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MEMOIRE

Présenté

A LA FACULTE DES SCIENCES

DE L’UNIVERSITE D’ORAN ES-SENIA

Pour l’obtention

Du

DIPLOME DE MAGISTERE EN BIOTECHNOLOGIE

SPECIALITE : EXPLOITATION DES INTERACTIONS PLANTES-MICROORGANISMES

Présenté par :

MELLE

SEKKOUR SONIA

Thème

Soutenu le devant la commission d’examen composée de :

Présidente : Mme FYAD LAMECHE Fatima Zohra, Professeur à l’université d’Oran Es-Senia.

Examinateur : Mr KIHAL Mabrouk, Professeur à l’université d’Oran Es-Senia.

Examinateur : Mr KACEM Mourad, Maître de conférences à l’université d’Oran Es-Senia.

Promoteur : Mr BEKKI Abdelkader, Professeur à l’université d’Oran Es-Senia.

Essai d’introduction d’un couple symbiotique Rhizobium-Acacia saligna

pour la revégétalisation de la Sablière de Sidi Lakhdar

(Wilaya de Mostaganem)

Remerciements

Ce travail de magister a été réalisé au laboratoire de Biotechnologie des Interactions Plantes- Microorganismes de l’université d’Oran Es Senia.

En tout premier lieu, je tiens à exprimer toute ma reconnaissance à mon encadreur Mr BEKKI A. (Professeur à l’université d’Oran Es-Senia), pour le temps, la patience et la confiance qu’il m’a accordé tout au long de ce travail et bien avant durant mes années d’étude d’ingénieur.

Je tiens à remercier également Mme BOUKHATEM F. (Chargée de cours à l’université d’Oran Es-Senia), pour tous ses conseils, ses remarques et pertinents commentaires tout au long de mon travail au laboratoire.

Mes remerciements vont également à Mme FYAD LAMECH F. Z. (Professeur à l’université d’Oran Es-Senia) pour m’avoir fait l’honneur de présider le jury.

Je remercie également Mr KIHAL M. (Professeur à l’université d’Oran Es-Senia) et Mr KACEM M. (Maître de conférences à l’université d’Oran Es-Senia), pour l’intérêt qu’ils ont porté à mon travail et pour avoir accepté de faire partie du jury.

Je tiens à exprimer ma gratitude à :

Mr ABDI directeur de recherche à l’INRA de Sidi Bel Abbes.

Mr RAHALI le conservateur des forêts de Mostaganem.

Mme BELHCAINE ingénieur au sein de la foresterie de Mostaganem. Mr CHENOUFI responsable de la pépinière à Mostaganem.

Mr MESILET le gérant de la Sablière de l’Ouest à Mostaganem.

Pour leur aimable collaboration, qui m’a facilité la réalisation de ce travail.

Je remercie aussi Mr Galiana A. chercheur au LSTM de Montpellier pour son aide dans la partie statistique.

Mes remerciements s’adressent également à Mme BOUCHENTOUF L. (Chargée de cours à l’université d’Oran Es-Senia) pour son aide dans la correction du mémoire.

Le dernier et non le moindre des remerciements, je le réserve à toute ma famille en particulier à ma mère, mon père, mes frères et ma sœur et mon fiancé et à tout mes amis et mes collègues au laboratoire qui n’ont cessé de me soutenir tout au long de ce travail.

MELLE

SEKKOUR SONIA

Résumé

Dans le but de sélectionner un couple symbiotique Rhizobium- Acacia saligna performant pour la revégétalisation de la Sabliere de l’Ouest situé dans la région de Mostaganem et la fixation des dunes littorales, 18 isolats ont été obtenus à partir des nodules racinaires d’Acacia saligna. Ces isolats présentent une morphologie comparable à celle des rhizobia connus, et une bonne résistance à la température jusqu’à 45°C, à la salinité jusqu’à 5% et au pH allant de pH 4 à pH 11, sur ceux 3 souches sont sélectionnées ASB13 (Rhizobium sp.), ASB5 (Sinorhizobium sp.) et ASB7 (non identifiée) pour être utilisé comme inoculum sur la base de leur efficience en conditions contrôlées (capacité à former des nodules et à fixer de l’azote atmosphérique) et de leur résistance aux conditions extrêmes. Ces inocula performants en conditions de laboratoire sont inoculés à de jeunes plants en pépinière. Après 4 mois il a été noté l’effet positive des deux souches l’une appartient au genre Rhizobium sp. et l’autre au genre Sinorhizobium sp. sur la croissance des plants d’Acacia saligna, puis ces derniers sont transférés sur la sablière et sont divisés en deux lot, le premier réinoculé contrairement au second. Les souches sont jugées sur leur persistance sur le terrain dégradé pour sélectionner la ou les souches les plus performantes. La souche qui appartient eu genre Rhizobium sp. a montré une efficacité très élevée pour la croissance et la nutrition azotée des jeunes plants d’Acacia saligna après 4 mois de transplantation sur site dégradé de la sablière. Mots clés : Revégétalisation, Sablière, Dunes littorales, Acacia saligna, Rhizobium, Inoculation. Summary In the purpose of selecting a symbiotic couple Rhizobium- Acacia saligna for the revegetalisation of the Sand pit located in Mostaganem and the fixing of the littoral dunes, 18 isolates were obtained from the root nodules of Acacia saligna. These isolates presented morphological characteristics comparable to known rhizobia, and a good resistant to the temperature until 45°C, salinity up to 5% and the p H going of pH 4 to pH 11, tree strains are selected ASB13 (Rhizobium sp.), ASB5 (Sinorhizobium sp.) and ASB7 (not identified) to be used as inoculum on the basis of their efficiency in controlled conditions (capacity to form nodules and to fix atmospheric nitrogen) and their resistance to the extreme conditions. These perform inoculates in conditions of laboratory are inoculated in young seedlings. After 4 months it was noted the positive effect of two strains on the growth of the seedlings of Acacia saligna in nursery, one of strains belongs to the kind Rhizobium sp. and the other to the kind Sinorhizobium sp. These seedlings of Acacia saligna are transferred on the sand pit and are divided into two batches, the first is inoculated second once but the second is not. Strains are judged on their persistence on the soil degraded to select the most performs. The strain Rhizobium sp. showed a very high effectiveness for the growth and the nutrition in nitrogen of the young seedlings of Acacia saligna after 4 months of transplantation on degraded site of the sand pit. Key Word: Revegetalisation, Sand pit, littoral Dunes, Acacia saligna, Rhizobium, Inoculation.

Sommaire

Sommaire

Chapitre I : Introduction

Introduction ………………………………………………………………………………

Chapitre II : Etude bibliographique

1. Généralités sur les rhizobiums…………………………………………………….. 1.1. Définitions et intérêts…………………………………………………………….. 1.2. Les principales caractéristiques……………………………………………………. 1.3. La taxonomie des BNL……………………………………………………….

2. Les légumineuses……………………………………………………………………. 2.1. Le genre Acacia……………………………………………………………………

2.1.1. Acacia saligna…………………………………………………………… 2.1.1.1. Description………………………………………………………….. 2.1.1.2. Exigences climatiques et édaphiques……………………………….. 2.1.1.3. Utilisations…………………………………………………………. 2.1.1.4. Symbiose fixatrice d’azote……………………………………….….

3. La symbiose Rhizobium-Acacia……………………………………………………….. 4. Les facteurs biotiques et abiotiques influant sur la nodulation ………………….

4.1. Les facteurs abiotiques…………………………………………………………….. 4.2. Les facteurs biotiques ………………………………………………………………

5. Inoculation des légumineuses………………………………………………………… 5.1. Quand est-il nécessaire d’inoculer ? ...................................................................

5.1.1. Le rendement de la légumineuse introduite……………………………… 5.1.2. Le facteur limitant est l’azote……………………………………………. 5.1.3. L’absence de souches spécifiques à la légumineuse introduite…………

5.2. Sélection des souches rhizobiennes…………………………………………….. 5.2.1 Infectivité……………………………………………………………………. 5.2.2 Efficience……………………………………………………………………. 5.2.3 Compétitivité………………………………………………………………… 5.2.4 Résistance à l’action létale de divers facteurs………………………………. 5.2.5 Persistance des souches dans le sol…………………………………………. 5.2.6 Adaptation au niveau de fertilité des sols…………………………………… 5.2.7 Stabilité des caractères génétiques…………………………………………. 5.3. Le choix de la plante hôte……………………………………………………….. 5.4. La qualité d’un inoculum …………………………………………………….. 5.5. Origine des échecs de l’inoculation……………………………………………

04 04 04 06 10 10 11 11 11 12 12 14 18 18 19 20 20 20 21 21 21 21 22 22 22 22 22 23 23 23 24

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Page

Sommaire

Chapitre III : Matériel et méthodes

1. Matériel……………………………………………………………………. 1.1 Les isolats bactériens………………………………………………………. 1.2 Matériel végétal……………………………………………………… 1.3 Sol………………………………………………………………………

2. Méthodes………………………………………………………………….. 2.1 Analyses physicochimiques du sol………………………………………

2.1.1 Analyses physiques ………………………………………… Analyse granulométrique…………………………………. L’humidité………………………………………………. Mesure du pH…………………………………………….

2.1.2 Analyses chimiques ………………………………………… Mesure de la conductivité électrique……………………… Dosage du calcaire total…………………………………….. Dosage du calcaire actif…………………………………….. Carbone total et matière organique…………………………

2.2 Collection et isolement des souches bactériennes…………………… 2.2.1 Collection……………………………………………………… 2.2.2 Isolement des bactéries…………………………………..…

2.3 Purification et conservation………………………………………….. 2.3.1 Observation macroscopique………………………………… 2.3.2 Observation microscopique………………………………….. 2.3.3 Test de nodulation……………………………………………. 2.3.4 Conservation des souches…………………………………….

2.4 Effet des différents facteurs environnementaux……………………… 2.4.1 Effet de la température……………………………………… 2.4.2 Effet du pH …………………………………………………….. 2.4.3 Effet de la salinité…………………………………………….

2.5 Séquençage partiel du gène 16S……………………….……………… 2.6 Sélection de souches performantes…………………………………..

2.6.1 Inoculation des plantes en serre………………………………. 2.6.2 Estimation de la croissance…………………………………… 2.6.3 Analyse statistique……………………………………………..

2.7 Evaluation de la symbiose Rhizobium-Acacia saligna in situ………. 2.7.1 Inoculation des plants en pépinière………………………….. 2.7.2 Transfert des plants sur champs…………………………………

25 25 25 25 26 26 26 26 26 26 27 27 27 28 28 28 28 29 29 29 29 29 31 31 31 31 31 31 32 32 33 33 33 33 34

Sommaire

Chapitre V : Résultats et discussion

1. Analyse physicochimique du sol………………………………………… 2. Vérification de la pureté des isolats……………………………………….

2.1 Caractéristiques morphologiques et microscopiques des isolats……….. 2.2 Test de nodulation…………………………………………………..

3. Effet des différents facteurs sur la croissance des isolats……………. 3.1 Effet de la température………………………………………………... 3.2 Effet du pH……………………………………………………….… 3.3 Effet de la salinité……………………………………………………….

4. Séquençage partiel du gène 16S………………………………………….. 5. Inoculation des plantes en serre………………………………………….. 6. Inoculation en pépinière………………………………………………. 7. Transfert des plants sur champs…………………………………………

Chapitre VI : Conclusion et perspectives

Conclusion et perspectives…………………………………………………………. Références bibliographiques………………………………………………….

Chapitre IV : Etat des lieux

1. Etat des lieux- caractéristiques du site étudié………………………………. 1.1. Climat………………………………………………………………….. 1.2. L’historique botanique…………………………………………………

36 36 37

38 39 39 41 41 41 42 44 46 48 52 55

57 58

Liste des tableaux

Liste des tableaux

Tableau n°1 : La taxonomie des BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses)………………………………………………

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Tableau n°2 :

Les températures et la pluviométrie enregistrées les cinq dernières années dans la région de Mostaganem………………..

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Tableau n°3 :

Le résultat de l’analyse de l’homogénat de quatre échantillons de sol prélevés du site dégradé à 20 cm de profondeur…………

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Tableau n°4 :

Les résultats du test de nodulation, effet des différents facteurs édaphiques et le séquençage partiel du gène 16S des souches isolées……………………………………………………………

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Tableau n°5 :

Le pourcentage de survie et la hauteur moyenne des plants inoculés comparés aux plants témoin non inoculés……………..

Page 53

Liste des figures

Liste des figures

Figure 1 : La sablière de l’Ouest Sidi lakhdar (Mostaganem)…………………. Page 03 Figure 2 :

La fixation des dunes littorales dans la région de Bomo plage (Wilaya d’Oran) par l’introduction d’Acacia saligna………………

Page 03

Figure 3 :

Aspect des colonies de Rhizobium sur milieu YEM gélosé…………

Page 05

Figure 4 :

Arbre d’Acacia saligna………………………………………………

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Figure 5 :

Ecorce d’A. saligna…………………………………………………..

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Figure 6 :

Feuilles d’A. saligna…………………………………………………

Page 13

Figure 7 :

Fleurs d’A. saligna…………………………………………………...

Page 13

Figure 8 :

Gousses d’A. saligna………………………………………………..

Page 13

Figure 9 :

Association symbiotique entre bactérie et plante……………………

Page 16

Figure 10 :

Les étapes de formation de nodules………………………………….

Page 17

Figure 11 :

Foret d’A. saligna dans la région de Mostaganem…………………..

Page 25

Figure 12 :

Les graines d’A. saligna après trois jours de germination à l’obscurité à une température ambiante…………………………….

Page 30

Figure 13 :

Le site de la sablière avant le réaménagement………………………

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Figure 14 :

Protocole d’inoculation suivi in situ sur le site de la sablière………..

Page 35

Figure 15 :

Localisation de la sablière destinée à être revégétalisée……………..

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Figure 16 :

La légumineuse Retama raetam la plus dominante dans le site de la sablière avant l’exploitation du sable………………………………..

Page 37

Figure 17 :

Aspect macroscopique de la souche ASB11 sur milieu YEM après 72h d’incubation à 28°C……………………………………………..

Page 39

Figure 18 :

Aspect visqueux de la souche ASB3 après une semaine d’incubation sur milieu YEM à 28°C……………………………………………...

Page 40

Figure 19 :

Formation des nodules sur des racines d’A. saligna inoculées sur sable stérile après 48 jours de croissance dans la chambre de culture.

Page 40

Figure 20 :

Aspect de la souche ASB5 à pH 3 après 48h d’incubation à 28°C….

Page 43

Figure 21 :

Aspect de la souche ASB5 à pH 12 après 48h d’incubation à 28°C...

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Liste des figures

Figure 22 : La croissance de la souche ASB3 sur milieu YEM incubé pendant 48h à 28°C……………………………………………………………

Page 45

Figure 23 :

La croissance de la souche ASB3 sur milieu YEM salé à 2% (350Mmol) incubé pendant 48h à 28°C…………………………….

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Figure 24 :

La croissance de la souche ASB5 sur milieu YEM incubé pendant 48h à 28°C……………………………………………………………

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Figure 25 :

La croissance de la souche ASB5 sur milieu YEM salé à 3.5% (500Mmol) incubé pendant 48h à 28°C……………………………

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Figure 26 :

Effet de l’inoculation avec la souche ASB17 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé……………………………

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Figure 27 :


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Figure 28 :


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Figure 29 :


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Figure 30 :

Effet souche sur le poids sec de la partie aérienne et la partie racinaire des plants d’A. saligna inoculées en pots après 4 mois de croissance……………………………………………………………..

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Figure 31 :

Effet de l’inoculation avec les différentes souches sur la croissance des plants d’A. saligna pendant 4mois en pépinière…………………

Page 53

Figure 32 :

La hauteur du plant témoin comparé à celui inoculé avec la souche ASB13................................................................................................

