Mémoire de soutenance présenté en vue de l’obtention d’une

habilitation à diriger des recherches

Université Paris Saclay

Etude de machines moléculaires impliquées dans la dynamique des

génomes bactériens et phagiques

Soutenu le 30/06/2021 par François LECOINTE

Chargé de recherche à INRAE, Equipe Phages, Unité Micalis, Centre

INRAE de Jouy-en-Josas

Composition du Jury :

Mireille Ansaldi, Directrice de Recherche, CNRS

Patrice Polard, Directeur de Recherche, CNRS

Patrick Calsou, Directeur de Recherche, INSERM

Fabrice Confalonieri, Professeur des Universités, Université

Paris-Saclay

Paulo Tavares, Directeur de Recherche, CNRS

1

Curriculum vitae

Nom, prénom : LECOINTE François

Né le : 20 juin 1973 à Issy-les-Moulineaux (92)

Tél. : 01 34 65 20 81

E-mail : francois.lecointe@inrae.fr

DIPLOMES ET FORMATION ____

1998-2002 Thèse de Doctorat en Microbiologie de l’Université Pierre et Marie Curie,

Paris.

Mention très honorable. Travaux réalisés au Laboratoire d’Enzymologie et

Biochimie Structurales (CNRS, Gif/Yvette, directeur J. Janin) dans l’équipe du

Dr. Henri Grosjean.

Sujet de thèse : Etude d’enzymes de modification de nucléotides des ARNt et

de leurs fonctions dans le métabolisme cellulaire chez S. cerevisiae.

Membres du jury : Dr. Pierre Thuriaux (rapporteur), Dr. Pierre Plateau

(rapporteur), Dr. Bruno Lapeyre (examinateur), Pr. Jean-Pierre Rousset

(examinateur), Pr. Maurice Claisse (président), Dr. Henri Grosjean (directeur de

thèse).

1997 DEA de Microbiologie Fondamentale, Mention Très Bien, Major de

promotion, Université Pierre et Marie Curie, Paris.

Magistère de Biotechnologies 3ème année, Mention Très Bien, Major de

promotion, Université Paris Sud, Orsay.

1996 Maîtrise de Biologie Moléculaire et Génétique.

Magistère de Biotechnologies 2ème année, Mention Assez Bien, Université Paris

Sud, Orsay.

1995 Licence de Biochimie option Biologie Moléculaire et Génétique, Mention

Assez Bien.

Magistère de Biotechnologies 1ère année, Mention Assez Bien, Université Paris

Sud, Orsay.

1993-94 DEUG B Sciences de la nature et de la vie, Mention Assez Bien, Université

Paris Sud, Orsay.

1992 PCS0, Université Paris Sud, Orsay.

1991 Bac série F7 (Biochimie), Lycée de la Vallée de Chevreuse, Gif-sur-Yvette.

2

EXPERIENCE PROFESSIONNELLE ____

Après la thèse

2015-auj. Chargé de recherche 1ère classe (CRCN depuis 2018) à l’INRA (INRAE

depuis 2020) Unité Micalis (directeur Dr. S. Aymerich puis Dr. P. Noirot), INRA, Jouy-en-

Josas, dans l’équipe PHAGES dirigée par la Dr. M.A. Petit.

Sujet de recherche : Compréhension des mécanismes de recombinaisons

phagiques à la base de leur évolution. Impact des phages tempérés sur la

physiologie de leur hôte.

2007-2015 Chargé de recherche 1ère classe à l’INRA Laboratoire : Unité de Génétique Microbienne (directeur Dr. S.D. Ehrlich) puis

Unité Micalis depuis 2010 (directeur S. Aymerich), INRA, Jouy-en-Josas, dans

l’équipe du Dr. P. Noirot.

Sujets de recherche : Caractérisation du mécanisme de recombinaison

illégitime chez les bactéries. Etude de la dynamique de complexes

nucléoprotéiques chez Bacillus subtilis et de son impact sur l’expression des

gènes.

2004-2007 Chargé de recherche 2ème classe à l’INRA

Laboratoire : Unité de Génétique Microbienne (directeur Dr. S.D. Ehrlich),

INRA, Jouy-en-Josas, dans l’équipe du Dr. P. Polard.

Sujet de recherche : Identification et caractérisation des complexes

multiprotéiques impliqués dans la réplication et la réparation du chromosome de

B. subtilis.

Sept.-nov. Stagiaire post-doctoral 2004 Laboratoire : Institut de Biochimie et de Biophysique Moléculaire et Cellulaire

à l’Université Paris Sud, Orsay, dans l'équipe du Pr. H. van Tilbeurgh.

Sujet de recherche : Etude structurale de l'ADN topoisomérase VI des Archaea

et de la polymérase X de Deinococcus radiodurans.

Nov. 2002- Attaché Temporaire d'Enseignement et de Recherche (ATER)

août 2004 Laboratoire : Institut de Génétique et de Microbiologie à l’Université Paris sud,

Orsay, dans l'équipe de la Pr. S. Sommer.

Sujet de recherche : Etude de la radiorésistance chez D. radiodurans.

Avant la thèse

Oct.1997- Scientifique du contingent au Laboratoire de Physiopathologie de

juil. 1998 l’Infection (Institut Pasteur - Paris), dans l’équipe du Dr. G. Marshal

Sujet de recherche : Construction d’un mutant de gène codant pour un facteur

de virulence potentiel chez Mycobacterium tuberculosis.

Janv.-août Stage de DEA au Laboratoire d’Enzymologie et Biochimie Structurales

1997 (CNRS à Gif-sur-Yvette)

Sujet de recherche : Caractérisation de la protéine Deg1 chez la levure.

3

Juin-juil., Stage en Microbiologie industrielle au Laboratoire LACTEOL (Houdan - 78).

sept. 1996 Sujet de recherche : Etude de la croissance de deux en culture mixte ou isolée

et mesure de leurs activités antimicrobiennes.

Juin-juil. Stage à l’Institut de Génétique et de Microbiologie à l’Université Paris sud,

1995 Orsay, dans l'équipe du Pr. P. Forterre.

Sujet de recherche : Développement d’un outil génétique par curage du

plasmide pGT5 chez Pyrococcus abyssi.

Juin-juil. Stage en Microbiologie industrielle au Laboratoire LACTEOL (Houdan - 78).

1994 Sujet de recherche : Suivi de l’activité antibiotique d’un L. acidophilus au cours

du processus industriel de fermentation.

ENSEIGNEMENT ____

2017-2020 Jury de soutenance de stages en M1 Master BIOLOGIE-SANTE, Spécialité

Microbiologie Appliquée et Génie Biologique (MAGB) et en M2 Spécialité

Génétique et environnement (env. 10h éq.TD/an). Université Paris Sud/Paris

Saclay.

2015-2016 TP en Biotechnologies en M2, Jury de soutenance de stages en M1-Pro Master

BIOLOGIE-SANTE, Spécialité MAGB. (30h éq.TD/an). Université Paris Sud.

2011-2014 (>64h éq.TD/an dans le cadre d’une Prime d’Excellence Scientifique attribuée

par l’INRA).

- TD M1 - Instabilité Génomique et Pathologies Associées du Master

BIOLOGIE SANTE, Spécialité Génomes, Cellules, Développement (GCDE).

Université Paris Sud.

- Cours M2 - Criblage Génomique/Génomique fonctionnelle du Master

BIOLOGIE-SANTE, Spécialité GCDE. Université Paris Sud.

- TP en Biotechnologies en M2 Pro Master BIOLOGIE-SANTE, Spécialité

MAGB. Université Paris Sud.

- Jury de soutenance de stages, M1 Pro Master BIOLOGIE-SANTE, Spécialité

MAGB. Université Paris Sud.

- Cours de Chimie Générale, L2 pro Biotechnologie. Université Paris Sud.

- Cours M2 du Master Biotechnologies Microbiologie Aliment Nutrition

Environnement, spécialité Biotechnologies microbiennes. Université de

Lorraine.

2005-2006 TP en M2 du Master BIOLOGIE-SANTE Spécialité GCDE (2 semaines en

2006 et 3 semaines en 2005). Université Paris Sud.

2002-2004 ATER. TP et TD de Biochimie et Biologie Moléculaire pour des étudiants de 1er

et 2nd cycles (96h éq.TD/an). Université Paris Sud.

1998 à 2001 Moniteur. TP et TD de Microbiologie pour des étudiants de DEUG. (64h

éq.TD/an). Université Paris VII.

4

ACTIVITES D’ENCADREMENT ____

Nov 2018-auj. Direction de la thèse de Pauline Misson portant sur la caractérisation du module

de recombinaison du phage Gally et de son impact sur la viabilité et la tolérance

de la souche Escherichia coli LF82 en macrophage.

2018 Encadrement du stage de M2 de Pauline Misson (janv. à juin 2018) sur le même

sujet que la thèse.

2017 Encadrement du stage de M1 de Pauline Misson (mai à juin 2017) portant sur la

caractérisation de la protéine Mu-Gam du phage Gally de la souche entéro-

pathogène LF82.

2015 Encadrement du stage de L2 « bioplus » de Florian de Ceuyper (mai à juin 2015)

portant sur la caractérisation de la recombinase Sak4 du phage PA73.

2014 Encadrement du stage de M1 d’Emilie Rollier (fév. à juin 2014) ayant pour but

l’adaptation du système CRIPR-Cas9 chez B. subtilis.

2011 Encadrement du stage de M2 d’Héloïse Simonson (janv. à juil. 2011) portant sur

la caractérisation du NHEJ chez B. subtilis.

2006-2010 Co-encadrement, avec le Dr. P. Polard, de la thèse d’Audrey Costes sur l’étude

fonctionnelle du rôle de la protéine SSB dans le maintien de l’intégrité du

génome de la bactérie B. subtilis.

2006 Encadrement du stage M2 d’Audrey Costes sur l’étude fonctionnelle in vivo de

la protéine RecG de B. subtilis.

2000 Co-encadrement, avec le Dr. H. Grosjean, du DEA de Stéphanie Vougier sur la

caractérisation biochimique de la protéine Pus4 chez la levure.

ACTIVITES D’EVALUATION DE LA RECHERCHE ____

Evaluation de thèses

Examinateur dans les jurys de thèse de Lingli Zhang de l’équipe du Pr P. Leblond (Université

de Lorraine, thèse soutenue le 23/09/2014), de Solenne Ithurbide de l’équipe de

la Pr. S. Sommer (Université Paris-Sud, soutenue le 23/09/2015), de Karima

Benferhat de l’équipe du Dr. E. Le Cam (Institut Gustave Roussy, soutenue le

27/08/2018) et de Léo Zangelmi de l’équipe du Dr. P. Boulanger (I2BC, soutenue

le 06/12/2018).

Invité au jury de thèse de Grégory Hoff de l’équipe du Pr. P. Leblond (Université de

Lorraine, thèse soutenue le 13/12/2016).

Membre des comités de thèse de Solenne Ithurbide (équipe de la Pr. S. Sommer à

l’Université Paris-Sud), Karima Benferhat (équipe du Dr. E. Le Cam à l’Institut

Gustave Roussy). Je suis actuellement tuteur de Nicolas Eugénie, étudiant en 4ème

année de thèse (dirigée par le Dr. P. Servant à l’université Paris-Sud).

5

Jury de recrutement

J’ai fait partie des jurys de recrutement de Maître de Conférences à

l’Université Paris-Sud en 2009 (Poste N 679), 2010 (poste N 579), 2011 (poste

MCU0551), 2015 (N 64-65 MCF0065) et 2016 (N 64-65 MCF681).

Relecteur d’articles

J’ai réalisé la critique d’articles soumis aux journaux suivants : Proteomics (2008),

Plos Genetics (2009, 2013), BMC Microbiol. (2011), Mol. Mic. (2017), NAR

(2014, 2018, 2018), Viruses (2018), Scientific Reports (2018), Future of Science

(2019), DNA Repair (2020).

ACTIVITES D’ANIMATION DE LA RECHERCHE ____

Sept. 2019- Co-responsable de l’équipe Préparation/laverie de l’unité Micalis constituée

auj. de 7 agents.

2015-2019 Membre élu du conseil académique de l’Université Paris-Saclay.

2016-2019 Membre élu suppléant du conseil de département des Sciences de la Vie de

l’Université Paris-Saclay.

PUBLICATIONS DANS DES JOURNAUX A COMITE DE LECTURE ____

Articles de recherche

1. Lossouarn, J., Briet, A., Moncaut, E., Furlan, S., Bouteau, A., Son, O., Leroy, M., DuBow, M.S.,

Lecointe, F., Serror, P., and Petit, M.A. Enterococcus faecalis countermeasures defeat a virulent

Picovirinae bacteriophage. Viruses, 2019. 11(1).

2. Hutinet, G., Besle, A., Son, O., McGovern, S., Guerois, R., Petit, M.A. &, Ochsenbein, F., and

Lecointe, F. & Sak4 of phage HK620 is a RecA remote homolog with single-strand annealing activity

stimulated by its cognate SSB protein. Front Microbiol, 2018. 9: p. 743. & co-auteurs de

correspondance.

3. Hoff, G., Bertrand, C., Zhang, L., Piotrowski, E., Chipot, L., Bontemps, C., Confalonieri, F.,

McGovern, S., Lecointe, F., Thibessard, A., and Leblond, P. Multiple and Variable NHEJ-Like Genes

Are Involved in Resistance to DNA Damage in Streptomyces ambofaciens. Front Microbiol, 2016. 7: p.

1901.

4. McGovern, S., Baconnais, S., Roblin, P., Nicolas, P., Drevet, P., Simonson, H., Pietrement, O.,

Charbonnier, J.B., Le Cam, E., Noirot, P., and Lecointe, F. C-terminal region of bacterial Ku controls

DNA bridging, DNA threading and recruitment of DNA ligase D for double strand breaks repair.

Nucleic Acids Res, 2016. Vol 44, Issue 10, p 4785-4806.

5. Nicolas, P., Mader, U., Dervyn, E., Rochat, T., Leduc, A., Pigeonneau, N., Bidnenko, E.,

Marchadier, E., Hoebeke, M., Aymerich, S., Becher, D., Bisicchia, P., Botella, E., Delumeau, O.,

Doherty, G., Denham, E.L., Fogg, M.J., Fromion, V., Goelzer, A., Hansen, A., Hartig, E., Harwood,

6

C.R., Homuth, G., Jarmer, H., Jules, M., Klipp, E., Le Chat, L., Lecointe, F., Lewis, P., Liebermeister,

W., March, A., Mars, R.A., Nannapaneni, P., Noone, D., Pohl, S., Rinn, B., Rugheimer, F., Sappa, P.K.,

Samson, F., Schaffer, M., Schwikowski, B., Steil, L., Stulke, J., Wiegert, T., Devine, K.M., Wilkinson,

A.J., van Dijl, J.M., Hecker, M., Volker, U., Bessieres, P., and Noirot, P. Condition-dependent

transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis. Science, 2012. 335(6072):

p. 1103-6.

6. Buescher, J.M. &, Liebermeister, W. &, Jules, M. &, Uhr, M. &, Muntel, J. &, Botella, E. *,

Hessling, B. *, Kleijn, R.J. *, Le Chat, L. *, Lecointe, F. *, Mader, U. *, Nicolas, P. *, Piersma, S. *,

Rugheimer, F. *, Becher, D., Bessieres, P., Bidnenko, E., Denham, E.L., Dervyn, E., Devine, K.M.,

Doherty, G., Drulhe, S., Felicori, L., Fogg, M.J., Goelzer, A., Hansen, A., Harwood, C.R., Hecker, M.,

Hubner, S., Hultschig, C., Jarmer, H., Klipp, E., Leduc, A., Lewis, P., Molina, F., Noirot, P., Peres, S.,

Pigeonneau, N., Pohl, S., Rasmussen, S., Rinn, B., Schaffer, M., Schnidder, J., Schwikowski, B., Van

Dijl, J.M., Veiga, P., Walsh, S., Wilkinson, A.J., Stelling, J., Aymerich, S., and Sauer, U. Global network

reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science, 2012. 335(6072):

p. 1099-103. & co-premiers auteurs, * co-6ème auteurs.

7. Delumeau, O., Lecointe, F., Muntel, J., Guillot, A., Guedon, E., Monnet, V., Hecker, M.,

Becher, D., Polard, P., and Noirot, P. The dynamic protein partnership of RNA polymerase in Bacillus

subtilis. Proteomics, 2011. 11(15): p. 2992-3001.

8. Costes, A.&, Lecointe, F. &, McGovern, S., Quevillon-Cheruel, S., and Polard, P. The C-

terminal domain of the bacterial SSB protein acts as a DNA maintenance hub at active chromosome

replication forks. PLoS Genet, 2010. 6(12): p. e1001238. & co-premiers auteurs.

9. Leulliot, N., Cladiere, L., Lecointe, F., Durand, D., Hubscher, U., and van Tilbeurgh, H. The

family X DNA polymerase from Deinococcus radiodurans adopts a non-standard extended

conformation. J Biol Chem, 2009. 284(18): p. 11992-9.

10. Graille, M., Cladiere, L., Durand, D., Lecointe, F., Gadelle, D., Quevillon-Cheruel, S.,

Vachette, P., Forterre, P., and van Tilbeurgh, H. Crystal structure of an intact type II DNA

topoisomerase: insights into DNA transfer mechanisms. Structure, 2008. 16(3): p. 360-70.

11. Lecointe, F., Serena, C., Velten, M., Costes, A., McGovern, S., Meile, J.C., Errington, J.,

Ehrlich, S.D., Noirot, P., and Polard, P. Anticipating chromosomal replication fork arrest: SSB targets

repair DNA helicases to active forks. EMBO J, 2007. 26(19): p. 4239-51.

12. Jolivet, E. &, Lecointe, F. &, Coste, G., Satoh, K., Narumi, I., Bailone, A., and Sommer, S.

Limited concentration of RecA delays DNA double-strand break repair in Deinococcus radiodurans R1.

Mol Microbiol, 2006. 59(1): p. 338-49. & co-premiers auteurs.

