1

Modèles d’enzymes • systèmes conçus pour mimer les substrats et les catalyseurs des réactions enzymatiques • facilitent l’étude mécanistique d’une réaction similaire à la réaction enzymatique • informations mécanistiques ainsi accueillies peuvent avancer notre compréhension de la

catalyse enzymatique et nous permettre de concevoir d’autres catalyseurs • section organisée selon les enzymes étudiées, leurs mécanismes natifs et leurs modèles

d’enzyme représentatifs

Références A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism R.B. Silverman, The Organic Chemistry of Enzyme-Catalyzed Reactions Voet & Voet, Biochemistry

2

Phosphodiesterase • catalyse l’hydrolyse des liens P-OR dans des phosphodiesters : (RO)P(O)O- • enzyme digestive qui catalyse l’hydrolyse de l’ARN en nucléotides

Ribonucléase A • première enzyme dont la séquence a été déterminée en 1960 (seulement 124 acides aminés) • synthétisée par Merrifield en 1969 • Moore et Stein ont gagné le Prix Nobel en 1972 pour les techniques de séquençage qu’ils ont

développées pour déterminer la séquence de la RNase A • l’ARN est clivé avec préférence (spécificité) pour une base de côté 3' de pyrimidine (uracile

ou cytosine)

Site actif de la ribonucléase A.

Notez l’orientation des groupes imidazoles des résidus His12 et His119.

Mécanisme • l’ARN est clivé, mais pas l’ADN, à cause de la cyclisation avec 2'-OH qui a lieu, suivie par

l’hydrolyse lente du phosphate cyclique intermédiaire • profil pH-vitesse : deux valeurs de pKa provenants du kcat / KM vs pH : 5.22 et 6.78 (enzyme

libre) ou 6.3 et 8.1 provenants du kcat vs pH (complexe enzyme-substrat) • deux mécanismes ont été proposés pour la réaction catalytique : un mécanisme

« concomitant » et un mécanisme « séquentiel »

3

• mécanisme « concomitant » :

O

O

P OO

OR'

O

R

O

P OO

O

CH2

O

P OO

O

CH2

O H

C

A

OH

O

R

O

P OO

O

CH2

O O

C

PO O

NHN

His12NH

NHHis12

His119

NHN H

NHN

His119

H OH

O

R

O

P OO

O

CH2

O

P OO

O

O H

C

4

• mécanisme « séquentiel » :

O

O

P OO

OR'

O

R

O

P OO

O

CH2

O

P OO

O

CH2

O H

C

A

OH

NHN

His12

NHN

His119

O

O

P OO

OR'

O

R

O

P OO

O

CH2

O

P OHO

O

CH2

O H

C

A

OH

O

R

O

P OO

O

CH2

O O

C

O

O

P OO

OR'

P

O

CH2 A

OH

OOH

NHNH

His12

His119

NHN H

O

R

O

P OO

O

CH2

O O

C

O

O

P OO

OR'

P

O

CH2 A

OH

OO HNH

N H

His119

triester intermédiaire

O

R

O

P OO

O

CH2

O O

C

PO O H

5

Modèle de Breslow • site de liaison fonctionnalisé avec des groupements catalytiques • figure la liaison d’un modèle de substrat par un modèle d’enzyme (« enzyme artificielle ») (J.

Mol. Cat. 1994, 91, 161-174)

Cyclodextrine • polymère cyclique du α-D-glucopyranose • la cyclodextrine peut comprendre six (α), sept (β) ou huit (γ) unités de glucose • son intérieure est relativement hydrophobe, son extérieure est relativement hydrophile

(soluble dans l’eau) • forme un cavité avec des groupements OH primaires autour du bout étroit et des groupements

OH secondaires situés au bout plus large • diamètre interne du β-CD est ~7.0 Å (parfait pour l’inclusion d’un anneau aromatique) • groupes fonctionnels (OH) rendent le CD plus susceptible à modification synthétique, pour

introduire des groupes réactifs

O

OH

HO O

OH

OOH

HO

OOH

O

OH

OH

O

HO

O

HO

OH

O

HO

O

HOOH

O

HOOHO

OH

O

OH

O

OH

HO

O

OH

β-cyclodextrine :(1,4-α-D-glucose)7

6

• Breslow a synthétisé un β-CD substitué sur deux groupes hydroxyles primaires avec un groupe imidazole :

CH2

HO

7

N

N

N

N

• Breslow a aussi synthétisé un phosphate cyclique (qui possède un groupe t-butylphényle qui

se lie bien dans la cavité) en tant que substrat pour la réaction d’hydrolyse suivante:

O

O

P OO

H2O

OH

O

PO

O

OH

Données cinétiques • l’apparition du produit est mono-exponentielle (premier ordre) et démontre la cinétique de

saturation en fonction de la concentration du phosphate cyclique (liaison du substrat suivie par la réaction du complexe formé)

• le profil pH-vitesse déterminé a la forme d’une cloche avec un sommet à pH 6.3 (la forme active du modèle est mono-protoné)

• l’effet isotopique de solvant mesuré est de 4 (effet isotopique primaire) • la grandeur de l’effet isotopique varie selon le pourcentage de D2O en solution (expérience

d’inventaire de protons, « proton inventory »), de manière concordante avec deux protons en vol à l’état de transition (deux transferts de proton en cours)

7

• mécanisme proposé : catalyse « bifonctionnelle » par le complexe « E•S » mono-protoné, impliquant un acide général et une base générale :