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Figure 33 :

Le taux de survie des plants inoculés avec les trois souches comparés aux plants témoin………………………………………….

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Figure 34 :

La plantation d’A. saligna suivant le protocole décrit auparavant…..

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Figure 35 :

Aspect des plants d’A. saligna inoculé avec la souche ASB13 (Sinorhizobium sp.) après 4 mois de croissance sur site de la sablière……………………………………………………………….

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I Introduction

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Introduction

La dégradation du sol peut être causée par l’abandon des carrières après une exploitation

anarchique et abusive. Malheureusement, ce phénomène est très fréquent en Algérie.

Les carrières doivent disposer d’un plan de réaménagement qui doit être réalisé sans délai dès

l’achèvement des opérations d’extraction.

L’exemple de la Carrière de l’Ouest de l’exploitation du sable qui est localisée dans le

Nord-Est de la région de Mostaganem (Figure 1), où le problème du déplacement des dunes

de sable cause des dégâts importants aussi bien pour le secteur agricole par l’envahissement

des terres arables, que pour le secteur urbain par l’ensablement des routes.

Le meilleur moyen pour remédier à tous ces problèmes et lutter contre l’érosion éolienne est

l’utilisation des systèmes fixateurs d’azote plante-microorganisme (Hatimi, 2001),

l’introduction d’une espèce d’Acacia Australienne, Acacia saligna dans le but de fixation des

dunes littorales à donner d’excellent résultats dans la région littorale de Bomo plage située à

la Wilaya d’Oran (Figure 2), c’est pourquoi il nous a semblé intéressant de mettre en place

des essais d’introduction de cette espèce dans le site de la sablière.

Dans ces sols pauvres ou dépourvus d’azote tels les sols dunaires, Acacia saligna est appelée

à jouer un rôle très important, elle présente un intérêt remarquable dans la fixation des dunes

du littoral grâce à la profondeur de son système racinaire, à sa croissance rapide et surtout à sa

capacité à s’associer avec des bactéries du sol du genre Rhizobium et à fixer l’azote

atmosphérique (Dommergues et al., 1999). Cependant, cela ne peut être obtenu qu’en

présence de souches efficientes et en nombre suffisant.

L’inoculation des graines d’Acacia en utilisant des souches effectives sélectionnées au

laboratoire est la méthode la plus convenable et la plus efficiente pour introduire une

population rhizobienne adéquate dans la rhizosphère de cette dernière, plusieurs études ont

rapporté que le rendement des légumineuses inoculées introduites augmente de plus de 25%

(Lal et Khanna, 1993 ; Ndoye et al., 1995).

C’est dans ce contexte que s’intègre notre travail. Il vise la sélection d’un couple

symbiotique Acacia saligna-Rhizobium performant destiné à la revégétalisation de la sablière

et à la lutte contre l’érosion éolienne. L’objectif de l’expérience était de comparer l’effet de

l’inoculation avec différentes souches sur la croissance et la fixation d’azote des plants

d’Acacia saligna en pépinière et sur champs.

Pour atteindre ces objectifs une étude du site dégradé de la sablière est réalisée afin de relever

les contraintes climatiques et édaphiques qui prévalent dans la région et qui peuvent entraver

I Introduction

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la croissance et la nodulation de l’Acacia introduit. S’ensuit un isolement et une sélection des

souches spécifiques à Acacia saligna selon deux critères : leur efficience (capacité à former

des nodules et à fixer l’azote atmosphérique) et leur résistance à la température, aux pH

extrêmes et à la salinité pour assurer leur survie dans les conditions naturelles.

Les souches sélectionnées au laboratoire sont inoculées à de jeunes plants en pépinière. Après

quatre mois de croissance le taux de survie des plants et leurs hauteur moyenne est calculé

pour relevé l’effet de l’inoculation sur la croissance des plants d’Acacia saligna en pépinière,

puis ces derniers sont transférés sur le site de la sablière et divisés en deux lots, le premier

réinoculé contrairement au deuxième. Les souches sont jugées sur leur performance sur le

terrain dégradé pour sélectionner la ou les souches les plus performantes "in natura".

I Introduction

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Figure 1 : La Sablière de l’Ouest Sidi Lakhdar (Mostaganem) Photo prise lors d’une sortie de l’équipe de rhizobiologie

dans la région de Mostaganem (Novembre 2007)

Figure 2 : La fixation des dunes littorales dans la région de Bomo plage (Wilaya d’ Oran) par l’introduction de l’espèce

Acacia saligna

II Etude bibliographique

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1. Généralités sur les rhizobiums :

1.1. Définition et intérêt :

Rhizobium signifie étymologiquement « ce qui vit dans les racines »; ce sont des bactéries du

sol appartenant à la famille des Rhizobiaceae (classe des Proteobacteria), elles sont capables

de reconnaître, d’infecter et de noduler les racines des légumineuses pour établir une

interaction symbiotique dans le but de fixer biologiquement l’azote. L’infection se traduit par

la formation d’un organe appelé nodule, dans lequel elles vivent comme endosymbiotes et

réduisent l’azote atmosphérique en ammoniac (Schultze et Kondorosi, 1998 ; Albrecht et al.,

1999), forme facilement assimilable par les plantes, en échange la plante hôte procure à la

bactérie un microhabitat favorable et les substrats carbonés issus de la photosynthèse

(Dommergues et al., 1999).

Cette association est largement exploitée dans les pays où les sols sont très pauvres en azote et

l’utilisation des engrais azotés chimiques, très coûteuse (Leena, 2002).

Dans ce contexte l’association rhizobiums-légumineuses peut remplacer efficacement les

engrais azotés chimiques à la fois très onéreux et polluants (Canadian, 1993).

1.2. Les principales caractéristiques :

Les rhizobiums constituent 0.1 à 8 % de la flore bactérienne totale du sol (Sadorwsky et

Graham, 1998), ils se présentent sous forme de coccobacilles ou en bâtonnets réguliers de

0.6 à 0.8 µm de large sur 1 à 4 µm de long (Dommergues et Mangenot, 1970 ; Vincent, 1974),

aérobies strictes (Pelmont, 1993), Gram négatives et asporulés (Jordan, 1984 ; Bekki, 1983),

généralement très mobiles quand elles sont jeunes grâce à la présence d’un seul flagelle

polaire ou 2 à 6 flagelles péritriches (Bergey’s, 1984).

Ces bactéries se trouvent soit à l’état libre ou à l’état symbiotique sous forme de bactéroïdes

avec une taille dix fois plus grande. Ces derniers ont une forme en X, Y et T (Dommergues et

Mangenot, 1970).

Sur milieu YEM gélosé (Vincent, 1970), ces bactéries forment des colonies de 2 à 4 mm de

diamètre après 3 à 5 jours d’incubation, de couleur blanchâtres ou beiges, circulaires,

convexes, semi translucides ou opaques, élevées et mucilagineuses (Figure 3).

Les rhizobiums sont des bactéries mésophiles, leur température optimale de croissance se

situe entre 25 et 30 °C (Elkan, 1992). Certaines espèces peuvent se développer à des

températures allant de 40,5 °C à 42 °C, c’est le cas de Rhizobium meliloti qui peut se

développer à 42 °C (Affianha et Alexander, 1992). D’autres souches isolées des légumineuses

ligneuses au Kenya, en Inde et au Pakistan peuvent croître à des températures variant entre


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44°C et 50°C (Zahran, 1999). Cependant, la température de croissance des rhizobiums varie

en fonction de l’espèce et de la région d’isolement (Cacciari et al., 2003).

Si la plupart des rhizobiums préfèrent la neutralité (Jordan, 1984), d’autres au contraire

tolèrent des pH très bas (Vincent, 1977), c’est le cas de Bradyrhizobium japonicum qui

supporte des pH de l’ordre de 3.5 à 4 (Dommergues et Mangenot, 1970).

D’autre part il a été montré que des souches de Rhizobium peuvent croître à des pH alcalins

allant jusqu’à 12 (Kulkarni et al., 2000).

Figure 3 : Aspect des colonies de Rhizobium sur milieu YEM gélosé. www.wou.edu/~boomers/research/MMLID.htm


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1.3. La taxonomie des BNL (Bactéries Nodulants les Légumineuses) :

La taxonomie des Rhizobiaceae a connu de profonds remaniements au cours des dix dernières

années, du fait de l'abandon du spectre d'hôte comme important critère pris en compte pour la

définition des espèces et de l'adoption des critères généralement retenus pour la classification

bactérienne (Vandamme et al., 1996).

Dans la huitième édition de Bergey’s (1984), un seul genre de Rhizobium était décrit avec six

espèces en se basant sur le concept de groupe d’inoculation croisée. Cette notion de groupe

d’inoculation était fondée sur le caractère d’infectivité des souches c'est-à-dire de leur

aptitude à pénétrer dans la racine ou la tige de la légumineuse et y induire la formation d’un

nodule.

En 1982, Jordan classa les bactéries symbiotiques fixatrices de l’azote en deux genres

Rhizobium et Bradyrhizobium selon leur vitesse de croissance sur milieu synthétique.

L’isolement de rhizobiums associés aux légumineuses non-prises en compte auparavant, a

souvent conduit au bouleversement de la taxonomie des Rhizobiaceae. Ces modifications

constantes de la taxonomie ont conduit à la recherche des critères à prendre en compte pour la

description de nouveaux taxa. C’est ainsi qu’il a été proposé l’utilisation de la taxonomie

moderne qui se base sur plusieurs techniques moléculaires (Graham et al., 1991 ; Vandamme

et al., 1996), de chacune résulte des informations à des niveaux cellulaires différents

(protéines, acides gras, ADN…), elle est de ce fait appelée taxonomie polyphasique (critères

phylogénétiques, phénotypiques et génotypiques) (Zakhia et de Lajudie, 2006).

La combinaison de ces techniques a révélé à la fois des diversités génétiques au sein de

groupes de bactéries qui avaient été considérés comme homogènes et des relations entre des

groupes très éloignés.

Les chercheurs indiquent que la diversité des rhizobiums, comme celle de tous les autres

microorganismes est extrême (Prin et al., 1993), rappelons que « rhizobia » est un terme qui a

été donné aux bactéries du sol qui sont capables d’induire des nodules sur les légumineuses, et

d’y fixer l’azote atmosphérique en symbiose. Récemment ce terme a été substitué par le terme

de BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses) (Zakhia et al., 2004). En effet, des bactéries

appartenant à différents genres et classes taxonomiques sont actuellement connues pour leur

capacité symbiotique. Ainsi, le genre Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium,

Ochrobactrum, Allorhizobium, Azorhizobium, Methylobacterium, Bradyhizobium,

Blastobacter, Devosia (classe des α-protéobactéries), Burkholderia et Ralstonia (classe des

β-protéobactéries) (Garrity et al., 2004) ainsi que certaines δ-protéobactéries

(Benhizia et al., 2004), forment actuellement l’ensemble des bactéries connues comme


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symbiotes de légumineuses (Weir, 2006), la taxonomie la plus récente des BNL (Bactéries

Nodulant les Légumineuses) est illustré dans le Tableau n°1.


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Tableau n°1 : La taxonomie des BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses) (Weir, 2006) Rhizobium Rhizobium daejeonense Rhizobium etli Rhizobium galegae Rhizobium gallicum Rhizobium giardinii Rhizobium hainanense Rhizobium huautlense Rhizobium indigoferae Rhizobium leguminosarum Rhizobium loessense Rhizobium lusitanum Rhizobium mongolense Rhizobium sullae Rhizobium tropici Rhizobium undicola Rhizobium yanglingense

Frank, 1889

Quan et al., 2005 Segovia et al., 1993

Lindstrom, 1989 Amarger et al., 1997 Amarger et al., 1997

Chen et al., 1997 Wang et al., 1997 Wei et al., 2002

Frank, 1879; Frank, 1889 Ancien nom "Rhizobium huanglingense" Wei et al., 2003

Nouvelle espèce 3/11/06 Valverde, 2006 Vanberkum et al., 1998

Ancien nom "Rhizobium hedysari" Squartini et al., 2002 Martinez-romero et al., 1991

"Allorhizobium undicola" de Lajudie, 1998; Young et al., 2001 Tan et al., 2001

Mesorhizobium Mesorhizobium amorphae Mesorhizobium chacoense Mesorhizobium ciceri Mesorhizobium huakuii Mesorhizobium loti Mesorhizobium mediterraneum Mesorhizobium plurifarium Mesorhizobium septentrionale Meorhizobium temperatum Mesorhizobium tianshanense

Javis et al., 1997

Wang et al., 1999

Velazquez et al., 2001 "Rhizobium ciceri" Nour et al., 1994; Javis et al., 1997 "Rhizobium huakuii" Chen et al.,1991; Javis et al.,1997

"Rhizobium loti" Javis,1982; Javis,1997 "Rhizobium mediterraneum"Nour et al., 1995; Javis et al., 1997

de Lajudie et al., 1998 Gao et al., 2004 Gao et al., 2004

"Rhizobium tianshanense" Chen et al., 1995; Javis et al., 1997 Ensifer Ensifer abri Ensifer americanum Ensifer arboris Ensifer fredii Ensifer indiaense Ensifer kostiense Ensifer kummerowiae Ensifer medicae Ensifer meliloti Ensifer adhaerens Ensifer saheli Ensifer terangae Ensifer xinjiangense

Ancien nom Sinorhizobium Willems et al., 2002; Young, 2003

Ogasawara et al., 2003

Toledo et al., 2003 Nick, 1999 ; Young, 2003

"Rhizobium fredii" Scholla et al., 1984; Young, 2003 Ogasawara et al., 2003

Nick et al., 1999; Young, 2003 Wei et al., 2002; Young, 2003

Rome et al., 1996; Young, 2003 "Rhizobium meliloti" Dangeard, 1926; Young, 2003

"Sinorhizobium morelense" Wang et al., 2002; Young, 2003 "Sinorhizobium morelense" Wang et al, 2002; Young, 2003

de Lajudie et al., 1994; Young, 2003 Chen et al., 1988; Young, 2003


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Tableau n°1 (suite) : La taxonomie des BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses)

Bradyrhizobium Bradyrhizobium elkanii Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium liaoningense Bradyrhizobium yuanmingense Bradyrhizobium canariense

Jordan, 1982

Kuykendall et al., 1993

"Rhizobium japonicum" Kirchner, 1896; Jordan, 1982 Xu et al., 1995 Yao et al., 2002

Vinuesa et al., 2005 Azorhizobium Azorhizobium caulinodans Azorhizobium doebereinerae

Dreyfus et al., 1988 Dreyfus et al., 1988 "Azorhizobium johannae" de Souza, Moreira et al., 2006

Methylobacterium Methylobacterium nodulans

Jaurand et al., 2004 Burkholderia Burkholderia caribensis Burkholderia cepacia Burkholderia mimosarum Burkholderia phymatum Burkholderia tuberum

Vandamme et al., 2002 Vandamme et al., 2002

Nouvelle espèce 3/11/06 Chen et al., 2006 Vandamme et al., 2002 Vandamme et al., 2002

Cupriavidus Cupriavidus taiwanensis

Ancien nom "Wautersia" puis "Ralstonia"

Chen et al., 2001; Vandamme et Coenye, 2004

Devosia Devosia neptuniae

Rivas et al., 2003 Herbaspirillum Herbaspirillum lusitanum

Valverde et al., 2003 Ochrobactrum Ochrobactrum lupini

Trujillo et al., 2005 Phyllobacterium Phyllobacterium trifolii

Valverde et al., 2003


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2. Les légumineuses :

La famille des légumineuses (aussi appelées Fabacées), l’une des plus importantes du règne

végétal (16000-19000 espèces) comporte 750 genres différents (Dommergues et al., 1999).

