PREMIERES DONNEES SUR LE CYCLE VIRAL DE L’ADENOVIRUS CELO CHEZ SON HOTE : LE POULET

Le Goff Frédérick, Langlois Patrick

Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments, Zoopôle, les Croix BP53, 22440 Ploufragan

Résumé Les principaux organes infectés in vivo par l’adénovirus aviaire CELO ont été déterminés par PCR et RT-PCR. Trois sites de multiplication ont été identifiés : la trachée, les cæca et la bourse de Fabricius. L’utilisation de deux virus recombinants possédant les gènes rapporteurs de la luciférase et de la SEAP (Secreted Alcaline Phosphatase) ont permis de confirmer ces résultats et de montrer la clearance du virus. Des infections in vitro par un virus recombinant produisant la GFP (Green Fluorescent Protein) sur des isolements de populations lymphoblastiques à partir d’amygdales cæcales et du sang total ont montré qu’un type cellulaire était infectable. Les cellules, dont la fréquence d’infection est faible, ont une morphologie proche de celle des macrophages, monocytes, ou de cellules dendritiques. de la VP2, ainsi que des virus recombinants exprimant

les gène rapporteurs codant pour la GFP (Green Fluorescent Protein) et la luciférase. 107pfu de chacun ont été inoculés à chaque poussin. Un dernier virus recombinant porteur du gène codant pour la SEAP (SEcreted Alkaline Phosphatase) a été inoculé par voie orale et par dermojet à des poulets (SPF de Ploufragan) de six semaines à la dose de 107pfu par poulet. Les poulets (PA12) utilisés pour les isolements lymphocytaires proviennent de l’INRA de Jouy en Josas.

Introduction Comme les adénovirus humain de type 2 et 5, l’adénovirus aviaire de sérotype 1 ou CELO (Chicken Embryo Lethal Orphan) possède toutes les caractéristiques nécessaires pour être utilisé comme vecteur de transfert de gènes, pour la vaccination avicole. Ce virus à ADN double brin linéaire est déjà décrit (Laver, 1971 ; Chiocca, 1996 ; Chiocca, 1997 ; Lehrmann, 1999 ; Michou, 1999). Stable, sous forme d’épisome, il se prête facilement aux manipulations génétiques in vitro, et n’est associé à aucune pathologie majeure du poulet. Des travaux précédents ont permis d’établir la séquence des 43804 pb du CELO (Chiocca, 1996) et la carte de transcription de son génome (Payet, 1998). Des outils moléculaires nécessaires à la fabrication de virus recombinants à partir de cosmides ont été mis au point au laboratoire (François, 2001). Enfin, des essais in vivo ont mis en évidence un effet vaccinant d’un virus recombinant exprimant le protéine majoritaire de la capside (VP2) du virus de Gumboro (François, résultats non publiés). Dans le cadre de l’utilisation du virus comme vecteur, il est essentiel aujourd’hui de savoir quelles sont les cellules cibles in vivo chez le poulet, ceci pour le virus sauvage et/ou les virus recombinants utilisés.

1.2. Fabrication des virus recombinants La Figure 1 décrit la méthode d’obtention des virus recombinants. Le génome du CELO peut être divisé en quatre parties. Des délétions ont été effectuées dans le Fragment A et le Fragment D et les gènes d’intérêts (VP2, GFP, SEAP et luciférase) y ont été insérés. 1.3. Analyses effectuées Des analyses par PCR et RT-PCR ont été effectuées sur les ADN et ARN des organes des poussins inoculés par les virus wt et les virus recombinants VP2. Les gènes rapporteurs de la luciférase et de la SEAP ont été analysés sur les organes et le sérum des poulets par chimiluminescence. Les isolements lymphocytaires sont réalisés sur gradient de ficoll à partir d’amygdales cæcales et de sang total de poulets non infectés. Après mise en culture, les cellules sont infectées in vitro par un recombinant GFP à une MOI de 10 pour les amygdales cæcales et de 22 pour le sang.

