralités 7

passent souvent inaperçus. Elle n'est, effectivement,

diagnostiquée que dans 2% des cas : on peut alors observer

une hépatosplénomégalie, une anorexie, des diarrhées et des

vomissements. Une myocardite aiguë, révélée dans un tiers de ces

cas, peut entraîner la mort, le plus souvent chez l'enfant de moins de

2 ans ; plus rarement, les lésions nerveuses se manifestent sous

forme d'une méningo-encéphalite aiguë.

Généralement, ces symptômes disparaissent après 8 semaines.

Pendant la phase aiguë, le parasite reste sensible à certains

médicaments (Nifurtimox et Benznidazole).

Un trait caractéristique de cette phase est une réaction

inflammatoire importante de la face appelée « signe de Romana ».

Cette inflammation indique, potentiellement, un début d'infection.

Elle se présente comme un gonflement cutané tout autour de l'œil.

C'est une réaction à la seule sensibilisation allergique à la piqûre de

triatomes (57), sans trypanosomes.

• la phase intermédiaire (Forme chronique indéterminée dans

la figure nOl) commence 1a semaines après la pénétration du

parasite dans l'organisme, indépendamment du retentissement de la

. phase aiguë; elle peut durer toute la vie du patient. Elle n'est

caractérisée par aucun symptôme clinique. La sérologie est positive.

Généralités 8

La parasitémie est indécelable par les méthodes directes ; seul le

xénodiagnostic la révèle dans 20 à 60% des cas.

• la phase chronique est caractérisée, dans 30% des cas au

maximum, par :

- une atteinte cardiaque. On observe une myocardiopathie

associée à une thrombose intracardiaque pouvant être à l'origine

d'embolies pulmonaires; le parasite n'est découvert dans les lésions

du myocarde que dans un tiers des cas au maximum.

- une atteinte digestive. L'appareil digestif peut être atteint

en n'importe quel point; les organes les plus touchés sont

l'œsophage, le côlon et le plexus nerveux intrinsèque.

- une atteinte neurologique. L'aggravation de la' phase chronique

peut engendrer des lésions du système nerveux central, périphérique

ou végétatif, entraînant des troubles fonctionnels et psychiques.

Le parasite

Trypanosoma (schizotrypanum) cruzi, Chagas 1909 est un

Kinétoplastidé, de la famille des Trypanosomatidae ; il appartient à la

section Stercoraria du genre Trypanosoma.

Une des caractéristiques marquantes de Trypanosoma cruzi est que, tout

au long du cycle biologique, le parasite subit plusieurs métamorphoses:

\ .._J

r-'"1

o

Figure nQ

: Formes pa asitaires présentes chez l'hôte vertébré.et b : Trypomastigotes sanguins (formes trapues) ;

c et d : Arna "'"igotes il tracellulair s t culture de fbroblas es desouris) ;e : Ai ,3stigotes libres après écla ement provoqué du fibroblaste.

Généralités 9

épimastigote, trypomastigote, amastigote et sphaeromastigote.

La nomenclature de toutes les formes cellulaires des trypanosomes a été

réactualisée par Hoare, Wallace (1966) et Brack (1968) (50). L'agencement

du flagelle, son point de naissance cellulaire et son point de détachement

du corps cellulaire, l'existence ou non d'une membrane ondulante sont les

bases de cette nomenclature.

Nous donnons, ci-dessous, une description des différentes formes

cellulaires présentes dans le cycle naturel de Trypanosoma cruzi.

Sur les figures n02 et 3, sont présentées les formes parasitaires

cultivées in vitro et in vivo pendant notre travail.

• Le trypomastigote (cf. figures n02 et n03). C'est une cellule

différenciée (qui ne se divise pas), libre, mobile, qui est

présente dans l'ampoule rectale du vecteur (trypomastigote

métacyclique) et dans le sang de l'hôte mammifère (trypomastigote

sanguicole). L'aspect de la cellule est le même dans les deux cas:

forme en S plus ou moins allongée, kinétoplaste postérieur en

position subterminale ou terminale, flagelle naissant près du

kinétoplaste, attaché le long du corps cellulaire par une membrane

ondulante; le flagelle se détache de la partie antérieure du corps

cellulaire ; la. partie libre est plus ~u moins longue.

La forme trypomastigote métacyclique est toujours très fine le

Figu n0 3: F r lesparasitaires obtenues encultUie et présentesnatureller e t c~ z levecteur.

Ci et b : 1rypomastigotes n étacyclique cul ure en milieu ""'"AU 3AAG ;ç : Épimastigote en cours de différenciation (le kinétoplaste migre versi' extrémité postérieure) ; ct : Culture d'épimastigo es en phase lateau;

e et f : Divis'on d'ép'mastigot

Généralités 10

kinétoplaste se présente sous une forme arrondie régulière, donnant

l'impression de déborder du corps cellulaire. Les formes sanguines

sont soit allongées et fines (forme fine, « slender form ») soit

courtes et épaisses (forme trapue, « stumpy form »). Chez cette

dernière, le flagelle libre est court.

Les formes trypomastigotes ne sont généralement pas sensibles à

l'action lytique du complément .

• L'amastigote (cf. figure n02). C'est le stade intracellulaire,

non mobile et la seule forme de multiplication cellulaire chez

l'hôte mammifère. Bien qu'il soit intracellulaire, il peut être

détecté dans la circulation sanguine de l'hôte vertébré durant la

phase aiguë de l'infection.

La cellule est sans flagelle, de forme ronde ou ovale ; le

kinétoplaste, de forme rectangulaire, est proche du noyau ; le noyau

est central.

La forme amastigote active la cascade du complément, par la voie

alterne', mais n'est pas lysé par le produit final.

• L'épimastigote (cf. figure n03) : C'est la forme de

multiplication chez le vecteur. Le corps cellulaire est en forme

d'amande plus ou moins allongée, le noyau est central, le

1 Les voies d'activation du complément sont de 2 sortes. La voie classiqueest initiée par le complexe antigène-anticorps, .Ia voie alterne est initiéepar des composants microbiens. Les deux aboutissent à la formation ducomplexe d'attaque membranaire.

Multiolication dans l'intestin

=x211

TranSfO~

Épimastigote

Métacyclogénèse

')

Contaminationpar les fa!ces

TrypomastigotevCYcliQue

VERTÉBRÉH01E

Trypomastigotesanguin

Repas sanguin

l~iii~fŒAl liifÜ~ii:l

Amastigote

Transformationet Libérationpar éclatementcellulaire

n=x2

Pénétrationtissulaire et ",transformation

Multiplication intracellulaire

Figure n°4 : Schéma du cyCle naturel domestique de Trypanosoma cruzi.

. -. .....

Généralités 11

kinétoplaste en position antéro-médiane proche du noyau, et de

forme ovoïde ; le corps basal est toujours près du kinétoplaste, le

flagelle émerge de la cellule sans formation de membrane ondulante

à l'extrémité antérieure.

C'est une forme intermédiaire dans la tranformation des

trypomastigotes en amastigotes se différenciant dans les

cellules de l'hôte vertébré (50).

L'épimastigote est sensible à la lyse du complément par la voie

alterne.

• Le sphaeromastigote (n'est pas présenté sur les figures n02

et n03) : Il a une forme ronde avec un flagelle émergeant libre. C'est

une forme de transition dans la différenciation d'épimastigote en

trypomastigote. C'est, aussi, une forme de transition entre

l'amastigote et toute autre forme flagellée (50).

Cycle biologique (Figure n04)

Le parasite est transmis naturellement à l'homme et à d'autres

mammifères par des insectes vecteurs: les réduves (Figures n04 et nOS).

Ce sont des hémiptères hétéroptères de la famille des Reduviidae et de la

sous-famille des Triatominae. On décompte, aujourd'hui, prés de 120

espèces ; LIn peu moins de la moitié est associée aux habitations humaines... ., '.

Les espèces suivantes sont considérées comme très importantes dans la

Panstrongylus megistus

Figure n°5 : Les vecteurs (en haut) déposent les parasites dans leursfèces pendant leur repas de sang sur les hôtes mammifères (en bas,deux hôtes sylvestres).Rcproduits dl''' Colour Atlas of Tropical ~(ediLJnt' &- Parasitologv" avcC' l'aimilble permissiondes iluteurs Pelers W. et Cille" H.\1. et de l'éditeur Mosby-\Volfe.

[ MATÉRIEL ET MÉTHODES J

r

Généralités 12

transmission de la maladie: Rhodnius prolixus (Walker, 1873), Rhodnius

pallescens (Barber, 1932), Triatoma infestans (Klug, 1834), Triatoma

dimidiata (Latreille, 1911), Triatoma sordida (Stal, 1859), Triatoma

braziliensis (Neiva, 1911) et Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835).

Ces réduviidés (<< vinchucas » dans les pays andins, « barbeiros » au

Brésil, « kissing bugs» aux États-Unis) déposent, pendant leur repas de

sang, leurs déjections sur la peau de l'hôte. Ces déjections contiennent

les formes infectantes du parasite.

Développement chez l'hôte mammifère

La forme infectante du parasite, le trypomastigote métacyclique, entre

dans l'organisme au niveau du point de piqClre ou de toute autre lésion.

Le trypomastigote ne se divisant pas, il pénètre dans les cellules de

différents tissus (cf. Clinique et pathologie page 6).

Le développement intracellulaire semble suivre deux schémas

1/ le modè fusiforme (50). Le trypomastigote devient épimastigote

par contraction du corps cellulaire; l'épimastigote se transforme

en amastigote, forme de multiplication. Au 3e ou 4e jour, la

cellule-hôte contient une centaine d'amastigotes, parfois plus. Le

cytoplasme de la" cellule-hôte est consommé par les parasites

cela aboutit à la formation du pseudokyste.

L'amastigote se transforme en épimastigote puis en

Généralités .13 .

trypomastigote.

2/ le mode orbiculaire (50, 89). Le trypomastigote se transforme

directement en amastigote ; ce dernier se multiplie activement

pendant 5 générations et, lorsque l'enceinte cellulaire devient

limitante (pseudokyste), il se transforme directement en

trypomastigote. Ces trypomastigotes sont lâchés dans la

circulation sanguine par éclatement de la cellule-hôte.

Dans les deux cas, le trypomastigote libéré, dans le flux sanguin, par

éclatement de la cellule-hôte va infecter de nouveaux tissus.

Le triatome s'infecte lors d'un repas sur un hôte malade par absorption de

formes sanguines trypomastigotes.

Cette alternance entre, d'une part la forme mobile présente dans le flux

sanguin qui ne se divise pas et, d'autre part la forme intracellulaire

immobile qui se divise, est une des caractéristiques les 'plus marquantes

de Trypanosoma cruz;.

Développement chez le vecteur

Tout le cycle vectoriel s'effectue dans la lumière de l'appareil digestif.

Seules les formes sanguines dites trapues (<< stumpy » ou « broad » en

anglais) ont un devenir chez le vecteur (63). 100% des réduves sont

Généralités 14

infectées pour peu qu'il y ait des parasites circulant chez l'hôte vertébré.

Les trypomastigotes ingérés se transforment en épimastigotes. Nous

observons deux types d'épimastigotes : les petits et les longs. Les petits

épimastigotes (10-20 pm) se multiplient dans l'intestin moyen du vecteur

et forment un « réservoir» de parasites : un insecte infecté lors d'un

repas de sang le reste toute sa vie. Les épimastigotes longs (35-40 pm)

passent dans l'intestin postérieur et adhèrent à l'épithélium de la glande

rectale (92 , 93) ; ils se différencient en sphreromastigotes (63), puis en

trypomastigotes métacycliques. Ceux-ci sont trouvés dans l'ampoule

rectale, n'adhèrent pas à l'épithélium et sont rejetés lors de la défécation,

pendant un repas de sang sur un hôte vertébré.

Variabilité de T. cruzi et épidémiologie de la maladie de

Chagas

Les données épidémiologiques, l'aspect clinique et les pathologies

tout montre une grande diversité chez l'agent de la maladie de Chagas.

De plus en plus d'études sont menées sur les caractéristiques parasitaires

dépendantes des stocks: infection in vivo, virulence, sensibilité aux

drogues, constitution antigénique, taux de croissance, quantité d'A.D.N., la

réponse immunitaire, génétique, etc.

Cependant, ces études Considèrent la variabilité de chaque caractéristique

séparément et n'ont pas été faites sur les mêmes stocks parasitaires.

Généralités 15

Nous sommes donc confrontés à une information partielle de la biologie de

certains stocks.

Des tentatives pour corréler une à une, différentes caractéristiques entre

elles ont été faites, mais le nombre de souches est toujours resté faible

(4, 32, 45, 52, 54) et jamais une synthèse des paramètres biologiques

même pour un nombre restreint de stocks n'a été réalisé.

Plusieurs revues générales témoignent de la difficulté (peut-être de

l'irréalisme) de considérer T. cruz; comme une seule entité taxonomique

et médicale (9, 17, 37).

Généralités 16


En 1991, l'O.M.S. estimait que 16 millions de personnes étaient

infectées par Trypanosoma cruzi.

Le cycle biologique est dixène. Le vecteur est un hémiptère

appartenant à trois genres principaux : Tria toma, Rhodnius et

Panstrongylus. Il transmet le parasite par contamination par ses

fèces à un hôte mammifère. Près de 150 espèces de mammifères

(dont l'homme) ont été recensés infectés par Trypanosoma cruzi.

