Modèle pour rapport d'essai...Mode : Le mode de la distribution est le diamètre moyen de la classe...

Dossier P156452 - Document DMSI/1 – /26

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RAPPORT D'ESSAI

Demandeur :

AGIR POUR L’ENVIRONNEMENT 2, rue du Nord 78018 PARIS

Date et référence de la commande :

19/04/2016 – Accord sur devis 2016/6510

Objet :

Extraction de nanoparticules de produits alimentaires et mesures de leurs propriétés dimensionnelles


1. ECHANTILLONS RECEPTIONNES ET INFORMATIONS RECUES

1.1. OBJECTIF DE L’ETUDE L’objectif de l’étude consiste à étudier les paramètres dimensionnels des nanoparticules (NP) potentiellement présentes dans des produits alimentaires. Sur les quatre échantillons reçus, il s’agira de : 1) Extraire l’additif à l’état nanoparticulaire en utilisant un protocole adapté.

2) Préparer la population de nanoparticules afin de réaliser des mesures fiables.

3) Identifier la nature chimique du nanomatériau grâce à une analyse élémentaire par EDX (Energy-dispersive X-ray spectrocopy).

4) Effectuer des mesures de taille, de distribution en taille et de forme (description qualitative) des populations extraites par SEM (Scanning Electron Microscopy, Microscopie Electronique à Balayage).

5) Quantifier dans le produit alimentaire, la teneur en TiO2 et SiO2 par ICP-OES (Inductively Coupled Optical Emission Spectrometry).

1.2. ECHANTILLONS RECEPTIONNES Quatre échantillons ont été réceptionnés : 1) Biscuits chocolatés de la marque LU « NAPOLITAIN signature chocolat »,

contenant, dans la liste des ingrédients, du E171.

2) Chewing-gums de la marque MALABAR, goût tutti frutti, contenant, dans la liste des ingrédients, du E171.

3) Mélange d’épices pour GUACAMOLE, taste mexico, de la marque Carrefour, contenant, dans la liste des ingrédients, du dioxyde de silicium.

4) Conserve de blanquette de veau, de la marque William Saurin, contenant, dans la liste des ingrédients, du E171.

1.3 CONTEXTE Le E171 et E551 sont des additifs alimentaires d’origine minérale correspondant respectivement au dioxyde de titane (TiO2) et dioxyde de silicium (SiO2).

Suite du rapport d’essai page suivante


Ils sont utilisés comme :

anti-agglomérant : Les particules de SiO2 permettent de fixer l'humidité et empêcher l'agglomération du sel, du sucre, des épices, du cacao et d’autres aliments sous forme de poudre. Les doses sont en générale de 10 000 mg/kg (mais sont fonction de la denrée).1

pigments blancs : Les particules de TiO2 sont mélangés aux aliments pour améliorer leur blancheur ou modifier les nuances de couleurs de colorants alimentaires. Le E171 est sans limite officielle de dosage.1

Ces additifs alimentaires pourraient se retrouver à l’état nanoparticulaire.

2. PROTOCOLE EXPERIMENTAL

2.1. PREPARATION DES ECHANTILLONS

Mesures SEM La préparation des échantillons pour la microscopie électronique dépend de la nature des produits alimentaires analysés. Le protocole suivi sera précisé dans la section Essais.

Analyse par ICP-OES Le chewing-gum malabar et le mélange d’épices pour guacamole ont été préalablement séchés à 110°C en étuve pendant quelques heures avant tout prélèvement. Pour le biscuit chocolaté « Napolitain », seule la partie du glaçage au chocolat noir et blanc a été prélevée pour la réalisation des essais et séchée à 110°C en étuve pendant quelques heures. Pour la conserve de blanquette de veau « William Saurin », seule la sauce blanche du plat cuisiné a été prélevée pour la réalisation des essais et séchée à 110°C en étuve pendant quelques heures.

1 Directives et Règlements de l'Union Européenne relatifs aux additifs alimentaires. Règlement

1129/2011.


