Etienne Carbonnelle

Service de Microbiologie

HEGP

Paris

Vendredi 20 juin 2014

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XIX ème journée de Microbiologie Clinique du COL.BVH

Place des nouveaux outils dans le diagnostic des bactériémies :

Biologie moléculaire, MALDI-TOF-MS

Conflit d’intérêt :

• Actionnaire chez ANDROMAS

Diagnostic

Meilleure prise en charge

Antibiothérapie ciblée et adaptée

Limiter la transmission (BMR, MST, …), gérer l’isolement

Durée d’hospitalisation

Suspicion clinique de bactériémie

Techniques idéales

Rapide

Faible coût

Sensible

Spécifique

Universelle

Simple

Identification Résistance aux anti-microbiens

Apport de la biologie moléculaire

2006-2007 : Septifast

Les hémocultures vont elles disparaître ?

Rapidite

Indépendant du traitement antibiotique

Sensible

Intérêt pour la détection des champignons

Multiplex PCR Temps réel

Mussap M,et al., J Chemother. 2007 Oct;19 Suppl 2:31-4.

Ce qui se dit :

Hémoculture

aérobie/anaérobie

résine/charbon

Sang

Sérum

Culture : ATBg et Id

PCR Temps réel spécifique (Coxiella, Bartonella,

Brucella, …)

Multiplex PCR Temps réel

PCR/Electrophorèse

PCR/Séquençage

+/- pré-culture

(quelques heures)

Diagnostic moléculaire des bactériémies

PCR Temps réel spécifique

Multiplex PCR Temps réel

FISH

Puce

PCR/Hybridation

PCR/Séquençage

PCR/ESI-MS

Liesenfeld et al., Eur J Microbiol Immunol, 2014

Liesenfeld et al., Eur J Microbiol Immunol, 2014

Délai de rendu des résultats en fonction des

techniques de diagnostic des bactériémies

~ 160 €

PCR en temps réel : Septi Fast (Roche)

Limites de la biologie moléculaire

Faux négatifs

Extaction

Présence d’inhibiteurs

Faible inoculum

Faible volume

Faux positifs

Persistance d’ADN bactérien

Contaminations

Bactériémie post prandiale

Non adapté aux prélèvements polymicrobiens

Panel de microorganismes identifiables restreint

Peu de détection de la résistance aux antibiotiques

Ne renseigne pas sur le caractère viable des microorganismes

Absence de validation clinique

Evaluation clinique

Utilisable en routine ?

De la galerie happy….

….à la spectrométrie de masse

1970 2010

http://www.microbe-edu.org/ http://www.microbe-edu.org/ Pr. A. Philippon

J1

J2 ou + Identification bactérienne, antibiogramme

Résistance Sérologie Autres BM

Identification

phénotypique

J1 Aspect des colonies

Examen direct

Coloration

Identification bactérienne

Place du MALDI-TOF ?

H24 :

H48 ou + Identification bactérienne, antibiogramme

Résistance Sérologie Autres BM

Identification

Micro-organisme

Antibiogramme

2 minutes

Tests

phénotypiques

Acquisition des spectres Dépôt des échantillons

Identification

Banque de données

A1 : Klebsiella pneumoniae

A2 : Staphylococcus saprophyticus

A3 : etc…..

Analyse des spectres

Transfert des données au

système informatique du laboratoire

Exemple d’identification bactérienne

à partir de colonies entières

matrice

analytes

Irradiation laser

+

+ +

+

+ + +

+

+ +

+ +

+

+ +

+ +

+

+

+

Désorption Ionisation

Analyseur TOF

m/z In

ten

sité

rela

tive

Détecteur linéaire

Grille

d’extraction

x

Zone de vol libre de champ Zone d’accélération

10-30 kV -20 kV

Cib

le m

éta

lliqu

e

Source MALDI TOF Détection

TOF : Time Of Flight

D’après les feuillets de Biologie

VOL N° 295 - JUILLET 2010

Empreintes spectrales obtenues à partir de colonies entières

de cinq espèces bactériennes différentes (Matrice -CHCA).

Utilisation en routine

Laboratoires équipés de MALDI-TOF-MS

Toutes les identifications

- soit sur colonies

- soit directement à partir de Prélèvements

- Hémocultures

- Urines

- ...

Les difficultés

Suspension de protéines issues de bactéries et des protéines “contaminantes”

Limites du MALDI-TOF MS : ne reconnait que les protéines majoritaires

Flacon d’hémoculture, les protéines majoritaires sont:

Protéines du globule rouge : hémoglobine

Protéines du sang, du pus, de l’urine etc…

Présence de résine ou de charbon

Masquent les protéines des bactéries

Nécessité de concentrer les bactéries

Phase pré-analytique

Obligation de séparer les bactéries des autres constituants avant

d’extraire leurs protéines et/ou améliorer l’extraction de leurs protéines

Les premiers résultats

• Bactec 9240, Bactec + aerobic et Lytic 10 anaerobic

• Centrifugation basse vitesse de 1.5ml pendant 5 min.

• Surnageant mélangé avec 1m d’eau distillée stérile

• Centrifugation haute vitesse pendant 5 min. pour culoter les bactéries

• 5µl of d’agent d’extraction pendant 5 min.

