BIOCHIMIE, 1975, 57, 261-264. Br6ve communication

Possibilit6 de biosynthbse "de novo" de phosphonates dam le foie de rat.

J o s e t t e ,XIARMOUYET, R d g i n e ~[AGET-DANA et L o u i s DOUSTE-]~LAZY.

Unitd I .N .S .E .R.M. 101, B i o c h h n i e des L i p i d e s , H6p i ta l P u r p a n - - 31052-Toulouse Cedex - - France .

(7-2-1975).

La prdsence de p h o s p h o n a t e s a 6t~ mise en ~videnee dans cer ta ins t i s sus de m a m m i f ~ r e s et en pa r t i cu l i e r dans le foie de eh&vre [1], le cerveau de bceuf !2] et des t i s sus h u m a i n s [3-5]. Mais dans aueun cas une b iosyn th6se de novo de la l i a i son C-P n ' a fit4 ddmon- tr6e chez des vert~brfis.

MATERIEL ET METHODES.

Animaux. Onze ra t s a lb inos souehe Wis ta r , pe san t en t re 80 et

120 g, regoivent ehacun une in jec t ion in t rap6r i tonda le de HNa_, a2PO, (3 mCi) en so lu t ion i so ton ique (CEA). Les a n i m a u x ont l ibre ace6s h la n o u r r i t u r e et 'a la b o i s s o n et son t sacrifi6s p a r d6capi ta t ion 24 heu re s apr6s l ' in jec t ion.

Six ra t s ax6n iques on t dr6 t ra i tds d 'une man i6 re iden t ique au Centre &Elevage et de S61eetion des A n i m a u x de Labora to i r e (CNRS - - Or leans La Source).

Hydrolyse. Les foies son t prd]evds, ddcoup6s en fines l amel les

et hydrolysf is p e n d a n t 48 heu re s pa r HC1 6 N an reflux. L ' h y d r o l y s a t est fittr6 s u r la ine de ver re et ~vapor6 p lu s i eu r s fois p o u r 5 l iminer HCl. Le r6s idu est dilud dans 10 ml de CH.~COOH 0,5 N.

Rdsines dchangeuses d'ions. Nous u t i l i sons des rfisines Bio-Rad Dowex 1.Xz

(100-200 m e s h ou 5 0 - 1 0 0 mesh) et Do'wex 50-X~ (206 - 400 mesh) .

Les r~sines dchangeuses d ' an ions son t ut i l is~es sous fo rme aefitate. Le p h o s p h a t e est r e tenn su r Dowex-1 ( fo rme acf ta te) et les compos6s a m i n o p h o s p h o n i q u e s sont dlu~s p a r l 'aeide acgt ique 0,5 N.

Les rdsines dehangeuses de ca t ions son t raises dans HCOOH 1 N. Les eomposds h e b r o m a t o g r a p h i e r son t d i s sous darts HCOOH 1 N. Le p h o s p h a t e est ~lu6 p a r lavage de la eolonne de rfisine Do'wex-50 p a r de l ' eau distill~e. Les compos~s amin6s n e n t r e s (dont les a m i n o p h o s p h o n a t e s ) qui sont res t6s fix6s s u r la colonne, son t 61u6s p a r NH~OH 3 N [6].

Dans cer ta ins cas, des f r ac t ions son t collect6es p a r u n f r a c t i o n n e u r a u t o m a t i q u e & n u m d r a t i o n 61ectro- n ique (Gilson).

Chromatographies sur couche mince. Apr6s ehaque passage s u r eolonne, une pa r t i e al i -

quote de l '~ luat est e h r o m a t o g r a p h i d e s u r couehe mince de sil ica-gel G en prdsence des t~moins : 2-AEP, 2-Mdthyl AEP, 2-Dim~thyl AEP, 2 -Tr imdthy l AEP (Calbiochem) et 32pi. Les so lvan t s ut i l is~s son t - - I : aeide ac6tique 0,02 M dans de l ' 6 thanol h 60 p. cent ;

- - I I : ph6no l -eau (4:1 v /v ) ; - - I I I : i s o p r o p a n o l - acide f o r m i q u e - e a u (8:1:1 v / v / v ) .

1 0 0 0

50C

0

0

2(

A

= = : -':1'if- =: 2:o = ~ 3 0 4o -" -'5~o

B lO

5 ~ . . . .

. . . . . ,o-" ~ ~o "- "-3b ~" 4o 5o 60 70

N O DU TUBE

FIG. 1. -- Isolement, d partir d'un hydrolysat de foies de rats, de compos~s amines neutres poss~dant une liaison non hydrolysable avec s:?p.