2.2. CONDITIONS DE REALISATION DES ESSAIS

Mesures SEM Les conditions de réalisation des essais pour la microscopie électronique dépendent de la nature des produits alimentaires analysés. Le protocole suivi sera précisé dans la section Essais.

Analyse par ICP-OES LES ECHANTILLONS ONT ETE PREPARES EN SUIVANT UN PROTOCOLE SPECIFIQUE

DEVELOPPE AU LNE ET COMMUNIQUE A AGIR POUR L’ENVIRONNEMENT. Sur les solutions obtenues, les éléments titane ou silicium ont été dosés quantitativement par spectrométrie d'émission plasma (ICP-OES, HORIBA, Activa M) au regard de droites d’étalonnage établies extemporanément pour chaque élément. Les concentrations en solution sont ensuite rapportées aux masses de prise d’essai pour calculer les teneurs élémentaires massiques dans l’aliment correspondant. La conversion en teneurs massiques en oxyde de titane ou silicium est ensuite réalisée sur la base stœchiométrique. Les analyses ont été effectuées semaines : 19, 20 et 21/2016.



3. ESSAIS

3.1. BISCUITS CHOCOLATES DE LA MARQUE LU « NAPOLITAIN SIGNATURE CHOCOLAT »

3.1.1. Préparation des échantillons pour une analyse en microscopie Une photo de l’échantillon étudié est donnée en Figure 1 avec l’étiquette indiquant la présence de E171 dans le produit.

Figure 1 : Photo d’un biscuit chocolaté de la marque LU étudié (à gauche) ainsi que de la mention E171 présente sur l’étiquette (à droite).

Le E171 étant utilisé comme colorant blanc, nous avons cherché la présence de TiO2 sur la couche supérieure du gâteau. Nous avons isolé les lettres blanches qui forment le mot « chocolat » (voir Figure 1 gauche, partie entourée en rouge). Le protocole d’extraction et de préparation d’échantillon que nous avons suivi est le suivant : 1- Après avoir gratté l’inscription, le produit est dissout dans de l’eau déionisée ultra-

pure.

2- La suspension obtenue est chauffée à ~60°C afin de faire fondre les résidus de chocolat.

3- Le dépôt blanc après décantation est lavé plusieurs fois suivant un protocole spécifique développé au LNE et communiqué à Agir pour l’Environnement.

L’analyse de NP par microscopie (SEM) nécessite une préparation spécifique des échantillons afin d’empêcher une agglomération excessive des NP. Pour cela, le LNE a développé un protocole original impliquant une « tournette » (spin-coater) communiqué à Agir pour l’Environnement.


3.1.2. Mesures SEM et analyse EDX réalisées sur les particules extraites Les images SEM des NP sont reportées en Figure 2. Nous observons des agglomérats d’environ 1 µm constitués de particules plus petites. Ces agglomérats de faible dimension témoignent d’un lavage efficace. Les particules primaires sont de forme plus ou moins isotrope typique du TiO2.

Figure 2 : Images SEM de nanoparticules de TiO2 extraites des biscuits chocolatés

de la marque LU « NAPOLITAIN signature chocolat »

Une analyse élémentaire qui nous renseigne sur les atomes constitutifs des particules est réalisée en utilisant la technique EDX. Il s’agit d’un détecteur installé sur le microscope électronique qui récupère les photons X émanant des nanoparticules.


TiO2 Napolitain – image a

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

Co

un

ts

Energy (keV)

TiO2 Napolitain - image a

TiO2 Napolitain - image b

Si Ka1

Ti Ka1

Ti Kb1

C Ka1

O Ka1

Al Ka1

Figure 3 : Spectres EDX effectués sur les images a et b reportées au-dessus.

La Figure 3 donne les spectres EDX de deux populations de particules imagées (images a et b, Figure 3). Les pics relatifs au Ti et O sont parfaitement visibles et indiquent clairement qu’il s’agit d’oxyde de titane. Concernant Ti, nous observons deux pics majoritaires

correspondant aux raies Ka1 et Kb1. Les pics relatifs à Si et Al viennent


respectivement du substrat utilisé et du porte échantillon en aluminium. Le carbone (pic C) est toujours présent dans ce type d’analyse. Afin de confirmer la composition chimique des particules, nous avons effectué une cartographie X donnée en Figure 4. La présence de titane et d’oxygène correspond exactement à la localisation des particules.

