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EndoZyme® 606356 V2.0 – fr – 2017/01

Hyglos GmbH - a bioMérieux company - Français

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1. Informations générales

1.1 Application

Application

EndoZyme® est utilisé pour la détermination quantitative des endotoxines (lipopolysaccharide chimique, LPS) dans les produits pharmaceutiques finis, les contrôles en cours de production et les échantillons de recherche, ainsi que dans les tests de dispositifs médicaux.

1.2 Principe du test

EndoZyme® est un dosage enzymatique homogène qui utilise le récepteur d’une endotoxine de synthèse (facteur C recombinant) dérivé de la cascade de coagulation sanguine des limules en combinaison avec un substrat fluorogénique.

Endotoxine Les endotoxines sont des composants de la membrane cellulaire bactérienne qui sont reconnus par le système immunitaire humain et peuvent déclencher de sévères réactions physiologiques. La principale endotoxine des bactéries Gram-négatif est la lipopolysaccharide (LPS). Le LPS se compose d’une partie commune (lipide A + noyau à structure essentiellement glucidique) et d’une partie hautement variable (antigène O).

Cascade de coagulation de la limule

Dans les amoebocytes, cellules sanguines des limules, telles que Limulus polyphemus et Tachypleus tridentatus, une cascade de coagulation est présente pour résister aux infections à bactérie Gram-négatif. Le principal récepteur de cette cascade protéolytique est une protéine appelée Facteur C. Il s’agit d’un zymogène/proenzyme (précurseur d’enzyme, ici la protéase) qui est activé par l’endotoxine.

Facteur C recombinant (rFC)

Le facteur C recombinant (rFC), plutôt que le lysat d’amoebocytes de Limulus ou de Tachypleus (LAL ou TAL), est utilisé en association avec un substrat fluorogénique de synthèse pour détecter les endotoxines.

1.3 Caractéristiques

Intervalle de dosage 0,005 à 50 EU/mL

Limite de détection 0,005 EU/mL

Durée du dosage 90 minutes

2. Composition du coffret

Nombre de tests

Le coffret contient des réactifs pour 192 tests.

Composition du coffret

Composant Récipient Contenu Description

1 Enzyme (ENZ) Flacon en plastique, bouchon transparent

1 x 2,5 mL Solution enzymatique (rFC), x 10 concentrée. Ce coffret contient des produits d’origine animale (albumine sérique bovine).

2 Substrat (SUB) Flacon en plastique brun, bouchon brun

1 x 2,5 mL Substrat fluorescent, x 10 concentré.

3 Endotoxine Standard de Contrôle (CSE)

Flacon en verre, bouchon orange

2 flacons Endotoxine Standard de Contrôle, lyophilisé, contenant environ 100 EU de LPS d’E. coli O55:B5.

4 Eau (EEB)

Flacon en plastique, bouchon bleu

2 x 100 mL Eau, exempte d’endotoxine détectables et d’interférence, pour reconstitution du standard et de ses dilutions et des échantillons.

5 Tampon* (AB)

Flacon en plastique brun, bouchon brun

2 x 12 mL Tampon, à associer au substrat 2 et à l’enzyme 1. Cet élément du coffret contient de l’imidazole*.

6 Microplaque (MPL)

Sachet en plastique

2 plaques Microplaques stériles, exemptes d’endotoxine détectable et d’interférence, 2 x 96 puits.

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(*) MENTION D’AVERTISSEMENT : DANGER

H360D P202 / P280 / P308+P313 Mention de danger : H360D : Peut nuire à la fertilité ou au fœtus. Conseils de prudence : P202 : Ne pas manipuler avant d’avoir lu et compris toutes les précautions de sécurité. P280 : Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de protection des yeux/du visage. P308+P313 : EN CAS d’exposition prouvée ou suspectée : consulter un médecin. Pour obtenir des informations complémentaires, consulter la fiche de données de sécurité.

