Biochimie 70 (1988) 885-894 (~) Soci6t6 de Chimie biologique / Elsevier, Paris 885

Prolif6ration cellulaire et coop6ration des oncog/ nes v-mil et v-myc

Christine DOZIER, Jean COLL, Sophie RAVIT, Dominique STEHELIN et Simon SAULE

Laboratoire d'Oncologie Moldculaire, I N S E R M U 1 8 6 / C N R S UA 1160, lnstitut Pasteur, I rue Calmette, 59019 Lille Cedex, France

(Received 29-2-1988, accepted 18-3-1988)

Summary m Retroviruses which possess the property tO recombine with genetic material from the ceil, have cloned and activated some oncogenes and hence are a privileged source for the study of these genes. Cellular oncogene activation can occur following two non mutually exclusive v'ays: (i) by over- expression of their products; (ii) by modifications of their products through mutations. Retroviruses can combine these two ways of activation leading to the over-expression of a modified product.

In this paper, we present results obtained in the study of MH2, a retrovirus containing two oncogenes. We have shown that the two oncogenes of MH2 (v-rail and v-myc) cooperate in vitro to transform neu- roretina cells from chicken embryos. These cells which normally do not grow in a defined medium, are induced to proliferate and become transformed upon infection by MH2. Our data enabled us to show that in MH2 v-mil was responsible for the induction of proliferation and v-myc for the transformation of the proliferating cells. Using in vitro constructs we located two regions in the protein encoded by v-rnil which are important for its mitogenic property. We have also cloned the cellular counterpart of v-rail and the study of its biological activity on neuroretina cells enabled us to propose a mechanism of activation of the cellular gene by truncation of its 5' part.

neuroretinal cells / proliferation / cooperation / oncogenes

Introduct ion

Une perturbation des mEcanismes susceptibles d'amener une multiplication cellulaire (mitose/ diff6renciation et leur regulation, surveillance immunologique...) peut 6tre ~ la base de l'appa- rition de cancers. Dans de nombreux tissus, la mitose qu;. permet la croissance est notamment rEgulEe par la differenciation qui restreint la division cellulaire en modifiant le statut de la cel- lule. Certaines voies biochimiques permettant mitose et diff~renciation sont tr6s semblables, voire identiques. Scion le type cellulaire, un m6me stimulus apr6s avoir activ6 une cascade de c-onc dEclenchera mitose ou diffErenciation. Ainsi, par exemple, le produit de v-src peut inhi- ber ia diffErenciation des myoblastes [1] ou induire la diffErenciation des cellules de phaechromocytome PCI2 [2]. Le produit d'un

m6me oncog6ne cellulaire (c-ras) est requis pour la diff6renciation [3] et pour ia prolif6ration [4]. Cependant, il est possible que le r61e physiologi- que des oncog6nes d6borde largement le cadre de la prolif6ration ou de la diffErenciation, ce qui 61argirait considErablement leur fonction [5].

Un mod61e de cooperation entre v-onc est fourni par !e virus AEV qui contient deux onco- g~nes v-erbA et v-erbB. Une Etude rEcente r6ali- see par Kahn et al. [6] et portant sur la coop6ra- tion entre ie produit v-erbA et le produit d'autres oncog6nes dans la transformation des Erythro- blastes a permis de dEfinir deux 6tapes dans cette transformation. Les produits des oncog~nes v- src, v-erbB, v-ras, v-sea permettent ia prolif6ra- tion des 6rythroblastes d'une fa~on ind6pen- dante de facteurs de type 6rythropoi'Etine. Tou- tefois, ces cellules exigent un milieu de culture complexe pour prolifErer (fen6tres de pH et de

886 C. Dozier et al.

force ionique bien d6finies) [7]. La sur-infection de ces cellules par un virus portant l'oncogEne v- erbA seul [8] permet leur proliferation en milieu standard et bloque leur maturation en Erythro- cyte mEme en presence de facteurs de type 6rythropoiEtine. Ce modEle montre que plu- sieurs 6vEnements gEnEtiques (fournis par le produit des v-onc) peuvent 6tre requis pour que la cellule acquiEre son phEnotype transform6 maximal: le premier stade dErEgule la prolifEra- tion et le second bloque la diffErenciation.