Ka-O

Ka-Ti

Kb-Ti

Figure 4 : Image SEM de nanoparticules de TiO2 extraites des biscuits chocolatés de la marque LU « NAPOLITAIN signature chocolat » avec une cartographie EDX.

Le spectre EDX de la figure 5 qui correspond à l’image SEM des particules (Figure 4) confirme ce résultat.



0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

Co

un

ts

Energy (keV)

Si Ka1

Ti Ka1

Ti Kb1C Ka1

O Ka1

Figure 5 : Spectre EDX de nanoparticules de TiO2 (imagées en Figure 4) extraites des biscuits chocolatés de la marque LU « NAPOLITAIN signature chocolat ».

A partir des nombreuses images SEM obtenues, nous avons mesuré chaque particule afin de construire un histogramme de distribution en taille. Afin que les mesures dimensionnelles soient représentatives de l’ensemble de la population étudiée, 330 particules ont été analysées.

100 200 300 400 500

0

10

20

30

40

50

60

D1 = 148,9 nm

= 51,9 nm

Po

pu

latio

n

Diamètre (nm)

Figure 6 : Histogramme de distribution en taille de nanoparticules de TiO2 extraites des biscuits chocolatés de la marque LU « NAPOLITAIN signature chocolat »


L’histogramme est donné en Figure 6 et montre une distribution log-normale (en trait rouge) caractéristique. Les différents diamètres tirés de cette mesure sont regroupés dans le tableau ci-dessous.

Mesurande

Diamètre moyen 148,9 nm ± 3,2 nm

Distribution en taille (écart type) 51,9 nm

Diamètre médian 143,8 nm

Mode 160,4 nm

Diamètre médian : le diamètre qui divise la distribution en deux parties d'aires égales. Mode : Le mode de la distribution est le diamètre moyen de la classe la plus fréquentée.

D’après les résultats de l’histogramme, 12 % de la population de particules en nombre est inférieur à 100 nm.

3.1.3 Analyse par ICP-OES Les résultats sont exprimés en g pour 100 g de glaçage au chocolat noir et blanc sec :

Teneur en Ti Moyenne

des 4 essais en Ti

Ecart type des 4 essais

en Ti

Moyenne des 4 essais

en TiO2


en TiO2

Essai n°1 0.042

0.038 0.004 0.064 0.007 Essai n°2 0.035

Essai n°3 0.035

Essai n°4 0.042

La teneur en nanoparticules de TiO2

présente dans le glaçage au chocolat noir et blanc est de : 0.064 % ± 0.014 %. Par report à la masse nette totale du biscuit chocolaté qui est de 31 grammes, la teneur en nanoparticules de TiO2

présente dans le biscuit chocolaté « Napolitain signature chocolat » est de : 0.0076 %.



3.2. CHEWING-GUMS DE LA MARQUE MALABAR, GOUT TUTTI FRUTTI

3.2.1 Préparation des échantillons pour une analyse en microscopie

Figure 7 : Photo du Malabar étudié (à gauche) ainsi que de la

mention E171 présente sur l’étiquette (à droite).

Une photographie du chewing-gum analysé est donnée en Figure 7. La mention E171 est clairement indiquée sur le papier d’emballage. Le Malabar a une couleur rose mais des grains blancs sont parfaitement visibles. L’extraction des particules a nécessité un travail long et plusieurs protocoles ont été testés avant d’arriver à un résultat concluant. Notre première idée fut de gratter la partie supérieure du chewing-gum afin d’isoler ces parties blanches. Afin de séparer la gomme des particules minérales, nous avons utilisé de l’acétone. La quantité en TiO2 n’était pas assez conséquente et nous n’avons pas observé la présence de particules.

LES ECHANTILLONS ONT ETE PREPARES EN SUIVANT UN PROTOCOLE SPECIFIQUE

DEVELOPPE AU LNE ET COMMUNIQUE A AGIR POUR L’ENVIRONNEMENT.