1. Matériels et méthodes 1.1. Animaux et virus utilisés Des poussins SPF (Specific Pathogen Free) de 1 jour du troupeau de Ploufragan ont été inoculés par voie orale avec du virus CELO de type sauvage (wt), des virus CELO recombinants porteurs du gène

2. Résultats Les analyses par PCR et RT-PCR sur des organes de poussins infectés par la souche sauvage, puis des

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

virus recombinants VP2 ont permis d’établir trois sites de multiplication du virus : la trachée, les cæca et la bourse de Fabricius (Tableaux 1, 2 et 3). Ceci a été confirmé par l’utilisation de virus recombinants exprimant le gène codant pour la luciférase (Tableau 4), et la SEAP (Figure 2) comme rapporteur, ainsi que l’établissement de la clearance du CELO. L’ensemble de ces résultats indiquent que le CELO se multiplie avec un pic 5 à 6 jours après infection. Dix jours après infection, du virus est encore détecté puis il n’est plus retrouvé. Des infections in vitro, par un virus recombinant GFP, réalisées sur des isolements de populations lymphocytaires à partir des amygdales cæcales et du sang ont montré que peu de cellules sont infectées au niveau des cæca (Photo 1a et 1b) ; des constructions en rosette ont été observées dans le sang (Photo 2a et 2b). Le type de cellules infectées reste encore à être identifié. Discussion Le virus CELO et ses recombinants sont réplicatifs in vitro sur LMH (Leghorn Male Hepatoma, Kawaguchi, 1987 ), mais qu’en est-il natur-ellement ? Les résultats d’infection avec le CELO wt et les virus recombinant VP2 (Tableau 1, 2 et 3) montrent une présence et des sites de multiplication virale évidents, parfaitement similaires. Il apparaît donc que les virus recombinants construits (Figure 1) n’ont pas un comportement différent évident in vivo, du virus sauvage. Les organes (cæca, bourse de Fabricius) où la multiplication du virus sauvage et des virus recombinants est détectée, possèdent en commun la présence de cellules de type lymphocytaire ou épithélial. Des cellules de type lymphocytaire comme cibles du virus est une possibilité. En effet il a été montré que certains adénovirus humains et les virus dérivés de ceux-ci peuvent soit persister, soit activer ce type cellulaire, et notamment des cellules présentatrices d’antigènes comme les cellules dendritiques

(Zhong, 1999) d’où leur utilisation pour le développement de vaccins (Arrbillaga, 2002 ; Masanori, 2002 ; Osquel, 2002). Pour confirmer ou infirmer cette hypothèse, des essais d’infections in vitro par un virus recombinant porteur du gène codant pour la GFP, sur les populations de cellules isolées à partir des cæca et/ou du sang (gradient de ficoll) ont été réalisés. Des cellules produisent de la GFP et ont une morphologie spécifique : cellules rondes de grande taille de type monocyte ou cellules dendritiques. Le nombre d’événement est cependant faible (1 pour 10000). Il reste donc à préciser le type exacte de cette cellule et de vérifier que l’on retrouve bien in vivo les résultats de ces infection in vitro. Conclusion Des organes où la présence du virus a été détectée, ont été identifiés mais le type cellulaire exact reste encore à être déterminé. Une cellule de type macrophage, monocyte, cellule dendritique est une possibilité. Les travaux vont se poursuivre par de nouvelles études in vitro (isolements) et in vivo (nouveaux rapporteurs), mais également par des études immunohistologiques. Références bibliographiques Arribillaga L., 2002. Vaccine, 21 pp 202-210. François A., 2001. J. Virol., 75 (11), pp 5288-5301. François A., 2002 Thèse. Laver W., 1971. Virology, 45 pp 598-514. Lehrmann H., 1999. J. Virol., 73 pp 6517-6525. Masanori M., 2002. Vaccine, 21 pp 211-220. Michou A.I., 1999. J. Virol., 73 pp1399-1410. Payet V., 1998. J. Virol., 72 (11), pp 9278-9285. Osquel B.H., 2002. Vaccine, 21 pp231-242. Zhong L., 1999. Eur J Immunol., 29 pp964-972.