Un autre exemple de cooperation est fourni par Faction des oncog/mes v-rail et v-myc (tous deux portEs par le rEtrovirus aviaire MH2), dans la transformation des cellules de neurorEtine d'embryons de poule de 7 jours (NRP) [9]. L'oncogEne v-mil est exprim6 dans les cellules par une protEine de fusion de 100Kd contenant les determinants du gEne gag et du g/me v-mil (la P100gag-mil). Cette protEine, codEe par I 'ARN gEnomique du virus, est cytoplasmique et pos- sEde in vitro une activit6 sErine/thrfonine kinase [10, 11, 12]. Le gEne v-myc est exprim6 sous forme d'un doublet de 61 /63Kd localisE dans le noyau des cellules infectEes [13]. Ce dou- blet est code h partir d'un ARN sous gEnomique produit par l'6pissage du gEnome viral [14]. Un modEle cellulaire in vitro dEveloppE par G. Calothy semblait singulariser MH2 au sein des virus contenant l'oncogEne v-myc (MH2, CMII, OK10 et MC29). En effet, les NRP maintenues en survie nrolif/~rent ~t g n n t t r a n e f n r m , g , ~ e h a , - I,~

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virus MH2 alors que, dans les mEmes conditions, ces cellules ne rEagissent pas ~ une infection par les virus MC29 ou apparentEs. La diffErenciation de comportement observEe pour les cellules infectees par l'un ou l'autre de ces virus pouvait s'expliquer soit par l'existence au sein de MH2 d'un allele du gEne v-myc particulier, soit par l'action du produit du gEne -mil, soit par une action conjointe des produits des deux onco- genes du virus MH2. A partir du clone molEcu- laire du virus MH2 [15] nous avons construit plu- sieL, rs mutants de ce virus, dElEtEs dans la por- tion de la P100gag "rail codEe par le gEne gag ou par le gEne v-mil, ainsi que des mutants dElEtEs dans le gEne v-myc. Les rEsultats obtenus montrent que ia P100gag "mii est responsable de la prolifEra- tion des NRP et que le doublet p61/63my cest responsable de la transformation des cellules qui prolifErent. La portion active de ia P100gag -rail est reprEsentEe par son domaine kinase, dEfini par comparaison de la sequence dEduite de cette protEine avec celle d'autres protEines possEdant une activitE kinase; toutefois, ia portion gag de

la protEine est importante pour un effet mito- gEne maximal sur les cellules de neurorEtine. La comparaison entre les sequences nuclEotidiques de v-mil et de c-mil montre 5 codons de diffE- rence entre les deux produits [16, 17]. A partir du gEne c-.mil clone nous avons construit un virus exprimant la portion carboxyterminale de ce g/me (contenant le domaine kinase); ce virus possEde la mEme activit6 mitogEne que son Equi- valent viral, suggErant que les mutations prEsen- tes dans cette portion de v-mil ne sont pas requi- ses pour son activit6 mitogEne.

MatEriel et mEthodes

Cellules, transfection et virus Les fibroblastes embryonnaires de caille (FEC), obtenus h partir d'embryons de 10 jours, sont cultivEs et transfect6s selon les conditions dEcrites dans la rEfErence [15]. Les cellules de neurorEtine de poule (NRP) sont obtenues h partir de la dissociation de neurorEtines d'embryons de poulet de 7 jours et sont cultivEes, transfect6es ou infectEes selon les condi- tions dEcrites dans ies rEfErences [9, 18].

L'obtention des virus MH2-PA200 et MH2-PA 201 est dEcrite dans la rEfErence [19]. L'obtention des virus MH2-C125 et MH2-C! 16 est dEcrite dans la rEfE- rence [9].

Construction des virus mutants Les diffErents virus mutants ont EtE construits ~ par- tir du provirus MH2 clone [15]. La construction des mutants MH2OB et PvS est dEcrite respectivement dans ies rEfErences [9, 18]. Les mutants BgX, GRL, XSK, HSK,RsH et HPv ont Et6 construits par dElE- tion partielle des genes gag et v-mil de fa~2on/l respec- ter le cadre de lecture correct de la protEine P100gag" mil (Coil et al. en preparation). Le mutant SGRL a EtE construit en substituant les sequences c-mil du virus LTRAc-rnil, dont la construction est dEtailiEe dans la rEfErence [18], par les sequences virales homologues (fragment v-rnil/myc StuI-SalI de 1.4 Kbp). La Fig. 1 donne un rEsum6 des diffErentes constructions.

Analyse des A R N et des protdines, courbes de croissance Les ARN extraits des FEC et des NRP transfectEs ou infectEs par MH2, MH2-PA200, MH2-C125 et C!16 sont analyses selon la technique de Northern blot dEcrite dans la r6fErence [19] et hybridEs avec les sondes LTR, v-mil, myc5', myc3' et env3' dont la description et la preparation ont 6t6 dEtaillEes prEcE- demment [19].