3. Précautions d’utilisation

Avertissement :

EndoZyme® n’est pas destiné à une utilisation d’échantillons cliniques ou pour le diagnostic d’une maladie humaine ou animale. Pour un usage professionnel uniquement. Le coffret contient des composants d’origine animale. La maîtrise de l’origine et/ou de l’état sanitaire des animaux ne pouvant garantir de façon absolue que ces produits ne contiennent aucun agent pathogène transmissible, il est recommandé de les manipuler avec les précautions d’usage relatives aux produits potentiellement infectieux (ne pas ingérer, ni inhaler).

Conditions Tout le matériel utilisé, tel que les récipients ou les embouts de pipette, doivent être exempt d’endotoxine détectable et d’interférence. Pour préparer l’échantillon et les dilutions de standard, il est conseillé d’utiliser des tubes à essai en verre car les endotoxines peuvent adhérer aux surfaces en plastique hydrophobes.

Traitement du matériel en verre

Après la procédure de nettoyage standard, le verre doit être « chauffé » à +200 °C pendant 4 heures. Utiliser les bouchons en aluminium ou une feuille d’aluminium pour boucher les ouvertures.

Traitement du matériel en plastique

Le matériel en plastique peut être traité avec NaOH 1M pendant 6-12 heures. Ensuite, rincer avec un grand volume d’eau exempte d’endotoxine détectable et d’interférence et laisser sécher à l’air libre. Le pH final de l’eau de rinçage doit être neutre.

Condition du matériel d’échantillonnage

Les échantillons doivent être conservés au réfrigérateur ou au congélateur. Traiter les échantillons avec soin pour éviter toute contamination microbienne ou par endotoxines. Tout le matériel en contact direct avec l’échantillon ou les réactifs doit être exempt d’endotoxine détectable et d’interférence.

4. Autres réactifs, équipements, instruments et logiciels nécessaires Équipement nécessaire

Pipettes Pipette multicanaux ou pipette distributrice Embouts de pipette, exempts d’endotoxine détectable et d’interférence Tubes à essai en verre, exempts d’endotoxine détectable et d’interférence (par ex.

EndoGrade® Glass Test Tubes – Réf. 800050) Instruments Agitateur de type vortex

0-1500 rpm Pour reconstituer l’Endotoxine Standard de Contrôle (CSE), mélanger vigoureusement en passant au vortex à 1400 rpm pendant 10 minutes. Les dilutions d’échantillon et les dilutions de standard doivent être mélangées vigoureusement pendant 2 minutes. Pour un résultat optimal, il est recommandé d’utiliser un vortex multi-tubes.

Incubateur (facultatif)

Idéalement, l’incubation de la microplaque s’effectuera dans le Fluorimètre à 37 °C. Sinon, la plaque de dosage peut être incubée dans un incubateur à 37 °C entre la mesure du point zéro et la mesure au temps de 90 minutes.

Fluorimètre Des Fluorimètres de différents fabricants peuvent être utilisés pour lire les résultats d’EndoZyme®.

Paramètres des instruments : Température 37 °C Filtre d’excitation (nm) 380 Filtre d’émission (nm) 445 Orientation de la mesure Depuis le haut Mesures par puits Minimum 10 Mode agitateur Activé* Sensibilité (échelle = 0 % à 100 %) 1-3 % à 0,5 EU/mL

*Agiter pendant 15 secondes à intensité moyenne avant la lecture du point 0.

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Ajustement de la sensibilité de l’instrument (gain)

La détection par fluorescence offre une plage dynamique de 4 ordres de grandeur. Lors de la première utilisation d’EndoZyme®, le réglage de sensibilité (gain) du lecteur doit être spécifiquement ajusté. Ne pas utiliser l’ajustement de gain automatique car il risque de modifier le gain pendant la mesure. La pente optimale de la courbe standard est obtenue lorsque le signal du troisième standard (0,5 EU/mL) est ajusté entre 1 % et 3 % du signal détectable maximum du lecteur.

Logiciel de calcul Pour l’ajustement de la courbe standard et le calcul de la quantité d’endotoxines dans les échantillons inconnus, un logiciel de calcul est nécessaire. De préférence, les données EndoZyme® de la courbe standard doivent être modélisées par une fonction logistique à 4 paramètres. Sinon, un modèle linéaire peut être utilisé.