Cette famille est connue pour les différents intérêts qu’elle offre :

- Utilisation en alimentation humaine et animale (graines, feuilles…).

- Amélioration de la fertilité du sol : par rotations ou culture mixte, en agroforesterie.

L’enfouissement des résidus de récolte ou des plantes entières de légumineuses riches en

azote permet d’accroitre la teneur en azote organique du sol. Les cultures qui succèdent aux

légumineuses peuvent ainsi bénéficier de l’azote fixé et libéré progressivement par la

décomposition des résidus enfouis dans le sol (Priefer et al., 2001).

- Augmentation de la couverture végétale pour lutter contre l’érosion et de ce fait la

désertification en plus de l’élévation du taux de la matière organique et enfin pour la

stabilisation et maintien des dunes.

- Réhabilitation écologique des sites dégradés, carencés, salés et milieux contaminés

(Requena et al., 2001).

- Revégétalisation des sites miniers après exploitation (Franco et de Faria, 1997).

- Phytostabilisation et bioremédiation (de Lajudie, 2006: communication personnelle).

En se basant sur les caractères floraux, la famille des légumineuses est subdivisée en trois

sous familles assez homogènes : les Papilionacées, les Césalpiniacées et les Mimosacées

qui comprend surtout les arbres des pays chauds, le genre Acacia en fait partie.

2.1 Le genre Acacia :

Le genre Acacia fait partie des légumineuses de la famille des Mimosacées. Il est composé de

1200 espèces réparties dans les différentes zones tropicales et subtropicales du monde

(Ndiaye et al., 2002). La plupart d’entre elles se trouvent dans les zones arides et semi arides.

Environ 850 sont endémique en Australie, 7 en Amérique du sud et 135 en Afrique, avec

quelque espèces qui se trouvent en Asie (Maslin et Striton, 1997).

En Algérie, les Acacia constituent une chaîne de forêts reliant les hauts plateaux et leurs

steppes (Tissouras, 2004).

Cet arbre souvent fixateur d’azote est appelé à jouer un rôle de premier plan en raison de son

adaptation aux milieux dégradés. Il constitue aussi une source fourragère non négligeable

(Dommergues et al., 1999).


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2.1.1. Acacia saligna

Appelé encore Acacia cyanophylla (Tackhlom, 1974), un arbre originaire du sud-ouest

d’Australie. Il a été introduit dans de nombreux pays hors de son aire naturelle, notamment en

Afrique du nord.

2.1.1.1. Description :

Un arbuste buissonnant, non épineux, multicaule, de 2 à 5 m de haut ; mais il peut également

se présenter sous la forme d’un arbre de 8 m de haut avec un seul tronc d’un diamètre

atteignant jusqu'à 30 cm (Figure 4).

L’écorce est lisse, de couleur rouge-brun au niveau des rameaux; sur les arbres âgés l’écorce

est gris-foncé et fissurée (Figure 5).

Feuilles: Phyllodes vert foncé à bleu-vert avec des nervures centrales très visibles, très

polymorphes, longs et étroits à lancéolés, droits ou falciformes, de 8 à 25 cm de long sur

0.4-0.2 cm de large, souvent plus grands à la base de l’arbre (Figure 6).

Fleurs: Jaune vif, groupées par 25-55 (jusqu’à 78) en glomérules sphériques de 5 à 10 mm de

diamètre portés par 2 à 10 pédoncules glabres, réunis en racèmes (Figure 7).

Fruits: Gousse étroites, de 4-6mm de large et 8-12cm de long, parfois légèrement arquées,

légèrement contractées entre les graines (Figure 8). Graines brun foncé à noir, brillantes, 5-6

mm de long sur 3.5 mm de large.

Longévité: Elle est de 7-15 ans avec des précipitations annuelles de 150-200 mm ; elle est

seulement de 5 ans si le sol est peu profond.

Propagation: Par graine, rejette aisément de souche et drageonne facilement, d’ou son intérêt

pour la fixation des dunes.

2.1.1.2. Exigences climatiques et édaphiques:

Acacia cyanophylla exige des précipitations annuelles de 300-1000 mm, il peut même

survivre à des précipitations annuelles inferieur à 200 mm (El Lakany, 1987). La température

moyenne du mois le plus chaud y est de 23 à 36 °C et la température du mois le plus

froid est de 4 à 9 °C. Acacia cyanophylla supporte des gelées très légères, mais souffre de

températures inférieures à -4°C (Crompton, 1992). Acacia cyanophylla n’a pas d’exigences

édaphiques particulières. Il se développe bien sur les sols sablonneux profonds. Il tolère les

sols salés et alcalins et a la réputation de bien résister aux embruns marins salés (Sheha,

1984).

2.1.1.3. Utilisation:

Acacia cyanophylla peut constituer des brise-vent efficaces en région semi-arides. Il a été

introduit avec succès pour la fixation des dunes dans différentes régions semi-arides.


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En Afrique du sud, Acacia cyanophylla a été très largement plantés et avec succès pour

stabiliser les dunes littorales. De plus sa propriété envahissante des zones littorales est due à

une excellente adaptation au climat, une fructification abondante et une grande aptitude à

drageonner. Il faut noter aussi qu’il présente de très faibles exigences nutritionnelles et un

bon potentiel fixateur d’azote (Witkowski, 1991a et b).

2.1.1.4. Symbiose fixatrice d’azote:

Rhizobiums compatibles: En 1961, Lange a rapporté que l’Acacia cyanophylla était nodulé

uniquement par des souches à croissance lente, des études plus récentes ont démontré que cet

arbre peut être nodulé par les deux types de souches : souches à croissance lente et celles à

croissance rapide (Marsudi et Glenn, 1999; Halimi et al., 2001). Cependant bien qu’Acacia

cyanophylla puisse former des nodules effectifs à la fois avec des rhizobiums à croissance

lente et à croissance rapide, il semble avec une préférence pour les Bradyrhizobium. Par

exemple, en Australie un grand nombre de légumineuses parmi eux les Acacia nodulent et

fixent l’azote essentiellement avec des rhizobiums du genre Bradyrhizobium (Lafay et

Burdon, 1998, 2001 ; Sprent, 2001).

Inoculation: Puisque l’effectivité des souches compatibles avec Acacia cyanophylla est très

variable, on peut supposer que dans certains sols, la proportion de rhizobiums compatibles

hautement effectifs est insuffisante: l’inoculation avec des souches sélectionnées et

compétitives est indispensable. Une deuxième raison pour inoculer Acacia cyanophylla est

que dans certains sols, notamment dans les sites arides, on ne trouve pratiquement pas de

rhizobiums compatibles avec Acacia cyanophylla (Dommergues et al., 1999).

Symbioses mycorhiziennes: On a montré expérimentalement qu’Acacia cyanophylla répond

positivement à l’infection par Glomus mosseae dans un sol déficient en phosphore (Nasr et

Diem, 1987). Mais lorsque la teneur du sol en phosphore assimilable atteint un certain seuil

(50 mg/kg), la croissance et la fixation de l’azote sont réduites par l’infection mycorhizienne

(Cornet et Diem, 1982 ; Nasr et Diem, 1987).


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Figure 4 : Arbre d’Acacia saligna Madau, 2005

Figure 5: Ecorce d’A. saligna Madau, 2005

Figure 7: Fleurs d’A. saligna Madau, 2005

Figure 6: Feuilles d’A. saligna Madau, 2005

Figure 8: Gousses d’A. saligna Madau, 2005


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3. La symbiose Rhizobium-Acacia :

Les rhizobia, comme on l’a vu précédemment sont des bactéries aérobies du sol appartenant à

la famille des Rhizobiaceae. Ces bactéries présentent la capacité de former une symbiose avec

des plantes de la famille des légumineuses dont l’Acacia, la légumineuse devient ainsi

indépendante de la fertilisation azotée.

En conditions limitant en azote combiné, les rhizobiums vont induire la formation de nodules

au niveau racinaire ou caulinaire des légumineuses. Ces nodules vont représenter de véritables

organes d’échange métabolique entre la bactérie et la plante.

Cette symbiose à bénéfice réciproque va permettre aux bactéries de profiter d’un micro

habitat exceptionnellement favorable; les légumineuses leur procurant un apport en substrats

carbonés issus de la photosynthèse. En échange, les bactéries vont fixer et réduire l’azote

atmosphérique en ammonium, directement assimilable par les plantes hôtes

(Broughton et al., 2003).

Ces interactions symbiotiques sont commandées par un échange de signaux entre les deux

partenaires (Mouchot, 2006) (Figure 9A et 9B).

Les bactéries s’approchent des racines par chimiotactisme, attirées par divers exsudats, et se

fixent à la surface racinaire à l’aide de protéines bactériennes adhésives ou de pilli. Elles se

multiplient et entament le processus de colonisation, selon diverses modalités allant de

l’entrée par des espaces intercellulaires (entre cellules corticales) à la pénétration par les poils

absorbants. Lors de la pénétration par les poils absorbants, ceux ci se courbent en crosse et

leur plasmalemme s’invagine pour former un canalicule tubulaire d’un diamètre de quelques

microns, rempli d’un mucilage polysaccharidique d’origine végétale: le cordon d’infection

(Duhoux et Nicole, 2004).

A la faveur d’une lyse localisée de la paroi, les bactéries colonisent ce cordon, qui croit,

progresse et se ramifie de cellule en cellule jusque dans le parenchyme cortical de la racine.

Les cellules de la plante reprennent leurs divisions et édifient une nodosité (Figure 10).

Au bout du cordon d’infection, les bactéries entrent dans les cellules en s’entourant d’une

membrane péribacteroïde, dérivée du plasmalemme elles se transforment alors en bactéroïdes

(augmentation de leur taille et déformation). Les bactéroïdes possèdent en effet une enzyme,

la nitrogénase qui catalyse la réduction de l’azote atmosphérique en azote ammoniacal

utilisable par les cellules végétales.


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Chez la bactérie existent des gènes, qu’on nomme gènes « nod » (Parnisk et Downie, 2003 ;

Perret et al., 2000). Le gène nodD code pour un apoactivateur de la transcription, la protéine

nodD, toujours synthétisée mais inactive.

Celle ci peut se lier à des molécules des exsudats racinaires : des flavonoïdes qui la rendent

capable d’activer les autres gènes nod, normalement silencieux (gènes nod inductibles). Les

produits de ces gènes nod ont des fonctions enzymatiques : ils synthétisent des petits

polymères de chitine, oligosaccharides. Ces oligosaccharides sont appelés facteurs nod, selon

le ou les types de facteurs nod qu’elle émet, une bactérie peut ou non être reconnue par une

légumineuse donnée. Des souches produisant différent facteurs nod peuvent donc interagir

avec diverses légumineuses.


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Figure 9: Association symbiotique entre bactérie et plante (Broughton et al., 2003) 9-A: Echange de signaux entre la bactérie et la plante 9-B: Formule chimique des Flavonoïdes

Flavonoïdes

Facteurs-Nod


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Poils absorbants

rhizobiums

Colonisation du poil absorbant

Courbure du poil absorbant

Pénétration par les poils absorbants

Formation des nodules

Figure 10 : Les étapes de formation de nodules. (Gage et Margolin, 2000)

b

a

c

d e

f

a, b, c, d et e : taille microscopique (microscope électronique). f : taille réelle.


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4. Les facteurs biotiques et abiotiques influant sur la nodulation :

4.1. Les facteurs abiotiques:

Le manque d’eau est le principal facteur limitant de la croissance et de la fixation

symbiotique d’azote dans les régions qui souffrent d’un climat aride et semi aride. Dans les

surfaces où l’évapotranspiration dépasse la pluviométrie, la salinité du sol pose un

problème sérieux, dû à l’accumulation du sel dans la couche superficielle du sol. Avec

l’effet combiné de la température ces facteurs peuvent avoir un effet destructif.

Les Acacia peuvent survivre dans ces conditions extrêmes grâce aux mécanismes associés

à la tolérance de la plante au manque d’eau, au sel et à la chaleur: quelques espèces

d’Acacia peuvent maintenir une absorption d’eau constante en développant des racines

profondes qui peuvent atteindre les niveaux humides du sol (Nilsen et al., 1983). Les

Acacia disposent aussi d’un mécanisme de réduction de la perte d’eau par la diminution de

la surface des feuilles : soit en limitant le développement des feuilles et /ou par la

sénescence des feuilles (Turner, 1986).

Les Acacia africains sont généralement à feuilles caduques qui laissent tomber leurs

feuilles durant la saison sèche.

Les Acacia australiens (Sous-famille hétérophyllum) produisent des feuilles bipennées

quand ils sont jeunes, à l’état adulte ces feuilles sont remplacées par des phyllodes

lignifiées accompagnées d’une cuticule épaisse. L’avantage de ces phyllodes réside dans

leur capacité à persister durant les longues périodes de sécheresse (Ullmann, 1989).

Cependant, les phyllodes peuvent répondre rapidement aux premières pluies et peuvent

commencer la photosynthèse sans utiliser les ressources en eau et en éléments nutritifs

pour produire un nouveau feuillage (Montagu et woo, 1999).

La fermeture du stomate est une autre méthode pour réduire la perte d’eau par la

transpiration (Turner, 1986), les Acacia ont une régulation stomatique quotidienne et

saisonnière (Nilsen et al., 1983, 1986 ; Ullmann, 1989 ; Montagu et woo, 1999).

La salinité réduit la photosynthèse et la croissance de la plante due aux effets complexes

des interactions osmotiques, ioniques et nutritionnelles qui reste encore peu connues

(Shannen, 1997). Chez les A. cyanophylla la salinité diminue la concentration des N, P et

K absorbés (Hatimi, 1999). La salinité du sol impose les effets spécifiques des ions sur la

plante, une haute concentration des ions (Na+, Cl-, SO4-2) s’accumule dans la cellule,

inactive les enzymes et inhibe la synthèse des protéines et la photosynthèse. La présence

d’une concentration élevée du sel dissous dans le sol engendre un potentiel osmotique


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négatif qui diminue le potentiel de l’eau. La balance générale de l’eau est cependant

affectée, le potentiel d’eau présent dans le sol et celui perdu par l’évaporation est

déséquilibré.

Pour lutter contre ces phénomènes plusieurs plantes sont capables d’un ajustement

osmotique (Taiz et Zeiger, 1998).

A une haute température la photosynthèse et la respiration sont inhibées, les plantes se

protègent de la température élevée par le même mécanisme de protection contre le manque

d’eau.

4.2. Les facteurs biotiques :

En plus des facteurs abiotiques qui inhibent la fixation symbiotique d’azote, d’autres

facteurs associés à la population bactérienne dans le sol peuvent avoir le même effet

(Räsänen, 2002).

L’absence de nodules effectifs sur les racines d’Acacia est due essentiellement à :

- Un sol pauvre en rhizobiums spécifiques à la plante hôte.

- Des souches indigènes induisent la formation de nodules ineffectifs.

- La formation de nodules est induite par les Agrobacterium.

L’absence totale des rhizobia dans un sol est très rare car les rhizobiums sont connus par

leurs capacités à persister dans un sol sous des conditions extrêmes même en absence de la

plante hôte (Barnet et al., 1985 ; Odee et al., 2002). L’absence des rhizobia compatibles

avec la plante hôte introduite est cependant un phénomène courant, la présence d’une

faible quantité de rhizobia compatibles est suffisante pour la nodulation.

L’inoculation des légumineuses avec seulement 50 cellules par gramme de sol augmente

significativement l’azote fixé (Turk et al., 1993).

Plusieurs expériences réalisées sur les Acacia ont montré que les nodules formés sur les

racines ne sont pas tous capable de fixer l’azote atmosphérique (Lawrie, 1983 ;

Barnet et al., 1985 ; Odee et al.,2002).