13. Pitarque, S., Herrmann, J.L., Duteyrat, J.L., Jackson, M., Stewart, G.R., Lecointe, F., Payre, B.,

Schwartz, O., Young, D.B., Marchal, G., Lagrange, P.H., Puzo, G., Gicquel, B., Nigou, J., and

Neyrolles, O. Deciphering the molecular bases of Mycobacterium tuberculosis binding to the lectin DC-

SIGN reveals an underestimated complexity. Biochem J, 2005. 392(Pt 3): p. 615-24.

14. Lecointe, F. &, Shevelev, I.V. &, Bailone, A., Sommer, S., and Hubscher, U. Involvement of an

X family DNA polymerase in double-stranded break repair in the radioresistant organism Deinococcus

radiodurans. Mol Microbiol, 2004. 53(6): p. 1721-30. & co-premiers auteurs.

15. Lecointe, F., Coste, G., Sommer, S., and Bailone, A. Vectors for regulated gene expression in

the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. Gene, 2004. 336(1): p. 25-35.

7

16. Lecointe, F., Namy, O., Hatin, I., Simos, G., Rousset, J.P., and Grosjean, H. Lack of

pseudouridine 38/39 in the anticodon arm of yeast cytoplasmic tRNA decreases in vivo recoding

efficiency. J Biol Chem, 2002. 277(34): p. 30445-53.

17. Pintard, L. &, Lecointe, F. &, Bujnicki, J.M., Bonnerot, C., Grosjean, H., and Lapeyre, B. Trm7p

catalyses the formation of two 2'-O-methylriboses in yeast tRNA anticodon loop. EMBO J, 2002. 21(7):

p. 1811-20. & co-premiers auteurs.

18. Grosshans, H., Lecointe, F., Grosjean, H., Hurt, E., and Simos, G. Pus1p-dependent tRNA

pseudouridinylation becomes essential when tRNA biogenesis is compromised in yeast. J Biol Chem,

2001. 276(49): p. 46333-9.

19. Lecointe, F., Simos, G., Sauer, A., Hurt, E.C., Motorin, Y., and Grosjean, H. Characterization

of yeast protein Deg1 as pseudouridine synthase (Pus3) catalyzing the formation of psi 38 and psi 39 in

tRNA anticodon loop. J Biol Chem, 1998. 273(3): p. 1316-23.

Article de revue

1. Bertrand, C., Thibessard, A., Bruand, C. &, Lecointe, F. &, and Leblond, P. & Bacterial NHEJ:

a never ending story. Mol Microbiol, 2019. 111(5): p. 1139-51. & co-auteurs de correspondance.

Chapitres de livre

1. Namy, O., Lecointe, F., Grosjean, H., and Rousset, J.P. Translational Recoding and RNA

Modifications. Topics in Current Genetics, 2005. Vol 12, pp 309-340. H. Grosjean (Ed): Fine-Tuning

of RNA Functions by Modification and Editing, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg.

2. Thibessard, A., Bertrand, C., Bartlett E.J., Doherty, A.J., Bruand, C., Leblond, P. and

Lecointe, F. Nonhomologous End-Joining in Bacteria. A paraître en aout 2021 dans Encyclopedia of

Biochemistry 3rd Edition doi:10.1016/B978-0-12-819460-7.00150-X.

COMMUNICATIONS ____

Communications orales

- 12ème Colloque des 3R, 2017, Presqu’île de Giens, France.

Sak4 of phage HK620 is a RecA remote homolog with single-strand annealing activity stimulated by its

cognate SSB protein.

- Congrès « Phages On Marseille », 2016, Toulouse, France.

Sak4 of phage HK620 is a RecA paralog with single-strand annealing activity stimulated by its cognate

SSB protein.

- Conférencier invité à l’atelier satellite du Colloque annuel 2015 des utilisateurs de SOLEIL : "INRA-

SOLEIL : l’Approche Synchrotron en Agriculture, Alimentation et Environnement", 2015, Gif sur

Yvette, France. Mécanismes de réparation des cassures double brin de l’ADN par le système NHEJ

chez B subtilis.

- BaSysBio 3rd Spring Meeting, 2010, Bruxelles, Belgique.

ChIP-chip: Novel targets of CcpA and role of CcpA during the carbon source media shift.

- Symposium Micalis, 2009, Jouy-en-Josas, France. Par Lecointe F. et Nicolas P.

Deux exemples d'études ayant nécessité le développement du ChIP on chip chez Bacillus subtilis

8

- Journée thématique "Interactome et spectrométrie de masse", 2008, Jouy-en-Josas, France.

Utilisation du SPA-Tag chez Bacillus subtilis: identification d'une plateforme d'interaction dans l'usine

réplicative bactérienne.

- Colloque du « RNA club », 2002, Gif-sur-Yvette, France.

Etude d’enzymes de modification de nucléotides des ARNt et de leurs fonctions dans le métabolisme

cellulaire chez S. cerevisiae.

- 9ème rencontre de l’école doctorale B2M, 2001, Paris, France.

Caractérisation d’enzymes de modification de nucléotides des ARNt et rôle au niveau de la traduction

génétique chez S. cerevisiae.

Posters (* : présentés par F. Lecointe)

- Hutinet, G., Besle, A., Son, O., McGovern, S., Guerois, R., Ansaldi, M., Djedid, A., Petit, M.A.,

Ochsenbein, F. and Lecointe, F*. Sak4 of phage HK620 is an SSB-stimulated annealase that is involved

in the lytic development of the phage. Congrès « PHAGES-sur-Yvette”, 2017, Gif sur Yvette, France.

- Lecointe, F*., Mc Govern, S., Baconnais, S., Roblin, P., Nicolas, P., Drevet, P., Simonson, H.,

Piétrement, O., Charbonnier, J.-B., Le Cam, E., Noirot, P. Characterization of the non homologous end

joining (NHEJ) mechanism in B. subtilis: the dual role of the C-terminal part of Ku. 11ème colloque

des 3R, 2015, Presqu'île de Giens, France.

- Lecointe, F*., Mc Govern, S., Simonson, H., Drevet, P., Roblin, P., Charbonnier, J.-B., Noirot, P.

Caractérisation du mécanisme de recollement d'extrémités non homologues (NHEJ) chez Bacillus

subtilis. 10ème colloque des 3R, 2013, Presqu'île de Giens, France.

- Pigeonneau, N., Lecointe, F., Nicolas, P., Noirot, P. New DNA binding sites for CcpA, the major

regulator of the carbon catabolite response in Bacillus subtilis. Congrès Systems Biology of

Microorganisms, 2010, Paris, France.

- Delumeau, O., Lecointe, F., Guillot, A., Monnet, V., Polard, P., Noirot, P. The dynamic protein

partnership of RNA polymerase in Bacillus subtilis. Congrès Systems Biology of Microorganisms,

2010, Paris, France.

- Lecointe, F. *, Costes, A., McGovern, S., Cheruel, S., Polard, P. SSB: coordinateur des mécanismes

de réparation des fourches de réplication ? Congrès des 3R "Réplication, Recombinaison, Réparation",

2009, Presqu’île de Giens, France.

- Lecointe, F. *, Sérèna, C., Velten, M., McGovern, S., Costes, A., Meile, J.C., Errington, J., Noirot, P.,

Polard, P. Un rôle général de SSB dans la surveillance des fourches de réplication chez les bactéries.

Congrès des 3R "Réplication, Recombinaison, Réparation", 2007, Presqu’île de Giens, France.

- Jolivet, E., Lecointe, F., Coste, G., Bailone, A., Sommer, S. Une concentration limitante de protéine

RecADr retarde la réparation des cassures de l’ADN et augmente la radiosensibilité de mutants

9

déficients pour ddrA. Congrès des 3R "Réplication, Recombinaison, Réparation", 2005, Presqu’île de

Giens, France.

- Lecointe, F. *, Bailone, A., Sommer, S. Mécanismes de radiorésistance chez Deinococcus

radiodurans. Congrès des 3R "Réplication, Recombinaison, Réparation", 2003, Presqu’île de Giens,

France.

- Lecointe, F. *, Motorin, Y., Grosjean, H. Purification et caractérisation biochimique de l'ARNt:

pseudouridine 38/39 synthétase (Pus3p) de S. cerevisiae. Congrès SIFRARN, Société Française de

Biochimie et Biologie Moléculaire, 2000, Toulouse, France.

- Lecointe, F. *, Motorin, Y., Grosjean, H. La protéine Deg1 de S. cerevisiae est une pseudouridine

synthétase catalysant la formation de 38 et 39 dans la boucle anticodon des ARNt. 7ème rencontre de

l’école doctorale B2M, 1999, Paris, France.

- Motorin, Y., Lecointe, F., Simon, C., Foiret, D., Keith, G., Simos, G., Hurt, E., Grosjean, H. Two

multisite specific tRNA:pseudouridine synthases from yeast. Congrès SIFRARN, Société Française de

Biochimie et Biologie Moléculaire, 1998, Strasbourg, France.

10

AVANT PROPOS

Ma recherche a toujours porté sur la caractérisation de mécanismes moléculaires mis en jeu

dans différents aspects du métabolisme des acides nucléiques et plus particulièrement sur les

mécanismes assurant la transmission de l’information génétique.

Pendant ma thèse, sous la direction du Dr. Henri Grosjean (1998-2002, LEBS, CNRS

Université Paris VI), j'ai identifié et caractérisé l'activité de deux enzymes de modification des

ARNt chez la levure S. cerevisiae, toutes deux influant sur l'efficacité de la traduction

génétique. Ce travail est décrit dans la première partie de ce dossier.

J'ai ensuite rejoint l'équipe de la Pr. Suzanne Sommer (2002-2004, IGM, Université Paris

XI) au cours d'un premier stage post doctoral pour travailler sur un micro-organisme fascinant,

Deinococcus radiodurans, capable de réparer son génome fragmenté en milliers de fragments

en seulement quelques heures. La seconde partie de ce document décrit les outils que j'ai mis

au point pour faciliter son étude ainsi que le rôle de la polymérase X dans la réparation des

cassures double-brin de l'ADN chez cette bactérie. J'ai initié le travail de caractérisation

structurale de cette enzyme au cours d'un second stage post-doctoral chez le Pr. Herman van

Tibeurgh (sept-nov 2004, IBBMC, université Paris XI).

L'étude des protéines isolées impliquées dans ces mécanismes assurant la pérennité et

l'expression des génomes, bien qu'essentielle, s'est avérée limitée pour comprendre les

mécanismes dans leur ensemble et expliquer des processus, même simples. Suite à mon

recrutement à l'INRA, je me suis donc focalisé sur l'identification des machines moléculaires,

i.e. des complexes protéiques ou nucléoprotéiques, assurant ces mécanismes, et sur la

caractérisation des interactions assurant leur cohésion et leur dynamique. Ces travaux portant

sur i) l'interactome de la protéine SSB de B. subtilis, et son rôle dans le redémarrage de la

réplication et la réparation de l'ADN, ii) la caractérisation de complexes nucléoprotéiques

impliqués dans l'expression du génome de cette bactérie, et iii) la caractérisation des protéines

Ku et LigD intervenant dans la réparation par NHEJ, sont décrits dans la troisième partie de ce

document. Ces travaux ont été réalisés dans les équipes dirigées par le Dr. Patrice Polard puis

par le Dr. Philippe Noirot (2004-2015, INRA, Jouy-en-Josas).

Depuis 2015, au sein de l'équipe dirigée par le Dr. Marie-Agnès Petit (INRA(E), Jouy-en-

Josas, je poursuis mon étude sur le NHEJ en m'intéressant au rôle d'un orthologue de Ku et de

ses partenaires chez les phages. J'étudie également un autre mécanisme de réparation par

recombinaison, le SSA, impliquant un paralogue de la recombinase RecA, Sak4, et son

partenaire SSB. Outre l'aspect fondamental de cette recherche visant à décrire les mécanismes

11

moléculaires mis en jeu dans ces processus de recombinaison phagiques, je cherche également

à savoir s'ils sont utiles au cycle de vie des phages, voire à leur hôte bactérien. Ces travaux sont

décrits dans la quatrième partie du présent document.

12

I- Thèse de doctorat : octobre 1998 - octobre 2002

Etude d’enzymes de modification de nucléotides des ARNt et de leurs

fonctions dans le métabolisme cellulaire chez S. cerevisiae.

Introduction

J'ai préparé une thèse sous la direction du Dr. Henri Grosjean au sein du Laboratoire

d’Enzymologie et Biochimie Structurales (LEBS) du CNRS à Gif-sur-Yvette. Mon sujet de

thèse a porté sur les modifications enzymatiques de nucléotides au cours de la maturation des

ARN de transfert (ARNt), ainsi que sur les rôles joués par certaines de ces modifications sur le

métabolisme cellulaire chez la levure Saccharomyces cerevisiae.

Chez S. cerevisiae, comme dans tout type de cellules, la biosynthèse des ARNt fonctionnels

est un processus complexe au cours duquel le produit initial de transcription de gènes subit une

série de transformations biochimiques très diverses, chacune catalysées par des enzymes

spécifiques (Hopper 2013). Parmi ces multiples transformations (telles que le raccourcissement,

l’épissage d’introns…), les modifications post-transcriptionnelles de nucléotides sont

particulièrement nombreuses et variées. A ce jour, 25 types différents de nucléotides modifiés

ont été répertoriés dans les 42 différents ARNt cytoplasmiques, dont le taux de modification de

certains d’entre eux peut atteindre 15% (Hopper 2013). Ce taux de modification est moindre

dans les ARNt de mitochondries (9.5 %, (Phizicky et al. 2010a)). Dans les ARNt

cytoplasmiques de cellules humaines ce taux de modification peut atteindre 20 % de leurs

nucléotides (8.7 % dans les ARNt de mitochondries). Plus de 110 nucléotides modifiés

différents ont été à ce jour répertoriés dans les ARNt séquencés de différentes origines

cellulaires (McCown et al. 2020). La majorité de ces nucléotides modifiés résultent de réactions

enzymatiques simples de type méthylation, thiolation, réduction ou désamination. D’autres

résultent de réactions plus complexes, voire de cascades de réactions chimiques donnant lieu à

des nucléotides dits hypermodifiés qui impliquent la participation de plusieurs types d’enzymes

pour leur biosynthèse. Les modifications qui interviennent au niveau de la boucle de l’anticodon

des ARNt sont celles qui ont la plus grande incidence lors de la traduction des ARN messagers

en protéines, et par voie de conséquence sur l’homéostasie et la croissance cellulaire (Agris et

al. 2017, Pollo-Oliveira et al. 2019, Accornero et al. 2020)

13

Travaux de thèse

Au cours de mon travail de thèse, je me suis concentré dans un premier temps sur

l’identification et la caractérisation de deux nouvelles enzymes de modification (une isomérase,

Pus3p, et une méthyltransférase, Trm7p) ayant chacune pour site d’action des nucléotides de la

tige-boucle de l’anticodon des ARNt. Dans un deuxième temps, nous avons analysé le rôle joué

par ces nucléotides modifiés au niveau de la traduction génétique et de la maturation des ARNt.

La levure S. cerevisiae a été utilisée comme modèle de cellules eucaryotes, étant données les

nombreuses informations déjà acquises à l’époque concernant le processus de maturation des

ARNt et leur contenu en nucléotides modifiés, mais encore très peu sur les enzymes impliquées.

(Figure 1).

Figure 1 : Localisation et nature des nucléotides modifiés des ARNt cytoplasmiques et

mitochondriaux de S. cerevisiae. Les pseudouridines (ψ) et 2’-O-méthylnucléotides (Gm, Cm et Um),

pour lesquels j’ai identifié les enzymes responsables de leur formation, sont entourés en rouge.

Cartographies réalisées d’après les banques de séquences d’ARNt http://trnadb.bioinf.uni-

leipzig.de/DataOutput/ (Juhling et al. 2009) et https://iimcb.genesilico.pl/modomics (Boccaletto et al.

2018) ainsi que la revue de (Hopper 2013). Certaines modifications d’uridine et d’adénosine aux

positions 34 et 37 restent à caractériser à ce jour.

1) Identification et caractérisation d’une ARNt : 2’-O-méthyltransférase (Pintard et al.

2002)

En partant de l’observation d'une forte similarité de séquence entre la protéine Ybr061p de

S. cerevisiae et une authentique 2’-O-methyltransférase (RrmJ) agissant sur les ARN chez E.

14

coli (Caldas et al. 2000, Pintard et al. 2002), nous avons cherché à déterminer si Ybr061p

pouvait catalyser des méthylations dans les ARNt. En analysant le contenu en nucléotides 2’-

O-méthylés (méthylation sur le ribose) des ARNt totaux purifiés (marqués radioactivement in

vivo au 32P), nous avons pu montrer que l’inactivation de YBR061c conduit à une réduction du

taux de nucléotides 2’-O-méthylés, principalement dans la région de l’anticodon (voir Figure

1). Ce résultat a ensuite été confirmé et précisé in vitro en montrant que la protéine Ybr061p,

étiquetée par une queue hexahistidine et purifiée d’une souche ΔYBR061c, est capable de

méthyler spécifiquement les nucléotides en positions 32 et 34 de la boucle anticodon d’un

transcrit synthétique, et donc non modifié, d’ARNt-Phe de S. cerevisiae. De plus, lorsque

Ybr061p est mutée au niveau du site probable de fixation du cofacteur S-adénosyl méthionine

(un aspartate en position 49), l’enzyme devient environ 500 fois moins active que la protéine

sauvage. Ces différents résultats nous ont donc permis de conclure que le gène YBR061c de S.

cerevisiae code pour l’ARNt : 2’-O-méthyltransférase, catalysant la formation des 2’-O-

méthylnucléotides aux positions 32 et 34 dans l’ARNt spécifique de la phénylalanine

(anticodon GmAA). La protéine, très conservée chez les eukaryotes, a été renommée Trm7p

(7ème tRNA méthyltransférase caractérisée dans la levure) et s’est avérée catalyser également la

méthylation des riboses 32 et 34 de l’ARNt-Trp (CmCA) et probablement de l’ARNt-Leu

(ncm5UmAA).