L'analyse des protEines synthEtisEes par les cellu- les transfect6es ou infectEes par les divers mutants s'effectue aprEs marquage mEtabolique des cellules

la mEthionine 3sS, immunoprEcipitation des lysats

Coopdration d'oncog~nes 887

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Fig. 1. Construction des virus mutants. (A): cartographie des d616tions correspondant aux diff6rents mutants sur la carte du provirus sauvage clon6 pMH2-Hd. Pot~r le mutant BalSp ia sSquence autour du site de d616tion est pr6sent6e comparativement

ceile du virus sauvage: ies quatre acides amin6s d616t6s et le nouveau r6sidu cr66 par ia recombinaison sont entour6s. (B): construction des recombinants LTRdc-mii, LTR c-mii et SGRL. [-]: exons non transduits par MH2; | : exons homologues h v-rail; -- : introns; SD: Site donneur d'6pissure; SA: site accepteur d'6pissure; ies r6gions hachur6es et en pointill6s repr6sentent les s6quences non codantes; les sites enzymatiques utilis6s pour ia construction des recombinants sont entour6s. Les abrSviations pour les sites enzymatiques sont les suivantes: B, BamHl; Bg, Bglll; St, StuI; Xh, XholI; Sp, Sphl; Rs, Rsal; H, Hpal; Pv, Pvul; Si, Sail; X, Xbal; E, EcoRl; Ss, Sstl.

et 6!ectrophor6se sur gel de polyacrylamide selon ia technique pr6c6demment d6crite [9].

Les courbes de croissance des NRP transfect6es ou infect6es par ies diff6rents mutants sont 6tablies selon le protocole suivant: apr6s 4 passages de cha- que culture, les cellules sont cuitiv6es h faible densit6 (105 par boite de 35 mm) puis num6r6es chaque jour I91. Clonage moldculaire des virus MH2-PA200, MH2-PA201 et MH2-Ci25 et sdquence des sites de recombinaison Les clones mol6culaires des diff6rents virus sont isol6s de banques d 'ADN construites ~ partir de cellules contenant les diff6rents provirus int6gr6s [19, 20]. Les banques sont construites en ins6rant les ADNs issus de ces cellules et partiellement dig6- r6s soit par i'enzyme EcoRl (MH2-PA200 et MH2- Ci25) soit par i'enzyme SAU3A (MH2-PA201) dans ies vecteurs Charon 4A et EMBL4 respective- ment. Ces banques.sont ensuite cribl6es soit avec les sondes v-mil et env (MH2-PA200 et MH2- PA201), soit avec les sondes LTR, gag et myc (MH2-C!25).

Les fragments de jonction myc-env des clones MH2-PA200 et MH2-PA201 et gag-myc du clone MH2-CI25 ainsi que le fragment contenant la d616-

tion dans le mutant BalSp sont pr6par6s par 61ec- trophor6se en gel d'agarose 119, 20"] et s6quenc6g par la technique de Maxam et Gilbert [21].

R6sultats

A partir du provirus MH2 clon6 [15], trois types de mutants ont 6t6 construits in vitro, en d616tant des s6quences d6finies de ce provirus: un mutant rail- myc ÷, un mutant mil ÷ myc- , ainsi que des mutants contenant des u~,,,,,,,J,,o~'~t'c+;""~ p , rt.iplit~g....~..__ d a n s diff6rentes r6gions de la P100gag -rail (Fig. 1A). La taiile des prot6ines synth6tis6es par ces mutants a 6t6 contr616e par transfection de ces mutants sur des cultures de NRP ou de fibroblastes embryonnaires de caille (FEC) et correspond la taille at tendue (Fig. 2). L'activit6 biologique des mutants a 6t6 6tudi6e par transfection ou infection sur les NRP.

Etude des mutants m i i - myc ÷

Le mutant mil- myc ÷ (MH2OB) est d6pourvu d'activit6 mitog6ne. En effet, la courbe de crois-

888 C. Dozier et al.

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virus MH2-C125 et C116 ont perdu ia totalitE du g~ne v-mil (Fig. 5A). Le clonage molEculaire du virus MH2-C125 montre que ce dernier corres- pond en fa r h la propagation de I 'ARN sous gEnomique du virus MH2. La sequence nuclEoti- dique du point de jonction entre Agag et v-myc confirme la reunion des deux sequences par un mEcanisme d'Epissage (Fig. 6). Ainsi, ce n'est pas un mutant ~ proprement parler, mais un nouveau type de virus; les virus de ce type reprE- sentent environ 10% d'un stock normal de MH2.

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N Fig. 2. Analyse des protEines synthEtisEes dans les FEC (A) et dans les NRP (B) transfectEes par les diffErents mutants. Les cellules sont marquees m_e'tabo!,.'quement ~. !a mEthio- nine S -~-s, lysEes et immunoprEcipitEes avec un serum anti v- rail (canaux i) ou avec un serum anti v-rail adsorb6 (canaux a ) .

sance rEalisEe sur les NRP infectEs par ce mutant est comparable ~ cclle des ccllulcs non infect(~es (Fig. 3A). L'effet du gEne myc est cependant perceptible sous forme de foyers de cellules visi- bles apr~s coloration des bores de culture (Fig. 4A), et les protEines codEes par ce virus non mitogEne peuvent ~tre mises en Evidence dans ces cultures.