Les bactéries appartenant au genre Agrobacterium sont reliées de prés au rhizobia mais ces

derniers induisent la formation de tumeurs ou pseudonodules sur les racines. Les

Agrobacteria sont des organismes présentent dans la rhizosphère.

Les souches appartenant au genre Agrobacterium ont toujours été identifiées à partir des

nodules de racines de légumineuses du genre Acacia (khbaya et al., 1998 ; Nick, 1998 ; de

lajudie et al., 1999, Odee et al., 2002).

Cependant quand ces espèces sont réinoculées au laboratoire, elles n’induisent pas la

formation de nodules (Nick, 1998 ; Odee et al., 2002), seulement après une inoculation


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intense, quelque souches forment un petit nombre de nodules ineffectifs sur différentes

espèces d’Acacia (de Lajudie et al., 1999), de ce fait Agrobacterium représente un groupe

de bactéries formant des nodules non fixateurs d’azote.

5. Inoculation des légumineuses :

On a évoqué auparavant que la fixation d’azote par les légumineuses présente un intérêt

environnemental considérable, puisqu’elle apparaît comme un moyen très économique de

maintenir ou d’accroître le stock d’azote du sol. Cet effet favorable ne peut être obtenu

qu’en présence d’une souche de Rhizobium hautement efficiente (capable de fixer une

grande quantité d’azote atmosphérique). Si une telle souche n’existe pas ou que sa

concentration demeure faible dans un sol donné, il est nécessaire de l’introduire. Cette

opération qui est de pratique courante est connue sous le nom d’inoculation: " Inoculum :

ce terme désigne l’ensemble des entités biologiques appartenant à un même groupe

taxonomique (l’espèce), présentes dans le volume de sol considéré, potentiellement aptes à

provoquer une infection sur un hôte donné" (Dommergues et al., 1999).

5.1. Quand est-il nécessaire d’inoculer ?

Il existe des sols où la densité de la population rhizobienne est très faible, d’autre où les

espèces spécifiques sont absentes, ce qui constitue une menace pour l’établissement du

processus de la fixation biologique d’azote (Thrall et al., 2001).

L’inoculation de la légumineuse est le meilleur moyen pour assurer la présence de la

souche rhizobienne appropriée au bon moment et en nombre suffisant afin d’assurer une

infection rapide et effective.

Avant de procéder à l’inoculation, il est nécessaire de vérifier les points suivants :

5.1.1. Le rendement de la légumineuse introduite : l’apparence ou l’état physique de la

légumineuse reflètent la présence ou l’absence des souches effectives, si la légumineuse est

robuste, verte et ses racines sont nodulées, une population rhizobienne efficiente est

présente dans le sol. Cependant, si la plante est jaune, non vigoureuse mais dont les racines

sont bien nodulées, on suppose que soit les souches sont infectives et non efficientes ou

bien la croissance de la plante est affectée par des facteurs environnementaux adverses tels

que le pH.

Si la légumineuse est non vigoureuse et ses racines sont non nodulés, on suppose que les

souches spécifiques à la plante sont absentes ou que leurs nombre est insuffisant.


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Dans les deux cas, où la plante présente une faible croissance une inoculation est

nécessaire, cette dernière doit contribuer au bon développement de la plante (Cleyet –

Marel, 1988).

5.1.2. Le facteur limitant est l’azote : il faut prouver que la croissance de la légumineuse

est affectée par la faible concentration d’azote dans le sol et non pas par des facteurs

écologiques tel que la température, ou par les propriétés du sol, ou autre carences, telle que

la carence en phosphore.

5.1.3. L’absence de souches spécifiques à la légumineuse introduite se traduit par

l’absence de nodules, ou bien le non efficience des souches présentes dans le sol :

La présence de rhizobiums dans le sol peut être facilement détectée par une simple

observation des nodules sur les racines de la légumineuse plantée dans ce site. Cependant,

leur position et leur taille indiquent leur nombre et leur efficience.

La présence d’un nombre important de nodules de grande taille, condensés au sommet de

la racine principale prouve l’abondance des souches, tandis que les petits nodules dispersés

situés dans les racines secondaires ou finales est signe d’une mauvaise nodulation. La

nodulation est souvent retardée ou absente à cause de l’absence ou de la faible

concentration de la population rhizobienne spécifique à la plante hôte, d’où la nécessité

d’inoculer cette dernière (Beunard, 2006 : communication personnel).

5.2. Sélection des souches rhizobiennes appropriées :

L’inoculation des graines d’une légumineuse dans des conditions écologiques données

nécessite la sélection préalable d’une ou plusieurs souches (dans le cas d’inoculation

multiple) présentant les qualités nécessaires à l’établissement d’une symbiose à haut

pouvoir fixateur d’azote.

Le travail de sélection consiste donc à exploiter la variabilité des espèces et à choisir la

souche la plus intéressante parmi une collection aussi large que possible. Le problème le

plus délicat est de définir selon quels critères on décidera qu’une souche est supérieure aux

autres.

Les critères de choix de Rhizobium performants sont les suivants (Brockwell et

Bottomley, 1995) :

5.2.1. Infectivité, c’est à dire aptitude particulière à pénétrer dans les tissus racinaires et à

y induire la nodulation. Pour éviter l’échec dû à la non-réceptivité de la plante hôte

considérée vis-à-vis de la souche de Rhizobium utilisée, on a préconisé l’utilisation de

souches à large spectre qui peuvent infecter un grand nombre de variétés d’une même

espèce de légumineuses ou même un ensemble d’espèces. Il faut cependant souligner que


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les souches à large spectre peuvent s’avérer moins efficientes que les souches plus

spécifiques et il est en fait plus rentable de choisir les souches à haut potentiel fixateur

(Burdon et al., 1999 ; Thrall et al., 2000).

5.2.2 Efficience (effectivité), ou aptitude à fixer l’azote atmosphérique. Ce critère est

primordial et doit aller de pair avec une réceptivité parfaite de l’espèce de légumineuse

considérée vis-à-vis de la souche de Rhizobium.

5.2.3. Compétitivité ou aptitude à la compétition, c’est à dire aptitude à supplanter des

souches autochtones. Les souches sont d’abord sélectionnées pour leur aptitude à remplir

la fonction qui leur est assignée (formation de nodules puis fixation d’azote). Cependant,

pour qu’un organisme dont le comportement est satisfaisant dans les conditions du

laboratoire puisse être retenu, il est nécessaire qu’il demeure efficace dans le milieu

complexe ou il sera employé. Soumis à une intense concurrence, il devra donc se montrer

compétitif.

Une souche hautement antagoniste en boite de Pétri ou dans la terre stérilisée peut être

complètement inhibée par la microbiostase dans un environnement naturel ou même

rapidement détruit par des parasites ou des prédateurs. Il faut donc que les souches

sélectionnées possèdent une forte aptitude à la vie saprophytique.

5.2.4. Résistance à l’action létale de divers facteurs physiques (température élevée,

dessiccation, salinité), chimiques (pH, substances toxiques) ou biologiques (bactéries,

champignons)

5.2.5. Persistance des souches dans le sol : La réponse à l’inoculation qui est très

marquée lors du premier établissement d’une légumineuse, tend à s’atténuer au cours des

cultures successives en raison de la multiplication spontanée dans le sol de souches natives

à faible pouvoir fixateur qui concurrencent les souches introduites. Il apparaît nécessaire

dans ces conditions, de chercher à sélectionner des souches non seulement compétitives et

efficientes mais aussi caractérisées par leur aptitude à persister dans le sol (Bergersen,

1970).

5.2.6. Adaptation au niveau de fertilité des sols : Il est toujours souhaitable de tenir

compte lors de la sélection des souches, du niveau de fertilité des sols ou elles seront

utilisées.

En effet, il a été démontré que certaines souches sont plus aptes que d’autres à la fixation

en présence de fortes doses d’azote combiné ou dans des sols carencés en potassium

(Dommergues et Mangenot, 1970).


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5.2.7. Stabilité des caractères génétiques : L’idéal serait de comparer tous les isolats dans

leurs conditions réelles d’emploi, ce qui est généralement impossible pour des raisons de

place, de temps, et de main d’œuvre. Il est donc nécessaire de recourir à des tests

miniaturisés (des inoculations sur des plantules en tubes).

Quelles que soient les méthodes qui permettent de les obtenir, les souches qui ont montré

leur efficacité au laboratoire doivent encore être éprouvées dans des conditions qui tout en

étant proche de la réalité, permettent une bonne reproductibilité des résultats. Cette

nouvelle série d’essais, réalisés en serre ou dans des enceintes climatisées a pour but

principal d’étudier les capacités d’adaptation à l’environnement, de faire un choix ultime

parmi le matériel sélectionné et de préciser ses conditions d’emploi.

Il faut enfin, dans une dernière étape, réaliser de multiples essais en plein champ pour

vérifier que l’agent biologique choisi répond bien aux critères cités ci-dessus.

5.3. Le choix de la plante hôte :

Il est important de ne pas perdre de vue que si grandes que soient ses potentialités, un

microorganisme symbiotique ne remplira pleinement son rôle que si le fonctionnement de

la plante à laquelle il est associé n’est pas perturbé par des contraintes environnementales.

Ainsi il est sans intérêt d’essayer d’introduire dans un sol une souche de Rhizobium

sélectionnée si la légumineuse hôte est par ailleurs soumise à un stress hydrique ou autre

facteur défavorable à sa croissance.

Dans le cadre de réaménagement de sablière et fixation des dunes littorales, l’espèce

ligneuse choisie doit présenter certaines qualités particulières ; elle doit fixer activement

N2, c’est à dire à haut potentiel fixateur, car les sols dunaires sont très pauvres en azote;

elle doit avoir des exigences limitées en nutriments; elle doit tolérer les embruns et parfois

la salinité du sol; elle doit enfin être résistante au vent et à la sécheresse et si possible être

capable de capter l’eau des condensations occultes.

Le nombre d’espèces présentant ces caractéristiques est limité. Un acteur majeur est

l’ Acacia saligna grâce à la profondeur de son système racinaire, à sa croissance rapide et à

son adaptation au milieu dunaire (Hatimi et al., 2001).

5.4. La qualité d’un inoculum:

Pour qu’un inoculum utilisé sur champs donne de bon résultats, il doit être de bonne

qualité c’est à dire il doit respecter certaines conditions entre autre la taille de ce dernier et

la méthode d’utilisation.

Le stade physiologique de la culture bactérienne n’a aucune influence sur la nodulation et

la croissance des plants (Diouf et al., 2003).


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La présence dans un sol de souches compétitives indigènes de Rhizobium peut

compromettre l’inoculation d’une légumineuse par une souche plus performante mais

moins compétitive. Des essais au champ ont permis d’établir que pour obtenir une réponse

positive à un apport d’inoculation, il faut qu’au moins deux tiers du total des nodosités

soient colonisés par la souche introduite et pour qu’une souche étrangère de Rhizobium

colonise plus de la moitié des nodosités, il faut un apport bactérien mille fois plus élevé

que la densité de l’inoculum naturel (Thies et al., 1991). Dans de telles situations, il est

donc nécessaire d’utiliser un inoculum très concentré et de le placer de telle sorte qu’il

arrive au contact des racines avant ses concurrents. Cette condition peut être réalisée soit

par un enrobage des semences (inoculation direct), grâce auquel l’infection a lieu dés la

germination, soit par un inoculum liquide (inoculation indirect) pendant le séjour en

pépinière s’il s’agit de sujets à transplanter (Galiana et al., 1990).

La taille de l’inoculum joue un rôle important sur la nodulation et la croissance des plants,

une inoculation avec des cultures bactériennes contenant 109 à 1010 bactérie/ml sont les

conditions optimales pour avoir une nodulation et une croissance maximale des plants

(Diouf et al., 2003).

5.5. Origine des échecs de l’inoculation :

l’inoculation des plantes avec des Rhizobium sélectionnés ne donne pas toujours l’effet

positif escompté sur les légumineuses fixatrices d’azote sur lesquelles elle a été appliquée

(Brunck et al., 1991).

Une mauvaise connaissance du devenir des inoculums au champ est l’une des causes des

échecs observés. En effet, la réponse à l’inoculation peut dépendre :

De la qualité de l’inoculum :

- Un inoculum de mauvaise qualité : une densité insuffisante des microorganismes vivants,

des souches non compétitives ou bien non infectives ni effectives.

- Contact de l’inoculum avec les engrais ou pesticides toxiques.

Des propriétés du sol :

Milieu-sol défavorable : pH élevé ou faible, humidité insuffisante, température anormale,

excès d’azote combinés, carence en certains éléments (P, Ca, Mo, Co, B) mais aussi des

propriétés physiques défectueuses.

Des caractéristiques symbiotiques de la plante ; Plante hôte non réceptrice, ou l’échec peut

être dû à l’ensemble des composantes du système sol-plante-microorganismes (Brunck et

al., 1991).

III Matériel et méthodes

Page 25

1. Matériel :

1.1. Les isolats bactériens:

Les isolats ayant fait l’objet de notre étude proviennent des nodosités d’Acacia saligna

prélevées in situ pendant la saison pluvieuse (Novembre) dans la région littorale de Bomo

plage (wilaya d’Oran).

1.2. Matériel végétal :

Les graines d’Acacia saligna récoltées dans la région où cette espèce présente une bonne

croissance (Figure 11) ont été triées puis les sujets sains sont choisis.

1.3. Sol :

Des échantillons de sol (100g) sont prélevés dans quatre endroits différents du site dégradé à

20 cm de profondeur puis sont mélangés en un seul lot. Des analyses physico-chimiques sont

effectuées sur cet homogénat des quatre échantillons de sol (400g).

Figure 11 : Foret d’Acacia saligna dans la région de Mostaganem Photo prise lors d’une sortie de l’équipe de Rhizobiologie à Mostaganem

Source : Direction des forets de Mostaganem


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2. Méthodes :

2.1. Analyses physico-chimiques du sol : (Annexe 1)

2.1.1. Analyses physiques :

a- Analyse granulométrique : (Rouiller et al., 1994)

L’analyse granulométrique du sol ou encore appelée analyse mécanique, ou analyse physique

consiste à classer les éléments du sol d’après leur grosseur et à déterminer le pourcentage de

chaque fraction (sable, limon, argile).

L’analyse granulométrique a pour but de définir la texture d’un sol, c’est à dire le pourcentage

de ces divers constituants, et par là d’expliquer les propriétés physiques de ce sol : son

comportement vis à vis de l’eau, de l’air et des racines et d’évaluer sa stabilité structurale

c'est-à-dire la solidité de l’état de la structure du sol et sa résistance aux agents de

dégradation.

On utilise pour cette analyse de la terre fine obtenue par tamisage au tamis à mailles 2mm, on

élimine la matière organique par un oxydant énergique (H2O2), la durée d’exposition dépend

de la teneur en matière organique (24h à 48h). Les particules minérales sont ensuite dispersées

à l’aide d’un dispersant alcalin (hexametaphosphate de sodium).

Les particules grossières de diametre superieur à 50 mm sont séparées par tamisage, les

particules moyennes et fines sont obtenues par la mesure de la vitesse de sédimentation.

D’après le triangle des textures, on définit la texture de notre sol (Annexe n°2).

b- L’humidité : (Soltner, 1974)

L’échantillon de sol est pesé une première fois (P1), puis le sol est séché à l’étuve à une

température de 160°C pendant 24h, par la suite il est pesé une deuxième fois (P2).

L’humidité est calculée comme suite:

P1 : le poids du sol humide.

P2 : le poids du sol séché.

c- Mesure du pH : (Callot-Dupuis, 1980)

Au 20g de terre fine (séchée à l’air) y sont ajoutés 50ml d’eau distillée (pour mesurer le

pHeau). Le contenu est agité pendant quelques minutes, puis laissé à reposer 2h. Le pH est

ensuite mesuré à l’aide d’un pH-mètre après une brève agitation.