Le parasite se présente sous plusieurs formes cellulaires:

l'épimastigote se multiplie et se différencie en trypomastigote

métacyclique chez le vecteur ; l'amastigote, intracellulaire, se

multiplie et se différencie en trypomastigote chez l'hôte mammifère.

L'infection humaine se déroule en trois phases. Une phase aiguë de

courte durée diagnostiquée que dans 2% des cas. Une phase chronique

prolongée et caractérisée dans 30% des cas par une atteinte

cardiaque, digestive et neurologique. Ces deux phases sont séparées

par une longue phase de latence clinique dite phase indéterminée.

(INTRODUCTIONJ

Introduction 1;'

INTRODUCTION

Modèle génétique

Certains paramètres biologiques importants ont permis de classer les

populations de T. cruz; en groupes : isoenzymes, analyse de fragments de

restriction d'A.D.N. kinétoplastique ou virulence et pathogénicité du

parasite (4, 73, 74).

Ces classements, pour chaque paramètre biologique, confortent l'idée que

la diversité biologique naturelle peut être expliquer par l'existence de

plusieurs ensembles de populations parasitaires. Cette classification en

trois ou quatre groupes, proposée par plusieurs auteurs (3, 59, 64), traduit

mal l'ampleur de la biodiversité du parasite. L'analyse porte toujours sur

un paramètre (ou biochimique ou biologique) et non sur un ensemble des

propriétés biologiques du parasite.

Tibayrenc et coll. (82) estiment qu' « une description typologique de la

variabilité des stocks semble inappropriée ». Ces auteurs ont postulé, sur

la base d'une approche de génétique des populations, que les populations de

T. cruz; présentent une structure principalement c10nale (79, 80). L'espèce

ne se divise plus en quelques groupes plus ou moins homogènes, mais en

clones naturels, stables da"ns l'espace et dans le temps (81).

Pratiquement, cela se répercute par la sélection de certains clones due à

diverses pressions naturelles et donc, par leur surreprésentation sur de

Introduction 17

vastes aires géographiques. Ces clones ont été nommés clones majeurs

(83). Tibayrenc et coll. (82) analysent les variants isozymiques de 121

stocks provenant de toute l'Amérique du sud et prélevés sur un grand

nombre d'hôtes et répartissent ces stocks en 43 génotypes ou clones

naturels: 53,7% de ces stocks sont représentés par seulement trois

génotypes (33,1% sont des génotypes n019 et n020 et 20,6% sont du

génotype n039).

Dans ce modèle, les génotypes caractérisés par un nombre déterminé de

marqueurs (1 5 loci isozymiques) ne représentent pas des clones au sens

propre du terme mais, plutôt, des familles de clones étroitement

apparentés (82). Le terme de c10net a été proposé (85) et désigne, chez

toute espèce à reproduction c1onale, tous les individus qui apparaissent

1

identiques entre eux sur la base d'une série de données de marqueurs

génétiques. Dans le cas des génotypes de Trypanosoma cruzi cités

ci-dessus, la série de marqueurs est constituée des 15 loci isozymiques

étudiés par Tibayrenc et coll. (82).

Nous admettons que plus augmentera le nombre de marqueurs, plus

augmentera la finesse du système. La numérotation originelle en 43

zymodèmes n'a aucun caractère définitif et ne saurait en avoir:

l'utilisation d'un plus grand nombre de loci enzymatiques, ou de marqueurs

génétiques différents, révèlera une hétérogénéité additionnelle au sein de

chacun des « clones ». Un c10net défini par n loci enzymatiques sera éclaté

Introduction 18

en une quantité de « nouveaux » c1onets, définis eux-mêmes par plus de n

loci enzymatiques (voir figure nO?). 1\ est donc important de préciser sur

quel éventail de marqueurs génétiques s'est faite la description des

c1onets.

Le modèle est « T. cruzi a une propagation clonale ». Ce modèle implique

que les c10nets sont stables dans l'espace et dans le temps, même à

l'échelle évolutive. Mais il n'exclut pas la possibilité de phénomènes de

recombinaison sexuée à bas bruit, qui pourraient moduler le devenir des

c10nets à l'échelle évolutive.

Les clones naturels représentent, selon ce schéma, des phylums évolutifs

indépendants, divergeant toujours davantage les uns des autres par

accumulation de mutations et dérive génique. 1\ est raisonnable de

postuler que ces divergences évolutives auront un impact notable sur les

propriétés biologiques du parasite, en particulier ses propriétés

médicalement importantes.

Hypothèse de travail

Notre hypothèse de trayail est que la variabilité c10nale du parasite a

un. impact majeur sur ses propriétés biologiques: les distances

génétiques mesurées entre c10nets auront un pouvoir prédictif statistique. .

sur les différences biologiques existant entre ces mêmes c1onets.

Introduction 19

Tester cette hypothèse revient à analyser la relation qui existe entre la

distance génétique de 2 populations du parasite et leur divergence

biologique. Si ces deux parmètres sont totalement indépendants,

l'hypothèse de travail n'est pas confirmée. Au contraire, s'il existe une

dépendance statistique significative de l'un par rapport à l'autre, cela

indiquera que le modèle clonai doit être pris en compte dans les études

portant sur la pathogénicité de Trypanosoma cruz; et la diversité clinique

de la maladie de Chagas.

Introduction 20


La diversité biologique de Trypanosoma cruz; a suggéré à plusieurs

auteurs d'organiser les populations du parasite en différents groupes.

Cette représentation typologiste semble inappropriée. En effet,

Tibayrenc et coll. montrent, par une approche de génétique des

populations, que Trypanosoma cruz; est formé de populations ayant

une structure fortement c1onale.

Certains clones naturels sont surreprésentés sur de vastes aires

géographiques : ils sont nommés clones majeurs.

Définis après l'étude de 15 loci isozymiques, les clones naturels sont,

en fait, des familles de clones étroitement apparentés : ils sont

nommés c1onets.

Les clones naturels représentent des phylums évolutifs indépendants.

Notre hypothèse de travail est que les divergences évolutives

existantes entre clones naturels ont un impact majeur sur les

propriétés biologiques, en particulier les propriétés médicallement

importantes.

Matériel et Méthodes 21

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Bases génétiques

Nous avons comparé trois c10nets : le n019, le n020 et le n039 (82).

Ils ont été choisis pour deux raisons :

1/ ils présentent une divergence phylogénique permettant de tester

au mieux notre hypothèse de travail: le c10net 19 et le

c10net 20 sont phylogénétiquement très proches l'un de l'autre et

ils sont, tous deux, très éloignés du c10net 39. Nous pouvons,

ainsi, comparer l'impact sur le comportement biologique de deux

distances génétiques, une très petite et une très grande ;

2/ Ce sont des clones « majeurs» c'est-à-dire surreprésentés et

ubiquistes. Cela augmente l'intérêt médical potentiel de notre

étude.

Le c10net 19 est représenté par 5 stocks, le c10net 20 par 5 stocks, le

c10net 39 par 6 stocks. Ces seize stocks de Trypanosoma cruz; ont été

choisis de manière à ce que leur provenance géographique et l'hôte sur

lequel ils ont été prélevés soient· représentatifs de la diversité naturelle

du parasite.

Ces données sont présentées dans la table n01.

Table n01 : Les origines géographique et biologique des 16 stocks

STOCKS CLONET HOTE LIEU

SPl 04 cil 19 Triatoma spinolai Chile / Region IVCutia cil 19 Dasylprocta aguti Brazil / Espiritu santo

Gamba cil 19 Didelphis azarae Brazil / Sao Paulo133 79 cl7 19 homme; Ph. aigUË:! Bolivia / Santa CruzOPS21 clll 19 homme Venezuela / Cojedes

5034 cl4 20 Triatoma infestans Bolivia / PotosiCuica cil 20 Opposum cuica philander Brazil / Sao PauloP209 cil 20 homme; phase chronique Bolivia / Sucre

Esquilo cil 20 Sciurius aestuans ingrami Brazil / Sao PauloPll cl3 20 homme; phase chronique Bolivia / Cochabamba

SC43 cil 39 Triatoma infestans Bolivia / Santa CruzBug2148 cil 39 Triatoma infestans Brazil / Rio grande do sul

S03 cl5 39 Triatoma infestans Bolivia / PotosiMN cl2 39 homme; Ph. chronique Chile / Region lVa

Bug2149 cil a 39 Triatoma infestans Brazil / Rio grande do sulNR cl3 39 homme ; Ph. chronique Chile / Region ilia


Nous rappelons que le c10net (82) est défini sur la base de l'étude de 15

loci isoenzymatiques (cf. Introduction page 17).

Caractérisation isoenzymatiqne

Tout au long de ce travail, nous avons vérifié régulièrement le profil

isoenzymatique des 16 stocks. De cette manière, nous voulions être sûrs

de ne pas avoir' de variation isoenzymatique au cours du temps due au

maintien des stocks en culture pendant trois ans, et de ne pas avoir

mélangé de stocks (manipulation simultanée des 16 stocks).

L'analyse isozymique des 16 stocks a été affinée, au début de ce travail,

par augmentation du nombre de loci utilisés (de 15 à 22) et par

amélioration des techniques à tous les loci.

. Les techniques de caractérisation ne sont pas exposées dans cette thèse

puisque le travail technique a été réalisé au laboratoire par C. Barnabé.

Des modifications de comportement biologique, tant en culture (37, 38)

que durant l'infection expérimentale (23), ont permis de constater que

nombreux stocks étudiés en .laboratoires étaient des compositions de

pl~sieurs sous-populations. Par ailleurs, l'utilisation de marqueurs

génétiques a démontré que de rJombreux isolats naturels du parasite

étaient constitués de plusieurs génotypes différents (19, 65).

La recherche des implications médicales de la variabilité clonale du


parasite nous demandait de travailler pour chaque stock sur une

population génétiquement homogène.

Nous avons, par conséquent, cloné tous les stocks. Chacun représente,

désormais, un clone de laboratoire ; cette qualité est indiquée par « cl »

après le nom du stock : par exemple, SP104 cil indique le résultat du

premier clonage réalisé sur le stock SP104.

Clonage

Nous avons utilisé la méthode de la micromanipulation.

Un seul parasite est prélevé par microcapillarité. Par pompage, le liquide

est vidé sur une lamelle. Cette dernière est renversée sur une lame

comportant une cavité circulaire centrale. Le milieu contenu dans cette

cavité permet d'éviter le séchage de la microgoutte. Nous pouvons, ainsi,

observer au microscope le parasite et valider le clonage. Cette

vérification est confirmée par 2 observateurs différents.

Le parasite est, ensuite, remis en culture dans un milieu biphasique. La.

première phase de ce milieu est une base solide d'agar et de sang: N.N.N.

(Nicolle, Novy et Mac Neal) ; la deuxième phase est le milieu de culture à

base de L.I.T. (Liver Infusion Tryptose) qui sera utilisé par la suite pour

l'entretien et la cinétique de culture. Le tout est gardé à 27°C.


[Milieu N.N.N.=

l/Phase solide Bacto-Agar 1,3% + NaCl 0,56% +

pH 7 Sang de lapin hépariné 7%

2/Phase liquide L.I.T.+ SVF2 décomplementé 10%

Milieu L.I.T.=

pH 7,2

NaCl 0,5% + Na2HP04 7,5% +

Tryptose 0,5% + KCl 0,04% +

Yeast Extract 0,3% + Hémine 2%

+ Liver Infusion 0,3% + AB3 4%

Dès que la densité de la nouvelle culture le permet, nous passons le

parasite en milieu de culture liquide4 (moins riche que le milieu N.N.N.).

Après 2 ou 3 passages, nous contrôlons le profil isoenzymatique de chaque

clone par la technique d'électrophorèse sur acétate de cellulose (11).

Les stocks ont été maintenus en culture pendant plusieurs mois au

laboratoire avant d'être clonés. Aucun clone n'a présenté un génotype

différent de celui du stock avant clonage.

Croissance des épimastigotes

L'entretien de tous les stocks clonés se fait par passage de 2x 106

parasites pour 3 millilitres (ml) de milieu de culture; tous les 15 jours,

2 SVP : Sérum de Veau Fœtal.3AB.: AntiBiotiques (Gentamycine + Pénicilline)

4 Le seul milieu de culture utilisé pour l'entretien et la cinétique decroissance des épimastigotes est du L.I.T. + SVF 10%.


en tubes de contenance de 15 ml. Les cultures sont gardées à 27°C.

L'épimastigote est la forme la plus facile à entretenir en culture: elle se

multiplie activement en milieu axénique et l'on peut obtenir le parasite en

grande quantité.

La première caractéristique biologique que nous avons comparée est la

cinétique de croissance des épimastigotes en milieu de culture.

Elle a été réalisée en boîtes de culture Nunclon® de 80 cm2 à col

droit. La concentration initiale est de 5x105 parasites par ml (P.lml) et le

volume final est de 50 ml. La culture est incubée à 27°C.

Tous les deux jours, la culture est homogénéisée et trois échantillons

sont prélevés pour compter les parasites sur cellule de Thoma. La

cinétique de croissance est suivie pendant 24 jours.

Les parasites prélevés sont fixés.