Ces rEsultats sont confirmEs par l'analyse de deux mutants spontanEs du virus MH2 (isolats biologiques) clones par G. Calothy et son 6quipe [9]. Ces deux virus mutants (MH2-Ci25 et MH2- Cll6) ont perdu la capacitE d'induire ia prolifE- ration des NRP mais possEdent toujours ia capa- cite de transformer les FEC. L'analyse des ARN viraux contenus dans les cellules infectEes par I'un ou i'autre de ces mutants suggEre que les

E t u d e des m u t a n t s rail ÷ m y c -

Le deuxiEme type de mutants construit, mil ÷ m y c - (PvS) induit la proliferation des NRP (Fig. 3B). Ainsi, le gEne v-rail seul est responsable de l'activit6 mitogEne du virus MH2.

Ce rEsultat est confirm6 par l'anaiyse d'isolats biologiques du virus MH2, isolEs sur NRP par G. Calothy, incapables de transformer ies fibroblas- tes mais ayant conserve leur pouvoir mitogEne sur neurorEtines [9]. L'analyse des AR N viraux contenus dans les NRP infectEes par i'isolat MH2-PA200 suggEre que ce virus d'une taille de 5,6 kb a perdu une partie du gEne v-myc (Fig. 5B). Le clonage molEculaire de cet isolat et la caractErisation de son g6nome (Fig. 6) nous rEvElent que ce virus est le fruit d 'une recombi- naison entre les virus RAVI (virus 'helper') et MH2 (Fig. 7). En effet, les LTR et les sequences nuclEotidiques dErivEes du gEne gag et du gEne env proviennent du virus RAV1. Afin de prEci- ser h quei endroit du gEnome la recombinaison avait eu lieu, nous avons utilisE comme sondes des fractions du g~ne v-myc. Les rEsultats obte-

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Fig. 3. Courbes de croissance des NRP infectEes ou transfec- tees par ies constructions contenant un gEne v-myc fonction- nel (A) ou un gEne v-myc non-fonctionnel (B).

Cooperation d'oncog@nes 889

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Fig. 4. (A): morphologie des cultures ~ diff6rents grossissements de NRP non in[ect~es (NRP) ou infect6es avec le virus sauvage MH2-Hd (NRP MH2 RAV-1) ou par les mutants non mitog/mes OB (NRP OB RAV-1), XSK (NRP XSK RAV-I) et BaISp (NRP BalSp RAV- l). (B): analyse des prot6ines synth6tis6es dans les NRP infect6es par les mutants XSK et BaiSp. Les cellules marquees sont lys6es et immunopr6cipit6es avec des s6rums anti gag (canaux 1), anti v-rail (canaux 2) et anti v-myc (canaux 3).

nus nous montrent que le virus MH2-PA200 contient l'extr6mit6 5' du g6ne v-myc et notam- ment !e signal accepteur d'dpissage, ce qui per- met aux cellules infect6es de produire un ARN sous-g6nomique contenant cette portion du g~ne v-myc ainsi que la partie 3' du g6ne env (Fig. 5B).

L'~solement ais6 de ce recombinant sugg~re rexistence d'un facteur favorisant soit la recom-

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Fig. 5. (A): analyse des ARN extraits des FEC infect6s Far le virus MH2 ou par les virus MH2-CII6 et MH2-Cl25 avec une sonde v-myc. (B): analyse des ARN extraits des NRP infect6es par le virus MH2 ou par le virus MH2-PA200. Les sondes utilis6es sont indiqu6es au-dessus de chaque canal.

binaison, soit la s61ection de ce type de virus. Afin d'61iminer la possibilit6 que des virus de type MH2-PA200 pr6-existent dans les stocks de vires, nous ;avons 6tudi6 ies virus produits par une culture de neuror6tines fraichement infect6e par le virus MH2 clone mol6culairement, MH2-Hd. L'analyse des ARN de ces ceilules, trois semaines

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Fig. 6. Carte enzymatique du clone MH2-C!25 et s~quence de la jonction gag-myc compar6e aux s6quences gag du RSV au voisinage du site donneur d'6pissure et v-myc de MH2 au voisinage du site accepteur d'6pissure. Les abr6viations uti- lis6es pour les sites enzymatiques sont: Ss, Sstl; Sin, Smal; Sp, Sphl; H, Hpal; P, Pvull; Sl, Sail. SD: site donneur d'6pissure; SA: site accepteur d'6pissure.

890 C. Dozier et al.

apr6s leur infection, nous montre l'apparition d'un nouveau virus d'une taiUe de 6kb contenant des s6quences v-rail et env (Fig. 5B, canal MH2 env 3'). Ces r6sultats indiquaient qu'une recom- binaison avait eu lieu entre le virus MH2 clon6 mol6culairement et le virus RAVI et que le virus r6sultant (appel6 MH2-PA201) 6tait rapidement devenu majoritaire dans la culture de neuror6ti- nes prolif6rantes.