Protocole 1: TFA

Protocole 2: acide formique

• Centrifugation haute vitesse 2 min pour retirer le matériel non lysé

• Identification OK si > 2/4 spots avec score >1.9

D’après B. La-Scola

• 584 flacons d’hémoculture testés (resultats comparés à l’identification MALDI-MS sur

colonies et/ou phenotypique)

• 562 flacons avec un seul morphotype au Gram sur le flacon

• Protocol 1 TFA:

• Gram -: 117/124 (94%) identified

• Gram +: 72/197 (37%) identified

• Protocol 2 acide formique:

• Gram - : 87/100 (87%) identified

• Gram +: 94/140 (67%) identified

• Problèmes:

• Une seul mauvaise identification (S. marcescens identifié comme A. hydrophila)

• Peu efficace pour les Streptococcus sp. (4/17, 23%)

• Lent!!!….

Les premiers résultats

D’après B. La-Scola

Détection des micro-organismes à partir des prélèvements :

les hémocultures

D’après M. Drancourt, CMI 2010

L’optimisation

• Comparaison aux protocoles existants

Gram positive

(n = 31)

Gram negative

(n = 91)

Overall

(n = 122)

Protocol 6 26 (83.8%) 89 (97.8%) 115 (94.3%)

LaScola et al. (14) 16 (51.6%) 80 (87.9%) 96 (78.7%)

Ferroni et al. (9) 20 (64.5%) 44 (48.3%) 64 (52.5%)

Greub et al. (19) 18 (58.1%) 12 (13.2%) 30 (24.6%)

Ferreira et al. (8) 19 (61.3%) 17 (18.7%) 36 (29.5%)

Stevenson et al. (22) 19 (61.3%) 9 (9.9%) 28 (23%)

D’après B. La-Scola

Protocole HEGP

Utilisation en routine : sur hémoculture et urine

Carbonnelle et al, Réanimation 2012

Mycose, April 2014

A partir des hémocultures : PNA-FISH YTL/Sepsityper/Culture

50 hémocultures positives à levures au Gram

MALDI

ITS rRNA seq

PNA-FISH YTL : 48 (96%) (littérature : entre 96 et 99%)

MALDI Sepsityper : 28 (56%) score >1.8 (littérature : 42 à 50%)

38 (76%) score >1.5

Amélioration à faire sur le MALDI Sepsityper

Hémocultures et MALDI-TOF

Efficace dans l’ensemble

Différents protocoles validés (commerciaux et maison)

En routine dans certains laboratoires

MAIS

Prend du temps technique

Opérateur dépendant

Peu efficace sur les mélanges

Mêmes difficultés que pour les identifications sur colonies

Plus mauvais résultats sur les flacons avec charbon

Identification après une courte incubation sur milieux solides

Incubation pendant 3 à 6h

sous CO2

Flacons détéctés positifs

1 goutte

CMI, 15 may 2014

SepsiTyper kit

Id espèce : 52,6%

Id genre : 71,1%

Toutes espèces confondues

165 Hc, 28 espèces différentes, 10 cultures polymicrobiennes, 13 faux positifs

Résultats :

300 flacons ont été inclus, dont 17 faux positifs et 5 polymicrobiens

Les identifications sont présentées par rapport à l’identification finale

Pour 168 : score > 2

-73/126 Staphylococcus sp.

-72/78 Entérobactéries

-1/8 Levures

-9/15 Streptococcus sp.

-2/5 Pseudomonas sp.

-1/1 Acinetobacter sp.

-2/3 Bacillus sp.

-8/9 Enterococcus sp.

Pour 42 : score > 1,7

-29/126 Staphylococcus sp.

-3/78 Enterobactéries

-2/10 Anaérobies

-4/15 Streptococcus sp.

-2/5 Pseudomonas sp.

-1/3 Bacillus sp.

-1/9 Enterococcus sp.

Pour 68 : score < 1,7

-44/126 Staphylococcus sp.

-3/78 Entérobactéries

-8/10 Anaérobies

-7/8 Levures

-2/2 Corynebactéries

-2/15 Streptococcus sp.

-1/5 Pseudomonas sp.

-Autres : 1

59% 14% 24%

D’après J-B. Zabbe, L. Zanaro, F. Mégraud, E. Bessède

Laboratoire de Bactériologie, CHU de Bordeaux

Résultats présentés aux JNI, juin 2014

Espèce Genre Absence d’identification

A : Méropénème

B : Témoin –

C : E. coli NDM-1

D : A. baumanii NDM-1

JCM 2012, 50(7)2441-2443

A

B

C

D

-26 +18

358,5 384,4 406,4 424,5

February 2014, vol 9, Issue 2

Temps :

11,4 vs 56,3h

Tests rapides résistance antibiotiques

En cours d’étude

Détection mecA pour les S. aureus

(Cepheid, Alere)

Détection BLSE pour les entérobactéries

Identification

Quel impact dans la prise en charge clinique ?

CID 2013:56 (15 april)

Conclusions

Nouvelles approches techniques

Biologie Moléculaire : sur l’échantillon primaire

dans certaines conditions ciblées

Multiplex PCR temps réel

MALDI : sur hémocultures

incubation courte sur milieux ou directement sur flacon

couplé aux tests simples pour la résistance

Progrès à faire

Juste prescription

Réalisation des hémocultures (volume de remplissage)

Remerciements

Dr Isabelle Podglajen (HEGP)

Dr Emilie Bessède (Bordeaux)

Pr Bernard La-Scola (Marseille)

Pr Francis Megraud (Bordeaux)

MALDI Team de Necker

Microbiologie de l’HEGP