N

NN

N

H

O

O

P OO

+

N

N

N

N

H

HOH

O

O

P OO

N

N

H

N

N

O

O

P O

OHHO

N

N

H

N

N

O

O

P O

OHHO

O

O

P O

OHHO

N

N

H

N

N

+

OH

O

P O

OHO

8

• de plus, ils ont étudié l’effet de la substitution d’un oxygène non-liant (sur le phosphore) par un soufre : la réaction est légèrement ralentie, mais elle aurait été beaucoup plus ralentie s’il y avait la formation d’un triester (avec un groupe hydroxyle du β-CD)

• effets isotopiques aussi concordants avec un état de transition légèrement associatif • informations mécanistiques fournis par le modèle étaient utiles pour élucider le mécanisme • MAIS, ce mécanisme (concomitant, figurant la catalyse bifonctionnelle) a été confirmé par

l’étude directe de la réaction enzymatique…

9

Aminotransferases • enzymes qui participent à la dégradation des acides aminés et à l’expulsion de l’ammoniac • dépendent du coenzyme pyridoxal-5'-phosphate (PLP) / pyridoxamine phosphate (PMP) :

N

O

CH3

H

H2C-2O3PO

CH2

NH2

pyridoxamine-5'-phosphate (PMP)

N

CH O

O

CH3

H

H2C-2O3PO

pyridoxal-5'-phosphate(PLP)

N

O

CH3

H

H2C

-2O3PO

CH2HO

pyridoxine(vitamine B6)

Site actif de l’aspartate aminotransferase, avec un analogue de la PLP.

Notez l’orientation de la Lys258.

10

Mécanisme • catalysent le transfert d’un groupe amino d’un acide aminé au coenzyme, suivi par le transfert

du groupe amino du coenzyme à un α-cétoacide • dans la première étape de la réaction globale, un acide aminé réagit en tant que donneur du

groupe amino (comme une source d’ammoniac) et produit un α-cétoacide • dans la deuxième étape de la réaction globale, un deuxième α-cétoacide réagit comme un

accepteur d’ammoniac pour former un deuxième acide aminé

acide aminé1 Enzyme-PLP α-cétoacide1+ Enzyme-PMP+

Enzyme-PMP α-cétoacide2 + Enzyme-PLPacide aminé2 +

11

• mécanisme général des aminotransferases :

N

CH N

H

(CH2)4

O

CH3

H

H2C-2O3PO

Enzyme

C

NH2

R

H

CO2-

+

C

N

R

H

CO2-

N

CHN

H

(CH2)4

O

CH3

H

H2C-2O3PO

Enzyme

HH

N

CH N

H

O

CH3

H

H2C-2O3PO

CR

H

CO2-(CH2)4

Enzyme

NH2

Acideα-aminé

Base de SchiffEnzyme-PLP

IntermédiaireDiamine géminal

Base de SchiffAcide aminé-PLP

N

CH N

H

O

CH3

H

H2C-2O3PO

CR

CO2-(CH2)4

Enzyme

H2N H

N

CH N

H

O

CH3

H

H2C-2O3PO

H

H(CH2)4

Enzyme

NH2

(CH2)4

Enzyme

NH2

N

CH N

H

O

CH3

H

H2C-2O3PO

CR

O

CO2-

H

H

(CH2)4

Enzyme

NH2

N

CH N

H

O

CH3

H

H2C-2O3PO

CR

CO2-

H

OH

Cétimine

Carbinolamine Enzyme•PMP

CR

O

CO2-

Acide α-céto

+

CR'

O

CO2-

C

NH2

R'

H

CO2-

12

Modèle de Breslow • les groupes coenzymes PLP et PMP peuvent tout seuls catalyser la plupart des réaction dans

lesquelles ils sont impliqués, mais les réactions en absence du reste de l’enzyme sont plus lentes et ne démontrent pas de sélectivité

• Breslow a donc synthétisé un β-CD substitué avec un groupe PMP (Science 1982, 218, 532-537 ; JACS 1980, 102, 421-422)

CH2

HO

7

N

CH

N H

OH

CH3CH2

H

H

CH2S

β-cyclodextrine-PMP • le β-CD-PMP est capable de transformer des α-cétoacides en acides α-aminés :

N

CH

N H

OH

CH3CH2

H

H

CH2S

β-cyclodextrine-PMP

+ R

NH2

CO2HR

O

CO2H+

N

CH OH

CH3CH2

CH2S

O

β-cyclodextrine-PLP

13

Liaison (?) • les α-cétoacides aromatiques transformés en acides-aminés plus rapidement que les

α-cétoacides alkyles ; e.g. Trp produit ~200 fois plus rapidement que Ala • cette préférence n’a pas été observée pour la réaction avec la PMP tout seul • cette observation a été interprétée en termes de la liaison du bicycle aromatique dans la cavité

de la cyclodextrine… • MAIS, aucune cinétique de saturation n’a été rapportée…

Stéréosélectivité • la cavité est chirale (formée des monomères chirales), ce qui permet de la stéréosélectivité ; • e.g. : 3 fois plus de L-Phe est produit que D-Phe, ce qui n’est pas observé avec le PMP tout

seul (MAIS : Rappel : ee = quel % ? seulement 50 %) • par contre, cette comparaison a été faite pour un α-cétoacide qui ne réagit pas très bien ; dans

le cas d’un α-cétoacide plus réactif, aucune comparaison n’a été faite (réactivité vs sélectivité ?)

