Principes des vecteurs non réplicatifs Virus défectifs Un ou plusieurs gènes essentiels à la...

Principes des vecteurs non réplicatifs

Virus défectifs

Un ou plusieurs gènes essentiels à la réplication sont délétés afin de

rendre les virus incompétents pour toute réplication dans l’hôte.

« Packaging cell line »

Une lignée cellulaire exprimant les gènes essentiels délétés dans le

vecteur est construite afin de produire les vecteurs viraux.

Séquences essentielles aux vecteurs

Séquence : séquence d ’encapsidation du vecteur recombinant

Séquence poly A : séquence permettant la stabilisation des ARNm

Séquences promotrices : Promoteur adapté en amont du TG

Transgène

Réplication des rétrovirus

pol envgag

LTR LTR

NoyauNoyau

CytoplasmeCytoplasme

Fixation et entrée

Bourgeonnement

Décapsidation

Rétrotranscription

IntégrationTransport au noyau

Vecteurs rétroviraux

Particularités des rétrovirus

Virus enveloppés pseudotype HIV/VSV env (ou autre protéines

d ’enveloppe)

Leur génome est un ARN + de taille réduite (10kb) limitation de la

taille des inserts

Ils intègrent leur matériel génétique de manière aléatoire risque

de transformation

Ils infectent largement les cellules mammifères

Les lentivirus infectent les cellules quiescentes

Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (1)


LTR LTRTransgène

Vecteurs lentiviraux (HIV)

Vecteurs rétroviraux commerciaux

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Avantages et limitations des vecteurs rétroviraux et lentiviraux

AvantagesTropisme : large choix de protéines d ’enveloppe Pas de réplication autonome et production minimum de protéines virales chez l’hôte Réponse immunitaire très limitée Intégration aléatoire et persistance du DNA rétrotranscrit (sauf méthylation des promoteurs)Survie des cellules infectéesGrand choix de promoteurs possiblesRisque de recombinaison limité par le fractionnement des constructionsLes vecteurs lentiviraux transduisent des cellules quiescentes

InconvénientsProduction difficile de hauts titres infectieuxIntégration aléatoire, risque pathogèneInsert de petite taille (max 10 kb) « Packaging cell lines » : constructions complexes exprimant gag, pol et envLes vecteurs rétroviraux classiques ne transduisent pas les cellules quiescentes

Vecteurs alphaviraux (SFV)

Virus à ARN+ simple brin

Matériel génétique de petite taille (10kb)

Virus enveloppés

Entrée dans la cellule, via des récepteurs spécifiques

Ils infectent tous les systèmes eucaryotes dont les cellules mammifères


sont requis pour visionner cette image.Réplicases

Protéines de structure

Cycle des alphaviraux

(SFV)



Vecteurs alphaviraux (SFV)

T7

3.Co-transfection

2. Clonage des protéines de structures et

mutagénèse du site de clivage de la protéine

d’enveloppe par un site sensible à la

chymotrypsine

4.Traitement à la

chymotrypsine

1.Transcription in vitro (T7 polymérase)

ARNm

Avantages et limitations des vecteurs alphaviraux

AvantagesFacilité de constructions et d’études de nombreux mutantsTropisme : infecte tous les types cellulaires eucaryotes Choix possible des protéines d’enveloppe (mutagénèse du site de clivage/sécurité) Pas de réplication autonome Survie des cellules infectéesChoix de promoteurs possiblesIdéale pour la vaccination

InconvénientsDifficulté de production des ARNm en grande quantité industrielleProduction difficile de hauts titres infectieuxPas d ’intégration, expression transitoireInsert de petite taille (max 10 kb) « Packaging cells lines » : exprimant les protéines de structureProduction des réplicases virales chez l’hôte

Non déterminéRéponse immunitaire ? Infection des cellules quiescentes?