[Solution de Fixation =

P.B.S.S

pH 7,2

Fixateur et

colorant

NaH2P04 8mM + Na2HP04 8mM +

NaCl 190mM

Formaldéhyde 0,75% +

Bleu Trypan 0,2%]

Le Bleu Trypan est un colorant vital qui colore les cellules mourantes ou

mortes. Le nombre de parasites comptés sur toute la chambre est

. multiplié par 104 pour obtenir la concentration parasitaire dans la boîte

5 P.B.S. Phosphate Buffer Saline ou Tampon phosphate isotonique.


de culture.

Nous obtenons des courbes du type de celle représentée par la figure nOG.

Ces courbes se divisent en 3 parties :

1/ une phase de croissance ou multiplication logarithmique (phase

log.) ;

2/ une phase de plateau ou stationnaire: nous observons l'apparition

de formes trypomastigotes métacycliques en quantité variable

selon les stocks.

3/ une phase de dégénérescence: les cellules se lysent plus ou moins

rapidement selon les stocks.

Les deux premières phases ont été caractérisées par 2 paramètres: le

Temps de Doublement (en anglais Doubling Time) et la Concentration

parasitaire de la fin de la phase logarithmique. Le temps de doublement

est déterminé par la pente de la droite que décrit (sur papier

semi-Iogarithmique) la phase de croissance: c'est une constante pour un

stock donné (36).

Nous symboliserons ces paramètres par, respectivement, TD et Cfl.

TD sera exprimé en heures; Cfl sera exprimé en 10-6 P.lml, soit en nombre

de parasites divisé par 106 , par millilitre~

Concentration parasitaireP.lml

phase decroissance phase plateau

phase dedégénéréscence

Cfl

2xY

y

11

.................................................................1

tl ~ • t2

DT Tempsjours

Figure nOG : Courbe d'une cinétique de multiplication cellulaire de T.cruzi dans du milieu de culture. L'axe des abscisses est en échellelinéaire ; l'axe des ordonnées est en échelle .Iogarithmique.


Différenciation cellulaire

Le deuxième caractère étudié est la cinétique de transformation des

épimastigotes en trypomastigotes métacycliques, en milieu axénique

défini. C'est une véritable différenciation cellulaire. Elle s'observe

naturellement dans l'intestin postérieur de l'insecte vecteur.

Le milieu utilisé dans notre étude, a été mis au point par Contreras et

coll., en 1985 (27).

Il est très pauvre et acide comme l'urine de triatome. Ce milieu stressant

déclenche la « métacyclogenèse ».. .

Deux étapes sont nécessaires pour obtenir une cinétique de transformation

reproductible.

La première étape aboutira à la synchronisation des parasites.

1/ Les épimastigotes d'une culture ne se trouvent pas tous à la même

phase du cycle cellulaire.

Or les trypomastigotes métacycliques sont des cellules en phase Go (elles

ne se divisent pas). La phase .Go commence après la mitose. Cette dernière

représente entre 15 et 20% de la durée totale du cycle (36).~ "

" a été montre que les épimastigotes adhèrent, chez l'insecte vecteur, à


l'épithélium de l'intestin postérieur au niveau de la glande rectale avant

de se différencier (92). Cette adhésion sur l'épithélium, prélude à la

métacyclogenèse, se retrouve dans la différenciation axénique in vitro

(12).

La synchronisation consiste à séparer les épimastigotes ayant adhéré à la

surface de la boîte de culture de ceux n'ayant pas adhéré, c'est-à-dire

n'étant pas prêts à se transformer.

Pratiquement, les épimastigotes sont récoltés en fin de phase

logarithmique par centrifugation 1 200g pendant 10 minutes à

température ambiante. Ils sont dilués dans du milieu T.A.U. à la

concentration finale de 5x108 P.lml, et sont incubés à température

ambiante pendant 2 heures dans des boîtes Falcon® de 25 cm2 à col

incliné (27).

[Milieu T.A.U. =

Sels + CaC12 2mM + MgC12 2mM +

pH 6 NaCl 190mM + RCI 17mM]

La deuxième étape est la cinétique.

2/ Les épimastigotes ayant adhéré pendant la phase de. .

synchronisation sont décollés pour être répartis en culture dans du milieu

de différenciation6 (12).' Cette répartition s'effectue comme suit: les

6 Le milieu où s'effectue la différenciation est le milieu T.A.U. 3AAG.


parasites sont remis en culture dans 10 boîtes de culture Falcon® 25 cm2

à col incliné, à la concentration finale de 5xl06 P.lml dans un volume

final de 10 ml à 28°e sans aucLlne agitation.

[ Milieu T.A.U. 3AAG = Milieu T.A.U. +

L-Glutamate SOmM + Proline lOmM

~spartate 2mM + D-Glucose lOmM]

Nous suivons quotidiennement la cinétique : dans une boîte, les cellules

collées sur la surface de la boîte sont mélangées, par grattage, aux

cellules du surnageant. Après une homogénéisation vigoureuse, trois

prélèvements sont déposés sur lames. Les frottis séchés sont colorés à

l'éosine-bleu de méthylène, après fixation au méthanol pur.

[ Fixation-Coloration : Méthanol Bain S mn.

(sans lavage) Eosine 1 mn.

(sans lavage) Bleu de méthylène 2 mn.

Après un lavage abondant à l'eau et un séchage, un comptage de 100

cellules est réalisé sur toute la surface de la coloration. La forme

trypomastigote se distingue facilement par sa morphologie .

caractéristique (cf. description, Généralités page n09).

Nous traduisons la capacité d'un stock à se différencier par le pourcentage

maximum de trypomastigotes métacycliques obtenus et par le moment

auquel on observe ce maximum.


Le premier, noté DIF, est exprimé en % ; le second, noté TDIF, est exprimé

en jours.

Infection expérimentale

Le troisième paramètre que nous avons étudié est l'infection

expérimentale de souris syngéniques.

Elle a été réalisée sur des souris BALB/C, femelles, âgées de 4 à 5

semaines. Pour chaque stock de parasites, Llne série minimale de 6 souris

a été utilisée.

Des essais préliminaires d'infections expérimentales ont été effectués

pour déterminer certaines conditions d'expérimentation. Les premières

infestations ont été faites par injection d'un culot parasitaire de culture

d'épimastigotes en fin de phase plateau. Nous n'avions pas séparé les

épimastigotes des trypomastigotes. De cette manière, environ 106

trypomastigotes furent injectés dans les souris âgées de 4 semaines.

Ces essais se sont soldés, dans la majorité des cas, p~r une absence de

parasitémie détectable (ceci étant du au fait que les stocks n'étaient pas

adaptés aux souris). Pour obtenir de fortes parasitémies et pouvoir,


potentiellement, adapter tous les stocks sur souris, nous avons joué sur

deux paramètres:

1/ la purification des trypomastigotes.

Les trypomastigotes métacycliques sont récoltés d'une culture

d'épimastigotes en fin de phase stationnaire. Ils sont séparés des

épimastigotes après incubation pendant une nuit à 3?OC, dans du sérum

humain non décomplémenté. Les trypomastigotes ne sont pas sensibles au

complément présent dans le sérum utilisé in vitro, contrairement aux

épimastigotes.

Les trypomastigotes sont lavés trois fois en P.B.S. par centrifugation à

1200g pendant 10 minutes à 4oC.

2/ Nous avons immunodéprimé toutes les souris utilisées pour ces

primo-infections.

.Une dose de 8mg (soit 400 mg de cyclophosphamide, Endoxan-Asta®,

Laboratoires Sarget, Merignac, France) par souris a été choisie, après

comparaison d'injections à différentes doses d'endoxan (résultats non

montrés).

Une étude réalisée par Calabrese et coll. (21) montrait qu'une injection

post-infection (5 jours après l'inoculation des parasites) engendrait une

parasitémie forte et durable. Nous avons comparé une injection

d'immunosuppresseur synchrone à l'inocul~tion de parasites et une


injection 3 jours après l'inoculation de parasites. Ce dernier essai

présentait le meilleur résultat.

La cyclophosphamide est sans doute le plus puissant des

immunosuppresseurs chimiques. C'est un agent alkylant qui, comme

tous les autres, semble exercer son action immunosuppressive (à

fortes doses) par la destruction des cellules prolifératives. Il

atteint les cellules T et les cellules B, bien que son action sur

le système T soit moins importante que la suppression de la

production d'anticorps.

Nous avons, finallement, opéré avec le protocole suivant :

• 3x106 trypomastigotes métacycliques sont injectés dans la

cavité péritonéale de souris. Les souris sont immunodéprimées 60

heures après l'injection. La parasitémie est mesurée selon une

variante de la technique de Pizzi (15, 69). Ce protocole a été préféré

à d'autres parce qu'il est fréquemment utilisé dans la littérature.

- 5 III de sang sont prélevés au bout de la queue de la souris et

sont étalés entre une lame porte-objet et une lamelle de

20x20 mm2 ; les parasites sont comptés sur 50 champs

microscopiques (objectif 40x et oculaire 1Ox).

La quantité de parasites observés est multipliée par le facteur 104 pour

obtenir la concentration parasitaire sanguine.


Un oculaire 10x ou d'indice 18 associé à un objectif 40x permet

d'observer un champs-objet de 0,45 mm de diamètre.

La surface d'un champs fait 0,159 mm2 i 50 champs couvrent 7,95 mm2 •

Il y a, sous la lamelle de 400 mm2 , 5 ~l de sang. Donc, les

parasites observés sur 50 champs sont contenus dans 0,1 ~l de

sang i il suffit de multiplier par 104 pour avoir la quantité de

parasites par ml de sang de souris.

La parasitémie est suivie tous les deux jours pendant 40 jours. La

mortalité est suivie quotidiennement, pendant 70 jours c'est-à-dire

jusqu'à la fin de la phase aiguë.

Les différents paramètres de l'infection sont

MP = Maximum de parasitémie ; il est exprimé en 10-4 P.lml, soit en

nombre de parasites divisés par 104, par millilitre de sang de souris.

INF = infectivité ; cela correspond au pourcentage de souris qui ont eu une

parasitémie détectable.

MOR = mortalité; c'est le pourcentage cumulé de souris mortes du 15e

jours au 70e jour après inoculation des parasites.


Comme nous l'avons expliqué dans le protocole de l'infection in vivo,

nous avions besoin de purifier les trypomastigotes métacycliques en


éliminant les épimastigotes (forme non infectante). La purification fut

effectuée par passage dans du sérum humain non décomplémenté. C'est une

purification rapide et imparfaite.

Nous avons constaté que cette purification dépendait du stock utilisé et

du temps d'incubation à 37°C.

Nous avons, do"nc, voulu considérer un paramètre supplémentaire : la

sensibilité des épimastigotes des 16 stocks à la lyse par le complément .

Le protocole est le suivant :

Un seul lot de sérum humain AB+ est utilisé pour tous les stocks ; il est

congelé à -20°C en autant d'aliquots qu'il y a de stocks.

Tous les stocks seront expérimentés avec le même lot de milieu L.I.T..

Les expériences sont effectuées en plaque de 24 puits Nunclon®.

La moitié du sérum est décomplémenté par chauffage au bain-marie à

56°C pendant 45 minutes. Le sérum est réparti dans les puits à raison de

0,5 ml par puits; cette plaque préparée et le milieu L.I.T. sont mis à 37°C

pendant 30 minutes.

Les parasites sont récoltés de cultures en milieu de phase logarithmique

(100% d'épimastigotes). Après un lavage en milieu L.I.T. par centrifugation

à 1 200g pendant 10 minutes à température ambiante, les parasites sont

resuspendus dans le milieu L.I.T. (sans sérum), maintenu à 37°C. La


concentration est fixée à 6,66xl06 P.lml.

Cette suspension est répartie à raison de 1,5 ml par puits pour avoir, lors

de l'expérience, une concentration finale de 5xl06 P.lml par puits.

Les parasites en contact avec le sérum sont mis à l'étuve à 37°C. Au bout

d'une heure d'incubation, les parasites sont comptés sur cellule de Thoma.

Pour chaque stock, nous avons préparé 4 puits où les parasites sont en

contact avec du sérum non décomplémenté (SNO) et 4 puits où les

parasites sont en contact avec du sérum décomplémenté (SO). Nous

effectuons, donc, 4 mesures SNO et 4 mesures SO.

Le pourcentage de parasites lysés est calculé comme suit :

- la moyenne des mesures SNO est divisée par la moyenne des

mesures SO. Cette fraction est soustraite à l'unité pour avoir, non pas

le pourcentage d'épimastigotes résistants sinon le pourcentage

d'épimastigotes lysés.

Nous avons symbolisé cette Sensibilité au Complément par SC. Il est

exprimé en %.

Analyse statistique

Toute l'analyse des données et le calcul des corrélations entre


biologie et génétique ont été réalisés grâce au logiciel «Analyses

multivariées et expression graphique des données environnementales »,

ADE version 3.6, créé et donné par Chessel D. et Dolédec S., Écologie des

Eaux Douces et des Grands Fleuves, URA CNRS 1451, Université C. Bernard

Lyon 1, 69622 Villeurbanne cedex.



16 stocks ont été choisis appartenant à 3 c10nets : les c10nets 19, 20

et 39.

Après avoir été cloné, ils ont été caractérisés par l'étude de 22 loci

isoenzymatiques. Les divergences sont mesurées par les distances

génétiques de Jaccard.