A : Rats n o r m a u x : La eolonne (30 F" 2 era) Dowex- 50 H *, fai te dans HCOOH 1N et lavde p a r de l ' eau est dlude p a r NH~OH 3N ( f rac t ions de 5 ml) .

B : R a t s axdn iques : D i m e n s i o n s de la eolonne (47 Y, 3 era) - - f r a c t i o n s de 5 ml .

Les composds r ad ioac t i f s son t d6teet~s p a r a u t o r a - d iograph ie (fihns Kodirex) . Les g r o u p e m e n t s a m i n e s sont v isual i s~s p a r v a p o r i s a t i o n d 'une so lu t ion de n inhyd r ine . Les compos~s p h o s p h o r ~ s sont r6v~I~s p a r le rfiactif de H a n e s - I s h e r w o o d [7].

2 6 2 J. M a r m o u y e t , R . M a g e t - D a n a el L . D o u s t e - B l a z g .

O %

v - -

Radioactioitd. La r a d i o a c t i v i t 6 e s t d 6 t e r m i n ~ e p a r s c i n t i l l a t i o n en

m i l i e u l i q u i d e ( P a c k a r d - T r i c a r b m o d u l e 3 390).

20C

100

-J it= 5 10 15

2,5

-- -10

B

2 0 3 0

N ° DU TUBE FI6. 2. - - Pro/i l d'dl~lio~2 des composds aminds neu-

tres possddant une liaison non hydrolysable aoec seP : A : R a t s norm~aux - - e h r o m a t o g r a p h i e s u r Dowex-1

(100-200 m e s h ) acd ta te (20 X 1 cm) . E l u t i o n p a r CH3COOH 0,5 N.

On r ecne i l l e des f r a c t i o n s de 3 ml . B : R a t s a x 6 n i q u e s --- c h r o m a t o g r a p h i e sin: Do'wex-1

(50-100 m e s h ) ae6 ta t e (25 X 2,5 era). E l u t i o n p a r CH:~COOH 0,5 N. On recue i ] le des f r a c t i o n s de 2,5 ml .

R E S U L T A T S ET DISCUSSION.

U n e p r e m i b r e c h r o m a t o g r a p h i c de l ' h y d r o l y s a t de fo ies de r a t s u r D o ~ e x - 1 (20 × 2 em) 61 imine u n e g r a n d e p a r t i e des p i g m e n t s et des i o n s p h o s p h a t e s (z2p) qu i r e s t e n t fix6s s u r la eo lonne . L ' ~ l u a t e s t ~va- p.or4 h see, r e p r i s p a r 10 m~l de HCOOH 1 N e t pa s s6 s u r colo.nne Do,wex 50-X4 (50 X 3 cm) . Les i o n s p h o s - p h a t e s s o n t 61imin6s p a r 500 m l d ' e a u dis t i l l6e . Les co.mpos6s a m i n 6 s s o n t 61u6s p a r 500 m l de NH~OH 3 N. Apr~s p l u s i e u r s 6 v a p o r a t i o n s p o u r 61 imine r NH,OH, l '(~luat r e p r i s p a r 10 m l de HCOOH 1 N e s t r e c h r o m a - to g r a p h i 6 d e u x fo i s s u r celo.nne Do,wex-50 (30 × 2 era). Lo~s de la de rn i~ re 61ut ion p a r NH~OH 3 N o.n r ecue i l l e des f r a c t i o n s de 5 rrd d o n t ]a r a d i o a e t i v i t 6 es t d6 te r - m i n 6 e s u r des p a r t i e s a l i q u o t e s de 0,01 ml . U n pie de r ad ioac t i v i t 4 es t s i tu6 a n f r o n t de l ' a m m o n i a q u e (fig. 1).

Le pic r a d i o a c t i f a i n s i m i s en ~vidence es t concen t r5 et c h r o m a t o g r a p h i ~ s u r Do%vex-1 (20 × 1 cm) p o u r 61 imine r les de rn i~ re s t r a ce s de p h o s p h a t e . L ' ~ l n a t (100 m l de CH:~COOH 0,5 N) es t concen t r6 e t r e c h r o - m a t o g r a p h i 6 su r Do,wex-1. Des f r a c t i o n s de 2,5 ou 3 m l so.nt col lect6es et l e u r r a d i o a c t i v i t d d 6 t e r m i n S e s u r 0,01 ml .