Le provirus MH2-PA201 ayant 6t6 clon6, la s6quence nucl6otidique des points de jonction v- myc-env des provirus MH2-PA200 et MH2- PA201 a permis de localiser plus pr6cis6ment le site de recombinaison qui se r6v61e diff6rent clans les deux provirus (Fig. 7). Alors que MH2- PA200 a recombin6 dans le g6ne v-myc i~ 90 nucl6otides en 3' du signal accepteur d'6pissure, MH2-PA201 a recombin6 dans le g6ne v-myc 50 nucl6otides en amont du site de recombinaison du virus MH2-PA200. MH2-PA201 contient 470 nucl6otides suppl6mentaires "du g6ne env par rapport ~ MH2-PA200. Les homologies de s6quence d6tect6es entre les g6nes v-myc de MH2 et env de RSV aux deux sites de recombi- naison (11 nucl6otides identiques entre v-myc et env pour le virus PA-200 et 9 pour 1¢ virus PA- 201) sugg6rent que les virus MH2-PA200 et MH2-PA201 se sont form6s a la suite d'une recombinaison homologue (Fig. 7).

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Fig, 7. Cartes enzymatiques des clones MH2-PA200 et MH2-PA201 et s6quences des jonctions myc-env compar6es aux s6quences v-myc de MH2 et env de RSV. Les abr6via- tions utilis6es pour ies sites enzymatiques sont: E, EcoRI; Sin, Smal; Sp, Sphl; H, Hpal; P, Pvull; SI, Sail; X, Xbal; Hd, Hindlll. SD: site donneur d'6pissure; SA: site accep- teur d'6pissure. Les nucl6otides communs aux g6nes v-myc et env autour du site de recombinaison sont encadr6s.

La culture analys6e n'a montr6 la pr6sence que d'un seul recombinant, ce qui sugg/~re que cet ,~v6nement est rare mais que la croissance des neuror6tines repr6sente un crible positif pour le mettre en 6vidence.

Localisation du domaine de la PlOOgag "mii essentiel p o u r la prolif6ration des cellules de neuror6tme

Le troisi~me type de mutants a 6t6 construit dans le but de caract6riser les r6gions de la P100gag -mit importantes pour l'activit6 mitog~ne. Ces mutants sont regroup6s en quatre cat6gories:

1) un virus amput6 dans les s6quences gag et dans les s6quences 5' de v-mil, hors du domaine kinase (SGRL, Fig. 1B);

2) un virus amput6 dans les s6quences 5' de v-rail, hors du domaine kinase (GRL);

3) des virus amput6s dans le domaine kinase (BgX, XSK, BalSp, HSK, RsH);

4) un virus amput6 en 3' du domaine kinase (HPv).

Les r~sultats obtenus sont repr6sent~s dans la Fig. 3. Le mutant SGRL poss~de une activit~ mitog~ne inf6rieure ~ l'activ,.'t~ du virus sauvage, mais cependant significative, (Fig. 3B). Le mutant GRL qui contient les mc3mes s6quences v-rail que le virus SGRL mais dans lequel les s6quences gag ont 6t6 rajout6es, poss~de une activit6 mitog/me identique au virus sauvage ~," '~" " ~ / "

Comme illustr6 dans la Fig. 3A pour XSK et BalSp, tousles mutants d616t6s dans le domaine kinase sont d6pourvus d'activit6 mitog/~ne. Le mutant BalSp est particuli~rement int6ressant dans la mesure oil ,ce virus poss~de une tr~s petite d616tion an niveau du site Sphl (Fig. 1A). Cette mutation supprime quatre acides amin6s (tyrosine, leucine, histidine, alanine) qui sont remplac6s par une s6rine. La prot6ine cod6e par ce vxrus, indistincte par son poids mol6culaire de la prot6ine sauvage, a pu 6tre mise en 6vidence dans les NRP infect6es et d6pourvues d'activit6 prolif6ratrice (Fig. 4B). Ces mutants sont d6pourvus de pouvoir mitog/~ne en pr6sence ou en absence du g~ne v-myc, ce qui montre que ce dernier ne peut restaurer l'activit6 de ia prot6ine cod6e par le g~ne v-rail modifi6. De plus, la mor- phologie des NRP infect6es par ces mutants en pr6sence du g~ne v-myc ne diff~re pas de celle de NRP infect6es par le mutant rail- myc + MH2- OB (Fig. 4A).