8 paramètres biologiques ont été étudiés : le Temps de Doublement

(TD) et la Concentration en Fin de phase Logarithmique (Cfl) pour la

croissance in vitro des épimastigotes ; le maximum de

trypomastigotes métacycliques obtenus (DIF) et le moment

d'observation de ce maximum (TDIF) pour la différenciation in vitro en

milieu axénique ; la Sensibilité des épimastigotes à la lyse du

Complément (SC) et le Maximum de Parasitémie (MP), l'INFectivité

(INF) et la MORtalité (MOR) de souris expérimentalement infestées par

T. cruzi.

[ RÉSULTATS J

Résultats 38

RÉSULTATS

Nous rappelons dans la table n02 le nom des variables, leurs unités et

leurs abréviations.

Variables Abréviations Unités

Temps de doublement TD heures

Conc. en fin de phase log. efi 10-6 P.lml

Max. de différenciation DIF %

Temps de DIF TDIF jours

Sensibilité au complément se %

Max. de Parasitémie MP 10-4 P/ml

Infectivité INF %

Mortalité MOR %

Table n02 : Variables, unités et abréviations

Description des Résultats

Génétique

Bien que les analyses isoenzymatiques complémentaires (22 loci au

lieu de 15) n'aient pas été faites par nous-mêmes, nous avons participé à

l'analyse de la variabilité génétique additionnelle,' et nous en donnons ici

les résultats utiles à la compréhension de notre sujet.

SPI 04 Cutia Gamba OI'S21 13379 5034 Cuica P209 Esquilo PlI SC43 BU92148 503 "'" BU92149 NR

SP104 0 PlICutia 0,09 0

Gamba 0,2 0,13 0OI'S21 0,31 0,31 0,31 013379 0,31 0,24 0,27 0,37 05034 0,17 0,09 0,13 0,34 0,31 0Cuica 0,17 0,09 0,13 0,34 0,31 0 0P209 0,17 0,09 0,2 0,37 0,17 0,17 0,17 0

Esquilo 0,24 0,17 0,13 0,27 0,24 0,09 0,09 0,24 0PlI 0,09 0 0,13 0,31 0,24 0,09 0,09 0,09 0,17 0

SC43 0,84 0,81 0,81 0,79 0,78 0,82 0,82 0,81 0,78 0,81 0Bug2148 0,84 0,81 0,81 0,83 0,81 0,82 0,82 0,81 0,82 0,81 0,09 0

503 0,84 0,81 0,81 0,83 0,81 0,82 0,82 0,81 0,82 0,81 0,17 0,09 0t,f.l 0,84 0,81 0,81 0,83 0,81 0,82 0,82 0,81 0,82 0,81 0,17 0,09 0 0

Bug2149 0,84 0,81 0,81 0,83 0,81 0,82 0,82 0,81 0,82 0,81 0,09 0 0,09 0,09 0NR 0,84 0,81 0,81 0,83 0,81 0,82 0,82 0,81 0,82 0,81 0,09 0 0,09 0,09 0 0

Table n03 Matrice des distances de Jaccard correspondant aux divergencesgénétiques entre les 16 stocks.

o1

0,11

0,21

0,31

0,41

0,51

0,61

0,71

0,81

0,91

1,01

1,11

1,21[

13379

CUK:a

5034

Cutia

Pl1

EsquiJo

Gamba

P209

SP104

OI'S21

BU92148

Bug2149

NR

503

MN

SC43

~--

}~

~-

-

~

Figure nO? Relation entre les 16 stocks; dendrogramme basé sur lesdivergences présentées table n03, au-dessus.

Résultats 39

Les degrés de dissemblance génétique ont été quantifiés par la distance de

Jaccard (52) qui se calcule grâce à la formule suivante:

Vij = 1-(C/(2N-C))

dans laquelle C est le nombre de bandes communes entre les stocks i et j

et N est le nombre total de bandes différentes entre les deux stocks.

Les distances de Jaccard, calculées sur la base de 22 systèmes

enzymatiques, sont rassemblées sur la table n03. Un dendrogramme

U.P.G.M.A. (Unweighted Pair-group Method with Arithmétic Averages [78])

est réalisé à partir de ces distances. \1 est présenté sur la figure n07.

Les relations phylogénétiques entre stocks ont été également visualisées

par un réseau de Wagner (39, 40), représenté sur la figure n08.

Le réseau de Wagner, qui présente un arbre phylogénétique, est élaboré

grâce au programme MIX communiqué par Felsenstein J. (PHYLIP package).

Avec cette caractérisation génétique améliorée, nous obtenons les

résultats suivants, bien visualisés par le dendrogramme et le réseau de

Wagner:

1/ Comme prévu (82), chacun des anciens donets (y compris le

39) se rév~le hétérogène. Les « cionets » ne sont pas de véritables

clones, mais des faniilles de clones étroitement apparentés.

2/ La distinction qui avait été faite entre les c10nets 19 et 20

Figure n08 : Réseau de Wagner reliant les 16stocks selon leur divergence évolutive. L'étude aporté sur 22 loci isozymiques.

10

En grisé, est représenté leréseau de Wagner originelprésentant les 43 génotypesdifférents de T. cruz; . Lacaractérisation a porté sur15 loci isozymiques.

CutiaSPI04 *~~~*II:~rïr-..i4__~r-~~~~~~Lfuica 1 4 Tehuentepec

3

35

Résultats 40

(82) est difficile à retrouver sur le dendrogramme et sur le réseau de

Wagner. Certains stocks (par exemple 133 79) présentent une

divergence génétique qui les éloignent autant des stocks 19 que des

stocks 20. OPS21 se trouve aussi proche de Tehuentepec

(caractérisée comme clonet 12 sur la base de 15 loci

isoenzymatiques [82]) que des stocks 19 et 20 dans leur ensemble.

Pour plus de prudence et dans le cadre du présent travail, nous parlerons,

désormais, pour les 10 stocks des c10nets 19 et 20, des stocks du «

groupe 19-20 ».

3/ Bien que la caractérisation génétique améliorée ait permis de

raffiner le tableau de divergence phylogénique au sein de notre

échantillonnage, les grandes lignes dressées par le travail antérieur

(82) demeurent vraies. Nous nous retrouvons, donc, avec deux groupes

(19-20 et 39) séparés une forte divergence phylogénique et au sein

desquels les divergences sont comparativement beaucoup plus

limitées. L1ancien c10net 39 reste plus homogène que le groupe 19-20.

Nous voyons donc, que le présent échantillonnage reste donc parfaitement

adapté pour tester Ilhypothèse de travail, à savoir que les distances

phylogéniques entre c10nets ont un pouvoir prédictif sur leùrs différences

biologiques. Cette hypothèse sera testée en prenant en compte les

distances génétiques estimées sur la base de 22 loci isozymiques.

Table n04 : Résultats de tous les paramètres biologiques étudiés.

Stock cloné Clonet Croissance en L.I.T. Différenciation Sens. Compl. Infection de sourisDT Cfl DIF TDIF SC MP INF MOR

SP104 cil 19 34.06 18 63.6 6 34.8 0.25 37.5 0Cutia cil 19 33.28 30.5 3 10 61.2 0 0 50

Gamba cil 19 28.98 42.33 63.68 8.75 100 887.7 100 59.7133 79 cl7 19 46.55 26.5 6.67 10 45 0 0 33.3

OPS21 cll1 19 40.3 9.4 35.31 7 91.8 0.77 12.5 0

5034 cl4 20 29.33 46.5 58.4 7.68 95.8 382.5 100 50Cuica cil 20 31.98 16 28.33 8 98.4 1.4 61.1 4.8P209 cil 20 21.34 27 49.67 8 88.1 378.1 100 62.5

Esquilo cil 20 50 31.5 58 9 91.3 1718.3 100 100Pll c13 20 35.17 39 2 10 90.4 22.2 11.1 0

SC43 cil 39 59.61 18.83 8.17 9.33 33 0 0 27.4Bug2148 cil 39 51 27.5 7.67 5 34.6 0 0 33.3

503 c15 39 78.1 11 45 9 24.9 11.67 75 75MN cl2 39 69.4 9.4 47 9 39.9 0 0 60

Bug2149 cllO 39 56.8 16 14.7 8 49.4 0.19 11 0NR cl3 39 51.02 23 4 5 10.6 0 0 0

DT en heures; Cfl en 1q-.6 P.lml; DIF en % ; TDIF en jours; SC en % ; MPen 10- 4 P.lml; INF en %; MOR en %.

Résultats 41

Biologie

Les résultats sont rassemblés dans la table n04.

Cinéti.que de culture

La phase de dégénérescence n'est pas considérée dans notre étude. La

faute en est à notre manque de perspicacité, et à l'excés d'intérêt pour la

phase de croissance.

L'observation non mesurée permet, cependa~t, de décrire qualitativement

une phase de dégénérescence beaucoup plus brutale et précoce pour les

stocks du groupe 19-20 que pour les stocks du c10net 39. Ces derniers

perdurent en phase plateau et semblent « résister » au phénomène de lyse

de cette phase.

Lors de nos premiers essais pour suivre la cinétique de croissance des

épimastigotes, nous nous sommes aperçus qu'il était nécessaire de

maintenir les parasites en phase logarithmique avant de mesurer les

paramètres de croissance.

Effectivement, bien que le temps de doublement soit considéré comme une

caractéristique du stock parasitaire (34, 37), il peut varier énormément,',

si le parasite est maintenu" en culture sans prendre en compte sa

cinétique.

STOCKS CLONET Mesures

GAMBA cl 1 19 10

Coefficient de variation (%)

TD

28,17

28,9

29,87

NM

2,3

..Cfl

34

31

62

NM

40,39

DIF

58,7

66,3

49,7

80

20,14

TDIF

7

8

10

10

17,14

S034 c14 20 29,62

30,06

28,32

35

34,5

70

49,3

64,7

61,5

7

8

8

Coefficient de variation (%) 3,08 43,76 13,89 7,53

SC43 cil 39 59,54

58,2

61,1

16,5

22,5

1,75

8

6,5

10

9

9

10

Coefficient de variation (%) 2,43 78,61 21,5 6,19

Table nOS: Mesures de la reproductibilité de la cinétique de croissance

des épimastigotes et de leur différenciation en milieu T.A.U.

3AAG (NM = Non Mesurée).

Résultats 42

Un nombre minimal de 3 passages de parasites de fin de phase

logarithmique est effectué pour avoir un temps de doublement

reproductible.

La table nOS montre les mesures de la reproductibilité, faites sur un

représentant de chaque c1onet.

La reproductibilité est considérée comme forte lorsque le coefficient de

variation est inférieur à 20 % ; elle est considérée comme nulle lorsqu'il

dépasse 40 %.

Le TD est une mesure fortement reproductible alors que Cfl ne l'est pas du

tout. Ceci peut expliquer pourquoi le Cfl n'est jamais considéré dans la

littérature.

Nous observons une croissance beaucoup plus rapide des stocks du groupe

19-20 et, sans faire de tests statistiques, il est évident que le temps de

doublement semble lié à la distance génétique qui sépare ces deux

ensembles (groupe 19-20 et clonet 39). Cela veur dire qu'il nous permet a

priori de distinguer des groupes de stocks génétiquement distincts.

Trois stocks du groupe 19-20 sont moins rapides que les autres stocks:

133 79, OPS21 et Esquilo.

Si on regarde l'arbre de Wagner qui traduit la divergence génétique entre

tous les stocks, nous pouvons constater que ces stocks se trouvent à la

périphérie de l'ensemble.

1

Résultats 43

Les valeurs les plus élevées de la concentration à la fin de la phase

logarithmique - Cfl - sont atteintes par des stocks du groupe 19-20.

Le TD apparait véritablement comme une variable permettant une très

bonne distinction de stocks phylogénétiquement différents.

Différenciation

Le processus de la métacyclogenèse est particulièrement important

puisqu'il représente la transformation morphogénétique d'une forme non

pathogène à une forme pathogène.

La table nOS montre clairement que les caractéristiques de la

différenciation sont fortement reproductibles.

Les comparaisons entre un inoculum parasitaire (épimastigotes en milieu

de culture) en milieu de phase de croissance, en fin de phase de croissance

et en phase plateau n'ont pas donné de résultats significativement

différents.

Nous avons ensemencé, avec, les parasites synchronisés en milieu T.A.U.,

dix. boîtes. La cinétique de transformation est suivie pendant 10 jours : la

lyse devient par la suite trop in:1portante. .

Le paramètre DIF est le pourcentage maximum de trypomastigotes

métacycliques obtenus.

Résultats 44

Dans l'ensemble, les stocks du groupe 19-20 ont une capacité plus grande

à se différencier en trypomastigotes métacycliques que les stocks du

c10net 39.

Trois stocks se distinguent des autres dans le groupe 19-20 : Cutia,

133 79 et Pll se transforment très peu. Deux se distinguent dans le

c10net 39 : 503 et MN se transforment beaucoup.

Nous observons que 503 et MN, dans le c10net 39, sont aussi les deux

stocks les plus lents en cinétique de culture. Dans le groupe 19-20 par

contre, nous ne notons pas de rapproc.hement entre les mesures de

différenciation et les mesures de cinétique de croissance des

épimastigotes.