• (en raison de comparaison, un dérivé chiral de la PMP a été synthétisé par le même groupe de recherche (JACS 1984, 106, 1490) et donne des ee de 92%)

Catalyse • le système est catalytique ; en présence d’un deuxième acide aminé (source du groupe amino)

le coenzyme est régénéré ; un acide aminé est converti en cétoacide et un cétoacide est converti en acide aminé

• appelé «la première génération des transaminases artificielles » MAIS qu’est-ce qui arrive

depuis les années 80 ? ? • récemment, les dérivés modifiés ont été synthétisés (Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 709-714)

mais l’énantiosélectivité est encore modeste et aucune autre étude mécanistique n’a été rapportée…

14

Protéases à Sérine • catalysent l’hydrolyse (des esters et) des amides – les protéines, les peptides • étudiées deouis 40 ans, leur mécanisme est parmi les mieux compris (surtout pour la trypsine,

la chymotrypsine, l’élastase et la subtilisine) • contiennent un triad catalytique de Ser, His et Asp :

Triade catalytique au site actif de la chymotrypsine : Ser195, His57, Asp102

15

Chymotrypsin • provient de la pancréas et aide à la digestion des protéines à l’intestin • catalyse l’hydrolyse du lien peptidique « après » (de côté du terminus C) un acide aminé dont

la chaîne latérale contient un groupe aromatique – Phe, Trp, Tyr)

Mécanisme • cinétique biphasique dans la réaction avec le pNPA : une phase rapide à l’état pré-

stationnaire, suivie par une phase lente à l’état stationnaire (implique la formation d’un intermédiaire) :

[p-n

itro p

heno

late

] (m

M)

Temps (min)0 2 4 6 8 10 12

0

1

2

3

4

[E]=0.8 mg mL-1

[E]=0.4 mg mL-1

(Biochem. J. 1954, 56, 294)

• l’intermédiaire impliqué est l’acyl-enzyme ; le cycle catalytique figure une étape d’acylation (N!O) et une étape de désacylation (O!O)

• le profil pH-kcat plafonne à haut pH (pKa ~7) (la forme basique de l’imidazole est nécessaire pour la catalyse)

16

Ser

O H

His

NN H

O

O Asp

N

H

R'

O

R

Intermédiaire tétraédrique

His

NN H

O

O Asp

H

Ser

O

O

R N

R'

H

Ser

O

O

R

His

NN H

O

O Asp

N

R'

H

H

Acyl-enzyme intermédiaire

R'NH2H2O

His

NN H

O

O Asp

Ser

O

O

RH

OH

Ser

O

O

R O

H

His

NN H

O

O Asp

H

Intermédiaire tétraédrique

O

HO

R

His

NN H

O

O Asp

Ser

O H

Complexe Michaelis

• le mécanisme a été vérifié en étudiant le mécanisme d’inhibition de l’enzyme par des inhibiteurs naturels (qui empêchent, par exemple la digestion catalytique de la pancréas!) qui sont des analogues de l’état de transition pour la formation de l’intermédiaire tétraédrique

• un aspect important de l’enzyme est la présence d’une poche oxyanionique (« oxyanion hole ») qui stabilise l’intermédiaire tétraédrique, mais pas le groupe carbonyle du substrat

17

Modèle de Bender • Bender a couplé un modèle d’un site de liaison (oui, c’est encore un cyclodextrine !) avec un

modèle de la triade catalytique des protéases à sérine • en fait c’était un des premiers modèles d’enzyme d’incorporer tous les composants du

système enzymatique, dans la même molécule, pour participer à une réaction intermoléculaire avec un modèle de substrat

• la molécule choisie comme un modèle de substrat était l’acétate de p-t-butylphényle (ce qui n’est pas, malheureusement, un amide !)

+

O

O

H3C

O

O

H3CO

H

S

NN CO2

-

H

S

NN CO2

-

HO

H

O

O

O

H3C

S

NN CO2

-

H

HHO

CH3CO2-

OH

S

NN

CO2-

H

18

Données cinétiques • cinétique de saturation observée, permettant le calcul des constantes kcat et KM (en indiquant

qu’il y a la formation d’un complexe de liaison) • 1 mmol de catalyseur a effectué l’hydrolyse de > 10 mmol de substrat (regéneration de

catalyseur; la vraie catalyse) • cinétique biphasique : l’observation d’un « burst » au graphique de [produit] vs time

(formation rapide d’un intermédiaire dont la réactivité limite la vitesse de la réaction à l’état stationnaire) :

[ p- t-

buty

l ph e

nola

te]

Temps

(Acc. Chem. Res. 1987, 20, 146-152.)

• la réaction est trois fois plus lente dans le D2O que dans l’eau (ce qui indique qu’il y a un proton en vol à l’état de transition et suggère que le mécanisme entraîne la catalyse de base générale et ne pas la catalyse nucléophile, ce qui est aussi possible avec des imidazoles)

• le profil pH-kcat plafonne au-delà de pH 10 (ce qui indique que la forme basique est active et est à l’appui d’un rôle en tant que base générale pour le groupe phénylimidazole)

• comparaisons (par l’auteur!) entre la chymotrypsine et la « chymotrypsine artificielle » :

o modèle plus stable par rapport aux conditions de pH et température o modèle plus efficace que l’enzyme par rapport à leurs masses moléculaires o le point de départ pour la synthèse des « enzymes artificielles » o « the ultimate proof of the mechanismof chymotrypsin catalysis »

• MAIS, la chymotrypsine catalyse l’hydrolyse des amides au pH 7 !