Au cours de cette étude in vitro nous avons observé une différence d’efficacité de Trm7p

dans la 2’-O-méthylation des nucléosides en position 32 et 34 du transcrit d'ARNt-Phe. Cette

différence est fortement atténuée lorsqu’un extrait cellulaire d’un mutant ΔYBR061c est ajouté

à la protéine purifiée dans le test. Ce résultat suggère que : i) la 2’-O-méthylation de la position

34 est peut-être dépendante d’autres modifications sur l’ARNt et/ou ii) un (ou des) cofacteur(s)

probablement protéique(s) serai(en)t nécessaire pour modifier efficacement chacune des deux

positions 32 et 34 des ARNt. La fin de la thèse ne m’a pas permis de trancher entre ces deux

hypothèses. L’utilisation d’une méthode de purification de complexes protéiques (Tandem

Affinity Purification, TAP), publiée peu de temps avant ma thèse (Rigaut et al. 1999), m’aurait

sans doute permis de trancher entre ces deux hypothèses. Dès ce moment-là, il était déjà très

clair pour moi que la caractérisation des enzymes de modifications basée uniquement sur

l’étude de protéines purifiées, indépendamment de leurs partenaires potentiels dans la cellule,

bien que fort utile, n’était pas suffisante. Cette idée de caractériser le partenariat protéique d’une

protéine d’intérêt et ainsi d'identifier des machines moléculaires complètes en vue d’en

caractériser les propriétés biochimiques ne m’a alors plus lâchée et a été l’une des lignes

directrices de mes recherches ultérieures dès mon recrutement à l’INRA.

15

Cette analyse par purification en tandem a été réalisée quelques années plus tard par un autre

groupe dans le cadre d’une étude globale, visant à caractériser les complexes protéiques formés

par plus de 4000 protéines chez la levure. Elle suggère que Trm7p interagit avec 2 protéines,

Trm732p et Trm734p (Krogan et al. 2006). Une analyse fine des complexes contenant Trm7p

a montré que cette méthyltransférase forme en fait un complexe indépendant avec chacune de

ces deux protéines. De manière remarquable, le complexe Trm7p-Trm734p permet la

méthylation du nucléotide en position 34 alors que le complexe Trm7p-Trm732p cible la

position 32 (Guy et al. 2012). Ainsi la méthyltransférase Trm7p est guidée sur son substrat par

l’un ou l’autre de ces cofacteurs protéiques en fonction de la position à modifier. Cette propriété

est d’ailleurs partagée par d’autres enzymes de modification d’eucaryotes (Guy et al. 2014).

Par ailleurs, l’analyse détaillée du mutant ΔYBR061c par l’équipe de Bruno Lapeyre du

CRBM au CNRS de Montpellier, avec lequel nous avons collaboré pour ce travail, a montré

une diminution importante du temps de génération, accompagnée par une diminution

d’incorporation d’acides aminés au cours de la croissance, par rapport à la souche sauvage. Cela

démontrait que Trm7p est impliquée dans l’efficacité de la traduction génétique chez la levure.

Cette conclusion a été confirmée et précisée plus tard par le groupe d’Eric Phizicky. Il a montré

que l’origine du défaut de croissance du mutant ΔTRM7 était non seulement liée à l’absence de

2’O-methyl sur le ribose en position 34 et 32 de l’ARNt-Phe (GmAA) (Guy et al. 2012), mais

aussi à l’activation de la voie de contrôle des acide-aminés, vraisemblablement due à un défaut

de chargement de l’ARNt-Phe hypomodifié (Han et al. 2018). La relation entre les 2’-O-

méthylnucléotides 32 et 34 et le chargement de l’ARNtPhe et/ou le défaut de croissance du

mutant ΔTRM7 peut toutefois être indirecte. En effet, l’absence de ces modifications a

également pour conséquence un défaut de formation de la Wyebutosine en position 37 dans la

tige boucle de l’anticodon de l’ARNt-Phe correspondant (Guy et al. 2012). Ceci démontre

l’interdépendance de certaines modifications dans les ARNt et la complexité à caractériser

l’effet de l’inactivation d’un gène de modification en particulier.

2) Identification et caractérisation d’une ARNt : pseudouridine synthétase (Lecointe et

al. 1998)

Le gène DEG1 de S. cerevisiae de fonction inconnue a été identifié par l’analyse

transcriptionnelle de la région centromérique du chromosome VI et son inactivation a montré

un impact sur le taux de croissance des cellules (Carbone et al. 1991). La protéine Deg1p

présente de fortes similarités de séquences avec l’enzyme TruA d’E. coli qui catalyse la

16

formation de pseudouridines (ψ, isomérisation d’une uridine) aux positions 38, 39 et 40 dans

les ARNt (Kammen et al., 1988). Partant de ces observations, nous avons comparé le contenu

des ARN en pseudouridines dans la souche sauvage et une souche ΔDEG1, mesuré in vitro les

capacités de pseudouridylation des extraits cellulaires correspondants, ainsi que celles de la

protéine Deg1p purifiée sur des ARNt transcrits in vitro. Les résultats obtenus nous ont permis

de conclure que Deg1p est l’ARNt : ψ synthétase qui catalyse la formation de pseudouridines

aux positions 38 et/ou 39 (Figure 1) dans au moins 22 ARNt cytoplasmiques et 9 ARNt

mitochondriaux. L’enzyme a été renommée Pus3p. Enfin nous avons montré que le mutant

ΔDEG1 présente un phénotype de thermosensibilité. Le rôle de Pus3p dans ce phénotype a été

étudié plus en détail par la suite par le groupe de Phizicky. Il a montré que l’absence de

pseudouridine en position 38 de l’ARNt-Gln(UUG) est en partie responsable de cette

thermosensibilité (Han et al. 2015).

3) Rôle de Pus3p dans la traduction génétique (Lecointe et al., 2002).

L’une des questions importantes que l’on se posait durant mon travail de thèse concernait le

rôle cellulaire des enzymes de modification des ARNt. En effet, à l'exception de TRM7 et PUS3

(voir plus haut), l'inactivation des gènes codant pour les enzymes de modification des ARNt,

connus chez S. cerevisiae au moment de notre travail, ne laissait pas transparaître de phénotype

de croissance important, ne donnant lieu apparemment à aucun phénotype sur la croissance des

cellules dans les conditions habituelles de ce genre de tests (milieu complet à 30°C). Le fait que

l’inactivation de PUS3 affectait le taux de croissance de la levure à 30°C et que cet effet était

amplifié à 37°C nous a amenés à proposer l’hypothèse d’un rôle des ψ38/39 sur la traduction

génétique. Pour valider cette hypothèse, j’ai utilisé un outil original développé par le groupe de

Jean-Pierre Rousset à l’Institut de Génétique et Microbiologie (Université Paris-Sud)

permettant d'étudier le rôle in vivo de facteurs agissant en cis et en trans sur des processus

d’erreurs de traduction programmés (Stahl et al. 1995). J’ai montré que l’absence des ψ38 et/ou

39 dans des ARNt suppresseurs naturels d’ambre, d’opale ou d’ochre diminue d’un facteur 2 la

fréquence de translecture des codons stop correspondants. De même, l’absence de ψ39 sur un

ARNt-Leu diminue d’un facteur 2 le décalage de phase de lecture en +1 sur une séquence

dérivée du site de décalage du rétrotransposon Ty1. L’ensemble de ces résultats suggérait donc

que les ψ38 et/ou 39 augmentent la potentialité des ARNt modifiés à lire d’autres codons que

ceux qu’ils sont supposés lire et donnent ainsi plus de plasticité à la traduction génétique. Ce

résultat inattendu contrastait avec l’idée qui prévalait à l’époque et qui proposait que le rôle des

17

nucléotides modifiés de la boucle anticodon des ARNt était plutôt d’assurer une plus stricte

spécificité de reconnaissance de l’anticodon avec le codon complémentaire de l'ARNm sur le

ribosome. Nos observations originales initiales ont été plus tard validées pour Pus3p avec un

autre système de translecture (Klassen et al. 2017).

4) Etude du rôle de de l’ARNt : pseudouridine synthétase Pus1p (Grosshans et al. 2001)

Dans le même esprit de recherche du rôle des modifications de nucléotides dans les ARNt,

le groupe d’Eduard Hurt (Biochemi-Zentrum, Heildeberg), avec lequel nous collaborions, a

montré que l’inactivation curieusement non-létale de PUS1, une enzyme multi-sites et bi-

spécifique, formant les pseudouridines aux positions 26, 27, 28, 34, 35, 36, 65, et/ou 67 (selon

l’ARNt cytoplasmique considéré (Simos et al. 1996, Motorin et al. 1998)) et en position 44 de

l’ARNsn U2 (Massenet et al. 1999) chez S. cerevisiae, devient co-létale avec une mutation dans

le gène codant pour une autre ARNt ψ-synthétase, Pus4p, une enzyme site-spécifique pour la

position 55 dans tous les ARNt cytoplasmiques. Pour ma part, j’ai d’abord complété cette

information en démontrant que cette mutation de PUS4 ne permet pas la formation de ψ55 dans

les ARNt. Ensuite, alors que des mutants nuls de PUS1 et PUS4 pris isolément n’ont aucun

effet sur la croissance, la combinaison des deux inactivations est létale. Cela démontre ainsi que

la modification de certains nucléotides devient essentielle lorsque la modification d’autres

nucléotides est compromise. Dans le même ordre d’idée, le groupe d’E. Hurt a également

montré que la mutation C50U de l’ARNt-Gln mineur est co-létale avec l’inactivation de PUS1.

Cette mutation dans le bras Tψ (voir Figure 1) pourrait déstabiliser la structure

tridimensionnelle de l’ARNt correspondant. J’ai complété cette information en démontrant que

cette mutation ralentit significativement la vitesse de modification de cet ARNt par d’autres

enzymes de modification, suggérant que Pus1p peut devenir essentielle si d’autres étapes de la

maturation des ARNt sont altérées. Cette conclusion a également été proposée plus tard pour

d’autres enzymes de modification des ARNt de S. cerevisiae. Par exemple, le phénotype de

thermosensibilité de la souche inactivée du gène PUS3 (voir précédemment) est spécifiquement

causé par le défaut de modification de l’uridine en position 38 de l’ARNt-Gln (UUG) ainsi que

par le défaut de thiolation du nucléotide mcm5U en position 37 du même ARNt (Han et al.

2015). Ceci montre de plus que l’absence d’une même modification à une même position dans

différents ARNt peut avoir un impact délétère sur la physiologie de la cellule dépendant de

l’hypomodification d’un seul ARNt particulier.

18

Autres avancées et perspectives dans le domaine

De toute évidence, la recherche portant sur les modifications post-transcriptionnelles

d’ARNt permet de mettre en évidence des liens inattendus entre différents éléments de la

synthèse protéique et constitue une source importante de nouvelles idées sur le métabolisme

cellulaire en général. Le premier âge d'or de cette recherche portait sur la localisation et la

caractérisation des différents types de nucléotides modifiés, principalement dans les ARNt et

les ARNr (où ils ont été historiquement identifiés) et à identifier les enzymes responsables de

leur formation (période 1960-2010). Cette période a aussi permis de découvrir une partie des

rôles joués par ces modifications sur i) l’efficacité de traduction, ii) la formation de structures

tridimensionnelles correctes et stables des ARNt requises pour leurs interactions avec la

machinerie traductionnelle et iii) l’aminoacylation des ARNt (pour revue, (Phizicky et al.

2010b)).

Cette recherche est maintenant rentrée dans un deuxième âge d’or lié à la découverte de

nucléotides modifiés dans la quasi-totalité des ARN cellulaires (y compris les ARNm) ainsi

qu’à la caractérisation des enzymes de modification correspondantes (McCown et al. 2020) La

mise en évidence de nouvelles modifications post-transcriptionnelles tient notamment au

développement de technologies haut-débit permettant l’identification d’un certain nombre de

nucléotides modifiés dans les ARN, qu’ils soient en quantité importante (ARNr, ARNt) ou non

(ARNm, ARNnc…) (pour revues, (Helm et al. 2017, Anreiter et al. 2020)). Ces méthodologies

permettent d’ouvrir de nouvelles voies de recherche, comme par exemple celles étudiant l’effet

de l’environnement sur le patron de modifications global des ARN. En effet, il devient de plus

en plus évident que des modifications post-traductionnelles ont un rôle de senseurs/marqueurs

de conditions physiologiques ou environnementales particulières. L’impact de l’état

physiologique des cellules sur le degré de modifications des ARN, ou encore l’effet de

l’environnement cellulaire, comme la privation de nutriments, les stresses oxydants ou encore

les rayonnements UV et les variations de températures, commencent à être démontrés et

explorés plus systématiquement. Chacun de ces éléments, pris individuellement ou combinés,

peut moduler le degré de modification des ARNt et ainsi perturber/modifier/voire réguler le

métabolisme normal de la cellule (pour revues récentes, (Pollo-Oliveira et al. 2019, Accornero

et al. 2020, Edwards et al. 2020)). On parle ainsi aujourd’hui d’épitranscriptomique, c’est-à-

dire de la caractérisation des altérations des modifications post-transcriptionnelles faisant suite

à des variations de l’état physiologique de la cellule, et de l'impact de ces altérations sur la

production de protéines. Le plus grand défi pour le futur sera certainement d’associer ces

19

changements de production à une ou plusieurs modifications post transcriptionnelles en

particulier sachant que certaines d’entre elles sont interdépendantes et qu’elles ne jouent pas

nécessairement le même rôle lorsqu’elles sont présentes sur un ARNt donné (voir plus haut).

Dans le cas des ARNt de plusieurs organismes modèles, dont S. cerevisiae, la quasi

intégralité du set d’enzymes nécessaires à leur modification est aujourd’hui caractérisée.

Cependant, l’impact de ces modifications sur les multiples interactions des ARNt avec les autres

constituants de la cellule restent en grande partie encore à découvrir (pour revues, (Hopper

2013, de Crecy-Lagard et al. 2019, Pollo-Oliveira et al. 2019, de Crecy-Lagard et al. 2020)).

De plus, l’identification d’un grand nombre d’enzymes de modification permet non seulement

de pouvoir corréler la fonction biochimique des enzymes et les phénotypes des mutants

correspondants, mais aussi de relier, dans certains cas, une enzyme de modification et la

modification associée à une maladie génétique ou à un cancer (Barbieri et al. 2020, Chujo et al.

2021) pour revues). Un nombre significatif de désordres neurologiques chez l’homme est déjà

associé à un défaut de modification des ARNt. Par exemple, des mutations du gène FTSJ1

humain, codant pour un homologue de la protéine Trm7p de S. cerevisiae (Li et al. 2020)

caractérisée pendant ma thèse, ont pour conséquence une diminution drastique de la quantité de

Ftsj1p (et donc la formation des 2’-O-méthylnucléotides aux positions 32 et 34 d’ARNt substrat

de Ftsj1p) et sont associées à une forme non spécifique de déficience intellectuelle liée au

chromosome X (pour exemple, (Freude et al. 2004)). Cette pathologie de déficience mentale

est également observée chez des patients dont le gène PUS3 (homologue à celui de la levure) a

perdu sa fonction (absence de ψ38/39 dans les ARNt) (Shaheen et al. 2016). D’autres mutations

de PUS3 seraient aussi à l’origine d’autres types de pathologies (de Paiva et al. 2019).

20

II- Travaux post-doctoraux : Novembre 2002 – Novembre 2004

Etude de la radiorésistance chez Deinococcus radiodurans

Introduction

Suite à mon travail de thèse, j'ai rejoint l’équipe du Pr. Suzanne Sommer à l’Institut de

Génétique et Microbiologie de l’Université Paris XI. Le travail réalisé au sein de ce groupe m’a

permis de mettre à profit les compétences acquises pendant la préparation de ma thèse pour

m’intéresser à un autre aspect du métabolisme des acides nucléiques que constitue la réparation

de l’ADN. Cette équipe s'attache à élucider les mécanismes de la radiorésistance chez la

bactérie Deinococcus radiodurans et en particulier les mécanismes de la réparation de l'ADN.

Cette bactérie, isolée à partir de boîtes de conserves stérilisées par irradiation aux rayons gamma

(Anderson 1956) présente en effet la particularité de pouvoir résister à de très fortes doses de

rayonnements ionisants (Figure 2A), mais aussi à d’autres agents génotoxiques qui peuvent être

endogènes (stress oxydant par exemple) ou exogènes (différents agents chimiques ou conditions

environnementales) (Confalonieri et al. 2011, Slade et al. 2011, Daly 2012). Par exemple, D.

radiodurans est capable de réparer plusieurs milliers de cassures double brin (CDB) générées

directement ou indirectement par irradiation γ en seulement quelques heures (Figure 2B). Cette

propriété fait de D. radiodurans l’un des organismes les plus radiorésistants sur la planète.

Figure 2 : D. radiodurans, une bactérie extrêmement radiorésistante. A. Courbes de survie

d'organismes représentatifs exposés au rayonnement γ. Les flèches indiquent le nombre approximatif de

DSB infligés par génome haploïde à la dose qui tue 90% des organismes. Pour information, la grande

majorité des organismes sur Terre sont hautement sensibles aux radiations et sont tués après exposition

à des doses inférieures à 500 Gy. Figure tirée de (Daly 2012). B. Cinétique de la réparation des cassures

double brin de l'ADN dans des cellules de D. radiodurans exposées à une irradiation γ de 6800 Gy.

L’ADN de D. radiodurans est analysé par PFGE après digestion par l’enzyme NotI. Figure tirée de

(Blasius et al. 2008).

A B

21

Les mécanismes à l’origine de cette extrême radiorésistance font l’objet de nombreuses

études. Lors de mon stage post-doctoral, les hypothèses suivantes étaient envisagées :

i) la présence d’un nucléoïde de structure de type anneau dont la compacité élevée

permettrait d’éviter une dispersion des fragments d’ADN après cassures (Levin-Zaidman et al.