Le jour du maximum de différenciation est une valeur difficile à utiliser ;

en effet, les valeurs mesurées varient sur une petite échelle (de 5 à 10

jours pour les 16 stocks) et ne semblent pas distinguer les c1onets..

Nous notons que, dans le groupe 19-20, les trois stocks Cutia, 133 79 et

Pll ne se différenciant pas, sont les seuls stocks à avoir un TDIF de 10

jours. Cependant, d'autres stocks ont un TDIF de 9 jours (Esquilo, 503 et

MN) et se différencient très bien.


Les épimastigotes sont connus pour leur sensibilité au complément.

En étudiant le comportement d'une culture d'épimastigotes maintenus en

STOCKS

CLONET

1° mesure

2° mesure

3° mesure

Coef. de variation

13379c17

19

45,42

34,04

55,54

23,9

Esquilo cil

20

89,06

93,53

NM

3,46

SC43 cil

39

36,16

39,54

23,32

25,93

Table nOG : Mesures de la reproductibilité de la sensibilité desépimastigotes au complément humain (NM = Non Mesurée).

Résultats 45

phase logarithmique, nous ne nous attendions pas à observer une telle

résistance au complément des parasites de certains stocks.

Les mesures de la reproductibilité de la sensibilité au complément sont

présentées dans la table nOG.

Les coefficients de variation montrent une sensibilité moyennement

reproductible. Une reproductibilité plus grande serait obtenue en

conservant les parasites dans les mêmes conditions de culture, ce qui

n'est pas le cas dans notre protocole. En effet, nous les transférons d'un

milieu de culture, L.I.T. en présence de 5VF7, dans un nouveau milieu L.I.T.

en présence d'un nouveau sérum (sérum humain frais au lieu de sérum de

veau fœtal frais), dans un nouveau volume, en contact avec un nouveau

matériau.

Les résultats sont surprenants puisque nous pouvons observer que les

épimastigotes de certains stocks (NR, 503) résistent très bien à la lyse du

complément.

Les épimastigotes des stocks du groupe 19-20 sont dans l'ensemble

sensibles à l'action lytique du complément : les épimastigotes du stock

Gamba sont lysés à 100%.

Dans l'ensemble, les stocks du c10net 39 sont résistants au complément

tandis que les stocks du groupe 19-20 sont sensibles.

Quat~e exceptions à l'ensemble des résultats sont observables: Bug 2149,

7 5VF : Sérum de Veau Fœtal

STOCKS CLONET

Gamba cil 19

Coefficient de variation

Cuica cil 20


SC43 cil 39


MP

10-4 P.lml

1680

1256,2

155

173,1

1301,5

760,6

71,22

0,8

0,95

2,38

63,35

o

o

o

o

INF

%

100

100

100

100

100

100

o

83,3

57,1

42,9

33,54

o

o

o

o

MOR

%

50

NM

NM

NM

66,7

62,5

14,53

o

o

14,3

173,2

o

22,2

60

110,72

TMP

jours

28

29

33

24

40

24

20,52

17

15

15

7,37

NM

NM

NM

NM

Table nO? : Mesures. de la reproductibilité des caractéristiques de

l'infection in vivo. (NM = Non Mesurée)

Résultats 46

MN sont plus sensibles que les autres stocks du c10net 39 ; 133 79 et

SP104 ont une sensibilité très moyenne par rapport aux autres stocks du

groupe 19-20.

Infection in vivo

La table n07 présente les mesures de la reproductibilité des

différents paramètres de l'infection expérimentale de souris.

Les résultats obtenus sont, pour le moins, hétérogènes et les coefficients

de variation sont explicites: selon le protocole que nous avons utilisé, les

mesures ne sont pas reproductibles.

Par contre, nous observons que « l'information qualitative» est

reproductible : certains stocks provoqueront toujours une parasitémie,

même dans les cas où la parasitémie fluctue plus que ce que nous

aimerions et inversement, certains stocks ne provoqueront jamais de

parasitémie mesurable.

C'est pour nous l'observation la plus importante; en effet, les mesures ne

nous fournissent pas d'informations quantitatives fiables sur le

comportement in vivo des stocks, sinon une information qualitative

reproductible.

Il nous était, donc, possible de répartir les 16 stocks en groupes selon la

« qualité » de l'infection provoquée. Nous avons considéré la virulence

Résultats 47

pour cette répartition. La virulence regroupe généralement la mortalité et

la parasitémie (4, 17, 72). Nous l'utilisons avec la même signification.

Nous avons réparti les stocks en trois groupes :

• ceux qui ne sont pas virulents.

Ce sont ceux qui provoquent un pic de parasitémie visible nulle ou

faible (MP ~ 22,2x104 P.lml) et une mortalité nulle ou faible

(MOR < 33,3%). Ils ont généralement une infectivité faible

(INF ~ 37,5%) à l'exception de Cuica dont l'infectivité est de 61,1 %.

• ceux qui sont très virulents.

Ce sont ceux qui provoquent et une forte parasitémie (MP ~ 3,78x1 06

P.lml) et une forte mortalité (MOR ~ 33,3%).

• ceux qui possèdent une virulence intermédiaire ou moyenne.

Ce sont ceux qui provoquent une forte mortalité sans pour autant

avoir engendré une forte parasitémie.

On observe une grande variabilité dans le groupe 19-20 autant pour le

maximum de parasitémie que pour la mortalité et l'infectivité.

Les stocks suivants ont un comportement particulier : Cutia, 133 79, Bug

2148, MN et S03. Les souris infectées par ces stocks, pendant 60 jours,

n'ont pas montré de parasitémie alors que leur état général s'aggravait

tout au long de l'infection et que ·Ie total des souris tuées pendant

Résultats 48

l'infection est égal ou supérieur à 33,3%.

Nous observons que la mortalité peut être forte sans que la parasitémie le

soit mais nous n'observons jamais une forte parasitémie pour une faible

mortalité.

La variabilité des résultats et la non-reproductibilité des mesures ne sont

pas surprenantes. Des infections reproductibles s'obtiennent en adaptant

le parasite à la souris par 4 à 5 passages sur des souris jeunes en vue de

stabiliser la courbe de parasitémie. Certains stocks qui n'ont présenté

aucune parasitémie se sont avérés impossibles à adapter sur souris.

Adapter les stocks n'était pas pour nous primordial, nous recherchions

seulement un éventail de paramètres biologiques pour tester notre

hypothèse de travail. Bien que, spontanément, les paramètres de

l'infection semblent moins « parlants » que les autres paramètres déjà

décrits, l'analyse statistique sera faite de la même manière.

Analyse statistique

Conformité à la loi de Laplace-Gauss, dite loi Normale

Le but est de détermin~r dar)s quelle mesure les variables mesurées

suivent, pour l'échantillon considéré, une distribution normale.

En général, chaque test statistique a des conditions d'application

Résultats 49

particulières. Pour tous ceux que nous avons utilisés, savoir si les

variables suivent une loi normale est nécessaire.

Le test khi carré est le plus utilisé. C'est un test robuste mais qui reste

inadéquat pour l'analyse d'échantillons de moins de 20 individus.

Le test de conformité de Kolmogorov-Smirnov est un test non

paramétrique qiJi s'applique aux distributions de fréquences de variables

quantitatives continues. Il possède l'avantage sur le test khi carré d'être

plus puissant, de ne pas nécessiter les regroupements par classes quand

l'effectif de l'échantillon est faible et de s'appliquer quand ce même

effectif est très petit.

C'est exactement notre cas.

Le test consiste à calculer les différences existant entre les

distributions relatives cumulées observées (Fobs) sur l'échantillon et les

distributions relatives cumulées théoriques (Fth) et de ne prendre en

compte que la différence maximale ainsi calculée « Dobs » :

Dobs = max. cl Fobs(xi) - Fth(xi)l) 'tJ xi

L'hypothèse nulle est:

« La distribution théorique est conforme à la distribution observée. »

L'hypothèse de travail est:

Résultats 50

« La distribution théorique n'est pas conforme à la distribution

observée; il existe au moins une valeur de x où l'écart entre les deux

distributions est trop grand. »

Notre question dans ce test, pour chaque variable, est :

« Les valeurs mesurées sur les 16 stocks se distribuent-elles selon une

loi normale? »

L'hypothèse Ho sera acceptée si chaque valeur de Dobs est inférieure à la

valeur critique Da pour les 16 individus (a étant le risque de première

erreur) ; cette valeur est de 0,392 pour a égal à 1%, et de 0,3273 pour a

égal à 5%.

Deux valeurs dépassent la valeur Do,os : la Dobs de MP et la Dobs de INF.

Variables

1

TD Cfl DIF TDIF SC MP INF MOR

1

Dobs 0,12 0,12 0,275 0,11 0,15 0,67 0,38 0,28

Table n08 : Valeurs de Dobs pour les 8 variables.

La variable MP ne suit pas du tout la loi normale tandis que INF suit la loi

normale de façon approximative (Dobs < Dl %).

• 38,-,.:0:-:,:,,:,:,:,,:'"-":":":'1

9.2 Cfl 47

·38 .26

lillilll0i:!ii·fl:;··'1

1. 9 D1F 64 T D1F

sc 0 MOR 110

Figure nog : Présentation des courbes de distribution desfréquences pour chacune des variables ; celles de MP et INF nesuivent pas un loi normale contrairement aux autres.

Résultats 51

La figure n09 présente, pour chaque variable, les courbes de répartition

des fréquences de distribution sur lesquelles nous avons superposé les

histogrammes donnant les différentes catégories créées dans chaque

variable et le pourcentage de stocks présents dans ces catégories.

Comparaisons des moyennes

Dans notre étude et pour une bonne compréhension de la suite des

analyses statistiques, nous devons préciser que l'information générale que

nous possédons des stocks utilisés est de deux ordres :

une information qualitative qui est donnée par les « paramètres

qualitatifs» (appartenance à un c1onet, provenance géographique, hôte

prélevé) et une information quantitative donnée par les « paramètres

quantitatifs» (toutes les variables mesurées).

En plus de l'appartenance aux c10nets 19, 20 et 39, les données

qualitatives sont épidémiologiques. Bien que l'objet principal du travail

était de tester l'impact de la variabilité génétique du parasite sur sa

diversité biologique, il nous a semblé intéressant d'aborder la question de

l'impact de ces paramètres épidémiologiques sur la diversité biologique.

Cependant, il fal~t souligner que cette partie de notre travail a un

caractère tout à fait préliminaire: l'échantillonnage a été conçu pour

Variables Moyennes Ecarts types V (%) Variances Unités

TD (total) _~__'t.~,8__~____.!.~ê.~ 35,29 250 heures._---.....---_.__.._- __._~ ....~09_._ .._~ ......cl 19 36,6 6,9 18,7 47,1cl 20 33,6 10,5 31,3 110,6cl 39 61,0 10,8 17,7 116,4

Cfl (total) 24,5 11,48 46,86 131,72 10-6 P/mlcl 19 25,3 12,5 49,3 156,1cl 20 32,0 11,6 36,3 135,1cl 39 17,6 7,0 39,5 48,4

DIF (total) 30,95 24,1 77,87 580,92 %

cl 19 34,5 29,4 85,4 866,4cl 20 39,3 24,2 61,5 583,4cl 39 21,1 19,6 93,0 384,6

TDiF (total 8,1 1,64 20,25 2,68 jours

cl 19 8,4 1,8 21,5 3,2cl 20 8,5 1,0 11,2 0,9cl 39 7,6 2,0 26,9 4,1

SC (total) 61,8 31,02 50,19 962,13 %

cl 19 66,6 28,5 42,9 814,4cl 20 92,8 4,2 4,5 17,6cl 39 32,1 13,3 41,4 176,3

MP (total) 212,7 469,51 220,74 220443,6 10-4 P/mlcl 19 177,7 396,9 223,3 157511,8cl 20 500,5 705,3 140,9 497453,6cl 39 2,0 4,7 240,3 22,6

INF (total) 38 43,24 113,79 1869,71 %

cl 19 30 42,0 140,1 1765,6cl 20 74,4 39,2 52,7 1537,5cl 39 14,3 30,0 209,6 902,7

MOR (total) 34,75 32,01 92,12 1024,4 %

cl 19 28,6 27,8 97,1 770,8cl 20 43,5 41,8 96,2 1746,4cl 39 32,6 30,7 94,0 940,3

Table nog : Présentation des calculs statistiques simples detoutes les variables étudiées ; V est le coefficient devariation (écart-type/moyenne)

Résultats 52

tester l'hypothèse de travail principale et n'est absolument pas suffisant

pour apporter des réponses rigoureuses sur les rapports entre les

paramètres épidémiologiques et la diversité biologique.

La table nog présente les calculs statistiques des moyennes, écarts types,

variances et coefficients de Variation.

Nous pouvons observer que toutes les variables sont hétérogènes : les

coefficients de variation sont élevés. TDIF semble échapper à la règle (les

valeurs varient de 5 jours à 10 jours). MP varie énormément de 0 P.lml à

1,7 107 P.lml.

La comparaison des moyennes sera faite par rapport aux modalités (ou

catégories) présentées à la table nOl0.