Le mutant HPv, dd16t6 dans la portion 3' du g~ne v-rail hors du domaine kinase, a conserv6

Coopdration d'oncogdnes 891

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Fig. 8. Sch6ma r6capitulatif des mutants d616t6s dans diff6- rentes r6gions de ia Pl00gag "milet de ieurs activit6s transfor- mantes sur FEC et mitog6nes sur NRP. Pour chaque cons- truction, une carte sch6matique de la d616tion ainsi que de la prot6ine synth6tis6e est pr6sent6e. Les prot6ines de 100Kd signal6es par oe t * sont en fait de taille 16g6rement inf6rieure/1 celle de la P100gag "rail. La r6gion quadrill6e cor- respond aux s6quences c-rail introniques. Les s6quences v- myc ne sont pas repr6sent6es ~t l'6cheUe. Les g6nes v-rayc non-fonctionnels sont hachur6s. Les abr6viations utilis6es sont d6crites dans les figures pr6c~dentes. + + indique un pouvoir mitog~ne 6gal h celui de la P100gag'mil; + indique un pouvoir mitog6ne 50% inf6rieur; - une croissance sembla- hie h celle de la cellule contr61e.

son pouvoir mitog6ne complet (Fig. 3B). Une r6capitulation de la structure de ces

mutants et de ieurs effets sur NRP et FEC est pr6sentEe dans la Fig. 8.

Etude de l'activitd biologique du gdne c-mil

Afin d'aborder le m6canisme d'activation du g6ne c-mii par le virus MH2, nous avons entre- pris d'analyser l'activit6 mitog6ne de virus conte- nant tout ou partie du g6ne c-rail aviaire. Deux r6trovirus ont 6t6 construits (Fig. 1B): le virus LTR Ac-mil contenant la partie carboxytermi- nale du g6ne c-rail (dont le domaine kinase) et comparable au virus SGRL (aux mutations pr6s), ainsi que le virus LTR c-rail exprimant tout le g6ne c-rail introduit dans ce virus par l'interm6diaire d'un cADN de ce g6ne [22].

Apr6s transfection sur NRP, les r6sultats obte- nus nous montrent que le virus LTR zac-mil est capable d'induire une prolif6ration significative de ces cellules, semblable/l celle induite par le mutant S G R L (Fig. 3). Une prot6ine de 35 Kd (poids mol6culaire attendu) est eK,:ctivement raise en 6vidence darts ces cellules (Fig. 2B). Aucune prolif6ration n'a pu 6tre obtenue avec le virus contenant la totalit6 du g6ne c-rail, mais ces r6sultats sont encore pr61iminaires.

D i s c u s s i o n

Nous avons montr6 dans ce travail que la trans- formation des NRP par le virus MH2 requiert la coop6ration des deux oncog6nes de ce virus, v- rail et v-myc. Le g6ne v-mil permet la prolif6ra- tion de ces cellules normalement quiescentes dans nos conditions de culture, le g6ne v-myc transforme les cellules qui prolif6rent. L'effet du g6ne v-myc seul sur ces cultures n'est pas nul dans la mesure of] des foyers de cellules "6pith6- liales" apparaissent, apr6s infection par le virus MC29 ou apr~s infection par des virus MH2 amput6s du g6ne v-rail. Cependant, ces cellules plac6es en basse densit6 sont incapables de pro- lif6rer. I1 semblerait que ces cellules exigent dans ces conditions la pr6sence de facteurs de croissance qui font d6faut. Dans la bore de culture, la pr6sence des foyers de cellules mon- tre qu'une densit6 cellulaire 61ev6e peut permet- ire une certaine prolif6ration, sugg6rant que des contacts intercellulaires sont importants pour la croissance de celles-ci.

Les NRP infect6es par le virus MC29 peuvent prolif6rer dans un milieu de culture riche [23]. Cela sugg6re que le produit de l'oncog6ne v-mil peut: (i) soit induire les neuror6tines infect6es par v-myc ~ s6cr6ter leur propre facteur de crois- sance comme cela a pu 6tre montr6 dans le sys-

Ik.;l~ll U l l w o t6me h6matopoi6tique. En effet, des - - ' """° my61oides infect6es par un r6trovirus portant i'oncog6ne v-myc sont transform6es mais n6ces- sitent pour prolif6rer durablement la pr6sence d'un facteur de croissance, le cMGF. Le produit de l'oncog6ne v-rail rend ces cellules ind6pen- dantes du cMGF en leur faisant secr6ter ce fac- teur qu'elles utiliseront d'une fa(;on autocrine [24]; (ii) soit relever ces cellules de leur d6pen- dance vis-a-vis de ce facteur, en mimant son effet biochimique. Le m6canisme propos6 dans ce deuxi6me point a 6galement pu 6tre montr6 darts le syst6me h6matopoi'6tique lors de la sur-infec- tion, par le virus A-MuLV portant roncog6ne v-

892 C. Dozier et al.

abl, des cellules 6rythroi'des transformdes par v- ras et dEpendantes de l'Erythropoi'Etine pour leur croissance. Ces ceilules deviennent indE- pendantes de cette hormone mais sans la pro- duire [25]; (iii) soit induire la prolif6ration et la diff6renciation d'un type cellulaire peu exigeant en facteurs de croissance. La neurorEtine d'embryon de poule de 7 jours mise en culture contient des cellules gliales, neuronales et des pr6curseurs de celles-ci [26, 27]. I1 est possible que le produit de l'oncog/~ne v-rail ou v-myc ne touche pas le m6me type cellulaire comme cela est le cas pour les cellules de neurorEtine de caille oil le produit de ces deux oncog6nes induit la proliferation de cellules gliales et neuronales, mais celles-ci ne sont pas prEsentes dans les m6mes proportions (P. Amouyei, en pr6para- tion). Pour rEpondre formellement h la question posde, une definition plus precise des cellules infectEes et la connaissance de ieurs exigences en facteurs de croissance est nEcessaire.