2003, Zimmerman et al. 2005). Cette propriété serait d’autant plus importante que la structure

génomique de D. radiodurans est assez complexe (deux chromosomes de 2640 et 412 kb, un

mégaplasmide (177Kbp) et un plasmide (45Kbp), chacun présent entre 4 et 10 copies suivant

les conditions de croissance (Hansen 1978, White et al. 1999)), et que des doses de radiation

générant plus de 100 cassures ne s’accompagnent d’aucune baisse de viabilité (Daly et al. 1996)

ni de réarrangements chromosomiques importants (voir Figure 2B).

ii) une protection accrue des macromolécules contre l’oxydation. Le séquençage du génome

de D. radiodurans (White et al. 1999) a montré la présence de nombreux gènes impliqués dans

la détoxification des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dont la présence dans la cellule

altère l’intégrité des macromolécules comme les protéines et l’ADN. La présence des protéines

correspondantes pourrait limiter l’effet délétère des ROS générés suite à une irradiation. En ce

sens, la plupart des gènes les codant sont surexprimés après irradiation (Liu et al. 2003, Tanaka

et al. 2004) et certains, comme sodA et katE1, après avoir été inactivés isolément, ont été

identifiés comme intervenant dans la radiorésistance, bien que modérément (Markillie et al.

1999). D’autre part, Daly et ses collaborateurs ont montré que le ratio manganèse/fer est assez

élevé chez D. radiodurans, une propriété partagée par différentes bactéries présentant une

capacité élevée à résister à une irradiation ionisante (Daly et al. 2004). Le Mn2+, associé à

d’autres métabolites comme des bases, l’orthophosphate ou des acides aminés, est capable de

se complexer aux ROS et ainsi de les piéger, atténuant de fait leur toxicité (pour revue, (Culotta

et al. 2013)).

iii) une production de protéines et des circuits de régulation radio-induits spécifiques à D.

radiodurans. L’étude réalisée par Tanaka et al. (Tanaka et al. 2004) visant à étudier les

variations de transcriptome de D. radiodurans en réponse à une irradiation ou à une

dessiccation, condition générant aussi des CDB de l’ADN, a montré entre autre que plusieurs

dizaines de gènes spécifiques aux Deinococcaceae codant pour des protéines nommées Ddr

(DNA damage response) de fonctions inconnues, sont surexprimés dans ces conditions. Ces

résultats suggèrent l’existence potentielle d’un mécanisme de résistance aux radiations et à la

dessiccation inédit chez cette bactérie. De plus, l’induction de l’expression de la recombinase

RecA de D. radiodurans est indépendante de la présence des deux homologues de la protéine

LexA de E. coli, essentielle à la mise en place de la réponse SOS chez cette bactérie (Narumi

22

et al. 2001, Bonacossa de Almeida et al. 2002). La découverte de la protéine IrrE, une protéine

qui n’a aucun homologue bactérien connu et qui est un régulateur positif de l’expression de

RecA ainsi que d’autres gènes de réparation, impliquerait une régulation de la voie de réparation

des CDB de l’ADN par recombinaison homologue dépendante de RecA spécifique à cette

bactérie (Earl et al. 2002, Hua et al. 2003). Ceci ouvrait de nouvelles et excitantes hypothèses

de travail alors que les études visant à l’obtention de sa séquence et des études de génomique

comparative, montrant que D. radiodurans possède quantitativement un arsenal de protéines de

réparation de l’ADN connues comparable, voir même inférieur, à celui de bactéries

radiosensibles, suggéraient plutôt que D. radiodurans serait doté d’un système de réparation

classique, mais peut-être plus efficace que dans d’autres bactéries (White et al. 1999, Makarova

et al. 2001).

iv) un mécanisme de réparation des CDB de l’ADN particulièrement efficace (Figure 2B).

Ces lésions sont extrêmement génotoxiques puisqu’elles vont bloquer la réplication de l’ADN

et provoquer la mort de la bactérie si elles ne sont pas réparées. D. radiodurans possède des

gènes qui codent pour l’ensemble des protéines nécessaires à la recombinaison homologue

RecA-dépendante à l’exception de RecB et RecC, impliquée chez E. coli dans l’étape

présynaptique de la RH, i.e. le processing des extrémités des CDB pour le chargement de la

protéine RecA (Makarova et al. 2001). Les protéines RecFOR, associées à d’autres protéines

(SSB, hélicase, nucléase…) sont proposées d’assurer cette étape présynaptique chez D.

radiodurans (Bentchikou et al. 2010, Confalonieri et al. 2011). L’étape synaptique est assurée

par RecA, protéine ubiquitaire chez les bactéries, et son rôle dans la reconstitution à l’identique

des chromosomes après irradiation chez D. radiodurans est essentiel (Daly et al. 1994, Daly et

al. 1996). Toutefois, une réparation partielle des CDB rapidement mise en place après cassure

et RecA-indépendante a été identifiée (Daly et al. 1996). Ce dernier résultat implique que

d’autres mécanismes de réparation des CDB indépendants de la protéine RecA, comme le NHEJ

(Non-Homologous End Joining), un mécanisme majeur de réparation des cassures de l’ADN

chez l’homme qui venait d’être identifié chez les bactéries ((Weller et al. 2002) et voir ci-après),

ou le SSA (Single Strand Annealing), mécanisme permettant l’appariement de régions

homologues localisées au voisinage des cassures (voir Figure 8), pourraient agir en conjonction

avec la recombinaison pour une réparation efficace des cassures chez D. radiodurans. La

caractérisation des produits de deux gènes, ddrA et pprA, de D. radiodurans dont l’inactivation

diminue la capacité de D. radiodurans à tolérer une exposition aux rayons gamma, renforce

cette hypothèse. En effet, la protéine PprA se fixe préférentiellement aux extrémités de l’ADN

double brin (ADNdb), les protégeant de l’action d’une exonucléase et stimule l’activité de

23

différentes ADN ligases. Cela pourrait impliquer PprA dans un mécanisme de type NHEJ

(Narumi et al. 2004). DdrA présente quant à elle une homologie de séquence avec la protéine

d’appariement simple brin (SSAP pour single strand annealing protein) RAD52 eucaryote (Iyer

et al. 2002). Bien que cette activité d’appariement n’ait pas été démontrée, DdrA se fixe

préférentiellement aux extrémités 3’ de l’ADN simple brin (ADNsb), le protégeant ainsi de

l’action d’exonucléase. Un rôle de DdrA dans le SSA ou dans la protection des substrats de

recombinaison dépendant de RecA a ainsi été proposé (Harris et al. 2004).

Travaux post-doctoraux

Pour valider ou invalider ces différentes hypothèses, la mise à disposition d’outils génétiques

pour la communauté est un élément essentiel. La construction d’un de ces outils a fait l’objet

d’une partie de mon stage post-doctoral chez la Pr. Suzanne Sommer, et une application directe

a permis d’étudier l’effet de l’induction de recA après un traitement endommageant l’ADN. La

recherche et la caractérisation d’une protéine potentiellement impliquée dans un mécanisme de

NHEJ chez D. radiodurans a fait l’objet d’une deuxième partie de mon travail, tout d’abord

chez la Pr. S. Sommer puis chez le Pr. Herman van Tilbeurgh au cours d’un second post-doc.

Ces travaux sont brièvement décrits ci-dessous.

1) Construction de vecteurs permettant de moduler l’expression des gènes chez D.

radiodurans et étude du rôle de l’induction de recA après traitement génotoxique (Lecointe

et al. 2004a, Jolivet et al. 2006).

Du fait de l’intérêt que représente la bactérie D. radiodurans comme bactérie modèle pour

étudier les mécanismes de radiorésistance, un certain nombre d’outils génétiques avaient déjà

été développés chez cet organisme. Cependant, des systèmes qui auraient permis une expression

contrôlée et modulable des gènes n’étaient pas disponibles.

Nous avons adapté un système d’expression contrôlée initialement développé chez B.

subtilis pour construire deux vecteurs d’expression chez D. radiodurans. Le premier vecteur

est réplicatif et permet de moduler l’expression des gènes sous contrôle d’un promoteur (Pspac,

(Yansura et al. 1984)) en fonction du nombre de copies du gène codant pour le répresseur du

système (lacI) et de la concentration en inducteur (IPTG). Ce vecteur a été utilisé à de

nombreuses reprises dans l’équipe. Il nous a par exemple permis de montrer que l’induction de

recA après exposition des cellules à la mitomycine C, un agent pontant de l’ADN causant entre

autre des CDB, conduisant à la surexpression de recA et portant la quantité de protéines de

24

11.000 à 44.000 molécules par cellule (Bonacossa de Almeida et al. 2002), était essentielle à la

survie des bactéries traitées continuellement par cet agent génotoxique (Lecointe et al. 2004a).

A l’inverse, nous avons montré que l’induction de recA n’a aucun effet sur la résistance des

bactéries à une dose ponctuelle d’irradiation γ. Ceci suggère que la surexpression de recA n’est

essentielle à la survie de D. radiodurans que lorsque celle-ci est continuellement exposée à un

traitement endommageant l’ADN (Jolivet et al. 2006). De même, l’absence de surexpression

de recA a un effet délétère additionnel sur la radiosensibilité d’un mutant ddrA, suggérant que

ddrA et recA n’interviennent pas dans la même voie de réparation (Jolivet et al. 2006).

Le second vecteur est intégratif et permet, suivant la partie clonée du gène d’intérêt, i) une

inactivation conditionnelle des gènes pour identifier par exemple des gènes essentiels ou

montrer l’effet de la déplétion progressive des protéines correspondantes, ii) l’inactivation d’un

gène d’intérêt et iii) l’expression conditionnelle des gènes en aval sur l’opéron. Ce système a

été validé par l’obtention d’une souche inactivée pour gyrA (codant pour une des sous-unités

de l’ADN gyrase essentielle) dont la viabilité est conditionnelle à l’expression ectopique du

gène (Lecointe et al. 2004a).

2) Découverte d’une polymérase de la famille X chez D. radiodurans, mise en évidence

de son implication dans la radiorésistance et étude structurale (Lecointe et al. 2004b,

Leulliot et al. 2009).

La caractérisation de PprA (Narumi et al. 2004) laissait suspecter la présence d’un

mécanisme de réparation des DSB chez D. radiodurans de type NHEJ, bien que cette bactérie

soit dépourvue des deux protéines essentielles à ce mécanisme, LigD et Ku, rencontrées dans

d’autres bactéries (voir la partie III de ce document traitant du NHEJ). En fonction des

extrémités cassées, la ligation peut nécessiter une maturation préalable des extrémités par une

ADN polymérase. L’analyse du génome de D. radiodurans a montré l’existence d’un

homologue potentiel des ADN polymérases de la famille X, la protéine codée par le gène

DR0467 (Makarova et al. 2001). Certaines polymérases de cette famille chez les mammifères

(λ, µ et la Tdt) sont impliquées dans le NHEJ alors que la polymérase β est impliquée dans la

réparation par excision des bases endommagées (BER pour Base Excision Repair ; pour revue,

(Hoitsma et al. 2020)). Les polymérases de la famille X sont rares chez les bactéries, elles sont

cependant retrouvées chez Bacillus subtilis et Mycobacterium tuberculosis, deux bactéries

capables de réparer des DSB par NHEJ (Weller et al. 2002). Ces protéines présentent la

particularité de posséder deux domaines, un domaine N-terminal homologue au domaine

25

polymérase des ADN polymérases X eucaryotes, et un domaine C-terminal PHP (Polymerase

and Histidinol Phosphatase) non retrouvé dans les polymérases X eucaryotes mais présent chez

les ADN polymérases bactériennes de type C (Aravind et al. 1998). Nous nous sommes

demandés si le gène DR0467 était fonctionnel chez D. radiodurans et s’il jouait un rôle dans la

réparation de l’ADN. En collaboration avec l’équipe du Dr. Ulrich Hubscher à Zurich, nous

avons montré que le gène DR0467 est exprimé de façon constitutive chez D. radiodurans et

qu’il code pour une ADN polymérase présente à environ 3000 molécules par cellule.

L’inactivation de DR0467 entraîne une sensibilisation des bactéries à des doses élevées de

rayonnement γ (supérieur à 10 kGy), accompagnée d’un retard dans la réparation des cassures

de l’ADN, ainsi qu’un retard dans la reprise de la division cellulaire après irradiation. Ces

résultats suggéraient un rôle de la protéine DR0467, renommée PolX, dans la réparation des

cassures de l’ADN (Lecointe et al. 2004b).

Le NHEJ bactérien requiert LigD, une enzyme possédant l’ensemble des activités

nécessaires à la maturation des extrémités cassées, i.e. des activités de ligase, de polymérase et

de nucléase (pour revue, (Bertrand et al. 2019)). De manière inattendue, PolX de D.

radiodurans possède, en plus de son activité polymérase, une activité 3’-5’ exonucléase sur

l’ADN simple et double brin inédite pour des polymérases de cette famille (Blasius et al. 2006),

une activité ensuite confirmée chez d’autres homologues bactériens (Banos et al. 2008b,

Nakane et al. 2009). Cette activité est inhibée en présence de structures de type tige-boucle sur

l’ADN. Le domaine polymérase et le domaine PHP sont requis pour un niveau de

radiorésistance sauvage (Blasius et al. 2006). Alors que chez D. radiodurans l’activité nucléase

est portée par le domaine polymérase de PolX, chez B. subtilis c’est le domaine PHP qui est

responsable de cette activité (Banos et al. 2008b).

Afin de caractériser la structure de PolX et d’en apprendre plus sur la mécanistique de cette

protéine, j’ai initié, au cours d’un second stage post-doctoral chez le Pr. Herman van Tilbeurgh,

la préparation d’une grande quantité de cette polymérase (ainsi que de la topoisomérase VI de

Sulfolobus shibatae, non décrite ici (Graille et al. 2008)). La structure de l’apoenzyme a été

obtenue quelques années plus tard dans le groupe d’Herman (Leulliot et al. 2009). Elle a montré

que PolX de D. radiodurans adopte une conformation étendue, très vraisemblablement inactive

en terme d’activité polymérasique, dans laquelle les sous-domaines « doigts-paume-pouce » et

le sous-domaine de 8 kD spécifique des ADN polymérases de la famille X sont éloignés les uns

des autres en comparaison de leurs positionnements dans la polymérase λ humaine (Figure 3B

vs 3C). De façon intéressante cette structure étendue du domaine polymérase semble être

stabilisée par le domaine PHP (absent dans les polymérases X eucaryotes), ce qui pourrait

26

impliquer un rôle régulateur de ce domaine sur l’activité de la polymérase. L’obtention des

structures de la PolX de Thermus thermophilus en complexe binaire avec un dNTP et ternaire

avec ce même dNTP, plus un substrat d’ADN db avec une brèche d’un nucléotide, montre que

la présence d’ADN est effectivement à l’origine d’un changement structural important de la

protéine au niveau des sous domaines 8kD et « doigts », requis pour la fixation de l’ADN et la

catalyse (Nakane et al. 2012a).

Figure 3 : Structure de la polymérase X de D. radiodurans. A. Représentation schématique de

différentes ADN polymérases de la famille X. NLS, signal de localisation nucléaire; BRCT, domaine

C-terminal de BRCA1. HhH, motif helice tige-boucle hélice. PHP, domaine Polymerase et Histidinol

Phosphatase. h, humain; S.c., S. cerevisiae. PolXDr de D. radiodurans. PolXBs de Bacillus subtilis,

PolXMt de Methanothermobacter thermautotrophicus et PolXTaq de Thermus aquaticus. Adapté de

(Lecointe et al. 2004b). B. Représentation schématique de Polλ en complexe avec un substrat d’ADN

contenant une brèche simple brin (PDB code 2BCR). C. Représentation schématique de PolX de D.

radiodurans (Leulliot et al. 2009).

Autres avancées et perspectives dans le domaine

Jusqu’à aujourd’hui, aucune preuve de l’existence d’un mécanisme de type NHEJ n’a été

démontrée chez D. radiodurans, même si, à ma connaissance, l'utilisation de méthodologies

dédiées à la recherche spécifique de ce type de mécanisme, comme celles permettant une

cassure unique ciblée sur un chromosome (de type CRISPR ou I-SceI, non réparable par

recombinaison homologue RecA-dépendante) ou celles utilisant la transformation de plasmides

linéarisés et la recherche d’évènements de ligature dépendants d’une recombinaison non

homologue, n'a pas été publiée. Quelle pourrait alors être la fonction de PolX ? Le fait qu’une

souche inactivée de polX soit légèrement sensible à l’exposition au peroxyde d’hydrogène, que

la PolX in vitro présente une activité ADN polymérase très peu processive ainsi qu’une activité

5'-deoxyribose-5-phosphate (dRP) lyase, impliquerait que cette enzyme intervienne dans la

résistance au stress oxydant chez cette bactérie en participant au mécanisme BER, comme son

PHP

A B C

27

orthologue humain Polβ (Khairnar et al. 2009). Cette hypothèse, initialement proposée sur la

base de la caractérisation de l’enzyme PolX purifiée de B. subtilis (Banos et al. 2008b, Banos

et al. 2008a) a été validée in vivo pour différentes PolX bactériennes (Nakane et al. 2012b,

Barajas-Ornelas Rdel et al. 2014). Les équipes des Dr. De Vega et Masui ont également

caractérisé d’autres activités enzymatiques portées par ces PolX bactériennes (3’phosphatase,

3’phosphodiesterase et apurinique/apyrimidique (AP) endonuclease) potentiellement requises

pour la maturation des extrémités de produits intermédiaires de réparation de la voie BER en

vue de leur extension avant ligature (Banos et al. 2010, Nakane et al. 2012b, Zafra et al. 2017).

Le rôle de PolX dans la radiorésistance de D. radiodurans pourrait alors s’expliquer par le

fait que les radiations ionisantes sont à l’origine d’une multitude de lésions provoquées

directement, ou indirectement via la production de ROS. La réparation de certaines de ces

lésions dépend d’un mécanisme de type BER (pour revue, (Sage et al. 2017)). Ainsi, pour que

D. radiodurans puisse survivre à une irradiation, la bactérie doit réparer les CDB mais aussi

l’ensemble des lésions qui pourraient bloquer la réplication de l’ADN. Le fait que l’inactivation

de polX ne montre un effet délétère sur la survie des cellules que pour des doses importantes de

radiations (Lecointe et al. 2004b) suggère i) que l’activité de PolX est redondante à l’activité

d’une autre ADN polymérase, probablement l’ADN Polymérase I impliquée chez E. coli dans

le BER, et ii) que l’abondance des lésions de bases après une forte irradiation requiert la

présence d’au moins deux ADN polymérases impliquées dans le BER.