5. Conservation et préparation des réactifs Conservation et stabilité

Avant ouverture, les coffrets sont stables entre 2 et 8 °C jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette. Pour plus d’informations sur la conservation et la stabilité de chaque composant, consulter le tableau ci-dessous.

Utilisation des composants du coffret, stabilité et conditions de conservation

Réactif Préparation Stabilité et conditions de conservation des solutions de travail

1 Enzyme (ENZ)

Pour la préparation du réactif Stable jusqu’à la date de péremption entre +2-8 °C.

2 Substrat (SUB) Pour la préparation du réactif Stable jusqu’à la date de péremption entre +2-8 °C.

3 Endotoxine Standard de

Contôle (CSE) (E. coli O55:B5)

Le volume de reconstitution est imprimé sur l’étiquette ; dissoudre le standard lyophilisé dans de l’eau (4) ; mélanger en passant au vortex pendant au moins 10 minutes

Stable pendant 4 semaines entre +2-8 °C ou jusqu’à la date de péremption du coffret en cas de conservation au congélateur sous forme d’aliquotes à -20 °C. Congeler et décongeler une seule fois.

4 Eau (EEB)

Prêt à l’emploi Stable jusqu’à la date de péremption entre +2-8 °C.

5 Tampon (AB) Pour la préparation du réactif Stable jusqu’à la date de péremption entre +2-8 °C.

Réactifs à préparer Reconstitution de

l’Endotoxine Standard de Contrôle (CSE) : Réactif :

Le volume de reconstitution de la CSE (3) est indiqué sur l’étiquette.

Pour la reconstitution, pipeter la quantité d’eau (4) indiquée dans le flacon 3.

Important : utiliser de nouveaux embouts de pipette pour chaque étape de pipetage afin d’éviter la contamination de l’eau.

Fermer le flacon et mélanger vigoureusement en passant au vortex à 1400 rpm pendant 10 minutes. Préparer le réactif juste avant utilisation (voir rubrique 6.6 Procédure du test, pour connaître les quantités).

EndoZyme®

6. Protoc 6.1 Aperçu

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6.2 Instructions générales d’utilisation Instructions d’utilisation

Tous les réactifs nécessaires pour réaliser le test EndoZyme® sont fournis dans le coffret.

Veiller à ne pas contaminer les composants du coffret utilisés. Les réactifs doivent être utilisés à température ambiante (20-25 °C). Pipeter soigneusement pour garantir le transfert précis de petits volumes. Effectuer une courbe standard parallèlement à chaque série de tests. Effectuer toutes les mesures en double. Les réactifs provenant de différents lots NE DOIVENT PAS être mélangés et utilisés

dans une série de tests. 6.3 Préparation du standard Dilution de l’Endotoxine Standard de Contrôle (CSE) :

La CSE (3) reconstituée a une concentration de 50 EU/mL. Pour la préparation de la série de dilution, utiliser des tubes à essai en verre exempts

d’endotoxine détectable et d’interférence. Important : la dilution dans des tubes en plastique peut engendrer une mauvaise récupération des faibles concentrations d’endotoxines.

Pipeter 900 µL d’eau (4) dans chaque tube préparé pour la série de dilution et le blanc. Ajouter 100 µL de CSE reconstituée pour préparer le deuxième standard. Fermer le

flacon et mélanger vigoureusement en passant au vortex à 1400 rpm pendant 2 minutes (pour obtenir une concentration de 5 EU/mL).

Répéter les étapes de dilution successive au 1:10 pour préparer les concentrations suivantes.

Utiliser l’eau (4) comme témoin (contrôle négatif). Les dilutions standard sont stables pendant 8 heures lorsqu’elles sont conservées

entre 2-8 °C.