19

Modèle de Brown • Brown a proposé un modèle de la triade catalytique des protéases à sérine sans aucun site de

liaison • il a aussi proposé un modèle de substrat qui ressemble beaucoup plus au substrat natif (et

pourrait avoir un mécanisme d’hydrolyse plus similaire) :

N

N

O OH

O

H

NO

N

N

O OH

O

N

H

O

GBC

GBC

N

N

O OH

OHN

H

O

O

(JACS 1989, 111, 1445-1451)

20

Protéase à Cystéine • catalysent l’hydrolyse des (esters et des) amides – les peptides, les protéines • étudiées deouis longtemps, leur mécanisme est assez bien connu, surtout pour la papaïne • contiennent un « triade » catalytique de Cys, His (et Asx : Asp ou Asn)

Papaïne • provient du papaye ; son rôle physiologique est (peut-être) de catalyser l’hydrolyse des

enzymes digestives des insectes qui mangent les feuilles ou le fruit

Site actif de la papaïne : His159 et Cys25.

Mécanisme • le profil pH-kcat montre des valeurs de pKa cinétique de 4.2 et 8.3 (la Cys25 et la His159 du

site actif sont actives sous forme zwitterionique (thiolate imidazolium) au pH neutre) • il n’y a aucun cas rapporté de la catalyse de base générale de l’attaque nucléophile d’un thiol ;

c’est toujours la forme thiolate qui fait l’attaque • l’hydrolyse des anilides substitués donne un graphique de Hammett dont ρ = -1.04, et l’effet

isotopique pour l’azote du groupe partant est assez grand ( )NN 1514 kk = 1.024 (ce qui

suggèrent que le départ de l’amine est impliqué dans l’état de transition de l’étape limitante (i.e. la décomposition de l’intermédiaire tétraédrique) :

21

Cys

S

His

NN H

H

N

H

R'

O

R

Intermédiaire tétraédrique

His

NN H

H

Cys

S

O

R N

R'

H

Cys

S

O

R

His

NN H

N

R'

H

H

Acyl-enzyme intermédiaire

R'NH2H2O

His

NN HCys

S

O

RH

OH

Cys

S

O

R O

H

His

NN H

H

Intermédiaire tétraédrique

O

HO

R

His

NN H

H

Cys

S

Complexe Michaelis

• pour l’étape de désacylation, l’effet isotopique dans le D2O est de ~3 et le profil pH-kcat plafonne au-delà de pH ~4 (catalyse de base générale de l’hydroyse de l’acyl-enzyme)

22

Modèles avant Brown • la plupart de modèles figurent la réaction intramoléculaire des thiolesters substitués avec des

groupements imidazoles, ou la réaction intermoléculaire entre des thioles (et thiolamines) et des esters activés (oui, c’est encore le pNPA)

• par contre, aucun modèle n’a démontré la collaboration entre le groupe amino et le groupe thiol

• de plus, très peu de systèmes modèles entraîne la réaction intermoléculaire entre des thiolamines et des amides (pourquoi? les amides réagissent très lentement…)

Modèle de Brown

Modèle de substrat • Brown a synthétisé un amide tendu (JOC 1986, 51, 2676) qui figure la distorsion du lien

amidique et diminue ainsi l’importance de la stabilisation due à la résonance, le rendant plus susceptible à l’attaque nucléophile :

N

O

hydrolysé 107 fois plus rapidement que N

CH3

O

CH3

• l’amide tendu est supposé de ressembler à un peptide lié au site actif d’une protéase (déstabilisation de l’état fondamental du complexe Michaelis lors de la distorsion du substrat)

Modèle d’enzyme • Brown a proposé un modèle simple (qui ressemble à son modèle d’une protéase à sérine), qui

comprend deux groupements importants : un thiol alkyle et un imidazole simple (par rapport aux thiophénols et aux benzimidazoles)

e.g. :

N

N SH

CH3 • la synthèse des ces modèles est légèrement plus compliqué, et ils sont légèrement plus

susceptibles à l’oxydation (tout comme les protéases à cystéine !)

23

Données cinétiques • le progrès de la réaction est suivi lors de l’ouverture du cycle pour « libérer » l’aniline comme

chromophore • pas de cinétique de saturation (parce que le modèle ne contient aucun site de liaison !) • réaction de deuxième ordre • la régénération du catalyseur est très lente (l’étape de « désacylation » est plus lente que

l’étape « d’acylation ») • le profil pH-vitesse a la forme d’une cloche (ce qui signifie que la vitesse maximale est

réalisé lorsque le système est sous la forme « monoprotonée ») • les valeurs des pKa ont été déterminées d’être 6.48 et 9.25 (probablement du thiolimidazole et

pas de l’amide) • au pH 7, ~70 % du modèle d’enzyme existe en forme zwitterionique :

N

N SH

CH3

N

N SH

CH3

H

N

N S

CH3

H

N

N S

CH3

k2 [amide]

24

• mécanisme proposé (JACS 1992, 114, 7983-7989):

N

N S

CH3

H

N

O

N

N

S

CH3

H

N

O

N

N

S

CH3

N

OH

N

N

S

CH3

N

OH

NN CH3

N

O

H

S

H2O

GBC

N

O

H

OH

NN CH3

S

H+

• il est à noter que la forme zwitterionique est active parce qu’elle contient un nucléophile