Modalités N° 1 N°2 N°3

Géographie Chili Bolivie Vénéz.-Brésil

Hôtes Vecteur Hôte sauvage Homme

Clonet 19 20 39

Table nOl0 : Répartition des différentes modalités pour les

variables qualitatives

L'analyse de la variance à un critère de çlassification s'applique

Variables qualitatives

d.d.1. = 15 Clonet Hôte Geographie

V TD F 13.6 1.18 0.365

a P 0.0006 0.337 0.701

rCfl F 2.63 0.59 0.97.

q p 0.11 0.566 0.403

ua DIF F 0.83 0041 0.16n P 0.456 0.672 0.857ti

TDIF F 0.53 0.92 2.5t P 0.6 0.424 0.121a.t F 15.79 2.76 3.05i SC

P 0.0003 0.1 0.082ves MOR F· 0.26 0.96 0041

P 0.773 0.409 0.67

Modalités Clonet Hôte Géogïclphiecomparées = Probabilité de ne pas observer une différence

MP n0 1 / n0 2 = 0,048 0,176 0,131

n0 1 / n0 3 = 0,214 0,469 0,133

n0 2 / n0 3 = 0,004 0,150 0,473

INF n0 1 / n0 2 = 0,090 0,238 0,190

n0 1 / n0 3 = 0,214 0,270 0,192

n0 2 / n03 = 0,009 0,150 0,473

Table nOll : Analyse de la variance à un critère declassification. Table nOll-a : F est le rapport des variancesTable nOll-a et nOll-b : P est la probabilité qu'il n'y aitaucune différence entre les modalités (cf. table n0 10).

Le taux d'acceptation de Ho est P ~ 0,05.

Résultats 53

indifféremment aux grands et aux petits échantillons. Cependant, il est

indispensable que la distribution de fréquence des variables suive une loi

normale.

MP et INF étant en-dehors de ces conditions d'application, nous serons

obligés d'utiliser un test non paramétrique de Wilcoxon-Mann-Whitney.

Le but de l'analyse de la variance à un facteur est de comparer les

différences existantes entre plusieurs catégories ; ces catégories sont

créées selon un caractère qualitatif. C'est, ainsi, l'influence de ce seul

facteur que l'on teste par cette analyse (cf. table n0 10 pour les

différentes catégories ou modalités).

L'hypothèse nulle est, ici, qu'il n'y a pas de différence entre les moyennes

des échantillons que ·l'on compare, c'est-à-dire que le facteur testé (la

provenance d'une même région par exemple) n'a pas d'influence

significative sur les mesures et donc, qu'il n'y a pas de différences

significatives entre groupes de stocks.

La table n011-a présente la valeur F (du nom du mathématicien Fischer) et

la probabilité P ; F étant considéré comme le rapport des variances

(Variance expliquée par le facteur/Variance inexpliquée par ce même

facteur) et P étant la probabilité que les différences observées soient

dues au seul hasard.

Résultats ~4

Plus F est grand, plus la variance expliquée augmente ou plus la variance

inexpliquée diminue et P est fort.

Le degré de liberté est de 13+2=15 ; 3 catégories par variable (3-1 =2) et

3 paramètres qualitatifs pour 16 stocks (16-3=13).

L'analyse de la variance est un test de comparaison des moyennes de plus

de 2 échantillons.

Les hypothèses sont les suivantes:

- l'hypothèse nulle est « toutes les moyennes sont identiques ».

- l'hypothèse alternative est « au moins une moyenne diffère des

autres ».

Nous accepterons ou rejeterons l'hypothèse nulle au risque d'erreur de 5%.

Cependant dans le cas où Ho est rejetée, nous ne pourrons pas dire quelle

moyenne diffère des autres.

Par l'observation de la table n011-a, nous pouvons dire que:

- l'appartenance à un c10net engendre significativement pour

TD et SCJ. et dans une moindre mesure pour Cfl (a = 10%), une

différence de co~port.ement.

- la nature de l'hôte sur lequel on a fait le prélèvement n'est

pas un caractère discriminant significatif pour les 16 stocks ;

Résultats 55

il l'est pour SC au risque d'erreur de 10%.

- la provenance géographique a, pour SC, une influence

statistiquement significative ; cette influence est

moindre pour TDIF (a = 12%).

Il nous faut souligner que les variables DIF et MOR ne présentent pas de

différences significatives entre les groupes pour aucune des variables

qualitatives.

La Sensibilité au Complément apparaît comme une variable très

informative: elle sépare (cf. Table n09) très bien les stocks du c10net 39

des stocks du groupe 19-20 et elle sépare très bien les stocks du Chili

(SCmoyen = 28,43%) des stocks des autres régions géographiques (Bolivie:

SCmoyen = 62,87% et Brésil: SCmoyen = 75,24%). Ce dernier résultat doit

être pris avec prudence puisque nous n'avons, dans notre échantillon, que

trois stocks du Chili.

Le test de Wilcoxon-Mann-Whitney est un test non paramétrique

c'est-à-dire qu'il n'est pas a~sujetti à la loi de distribution des éléments

de .Ia population. Les éléments sont classés par ordre croissant sur une

même échelle ordinale, ils occupent ainsi d~s rangs. Le test cherche à

vérifier si les éléments de deux groupes occupent des rangs équivalents

Résultats S6

révélant ainsi une similitude des deux distributions.

Les résultats, table nO' , -b, nous permettent de dire que les stocks du

c10net 20 se distinguent significativement des stocks des c10nets , 9 et

39 pour ces 2 caractéristiques de l'infection in vivo et que la provenance

géographique aurait tendance (a. = '3%) à séparer les stocks du Chili des

autres pour la variable MP ; que l'hôte n'est pas un facteur déterminant

dans la classification des stocks présentés pour les variables MP et INF.

Corrélation entre biologie et génétique

La comparaison de moyennes entre c10nets ne donne qu'une

information globale de la relation entre chaque variable biologique et la

divergence génétique et ne saurait être utilisée, seule, pour tester notre

hypothèse pour deux raisons :

, / comme le montre la table n04, les valeurs trouvées au sein de

chaque c10net pour les différents paramètres biologiques peuvent

être très hétérogènes;

2/ les nouvelles méthodes d'analyse isoenzymatique ont montré

une hétérogénéité génétique additionnelle au sein de chaque c1onet.

Nous devons, donc, prendre en compte ces deux qbservations et chercher,

pour plus de rigueur, à mesurer le degré de corrélation qui existe entre

Résultats 57

d'une part, les distances génétiques de Jaccard entre paires de stocks et

d'autre part, les valeurs absolues des différences, entre ces mêmes paires

de stocks, des mesures de chaque variable biologique. C'est ici la

démarche la plus appropriée pour tester notre hypothèse de travail8.

Le degré de liberté de l'étude de la corrélation est le nombre de paires de

stocks moins 1, soit 119. Cette solution n'est pas totalement

satisfaisante, car les distances génétiques et les « distances

biologiques » (les différences, entre paires de stocks, des mesures des

variables biologiques) ne sont pas réellement indépendantes les unes des

autres (84) comme l'exigerait l'analyse du coefficient de corrélation de

Pearson. Cependant, dans la pratique, des tests de tirages aléatoires (test

de Mantel), qui ne demandent pas d'estimation sur les degrés de liberté,

ont toujours donné des résultats parallèles aux corrélations classiques

dans de telles comparaisons de matrices de distances (Tibayrenc M., en

préparation). Nous avons, donc, retenu les résultats obtenus par la mesure

du coefficient de corrélation de Pearson (figure nO l0).

En plus de l'estimation du degré de liberté, les variables comparées

doivent être quantitatives et avoir une distribution jointe binormale.

Nous nous trouvons avec ·9 variables· et 120 individus. Ce grand nombre8 L'hypothèse étant que les divergences phylogéniques ont un impact surles propriétés biologiques des stocks.

GÉN TD Cfl DIF TDIF sc MP INF MOR

GÉN

TD

Cfl

DIF

TDIF

sc

MP

INF

MOR

1----:~__1 -. 692 .372 .696 .445 .57 .24

.49

.455

.232

.684

.594

La corrélation est considériJ~

significatiueo 05pour ai ,

10- 4

10- 4 10· 4

10- 4 0,03/' :'\~,3~

/" "' 10- 4 /"V':'"~,57./ ~,63./~,4~

10- 4 10- 4 10- 4 10- 4 0,03

10- 4 va 07' 10· 4 10- 4 1~1"' 10- 4f'....' ./ 1'....'.-/

10- 4 10- 4 10- 4 10- 4 ~ 51"" 10- 4 10. 41'....'../

V ........2.10· 4 10. 4 10· 4 10- 4 10. 40,008 ~,1~ 0,01

MP

MOR

DIF

sc

Cfl

INF

TDIF

TD

GÉN TD Cfl DIF TDIF sc MP INF

.Figure nO' O': Matrice des coefficients de corrélations (en haut) et destaux de signification a (en bas) ; les coefficients de corrélation sontliés aux courbes de régression dessinées sur. la matrice; l'abscisseest la variable de la colonne et l'ordonnée est la variable de la ligne.

Résultats 58

nous a permis de confirmer que les différentes variables avaient une

distribution s'approchant de la normale et, y compris pour MP et INF, nous

avons considéré l'utilisation du coefficient de Pearson comme correct.

La figure nOl0 présente les coefficients de corrélation entre chacune des

variables biologiques d'une part et les distances génétiques d'autre part ;

et entre toutes les variables biologiques comparées deux à deux.

Cette dernière information nous permettra de vérifier dans quelle mesure

les paramètres biologiques ont un pouvoir prédictif les uns sur les autres.

Les coefficients de' corrélation encerclés sur la figure nOl0 sont

considérés comme non significatifs (a > 5%) comme le montrent les taux

de signification au bas de la figure (le test de signification est réalisé

par un test de Student).

La corrélation entre les distances génétiques et les paramètres

biologiques est hautement significative, sauf pour TDIF. Cette corrélation

est très accentuée pour TD et pour SC, moins pour MP, INF et DIF.

DIF est fortement corrélé à tous les paramètres de l'infection in vivo

. alors qu'il est faiblement corrélé aux paramètres de croissance des

épimastigotes.

Le .fait de trouver une telle corrélation entre la facilité à se différencier

en milieu axénique in vitro et la virulence du stock plaide en faveur de la

Résultats S9

qualité du modèle expérimental de différenciation en milieu T.A.U. 3AAG.

Nous voyons que le paramètre TDIF est le seul à ne pas être corrélé avec

les distances génétiques. Ce paramètre est particulier puisqu'il n'est

corrélé qu'au TD, au MOR et au SC.

TD et MOR ne sont pas corrélé entre eux.

Nous pouvons constater que nous n'avons pas de variables complètement

redondantes : par exemple, MOR est fortement corrélé aux autres

paramètres de l'infection, cependant nous voyons que son comportement

par rapport au TDIF est différent. INF est fortement relié aux MP et MOR,.

cependant MP est faiblement relié au TD.

La corrélation nous renseigne sur le comportement de chaque variable

biologique par rapport à toutes les autres. Mais il est plus informatif de

synthétiser, d'un coup, l'information de toutes les variables et de voir la

puissance de cètte information pour décrire et caractériser les stocks.

Nous nous proposons de le faire dans les chapitres suivants.


Analyse en composantes principales ou A.C.P.

Cette analyse est un pas nécessaire pour introduire l'analyse

Résultats 60

factorielle discriminante. Cela nous permettra de « débroussailler », de

manière descriptive, l'information synthétique sur l'organisation des

stocks en différentes classes.

L'analyse en composantes principales consiste précisément à chercher de

nouvelles variables - les composantes principales - non corrélées entre

elles et combinaisons linéaires des variables de départ (TD, Cfl, DIF, TDIF,

SC, MP, INF, MOR).

Cette analyse détermine des axes principaux d'inertie du nuage.

En termes pratiques, lorsque l'on se trouve face à un tableau de données

tel que celui présenté table n04, nous ne pouvons parler que de

l'information apportée séparément par chaque variable. Synthétiser

l'information obscurcie par la masse de nombres revient à obtenir le

maximum d'information sur le modèle à partir du minimum de données.

Transformer les différents paramètres quantitatifs en variables non

corrélées entre elles permet de mieux gérer l'information intrinsèque à

chacune - il n'y a pas redondance d'information - et de nous limiter à un

petit nombre d'entre elles sachant quelle est leur valeur informative.

Tout ce qui suit consiste don~ à r~duire la dimension de l'espace à 8

dimensions (les 8 variables) des 16 individus (les stocks) en une espace

en deux ou trois dimensions.

Les axes de cet espace possèdent chacun une inertie différente,

Inertie (%) Cumul (%)

1° axe 45,87 45,87

2° axe 20,83 66,70 Axes conservés pourl'interprétation

3° axe 15,12 81,81

4° axe 8,64 90,45

5° axe 4,11 94,56

6° axe 2,15 96,71 Axes mineurs

raxe 1,95 98,67

8° axe 1,33 100

Table n0 12 : Inertie individuelle et cumulée desaxes créés pour l'A.C.P.

2

A est faiblement représenté parl'axe 1, fortement représentépar l'axe 2.

A est fortement représenté parl'axe 1, faiblement représentépar l'axe 2.

Figure n0 11 : Description des cercles des corrélationsentre les variables et les axes.

Résultats 6'

c'est-à-dire une partie différente de l'information du modèle.

La table nO' 2 présente l'inertie de chaque axe. Les 4 premiers axes ont été

retenus pour l'analyse. Ils synthétisent 90,45% de l'information du modèle.