Nous ne savons pas actuellement si l'un ou rautre de ces mEcanismes est applicable aux cel- iules de neurorEtine.

La cooperation entre les oncog/mes v-mil et v- myc dans les NRP ne peut 6tre mise en Evidence que dans les premi/~res semaines de culture. En effet, la culture de NRP infectEe par un virus MH2 clone contient tr/~s rapidement (apr~s 3 semaines de culture) un virus recombinant ayant perdu l'oncog/me v-myc (voir Fig. 5B). Ce type de virus, r6sultant d'une recombinaison entre le virus MH2 et son virus helper RAVI, est facile- ment isolable dans la culture oil il devient rapi- dement prEpondErant. Ces rEsultats indiquent que l'oncog~ne v-myc est contre-selectionnE par ce type de culture (nous n'avons jamais observe ce type de recombinaison sur des cultures de fibroblastes de poule). I1 est peu probable que le mEcanisme de la recombinaison soit favorisE dans ce type cellulaire, par contre, la prolif6ra- tion du virus MH2-PA200 ayant perdu v-myc semble favorisEe dans ces cultures. Deux raisons peuvent expliquer cette proliferation privil6- giEe: le virus recombinant se propage mieux que MH2, ou les cellules infectEes par le mutant ont un avantage s61ectif par rapport aux cellules infectEes par le virus de depart. I! semble en fait que ces deux 616ments se conjuguent pour assu- rer la suprEmatie du virus de type MH2'PA200 dans la culture. Le titre du virus recombinant est 103 lois plus Elev6 que celui du virus MH2 [19]; d'autre part, ies cellules transformdes par MH2 ont tendance h quitter le tapis cellulaire et sont perdues avec le renouvellement du milieu de

culture. Enfin, la sur-infection par le virus MC29 (ne contenant que i 'oncog6ne v-myc) de cellules prolif6rant sous l 'action du virus MH2-PA200, induit une tr6s importante mortalit6 cellulaire sugg6rant un effet toxique sur ces cellules.

La cr6ation d 'un certain nombre de mutants dans la sdquence codant pour la Pl00gag "mil de MH2 (dont le produit de fusion poss~de in vitro une activit6 s6r ine/ thrEonine kinase) nous a permis de montrer que l'intEgritE du domaine kinase de ce g~ne est requise pour la conserva- tion de l'activitE biologique sur les cellules de neurorEtine. Un rEsumE de ces rEsultats et des donndes discutEes ci-apr~s est reportE dans la Fig. 9. Ces rEsultats sont renforcds par l 'obten- tion par F. Denhez, d 'un mutant construit par mutation dirigEe sur le site fixateur de I 'ATP (la iysine 622 est remplacEe par une mEthionine). Ce mutant qui code pour une P100gag -mil ayant perdu la capacitE de s 'auto-phosphoryler sur les rEsidus sErines/thrEonines, n'est plus capable d'induire la proliferation des NRP [28]. Cepen- dant, une faible activitE kinase semble ~tre suf- fisante pour la conservation de l'activitE biologi- que sur neurorEtines, puisque le clone molEcu- laire de MH2 (pMH2-Hd) permet d 'obtenir un virus biologiquement actif bien qhe la P100gag -m" codde par ce virus poss/~de in vitro une activitE kinase tr6s rEduite, due h une mutation ponc- tuelle dans le g~ne v-mil (l 'asparagine 720 est remplacEe dans ce virus par une sErine) (Denhez P t I l l ~ n n r ~ n a r a t i n n ~ t ' ~ t , a , r , ,~ , , * . ' , * ; . " - , . " . . . . . . . . i - . . v l . . . . . . . . . . l" ,~..,vl.t~,., i l l u I . a l L I U I I mtervient

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Fig. 9. Localisation des s6quences v-mil essentielles pour I'activit6 mitog6ne de la P10Ogag "rail sur les NRP. La num6ro- ration se r6f/~re aux acides amines significatifs ou jouxtant les d616tions. Les acides amin6s sont numdrot6s selon leur position au sein de la P10Ogag "rail. La zone hachur6e corres- pond au domaine kinase d6fini par homologie de s6quence avec les protdines poss6dant une activit6 kinase. Les homo- logies, repr6sent6es par les barres verticales, sont d6finies .selon les r6gles de conservation suivantes: G=A=V=L=I; E=D; K=R; Q=N; Y=T=S; Y=F. K correspond h la iysine 622 impliqu6e dans la fixation de rATP. N--, S corres- pond ~ une mutation ponctuelle trouv6e darts ie clone MH2- Hd (asparagine 720 remplac6e par une s6rine) et responsa- ble de ractivit6 kinase r6duite de la prot6ine in vitro.