(thiolate) et un agent de protonation du groupe partant • il n’y a pas de catalyse de base générale de l’attaque nucléophile du thiol tout comme il n’y a

pas de catalyse d’acide général pour l’expulsion du thiolate (selon la loi de réversibilité microscopique)

• l’état d’ionisation de la forme active appuie la proposition que le site actif de la papaïne est aussi active en cette forme

• l’effet isotopique cinétique est 1.0 (ce qui signifie qu’il n’y a pas de proton en vol à l’étape limitante de la réaction ; c’est soit l’attaque nucléophile ou la décomposition de l’intermédiaire tétraédrique « piégé »)

25

Conclusions et pertinence • ce modèle est à l’appui de l’hypothèse que c’est bien la forme zwitterionique du site actif qui

est en le bon état d’ionisation pour faire la catalyse • le catalyseur est assez efficace pour l’hydrolyse et la formation des amides (JACS 1994, 116,

4669-4673) (application ?) • un autre élément important de cette étude est la différence entre le profil pH-vitesse pour la

réaction de l’amide avec la catalyseur et celui pour la réaction avec le pNPA :

N

O

N

N S

CH3

H

O

O

CH3

O2N

N

N S

CH3

N

N SH

CH3

H

log

k 2ob

s

0 -

1 -

2 -

-1 -4 115 6 7 8 9 10

pH • on voit ici que les mécanismes ont des dépendances de pH qui sont assez différentes (le

pNPA n’ayant pas besoin de protonation de son groupe partant et étant capable de réagir avec les deux formes de thiolate)

• ceci démontre l’importance de la conception du modèle vis-à-vis la pertinence des résultats au système biologique…

26

Métallophosphatase • catalysent l’hydrolyse des phosphates (monoesters) • joue un rôle important dans le phénomène de la transduction de signal : la phosphorylation

est souvent utilisée pour activer des protéines (enzymes) dedans la cellule : • e.g. : la phosphorylation d’une Sér rend le résidu ionique (négativement chargée) et

capable d’attirer des Arg pour effectuer un changement de conformation de la protéine

M•e1e1

K1+M

Enzyme modificative

formemoinsactive

formeplus

active

Enzyme démodificative

formeplus

active

forme moinsactive

e2K2

+D D•e2

EOH

formemoinsactive

formeplus

active Enzyme ciblée

H2OPi

ATP ADP

E*P

Représentation générale d’un cascade de régulation enzymatique • les phosphatases sérine/thréonine ont besoin de deux ions métalliques pour leur activité, ce

qui suggère un mécanisme associatif qui entraîne l’activation des phosphoesters par deux acides de Lewis

• ces enzymes lient les phosphates sous forme oxyanionique :

RO P

O

O

O

27

Phosphatase de phosphoprotéine 1 • rôle physiologique : métabolisme du glycogène aux muscles ; déphosphorylation (et donc

désactivation) des enzymes qui catalysent la phosphorylation (qui résulte en la consommation) du glycogène :

• transduction des signaux : nettement, la PP1 est activée par l’insuline pour « communiquer le

message » de synthétiser le glycogène, tandis qu’elle est désactivée par l’épinéphrine pour transmettre le message de consommer le glycogène

M•e1e1

K1+M

Enzyme modificative: Phosphorylase kinase

formemoinsactive

formeplus

active

Enzyme démodificative: Phosphoprotéine phosphatase-1

formeplus

active

forme moinsactive

e2K2

+D D•e2

EOH

formemoinsactive

formeplus

active

Enzyme ciblée:Glycogène phosphorylase

H2OPi

ATP ADP

E*P

Consommation du glycogène

Synthèse du glycogène

(activée par l'épinephrine)

(activée par l'insuline)

28

• existe sous forme d’un complexe dinucléaire avec MnII et FeII :

N

N

H

H

His125

O

O

Asp95

Tyr272

HO

HOH

OP

O

OO

R

O

O

Asp92

HN

N

His173

NHN

His248

Asn124O

NH2

MnII FeIIHO O

OAsp64

HN

N

His66

• les ions métalliques exaltent la nucléophilie d’une molécule d’eau (qui est rendue

effectivement un anion hydroxyde) • selon les résultats des expériences de mutagenèse, le résidu de la His éloignée est aussi

important ; l’enzyme mutée H125A est inactive • la His125 joue probablement le rôle d’un acide général qui catalyse le départ de l’alcool

29

Modèles de Chin • complexe dinucléaire avec deux atomes de CoIII qui réagit de manière intramoléculaire pour

donner le produit d’hydrolyse (voir Acc. Chem. Res. 1999, 32, 485-493 et JACS 1999, 121, 3341-3348):

Co3+

NH

HNO

OO Co3+

NH

O

NHNH

P

OO

HNH

H

X

Co3+

NH

HNO

OO Co3+

NH

O

NHNH

P

OO

HNH

HH2O

XO

Données pH-vitesse • la valeur de log khyd augmente de manière linéaire avec le pH (entre ~5 et ~13); i.e., khyd

dépend de la concentration de –OH (alors la forme basique du système est la forme active) • MAIS le pKa cinétique ne peut pas être déterminé sans un plateau du graphique (pKa > 13?)