Les f r a c t i o n s c o r r e s p o n d a n t a n pig r a d i o a c t i f (fig. 2) s o n t eoncen t rSes , 6vapor6es p l u s i e u r s fo i s p o u r 61imi- n e r CH~COOH et des p a r t i e s a l i q u o t e s s o n t e h r o m a -

F1s. 3. - - Autoradiogramme de la chromatographie sur couche mince d'un hydro- lysat de foies de rats apr~s injection intrap~rilon~alc de HNafi2PO~.

:~2Pi a 6t~ 61imin6 p a r c h r o m a t o g r a p h i e s s u r Dowex-50 et Dowex-1 . S o l v a n t : ac ide ae6 t ique 0,02 M d a n s l ' O h a n o l h 60 p. cent . Les t 6 m o i n s (2-AEP)

ae ide 2 - a m i n o 6 t h y l p h o s p h o n i q u e , (a) m o n o m 6 t h v l 2-AEP, s o n t r6v616s p a r la n i n h y - d r ine . (b) d i m 6 t h y l 2-AEP, (c) t r i m 6 t h y l 2-AEP s o n t r~vOlSs p a r le r~ac t i f de H a n e s - I s h e r w o o d .

A : r a t s n o r m a u x .

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 2.

Biosgnth~se de n o v o de phosphonales chez le rat. 263

t o g r a p h i d e s s u r c o u c h e m i n c e de s i l i ca -ge t G, d a n s les s o l v a n t s I e t II.

Ces e h r o m a t o g r a p h i e s (fig. 3 et 4) m e t t e n t en dv idenee t r o i s c o m p o s d s r a d i o a c t i f s qu i ou t r6s i s t6 h l ' h y d r o l y s e acide. Le p r e m i e r r 6 s u l t a t o b t e n u es t doric que les r a t s b i o s y n t h d t i s e n t , h p a r t i r de p h o s p h a t e (32p), des c o m p o s d s a m i n d s p o s s d d a n t u n e l i a i s o n n o n h y d r o l y s a b l e avec te p h o s p h a r e . Cet te r 6 s i s t a n c e ~t l ' h y d r o l y s e ac ide es t c a r a c t 6 r i s t i q u e d ' u n e l i a i s o n co- v a l e n t e e n t r e le p h o s p h o r e et le c a r h o n e [8-9] : ces c o m p o s d s s e r a i e n t doric des p h o s p h o n a t e s . On r e m a r -

Alhadef f e t coll. [10] a v a i e n t proc6d6 en 1972 /t des expdr i ences a n a l o g u e s en u t i l i s a n t c o m m c p r d c u r s e u r d u g lucose (14C) et n ' a v a i e n t t r o u v 6 a u c u n e i n c o r p o - r a t i o n de la r a d i o a c t i v i t d d a n s des c o m p o s 6 s p h o s - phon~s . Mats i ls n ' a v a i e n t t r a i t 6 que d e u x r a t s et ne l e a r a v a i e n t i n j ec td que 27,5 ~Ci. I l s p r 6 c i s e n t q u e l ' i n c o r p o r a t i o n d u g lucose (14C) es t i n f 6 r i e u r e h

1 100.000 ; l ' i n c o r p o r a t i o n du p h o s p h a t e (32p) d a n s n o t r e

1 cxpdr i ence cs t de l ' o rd re de 10.000

FIG. 4. - - Autorad iogramme de la chromatographic sur couche mince d'un hgdro lysa t de rotes de rats apr~s in jec t ion intrapdritondale de HNa2~PO~.

32pi a dtd d l im i nd p a r c h r o m a t o g r a p h i c s u r Dowex-50 et Dowex-1 . S o l v a n t : p h 6 n o l - e a u (4 : I v / v ) . Les t 6 m o i n s ( 2 - A E P ) a c i d e 2 - a m i n o 6 t h y l p h o s p h o u i q u e , (a) m o n o m 6 t h y l 2-AEP s o n t r6v61i, s p a r la

n i n h y d r i n e . (h) d i mf i t hy l 2-AEP, (c) t r i m d t h y l 2 -AEP s o n t rdvdl6s p a r le rdae t i f de H a n e s - I s h e r - wood.

A : R a t s n o r m a u x ; B : R a t s a x 6 n i q u e s .

que , d ' a u t r e par t , que ehez les r a t s a x d n i q u e s , cet te b i o s y n t h 6 s e es t e n v i r o n 20 lo i s p l u s f a i b l e que chcz des r a t s n o r m a u x .