Cependant, les PolX bactériennes présentent une activité 3’-5’ exonucléase et la PolX de B.

subtilis est capable de cliver des extrémités sortantes 3’ non appariées (Banos et al. 2008b), des

substrats potentiels résultant d’un mécanisme de réappariement d’extrémités cassées par NHEJ

ou par SSA. Cela laisse alors la possibilité que la PolX de D. radiodurans ait une deuxième

fonction en rapport direct avec la réparation des DSB. La dualité de fonctions d’ADN

polymérases impliquées dans le BER et le NHEJ chez les bactéries comme chez les eucaryotes

n’est pas sans précédent (pour exemple, (Thapar et al. 2019) et pour revue (Bertrand et al.

2019)). Par exemple, la ligase multifonctionnelle LigD de B. subtilis, essentielle au NHEJ chez

cette bactérie, présente aussi une activité dRP lyase requise pour un mécanisme de type BER

(de Ory et al. 2016, de Ory et al. 2019). D’autre part, les activités de PolX sont compatibles

avec son intervention dans le mécanisme ESDSA décrit plus bas.

Comme mentionné précédemment, aucun mécanisme de type NHEJ n’a été démontré chez

D. radiodurans. La réparation, rapide, partielle et RecA-indépendante, de l’ADN fragmenté

juste après irradiation (Daly et al. 1996) et la reconstitution partielle des chromosomes de la

bactérie, 24h après irradiation et indépendante de RecA (Slade et al. 2009, Devigne et al. 2013),

28

impliquent donc un autre processus. Cet autre mécanisme pourrait être le SSA et la protéine

impliquée DdrB, une protéine de type Single Strand Binding (SSB) (Norais et al. 2009). Celle-

ci est douée d’activité SSA et l’inactivation de son gène couplée à celle de recA inhibe toute

reconstitution des chromosomes de D. radiodurans après irradiation (Xu et al. 2010).

Le faible retard de réparation des cassures dans un mutant ddrB suggère toutefois que la

réparation RecA-dépendante est extrêmement efficace. Ce type de réparation implique un

mécanisme inédit chez cette bactérie, nommé ESDSA (Extended Synthesis-Dependent Strand

Annealing, (Zahradka et al. 2006)). Celui-ci fait intervenir une première étape de maturation

des extrémités cassées, permettant ainsi l’invasion de molécules d’ADN homologues, la

synthèse d’ADN et l’appariement des fragments d’ADN néosynthétisés. Dans un deuxième

temps, la recombinaison homologue des fragments longs, issus de la première étape, permet la

recircularisation des chromosomes de la bactérie et la reprise de la division cellulaire (Figure

4A). Le mécanisme SSA dépendant de DdrB pourrait être lié au mécanisme d’ESDSA puisque

la synthèse massive d’ADN au cours de l’ESDSA est retardée après irradiation dans un mutant

inactivé de ddrB (Bouthier de la Tour et al. 2011).

La réparation des DSB par ESDSA implique cinq des huit gènes impactant le plus la

radiorésistance chez cette bactérie (recA, recO, recF, recR et polA ; (Zahradka et al. 2006, Slade

et al. 2009, Bentchikou et al. 2010)). Cependant, la réparation des DSB n’est qu’une des étapes

à l’origine de la radiorésistance de cette bactérie. Le lecteur est invité à consulter une revue

récente traitant de la radiorésistance. Elle présente l’ensemble des processus révélés à ce jour

liés à ce phénotype, les protéines impliquées connues et leur conservation ou non dans

différentes espèces de Deinococcus radiorésistantes (Lim et al. 2019). Je ne mentionnerai ici

brièvement que les travaux des équipes des Dr. Daly et Radman qui ont clairement mis en

évidence le rôle essentiel du manganèse intracellulaire dans ce processus (pour revues, (Daly

2012, Krisko et al. 2013, Qi et al. 2020 )). Comme dit précédemment, le ratio Mn2+/Fe2+ est

particulièrement élevé chez D. radiodurans et d’autres espèces radiorésistantes par rapport à

des espèces radiosensibles. De manière remarquable, ce ratio est anticorrélé avec l’oxydation

des protéines après irradiation (Figure 4B), une propriété qui serait liée au piégeage des ROS

par les complexes formés avec le manganèse dans la cellule. Ainsi, la quantité de manganèse

élevée chez D. radiodurans assure une protection à l’oxydation de ces protéines (mais aussi de

l’ADN) après irradiation, permettant le maintien du métabolisme cellulaire et donc la réparation

de l’ADN endommagé.

29

Figure 4 : Deux mécanismes essentiels de la radiorésistance de D. radiodurans. A. Le mécanisme

de réparation des DSB par ESDSA. Etapes 1 à 4 : maturation des extrémités et chargement de RecA

permettant la formation d’une D-loop et la synthèse d’ADN par PolIII et PolI. Il est à noter que PolX,

de par ses activités, pourrait participer à la réparation des brèches issues du BER (croix rouges sur les

molécules d’ADN). Etapes 5 à 6 : synthèse convergente d’ADN et dissociation des brins. Etapes 7 à 8 :

appariement des brins néosynthétisés, maturation des produits appariés pour la formation de longues

molécules d’ADN. Ici aussi, les activités de PolX permettraient à cette dernière de participer. L’étape 9

fait intervenir une recombinaison homologue classique permettant la recircularisation des chromosomes

de D. radiodurans (figure tirée de (Slade et al. 2009)). B. Relation entre le ratio intracellulaire de Mn/Fe,

la radiorésistance et le degré d’oxydation des protéines après irradiation pour différentes bactéries (tirée

de (Slade et al. 2011)).

A B

30

III- Travaux réalisés dans l’équipe du Dr. P. Polard puis du Dr. P. Noirot : Décembre 2004 - Mars 2015

J’ai obtenu un poste de CR2 à l’INRA dans l’unité de Génétique Microbienne de Jouy-en-

Josas. La mission associée au profil du poste était l’identification et la caractérisation

fonctionnelle des assemblages multiprotéiques et nucléoprotéiques impliqués dans la

dynamique du génome chez la bactérie modèle à Gram+ B. subtilis. L’approche que j’ai

proposée pour répondre à cette mission permettait de trouver de nouvelles protéines impliquées

dans la dynamique des génomes bactériens, mais aussi potentiellement de trouver de nouvelles

fonctions à des protéines déjà connues et de rechercher à intégrer au niveau cellulaire des

mécanismes moléculaires décortiqués in vitro. Cette technique, dite de purification par affinité

en tandem (ou TAP pour Tandem Affinity Purification), développée par l’équipe de B. Séraphin

(Rigaut et al. 1999), vise à caractériser des complexes multiprotéiques d’intérêt par

l’intermédiaire de la purification sélective d’un de leur constituant, dans des conditions de

purification suffisamment douces pour maintenir les interactions entre molécules. La TAP

permet ainsi d’identifier les protéines composant un complexe et, sur la base de la connaissance

de la fonction du complexe et/ou de certaines protéines qui le composent, de proposer une

fonction aux protéines du complexe dont le rôle était jusqu’alors inconnu. Suite à mon

recrutement, j’ai adapté la TAP à B. subtilis et initié mes recherches en caractérisant les

complexes formés par une trentaine de protéines impliquées dans la dynamique du génome. Les

premières étaient impliquées dans la réactivation des fourches de réplication de l’ADN arrêtées,

les suivantes dans la régulation transcriptionnelle chez B. subtilis.

Identification et caractérisation du partenariat multiple de SSB et son rôle

chez B. subtilis

Introduction

J’ai en particulier utilisé l’approche de TAP pour participer, dans l’équipe dirigée par le Dr.

Patrice Polard, à l’étude du fonctionnement du primosome PriA-dépendant de B. subtilis, un

appareil multiprotéique spécialisé dans le redémarrage de la réplication de l’ADN

chromosomique. Le chromosome de B. subtilis, comme pour la plupart des bactéries, est une

molécule circulaire. Sa réplication est initiée au niveau d’une origine de réplication unique,

OriC, reconnue par l’initiateur de réplication DnaA (pour revue, (Hansen et al. 2018)). Par le

31

biais d’interactions entre les protéines primosomiques, différentes selon la bactérie étudiée

((Brezellec et al. 2016) et pour revue, (Jameson et al. 2017)), deux réplisomes, c’est-à-dire les

machineries multiprotéiques en charge de la réplication (Figure 5A), vont être chargés à chaque

extrémité de la bulle de réplication et vont répliquer le chromosome jusqu’au site de

terminaison. Cette réplication bidirectionnelle implique que chaque réplisome est en charge de

la synthèse de la moitié du chromosome, ce qui représente chez B. subtilis plus de 2Mb (Figure

5B). Cependant, les fourches de réplication peuvent rencontrer divers obstacles au cours de leur

cheminement. Bien qu’une partie de ces obstacles, notamment des lésions sur l’ADN, puisse

être, au moins in vitro, contournée sans effondrement de la fourche de réplication ((Heller et al.

2006, Yeeles et al. 2011) et pour revue, (Marians 2018)), d’autres, comme des démantèlements

de réplisome ou des collisions entre le réplisome et des protéines associées à l’ADN (pour revue

(Michel et al. 2017)), vont entraîner l’arrêt de la réplication et la mort cellulaire si un nouveau

réplisome n’est pas rechargé après résolution du problème à l’origine de l’arrêt (Figure 5B). Il

est estimé qu’un réplisome chargé à OriC se dissociera de sa matrice ADN au moins une fois

avant la terminaison de la réplication (Cox et al. 2000). Comme DnaA n’initie pas la réplication

en dehors d’OriC, les bactéries ont mis en place un système de redémarrage de la réplication

(pour revue (Windgassen et al. 2018)). Chez E. coli, le redémarrage de la réplication requiert

les protéines PriA, PriB, PriC et DnaT. Ces protéines ont été caractérisées en utilisant le phage

ΦX174 dont l’initiation de la réplication au site pas (Primosome Assembly Site), une structure

branchée de l’ADN ressemblant à une fourche de réplication, dépend de ces protéines (pour

revue, (Marians 1992)). Pour ce phage, PriA est l’initiateur de la réplication (homologue

fonctionnel de DnaA à OriC) en se fixant au site PAS et en permettant le recrutement des autres

protéines du primosome. Bien que PriA soit une protéine conservée chez les bactéries, les autres

protéines primosomiques ne le sont pas. Chez B. subtilis le primosome, impliqué dans

l’initiation de la réplication du plasmide pAMβ1 contenant une site ssiA, homologue structurel

du site pas du phage ΦX174, et dans le redémarrage de la réplication de fourches

chromosomiques arrêtées, est constitué de PriA, DnaD, DnaB et DnaI, ((Bruand et al. 1995,

Marsin et al. 2001, Polard et al. 2002, Velten et al. 2003, Bruand et al. 2005), Figure 5C). PriA

n’est pas seulement une protéine de recrutement. Elle est aussi une hélicase ADN de la famille

SF2 dont l’activité, in vitro, est régulée par la structure de la fourche reconnue et par la protéine

de fixation à l’ADNsb, SSB. PriA est ainsi capable de remodeler la fourche arrêtée en cas de

besoin, notamment si de l’ADNsb n’est pas disponible sur le brin retardé (Jones et al. 1999,

Jones et al. 2001), un substrat requis pour le chargement de l’hélicase réplicative. L’activité

hélicase de PriA de E. coli est stimulée in vitro en présence de SSB, et cette stimulation requiert

32

une interaction physique entre le domaine C-terminal de SSB et PriA (Cadman et al. 2004).

La protéine SSB (RPA chez les eucaryotes) est une protéine ubiquitaire et essentielle chez

les êtres vivants. Sa fonction première est de se fixer sur les intermédiaires d’ADNsb issus des

processus de réplication (Figure 5A), de recombinaison et de réparation de l’ADN. Sa fixation

va permettre de recouvrir et ainsi de protéger l’ADN de l’action de protéines inadéquates, ou à

l’inverse, de faciliter l’action d’enzymes sur ce substrat.

Figure 5 : Le redémarrage de la réplication chez B. subtilis. A. Représentation schématique du

réplisome de B. subtilis (figure tirée de (Jameson et al. 2017). B. Réplication bidirectionnelle du

chromosome bactérien et représentation schématique illustrant l'arrêt et l'effondrement de la fourche de

réplication. Le schéma de différents types de fourches reconnues par PriA est représenté : des fourches

en cours de réplication et abandonnées par leur réplisome et directement re-démarrables, des fourches

issues des processus de réparation de l'ADN, de l'initiation de la réplication de l'ADN de certains phages

et plasmides ou encore liées à la transcription. L'ADN parental est indiqué en noir, le néosynthétisé en

gris et l'ARN en rouge. SSB est affiché en orange (issu de (Windgassen et al. 2018)). C. Modèle

d’assemblage du primosome dépendant de PriA chez B. subtilis. (i) La fourche arrêtée et réparée est

fixée par PriA. (ii) PriA assiste la fixation de DnaD. (iii) DnaD active la fixation de DnaB sur l’ADNsb

voisin. (iv) Le complexe DnaC-DnaI est recruté sur le brin leading pour redémarrer la réplication (issu

de Marsin, 2001 #360}).

A

C

B

33

Dans ce dernier cas, l’accès à l’ADN est facilité via une interaction physique entre SSB et son

partenaire ou via l’inhibition de la formation de structures secondaires sur l’ADNsb. Les SSB

des modèles E. coli et B. subtilis se composent de trois régions (pour revue, (Antony et al.

2019)). La région N-terminale contient un domaine OB (Oligonucleotide / oligosaccharide

Binding fold) responsable de la tétramérisation de SSB et de sa fixation à l’ADN. La région C-

terminale de 6 acides aminés (ou 9 selon les publications, région nommée TIP) est

amphipathique, elle est constituée de résidus acides et de résidus hydrophobes hautement

conservés entre les différentes SSB bactérienne. Cette région, chez E. coli, est essentielle à la

viabilité cellulaire et est requise pour assurer les interactions de SSB avec ses multiples

partenaires protéiques, dont PriA, mais pas avec l’ADN ((Curth et al. 1996), pour revue (Antony

et al. 2019)). Cette extrémité amphipathique est séparée du domaine N-terminal par une région

centrale, nommée IDL (Intrinsically Disordered Linker), riche en glycine et proline et ne

présentant pas de structure secondaire évidente. L’IDL n’est pas essentielle puisque des mutants

de la SSB d’E. coli (SSBEc) constituée de la région N-terminale fusionnée directement avec

l’extrémité amphipathique sont viables (Curth et al. 1996). L’IDL est cependant impliquée dans

des interactions protéine-protéine (voir ci- dessous).

Figure 6. Architecture de la SSB d’E. coli. (A) Schéma du domaine OB de liaison à l'ADN, de

l’extrémité acide en C-terminal (TIP) et de la région IDL. La séquence du TIP de la SSB de B. subtilis

est DISDDDLPF. (B) Structure de SSB liée à l'ADNsb (bâtonnets noirs) représentée avec ses quatre

sous-unité colorées. Les IDL sont représentés s'étendant loin du noyau de liaison à l'ADN (tirée de

(Antony et al. 2019)).

Travaux de recherche

Caractérisation de l’interactome de SSB chez B. subtilis et de son rôle dans la dynamique du

génome (Lecointe et al. 2007, Costes et al. 2010)

Le redémarrage de la réplication dépendant de PriA était bien caractérisé in vitro chez B.

34

subtilis, comme chez E. coli. Cependant le mécanisme par lequel PriA est chargée sur une

fourche de réplication arrêtée et réparée restait une énigme. En effet, comment PriA, protéine

peu abondante ((~ 50 molécules/cellule, (Polard et al. 2002)) est-elle capable d’atteindre son

site d’action dans la cellule alors que la fourche de réplication est susceptible d’être fixée par

un grand nombre de protéines différentes impliquées dans sa réparation ? De manière plus

générale, comment sont coordonnés les processus cellulaires impliqués dans le sauvetage des

fourches de réplication ?

Nous avons montré que la protéine de fusion GFP-PriA est continuellement co-localisée

avec des protéines du réplisome vraisemblablement au niveau de l’usine réplicative (UR) : le

˝compartiment˝ de la cellule où l’ADN est répliqué (Lemon et al. 1998). In vitro, PriA de B.

subtilis (PriABs) interagit avec la SSB de B. subtilis (SSBBs) et cette interaction requiert la partie

C-terminale de SSBBs, comme chez E. coli. Pour rechercher en quoi cette interaction intervenait

dans le profil de localisation de PriA dans la cellule, nous avons créé un mutant d’interaction

de PriA (PriAZF) en substituant les deux motifs à doigts de zinc (souvent impliqués dans

l’interaction entre macromolécules) de PriABs par celui de PriA de E. coli (PriAEc). La protéine

chimère obtenue présentait in vitro une interaction avec l’ADN similaire à celle obtenue avec

la protéine sauvage, mais était incapable d’interagir avec la SSBBs et ne localisait plus à l’UR

in vivo. Cela suggérait que le profil de localisation continuel de PriABs à l’UR était dépendant

de l’interaction de cette dernière avec SSBBs (présente également continuellement à l’UR,

(Meile et al. 2006)). Cependant, comme PriAEc est capable d’interagir avec la SSBBs, cette

hypothèse restait à valider. Cette validation est venue grâce à l’utilisation d’une souche mutante

de B. subtilis codant pour une SSB tronquée de ses 35 acides aminés en C-terminal. Pour

l’anecdote, j’ai obtenu ce mutant de B. subtilis (pas de mutant viable du C-terminus connu chez

E. coli) par un heureux hasard en essayant de fusionner une étiquette d’affinité (appelée SPA)

au gène SSB, en vue de caractériser son partenariat par TAP (voir ci-dessus). A ma grande

surprise, l’unique clone que j’ai obtenu sur une boîte oubliée plusieurs jours sur ma paillasse ne

codait pas pour une protéine SSB-SPA, mais pour une protéine tronquée de ses 35 derniers

résidus (SSBΔ35). Après reconstruction d’un mutant « propre » ssb𝛥35 nous avons pu

confirmer que PriABs localise à l’UR de manière dépendante de la queue C-terminale de SSBBs.