Vecteurs adénoviraux (Ad2, Ad5)



Virus non enveloppés génome ADN 2 brins linéaires 36kb infectent les cellules quiecentes tropisme large (récepteur aux intégrines v5 et v3 ) niveau d’expression élevée

Infection par les adénovirus



Cycle viral des adénovirus

Organisation génétique des adénovirus

E1A : transactivation et entrée en phase S

E1B : fonction anti-apoptotique

E2 : réplication du DNA

E3 : contrecarre les défenses innées

E4 : régule le processing et l’export des ARNm tardifs

IVa2 : transactivation du promoteur tardif



Première génération de vecteurs adénoviraux

Formation de virus recombinants

Particularité des protéines E1 et E3 : •E1 transactive l ’expression des gènes viraux et transforme les cellules•E3 une protéine non essentielle qui contrecarre les défenses de l’hôte anti-adénovirus la délétion de E1 et E3 libère 7kb pour insérer un transgène

Transfection

Recombinaison homologue

Noyau

MCS

Transgène

Cellules 293(expriment E1)Adénovirus

recombinant

ITRPoly A

Promoteur

Séquences de recombinaison homologue

(E2)ITR

Génome viral 3’

Vecteurs adénoviraux commerciaux









Deuxième génération de vecteurs adénoviraux

Avantages et limitations des vecteurs adénoviraux

AvantagesTropisme pour des récepteurs largement exprimés (sauf lignées lymphoïdes) Pas de réplication autonome et production minimum de protéines virales chez l’hôte Survie des cellules infectéesChoix de promoteurs, niveau d ’expression élevéProduction de hauts titres infectieuxVecteur transduisant des cellules quiescentes« Packaging cell lines » : les cellules 293 expriment les protéines E1

InconvénientsPas de choix possible des récepteursLa réponse immunitaire reste un obstacle majeur (80% de la population est séropositive)L ’ADN ne s ’intègre pas (épisome) persistance limitée dans le temps du DNA (2 semaines)Insert de petite taille (max 7 kb) Risque de recombinaison théorique avec des infections endogènes

Vecteurs adéno-associés

Utilisation principale : expression de protéines en cellules mammifères à des fins de thérapie génique (cellules quiescentes)

Cycle réplicatifVirus nusADN simple-brin linéaire (5 kb)Leur cycle réplicatif implique :

L ’entrée dans la cellule par endocytose, via les héparines sulfates et récepteurs secondaires (v5, FGF) (large spectre de cellules infectées)Adressage de l ’ADN au noyauTranscription en ADN double-brin (nécessite un virus helper du type adéno (E4), herpes)Intégration dans le chromosome 19Expression des ARNm (facilitée par les virus helper )La production de particules virales (très résistantes : pH, température, détergents)

Ils infectent la plupart des cellules mammifères

Formation de virus recombinants

Particularité des vecteurs adéno-associés : •Tous les gènes viraux sont délétés•Les « packaging cell lines » sont complémentés pour les protéines virales et helper

Transfection

Noyau

MCS

Transgène

Cellules 293(expriment E1)Virus adéno-associé

recombinant

ITR

Promoteur

Gènes rep

Gènes cap

ITR

Poly APlasmide E2 et E4

adénovirus

Avantages et limitations des vecteurs adéno-associés

AvantagesTropisme pour un récepteur largement expriméPas de réplication autonome et absence de production de protéines virales par

l’hôte Survie des cellules infectéesProduction de hauts titres infectieuxL ’ADN s ’intègre dans le chromosome 19 persistance de l ’expression

intégration aléatoire limitée Réponse immunitaire très faible Les vecteurs transduisent des cellules quiescentes

InconvénientsPas de choix possible des récepteursInsert de petite taille (max 4 kb) « Packaging cell lines » : expriment rep, cap (adéno-associées) E1, E3 et E4

(adénovirus)

Stratégies d’utilisation des alphavirus

réplicases Pro Transgène

3’5’

Poly A

Transcription in vitro (SP6 ou T7 polymérase)

ARNm

Packaging cell lineexprimant les

protéines de structures Noyau

SFVrecombinant

Transfection

*

* Possibilité de transfecter l’ADN sous le contrôle d ’un promoteur eucaryote

SP6ouT7

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