Données d’échange d’isotope • l’étude de la réaction effectuée dans le H2O18 indique qu’aucun 18O n’est incorporé dans le

produit d’hydrolyse (alors la réaction est intramoléculaire) • en suivant la réaction du composé marqué avec 18O dans le H2O par RMN-31P, le couplage

31P-18O indique qu’un nouveau lien P-18O est formé (ce qui suggère que la réaction intramoléculaire implique un attaque nucléophile sur le phosphore par un oxygène)

Données du graphique de Brønsted • le changement du groupe partant aux « substrats » (phosphoesters aromatiques) affectent

assez fortement la constante de vitesse observée à un pH donné : βlg = -1.1 (ce qui indique qu’il y a du bris partiel du lien P-OAr à l’état de transition)

• une fois que l’on corrige pour l’effet sur l’équilibre, on peut calculer la charge sur l’oxygène partant à l’état de transition et donc le degré de bris du lien : 67 % brisé (ce qui est loin de complet et donc le mécanisme est seulement partiellement dissociatif (et donc partiellement associatif))

• c’est dommage qu’on pouvait pas déterminer si le groupe substituant influençait aussi le pKa cinétique…

30

Mécanisme proposé

Co3+

NH

HNO

OO Co3+

NH

O

NHNH

P

OO

HNH

H

XO

Co3+

NH

HNO

OO

Co3+

NH

O

NHNH

P

OO

HNH

H

X

Co3+

NH

HNO

OO Co3+

NH

O

NHNH

P

OO

HNH

X

Ka

+ L2OL3O++

k

Co3+

NH

HNO

OO Co3+

NH

O

NHNH

P

O

HNH

• système est facile (?) à caractériser, mais il ne représente qu’une réaction intramoléculaire

modèle (pas de catalyse)

Données des effets isotopiques • l’effet isotopique de solvant (D2O plutôt que H2O) sur kobs ( = kKa / Kw) est inverse et égale

0.56 • pour une réaction qui implique la réaction intramoléculaire de la forme basique d’un

composé, cet effet est le résultat de la combinaison des effets isotopiques sur l’acidité du composé (Ka), l’acidité du solvant (Kw) et la solvatation des produits libérés dans l’étape limitante (k)

• l’effet sur k est calculé d’être assez petit (désolvatation), ~1.1 • l’effet sur 1/Kw est connu d’être 0.135 • l’effet sur Ka est habituellement entre 2.5 et 4 pour acides oxygénés et peut être calculé (selon

kobs = kKa / Kw) d’être 3.8 ( 0.56 = 0.135 × 1.1 × 3.8 ) • (effets isotopiques concordants avec mécanisme proposé, mais n’aident pas à la proposition

d’un mécanisme, sauf peut-être l’ionisation avant l’étape limitante)

31

• grâce au changement du modèle – en utilisant le CuII plus labile – la réaction intramoléculaire

modèle avec ApA (plus pertinente?) a été démontrée :

O OP

OO

OO

O

HOAd

Ad HO

OH H

Cu2+

N

HNHN

Cu2+

NNHNH

OH HO

• MAIS, aucune évidence de catalyse pour les deux modèles • réactions modèles sont quand même 103 – 106 fois plus rapides que les réactions de fond

32

Décarboxylases • enzymes métalliques (e.g. décarboxylase d’oxaloacétate) et non-métalliques (e.g.

décarboxylase d’acétoacétate) qui catalysent la décarboxylation des acides caroxyliques

Décarboxylase d’acétoacétate • joue (possiblement) un rôle métabolique chez les micro-organismes • catalyse la décarboxylation de l’acétoacétate pour donner l’acétone et le dioxyde de carbone :

C H3C

O

CH2C

O

OHC

H3C

O

CH3

O

C

O

+

• utilisée pendant la première guerre mondiale pour la production de l’acétone, un composant

important de la colle pour les ailes des avions, à partir de l’acétoacétate, un produit naturel hautement disponible

Mécanisme proposé • le mécanisme a été proposer d’impliquer la catalyse covalente, plus spécifiquement la

formation d’une base de Schiff (à partir d’un résidu de Lys) :

Réaction chimique :

Réaction enzymatique :

H3C

O O

O

CO2

H3C

O

CH2

H+

H3C

O

CH3

RNH2

-OH

H3C

N O

O

R H CO2

H3C

N

CH2

HR H+

H3C

NR H

CH3

-OH

RNH2

33

Expériences de marquage • Westheimer a trouvé que la réaction enzymatique avec acac-18O produit de l’eau marquée :

+CH3C

O

CH3

CH3C

18O

CH2C

O

OH

acétoacétatedécarboxylase

H2OH2

18O+CO2

• Westheimer a également montré que la réaction enzymatique effectuée dans le D2O donne de

l’acétone marqué :

CO2 + HODD2O

acétoacétatedécarboxylase

CH3C

O

CH2C

O

OHC

H3C

O

CH2D+

Piégeage • Westhemier a aussi « quenché » (éteint) la réaction enzymatique lors de l’ajout du NaBH4 qui

réduit la base de Schiff pour piéger l’enzyme en forme alkylée au résidu Lys115 :

H3C

N O

O

R H CO2

H3C

N

CH2

HR H+

H3C

NR H

CH3

NaBH4

H3C

NR H

CH3 H

34

Mutagenèse • l’enzyme mutée K115C est inactive ; MAIS la modification de la Cys115 avec 2-

bromoéthylamine (Gerlt & Kenyon) restaure l’activité ! (« chemical rescue ») :

mutagénèse

active inactive active

BrCH2CH2NH2 S

H2N

Cys115Cys115

SH

H2N

Lys115

35

Décarboxylase d’oxaloacétate • catalyse la décarboxylation de l’oxaloacétate :