H% = (P1-P2) x 100 / P2


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2.1.2. Analyses chimiques :

Sur l’homogénat des quatre échantillons prélevés (à 20 cm de profondeur), on a effectué la

mesure de la salinité, le dosage du calcaire total et actif, et enfin le dosage de carbone et de la

matière organique dans le sol.

a- Mesure de la conductivité électrique : (Aubert, 1978)

Le principe consiste à déterminer la conductivité électrique (C. E.) de l’eau pour déterminer la

salinité de l’extrait du sol. Elle est effectuée en mélangeant 1/5 du sol avec 4/5 d’eau distillée.

Après une agitation de quelque minute la solution est chauffée à une température T (25°C),

une première lecture est réalisée à cette température (CT), puis chauffer à une température T’

(35°C) une deuxième lecture est réalisé avec le conductivimètre (CT’ ).

Le coefficient de température ß est calculé comme suite :

Le conductivimètre est réglé à la valeur ß et la mesure de la C.E. est effectuée ; cette

dernière s’exprime en milli Siemens (mS).

On évaluera le degré de la salinité du sol en se référant aux normes internationales

(Annexe n°3).

b-Dosage du calcaire total : (Callot-Dupuis, 1980)

Le calcaire n’est pas un constituant toujours présent dans le sol. Par contre pratiquement tous

les sols contiennent du calcium si peu soit-il, cet élément se trouvant en particulier fixé sur

l’argile sous forme d’ion calcique ou en solution sous forme de sels solubles de calcium.

Le calcaire ou carbonate de calcium, CaCO3, est un sel insoluble. Mais l’eau chargée de gaz

carbonique peut le dissoudre lentement le transformant en un sel soluble, le bicarbonate de

calcium. C’est ainsi que peu à peu le calcaire disparaît d’un sol donné. Mais la solution du sol,

et l’argile gardent très longtemps du calcium provenant de la dissolution du calcaire.

On utilise la propriété du carbonate de calcium qui se décompose sous l’action d’un acide

(HCl) en eau et gaz carbonique, ce dernier est recueilli dans un tube gradué en ml.

p : poids du CaCO3 pure utilisé pour l’étalonnage.

V: volume du gaz carbonique dégagé par l’échantillon du sol.

P : poids de l’échantillon du sol.

v : volume de gaz carbonique dégagé par le CaCO3.

ß = (CT’ –CT) x 100 / (T’ –T) x CT

CaCO3% = (p x V) x100 / (P x v)


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c- Dosage du calcaire actif : (Drouineau, 1942)

Dans le sol, une partie plus ou moins importante de calcaire total se trouve à l’état de fines

particules actives pour les végétaux, cette fraction est facilement solubilisée par les eaux

riches en gaz carbonique.

Pour le dosage du calcaire actif, on utilise la propriété du calcium se combinant aux oxalates

d’ammonium pour donner de l’oxalate de calcium insoluble.

L’excès de solution d’oxalate d’ammonium et ensuite dosé par une solution de permanganate

de potassium en milieu sulfurique.

La teneur en calcaire actif exprimée en % est obtenue à partir de la formule suivante:

N-n: correspond à la quantité d’oxalate de calcium précipité, donc à la quantité d’oxalate

d’ammonium qui a réagi avec le calcaire actif.

N: nombre de ml KMnO4 utilisés pour titrer la solution d’oxalate d’ammonium.

n: nombre de ml KMnO4 utilisés pour titrer l’extrait du sol

d- Carbone total et matière organique : (Méthode Anne, 1945)

La teneur en matière organique totale du sol s’obtient généralement en dosant la teneur en

carbone. On estime que le rapport matière organique / carbone est à peu prés constant et égal

à MO/C =1.72.

Le carbone de la matière organique est oxydé par un mélange de bichromate de potassium et

d’acide sulfurique (H2SO4). On admet que l’oxygène consommé est proportionnel au carbone

que l’on veut doser.

L’excès de bichromate inutilisé dans la réaction est dosé par le sel de mohr.

2.2. Collection et isolement des souches bactériennes :

2.2.1. Collection :

Les souches bactériennes utilisées pour cette étude sont isolées à partir des nodules d’Acacia

saligna qui proviennent de la région littorale de Bomo plage, cette région présente les

caractéristiques (climat, sol) proche de la région étudiée. Les nodosités d’Acacia saligna sont

collectées "in situ". Les racines sont déterrées puis transportées rapidement au laboratoire.

2 KMnO4 + 5(NH4)2C2O4 + 8H2SO4 2Mn SO4 + K2 SO4 + 5(NH4)2SO4 + 10CO2 + 8H2O

Calcaire actif % = (N-n) x 1.25


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2.2.2. Isolement des bactéries :

Les racines d’Acacia saligna sont rincées à l’eau distillée pour éliminer le sable.

Chaque nodule est détaché de la racine à l’aide d’un scalpel, les nodules sont rincés dans de

l’eau distillée puis dans du surfactant non-ionic "Tween 80" (100 ml/l) pour éliminer toute

trace de sable.

Les nodules sont stérilisés en surface par immersion dans du chlorure mercurique Hg Cl2 à

0,25 % pendant 4 secondes.

Chaque nodule est rincé dans de l’eau distillée stérile 10 à 15 fois, puis écrasé dans des boites

contenant YEM solide (Annexe n°4 : composition milieu YEM).

2.3. Purification et conservation :

2.3.1. Observation macroscopique :

Les boites de Pétri sont incubées à 28°C entre 3 à 10 jours. Les colonies isolées sont

ensemencées sur milieu YEM solide, et incubées à 28°C pendant 2 à 3 jours, une observation

macroscopique permet de déterminer la couleur, la taille, la forme, le contour des colonies,

ainsi que la pureté des souches.

Les colonies du Rhizobium sur milieu YEM solide sont de couleur blanchâtres ou beiges,

circulaires, convexes, semi translucides, élevées et mucilagineuses (Dommergues et

Mangenot, 1970).

2.3.2. Observation microscopique :

Suite à une coloration de Gram (Annexe n°5), l’observation microscopique permet de

déterminer le Gram, la morphologie et la pureté des souches. Les Rhizobium sont des

bactéries Gram négatif en forme de coccobacilles ou de bâtonnet de 0.6 à 0.8 µm de large, et

1 à 4 µm de long (Dommergues et Mangenot, 1970).

2.3.3. Test de nodulation :

Le test de nodulation est un critère important dans la caractérisation des Rhizobium, les isolats

extraits des nodosités d’Acacia saligna ne peuvent être identifiés comme rhizobia qu’après

avoir prouver leur capacité à former des nodosités sur leur plante hôte en conditions

bactériologiques contrôlées (Graham et al., 1991).

Désinfection et scarification des graines :

Les graines d’Acacia saligna sont désinfectées à l’hypochlorite de sodium (12°) pendant 15

min, puis rincées 6 à 10 fois à l’eau distillée stérile afin d’éliminer les traces du désinfectant.

Elles sont ensuite scarifiées à l’aide d’une aiguille chauffée à blanc puis mises à germer


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aseptiquement sur de l’eau gélosée (0.8%) (Annexe n°6) (Tillard et Drevon, 1988) ; les boites

ainsi préparées sont mises à l’obscurité, à température ambiante.

Culture et inoculation des plantules "in vitro" :

Après germination des graines, l’ensemble des plantules obtenues dont la longueur des

radicelles ne dépasse pas 2 cm (Figure 12), sont transférées dans des tubes à essai (Longueur

18 cm, diamètre 2 cm, et une capacité de 35 ml) contenant une solution nutritive décrite par

Broughton et Dilworth (1971) (Annexe n°7). Après leur inoculation par 2 ml de la suspension

bactérienne de la souche à identifier d’une concentration de 15 x 108 cellules/ml (cette

concentration est obtenue en comparant la turbidité du milieu ensemencé avec celle de

Mac Farland n°05 (Annexe n°8), les plantules sont transférées dans une chambre de culture

(de type Sanyo Electrobiomedical. Co. LTd. Prints. Japon) à une température de 25 °C ± 1,

une photopériodicité de 16 heures et une intensité lumineuse de 2000 luxes. Les racines

doivent être maintenues à l’obscurité dans une boite en carton trouée permettant l’introduction

de la moitié inférieure des tubes.

Une agitation quotidienne est réalisée pour faciliter le contact des bactéries avec les racines

des plantules. Il est nécessaire d’avoir des plantules non inoculées, qui serviront de témoins.

Un test de nodulation sur support sable stérile est aussi réalisé, des pots sont remplis par 100g

de sable stérilisé, les graines germées sont placées et inoculées avec 2ml d’une suspension

bactérienne d’une concentration de 15 x 108 cellules/ml de chaque souche testée. Les pots

sont ensuite placés dans une chambre de culture, les plantules sont arrosées chaque deux jour

avec une solution dépourvue d’azote (Annexe n°7). Des pots témoin non inoculés sont aussi

préparés.

Figure 12 : Les graines d’A. saligna après trois jours de germination à l’obscurité et à température ambiante


Page 31

2.3.4. Conservation des souches :

Les colonies pures dont les cellules sont des bacilles courts Gram négatif, sont repiquées

stérilement sur milieu YEM incliné et incubées à 28°C pendant 48 à 72 h. Les tubes sont

ensuite conservés à 4°C pour une durée de 3 mois. Pour une conservation de longue durée

dépassant les 6 mois, les souches sont conservées à –20°C dans du YEM liquide ensemencé

par ces souches et additionné de glycérol à un ratio de 1 : 1.

2.4. Effet des différents facteurs environnementaux sur les isolats :

Des facteurs environnementaux peuvent avoir un effet limitant sur l’établissement de la

symbiose entre la légumineuse et les souches introduites. Parmi ces facteurs la température et

la salinité ainsi que le pH sont les principales contraintes qui prévalent dans les régions à

climat méditerranéen semi aride (Caravaca et al., 2002) d’où l’intérêt d’utiliser des souches

résistantes.

2.4.1. Effet de la température :

Afin de déterminer l’effet de la température sur la croissance des isolats, les boites sont

ensemencées par étalement de 50 µl de la suspension bactérienne d’une concentration de

15 x 108 cellules/ml et incubées à différentes températures : 4°C, 7°C, 10°C, 28°C, 35°C,

40°C et 45°C.

2.4.2. Effet du pH :

Le milieu YEM préparé est ajusté à différent pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 et 12. Les boites

sont ensemencées avec les différents isolats de la même façon que pour le test de la

température et sont incubées à 28°C.

2.4.3. Effet de la salinité :

Ce test permet de sélectionner les souches microbiennes les plus résistantes à la salinité.

L’évaluation de la tolérance au sel est effectuée par culture des souches sur du milieu YEM

gélosé renfermant des teneurs croissante en NaCl à raison de: 1%, 2%, 3%, 4%, 5% et 7%.

Trois répétitions sont réalisées pour chaque traitement et la croissance des souches est évaluée

par l’apparition de colonies dans les boites de Pétri.

2.5. Séquençage partiel du gène 16S :

L’étude de l’opéron ribosomique codant pour les ARNr 16S constitue un outil de choix pour

la classification des bactéries grâce à sa présence chez toutes les bactéries, sa fonction

constante et la présence de zones très conservées ainsi que des parties à séquence variable

(Woese, 1987 ; Schleifer et Ludwig, 1989 ; Stackebrandt et Goebel, 1994).


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Un séquençage partiel du gène 16S des souches isolées est réalisé au Laboratoire des

Symbioses Tropical et Méditerranéen à Montpellier.

Presque la totalité du 16S ADN ribosomal est amplifié en utilisant les amorces universelles du

16S ADNr eubactérien FGPS6 et FGPS1509 (Normand, 1992).

Le volume du mélange réactionnel est de 25µl contenant : 2µl de l’ADN, 13.85 µl de d’eau

Milli-Q stérile, 5µlTampon X5 (Invitrogen, USA), 2 µl DNTPs (2.5 mM), 1 µl de chaque

amorce (20µM) et 0.15 µl de Taq polymerase. Un control négatif est utilisé : remplacement

du 2µl d’ADN par de l’eau.

La réaction de séquence est réalisée grâce au thermocycleur (Perkin Elmer 2400) en utilisant

le programme suivant : une dénaturation initiale à 96°C pendant 2 minutes, puis 36 cycles

avec les étapes suivantes : dénaturation (30 secondes à 94°C), hybridation (30 secondes à

56°C), élongation (2 minutes à 72°C) puis une étape finale d’élongation (7 minutes à 72°C).

7- Séquençage partiel de l’ADNr 16S : Le produit PCR du 16S sont soumis à une

électrophorèse sur gel d’agarose à 0.7%, les bandes sont découpées et purifiées en utilisant un

kit d’extraction de gel QIAquick (Qiagen, Courtaboeuf, France) et séquencées en utilisant

deux amorces FGPS6 et FGPS1509.

Les séquences du 16S ADNr sont corrigées, alignées et analysées avec le logiciel Chromas

pro 1.23 et alignées en utilisant le logiciel Clustal X.

2.6. Sélection de souches performantes :

2.6.1. Inoculation des plantes en conditions contrôlées:

L’amélioration de la symbiose Rhizobium-Acacia passe obligatoirement par la recherche des

souches qui permettent une bonne nodulation et par conséquence une meilleure croissance de

la plante dans des conditions optimisées pour passer ensuite aux conditions naturelles.

Une inoculation en pots est réalisée afin d’évaluer l’effet d’un apport d’inoculum de chaque

souche sur la croissance d’A. saligna, les essais ont été conduits en serre réglée aux conditions

climatiques méditerranéennes.

Le sol prélevé à partir du site destiné à être revégétaliser est autoclavé 3 fois à intervalle de

24 h entre chaque stérilisation. Des graines germées sont planté dans des pots contenant 200g

du sol stérilisé, chaque pot est inoculé par 5 ml d’une suspension liquide de la souche à la

phase exponentielle à une concentration de 15 x 108 cellules/ml (Mac Farland n°05) (Diouf et

al., 2003 ; Galiana et al., 1994 ). Des pots témoin non inoculé sont préparés, les plantes sont

arrosées un jour sur deux avec la solution nutritive dépourvu d’azote (Annexe n°7).


Page 33

Une deuxième inoculation est effectué une semaine après la levée pour assurer l’établissement

de la symbiose (Benbrahim et al., 1998).

2.6.2. Estimation de la croissance :

Après quatre mois de culture sous serre les plantes sont déterrées, le poids sec de la partie

aérienne (PSA) et celui de la partie racinaire (PSR) des plantes nodulées sont mesurés; le

poids sec est obtenu par un séchage des racines et les parties aériennes (tiges et feuilles) à

70°C pendant 48h. Cette méthode permet de comparer l’efficience des souches inoculées sur

des plantes poussant sur un milieu sans azote (Domenach et Wery, 1989).

2.6.3. Analyse statistique :

Toutes les valeurs du test d’inoculation représentent la moyenne de cinq répétitions. Les

résultats ont fait l’objet d’une analyse de variance à un seul facteur (effet souche). Elle

s’applique lorsqu’on veut comparer les moyennes obtenues pour une variable donnée chez

différentes populations, l’analyse de variance permet de distinguer comment se répartit la

variation totale observée et de voir plus précisément si la variation observée entre les

différentes populations (ou niveaux) du facteur contrôlé testé a un poids nettement plus

important que les variations observées au sein des populations (à l’intérieur des niveaux) due

à l’erreur résiduelle (Galiana, 2007 : communication personnelle).

Le seuil de la probabilité utilisé pour déterminer la signifiance est P < 0.05, quand le logiciel

STATISTICA indique un effet significatif, les moyennes sont comparées avec le test de

Newman & Keuls.