Coopdration d' oncogdnes 893

dans une region essentielle pour 1' activit6 du gEne v-mil puisque le mutant BalSp (rEalisE h partir du clone pMH2-Hd) est dEl6t6 dans cette zone (les acides amines 705 h 708 sont remplacEs par une sErine) et a perdu toute activit6 mito- gEne sur les NRP. I1 est impossible pour des rai- sons techniques de determiner si ce mutant pos- sEde une activitE kinase rEsiduelle infErieure ou Egale :~ celle du virus MH2 dErivE du clone pMH2-Hd, mais cela pourrait expliquer la perte d'activitE biologique de ce virus. Une autre pos- sibilit6 serait l'implication de cette region dans la reconnaissance de son substrat par la P100gag -rail.

Ainsi que cela a pu 6tre montrE dans d'autres systEmes biologiques pour les oncogEnesfps [29] abl [30] et fms [31], les acides amines codes par les rEsidus du gEne gag ne sont pas essentiels dans l'activitE mitogEne de la protEine de fusion P100gag "rail. Cependant, l'activitE mitogEne obte- nue pour le virus SGRL est infErieure ~ celle obtenue pour le virus GRL, lequel ne diffEre du premier que par le contenu en sequences gag. Sans ~,tre essentieUes, ces sequences intervien- draient dans l'activitE mitogEne de la protEine gag-rail. Un r61e des sequences gag a notamment pu 6tre mis en Evidence dans l'activation du gEne c-fps [32] ainsi que dans le pouvoir leucEmogEne de la protEine gag-abl [33]. L'activit6 du virus SGRL est identique ~ celle du virus LTR Ac-mil. Ce rEsultat montre que les mutations accumu- lees dans la portion carboxyterminale du gEne v- rail ne sont pas requises pour son activitE mito- gEne, contrairement ~ ce que l'on peut observer pour d'autres oncogEnes [34, 35]. Ainsi, il sem- blerait que le mEcanisme d'activation du gEne c- rail nEcessite une amputation de son extrEmitE aminoterminale, plut6t que raccumulation de mutations ponctuelles. Plusieurs observations sont en faveur de cette hypothEse: l'Equivalent murin du gEne v-mil, le gEne v-raf, porte par le virus MSV3611 est encore plus court en 5' que le gEne v-mil [36]; l'activation du gEne c-rafpar LTR activation dans les cellules NIH3T3 aboutit ~t l'expression de la portion carboxyterminale de ce gEne [37]; l'oncogEne active trouvE par trans- fection de rADN d'un cancer de l'estomac sur lescellules indicatrices NIH3T3 correspond 6ga- lement ~ la portion carboxyterminale du gEne c- raf humain [38]; enfin, des rEsultats prEliminai- res suggErent que l'introduction dans les cellules de neurorEtine de la totalitE de la sequence codante de c-rail sous le contr61e d'un promo- teur rEtroviral est sans effet sur la proliferation de ces cel-lules. La portion aminoterminale de ce gEne pourrait exercer un r61e rEgulateur nEga-

tif sur la fonction de son produit, sur le choix du substrat ou sur la localisation de la protEine c-mil dans la cellule.

En conclusion, il semble que l'activit6 kinase de la protEine codEe par le g/me v-rail est essen- tielle pour permettre aux cellules de neurorEtine de prolifErer, cette activit6 permettant ensuite ces cellules d'Etre transformEes par le produit de l'oncogEne v-myc. Comment se fait cette coopE- ration? II est possible que comme pour les cel- iules myElomonocytiques du systEme hEmato- poi6tique [24], cette cooperation s'effectue par i'intermEdiaire de facteurs de croissance secrEtEs par ces cellules. I1 est Egalement possible que d'autres produRs d'oncogEnes puis~ent coopErer avec v-myc dans la transformation de ces ceilu- les. Ces rEsultats montrent que la neurorEtine est un puissant systEme pour Etudier les mEcanis- mes de la transformation cellulaire.

Remerciements

Ce travail a 6t6 effectu6 gr~ice /~ l'aide financiEre apportEe par l'lnstitut National de ia Sant6 et de la Recherche MEdicale, le Centre National de la Recherche Scientifique, l'Association pour la Recherche contre le Cancer et l'Institut Pasteur de Lille. C. Dozier est boursiEre de i'Association pour la Recherche contre ie Cancer et S. Ravit boursi/:re du Centre National de la Recherche Scientifique.

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