Ils expriment aussi différemment chaque variable de départ étant entendu

qu'ils sont une composition de celles-ci. Les huits axes ont donc deux

propriétés :

, / ils ne possèdent pas la même information du modèle

d'ensemble ;

2/ ils n'expriment pas les variables de la même manière.

En fait, un cercle de corrélation permet, par rapport à 2 axes (1 horizontal

et , vertical) créés et définis lors des calculs préparatoires de l'A.C.P., de

représenter graphiquement les relations qui existent entre les différentes

variables et les différents axes. Nous voyons sur la figure nO" qu'une

variable est d'autant bien prise en compte par un axe que sa projection

orthogonale sur celui-ci est grande.

Sur la figure nO' 2 ( et table nO?), nous notons que

- l'axe' exprime très fortement les variables MP et INF et SC,

et bien toutes les autres variables sauf TDIF ;

- l'axe 2 prend très bien en compte TD et MOR, et mal TDIF, INF,

DIF, MP ;

- l'axe 3 prend très bien en compte TDIF et faiblement DIF et pas

Figure n012 : Représentation graphique des cercles descorrélations entre les variables biologiques et lesprincipaux axes de l'A.C.P.

1,1

-1,1

Résultats 62

c'est-à-dire une partie différente de l'information du modèle.

La table n01 2 présente l'inertie de chaque axe. Les 4 premiers axes ont été

retenus pour l'analyse. Ils synthétisent 90,45% de l'information du modèle.

Ils expriment aussi différemment chaque variable de départ étant entendu

qu'ils sont une composition de celles-ci. Les huits axes ont donc deux

propriétés :

1/ ils ne possèdent pas la même information du modèle

d'ensemble;

2/ ils n'expriment pas les variables de la même manière.

En fait, un cercle de corrélation permet, par rapport à 2 axes (1 horizontal

et 1 vertical) créés et définis lors des calculs préparatoires de l'A.C.P., de

représenter graphiquement les relations qui existent entre les différentes

variables et les différents axes. Nous voyons sur la figure n011 qu'une

variable est d'autant bien prise en compte par un axe que sa projection

orthogonale sur celui-ci est grande.

Sur la figure n012, nous notons que

- l'axe 1 exprime très fortement les variables MP et INF et SC,

et bien toutes les autres variables sauf TDIF ;

- l'axe 2 prend très bien en compte TD et MOR, et mal TDIF, INF,

DIF, MP ;

- l'axe 3 prend très bien en compte TDIF et faiblement DIF et pas

Inertie totale = 66.7%

.Esqui.lo

RMe 2

.5(43

RHe 1

209

•

Pll

R

Inertie totale = 23.76% RMe 4

ffi·1-3.9 tfi 3.1

-2

RHe 3

SP104•

Figure nO' 3 : Représentation graphique en deux dimensions del'A.C.P.. En haut: le graphe a les axes' et2 (graphe' -2) ; en bas: le graphe a les axes 3 et4 (graphe 3-4).

Résultats 62

du tout TD et MP ;

- l'axe 4 prend faiblement en compte Cfl.

Nous confirmons que les axes 1,2 et 3 forment la meilleure combinaison

autant pour la quantité d'inertie que pour qualité d'expression des

variables.

La figure n013 présente deux graphes à deux dimensions distribuant les

stocks selon les nouveaux axes définis par l'A.C.P. : l'un est formé par les

axes 1 et 2, l'autre par les axes 3 et 4.

Sur le graphe 1-2, quatre groupes sont formés.

L'axe 1 sépare les stocks en 2 groupes, dont l'un est formé de Esquilo,

Gamba, P209 et S034. Les cercles des corrélations montrent que les

variables les mieux exprimées par l'axe 1 sont MP et INF et SC et

effectivement, Esquilo, Gamba, P209 et S034 forment le groupe des

stocks les plus virulents9 avec une faible résistance au complément.

L'axe 2 sépare les stocks en deux groupes dont l'un est formé de Esquilo,

MN et S03 : les cercles des corrélations montrent que les variables les

mieux exprimées sur l'axe 2 sont TD et MOR.

Nous voyons qu'en prenant en compte plus des deux tiers de l'inertie totale

les stocks se répartissent « aux quatre coins » du graphe témoignant de

comportements biologiques différent's. Nous pouvons dire que, sur les 169 La virulence étant aptitude à déterminer chez .Ia souris une forteparasitémie et une forte mortalité.

Résultats 0.:5

stocks, Gamba, P209 et S034 s'individualisent par une virulence forte et

une croissance en milieu axénique rapide, que S03 et MN s'individualisent

par une croissance très lente et des mesures de MOR élevées et que les

autres stocks (mis à part Esquilo) n'ont pas de composantes biologiques

déterminantes.

Les axes 3 et 4 ne concernent à deux que à peu près 24% de l'inertie. Ils

sont donc beaucoup moins informatifs pour distinguer les stocks les uns

des autres. Toutefois, il convient de considérer plus en détail une qualité

particulière de l'axe 3 : il exprime 74% de l'information de TDIF.

L'axe 3 isole SP104 et regroupe Pll, Cutia et 133 79. Le rapprochement

des 3 autres stocks est dû leur très fort TDIF.

L'axe 4 nous permet d'individualiser Cuica et OPS21 d'une part, et NR et

Bug 2148 d'autre part, ces stocks ayant respectivement des

caractéristiques biologiques in vitro similaires.

Nous présentons, sur la figure n014, 2 graphes en· trois dimensions. Nous

augmentons ainsi le pourcentage d'inertie (de 66,7% pour le graphe 1-2

nous parvenons à 81,5% de l'inertie totale sur le graphe 1-2-3).

Nous espérons, ainsi, vérifier les séparations observées figure n013 et

faire éclater le groupe compact de 10 stocks observé dans le graphe 1-2.

Le graphe 1-3-4 semble proposer plus clairement des rassemblements de

stocks que le graphe 1-2-3.

RHes 1, 2. 3 :81,5% del'inertie total e

Esquilo

RH 2

503

RH 3

RHes 1, 3,4 :65,8% del'inertie totale

RH 4

Ax 1 min.=-3,9Ax 2 min.=-2Ax 3 min.=-1,9Ax 4 min.=-1,7

max.=2,6max.=3,1max.=2,2max.=1,5

RH 1

Figure n014 Représentation graphique en 3 dimensions del'analyse en composantes principales.Le graphe du haut a les axes 1, 2 et 3 (1-2-3) ; le graphe du basa les axes 1,3 et 4 (1-3-4).

Résultats 64

Nous pouvons discerner 5 groupes dont Esquilo, Gamba, P209 et S034 d'un

côté et Pll, Cutia et 133 79 de l'autre.

Au centre Bug2149, MN et S03 sont séparés de Cuica et Esquilo.

SP104 est isoléainsi que Bug2148 et NR.

Nous constatons, grâce à l'analyse en composantes principales, qu'il est

désormais plus facile d'identifier biologiquement les stocks. Ceux-ci se

regroupent selon les paramètres qui leur sont les plus marquants : par

exemple, Esquilo, Gamba, P209 et S034 se distinguent, entre autre, par

leur forte virulence.


La classification automatique est une autre méthode d'analyse des

données. Elle porte sur des individus qu'il s'agit de regrouper en catégories

jugées homogènes au regard de tel ou tel critère.

Nous avons représenté, sur la figure n015, la classification automatique

des 16 stocks.

Nous pouvons voir que cette méthode se rapproche de l'analyse en

composantes principales (cf. figure n014, graphe 1-3-4).

Nous voyons, de nouveau, que les stocks Esquilo, Gamba, 5034 et P209 se

distinguent de tous les autres stocks ; que 503 et MN se regroupent (cf.

figure n013, graphe 1-2) d'un côté ainsi que Cutia, 133 79 et Pl1 d'un

autre côté.

o 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,37

SPl04

OPS2l

Cuica

Cutia

13379

PlI

Bug2l49

SC43

Bug2l48

NR

S03

MN

Esquilo

Gamba

S034

P209

1

1

1 ~

1

1

1

1

1

1

1

~

Figure nO' 5 : Dendrograrnme représentant la variabilitébiologique totale entre les stocks.

Résultats 65

Les résultats de l'étude de la corrélation (entre distance génétique

et paramètres biologiques) et les résultats de l'A.C.P. sont autant

d'arguments pour réaliser l'analyse factorielle discriminante.

Analyse factorielle discriminante

On peut assigner aux méthodes de discriminations deux objectifs

complémentaires :

1/ étudier si les variables recueillies permettent de distinguer des

groupes et

2/ fournir des règles de classement pour prédire l'appartenance des

observations à des groupes prédéterminés.

L'analyse factorielle discriminante consiste à chercher de nouvelles

variables, combinaisons linéaires des variables de départ (comme l'A.C.P.),

qui fournissent les meilleures séparations des groupes. Elle apparait alors

comme une analyse en composantes principales particulière.

On peut considérer que l'objet de l'analyse discriminante est l''élaboration

d'une règle de décision perm~ttan~ de classer au mieux les observations

futures.

Toutes les variables n'ont pas le même « pouvoir» discriminant. Certaines

variables peuvent même apporter du « bruit » au problème décisionnel

Résultats 66

posé. II est donc, la plupart du temps, indispensable de passer par une

phase de sélection des meilleures variables afin d'obtenir une

discrimination fiable.

Le calcul des coefficients de corrélation nous a permis de voir quelles

variables étaient entre elles et donc, présentaient un certain degré de

redondance. L'A.C.P., en revanche, nous a permis de préciser qu'elles

apportent, pour' la plupart des cas, une information spécifique. La variable

MP fait exception et n'a pas été utilisée pour l'analyse discriminante.

Nous remarquons que la variable MP - le nombre maximum moyen de

parasites observés dans le sang d'une souris infectée expérimentalement

- est une variable qui a un faible pouvoir analytique. Ceci ne veut pas dire

qui faille rejeter ce paramètre pour des études postérieures : dans les

conditions expérimentales utilisées, MP ne donne pas toute sa puissance

informative. Cela aurait été probablement le cas si avec temps, patience

et obstination, nous avions adapté chaque stock pour l'infection

expérimentale et observé une parasitémie contrôlée, stable et beaucoup

plus significative. Cependant, il est utile de préciser que l'adaptation chez

la souris de stocks ne donnant pas de parasitémie est un travail quelque

fois très long.

Nous avons préféré augmenter le nombre de paramètres descriptifs. .

pouvant être analysés.

La figure n016 présente les résultats graphiques de l'analyse

HK 2

Figure n016 : Représentation graphique de l'analyse factoriellediscriminante ; chaque stock est relié au centre de gravité deson c10net (1 c::::> 19; 2 c::::> 20; 3 c::::> 39); les aires deprobabilité définissent l'espace où la probabilité de trouver unstock appartenant au c10net précisé est de 93%. Les axes 1 et 2définissent complètement le modèle (100% de l'inertie). .

Résultats 67

discriminante des données biologiques par rapport au modèle génétique.

Dans cette analyse, la question est: « dans quelles mesures l'ensemble

des données biologiques ci-dessus traitées permettent-elles de prédire

l'appartenance d'un stock à un donet? »

Nous voyons que la répartition des stocks après l'analyse discriminante

sépare nettement les stocks du c10net 39 de ceux du groupe 19-20. L'aire

de probabilité est de 93% sans chevauchement entre le c10net 39 d'une

part et le groupe 19-20 d'autre part. En d'autres termes, par ces

caractéristiques biologiques, un stock 39 aura 93% de chance de se

trouver dans l'aire de l'ellipse du c10net 39.

Nous pouvons, aussi, observer que le c10net 19 est très hétérogène et que

les c10nets 19 et 20 ont tendance à se séparer sur l'axe vertical (axe n02).

Résultats 68


Une hétérogénéité additionnelle au sein de chaque clonet est mise

en évidence après augmentation (de 15 à 22) du nombre de loci

isozymiques étudiés.

Les c10nets 19 et le c10net 20 se trouvent ainsi indifféremment

assemblés dans le groupe génétique 19-20. Ce dernier est

phylogénétiquement très divergent du c10net 39.

Les paramètres in vitro, surtout le TD et SC, sont reproductibles

et permettent de bien distinguer les différents groupes génétiques.

Les paramètres in vivo sont moins reproductibles et s'avèrent très

.variables.

Les variables MP et INF ne suivent pas une loi normale

contrairement à toutes les autres. Seules les variables SC et TD ont

des valeurs significativement différentes entre les stocks de c10nets

différents. Toutes les variables sauf TDIF sont fortement corrélés aux

distances génétiques. L' A.C.P. nous permet de constater que les stocks

se regroupent selon des composantes biologiques fortes. L'analyse

discriminante permet de dire que, à 93%, les stocks du c10net 39 et du. . .

groupe 19-20 ont des comportements biologiques statistiquement

différents..

[ DISCUSSION J

Discussion 69

DISCUSSION

Discussion principale

Le présent travail a pour but de répondre à une question simple :

l'évolution c1onale, postulée chez T. cruzi (79, 81, 82), a-t-elle un impact

sur la diversité biologique considérable du parasite? En d'autres termes,

les divergences phylogéniques existant entre clones n~tlJrels de T. cruzi

ont-elles un pouvoir prédictif sur les différences de comportement

biologique du parasite qu'on peut voir d'un stock à l'autre?