La sélection des souches destinées à être utilisées comme inoculum en pépinière est basée sur

deux critères :

- Souches qui permettent une bonne nodulation (nodules actifs) et par conséquence une

meilleur croissance de la plante hôte en condition contrôlés (souches efficientes).

- Souches résistantes aux conditions édaphiques extrêmes de pH, température et salinité afin

d’assurer la survie de cette dernière et le fonctionnement de la symbiose dans les conditions

naturelles.

2.7. Evaluation de la symbiose Rhizobium-Acacia saligna in situ :

2.7.1. Inoculation des plants en pépinière (Mai 2007) :

Les plants d’Acacia saligna sont produits dans une pépinière dans des conditions routinières,

c'est-à-dire que le sol de la pépinière n’a pas été traité avant d’être inoculés avec les souches

sélectionnés, l’inoculation s’est faite par la méthode indirecte (un inoculum liquide au


Page 34

moment du semi) car ce dernier à été immédiatement utilisé et non pas conservé, puis les

plants ont été transférés sur champs après 6 mois d’entreposage en pépinière.

Les graines sont scarifiées à l’eau bouillante puis sont laissées à refroidir dans l’eau pendant

une nuit. Chaque graine est plantée dans un sachet en plastique (17 cm x 9.5 cm). Au semis,

les plants sont inoculés avec 5 ml d’une culture pure de rhizobium incubée pendant une

semaine et contenant 15 x 108 bactéries/ml (Diouf et al., 2003), une semaine après la levée,

les plantules ont reçu une deuxième inoculation de la même façon que la précédente.

Nous avons choisi de tester l’infectivité et l’efficience au champ de trois souches

sélectionnées en serre, 200 plants sont inoculés avec chaque souche sélectionnée et 200 plants

témoins non inoculés sont aussi préparés.

Après quatre mois de croissance en pépinière le pourcentage de survie des plants ainsi que

leurs hauteurs moyennes sont calculés.

2.7.2. Transfert des plants sur champs:

Après six mois de croissance en pépinière (en Octobre 2007), les plants sont transférés sur le

site destiné à être revégétalisé (Figure 13).

La parcelle de plantation est entourés par des roseaux pour protéger les plants contre l’érosion

éolienne et les troupeaux d’ovins, le sol est retourné pour extraire les cailloux, ensuite les

plants sont mis en terre suivant le dispositif ci-dessous et sont irrigués selon les besoins des

plants (Figure 13 et 14).

Figure 13 : Le site de la sablière avant le réaménagement.

Photo prise en Octobre 2007


Page 35

Après quatre mois de croissance des plants sur site, la hauteur moyenne de ces derniers est

estimée et leur état physiologique est relevé afin de comparer les plants inoculés aux plants

témoins non inoculés et aux plants d’Eucalyptus non fixateurs.

1, 2, 3 : Plants inoculés en pépinière avec les souches ASB13, ASB7, ASB5 respectivement. 1’, 2’, 3’ : Plants réinoculés sur champs avec les mêmes souches. Témoin : Plants non inoculés. m : mètre.

24m

3 m

Figure 14 : Protocole d’inoculation suivi in situ sur le site de la sablière.

A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A E E E E E E E E E A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A E E E E E E E E E A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A E E E E E E E E E A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A A A A A E A A A A E E E E E E E E E 3 m

N

A : Acacia saligna E : Eucalyptus urophylla

Témoin

1 1’

2

3

2’

3’

Témoin

12m

60m

15m

IV Etat des lieux

Page 36

1. Etat des lieux - Caractéristiques du site étudié :

1.1. Localisation du site :

Le site destiné à être revégétalisé est situé à environ 7km au nord de Sidi Lakhdar à 50

km vers l’est de Mostaganem (Figure 15), la sablière s’étend sur une superficie de 76

hectares, dont 43 hectares sont en état de reboisement, 8 hectares sont au cours

d’exploitation et 25 hectares sont encore à l’état natif.

1.2. Le climat :

D’après la pluviométrie (qui ne dépasse pas 600 mm) (ONM : Organisation Nationale

de Météo, 2007) et les températures des saisons sèches et humides enregistrées ces cinq

dernières années (Tableau n°2), la région est caractérisée par un climat méditerranéen

sec.

Aschmann (1973) a défini les régions à climat méditerranéen dans le monde comme des

zones dans lesquelles au moins 65% de la précipitation tombe en hiver, la précipitation

annuelle oscille entre 275 et 900 mm et la température moyenne en hiver est inferieure à

15°c.

Dans les régions méditerranéennes, indépendamment de la quantité de la précipitation

moyenne annuelle, il existe toujours une période d’aridité ou de sécheresse estivale

(Rivas-Martinez, 1981 ; Godard et Tabeaud, 2004), et elles sont caractérisées par des

hivers humides et tempérés et des étés chauds et secs.

Figure 15: Localisation de la sablière destinée à être revégétalisée.

Sablière de l’ouest

IV Etat des lieux

Page 37

Tableau n°2 : Les températures et la pluviométrie enregistrées les cinq dernières années dans la région de Mostaganem.

Par l’ONM (Organisation Nationale de la Météo)

1.3. L’historique végétal :

Avant l’exploitation du sable le site présentait une végétation autochtone qui était

constituée essentiellement par des Retama raetam, une espèce ligneuse pionnière des

sols dunaires sablonneux (Figure 16).

Année

Température (°C)

Pluviométrie (mm)

2002 Mois le plus chaud : 27°C Mois le plus froid : 10.5°C

614 mm

2003 Mois le plus chaud : 26.5°C Mois le plus froid : 11.8°C

255 mm


220 mm


393 mm


310 mm

Figure 16 : La légumineuse Retama raetam la plus dominante dans le site de la sablière avant l’exploitation du sable.

Source : La foresterie de Mostaganem

V Résultats et discussion

Page 38

1. Analyses physico-chimiques du sol :

D’après les analyses physico-chimiques du sol, ce dernier à une texture sablonneuse

(Tableau n°03), ce qui fait de lui un sol bien aéré, facile à travailler, mais pauvre en réserve

d’eau (humidité = 2.87%), il est alcalin grâce à la présence d’une concentration élevée en

calcaire (51.22%) ; non salé (CE = 0.06 mS) d’après Les normes internationaux. Il a été noté

une faible activité microbienne exprimée en faible concentration en matière organique, de

plus ce sol est pauvre en éléments nutritifs ce qui est une des caractéristiques des sols

sablonneux.

Tableau n°03 : Le résultat de l’analyse de l’homogénat de quatre échantillons de sol prélevés du site dégradé à 20cm de profondeur, réalisé à l’INRA (Institut National de la Recherche Agronomique) de Sidi Bel Abbes au

mois de Mai 2007.

En étudiant les deux paramètres (climat et sol), on constate que la région reçois des

précipitations très faibles, le sol est pauvre en éléments nutritifs, le pH est alcalin. Ces

conditions défavorables constituent non seulement une contrainte à la végétation, mais

également entravent le développement de la flore microbienne du sol indispensable pour la

croissance et la nutrition des plantes (Hatimi et al., 2001) d’où l’intérêt de sélectionner des

souches performantes.

L’humidité Conductivité électrique

pH Calcaire total

Calcaire actif

Matière organique

Carbone total

Granulométrie

2.87 % 0.06 mS 9.45 51.22 % 0.25 % 0.18 % 0.092 %

Sable grossier : 2.66%

Sable moyen : 58.83% Sable fin : 36.2%

Limon grossier : 1%

Limon fin : 3.46% Argile : 0 %


Page 39

2. Vérification de la pureté des isolats :

2.1. Caractéristiques morphologiques et microscopiques des isolats:

18 souches sont isolées des nodules d’A. saligna (Tableau n°4), Les colonies obtenues après

purification des différents isolats sur milieu YEM présentent les mêmes caractéristiques

macroscopiques (Figure 17), elles apparaissent homogènes le long des stries, elles sont

circulaires de 2 à 3 mm de diamètre, de couleur blanchâtre, compactes pour la plupart,

opaques, de surface lisse et visqueuse à contour régulier et marquées par une très forte

viscosité qui augmente avec le temps d’incubation surtout chez les isolats ASB3, ASB6,

ASB8, ASB9, ASB12, ASB13 (Figure 18). Cette viscosité est due à une production massive

d’exopolysaccharide (Zahran, 1994). Ces caractéristiques morphologiques obtenues sont

semblables à ceux des rhizobiums décrits par de Lajudie et al., 2004.

L’observation microscopique des isolats après coloration de Gram montre qu’ils présentent

une forme coccobacillaire pour les isolats ASB1, ASB3, ASB6, ASB8, ASB9, ASB10,

ASB11, ASB16, ASB17, à bacilles pour les isolats ASB2, ASB4, ASB5, ASB7, ASB12,

ASB13, ASB14, ASB15, ASB18, de couleur rose (Gram-), ce qui confirme la pureté de nos

isolats.

Figure 17: Aspect macroscopique de la souche ASB11 sur milieu YEM après 72h d’incubation à 28°C


Page 40

2.2. Test de nodulation :

La formation de nodules sur les racines de la plante hôte après 48 jours d’incubation confirme

l’appartenance des souches isolées au groupe des BNL (Bactéries Nodulant les

Légumineuses) (Figure 19) (Tableau n°04).

Figure 18: Aspect visqueux de la souche ASB3 après une semaine d’incubation sur milieu YEM à 28°C

ASB1 ASB2

Figure 19 : Formation des nodules sur des racines des plantes d’Acacia saligna inoculées sur sable stérile après 48 jours de croissance dans la chambre de culture


Page 41

3. Effet des différents facteurs sur la croissance des isolats :

Certains auteurs (Zahran, 1999 ; Priefer et al., 2001 ; Brigido et al., 2007 ; Chimining’wa et

Vessey, 2006) ont montré que les facteurs environnementaux tels que la température, la

salinité et le pH sont des facteurs limitant de la croissance et de l’activité des deux partenaires

de la symbiose.

Afin d’assurer l’établissement de la symbiose dans les conditions naturelles, il est nécessaire

de sélectionner des souches résistantes aux différents facteurs environnementaux

(température, pH et salinité).

3.1. Effet de la température :

Ce test a été effectué dans l’objectif de déterminer la croissance des isolats à différentes

températures, et de ce fait sélectionner ceux qui présentent une croissance à des températures

extrêmes.

Les résultats obtenus montrent que toutes les souches présentent une meilleure croissance à

28 °C, qui représente la température de croissance optimale des rhizobiums (Dommergues et

Mangenot, 1970 ; Dommergues et al., 1999).

Aucune croissance n’est signalée à 4 °C pour toutes les souches, c’est une température de

conservation.

A 7 °C seules les deux souches ASB2 et ASB4 présentent une bonne croissance, tandis que

les souches ASB9, ASB16 et ASB18 présentent une croissance moyenne.

A 10 °C la croissance est observée chez toutes les souches.

A 35 °C, ASB2 et ASB4 sont les seules souches qui ne présentent aucune croissance, tandis

que les autres souches présentent une bonne croissance à cette température, avec un degré

moins important pour les deux souches ASB14 et ASB18.

A 40°C la souche ASB11 présente une bonne croissance, tandis qu’elle est légèrement

affectée pour les souches ASB1, ASB3, ASB5, ASB6, ASB7, ASB8, ASB9, ASB10, ASB11,

ASB12, ASB13, ASB15, ASB16, ASB17 est totalement inhibée pour les souches ASB2,

ASB4, ASB14 et ASB18.

La capacité des souches de rhizobium à croître à 40 °C a été déjà démontrée par Zarhari et al.,

en 2000 pour des souches isolées à partir de 4 espèces d’Acacia : A. seyal, A. tortilis,

A. senegal et A. saligna.

A 45 °C la croissance n’est observée que chez trois isolats ASB9, ASB11, ASB16.

La majorité des souches présentent une résistance à une température supérieure ou égale à

40°C, ce résultat peut être expliqué par le fait que ces souches ont été isolées d’une région


Page 42

présentant des périodes d’aridité. En effet, Cacciari et al., (2003) ont conclu que la

température de croissance des rhizobiums varie en fonction de l’espèce et de la région

d’isolement. Et pour ce qui est de la croissance des rhizobiums à des températures élevées

plusieurs travaux ont rapporté que certaines souches isolées des légumineuses ligneuses au

Kenya, en Inde et au Pakistan peuvent croître à des températures variant entre 44 °C et 50 °C

(Zahran, 1999). Des résultats similaires ont été aussi signalés par Cacciari et al., (2003) qui

ont montré que certaines souches de rhizobium isolées d’Acacia tortilis subsp. raddiana

provenant du Sénégal peuvent croître à 45 °C.

On remarque que certaines souches préfèrent des températures basses et sont sensibles aux

températures élevés tel que les deux souches ASB2 et ASB4, d’autres au contraire sont

sensibles aux températures basses et préfèrent des températures élevés, un troisième groupe de

souches peuvent croitre aux températures extrêmes, elles présentent donc un intérêt pour la

sélection.

3.2. Effet du pH :

Ce test permet de déterminer le pH optimal de croissance des différents isolats, ainsi que les

pH extrêmes auxquels ils peuvent croître.

On remarque que les deux souches ASB5 et ASB12 présentent une bonne croissance dans

l’intervalle de pH de 3 à 12 (Figure 20 et 21).

La souche ASB7 présente une bonne croissance dans l’intervalle de pH de 3 à 11.

La souche ASB1 présente une bonne croissance allant de pH 4 jusqu’au pH 11.

Les autres souches présentent une bonne croissance dans un intervalle de pH 5 à 11 sauf pour

la souche ASB18 qui est de pH 6 à 11.

Singleton (1999), Young et al., (2001) ont montré que le pH optimal de croissance des

rhizobiums est compris entre 6 et 7, alors que celui de nos isolats se situ dans l’intervalle de

5 à 11 pour la plupart des souches (Tableau n°04). Selon Beunard en 2007 (communication

personnelle) la croissance des souches à cette gamme de pH au laboratoire ne signifie pas

forcément que ces souches peuvent croître à des pH aussi basique (pH 11) et acide (pH 5)

dans la nature.

Nos résultats sont en corrélation avec d’autres travaux, en effet, Zahari et al., (2000) ont

rapporté que certaines souches isolées d’Acacia saligna et Acacia tortilis supportent des pH

bas de l’ordre de 4, Watkin et al., (2003) ont aussi rapporté qu’une souche de Rhizobium

leguminosarum biovar trifolii peut croître à un pH de 3,5.

Tandis que Kulkarni et al., en 2000 ont montré que des souches de Rhizobium peuvent croître

jusqu’à des pH de12.


Page 43

Figure 20 : Aspect de la souche ASB5 à pH 3 après 48 h d’incubation à 28°C

Figure 21 : Aspect de la souche ASB5 à pH 12 après 48 h d’incubation à 28°C


Page 44

3.3. Effet de la salinité :

La salinité réduit la survie et la distribution des rhizobia dans le sol et la rhizosphère (Tate,

1995 ; Jenkins et al., 1989), elle affect également le processus de nodulation ainsi que la

fixation symbiotique de l’azote (El-Sheikh et Wood, 1995), Néanmoins, cet effet diffère selon

que les souches de rhizobia présentes dans le sol sont sensibles ou tolérantes au sel (Kumar et

al., 1999).

Dans le but de sélectionner les souches les plus tolérantes à la salinité destinées à la

production d’inoculum, et pour déterminer le seuil de tolérance de nos isolats vis-à-vis du

NaCl, nous les avons cultivés sur milieu YEM avec différentes concentrations de NaCl.

D’après les résultats obtenus on remarque que les souches ASB7, ASB10 et ASB18 sont les

moins tolérantes au sel, en effet une faible croissance est observée à une concentration de 2 %

(350 mM) de NaCl.