Concentrations des standards :

Selon la méthode de calcul utilisée, différentes concentrations de standard doivent être préparées :

Modèle de régression non linéaire

Modèle de régression linéaire

50 EU/mL 5 EU/mL 0,5 EU/mL 0,05 EU/mL 0,005 EU/mL

+ + + + +

-- + + + +

6.4 Préparation des échantillons Préparation des échantillons/dilution des échantillons

Les échantillons d’eau peuvent être analysés non dilués. D’autres compositions matricielles peuvent interférer avec le dosage (voir rubrique 6.10). Par conséquent, un test d’interférence est nécessaire. Les interférences (inhibition/accentuation) sont contrôlées en surchargeant un échantillon ou une dilution d’échantillon avec une concentration connue d’endotoxine et en testant la récupération de la surcharge à deux reprises ; voir section 6.5. En règle générale, les interférences matricielles de l’échantillon dépendent de la concentration en composants matriciels autres que l’endotoxine. Dans la plupart des cas, l’inhibition/l’accentuation activation peut être surmontée en diluant l’échantillon dans de l’eau exempte d’endotoxine détectable et d’interférence. Remarque : pour les matrices d’échantillon très complexes, nous recommandons d’utiliser le test de détection des endotoxines EndoLISA®.

Pour la dilution des échantillons, utiliser des tubes à essai en verre exempts

d’endotoxine détectable et d’interférence. Par exemple, une dilution au 1:10 doit être préparée de la manière suivante : Pipeter 900 µL d’eau (4) dans un tube et ajouter 100 µL d’échantillon. Agiter

au vortex pendant 1 minute.

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6.5 Contrôle surcharge Surcharge des échantillons

Les échantillons doivent être surchargés pour déterminer si les composants de l’échantillon interfèrent avec le test et si une dilution est nécessaire (voir rubrique 6.10 pour connaître les paramètres d’interférences).

Matériel de surcharge

L’Endotoxine Standard de Contrôle (CSE) fourni dans le coffret peut être utilisée pour le contrôle de surcharge.

Concentration de la surcharge

La concentration des endotoxines ajoutées doit être égale ou proche du centre de la courbe standard. Une concentration de matériel ajouté de 5 EU/mL ou 0,5 EU/mL est fréquente.

Protocole recommandé Critères de validité

Pipeter au moins quatre échantillons de 100 µL chacun. Ajouter 10 µL de CSE à 50 EU/mL ou 5 EU/mL dans deux puits d’échantillonnage. Procéder selon les instructions de la rubrique 6.6 Procédure du test.

Un résultat est jugé valide si la récupération de la surcharge est comprise entre 50 % et 200 %. Les échantillons donnhant une faible récupération de la surcharge doivent être dilués.

6.6 Procédure du test Préparation du réactif :

Les quantités requises sont présentées dans le tableau ci-dessous. Combiner 8 parts de tampon (5), 1 part d’enzyme (1) et 1 part de substrat (2). Mélanger soigneusement - ne pas passer au vortex. Déposer les volumes indiqués dans un réservoir de réactif exempt d’endotoxine détectable et d’interférence :

Réactif Tampon Substrat

Enzyme

2 mL pour 16 réactions 4 mL pour 32 réactions 6 mL pour 48 réactions 8 mL pour 64 réactions 10 mL pour 80 réactions 12 mL pour 96 réactions

1,6 mL 3,2 mL 4,8 mL 6,4 mL 8,0 mL 9,6 mL

0,2 mL 0,4 mL 0,6 mL 0,8 mL 1,0 mL 1,2 mL

0,2 mL 0,4 mL 0,6 mL 0,8 mL 1,0 mL 1,2 mL

Démarrer le lecteur Attendre que le Fluorimètre atteigne 37 °C.

Remplissage de la microplaque

Sélectionner le nombre de puits nécessaire. Les dosages en double sont recommandées.

Déposer 100 µL d’échantillon ou de dilution standard dans les puits respectifs. Effectuer la supplémentation selon les instructions de la rubrique 6.5. Réchauffer la microplaque avec les échantillons à 37 °C.

Étape de détection Préparer 100 µL de réactif dans chaque puits (description ci-dessus).

Placer la microplaque dans ou près du lecteur et ajouter 100 µL de réactif dans chaque puits. Recommandé : utiliser une pipette distributrice ou une pipette multicanaux pour

réduire le temps de manipulation. Fermer le lecteur et attendre 1 minute que la température se stabilise. Agiter pendant 15 secondes à intensité moyenne. Lire la fluorescence au temps zéro

(première lecture). Incuber la plaque à 37 °C (incubateur ou Fluorimètre). Lire la fluorescence au bout de 90 minutes (deuxième lecture).