L'hypothèse nulle, par rapport à laquelle sont effectués les tests

statistiques, est que la variabilité génétique n'a pas d'impact sur la

variabilité biologique de Trypanosoma cruzi.

Dans cette optique, l'étude des divers paramètres biologiques considérés

dans le présent travail n'était pas un but en soi, mais visait seulement à

constituer la panoplie la plus étendue et la plus variée possible de

caractères différents susceptibles de répondre à notre question.

Deux observations principales peuvent être tirées de nos résultats:

1/ L'hypothèse nulle est peu compatible avec ce que nous observons;

en effet, les distances génétiques sont nettement ou fortement corrélées

à tous les paramètres biologiques sauf un. Le bon accord entre distances

génétiques et diversité biologique est spécialement bien illustré par

Discussion 70

l'analyse factorielle discriminante (figure n016).

2/ L'information génétique apportée par la caractérisation

isoenzymatique n'a pas Lin pouvoir prédictif de 100% sur la diversité

biologique. Nous le voyons sur les tables n04 et n09 : à l'intérieur d'un

groupe génétique donné (par exemple l'ancien c10net 39, qui reste

relativement bien homogène génétiquement malgré l'utilisation de

techniques isoenzymatiques plus résolutives), la variabilité biologique

reste importante.

Ceci suggère donc fortement que la divergence phylogénique entre c10nets

n'est pas le seul paramètre influençant la diversité biologique de T. cruz;,

même si la première semble bien avoir un impact majeur sur la seconde.

Tibayrenc et coll. (81) ont proposé que la diversité biologique de T. cruz;

pouvait s'expliquer, soit par la divergence phylogénique entre clones

naturels, soit par l'adaptation à différents cycles écologiques, soit par

une combinaison de ces deux facteurs. Si l'adaptation à des cycles

écologiques divers était le facteur prépondérant, on devrait attendre que :

1/ des stocks présentant le même profil isoenzymatique (appartenant

au même c1onet), mais venant de cycles radicalement différents (par

exemple, pris chez des patients chagasiques chroniqu,es et chez des

mammifères sylvestres) tendent à être très différents pour leurs

propriétés biologiques ;

2/ des stocks appartenant à des c10nets radicalement différents et

Discussion 71

venant tous d'un même cycle écologique (par exemple, tous isolés de

Triatoma infestans en cycle domestique) montrent peu de diversité

biologique.

Le dernier cas de figure résulterait d'une véritable convergence évolutive :

des stocks issus de phylums radicalement différents deviendraient

biologiquement similaires par. le fait de pressions environnementales

comparables.

Malheureusement, le présent échantillonnage se prête malaisément à

l'estimation de cette hypothèse puisque nous avons bien 5 stocks issus de

Triatoma infes tans, mais le c10net 39 Y est hyper-représenté (4 stocks

sur 5).

La question reste donc ouverte de l'impact spécifique de la différenciation

écologique sur la diversité biologique de T. cruzi.

Les résultats du présent travail pourraient être redoutablement

remis en cause par une hypothèse récemment proposée chez T. cruz! (2) et

chez Entamœba histolytica (61), hypothèse selon laquelle les zymodèmes

de parasites ne représentent pas des génotypes stables, mais de simples

phénotypes susceptibles de subir des changements radicaux sous des

pressions environnementales adéquates (2, 87).

Une telle hypothèse, si elle est vraie, rend nul et non avenu le modèle

clonai de T. cruzi, et par là-même le présent travail. Cependant, une

Discussion 72

somme considérable de connaissances en génétique des populations,

acquises à partir d'organismes extrêmement divers, y compris des

microorganismes, montrent qu'en règle générale, les caractères

isoenzymatiques représentent bien des génotypes fiables. Il faudrait donc

admettre que les protozoaires parasites, pour quelque mystérieuse raison,

constituent un cas spécial.

Par ailleurs, une donnée extrêmement robuste plaide en faveur de

l'hypothèse que les profils isoenzymatiques de T. cruz; représentent bien

des lignées évolutive authentiques : la corrélation entre plusieurs séries

indépendantes de marqueurs génétiques, exemple particulier spécialement

frappant de déséquilibre de liaison (84).

Une telle corrélation a été observée pour des marqueurs très divers chez

T. cruz; (49, 76, 82, 84), et est très difficilement compatible avec

l'hypothèse proposée par Alves et coll. (2) et Mirelman (61).

Notre propre travail apporte des éléments nouveaux à ce débat, puisque la

stabilité des profils isoenzymatiques de nos stocks a été confirmée sur

plusieurs années dans des conditions expérimentales extrêmement

diverses.

Il est probable que les résultats, présentés à l'encontre de la stabilité

des profils isoenzymatiqLies, soient en fait dus simplement aux clonages

imparfaits comme le suggèrent Clark et coll. (26).

Discussion 73

Bien que l'étude des paramètres biologiques n'ait pas été un but en soi

dans notre travail, il nous a été possible de glaner sur ces paramètres un

certain nombre d'observations qui valent la peine d'être rapportées

brièvement.

Virulence et Métacyclogenèse

L'infection in vivo a fourni des mesures très hétérogènes (Table n0 9).

Néammoins, nous avons pu séparer les stocks en 3 groupes selon leur

virulence. Bien que les paramètres de virulence soient statistiquement

corrélés aux distances génétiques, les 3 groupes de virulence ne

correspondent pas aux 3 c10nets étudiés ici.

Chez Cutia et MN, la parasitémie n'est jamais détectable bien que la

mortalité soit élevée. Cela semblerait confirmer plusieurs travaux

antérieurs (68, 69, 70), qui précisent que le nombre de parasites

circulants n'est pas toujours un indicateur du développement de l'infection

chez la souris.

Le maximum de différenciation in vitro est trés fortement corrélé aux

paramètres de l'infection in vivo. Cette corrélation a déjà été soulignée

par Sanchez et coll. (75). Les paramètres de transformation in vitro,

relativement simples à mettre en œuvre, auraient donc un bon pouvoir

prédictif sur la virulence.

Discussion 74

Temps de doublement et tests de sensibilité aux drogues

Le Temps de doublement et la Sensibilité au complément sont les

paramètres in vitro qui séparent le plus nettement les stocks appartenant

aux différents c1onets.

Le Temps de doublement des épimastigotes in vitro a été le premier

paramètre biologique à avoir été relié aux variations isozymiques, avec,

cependant, un sondage non exploitable statistiquement (36).

C'est une donnée biologique facilement obtenue en laboratoire et très

informative :

• le TD est considéré comme une caractéristique intrinsèque du

parasite (36) ; il est corrélé au temps de doublement intracellulaire de

l'amastigote (38).

• le TD a aussi été corrélé (36) aux pourcentages d'épimastigotes

présents dans les différentes phases du cycle cellulaire (Gl, S, G2-M),

montrant une durée de la phase S proportionnelle au temps de doublement.

Ces informations sont importantes, puisque la connaissance indirecte

de la durée des différentes phases du cycle peut permettre de choisir les

drogues les plus susceptibles d'agir sur telles ou telles populations.

Effectivement, une population parasitaire ayant une phase S longue (phase

de synthèse de l'ADN) est très .sensible à des agents interférant avec cette

synthèse (36). Par ailleurs, une infection par un parasite ayant une

croissance intracellulaire de longue durée doit faire l'objet d'un

Discussion 75

traitement par un agent chimique restant suffisamment longtemps dans la

circulation sanguine.

L'épimastigote serait, ainsi, un bon modèle pour le criblage de produits

trypanocides (36).


C'est la première fois que l'on montre une résistance partielle des

épimastigotes au complément. Les épimastigotes sont effectivement

connus pour se lyser au contact de sérum non décomplémenté, ce qui

permettait de les séparer des formes trypomastigotes résistantes à cette

lyse (14, 31).

Nous avons comparé la sensibilité au complément de « vrais »

épimastigotes. Les parasites ont été prélevés en milieu de phase

logarithmique. La résistance observée pour certains stocks est

temporaire, puisqu'en augmentant le temps d'incubation, 100% des

épimastigotes de tous les stocks ont été lysés (Cf. le protocole d'infection

expérimentale).

L'acquisition de la résistance des trypomastigotes au complément a été

reliée à l'apparition de diverses protéines de surface. Ces protéines

seraient des inhibiteurs contrôlant la formation du complexe d'attaque

résultat de la cascade du complément (51).

La synthèse de telles molécules semblerait survenir très rapidement

Discussion 76

après le déclenchement de la métacyclogenèse (27).

La resistance temporaire des épimastigotes révélée dans notre travail

semble indiquer que l'activation de la voie alterne du complément est

modulée par un facteur intrinsèque au parasite : on obtient, dans tous les

cas, 100% de lyse. Cependant, les épimastigotes de certains stocks

doivent être incubés au contact du complément beaucoup plus longtemps

que les autres.

Discussion 77


Les distances génétiques sont bien corrélées aux paramètres

biologiques. L'analyse discriminante nous permet de bien séparer les

stocks du c10net 39 des autres stocks par leur comportement

biologique sur les 8 variables.

La variabilité biologique nlest pas complètement expliquée par le

modèle clonale et l'adaptation du parasite aux différentes niches

écologiques doit intervenir.

Le Temps de Doublement et la Sensibilité au Complément sont les

deux paramètres les plus informatifs vis-à-vis du modèle génétique.

[CONCLUSIONSJ

Conclusions 78

CONCLUSIONS

Des études de valeur ont par le passé considéré la diversité

biologique de protozoaires parasites, en particulier de Trypanosoma cruzi

(36). Cependant, ce travail est le premier, à notre connaissance, qui appuie

une telle étude biologique sur un cadre rigoureux de génétique des

populations. Le modèle clonai fournit une hypothèse réfutable : « la

diversité clonale a un impact notable sur la diversité biologique de T.

cruzi ».

Cette hypothèse n'est pas réfutée par la présente étude, ce qui nous

conduit donc à la retenir comme hypothèse de travail.

La diversité biologique importante mise en évidence chez des stocks,

pourtant très apparentés génétiquement, nous montre clairement par

ailleurs que la diversité c10nale n'est pas le seul facteur responsable de

cette diversité: l'impact des pressions environnementales devra être

évalué par un échantillonnage plus approprié prenant en compte, d'une part

des séries de stocks venant d'environnements diversifiés, mais

relativement homogènes génétiquement, d'autre part, des séries de stocks

provenant de mêmes environnements mais génétiquement très différents.

Bien que .Ies résultats obtenus soient trop préliminaires pour le

certifier (il faut augmenter le nombre de stocks), il semble bien que,

Conclusions 79

malgré leur diversité biologique notable, les stocks du c10net 39 aient,

dans leur ensemble, un comportement spécifique par rapport aux stocks du

groupe 19-20 : en particulier, une croissance lente en culture

d'épimastigotes et une faible virulence chez la souris SALS/C.

Nous soulignons l'importance potentielle d'un tel résultat dans l'étude de

la variabilité clinique de la maladie de Chagas : les stocks du c10net 39

sont fort répandus dans le sud de la zone de répartition de la maladie (

c'est un clone majeur), et il est bien sûr vital de vérifier s'ils pourraient

avoir un comportement clinique moins sévère que les stocks du groupe

19-20.

Cependant, il est essentiel de dépasser ce modèle (peut-être simpliste)

reposant sur l'étude séparée des différents génotypes. Cette étape

réductionniste est indispensable mais ne suffit pas pour comprendre

complètement les observations sur le terrain. En effet, chez T. cruzi, les

mélanges de clones naturels chez un hôte (ou triatome [79] ou patient

chagasique [19]) semblent très fréquents.

Il est possible que ces mélanges aient un rôle dans la pathogénicité de la

maladie de Chagas. Une hypothèse de travail future est que le mélange de

de.ux c10nets chez un hôte donné n'a pas le même effet que la simple

juxtaposition des effets séparés de ces c10nets : des phénomènes. .

d'inhibition, ou au contraire, de potentialisation pourraient se voir.

Des expérimentations futures devront donc explorer cette voie, en

Conclusions 80

étudiant les conséquences, en particulier chez l'animal de laboratoire, des

mélanges de c1onets.

Un des apports majeurs du présent travail aura été d'ouvrir la voie à ces

recherches complémentaires, en dégageant la méthodologie expérimentale

nécessaire.

" est utile d'annoncer ici que les résultats préliminaires obtenus dans le

cadre d'une « thèse-sœur» s'appuyant sur le modèle expérimental que

nous avons mis au point dans ce travail, sont tout à fait parallèles à ceux

que nous avons obtenus (Susana Revollo, communication personnelle) : en

effet, la sensibilité in vitro de deux drogues antichagasiques majeures est

fortement corrélée à la divergence phylogénique entre c1onets, mais on

observe une diversité notable entre stocks génétiquement apparentés.

La démarche que nous avons suivie (utilisation d'un cadre rigoureux de

génétique des populations pour l'étude de la biologie d'un protozoaire

parasite) est potentiellement applicable à tout microorganisme et vise, en

fait, à répondre à une question essentielle de très large portée, sans

réponse à ce jour: quel est l'impact de la variabilité génétique des

microorganismes sur leurs propriétés médicales importantes?

Notre espoir est que. la présente recherche apparaisse dans le futur

comme un trav~il pionnier dans l'étude de cette· question.

[ BIBLIOGRAPHIE J

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