Par contre, les isolats ASB9, ASB11, ASB14, ASB15 et ASB16 peuvent croître à une

concentration de 3% (400 mM) de NaCl et les souches ASB1, ASB2, ASB3, ASB4, ASB5,

ASB6, ASB8, ASB12, ASB13, ASB17 peuvent croitre jusqu’à une concentration de 5% de

NaCl (Figure 22, 23 et 24, 25).

Malgré la provenance des différents isolats de la même plante hôte, leur réaction vis-à-vis du

sel diffère. Cette variabilité s’observe non seulement entre deux espèces différentes de

rhizobium mais aussi entre deux souches d’une même espèce isolées à partir d’une même

plante hôte (Bekki, 1983). Serraj et al., (2004) ont montré que la sensibilité des souches de

rhizobiums à la salinité varie d’une souche à l’autre.

La vitesse de croissance des rhizobia intervient dans la tolérance à la salinité, El-Sheikh et

Wood (1995) ont observé que des souches de rhizobia isolées du pois chiche et à croissance

rapide sur milieu de culture, étaient plus tolérantes à la salinité que celles à croissance lente.

Ce qui peut expliquer la tolérance de nos souches à de forte concentration de sel.

La plupart de nos isolats sont plus tolérantes au sel comparés à certaines souches de

Sinorhizobium americanus isolées à partir d’Acacia spp qui ne présentent aucune croissance à

300 mM de NaCl (Toledo et al., 2003).

Quoique cette tolérance reste faible comparant à des souches de rhizobium isolées d’Acacia

saligna et Acacia karoo qui peuvent tolérer une concentration allant jusqu’à 8% de NaCl

(Mohamed et al., 2000).


Page 45

Figure 24: La croissance de la souche ASB5 sur milieu YEM incubé pendant 48h

à 28°C

Figure 23: La croissance de la souche ASB3 sur milieu YEM salé à 2% (350Mmol)

incubé pendant 48h à 28°C

Figure 22: La croissance de la souche ASB3 sur milieu YEM incubé pendant

48h à 28°C

Figure 25: La croissance de la souche ASB5 sur milieu YEM salé à 3.5% (500Mmol)

incubé pendant 48h à 28°C


Page 46

4. Séquençage partiel du gène 16S :

Les résultats du séquençage partiel du gène 16S de nos souches révèlent une certaine diversité

malgré le nombre limité des souches identifiées, certaines légumineuses dites à large spectre

d’hôte acceptent plusieurs espèces de rhizobia, c’est le cas des Acacia (Lewin et al., 1987, de

Lajudie et al., 1994 ; de Lajudie et al., 1998 ; Nick et al., 1999). On note qu’Acacia saligna

nodule avec quatre genres différents de BNL (Bactéries Nodulant les Légumineuses) :

Rhizobium, Sinorhizobium, Devosia et Phyllobacterium. Cependant toutes les souches

identifiées sont des souches à croissance rapide, la nodulation des Acacia avec des souches à

croissance rapide a été rapporté par plusieurs auteurs (Lal et Khanna, 1993 ; Ndoye et al.,

1995).

On peut rapporter cependant qu’une souche identifiée comme appartenant au groupe des

BNL : ASB1 est nod-, ceci peut être du à la perte du plasmide où siège les gènes de

nodulation (Martinez-Romero, 1994). En effet selon Rosenberg et al., 1981 ; Appelbaum et

al., en 1985, les gènes nod de la plupart des Rhizobium à croissance rapide sont localisés sur

un grand plasmide appelé pSym.

Autre phénomène intéressant noté pour les souches ASB4 et ASB11 appartenant au genre

Azospirillum et Devosia respectivement qui sont nod+, on ne peut valider ces résultats

qu’après un séquençage des souches isolées à partir des nodules formés.


Page 47

Tableau n°04: Les résultats du test de nodulation, effet des différents facteurs édaphiques et le séquençage partiel du gène 16S des souches isolées

T°C : Température, NI : Non identifiée, Nod- : Absence de nodules, Nod+ : Présence de nodules.

Facteurs édaphiques Souches Test de

nodulation T°C pH Sel %

Identification

moléculaire

ASB1

Nod-

10 - 40

4 - 11

5

Rhizobium sp.

ASB2

Nod-

07 - 30

5 - 11

5

NI

ASB3

Nod+

10 - 40

5 - 11

5

Rhizobium sp.

ASB4

Nod+

07 - 30

5 - 11

5

Azospirillum lipoferum

ASB5

Nod+

10 - 40

3 - 12

5

Sinorhizobium sp.

ASB6

Nod-

10 - 40

5 - 11

5

NI

ASB7

Nod+

10 - 40

3 - 11

2

NI

ASB8

Nod-

10 - 40

5 - 11

5

Azospirillum sp.

ASB9

Nod+

07 - 45

5 - 11

3

Rhizobium sp.

ASB10

Nod-

10 - 40

5 - 11

2

NI

ASB11

Nod+

10 - 45

5 - 11

3

Devosia naptuniae

ASB12

Nod+

10 - 40

3 - 12

5

NI

ASB13

Nod+

10 - 40

5 - 10

5

Rhizobium sp.

ASB14

Nod-

10 - 35

5 - 11

3

NI

ASB15

Nod-

10 - 40

5 - 11

3

Phyllobacterium sp.

ASB16

Nod-

07 - 45

5 - 11

3

NI

ASB17

Nod-

10 - 40

5 - 11

5

NI

ASB18

Nod-

07 - 35

6 - 11

2

NI


Page 48

5. Inoculation des plantes en serre:

Après 4 mois de culture en pots sous serre une première observation est faite sur la croissance

des plantes inoculées avec les différentes souches comparées à celle des plantes témoins non

inoculées.

La croissance des plantes inoculées avec les souches ASB1, ASB2, ASB6, ASB8, ASB10,

ASB14, ASB15, ASB16, ASB17 et ASB18 est la même à celle des témoins (Figure 26), par

contre celle des plantes inoculées avec les souches ASB3, ASB4, ASB5, ASB7, ASB9,

ASB11, ASB12 et ASB13 est nettement améliorée par rapport aux témoins non inoculés

(Figure 27, 28 et 29).

Ensuite toutes les plantes sont déterrées pour vérifier la présence de nodules sur leurs racines ;

seule les plantes inoculées avec les souches ASB3, ASB4, ASB5, ASB7, ASB9, ASB11,

ASB12 et ASB13 présentent des nodules sur leurs racines, ce qui explique leur croissance qui

dépasse celle des plantes témoins.

Après avoir dessécher les parties racinaires et les parties aériennes des plantes nodulées et des

plantes témoins et les avoir pesées, on a analysé les résultats par le logiciel Statistica, une

analyse de variance à un facteur (effet souche sur le PSA et PSR des plantes) qui a révélé un

coefficient de corrélation P= 0.0001 (P<0.05) ce qui veut dire que l’effet souche est

significatif, confirme les observations visuelles faite sur la croissance des plantes, le

classement de moyenne de Newman & Keuls montre que les souches ASB3, ASB7 et ASB13

augmentent de manière significative le poids sec de la partie aérienne et celui de la partie

racinaire des plantes d’Acacia saligna (Annexe n°8).


Page 49

ASB7

Témoin

Figure 27 : Effet de l’inoculation avec la souche ASB7 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé

Figure 26: Effet de l’inoculation avec la souche ASB17 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé

Témoin ASB17


Page 50

Témoin

ASB13

Figure 28 : Effet de l’inoculation avec la souche ASB13 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé

Témoin ASB5

Figure 29: Effet de l’inoculation avec la souche ASB5 sur la croissance d’A. saligna comparée au témoin non inoculé


Page 51

L’effet de l’inoculation sur la croissance des plantes hôtes varie en fonction des souches

bactériennes. Les résultats obtenus (Figure 30) montrent que dans la majorité des cas,

l’inoculation a amélioré favorablement le développement des parties aériennes et des parties

racinaires des jeunes plantes d’A. saligna. Avec la souche ASB5 la biomasse sèche de la

partie aérienne des plantes d’A. saligna atteint 0.1066 g par plante, soit une augmentation

d’environ 80% par rapport aux témoins.

L’effet positif des rhizobiums à été rapporté par plusieurs auteurs (Lal et Khanna, 1993 ;

Ndoye et al., 1995)

On a sélectionné trois souches ASB5 (Sinorhizobium sp.), ASB7 (n’a pas encore été

identifiée), ASB13 (Rhizobium sp.) qui présentent une bonne résistance "in vitro" aux pH

(allant de pH 5 jusqu’au pH10), à la température (40°C) et à la salinité (allant de 2% jusqu’à

5%) du milieu de culture. Ces souches une fois associées à la plante hôte, ont montré une

infectivité et une efficience importante, ce qui a permis l’amélioration de la nutrition azotée

des jeunes plantes d’A. saligna et par conséquent l’amélioration de leur croissance dans les

conditions contrôlées.


Page 52

6. Inoculation en pépinière :

Les résultats obtenu en pépinière montrent qu’il est important que la souche sélectionnée en

conditions contrôlées en serre et qui présentait de bonnes caractéristiques symbiotiques puisse

conserver ces propriétés une fois introduite dans le sol de la pépinière en plus de son pouvoir

compétitive vis-à-vis des souches indigènes.

On remarque qu’après quatre mois de croissance en pépinière, le pourcentage de survie des

plants inoculés avec la souche ASB7 est de 60% proche à celui du témoin qui est de 50%,

par contre celui des plants inoculés avec la souche ASB5 (Sinorhizobium sp.) est de 80% et

celui des plants inoculés avec la souche ASB13 (Rhizobium sp.) est de 95%, en effet,

l`inoculation avec les deux souches ASB5 et ASB13 a diminué le taux de mortalité des plants

de 20 - 15% respectivement comparé à la souche ASB7 (non identifiée) (Figure 31).

Cependant, il n`a pas été noté une grande différence concernant la croissance en hauteur des

plants inoculés avec la souche ASB5 (12cm) et ceux inoculés avec la souche ASB7 qui est de

17cm comparé aux plants témoins non inoculés qui est de 13cm, tandis que la hauteur

moyenne des plants inoculés avec la souche ASB13 est nettement plus élevé 29 cm par

rapport aux témoins (Figure 32, Tableau n°5), il est clair que le paramètre de survie est plus

sensible à l’inoculation que le paramètre de hauteur moyenne.

L’état physiologique des plants est différent, les plants inoculés avec les deux souches ASB5

et ASB13 présentent des feuilles larges de couleur vert foncé contrairement à celles des plants

témoins et les plants inoculés avec la souche ASB7, elles sont moins large et de couleur

jaunâtre (Figure 33).

L’efficience des deux souches ASB5 et ASB13 en serre est confirmée en pépinière,

l’inoculation a amélioré significativement la croissance en hauteur et la nutrition azotée des

plants exprimé en un taux de survie élevé et un bon état physiologique des plants.

Néanmoins l’effet de l’inoculation avec la souche ASB5 a diminué en pépinière par rapport à

son effet en serre.

Le succès de l’inoculation avec ces deux souches s’explique par la bonne qualité de

l’inoculum, contrairement à l’inoculation avec la souche ASB7, l’échec est dû probablement

au phénomène de compétitivité ; des souches de rhizobiums natifs au sol utilisé en pépinière

qui doivent être peu efficientes ont colonisé le système racinaire des plants.

Nos résultats sont semblables à ceux obtenu par Galiana en 1990, qui a inoculé une espèce

d’Acacia australienne Acacia mangium avec la souche de Bradyrhizobium Aust 13c, cette


Page 53

souche avait un effet positif sur la croissance de l’espèce d’Acacia en pépinière mais qui

diminue avec le temps à cause du phénomène de compétitivité.

Tableau n°05 : Le pourcentage de survie et la hauteur moyenne des plants inoculés comparés aux plants

témoins non inoculés en pépinière

% de survie Hauteur

moyenne

Témoin 50% 13cm

ASB5 (Sinorhizobium sp.) 80% 12.5cm

ASB7 (non identifiée) 60% 17cm

ASB13 (Rhizobium sp.) 95% 29cm

Témoin Sinorhizobium sp. ASB7 Rhizobium sp.

Témoin ASB13

Figure 31: Effet de l’inoculation avec les différentes souches sur la croissance des plants d’A. saligna pendant 4mois en pépinière.

Figure 32 : La hauteur du plant témoin comparé à celui inoculé avec la souche ASB13 (Rhizobium sp.)

6 cm

20 cm


Page 54

Figure 33: Le taux de survie des plants inoculés avec les trois souches comparés aux plants témoin en pépinière.

Tém

oin

AS

B7

AS

B13

(Rh

izob

ium

sp.)

AS

B5

(Sin

orh

izo

biu

m sp

.)


Page 55

7. Transfert des plants sur champs :

Les plants ont été transférés sur site dégradé de la sablière selon le dispositif décrit auparavant

(Figure 14) (Figure 34), après 4 mois de croissance, une observation a été faite sur la survie

et la croissance des plants. Les plants inoculés avec la souche ASB13 (Rhizobium sp.)

présentent un taux de survie élevé et une croissance en hauteur améliorée par rapport aux

autres plants (Figure 35), ce résultat reste à confirmer après 6 mois de croissance des plants

sur la sablière avec une étude statistique.

Figure 34 : La plantation d’Acacia saligna suivant le protocole décrit auparavant

Photo prise en Novembre 2007

Figure 35 : Effet de l’inoculation avec la souche ASB13 (Rhizobium sp.) sur A. saligna après 4 mois de croissance sur site de la sablière

Photo prise en Janvier 2008

VI Conclusion & perspectives

Page 56

Conclusion & perspectives

Dans le but de revégétaliser la Sablière de l’Ouest dans la région de Mostaganem et de lutter

contre l’érosion éolienne très fréquente dans la région, un couple Acacia - Rhizobium

performant est proposé, parmi les 18 souches spécifiques à Acacia saligna qui ont été isolées,

seuls deux candidats ont été retenus.

Cette étude a montré que Acacia saligna, plante fixatrice des dunes littorales est nodulée

préférentiellement par des souches à croissance rapide, les souches identifiées appartiennent

aux différents genres ce qui nous a permis d’enrichir la collection du laboratoire. Ces

dernières présentent une bonne résistance in vitro à la température jusqu’à 45°C, aux pH

allant de 4 à 11 et à la salinité jusqu’à 5%.

Parmi ces souches, trois sont sélectionnées pour des essais en pépinière et sur champs : ASB5

(Sinorhizobium sp.), ASB13 (Rhizobium sp.) et ASB7 (non identifiée). Elles présentent en

effet une bonne efficience (formation de nodules et fixation d’azote) en conditions contrôlées

qui se traduit par une amélioration de la nodulation et de la croissance des plants, en plus de

leur résistance aux conditions extrêmes.

Par ailleurs, après quatre mois de croissance en pépinière, deux souches ont amélioré la

nodulation et la croissance des plants : Rhizobium sp. et Sinorhizobium sp.

A noté que l’effet positif de la souche Rhizobium sp. persiste même après transfert des plants

sur site dégradé de la sablière.

Nous pouvons donc conclure que le couple A. saligna- ASB13 (Rhizobium sp.) peut être

proposé au département forestier pour un programme de revégétalisation ou de fixation des

dunes côtières ; en plus de sa résistance aux conditions extrêmes et de son efficience, cette

souche a prouvé sa compétitivité face aux souches indigènes.

L’introduction d’Acacia saligna inoculés par les souches sélectionnées à été un réel succès et

offre de véritables potentialités pour de futures plantations à plus grande échelle destinée à la

revégétalisation des sablières et à la fixation des dunes littorales.

Ce travail sera complété par une analyse statistique des résultats sur champs puis un

réisolement des souches à partir des nodules des plants inoculés afin de tester la pérennité des

souches introduites et leur compétitivité vis-à-vis des souches autochtones.