CC

O

CH2C

O

OH

O

HO

O

C

O

+CC

O

CH3

O

HO

acide oxaloacétique acide pyruvique • le mécanisme enzymatique dépend de la présence d’un métal – Mn2+ ou Mg2+

Expériences de marquage • la réaction enzymatique avec un β-cétoacide marqué donne la cétone marquée :

B

H

Mn2+

CC

18O

CH2

O

-OCO2-

Mn2+

CC

18O

CH2C

O-

O

O

-OMn2+

CC

18O

CH2C

O-

O

O

-O

CC

18O

CH3

O

-O

36

Application industrielle • le processus de Rozzell est utilisé pour synthétiser la Phe :

CC

O

CH2C

O

OH

O

HO

O

C

O

+CC

O

CH3

O

HO

acide oxaloacétique acide pyruvique

oxaloacétatedécarboxylase

+

CC CH2

C

O

OH

O

HO

H2N H

acide L-aspartique

+transaminase

CC

O

HO

H2N H

RC

C

O

O

HOR

2-cétoacide acide L-aminé • notez l’usage de la transaminase ! • il serait préférable de pouvoir utiliser un catalyseur sans métaux…

37

Modèle de Benner • catalyse de la décarboxylation de l’oxaloacétate selon le mécanisme de la décarboxylase

d’acétoacétate – catalyse covalente; formation d’une base de Schiff; pas de métaux • conception (design) rationnelle d’un nouveau catalyseur de squelette protéique (Nature 1993,

365, 530-532.)

Conception • basée sur les critères jugées d’être critiques pour la catalyse, étant donné ce qui est connu du

mécanisme de la décarboxylase d’acétoacétate et du mécanisme de la réaction de l’oxaloacétate avec une amine simple :

CC

O

CH2C

O

O-

O

-Ok1

k-1

OA

+RNH2

C

CC CH2

C

O

O-

O

-O

RHN OH

k2 [H+]k-2

CC

N

CH2C

O

O-

O

-O

HR

I1

CC

N

CH2

O

-O

HR

CO2

CC

O

CH3

O

-O

+RNH2

CC

N

CH3

O

-O

HR

I2

P

k3

• critères pour la catalyse :

1. présence d’une amine primaire pour former une imine ; soit un groupe amino-α ou un groupe amino-ε (Lys)

2. accélération de l’étape limitante : formation de l’imine I1 au-delà de pH 4

3. entre pH 4 et 7, l’étape limitante est l’élimination de l’eau à partir de la carbinolamine, ce qui est catalysée par acide spécifique, alors les acides généraux ne sont pas nécessaires

4. puisque la carbinolamine est l’intermédiaire de plus haute énergie, l’état de transition pour la formation de l’imine à partir de la carbinolamine ressemble à la carbinolamine ; donc, il faut stabiliser la carbinolamine pour stabiliser l’état de transition et ainsi accélérer la réaction (comment? interactions électrostatiques)

38

5. l’amine libre est la forme active pour l’attaque nucléophile, mais βnuc = 0.5 ; alors l’efficacité catalytique augmente par 0.5 unité de log lors de chaque unité de diminution du pKa à un pH donné jusqu’à ce que le pKa ≈ pH ; au pKa < pH, la concentration de l’amine libre augmente très peu, et la nucléophilie diminue encore; (alors le pH optimal est ~ pKa )

6. la basicité de l’amine affecte similairement la probabilité de la réaction de l’imine pour expulser un équivalent de CO2 ou de subir d’une attaque nucléophile par l’eau (étape inverse) ; donc, le ratio de partition est indépendant du pKa de l’amine ; donc, la perturbation de la basicité de l’amine n’affectera pas cette étape de catalyse

Réalisation • le squelette choisi est une hélice-α ; (ce qui baisse le pKa de l’amine-α par l’effet de dipôle

hélice) • plusieurs Lys sont situées à côté l’une de l’autre, ce qui perturbe leurs pKa par effet

électrostatique • synthétisé sur phase solide en utilisant « la chimie standard de Boc » ; purifié par HPLC

(phase inverse)

Côté hydrophobe

Côté hydrophile

RNH-Leu-Ala-Lys-Leu-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-CONH2

Leu LeuLeu

Ala

Ala

Lys

LysLys

Leu

Ala

LysLys

Leu

Leu

H2NCO

RNH

1

2

3

45

67

8

9

10

11

12

1314

39

Données cinétiques • la structure hélice a été établie à l’aide des études de CD et des nOE, et à cause de la

dépendance de la concentration de TFE • le progrès de la réaction a été suivi par la disparition de l’énol de l’oxaloacétate et/ou la

formation de la pyruvate, détecté par sa réaction avec une enzyme • la cinétique de saturation a été observée, ce qui n’était pas observée avec des amines simples

(ce qui signifie qu’un complexe est formé – liaison ?) • la réactivité nécessite la formation de hélice – la protéine mutée est moins active (alors la

« liaison » dépend de la structure secondaire) • la réaction est accélérée : kcat / KM = 103 – 104 × k2 (pour des amines simples), « due à la

stabilisation électrostatique » :

Énergie libre

Co-ordonnée de réaction

A + O

M + O

k1

k2k3

C

I1

CO2-

perturbation du pKa

interactions électrostatiques

40

Comparaisons • par rapport, les anticorps catalytiques accélèrent la réaction 103 – 106 fois; la décarboxylase

d’oxaloacétate l’accélère 108 fois • la « liaison »,n’est pas aussi bonne avec l’acétoacétate (donc elle implique une spécificité –

probablement purement électrostatique ?) • la « stabilisation électrostatique » par autant de Lys est compliquée; mais la catalyse n’est pas

simplement due à la perturbation du pKa des amines; par contre l’augmentation de la concentration effective de la Lys doit être aussi important (quelle(s) Lys font la catalyse ? quelle expérience de contrôle pourrait-on faire ?)