Une analyse de diffraction X, XRD (X-ray Diffraction) a été effectuée directement sur la poudre et le diffractogramme est donné en Figure 8.

Figure 8 : spectre de diffraction X (Cu K-alpha, 0,15418 nm) effectué directement sur la poudre

de Malabar.

Nous observons des pics à 27°, 36° et à 55° correspondant à la phase Rutile (R) et des pics à 25° et 48° correspondant à la phase Anatase (A) du TiO2. Ces résultats sont en accord avec les pics de la base de données JCPDS (no. 88-1175 et 84-1286). [Rutile phase, JCPDS no 21-1276. (2θ= 26.9, 35.9, 40.9 and 43.7); Anatase phase, JCPDS no 21-1272 (2θ= 25, 37.3, 47.7 and 53.8)]. La présence de TiO2 est d’ores et déjà confirmée mais l’intensité des pics montre que la quantité de TiO2 dans le chewing-gum est faible. Quant au reste des pics présents sur le diffractogramme ils correspondent majoritairement au Saccharose.



3.2.2 Mesures SEM et analyse EDX réalisées sur les particules extraites Le dépôt de la suspension est observé en microscopie et les images SEM sont données en Figure 9.

Figure 9 : Images SEM de nanoparticules de TiO2 extraites des chewing-gums de la marque MALABAR, goût tutti frutti.

Les particules observées ressemblent à celles extraites du biscuit NAPOLITAIN. La forme plus ou moins est caractéristique des particules de TiO2. Les particules sont souvent agglomérées comme le montre la Figure 9 (en bas) car la partie organique (gomme) est très difficile à supprimer totalement. Une cartographie EDX a été réalisée sur la population de nanoparticules imagées en Figure 10. Une correspondance parfaite est observée entre la présence d’oxygène et de titane (d’oxyde de titane) et la localisation des nanoparticules. La nature des nanoparticules (oxyde de titane) est confirmée par le spectre effectué sur cette même population (Figure 11).


Figure 10 : Image SEM de nanoparticules de TiO2 extraites des chewing-gums de la marque MALABAR, goût tutti frutti avec une cartographie EDX.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0

Co

un

ts

Energy (keV)

C Ka1Si Ka1

O Ka1

Ti La1

Ti Ka1

Ti Kb1

Figure 11 : Spectre EDX de nanoparticules de TiO2 (imagées en Figure 10) extraites des chewing-gums de la marque MALABAR, goût tutti frutti.

Ka-O

K a - Ti K b - Ti


L’histogramme de distribution en taille des particules extraites du Malabar est reporté en Figure 12 : 260 particules ont été analysées.

100 200 300 400 500

0

10

20

30

40

50

60

D1 = 183,6 nm

= 66,4 nm

Po

pu

latio

n

Diamètre (nm)

Figure 12 : Histogramme de distribution en taille de nanoparticules de TiO2 extraites des chewing-gums de la marque MALABAR, goût tutti frutti.

L’histogramme montre une distribution log-normale (en trait rouge) caractéristique. Les différents diamètres tirés de cette mesure sont regroupés dans le tableau ci-dessous.

Mesurande




Mode 165,7 nm


D’après les résultats de l’histogramme, 2,5 % de la population de particules en nombre est inférieur à 100 nm.



3.2.3. Analyse ICP-OES Les résultats sont exprimés en g pour 100 g de matière sèche :


des 4 essais en Ti


en Ti


en TiO2


en TiO2

Essai n°1 0.0016

0.0019 0.0002 0.0031 0.0003 Essai n°2 0.0019

Essai n°3 0.0021

Essai n°4 0.0018


présente dans le chewing-gum MALABAR est de : 0.0031 % ± 0.0006 %

3.3. MELANGE D’EPICES POUR GUACAMOLE, TASTE MEXICO, DE LA MARQUE CARREFOUR

3.3.1. Préparation des échantillons pour une analyse en microscopie L’extraction consiste à séparer la partie minérale (SiO2) des épices. Le protocole testé est constitué des phases suivantes :


DEVELOPPE AU LNE ET COMMUNIQUE A AGIR POUR L’ENVIRONNEMENT. La suspension obtenue est déposé sur une grille cuivre utilisée traditionnellement en microscopie. En effet, nous sommes à la recherche de SiO2 et le substrat de silicium proposé dans le protocole défini en section 3.1.1, nous empêcherait d’identifier les raies de silicium. Une image du sachet étudié est donné en Figure 13.