Références bibliographiques

Page 57


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Annexes

ANNEXES

Annexe 1 : Analyses physicochimiques du sol

a. Analyse granulométrique :

La granulométrie a été déterminée par la méthode internationale à la pipette de

Robinson.

- Dans un bécher de 600 ml, mettre 15g de terre fine séchée et tamisée.

- Ajouter 50 ml de l’eau oxygénée (H2O2) à 20 volumes.

- Recouvrir le bécher afin d’éviter les projections pendant la période de

l’effervescence.

- Mettre le bécher sur un bain de sable dont la température ne dépasse pas 85°C

Si une ébullition trop forte se manifestait, l’eau oxygénée se décompose très

rapidement.

Si la terre est humifère l’effervescence peut produire une mousse abondante risquant

de déborder, ce phénomène peut être évité en ajoutant quelques gouttes d’alcool

éthylique.

A la fin défervescence, faucher pendant 2 h pour éliminer l’H2O2 en excès et terminer

par 10 min d’ébullition (on peut accélérer l’élimination de l’excès d’eau oxygénée en

ajoutant quelques gouttes d’ammoniaque).

- S’assurer que toute l’eau oxygénée a disparu en versant quelques gouttes du

liquide chaud 60°C dans une solution de permanganate de potassium, en

présence d’eau oxygénée le permanganate de potassium se décolore.

- Laisser refroidir puis transvaser à l’aide d’un jet de pissette dans un flacon de

sédimentation à large ouverture et jaugé de 750 ml.

- 15 ml d’hexaméthaphosphate de sodium 50 g/l. Cette solution alcaline a pour

rôle de disperser les particules qui ont tendance à s’agglomérer.

- Compléter avec de l’eau déminéralisée jusqu’au trait de jauge 750 ml.

- Agiter le flacon durant une heure sur un agitateur magnétique.

- Porter le flacon à proximité de la pipette de Robinson qui doit être placée dans

une pièce à température constante.

Annexes Pour le mélange des argiles, des limons fins et des limons grossiers :

- Maintenir la température à 20°C, agiter immédiatement par retournement

répété de manière à mettre en suspension toute la terre.

- Laisser décompter pendant 20 secondes.

- Prélever au bout de 46 secondes, à 10cm de profondeur 10ml de liquide.

- Porter la capsule dans une étuve à dessiccation à température 105°C.

- Après évaporation totale, peser la capsule et son contenu sec.

- Par différence avec le poids de la capsule vide, déterminer le poids P1 de

sédiment.

(Argile + limons fins + limons grossiers + hexaméthaphosphate de sodium) contenu

dans 10 ml de suspension.

Pour le mélange des argiles et des limons fins :

- Après agitation et retournement du liquide, laisser déposer durant 4 min.

- Effectuer le prélèvement de 10 ml à une profondeur de 10 cm après la

sédimentation.

- Transvaser le prélèvement dans une capsule en verre pyrex.

- Faire évaporer puis peser la capsule.

- Par différence avec le poids de la capsule vide, déterminer le poids P2 du

sédiment (Argile + limon fin + hexaméthaphosphate de sodium) contenu dans

10 ml de suspension.

Pour l’argile :

- Agiter et laisser sédimenter 8h.

- Effectuer le prélèvement de 10 ml.

- Peser comme précédemment P3 (Argile + hexaméthaphosphate de sodium)

dans 10 ml de suspension.

- Verser 15 ml d’ hexaméthaphosphate de sodium dans un flacon gaugé de

750 ml.

- Agiter puis faire un prélèvement à la pipette Robinson comme précédemment.

- Transvaser le prélèvement dans une capsule en verre pyrex.

- Faire évaporer puis peser la capsule et son contenu sec.

- Déterminer comme précédemment le poids correspondant à la surcharge en

hexaméthaphosphate de sodium contenu dans 10 ml de suspension.

- D’après les pesées P1, P2, P3, calculer les taux des Argiles, limons fins et

limons grossiers.

Annexes

- Tamiser et peser les sables fins et sables grossiers, pour les sables grossiers

utiliser un tamis de 200 µm et pour les sables fins un tamis de 50µm.

b. Dosage du calcaire total :

Déposer 1g de sol séché à l’air, dans un flacon puis remplir l’appendice latérale du

flacon avec 5 ml de HCl 0.5N, après avoir lier le flacon au calcimètre de Bernard

amener au zéro les niveaux de l’eau dans la colonne et dans l’ampoule, verser

l’acide sur l’échantillon, ensuite à l’aide de l’ampoule, rétablir le niveau et lire le

volume de CO2 dégagé (en cm3), une foie le dégagement du CO2 terminé, baisser

l’ampoule du calcimètre jusqu’à ce que le niveau de cette dernière soit dans un

même plan horizontal que celui dans la colonne, enfin déposer 1g de CaCO3 pur

pour l’étalonnage de l’appareil tel qu’il provoque un dégagement gazeux.

c. Dosage du calcaire actif :

Peser 10g de sol séché à l’air, les introduire dans un flacon de 500ml et y ajouter

250 ml de la solution d’oxalate d’ammonium (NH4)2C2O4 à 0.2N, agiter durant

2h, ensuite filtrer la solution en rejetant les premier ml du filtrat.

Prélever 10ml du filtrat qui sera versé dans un bécher de 100ml, ajouter à ce

dernier 10ml de H2SO4au 1/10, ensuite porter le contenu du bécher à une

température de 60°C, puis placer le bécher sur un agitateur magnétique surmonter

d’une burette graduée contenant le permanganate de potassium KMnO4 en

solution décimale, le titrage par le permanganate se fait jusqu’à l’obtention d’une

couleur rose persistante, soit n le nombre de ml de KMnO4 versé.

Titrer de la même façon 10ml de la solution d’oxalate d’ammonium utilisée, soit

N le nombre de KMnO4 versé pour le témoin.

d. Dosage du carbone total et de la matière organique :

- Utiliser un sol finement broyé et passé au tamis (0.2 mm).

- Peser 0.25g de sol, introduire la prise dans un ballon pyrex avec réfrigérant

ascendant, ajouter 10 ml de solution de bichromate à 8% et 15 ml d’acide

sulfurique H2SO4 pure.

- Porter 5 min à l’ébullition douce.

- Laisser refroidir puis transvaser dans une fiole jaugée de 200 ml, laver trois

fois à l’eau distillée, verser dans un bécher de 250ml.

- Diluer à 200ml.

- Ajouter 1.5g de fluorure de sodium (FNa) en poudre par ml d’acide sulfurique

H2SO4 plus 3 à 4 gouttes de diphénylamine puis titrer l’excès de bichromate

Annexes

avec une solution de Mohr à 0.2N (la couleur passe du bleu foncé au

bleu-vert).

Les calculs :

1g de bichromate 0.2N oxyde 0.615mg de carbone (C)

Effectuer un témoin avec du sable stérile calciné, soit

n : la quantité de sel de Mohr versé

n´ : la quantité de sel de Mohr correspondant à l’échantillon.

C% = ( n-n´) x 0.615 x 100/ 1000

Pour obtenir le taux de la matière organique, multiplier C% par 1.72.

Annexe 2 : Le triangle de texture

Permet de classer les sols d’après leur composition granulométrique

Annexes

Annexe 3 : Les normes de salinité du sol ISS, htpp//www.iges-stb.org/pdf/dico_donesol2.pdf

1S/m = 104 µS/cm = 10 mS/cm = 103mS/m

(Normalisations françaises, afnor, 1986)

Annexe 4 : Milieu de culture YMA (Yeast Mannitol Agar) (Vincent, 1970).

Utilisé pour la culture courante des souches de BNL, sa composition en gramme par

litre est la suivante :

Extrait de levure …………………………………..1g Agar-Agar ………………………………………...15g Mannitol …………………………………………..10g KCl 1g FeCl3 0.02g Solution minérale de Bergersen 10 M…………..100ml : CaCl2,2H2O 0.53g Bergersen (1961) Na2HPO4,12H2O 4.5g MgSO4,7H2O 1g H2O distillée 1000ml H2O distillée……………………………………….qsp 1000ml pH (6.9 –7)

Salinité (ECe : mS/CM) Salinité du sol Réponse des plantes

0 à 2 Non salé Pas d’impact sur la

croissance des plantes

2 à 4 Légèrement salé La croissance des plantes

sensibles peut être réduite

4 à 8 Moyennement salé La croissance de plusieurs

plantes est réduite

8 à 16 salé Bonne croissance des

plantes tolérantes au sel

>16 Très salé Bonne croissance des

plantes très tolérantes au sel

Annexes

Annexe 5 : Coloration de Gram

La coloration de Gram différencie les bactéries en deux groupes, celles qui retiennent

la première coloration (bactéries Gram- positives) et celle qui perdent la première

coloration et qui prennent la couleur de la contre- coloration (Gram- négatives).

Au cours de la coloration Gram, on utilise 4 réactifs : un colorant pour la première

coloration, l’iodure de potassium, un décolorant, et un contre-colorant.

La paroi des bactéries Gram positifs se distingue de celle des Gram-négatifs par la

présence de l’acide muramique.

Les étapes du protocole sont les suivant :

Les cellules sont fixées à la flamme. Ensuite le violet de Genciane est ajouté (20 sec).

Les bactéries se colorent alors en violet. Le colorant et par la suite fixé à l’aide du

Lugol (Iodure de potassium KI). La préparation est abondamment rincée à l’eau du

robinet afin d’éliminer l’excès de colorant. La préparation est décolorée (l’éthanol à

95° pendant 5 sec) et rincée de nouveau abondamment à l’eau de robinet. Puis, une

recoloration avec de la Fuschine acide est réalisée (30 sec). De nouveau, la

préparation est rincée à l’eau et séchée à une température ambiante. L’observation

microscopique permet de voir si les cellules sont colorées en violet (Gram-positives)

ou bien en rose (Gram-négative).

Annexe 6 : Eau gélosée (0.8%)

Agar-agar…………....0.8 g

Eau distillée………....100 ml

Autoclavé pendant 20 min à 120°C.

Annexes

Annexe 7 : Solution nutritive pour la nodulation in vitro des Acacia. (Broughton &Dilworth, 1971)

Solutions stock

Formule chimique

Concentration

g/l

Volume de la solution stock/volume finale

ml/l 1 CaCl2 2H2O 294 0.5 ml 2 KH2PO4 196 0.5 ml 3 MgSO4 7H2O

K2SO4 MnSO4 H2O

126 87

0.338

0.5 ml

4 H3BO3 ZnSO4 7H2O CuSO4 5H2O CoSO4 7H2O

Na Mo O2 2H2O

0.247 0.288 0.100 0.056 0.048

0.5 ml

5 Na Fe_EDTA 0.734 0.5 ml Annexe 8 : Mc Farland n° 5 (15 x 108 UFC/ml) (NCCLS, 2000)

BaCl2 (1.175%)…………… 0.5 ml

H2SO4…………………….. 9.5 ml

Composition des standards de turbidité de McFarland

Standard de turbidité numéro

Dihydrate de chlorure de baryum (1,175 %), en ml

Acide sulfurique (1 %), en ml

Densité approximative correspondante de

bactéries/ml 0,5 0,5 99,5 1.108 1 0,1 9,9 3.108 2 0,2 9,8 6.108 3 0,3 9,7 9.108 4 0,4 9,6 12.108 5 0,5 9,5 15.108 6 0,6 9,4 18.108 7 0,7 9,3 21.108 8 0,8 9,2 24.108 9 0,9 9,1 27.108 10 1 9,0 30.108

Annexes

Annexe 9 : Analyse statistique avec le logiciel Statistica de l’effet

souche sur la croissance (Poids Sec des Parties Aériennes et Poids Sec

des Parties Racinaires) des plantes en serre

Type III Sums of Squares

Source

df

Sum of

Squares

Mean

Square

F-Value

P-Value

Souche 8 ,002 2,105E-4 8,560 ,0001

Residual 36 ,001 2,459E-5

Dependent: PSPR (g)

Means Table

Effect: Souche

Dependent: PSPR (g)

Count Mean Std. Dev. Std. Error ASB10

5 ,004 ,004 ,002

ASB11

5 ,013 ,006 ,003

ASB12

5 ,010 ,006 ,003

ASB13

5 ,006 ,006 ,003

ASB3

5 ,016 ,009 ,004

ASB4

5 ,002 ,001 ,001

ASB7 5 ,021 ,005 ,002

ASB9 5 ,010

,010 ,001

Témoin 5 ,004

,002 ,001

Annexes

Student-Newman-Keuls

Effect: Souche

Dependent: PSPR (g)

Significance level: ,05

Type III Sums of Squares

Source

df

Sum of

Squares

Mean

Square

F-Value

P-Value

Souche 8 ,045 ,006 18,397 ,0001

Residual 36 ,011 3,049E-4

Dependent: PSPA (g)

Means Table

Effect: Souche

Dependent: PSPA (g)

Count Mean Count Mean

ASB4 5 ,002

ASB10 5 ,004

Témoin 5 ,004

ASB13 5 ,006

ASB9 5 ,010

ASB12 5 ,010

ASB11 5 ,013

ASB3 5 ,016

ASB7 5 ,021

Count Mean Std. Dev. Std. Error ASB10

5 ,013 ,003 ,001

ASB11

5 ,093 ,015 ,006

ASB12

5 ,057 ,017 ,008

ASB13

5 ,036 ,021 ,009

ASB3

5 ,039 ,026 ,012

ASB4

5 ,013 ,010 ,005

ASB7

5 ,107 ,008 ,004

ASB9

5 ,048 ,027 ,012

Témoin

5 ,020 ,015 ,007

Annexes Student-Newman-Keuls

Effect: Souche

Dependent: PSPA (g)

Significance level: ,05

Count Mean Count Mean

ASB10 5 ,013

ASB4 5 ,013

Témoin 5 ,020

ASB13 5 ,036

ASB3 5 ,039

ASB9 5 ,048

ASB12 5 ,057

ASB11 5 ,093

ASB7 5 ,107

RÉSUMÉ

Dans le but de sélectionner un couple symbiotique Rhizobium- Acacia saligna performant

pour la revégétalisation de la Sabliere de l’Ouest situé dans la région de Mostaganem et la

fixation des dunes littorales, 18 isolats ont été obtenus à partir des nodules racinaires

d’Acacia saligna. Ces isolats présentent une morphologie comparable à celle des rhizobia

connus, et une bonne résistance à la température jusqu’à 45°C , à la salinité jusqu’à 5% et au

pH allant de pH 4 à pH 11, sur ceux 3 souches sont sélectionnées ASB13 (Rhizobium sp.),

ASB5 (Sinorhizobium sp.) et ASB7 (non identifiée) pour être utilisé comme inoculum sur la

base de leur efficience en condition contrôlées (capacité à former des nodules et à fixer de

l’azote atmosphérique) et de leur résistance aux conditions extrêmes. Ces inocula

performants en condition de laboratoire sont inoculés à de jeunes plants en pépinière. Après

4 mois il a été noté l’effet positive des deux souches l’une appartient au genre

Rhizobium sp. et l’autre au genre Sinorhizobium sp. sur la croissance des plants d’Acacia

saligna, puis ces derniers sont transférés sur la sablière et sont divisés en deux lot, le

premier réinoculé contrairement au second. Les souches sont jugées sur leur persistance

sur le terrain dégradé pour sélectionner la ou les souches les plus performantes. La souche

qui appartient eu genre Rhizobium sp. a montré une efficacité très élevée pour la croissance

et la nutrition azotée des jeunes plants d’Acacia saligna après 4 mois de transplantation sur

site dégradé de la sablière.

Mots clés :

Revégétalisation, Sablière, Dunes littorales, Acacia saligna, Rhizobium, Inoculation.

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