Nous avons étendu cette observation à deux autres hélicases de la famille SF2 également

impliquées dans le sauvetage des fourches de réplication arrêtées, RecG et RecQ, pour

lesquelles nous avons pu confirmer aussi la présence de SSBBs dans leur interactome respectif.

La surexpression nécessaire du mutant PriAZF pour augmenter la survie d’une souche de B.

subtilis n’exprimant qu’une très faible quantité de PriABs sauvage montre que le rôle de

35

l’interaction entre SSBBs et PriABs est, a minima, de permettre à cette dernière d’atteindre

efficacement son site d’action dans la cellule en la concentrant continuellement à proximité de

la fourche de réplication. Ceci permet aussi de palier à la faible quantité de PriABs produite dans

les cellules. Sur la base de ces résultats, nous avons proposé que la protéine SSBBs joue, en plus

de son rôle de protection de l’ADNsb, le rôle de plate-forme dans l’UR pour différentes ADN

hélicases, facilitant ainsi leur action de réparation des fourches de réplication arrêtées. Une

partie de ce travail a été menée par Mlle Céline Serena, en thèse à l’époque sous la direction de

P. Polard et par Mlle Audrey Costes dont j’ai co-encadré, avec P. Polard, le stage de M2

(Lecointe et al. 2007).

L’interactome de SSBEc est constitué de plus d’une dizaine de protéines. Afin de déterminer

si d’autres protéines de la dynamique du génome pouvaient être recrutées à l’UR via SSBBs, A.

Costes, dont j’ai ensuite co-encadré la thèse avec P. Polard entre 2007 et 2010, et moi-même

avons mené deux études. La première visait à déterminer, dans un mutant de ssb dépourvu de

sa partie C-terminale (ssbΔ35 comme ssbΔ6 présentaient des résultats identiques), le profil de

localisation des protéines de réparation de l’ADN connues pour être localisées à l’UR dans un

contexte sauvage. La deuxième étude, sans a priori, visait à caractériser l’interactome de la

SSBBs par TAP. Nous avons ainsi identifié neuf nouveaux partenaires de SSB. L’analyse de cet

interactome et les connaissances sur les fonctions des protéines le constituant, acquises à

l’époque ou ultérieurement par d’autres équipes, indiquent que l’interactome de SSB est

conservé entre E. coli et B. subtilis en terme de fonction : la réplication (DnaE chez B. subtilis),

la recombinaison (RecQ, YpbB/RecS, RecJ, RecO, RecG, RecD2), la réparation (XseA (sous

unité de l’exonucléase VII), Ung, SbcC) et le redémarrage (PriA), même si certaines protéines

sont spécifiques de la bactérie étudiée ((Torres et al. 2017b) et pour revues : (Lenhart et al.

2012, Alonso et al. 2013, Antony et al. 2019), Figure 7A)). Une autre protéine de l’interactome

de SSBBs, RarA, fonctionnellement mal caractérisée, est également impliquée dans des

processus de réparation/recombinaison et/ou de redémarrage de la réplication (Carrasco et al.

2018, Romero et al. 2019a, Romero et al. 2019b, Jain et al. 2020, Romero et al. 2020). Ainsi,

certaines protéines impliquées dans la réactivation des fourches en cas d’arrêt sont

continuellement présentes avec SSB dans l’UR. Quel est le rôle de cette présence continue ?

Nous avons montré qu’un mutant ssbΔ35, en plus de présenter un défaut de viabilité en

condition non stressante, est extrêmement sensible aux UV et que la réponse SOS est altérée

dans ce contexte. Ce mutant présente aussi la particularité d’être thermosensible et nous avons

montré que la surexpression de RecO (médiateur du chargement de RecA) atténue ce

phénotype, indiquant que SSBBs joue aussi un rôle de concentrateur de protéines de la réparation

36

de l’ADN au niveau de la fourche de réplication. Enfin, le phénotype de thermosensibilité de

mutants de réplication est amplifié dans un contexte ssbΔ35 suggérant que le C-terminus de

SSBBs devient essentiel lorsque des stresses portent atteinte au réplisome bactérien. Ces

résultats ont ainsi montré qu’en plus de son rôle de protection de l’ADN, SSBBs est également

impliquée dans sa réparation en tant que plate-forme d’interactions pour de multiples protéines

de la dynamique des génomes (Figure 7A). Ce travail a fait l’objet d’un article qu’A. Costes a

signé en co-premier auteur (Costes et al. 2010).

Figure 7. L'interactome de SSBBs et son rôle. A. Modèle du rôle du C-terminus de SSBBs dans la

réparation des dommages des fourches de réplication. La réactivation de la fourche de réplication est

décrite comme un processus en deux temps. Le premier vise à restaurer l’intégrité structurelle de la

fourche inactivée (étapes 1, 2 et 3). Le deuxième consiste à réassembler le réplisome sur la fourche

réparée (étape 4). La fourche active en cours de réplication est représentée avec le réplisome (rond gris

foncé). SSBBs (ronds gris clairs), qui recouvre le brin retardé, est entouré par son interactome représenté

sous forme de cylindre. L’étape 0 (flèche pointillée) représente un démantèlement de réplisome sans

nécessité de réparation de la fourche avant réactivation. Les flèches pleines (étapes 1, 2, 3, 4)

représentent toutes les autres voies de réparation de la fourche qui pourraient faire intervenir les

partenaires de SSBBs (Costes et al. 2010). B. structure de SSBBs et du mutant SSBΔ60+6 et localisation

de partenaires de SSBBs dans le contexte sauvage (ssb) ou mutant (ssbΔ60+6). DAPI en bleu, signal

GFP en vert.

B

ssb ssbΔ60+6

SSB

Nter IDL

SSBΔ60+6

TIP

A

37

Un deuxième aspect du travail de thèse d’A. Costes a consisté à comprendre comment sont

régulées ces interactions protéine-protéine alors que tous les partenaires semblent requérir le

même domaine C-terminal amphipathique de SSBBs. En effet, la fourche de réplication est le

lieu où les machineries en charge de la réplication, de la réparation et du redémarrage sont

amenées à être utilisées. A première vue, pour être efficace, ces mécanismes doivent être au

moins régulés temporellement s’ils ne le sont pas spatialement. Dans ce cadre, A. Costes a créé

toute une série de mutants de la queue C-terminale, caractérisé les effets de ces mutations sur

la viabilité cellulaire après stress et localisé les partenaires de SSBBs. Ce travail a permis de

montrer un rôle potentiel de l’IDL (voir Figure 6A) dans l’interaction de certaines protéines

avec SSBBs. En effet, un mutant SSBΔ60+6, dépourvu de cette région et sur lequel l’extrémité

C-terminale amphipathique de 6 acides aminés est fusionnée au domaine N-terminal (Figure

7B), permet la localisation de PriABs (non montré) et de RecG à l’UR, mais pas celle de DnaE

ou RecO. D’autre part, A. Costes a pu montrer in silico l’existence de trois domaines dans l’IDL

de SSBBs similaires à la TIP, en ce sens qu’ils sont constitués d’acides aminés polaires et

d’acides aminés hydrophobes. De manière intéressante, l’un de ces domaines se retrouve à

l’extrémité du mutant ssbΔ35. La mutation de la partie hydrophobe de ce motif altère encore

plus les défauts de viabilité du mutant ssbΔ35. Ces résultats suggérent que ce motif peut être

important pour la fonction de SSBΔ35 et potentiellement de la protéine sauvage. D’autre part,

le travail d’A. Costes montrait que toutes les pièces de l’interactome n’interagissent pas de la

même manière avec SSB et proposait un rôle de l’IDL dans la composition de cet interactome

chez B. subtilis. Le comportement différent des partenaires en fonction des mutants de SSBBs

suggérait également que SSBBs soit un des éléments régulateurs de l’accès des protéines de

réactivation à la fourche de réplication arrêtée.

Autres avancées et perspectives dans le domaine

Comme mentionné précédemment, les résultats de thèse d’A. Costes suggéraient un rôle de

l’IDL dans les interactions de SSB avec une partie de ses partenaires. Cette hypothèse semble

désormais être validée pour la SSBEc puisque les travaux de l’équipe du Dr. Piero Bianco, sur

la caractérisation de l’interaction entre SSBEc et RecG ou RecO d'E. coli, montre un rôle

important de cette région (Bianco et al. 2017). L’IDL et la TIP sont aussi impliquées, à des

degrés divers en fonction du mode de fixation de SSBEc à l’ADNsb, dans l’interaction de SSBEc

avec elle-même. Cette interaction est à l’origine de la coopérativité de fixation de cette protéine

sur l’ADNsb ((Kozlov et al. 2015, Tan et al. 2017) et pour revue (Antony et al. 2019)). Ceci

38

implique que l’interaction de certains partenaires avec SSBEc (et SSBBs par extension) puisse

être à l’origine de la désorganisation du filament de SSBEc sur l’ADNsb, provoquant ainsi une

diminution de l’effet barrière de SSB (effet de protection de l’ADNsb vis-à-vis de la fixation

de protéines non désirées), une étape importante pour permettre le chargement d’autres

protéines de réparation de l’ADN, telle que PriAEc (pour revue, (Antony et al. 2019)). Il est à

noter qu’une partie des phénotypes observés pour la souche ssbΔ35 pourrait aussi être liée à

une altération des capacités de fixation de la protéine SSBΔ35 sur l’ADNsb par rapport à la

protéine sauvage, même si in vitro nous n’avons pas été en mesure de vérifier cette hypothèse.

Quel que soit le rôle de l’IDL, une constante dans les études réalisées est la nécessité de la

présence de la TIP pour observer les interactions entre SSB et ses partenaires, chez B. subtilis

comme chez E. coli. Pour le groupe de Bianco, la TIP aurait seulement un rôle régulateur sur

la structure de l’IDL et ses capacités à interagir avec les partenaires de SSBEc. Cette hypothèse

n’explique toutefois pas l’identification de la surface d’interaction entre l’extrémité hydrophobe

de la TIP de SSBEc et la poche hydrophobe de plusieurs partenaires de SSBEc (Antony et al.

2019). D’autre part, des travaux récents de l’équipe du Dr. Thimothy Lohman, ayant pointé ces

contradictions, montrent que des peptides constitués de la TIP et de parties plus ou moins

importantes de l’IDL de la SSBEc ont la même affinité pour différents partenaires de SSBEc

(Shinn et al. 2019). Ce travail a de plus montré que tous les partenaires testés n’ont pas la même

affinité pour la TIP seule, suggérant que cette région pourrait avoir un rôle régulateur dans

l’accès des partenaires de SSBEc à la fourche. Quoiqu’il en soit, les travaux de l’équipe de

Bianco (et ceux d’A. Costes) relancent la question de la mécanistique d’interaction de SSB avec

son interactome et montrent le besoin crucial d’obtenir la structure de différents complexes

SSB/partenaire en présence ou non d’ADN ainsi que l’obtention de mutants de séparation de

fonctions, mutants dont les partenariats différents permettront de mieux comprendre le rôle de

chacune des interactions.

Outre l’impact de ces études sur l’interaction en elle-même, celles-ci permettent également

de comprendre son rôle dans les mécanismes en charge des fourches arrêtées. Ainsi, l’obtention

de la structure de PriAEc en présence de la TIP de SSB et la caractérisation de l’interaction en

molécule unique montrent que la fixation de PriAEc sur une fourche de réplication dont le brin

retardé est couvert de SSBEc change le mode de fixation de SSBEc à l’ADN et a pour

conséquence de libérer de l’ADNsb. Cette exposition permettrait par la suite le chargement des

autres protéines primosomiques et enfin de l’ADN hélicase réplicative (Bhattacharyya et al.

2014). Par conséquent, la capacité de PriAEc à interagir avec SSBEc a donc deux fonctions :

faciliter l’accès de PriAEc à son substrat et lever l’effet barrière de SSBEc vis-à-vis des protéines

39

primosomiques et de l’ADN hélicase.

Une des questions relevées par nos études concerne la nature des foyers de fluorescence

observés soit par fusion de la GFP sur des partenaires de SSBBs soit sur la SSBBs elle-même.

Comme dit précédemment, DnaE fusionnée à la GFP forme des foyers de fluorescence

dépendant de la queue C-terminale de SSBBs. DnaE est une ADN polymérase essentielle chez

B. subtilis dont le rôle serait d’allonger de quelques nucléotides les amorces ARN des fragments

d’Okazaki sur le brin retardé avant leur prise en charge par l’autre ADN polymérase réplicative

PolC (Sanders et al. 2010, Li et al. 2019). Ce modèle d’action essentielle mais limitée à la

fourche de DnaE reste cependant discuté (Paschalis et al. 2017, Seco et al. 2017). Quoi qu’il en

soit, le fait que DnaE-GFP ne forme pas de foyer dans la ssbΔ35 implique que cette protéine

fusion en activité sur la fourche n’était pas visible par épifluorescence avec le matériel dont

nous disposions. De la même manière, la très grande majorité des cellules observées ont des

foyers de type UR pour les différentes protéines de réactivation partenaires de SSB, dans des

conditions de croissance normale (i.e. sans agents endommageant l’ADN). Ceci implique que

les foyers observés seraient des formes de stockage des protéines partenaires sous une forme

non active, en attente d’un substrat. Nous avons proposé que ces protéines interagissent avec

les tétramères de SSBBs fixés sur l’ADNsb au niveau de la fourche de réplication (Figure 7A).

Cependant, la quantité importante de tétramères de SSBBs (environ 5000 chez B. subtilis, thèse

de Céline Sérena) et la fixation d’environ une soixantaine seulement d’entre eux sur les

fragments d’Okazaki présents sur les deux fourches (estimation basée sur un mode de fixation

de SSBBs sur 35 nt pour une taille de fragment d’Okazaki d’environ 1 kb), impliquent qu’une

majorité de la SSBBs n’est pas associée à l’ADNsb. Dans ce cas, pourquoi visualise-t-on des

foyers de protéines interagissant avec SSB co-localisant avec d’autres protéines du réplisome

dont la localisation est indépendante de SSBBs? Qu’est-ce qui définit la compartimentation de

ces protéines au niveau ou à proximité de l’UR ? Où est localisée la SSBBs en excès ?

Un élément de réponse, avec les connaissances disponibles, était que les queues C-terminales

des tétramères de SSBBs non fixés à l’ADN pourraient interagir avec les domaines OB-fold et

ainsi ne plus être disponibles pour interagir avec les partenaires de SSBBs. Cette hypothèse était

basée sur l’observation qu’une interaction entre le domaine C-terminal acide et le domaine OB

fold chez les protéines SSB des phages T4 (gp3, (Wu et al. 1999)) et T7 (gp2.5, (Marintcheva

et al. 2008)) influe sur l’interaction entre ces SSB et l’ADNsb. Le rôle de la TIP de la SSBEc

sur interaction avec l’ADNsb a également été montré (Kozlov et al. 2010, Su et al. 2014). Ainsi,

la majorité des SSB, non liée à l’ADNsb, pourrait simplement ne pas être capable d’interagir

avec les protéines de l’interactome, laissant ces dernières fixées sur les nucléofilaments de SSB

40

à la fourche. Une seconde explication peut désormais être avancée suite aux travaux récents

montrant la propriété de la SSBEc à former des condensats par séparation de phase liquide-

liquide dans des conditions compatibles avec le milieu intracellulaire (Harami et al. 2020). Ces

condensats se forment par de multiples interactions entre les protéines SSBEc via leurs différents

domaines, l’absence de l’IDL et de la TIP altérant fortement la formation de ces structures. La

présence d’une région intrinsèquement désordonnée est une marque des protéines présentant

cette capacité à former des condensats par séparation de phase (pour revue (Alberti et al. 2019)).

En plus de concentrer la protéine SSBEc elle-même, ces condensats peuvent accueillir et

concentrer spécifiquement des protéines de l’interactome ainsi que de l’ADNsb. Ainsi, les

foyers de fluorescence des partenaires de SSBBs que nous observions dans nos études pourraient

contenir l’ensemble des SSBBs de la cellule, formant un condensat unique échafaudé à partir

des molécules de SSBBs fixées à l’ADNsb. La dynamique de mouvement de SSBEc au sein de

ces condensats (Harami et al. 2020) permettrait de séquestrer les partenaires afin d’éviter une

action néfaste sur la réplication en conditions normales et de les libérer en cas de besoin. Cette

capacité à former des condensats mise à jour pour la SSBEc, et vraisemblablement existant pour

la très grande majorité des SSB bactériennes qui présentent quasi systématiquement une région

IDL, nécessite désormais de comprendre les déterminants à la base de cette propriété, une étape

essentielle à la production de mutants de séparation de fonction. Ces derniers permettraient de

différencier les différents rôles de la partie C-terminale de cette protéine et de caractériser les

différents rôles de SSB au sein de la cellule.

Etude de la régulation transcriptionnelle en réponse à des changements

environnementaux chez B. subtilis.

Suite au départ de P. Polard de l’INRA en 2007, j’ai recherché une équipe d’accueil en ayant

pour objectif de développer, parallèlement à ce travail sur SSBBs avec A. Costes restée la moitié

de sa thèse à l'INRA, ma propre thématique de recherche associée à l’étude de la dynamique

des génomes bactériens et au sein de laquelle je pouvais apporter mon expertise de

caractérisation des complexes multiprotéiques. J’ai rejoint l’équipe du Dr. Philippe Noirot dans

l’unité Micalis qui s’orientait vers la biologie des systèmes. Cette thématique, visant à élaborer

des modèles mathématiques prédisant l’évolution de systèmes biologiques en réponse à des

changements environnementaux, était pour moi un moyen complémentaire d’appréhender les

réponses cellulaires de B. subtilis confronté à une multitude de stresses induisant des dommages

41

à l’ADN, et ainsi de caractériser l’ensemble des gènes impliqués dans les mécanismes de

réparation et leurs interactions potentielles.

Les interactions protéine-protéine ne sont pas ou peu prises en compte dans les modèles

mathématiques pour la biologie systémique. Or, ces interactions peuvent fortement influer sur

l’activité des protéines et donc sur l’élaboration de modèles prédictifs. En me basant sur ce

besoin et avec l’aide du Dr. Olivier Delumeau, un post-doctorant que nous avons recruté dans

le cadre du projet européen BaSysbio, nous avons optimisé la méthodologie TAP chez B.

subtilis afin de caractériser des complexes multiprotéiques à grande échelle. Nous l’avons

standardisée au sein du consortium afin que puissent être comparés les résultats générés par les

différentes équipes associées au projet Basysbio. Une application directe de cette technique a

été d’étudier la dynamique de la composition de l’ARN polymérase de B. subtilis dans

différentes conditions de croissance (Delumeau et al. 2011).