FIGURE 1 :

Fabrication des virus recombinants A-, D-, et insertion des gènes de la VP2, des ORF 9 et 11 et des gènes

rapporteur de la GFP (Green Fluorescent Protein) de la luciférase et de la SEAP (Secreted Alkaline Phosphatase)

A B C DGénome du Celo: 43804 pb

Génome du Celo délété (A-, D-)

Celo rec(A-)/ D-(VP2)VP2

Celo rec A-(ORF9) / D-(VP2)

Celo rec A-(ORF11)/D-(VP2)

Celo rec A-(ORF9+11) /D-(VP2)

Celo rec GFP

Celo rec Luciférase

ORF9

ORF11

GFP Luciférase

TABLEAU 1:

Détection du CELO par PCR et de sa multiplication par RT-PCR sur les organes de poussins infectés à la dose 107pfu

Temps SangAnalyse PCR RT-PCR PCR RT-PCR PCR RT-PCR PCR RT-PCR PCR RT-PCR PCR2 heures + - + + - + + - +4 heures + - + - + + + - + - +8 heures + - + - + + + - + - +

1 jour + + + + + - + +2 jours + + - + + + - + + +3 jours + + + - + + + - + + +6 jours + + + - + + - - + + +10 jours - - + - + + - - - - +20 jours - - + - + - - - - - +30 jours - - - + - - - - - -40 jours - - - + - - - - - -50 jours - - - - - - - -

Bourse de F.Trachée Rate Caecum Rein

+

TABLEAU 2 et 3 :

PCRTemps 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 41 jour + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + - +2 jours + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +3 jours + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + +6 jours + + - + - - - - + + + + - + - - + + - - + + + +10 jours + + - + - - - - + + + + - - - - - - - - + - + +20 jours - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -30 jours - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Bourse de F. sangTrachée Rate Caecum Rein

Détection des virus recombinants CELO par PCR (2) et de leur multiplication par RT-PCR (3) sur les organes de poussins infectés à la dose 107pfu :1:D-(VP2); 2: CELO/A-(ORF9)/D-(VP2); 3: CELO/A-(ORF11)/D-(VP2); 4:

CELO/A-(ORF9 + ORF11)/D-(VP2)

RT-PCRTemps 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 41 jour + + + - + - + + - + - -2 jours + + + + + + + + + + + +3 jours + + + + + + + + + + + +6 jours + + + - + + - - - - + -10 jours - - - - - - - - - - - -20 jours - - - - - - - - - - - -

Trachée Caecum Bourse de F.

TABLEAU 4:

Rapport des intensités lumineuses relatives des échantillons testés pour la luciférase, avec l’intensité relative des

témoins négatifs (positif > 2)

Temps Trachée Rate Caecum Bourse de F.1jour 41,5 2,9 0,7 162jours 2,7 2,3 1,4 22,53jours 19,3 1,3 7,6 1,74jours 7,9 1,2 1,2 3,66jours 1,7 1,2 0,7 110jours 1,2 1 1,2 0,720jours 1 1 1,1 0,730jours 0,6 0,9 1 0,640jours 0,6 0,8 0,5 0,7

Rapport RLU/témoin

FIGURE 2 :

A Quantités moyennes de SEAP (x10-4mg) sécrétées au cours du temps suivant le mode d’inoculation (voie orale ou sous cutanée par dermojet) (Tableau)

B Représentation de l’évolution de la quantité de SEAP sécrété suivant le mode d’inoculation (• : voie orale ; : sous cutanée par dermojet) (Graphique)

Temps (Jours) Dermojet Orale0 0 03 14,8 20,84 20,75 16,85 32,2 26,26 34,8 24,57 0,73 0,8410 0,41 0,211 0,06 0,2312 0,188 0,3813 0,11 0,104

Voie d'inoculationA EVOLUTION de la QUANTITE de SEAP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 3 4 5 6 7 10 11 12 13

JoursQ

uant

ité d

e SE

AP

(x 1

0-4

mg)

B

PHOTO 1a et 1b :

Isolement de cellules lymphocytaires à partir d’amygdales caecales de poulet (PA12, 19 jours) :

infection par du CELO GFP (10 MOI), grossissement X40

a b

PHOTO 2a et 2b :

Isolement de cellules lymphocytaires à partir du sang total de poulet (PA12, 15 jours) : infection par du CELO GFP (22MOI), grossissement X40

a b