Figure 13 : Photo du sachet de mélange d’épices pour GUACAMOLE étudié (à gauche) ainsi que de la mention dioxyde de silicium (antiagglomérant) présente sur l’étiquette (à droite).

3.3.2. Mesures SEM et analyse EDX réalisées sur les particules extraites

Les images SEM du produit déposé sur des grilles de cuivre sont reportées en Figure 14. Nous voyons clairement la présence de particules de forme isotrope, mais fortement agglomérées et enveloppées dans une couche organique.

Figure 14 : Images SEM de nanoparticules de SiO2 extraites d’un mélange d’épices pour GUACAMOLE, taste Mexico, de la marque Carrefour.


Une cartographie EDX a été effectuée sur la population imagée en Figure 15 (haut). La présence de silicium et d’oxygène (oxyde de silicium) est en cohérence avec la localisation des particules extraites.

Ka1 - O

Ka1 - Si

Figure 15 : Images SEM de nanoparticules de SiO2 extraites d’un mélange d’épices pour GUACAMOLE, taste Mexico, de la marque Carrefour, avec une cartographie EDX.


Un second essai sur deux populations de particules (image a et b, Figure 16) confirme que les particules sont bien constituées d’oxyde de silicium.

Image a

Image b

0

50

100

150

200

250

300

350

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00

Co

un

ts

Energy (keV)

Image a Image b

Si Ka1

Al Ka1

C Ka1O Ka1 Cu La1

Mg Ka1

Figure 16 : Spectre EDX effectué sur des nanoparticules de SiO2 extraites d’un mélange d’épices pour GUACAMOLE, taste Mexico, de la marque Carrefour.

Les raies correspondantes au cuivre et à l’aluminium proviennent respectivement de la grille de dépôt et du porte-échantillon. Le magnésium est un élément présent dans le mélange d’épices.


L’histogramme de distribution en taille des particules extraites du mélange d’épices est reporté en Figure 17 : 270 particules ont été analysées.

0 10 20 30 40 50

0

10

20

30

40

D1 = 20 nm

= 7,1 nm

Po

pu

latio

n

Diamètre (nm)

Figure 17 : Histogramme de distribution en taille de nanoparticules de SiO2 extraites d’un mélange d’épices pour GUACAMOLE, taste Mexico, de la marque Carrefour.


Mesurande

Diamètre moyen 20 nm ± 2,1 nm



Mode 17,5 nm


D’après les résultats de l’histogramme, 100 % de la population de particules en nombre est inférieur à 100 nm.



3.3.3. Analyse par ICPMS-OES

Les résultats sont exprimés en g pour 100 g de mélange d’épices sèches :

Teneur en Si Moyenne

des 4 essais en Si


en Si


en SiO2


en SiO2

Essai n°1 0.156

0.157 0.005 0.337 0.010 Essai n°2 0.158

Essai n°3 0.152

Essai n°4 0.163

La teneur en nanoparticules de SiO2

présente dans le mélange d’épice pour guacamole est de : 0.337% ± 0.020 %

3.4. CONSERVE DE BLANQUETTE DE VEAU, DE LA MARQUE WILLIAM SAURIN

3.4.1. Préparation des échantillons pour une analyse en microscopie Dans cet essai, les particules de TiO2 doivent être extraites de la sauce. La boîte de conserve à étudier est imagée en Figure 18. La présence de TiO2 est clairement indiquée dans la liste des ingrédients (Figure 18, droite).

Figure 18 : Photo de la boîte de conserve de blanquette de veau étudiée (à gauche) ainsi que de la mention E171 présente sur l’étiquette (à droite).




DEVELOPPE AU LNE ET COMMUNIQUE A AGIR POUR L’ENVIRONNEMENT.