Remarque : un temps de réaction plus long peut augmenter la sensibilité du test.

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6.7 Analyse de la courbe standard à l’aide du modèle de régression logistique à 4 paramètres Traitement des données

Retirer les valeurs du temps zéro des valeurs du temps 90 minutes. Calculer la courbe standard à l’aide de l’équation suivante :

Y = (A-D)/(1+(X/C)^B)+D avec un poids ajusté : 1/y

Calculer la concentration de l’échantillon en EU/mL en fonction des paramètres de la courbe standard.

Calculer le coefficient de corrélation (r doit être > ou égal à 0,980). Les valeurs calculées des standards de 5-0,005 EU/mL doivent être comprises entre

60 % et 140 % des concentrations nominales. 6.8 Analyse de la courbe standard à l’aide du modèle de régression linéaire Correction du zéro Retirer les données du temps zéro des données du temps de 90 minutes.

Calculer la valeur moyenne du blanc. Retirer la valeur moyenne du blanc des valeurs des standards/échantillons. Calculer les valeurs moyennes des standards et des échantillons. Calculer le logarithme des valeurs de RFU et de la concentration des standards

(EU/mL).

Courbe standard Représenter la courbe standard (log(EU/mL) vs. log(RFU)). Calculer la fonction en l’ajustant à l’équation linéaire.

Y = A + BX Calculer le coefficient de régression (r doit être > ou égal à 0,980).

Concentration de l’échantillon

Calculer la concentration de l’échantillon en EU/mL sur la base de l’équation linéaire. Multiplier les résultats par le facteur de dilution de l’échantillon.

6.9 Courbes standard types 1. Courbe standard EndoZyme® (modèle de régression logistique non linéaire à 4 paramètres)

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2. Courbe standard EndoZyme® (modèle de régression linéaire)

6.10 Paramètres d’interférences et limites

Les interférences du test (résultats non valides) peuvent être dues à plusieurs facteurs. Les deux principales causes sont l’altération des conditions de réaction enzymatique ou l’altération de l’état d’agrégation des endotoxines de la surcharge en raison des interférences avec la matrice. En règle générale, de telles interférences peuvent être surmontées en diluant l’échantillon dans de l’eau exempte d’endotoxine détectable et d’interférence. Si l’interférence d’un échantillon ne peut être levée avec une dilution acceptable, la méthode de test n’est pas adaptée. Dans cette éventualité, nous recommandons d’utiliser le test de détection des endotoxines EndoLISA®. Série de paramètres pouvant influencer le test :

Température Une température de 37 °C est obligatoire pour la réaction de la détection. Avant utilisation, les composants du test doivent atteindre la température ambiante.

Agitation Après l’ajout de la solution à doser, la plaque doit être agitée vigoureusement.

pH Les échantillons ayant des valeurs de pH extrêmes peuvent influencer le test, si la réserve de tampon du système de test est épuisée. L’interférence peut être examinée avec des techniques de supplémentation. En cas de récupération inadéquate de la surcharge, une dilution ou un ajustement du pH à 7,0 est nécessaire.

Concentration de sel

La concentration totale de sel dans un échantillon ne doit pas excéder 500 mM. En cas de concentration plus élevée, une dilution est nécessaire.

Détergents Les détergents peuvent interférer avec EndoZyme®. L’interférence peut être contrôlée avec des techniques de surcharge. En cas de récupération inadéquate du matériel ajouté, une dilution est nécessaire.

Agents chélateurs Les agents chélateurs (par ex. EDTA, EGTA et citrate) dans l’échantillon interféreront avec le dosage. En présence de ces agents, une dilution ou la neutralisation de l’agent chélateur, avec du magnésium par exemple, est nécessaire. L’interférence peut être contrôlée avec des techniques de surcharge.

Agents chaotropiques

Les agents chaotropiques peuvent interférer avec le test EndoZyme®. L’interférence peut être contrôlée avec des techniques de surcharge. En cas de récupération inadéquate de la surcharge, une dilution est nécessaire.

Solvants organiques

L’interférence des solvants organiques doit être testée. L’interférence peut être contrôlée avec des techniques de supplémentation. En cas de récupération inadéquate de la surcharge, une dilution est nécessaire.