Par ailleurs, la compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation

transcriptionnelle est un maillon important de la biologie des systèmes. Pour cela, j’ai

développé et standardisé une technique d’immunopurification de la chromatine permettant de

cartographier les sites de fixation de protéines d’intérêt sur le chromosome de B. subtilis.

Dans le cadre du projet BaSysbio, j’ai utilisé cette technique pour deux études. La première

visait à caractériser la réponse cellulaire de B. subtilis à un changement de source carbonée dans

le milieu de culture. La Dr. Nathalie Pigeonneau, stagiaire post-doctorale que j’ai encadrée et

formée à cette technique, et moi-même, avons cartographié les sites de fixation sur le

chromosome de CcpA, un des régulateurs de la répression catabolique. Une analyse in silico

comparant ces sites aux gènes différentiellement exprimés après le changement de source

carbonée montre que sur les 200 gènes les plus impactés par ce changement, près de 60%

seraient régulés par CcpA, confirmant l’impact majeur de ce régulateur. Ce travail a été intégré

dans une étude globale qui a été publiée dans Science (Buescher et al. 2012).

La deuxième étude visait à cartographier l’ensemble des unités transcriptionnelles du

génome de B. subtilis par caractérisation de son transcriptome dans une centaine de conditions

de croissance différentes. Ces conditions incluaient des croissances en présence d’agents

génotoxiques, d’un intérêt particulier pour ma thématique de recherche sur le NHEJ (voir ci-

dessous). Ce travail a permis entre autres de réaliser une classification des promoteurs basée

sur l’expression des gènes associés. J’ai identifié les sites sur lesquels se fixe le facteur sigma

de ménage. Ceci a contribué à valider l’hypothèse selon laquelle cette classification repose

essentiellement sur la reconnaissance des promoteurs par les facteurs sigma. Cette classification

a ainsi permis de prédire un rôle à des gènes de fonctions encore inconnues (Nicolas et al. 2012).

42

Etude du NHEJ bactérien

Introduction

A partir de 2011, dans l’équipe de P. Noirot, j’ai parallèlement développé un nouvel axe de

recherche visant à caractériser le mécanisme de réparation des CDB par recombinaison

illégitime, le NHEJ, chez les bactéries, et plus exactement à i) caractériser les intervenants et ii)

comprendre les interactions mises en jeu aboutissant à un mécanisme de réparation efficace.

Chez les bactéries, le mécanisme majeur de réparation des CDB est la recombinaison

homologue (HR) faisant intervenir la recombinase ubiquitaire RecA (pour revue,

(Kowalczykowski 2015)). Ce mécanisme nécessite la présence d’une région homologue à la

région lésée et intacte dans la même cellule (Figure 8). Ainsi, ce système ne peut être efficace

que chez les bactéries présentant plusieurs copies de leur chromosome (cas par exemple de D.

radiodurans) ou chez des bactéries haploïdes en phase active de réplication où tout ou partie

du(es) chromosome(s) est dupliqué postérieurement à la division cellulaire. Pour ces dernières,

se pose alors la question de leur capacité à réparer des CDB dans des conditions non réplicatives,

telles que la phase stationnaire ou la sporulation, ou encore dans des conditions à faible taux de

croissance où la réplication est ralentie et où les portions de chromosome non répliquées peuvent

être plus importantes et donc plus sensibles aux CDB. D’abord basée sur des études in silico

identifiant un homologue bactérien des protéines Ku70/80 humaines, Ku, dont le gène est

souvent à proximité d’un gène codant une ADN ligase ATP-dépendante (Aravind et al. 2001,

Doherty et al. 2001), puis validée expérimentalement (Weller et al. 2002), la découverte du

mécanisme de NHEJ chez les bactéries permettait d’envisager de répondre, au moins

partiellement, à cette question. En effet, ce mécanisme assure la ligature de deux extrémités

d’ADNdb sans avoir besoin d’une région homologue intacte et pourrait donc être un mécanisme

de choix dans des conditions ne permettant pas la réplication de l’ADN. Cette hypothèse a été

validée par l’observation de l’efficacité du NHEJ principalement au cours de la germination des

spores de B. subtilis (Wang et al. 2006) ou en phase stationnaire chez Mycobacterium smegmatis

et Sinorhizobium meliloti après irradiation par rayonnement ionisant (Pitcher et al. 2007b,

Stephanou et al. 2007, Kobayashi et al. 2008, Dupuy et al. 2017). Il faut toutefois noter que le

NHEJ n’est pas un mécanisme conservé chez les bactéries, à l’inverse de ce qui est observé chez

les eucaryotes. En effet, seulement environ 20% des bactéries séquencées présentent un

homologue de Ku et/ou de la ligase LigD et ce mécanisme est distribué de manière sporadique

43

dans le règne bactérien (McGovern et al. 2016, Sharda et al. 2020). Bien qu’aucun mode de vie

bactérien (comme la sporulation) n’ait pu être corrélé à la présence du NHEJ dans les bactéries,

des associations positives entre bactéries disposant de ce mécanisme et un pourcentage de bases

en GC élevé, une taille de génome élevée ou encore un taux de croissance faible ont été

identifiées (Weissman et al. 2019, Sharda et al. 2020).

Alors que le NHEJ chez les eucaryotes implique plus d’une dizaine de protéines différentes

(pour revues, (Frit et al. 2019, Zhao et al. 2020)), chez Mycobacterium tuberculosis (Weller et

al. 2002), le premier NHEJ bactérien décrit in vitro (Figure 8), ce mécanisme repose sur un

système minimal composé de seulement deux enzymes, Ku et LigD. Ce système minimal

s’explique en partie par le fait que LigD de M. tuberculosis est composée de trois domaines

responsables de la multifonctionnalité de cette enzyme, qui est à la fois une ADN ligase, une

polymérase et une 3’-5’ exonucléase (Della et al. 2004). Le domaine polymérase possède une

variété importante d’activités nucléotidyl transférases, telles que d’ADN et ARN polymérase

ADN-dépendante, d’extension de brins sans matrice et de remplissage de brèches simple brin

contenant ou non un site abasique (pour revues, (Shuman et al. 2007, Gu et al. 2008, Brissett et

al. 2009)). D’autre part, LigD présente une activité 5’-2-deoxyribose-5-phosphate (dRP) lyase

impliquée dans le mécanisme de réparation par excision de base (BER) et permettant de réparer

un site abasique dans un duplex d’ADN à proximité d’une extrémité (de Ory et al. 2016, de Ory

et al. 2019). Ainsi, LigD présente un nombre important des activités requises dans le NHEJ pour

permettre de réparer une CDB dont les extrémités ne sont pas directement ligaturables ou dont

la présence de lésions à proximité altère l’efficacité de ligature (bases oxydées, sites abasiques,

extrémités 3’P…). Ceci est notamment le cas pour les CDB induites par rayonnement ionisant,

supposées être entourées par d’autres lésions de l’ADN (concept du cluster de lésions, (Ward

1994)). Les activités de LigD sont portées par des enzymes distinctes, parfois redondantes, chez

les eucaryotes, expliquant en partie le nombre plus élevé de participants.

Les études in silico de l' équipe du Dr. Koonin et du Dr. Doherty ont montré que la protéine

Ku bactérienne présente un domaine N-terminal très semblable au domaine central des Ku70 et

Ku80 eucaryotes, formant l’hétérodimère Ku70/80 ((Aravind et al. 2001, Doherty et al. 2001),

Figure 9A). Ce domaine central chez les Ku eucaryotiques forme la structure caractéristique en

anneau de Ku70/80, à l’intérieur duquel peut passer une molécule d’ADNdb ((Walker et al.

2001), Figure 9B).

44

Figure 8. Exemples de mécanismes de réparation des CDB. A. Mécanismes de réparation des CDB

par recombinaison non homologue (NHEJ) ou homologue (SSA, SDSA, DSBR). Les boites jaunes,

uniquement montrées en haut de la figure, correspondent à des séquences répétées, essentielles au

mécanisme de réparation par appariement (SSA). La voie DSBR (DSB repair) est la voie de

recombinaison homologue communément utilisée chez les bactéries pour réparer une DSB. (adapté de

(Ertl et al. 2017)). B. Modèle du NHEJ chez les procaryotes. Une CDB est reconnue par Ku (ovale violet)

qui va alors recruter l’holoenzyme LigD (soit un polypeptide soit plusieurs, ovale bleu) dont les activités

polymérase, nucléase et ligase vont permettre la maturation des extrémités, l’appariement des 2 brins via

leur microhomologie et leur religature (adapté de (Pitcher et al. 2007a)).

Cette structure permet d’expliquer certaines propriétés de la Ku70/80 eucaryote, telle que sa

capacité à former un nucléofilament in vitro en s’enfilant sur l’ADN telles des perles sur un

collier (de Vries et al. 1989, Paillard et al. 1991, Downs et al. 2004), de recruter les protéines du

NHEJ et de glisser afin de mettre les extrémités d’ADN cassées à disposition de ces protéines

(Yoo et al. 1999) ou encore de dissocier des complexes nucléoprotéiques potentiellement

gênants pour la réparation par NHEJ (Roberts et al. 2007). Les domaines N- et C- terminaux des

Ku70 et Ku80 sont, quant à eux, impliqués dans les diverses interactions avec leurs partenaires

protéiques multiples, ou avec l’ADN, même si, pour ce dernier, le rôle d’une telle interaction

reste à caractériser. Ainsi, le rôle premier de Ku70/80 dans le NHEJ eucaryotique est, à l’instar

de la protéine SSB (voir précédemment), de servir de base à l’échafaudage d’un complexe

multiprotéique capable de réparer l’ADN, ici une CDB. Bien qu’un rôle de Ku70/80 dans l’étape

synaptique du NHEJ ait été proposé par le passé, où l’hétérodimère à lui seul permettrait le

maintien à proximité des extrémités d’ADN avant leur ligature (Ramsden et al. 1998), il

semblerait que cette étape soit en fait assurée par deux voies différentes, l’une dépendante de

Ku/70/80 et de XRCC4/LIG4 et l’autre de la polymérase µ (pour revue, (Zhao et al. 2020)).

45

Cette étape n’a pas été caractérisée dans le NHEJ bactérien.

Le modèle de NHEJ bactérien présenté dans la figure 8, basé sur la capacité de Ku à former

un complexe avec de l’ADNdb linéaire, permettant le recrutement de LigD et la stimulation de

ses différentes activités (Weller et al. 2002, Gong et al. 2005, Zhu et al. 2010, de Vega 2013,

Kushwaha et al. 2013b), propose un rôle de la Ku bactérienne identique à celui de de la Ku70/80

eucaryote, i.e. recruter les autres protéines impliquées, un rôle ainsi plutôt passif.

Travaux de recherche

1) Rôle de Ku dans le NHEJ bactérien (McGovern et al. 2016)

Le modèle présenté figure 8 n’implique cependant pas les diverses propriétés de fixation de

la Ku bactérienne à l’ADN. En effet, la Ku de M. tuberculosis multimérise sur l’ADNdb linéaire,

suggérant qu’elle est capable de s’enfiler sur cette molécule comme son homologue eucaryote

(Weller et al. 2002). Ensuite, les Ku de M. smegmatis et de B. subtilis sont capables de se fixer

sur un ADNdb ne présentant pas d’extrémités et chez M. smegmatis, cette propriété est liée à la

présence du domaine C-terminal de la Ku (Kushwaha et al. 2013b, de Ory et al. 2014). Le rôle

de ce domaine, riche en lysine, non présent chez les eucaryotes et non ubiquitaire chez les

bactéries, restait à définir dans le NHEJ bactérien. De manière remarquable, chez M. smegmatis,

ce domaine est défini comme une région de faible complexité (Kushwaha et al. 2013a). Ce type

de domaine est souvent classé parmi les domaines IDL, similaire à celle rencontrée dans la

région centrale des protéines SSB (voir précédemment). Afin de caractériser le rôle de ce

domaine C-terminal de Ku, nous avons initié, en collaboration avec le Dr. Pierre Nicolas (Unité

MAIAGE, INRAE), une analyse in silico de l’ensemble des séquences des Ku procaryotiques

disponibles en 2014 (2645 génomes séquencés). Nous avons montré i) qu'environ 24% des

procaryotes dispose d’une (20,2%) ou plusieurs Ku (3,5%, jusqu’à 6 Ku) ; ii) que toutes les Ku

bactériennes sont constituées d’un domaine N-terminal homologue au domaine central des Ku

eucaryotiques formant l’anneau autour de l’ADN (Ku core, Figure 9A et B) ; iii) que plus de

99,9% d’entre elles présentent un domaine C-terminal minimal d’une dizaine d’acide aminés

(nommé MC pour minimal C-terminus) ; iv) plus de 93% des Ku bactériennes contiennent un

domaine C-terminal étendu (EC pour extended C-terminus) d’au moins dix acides aminés, riche

en lysines et dont le pI moyen est de 11,4, à comparer au 5,5 du Ku core associé au MC.

Les protéines Ku et LigD de B. subtilis forment un système minimal de NHEJ dans lequel

les deux protéines suffisent à ligaturer deux molécules d’ADNdb linéaire et pour lequel aucune

autre protéine n’est connue pour intervenir (de Vega 2013).

46

Figure 9. La protéine Ku. A. Domaines constituant les protéines Ku chez les êtres vivants et les phages.

Le noyau de Ku (Ku core bleu), responsable de la structure en forme d'anneau, est conservé parmi ces

protéines. Les Ku procaryotes contiennent un domaine C-terminal minimal (MC, vert) impliqué dans la

liaison avec LigD. La plupart de ces Ku contiennent un domaine C-terminal étendu (EC, rouge) qui se

lie à l'ADNdb. Très rarement, ce domaine est remplacé par un domaine Helix-Extension-Helix (HEH),

phylogénétiquement lié au domaine SAP présent dans la Ku70 humaine. Les astérisques désignent un

domaine N-terminal rarement présent. Les domaines impliqués dans l'interaction avec les partenaires

des Ku humaines sont le domaine von Willebrand A (vWA) et le site de liaison à DNAPKcs (CS). NLS

: signal de localisation nucléaire. CTD : domaine C-terminal. Figure tirée d’un chapitre à paraître dans

l’Encyclopedia of Biological Chemistry. B. Structure de la Ku70/80 humaine en présence d’une

molécule d’ADNdb. Ku70 est en rouge, Ku80 en orange et l’ADNdb, traversant l’anneau formé par

l’hétérodimère, en gris. Deux vues pivotées de 90° par rapport à l’axe noir sont montrées (adapté de

(Walker et al. 2001)). C. Capacité de Ku de B. subtilis et des mutants C-terminaux à former des

nucléofilaments (comme ceux pointés par les flèches blanches) par enfilage sur l’ADNdb linéaire à

partir des extrémités (molécules d’ADN nues identifiables par les astérisques). A haute concentration

(150 mM), Ku forme des complexes de hauts poids moléculaire avec l’ADNdb alors que les mutants

forment toujours des nucléofilaments, bien que de taille plus importante qu’à 30 mM. Les barres

indiquent 100 nm (Adapté de (McGovern et al. 2016)).

C

A B

Ku KuΔEC Ku core

47

Ku de B. subtilis répond au schéma classique d’une Ku procaryotique avec un domaine MC

de 18 résidus et un domaine EC de 40 résidus dont le pI moyen est de 11,7. Afin de déterminer

le rôle de ces différents domaines C-terminaux, nous avons purifié la protéine sauvage Ku de B.

subtilis ainsi que deux mutants, l’un dépourvu du EC (protéine KuΔEC) et l’autre dépourvu de

l’intégralité du C-terminus (protéine Ku core). Nous avons montré que ces trois protéines

forment des homodimères. L’enveloppe moléculaire obtenue par SAXS et la modélisation

moléculaire (collaboration avec le Dr. Pierre Roblin au synchrotron Soleil) montrent que le

mutant Ku core présente une structure en anneau semblable à celle du domaine Ku core de la

Ku70/80 humaine (Figure 9B). La protéine sauvage adopte une forme plus étendue, liée à la

présence du domaine en anneau mais également à la présence des domaines C-terminaux non

structurés. Ce résultat et la faible complexité en acides aminés suggèrent que ce domaine est

bien une région IDL, comme initialement proposé pour le domaine homologue de la Ku de M.

smegmatis (Kushwaha et al. 2013a). Nous avons ensuite montré que Ku stimule l’activité de

ligature de LigD in vitro. Cette stimulation est sensiblement altérée avec le mutant KuΔEC et

inexistante avec le mutant Ku core. Nous avons montré pour la première fois une interaction

physique directe, et indépendante de l’ADN, entre Ku et LigD. Alors que l’affinité de LigD pour

Ku et KuΔEC est similaire (collaboration avec l’équipe du Dr. Jean Baptiste Charbonnier, CEA

Saclay), le mutant Ku core est incapable d’interagir avec LigD. Le domaine MC est donc

nécessaire à l'interaction entre Ku et LigD, et son absence dans la protéine Ku core explique son

incapacité à stimuler la ligase. L’analyse des propriétés de fixation de Ku et des mutants à

différents types de molécules d’ADN nous a permis de conclure que i) le domaine Ku core et le

domaine EC sont chacun capables de se fixer à l’ADNdb qu’il soit circulaire ou linéaire ; ii) le

domaine Ku core est suffisant pour que la protéine Ku forme des nucléofilaments à partir des

extrémités de molécules d’ADNdb linéaire et cela en direction du centre de ces molécules

(collaboration avec l’équipe du Dr. E. Le Cam, IGR, Villejuif, Figure 9C) ; iii) cette propriété

est à l’origine de la protection des extrémités de l’ADN par Ku vis-à-vis d’exonucléases, mais

également vis-à-vis d’une endonucléase agissant à proximité d’une extrémité d’ADN ; iv) le

domaine EC provoque une diminution de la taille de ces nucléofilaments ; v) l’EC est requis

pour la formation de complexes nucléoprotéiques de haut poids moléculaires, générés par

l’assemblage de multiples molécules d’ADN et de protéines, maintenues ensemble via des

interactions protéine-protéine et/ou protéine-ADN, observables en MET (Figure 9C) et

permettant à Ku d’assurer un pontage efficace entre molécules d’ADNdb linéaire, en absence

de LigD.