• il est à noter que l’on pourrait tenter de catalyser le processus de Rozzell à l’aide de deux

différents modèles d’enzymes : • application potentielle : la catalyse de la synthèse stéréochimique des acides aminés par

des catalyseurs synthétiques ?

CC

O

CH2C

O

OH

O

HO

O

C

O

+CC

O

CH3

O

HO

acide oxaloacétique acide pyruvique

+

CC CH2

C

O

OH

O

HO

H2N H

acide L-aspartique

+

CC

O

HO

H2N H

RC

C

O

O

HOR

2-cétoacide acide L-aminé

à la Benner

Leu LeuLeu

Ala

Ala

Lys

LysLys

Leu

Ala

LysLys

Leu

Leu

H2NCO

RNH

N

CH

N H

OH

CH3CH2

H

H

CH2S

à la Breslow

41

Catalyseurs « de novo » • nouveaux catalyseurs qui sont conçus selon des critères pour la catalyse d’une réaction ciblée,

déterminées par des études mécanistiques précédantes de la réaction chimique et enzymatique • miment des enzymes en principe mais pas nécessairement en détail • souvent conçus pour catalyser des réactions jugées utiles ; par exemple :

Ligase peptidique • dans un article récent (JACS 2001, 123, 1797-1803) Ghadiri résume très bien le domaine des

modèles d’enzymes et présente un système qui démontre la catalyse de la formation d’un lien peptidique entre deux protèines (voir aussi Nature 1997, 389, 706-709)

Conception • le système démontre très bien l’importance de la complémentarité et de l’approche dans la

catalyse • deux hélices-α ont été conçues qui forment un dimer (« E•P ») ; la hélice-α « P » a été divisé

en deux fragments (« S ») avant un résidu Cys • le fragment N-terminal était dérivé en ester thiobenzyle et réagit avec le fragment C-terminal

de manière non-catalysée pour donner le produit « P » encore :

HN

O

H2N

HS

NH

O

S

S

NH

O

HN

O

H2N

S

P*

NH

O

HN

O

HN

SH

P

42

• l’autre protéine du dimer (« E ») sert comme un gabarit pour rapprocher les deux fragments et accélérer la réaction :

Sαααα Sωωωω

kuncat

P

SωωωωSαααα

EE•Sαααα•Sωωωω

E•P*

kcat

E•P

Données cinétiques • la cinétique de saturation a été observée (ce qui signifie la formation d’un complexe des

réactifs) • la réaction en présence des quantités sous-stoechiométriques du gabarit est accélérée (~4000

fois) par rapport à la réaction en absence du gabarit et la vitesse réactionnelle dépend de la concentration du gabarit (ce qui signifie la catalyse)

• le thiol utilisé pour former le thiolester de départ a été varié et une relation « linéaire » a été déterminée entre la constante de vitesse et le pKa de l’acide conjugué du groupe partant ; la pente βnuc de ce graphique de Brønsted est ~ -0.2 (ce qui signifie que la vitesse réactionnel dépend légèrement de la nucléofugalité de la thiolate, suggérant ainsi que le départ est impliqué à l’état de transition de l’étape limitante)

• « démonstration de la possibilité de concevoir des sites de liaison de substrat et l’utilité des

hélices-α dans la construction des enzymes artificielles », MAIS : • la « conception » d’un site de liaison ? les substrats ont été « retro-conçus » à partir du

produit ! est-ce que le site démontre de la specificité (en compétition avec d’autres substrats similaires) ?

• quel est le dépendance de pH du système ? par exemple, est-ce que l’ionisation du thiol est importante ?

43

Commentaires • distinction (subtile) possible :

• modèle d’enzyme : conçu pour ressembler à la structure de l’enzyme, étudié pour révéler le mécanisme enzymatique (apprentissage)

• mimique d’enzyme : conçu pour mimer l’activité de l’enzyme, basé sur ce qui est déjà connu du mécanisme, typiquement en incluant certains éléments de la structure, et souvent utilisé pour catalyser une réaction similaire (application)

• limitation de la pertinence du modèle d’enzyme est la qualité de la conception du système • très utiles au cours des années passées pour l’accueil des informations mécanistiques des

réaction enzymatiques • pas encore passé de mode ! • MAIS, il est maintenant plus facile (qu’avant) d’étudier directement les réaction

enzymatiques • on a des outils de plus en plus puissants (e.g. biologie moléculaire, mutagenèse) • le développement de nouveaux catalyseurs est encore le but ultime de la modélisation des

enzymes, mais même ce dernier pourrait être réaliser en utilisant des techniques biologiques, pour modifier des enzymes existantes pour mieux servir nos besoins (évolution dirigée)

• la Professeure Pelletier vous en discutera…