Protéines Les concentrations élevées de protéines peuvent interférer avec le dosage. L’interférence des protéines dépend fortement des propriétés physico-chimiques des protéines. Par conséquent, les interférences dues aux protéines doivent être contrôlées avec des témoins surchargés.

Échantillons biologiques

EndoZyme® n’est pas adapté pour la détection directe d’endotoxines dans les échantillons sériques, plasmatiques ou sanguins.

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7. Élimination des déchets

Les réactifs non utilisés peuvent être éliminés comme déchets non dangereux. Éliminer les réactifs utilisés et tout autre matériel jetable contaminé suivant les procédures relatives aux produits infectieux ou potentiellement infectieux. Il incombe à chaque laboratoire de gérer les déchets et les effluents qu’il produit selon leur nature et leur dangerosité, et d’en assurer (ou faire assurer) le traitement et l’élimination selon les réglementations applicables.

8. Contrôle qualité

EndoZyme® a été conçu et développé de façon à respecter les normes de qualité les plus strictes. Les résultats de notre contrôle qualité sont présentés dans le certificat de contrôle qualité disponible sur notre site Web (www.hyglos.com).

9. Guide de dépannage Observation Cause possible MesurePas de signal Réglages erronés de l’instrument Vérifier les paramètres de l’instrument Lampe défaillante Remplacer la lampe Erreur de pipetage Vérifier les réactifs, répéter le test Température d’incubation beaucoup

trop élevée ou beaucoup trop basse Vérifier le réglage de la température

Pas de signal avec les échantillons

Erreur de pipetage (pas de standard ou d’échantillon pipeté)

Répéter le test

individuels Ingrédients interférents Contrôle par surcharge ; diluer l’échantillon au 1:10

pH inapproprié Vérifier le pH ; neutraliser l’échantillon Niveau de signal Réglage de sensibilité (gain) erroné Ajuster la sensibilité faible Lecteur défaillant (par ex. optiques) Effectuer un contrôle de l’instrument Température d’incubation trop élevée

ou trop basse Vérifier la température

Coffret endommagé (pendant le transport ou le stockage)

Vérifier les conditions de stockage et l’emballage ; contacter le service technique

Coffret ou solutions de travail périmé(es)

Utiliser un nouveau kit ou de nouveaux réactifs

Longueur d’onde ou bande d’émission inappropriée

Le filtre d’émission ne doit pas être supérieur à 445 nm

Bruit de fond élevé dans les standards

Contamination LPS des composants du test (par ex. eau)

Utiliser de nouveaux réactifs

et le contrôle négatif Contamination LPS des flacons ou des embouts de pipette

Utiliser un autre lot de flacons et d’embouts de pipette ; privilégier des flacons en verre ou changer de fournisseur

Longueur d’onde ou bande d’excitation inappropriée

Le filtre d’excitation ne doit pas être inférieur à 360 nm

Importante variation entre les puits

Gradient de température (incubateur, lecteur)

Remplacer l’incubateur, le lecteur

Pipette endommagée Calibrer les pipettes Contrôle surcharge non valide

Ingrédients interférents Diluer l’échantillon

pH inapproprié Vérifier le pH ; neutraliser l’échantillon

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BIOMERIEUX, le logo bleu, Hyglos, Hyglos (Logo), EndoLISA, EndoZyme et EndoGrade sont des marques utilisées et/ou déposées et/ou enregistrées appartenant à bioMérieux, ou à l’une de ses filiales, ou à l’une de ses sociétés. Les autres marques et noms de produits mentionnés appartiennent à leurs propriétaires respectifs.

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13. Historique des révisions

Catégories de type de modifications : N/A Non applicable (première version)

Correction Correction d’anomalies présentes dans la documentation

Modification technique Ajout, révision et/ou retrait d’informations relatives au produit

Administratif Modifications d’ordre non technique perceptibles par l’utilisateur

Les modifications mineures de typographie, de grammaire et de mise en page n’apparaissent pas dans l’historique des révisions.

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2017/01 606356 V2.0 Administratif Tous – changement de modèle

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