Les p h o s p h o n a t e s s o n t s~par~s p a r c h r o m a t o g r a p h i c s u r conche 6pa i s se (2 m m ) de s i l i ca -ge l G. C h a q u e h a n d e r6vdlde p a r a u t o r a d i o g r a p h i e es t g ra t t6e et le c o m p o s 6 r a d i o a c t i f e s t 61u~ du gel de si l ice p a r de l ' e au dis t i l l6e .

N o u s a v o n s o b t e n u u n e q u a n t i t d i n f i me de m a t d r i e l (il a f a l l u ~ S h i m i z u e t colt. [21 p r6s de 30 kg de ccr- v e a u de b0euf p o u r o b t e n i r 18 m g d ' a c i de 2 - a m i n o - 6 t h y l p h o s p h o n i q u e , et n o u s n ' a v o n s t r a i td que 60 g de rotes de r a t s clans le eas de s r a t s n o r m a u x et 30 g d a n s le cas des r a t s a x ~ n i q u e s ) . Unc i den t i f i c a t i on de ces c o m p o s 6 s p a r c h r o m a t o g r a p h i c en p h a s e g a z e u s e ap rbs s i l y l a t i o n es t en cours .

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 2.

La h i o s y n t h 6 s e de p h o s p h o n a t e s chez le r a t prd- s en te u n int6rOt p a r t i c u l i e r . En effet, c e r t a i n s p ro to - zoa i r e s e n t r a n t d a n s la c o m p o s i t i o n du t u r e e n de bceuf [11] et de chbvre [12], c o n t i e n n e n t de I 'AEP, ce qui p e u t e x p l i q u e r l a p rdsence d ' A E P darts le c e r v e a u de bceuf [2] et le foie de ch6vre [1], d ' a u t a n t p l u s que R o s e n b e r g [133 a m o n t r 6 qu ' i l y a v a i t u n 6 c h a n g e d ' ac ide 2 - a m i n o f t h y l p h o s p h o n i q u e e n t r e T. pyr i f o rmi s et le m i l i e u e a v i r o n n a n t . La p r6sence d ' A E P d a n s ]es t i s s u s h u m a i n s [3-4] p e n t t~galement p r o v e n i r d ' u n a p p o r t e x t 6 r i e u r : d ' a p r b s Q u i n [8] on p e u t ing~re r j u s q u ' h 30 m g de 2-AEP en m a n g e a n t q u a t r e p a l o u r d e s ou h u i t m o n i e s . Les h u i t r e s s o n t d g a l e m e n t r i che s en p h o s p h o n a t e s !141. Mats , chez le r a t , les p h o s p h o n a t e s ne p r o v i e n n e n t pa s de sa n o u r r i t u r e - - ¢ a l i m e n t composd complete> (*), d o n t n o u s e o n n a i s s o n s l a

(*) A l i m e n t s JOF - - T o u l o u s e .

2 6 4 J. M a r m o u y e t , R. M a g e t - D a n a et L . D o u s t e - B l a z y .

c o m p o s i t i o n exac t e - - n i de la flore d u t u b e d i g e s t i f ou de la flore i n t e s t i n a l e , les m ~ m e s rg~sultats a y a n t 6td o h t e n u s chez des r a t s a x ~ n i q u e s . I1 p o u r r a i t s ' a g i r d u p r e m i e r e x e m p l e d ' u n e b i o s y n t h 6 s e de novo de ]a l i a i s o n c a r b o n e - p h o s p h o r e chez u n m a m m i f b r e . Cepen- d a n t le f a i t que eet te h i o s y n t h 6 s e so i t b e a u c o u p p l u s i m p o r t a n t e chez des r a t s n o r m a u x q u e ehez des r a t s a x 6 n i q u e s , sugg6re q u e e e r t a i n s m i e r o o r g a n i s m e s p a r - t i e i p e r a i e n t /l cet te b i o s y n t h 6 s e , a n m ~ m e t i t r e que cer- t a i n s p r o t o z o a i r e s ci l i5s d u n s la p a n s e de m o u t o n [15].

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Printed in France. Le Directeur de la publication : J 6 r b m e TALAMON.

M a s s o n et Cie, E d i t e u r s , Pa r i s . D t p 6 t 16gal 1 er t r i m e s t r e 1975 - - N u m 6 r o d ' o r d r e : 4861.

I m p r i m e r i e DECLUME L o n s - l e - S a u n i e r . - - 126-75-2400.

Mai 19,75 << Ddp6t l~dgal 2 ~ t r i m e s t r c 19'75 - - N ° 6439 >>.