3.4.2. Mesures SEM et analyse EDX réalisées sur les particules extraites Des agglomérats de particules de forme plus ou moins isotrope, caractéristique des nanoparticules de TiO2, sont facilement observés en SEM. La population en particules semblent très importante. Les particules agglomérées de l’image en haut à droite reposent sur un bout de silicium qui s’est arraché du wafer.

Figure 19 : Images SEM de nanoparticules de TiO2 extraites d’une conserve de blanquette de veau, de la marque William Saurin.



Une cartographie EDX, effectuée sur l’agglomérat imagé en Figure 20, a été réalisée. La localisation des particules correspond exactement à la présence d’oxygène et de titane démontrant que les particules sont constituées d’oxyde de titane. Ce résultat est confirmé par le spectre EDX effectué sur l’ensemble de l’agglomérat et donné en Figure 21.

Ka-O

Ka-Ti

Kb-Ti

Figure 20 : Images SEM de nanoparticules de TiO2 extraites d’une conserve de blanquette de veau, de la marque William Saurin, avec une cartographie EDX.



0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

Co

un

ts

Energy (keV)

Si Ka1

Ti Ka1

C Ka1

O Ka1

Ti La1

Ti Kb1

Figure 21 : Spectre EDX effectué sur l’agglomérat de particules imagées en Figure 20, extraites de la sauce pour blanquette de veau.

L’histogramme de distribution en taille des particules extraites de la sauce de la blanquette est reporté en Figure 22 : 250 particules ont été analysées.

100 200 300

0

10

20

30

40

D1 = 131,6 nm

= 34,7 nm

Po

pu

latio

n

Diamètre (nm)

Figure 22 : Histogramme de distribution en taille de nanoparticules de TiO2 extraites de la sauce de blanquette de veau William Saurin.



Mesurande




Mode 133 nm


D’après les résultats de l’histogramme, 16 % de la population de particule en nombres est inférieur à 100 nm.

3.4.3. Analyse par ICP-OES Les résultats sont exprimés en g pour 100 g de sauce blanche sèche :


des 4 essais en Ti


en Ti


en TiO2


en TiO2

Essai n°1 0.361

0.407 0.054 0.680 0.090 Essai n°2 0.482

Essai n°3 0.376

Essai n°4 0.411


présente dans la sauce blanche de la blanquette de veau est de : 0.68 % ± 0.18 %. Par report à la masse nette totale de la conserve qui est de 400 grammes, la teneur en nanoparticules de TiO2

présente dans la conserve de blanquette de veau de la marque « William SAURIN » est de : 0.18 %.

4. CONCLUSION 1. Biscuits chocolatés de la marque LU « NAPOLITAIN signature chocolat »,

contenant, dans la liste des ingrédients, du E171

La présence de particules de TiO2 est confirmée

La taille moyenne des particules est 148,9 nm ± 3,2 nm avec une distribution en taille de 51,9 nm.

12 % de la population de particules en nombre est inférieur à 100 nm.

La teneur en particules de TiO2 présente est de 0,0076 %


2. Chewing-gums de la marque MALABAR, goût tutti frutti, contenant, dans la liste des ingrédients, E171



2,5 % de la population de particules en nombre est inférieur à 100 nm.

La teneur en particules de TiO2 présente est de 0,0031 % ± 0,0006 % 3. Mélange d’épices pour GUACAMOLE, taste mexico, de la marque Carrefour,

contenant, dans la liste des ingrédients, du dioxyde de silicium

La présence de particules de SiO2 est confirmée



La teneur en particules de SiO2 présente est de 0,337 % ± 0,02 %

4. Conserve de blanquette de veau, de la marque William Saurin, contenant, dans la liste des ingrédients, du E171




La teneur en particules de TiO2 présente est de 0,18 %

Trappes, le 9 juin 2016 Le Responsable de l'essai Nicolas FELTIN Nicolas FELTIN

Les résultats mentionnés ne sont applicables qu'aux échantillons, aux produits ou aux matériels soumis au LNE et tels qu'ils sont définis dans le présent document.

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