48

L’ensemble des données obtenues au cours de cette étude nous a permis de proposer plusieurs

rôles à la protéine Ku procaryotique dans le NHEJ, dépendants des domaines qui la constitue.

i) La capacité de Ku à interagir avec de l’ADN sans extrémités (via le Ku core et/ou le domaine

EC) permet de positionner Ku sur son substrat en attente d’une cassure. Une fois cette lésion

produite, Ku s’enfile sur ces extrémités et recrute LigD sur son site d’action, stimulant alors les

activités de cette dernière. Dans le cas de B. subtilis, la présence de Ku est même requise pour

observer de la ligature par LigD in vitro. Nous avons montré que cette étape est assurée par une

interaction directe entre les deux protéines et est dépendante du domaine MC de Ku. La

concentration de Ku aux extrémités de l’ADN, liée à la présence de son domaine EC qui tend à

limiter le mécanisme d’enfilage, permettrait de contrebalancer la faible interaction existant entre

les deux protéines.

ii) La capacité de Ku dépendante de son domaine EC, à former des complexes nucléoprotéiques

permettant le pontage de deux molécules d’ADNdb linéaire pourrait jouer un rôle important

dans l’étape synaptique du NHEJ dans la bactérie. Cette étape permettrait d’assurer le maintien

des extrémités cassées à proximité dans la cellule, afin d’éviter leur dispersion et d’éventuels

remaniement chromosomiques. Les données collectées en MET au cours de notre étude nous

ont permis de proposer que Ku réaliserait cette étape synaptique par le biais d’interactions

protéine-protéine et/ou protéine-ADN, entre des nucléofilaments positionnés latéralement

(Figure 10). Ce type de structures est qualifiée de synapses flexibles (Zhao et al. 2020). Notre

étude n'a pas permis de caractériser l’étape assurant la formation d’une synapse fermée requise

pour la ligature par LigD, dans laquelle les deux extrémités se font face. Une étude récente

montre que cette étape est aussi dépendante de Ku mais que le domaine C-terminal n'est pas

requis (Oz et al. 2021). Enfin, le positionnement de LigD sur ces nucléofilaments formés par Ku

reste encore à caractériser à ce jour.

Figure 10. Les différents complexes nucléoprotéiques impliquant Ku. Les différents modes de

fixation de Ku de B. subtilis à l’ADN (1, 2, 3) et les différents types de pontages supposés, basés sur les

analyses des données de MET (4 et 5) sont présentés. Les modèles 3, 4 puis 5 sont obtenus en augmentant

la concentration en Ku. L’homodimère Ku est schématisé avec son domaine noyau en forme de beignet

(blanc et rouge) et avec les domaines C-terminaux de chaque monomère le constituant (traits oranges).

49

iii) La capacité de Ku à se fixer aux extrémités de l’ADN permet de les protèger de l’action de

nucléases, autres que l’holoenzyme LigD. Ainsi, dans des conditions physiologiques où le NHEJ

et la RH se trouvent être fonctionnels dans une même cellule (voir ci-dessous), cette activité de

Ku pourrait jouer un rôle dans le choix du mécanisme de réparation de DSB à employer, en

inhibant par exemple la nucléase AddAB de B. subtilis (résultats non publiés) ou AdnAB chez

les mycobactéries (Sinha et al. 2009), requises pour la maturation des extrémités de l’ADN en

vue du chargement de RecA. Ce rôle de Ku rappelle celui de son homologue eucaryote dans la

compétition entre ces deux mécanismes de réparation en phase S et G2 (pour revue, (Zhao et al.

2020)).

iv) La capacité de Ku à s’enfiler sur l’ADN pourrait aussi permettre de laisser l’accès aux

extrémités à son partenaire LigD et de réparer des sites abasiques à proximité des cassures. En

effet, la Ku bactérienne, comme la Ku70/80 humaine (Roberts et al. 2010) et LigD, présente une

activité dRP-lyase, capable de couper un site abasique à proximité d’une cassure. Cependant la

spécificité de substrat pour Ku et LigD est différente, ce qui suggère que ces deux protéines ont

évolué pour permettre la réparation de sites abasiques sur différentes configurations

d’extrémités d’ADN (de Ory et al. 2019).

v) Si l’enfilage de Ku sur l’ADN peut avoir des effets positifs, le domaine EC, présent dans la

très grande majorité des Ku bactériennes, limite cette capacité. Ce domaine pourrait éviter une

propagation de Ku sur la molécule d’ADN pouvant affecter l’activité d’autres machineries en

charge du métabolisme de l’ADN.

Ainsi, le rôle de Ku dans le NHEJ bactérien pourrait être bien plus proactif qu’initialement

proposé. La mise au point des premiers tests de NHEJ in vitro réalisés dans cette étude avec la

protéine Ku a été réalisée par Mlle Héloise Simonson dont j’ai encadré le stage de M2. Une partie

de ce travail a été réalisée par Mr Stephen McGovern, assistant ingénieur de l’équipe dont j’avais

la responsabilité. Tous deux signent la publication correspondante (McGovern et al. 2016).

2) Caractérisation du mécanisme de NHEJ chez Streptomyces ambofaciens :

multiplicité des acteurs impliqués dans ce mécanisme (Hoff et al. 2016)

La structure à trois domaines de LigD de M. tuberculosis est retrouvée chez d’autres espèces,

mais n’est pas conservée dans le monde bactérien. LigD peut être constituée uniquement d’un

domaine ligase, ou de celui-ci fusionné à un domaine polymérase ou nucléase (pour revue

(Bertrand et al. 2019), Figure 11). Par exemple, la LigD de B. subtilis ne contient pas de

50

domaine nucléase (de Vega 2013). De plus, comme nous l’avons vu précédemment, plus de 3%

des espèces "Ku positives" contiennent dans leurs génomes de 2 à 6 gènes codant pour un

homologue de Ku (McGovern et al. 2016). A ce degré de complexification supplémentaire par

rapport au système à 2 protéines proposé initialement chez M. tuberculosis (Weller et al. 2002),

s’ajoute le fait qu’un nombre important d’espèces "NHEJ positives" codent pour plusieurs

protéines présentant des similarités de séquences avec différents domaines de la LigD de M.

tuberculosis (Figure 11, et voir ci-dessous). Ainsi, le chromosome de M. smegmatis code pour

quatre ligases ATP-dépendantes, LigB, LigC1, LigC2 et la tri-fonctionnelle LigD (Gong et al.

2005). La ligase LigC1 (contenant uniquement un domaine ligase), est impliquée dans le BER

(Plocinski et al. 2017), mais est aussi utilisée dans le NHEJ lorsque le domaine Ligase de LigD

est inactivé (Gong et al. 2005, Akey et al. 2006, Aniukwu et al. 2008, Bhattarai et al. 2014).

L'ensemble de ces observations montre qu'en plus d'un mécanisme de NHEJ minimal,

certaines bactéries pourraient disposer d'un NHEJ impliquant d'autres protéines aux activités

redondantes ou complémentaires (Core + accessory NHEJ actors dans la figure 11), ou encore

de plusieurs voies différentes de NHEJ (Multiple NHEJ dans la figure 11).

Figure 11. Les protéines du NHEJ dans différentes bactéries possédant un système allant du

NHEJ minimal à des systèmes plus complexes. Les domaines Ligase (LigDom), Polymérase (PolDom)

et/ou Nucléase (NucDom) constituant LigD sont présents dans un seul polypeptide ou sous forme de

domaines autonomes. Les protéines ayant le même nom dans différents organismes ne sont pas

nécessairement codées par des gènes orthologues. ✧ indique les acteurs qui ont été impliqués

expérimentalement dans la réparation des DSB. ♦ dans M. tuberculosis désigne des protéines accessoires

impliqués dans le NHEJ, sur la base d'études de leurs homologues chez M. smegmatis. Chez S.

ambofaciens, les acteurs accessoires impliqués dans la réponse aux dommages à l'ADN sont mis en

évidence par une astérisque (Hoff et al., 2016; 2018). Tiré de (Bertrand et al. 2019).

51

Afin de trancher entre ces différentes hypothèses, la caractérisation in vitro et in vivo de

l'ensemble des acteurs potentiellement impliqués est nécessaire. Dans ce sens, j’ai entamé un

travail collaboratif avec le Pr. Pierre Leblond (Université de Lorraine) afin d'initier la

caractérisation du NHEJ chez Streptomyces ambofaciens. Cette bactérie au génome linéaire

contient un grand nombre d’ensembles (clusters) de gènes dont l’expression aboutit à la

formation de métabolites secondaires à fort intérêt industriel (antibiotiques, anticancéreux…).

Le NHEJ pourrait intervenir dans les multiples recombinaisons que subissent ces clusters,

celles-ci étant à l’origine de la diversité des produits codés. Par une approche in silico, P.

Leblond et son équipe ont identifié plusieurs gènes présentant des similarités de séquence avec

les gènes codant Ku et les différents domaines de LigD des mycobactéries, donc potentiellement

impliqués dans le NHEJ (Figure 11). La mutation de ces gènes a montré que 3 homologues de

Ku, 2 homologues du domaine ligase et 2 homologues du domaine polymérase de LigD sont

impliqués dans la réparation de l'ADN et la radiorésistance de spores de S. ambofaciens. J’ai

montré que les produits de trois de ces gènes (KuA, KuB et KuC) sont capables de protéger les

extrémités d'un ADNdb linéaire de l'action d'une exonucléase. De plus, ces trois protéines

stimulent l'activité de la LigD de B. subtilis. Ainsi les spores de S. ambofaciens contiennent 3

protéines Ku intervenant dans le NHEJ. L'inactivation des 3 gènes ku a un effet cumulatif sur la

radiorésistance des spores par rapport aux inactivations individuelles, suggérant que les trois Ku

interviennent dans le NHEJ et que leur activité n'est pas (au moins en partie) redondante. Il en

est de même pour les deux ligases LigC et LigD et les deux polymérases PolK et PolR (Hoff et

al. 2016).

Ces résultats soulèvent de multiples questions sur i) la spécificité de substrat de ces

différentes enzymes, ii) les interactions physiques et fonctionnelles existantes entre elles et enfin

iii) l'expression des gènes correspondants dans différentes conditions de croissance. Ces

questions ont fait l'objet de demandes de financement à l'ANR, décrites ci-dessous.

Autres avancées et perspectives dans le domaine (pour revue, (Bertrand et

al. 2019))

Avec le Dr. Claude Bruand (INRAE, Toulouse) et l'équipe de P. Leblond, nous avons

récemment publié une revue (Bertrand et al. 2019) et un chapitre d'ouvrage, en cours de parution

dans l’Encyclopedia of Biological Chemistry, décrivant les données récentes obtenues sur le

mécanisme de NHEJ bactérien et les perspectives futures concernant le NHEJ chez les

procaryotes et les phages. Sans citer l'ensemble des points décrits dans ces manuscrits, je

52

reviendrai ici sur ce qu'il me semble être les points cruciaux restant à élucider.

La découverte des multiples fonctions du domaine EC de Ku soulève la question de son

impact dans l’environnement cellulaire et la nécessité de mesurer les effets de la suppression de

ce domaine in vivo sur les capacités de réparation des CDB. De même, l’existence de

nucléofilaments formés par Ku s’enfilant sur l’ADN cassé reste à démontrer in vivo. Cette

question se pose puisque les données de microscopie à super résolution sur le système NHEJ

humain tend à montrer que l’hétérodimère Ku70/80 est présent aux extrémités de l’ADN, mais

ne forme pas de filament étendu (la résolution ne permettant toutefois pas de connaitre la

stoechiométrie de cette protéine aux extrémités, (Reid et al. 2015)). La présence de DNA-PKcs,

formant un complexe avec Ku70/80 chez l’homme et ne présentant pas d’homologue bactérien,

pourrait être à l’origine du maintien de Ku70/80 aux extrémités et empêcher sa propagation à

l’intérieur de la molécule dans certaines conditions (Calsou et al. 1999). L'utilisation de la

microscopie à super résolution et/ou de ChiP-seq permettrait de confirmer ou non la présence

de nucléofilaments contenant Ku chez les bactéries et d'estimer leur taille.

Une autre question importante concernant Ku concerne le nettoyage de la région réparée,

i.e. comment Ku est éliminée de la molécule d'ADN. En effet, l'enfilage de Ku sur une molécule

d'ADN in vitro va piéger la protéine sur l'ADN après réparation (Paillard et al. 1991, Oz et al.

2021). Chez les eucaryotes, l'élimination de Ku70/80 de l'ADN passe par sa polyubiquitination

et sa prise en charge par le protéasome (pour revue, (Kragelund et al. 2016)). La question reste

ouverte chez les bactéries. Une étude portant sur la formation et la stabilité de foyers de

fluorescence de la protéine fusion Ku-GFP sur des DSB dans des mutants de protéases, ainsi

qu'une approche in vitro, permettant d'identifier potentiellement la(es) protéase(s) active sur Ku,

permettraient peut-être de répondre à cette question. Une alternative à la présence de protéases

pourrait être un changement structurel important de Ku, après réparation, lié à une modification

de la protéine. Dans ce sens, la déacétylase Sir2 chez M. smegmatis interagit avec Ku (Li et al.

2011) et est impliquée dans son acétylation. Un effet direct de l'acétylation de Ku sur ses

propriétés biochimiques n'est pas connu, mais l'efficacité du NHEJ à circulariser un plasmide

linéaire est anti-corrélée au degré d'acétylation de Ku (Zhou et al. 2015) et est corrélée à la

présence de Sir2 (Li et al. 2011). L'identification de l'acétyltransférase responsable de la

modification de Ku permettrait de caractériser finement in vitro les effets de l'acétylation sur les

caractéristiques biochimiques de Ku (affinité pour l'ADN, pour LigD, capacité à s'enfiler,

stabilité sur l'ADN…).

Nous avons montré que le domaine EC de Ku de B. subtilis n'est pas structuré et que la

diversité des acides-aminés la composant est faible (McGovern et al. 2016), rappelant celle de

53

la Ku de M. smegmatis (Kushwaha et al. 2013a). Ces caractéristiques sont similaires à celles du

domaine IDL de la SSB bactérienne impliqué dans la formation de condensats par séparation de

phase liquide-liquide dans certaines conditions (Harami et al. 2020). Il serait intéressant de voir

si Ku partage cette même propriété et d'en caractériser le rôle dans le NHEJ. Cette propriété

pourrait-elle être à l'origine des complexes Ku/ADN de hauts poids moléculaires observés en

MET (Figure 9C) et potentiellement à l'origine de la capacité de Ku à ponter des molécules

d'ADNdb linéaire? Cette propriété pourrait aussi faciliter l'interaction entre Ku et LigD, une

interaction qui est faible (de l'ordre de 10 µM) in vitro dans les conditions de nos expériences.

Sans tomber dans la recherche systématique de la capacité d'une protéine à promouvoir ce type

de condensat (Leslie 2021), il n'en reste pas moins que le parallèle avec la région IDL de SSB

peut être fait et mérite qu'on s'y intéresse.

L’optimisation des conditions de purification de Ku et de LigD de B. subtilis a permis

d’obtenir des quantités importantes de ces protéines. Ce travail important de S. McGovern a

nécessité la modification des gènes pour une expression optimale chez E. coli et l’établissement

d’un protocole de purification particulier pour éviter de perdre Ku sur les cassures de l’ADN

générées au cours de la lyse cellulaire. Les quantités obtenues permettent d’envisager la

cristallisation de ces deux enzymes, isolées ou en complexe, avec ou sans ADN, afin de

caractériser pour la première fois un complexe nucléoprotéique complet permettant le NHEJ.

La multiplicité des partenaires impliqués chez d'autres bactéries, et a fortiori chez les

eucaryotes, rendent difficilement atteignable cet objectif.

Comme nous l’avons vu précédemment, nous avons caractérisé trois Ku chez S. ambofaciens.

L'étude des interactions physiques entre ces Ku et les polymérases et ligases putatives, révélées

par cette étude, par double hybride en approche matricielle ou par TAP, permettrait de clarifier

les différents complexes NHEJ présents chez cette bactérie et d'identifier potentiellement la ou

les nucléases impliquées dans ce mécanisme (non identifiées par l'approche in silico réalisée par

P. Leblond). Cette étape importante permettrait par la suite de reconstituer des complexes

fonctionnels afin d'en étudier les caractéristiques (efficacité, fidélité, redondance, spécificité…).

Par ailleurs, l'étude de la régulation de ces différents gènes permettrait i) d'identifier les

protéines agissant ensemble et/ou ii) d'identifier les conditions de vie permettant à S.

ambofaciens de disposer d'un mécanisme NHEJ. Nous avons vu que ce mécanisme est au moins

fonctionnel dans les spores de S. ambofaciens, comme c'est le cas chez B. subtilis où l'opéron

unique ku-ligD est sous le contrôle du facteur sigma alternatif SigG et du facteur de transcription

SpoVT produits au cours de la sporulation (Wang et al. 2006). Cependant, au cours de l'étude

visant à la ré-annotation du génome de B. subtilis, liée à la caractérisation de son transcriptome

54

dans une centaine de conditions de croissance différentes (Nicolas et al. 2012), nous avons

observé une induction modérée de cet opéron dans la condition de croissance après un passage

à basse température. Dans cette condition sigG et spoVT ne sont pas sur-exprimés, suggérerant

que l'opéron ku-ligD est différemment régulé en fonction des conditions de croissance. La

fonctionnalité du NHEJ dans cette condition n'a toutefois pas été testée. Il se pourrait dès lors

que les multiples protéines du NHEJ de S. ambofaciens soient produites dans d'autres conditions

que la sporulation, permettant à cette bactérie d'assurer une partie des multiples évènements de

recombinaison dont son chromosome fait l'objet (Hoff et al. 2018).

La présence de multiples systèmes NHEJ actifs au sein d'une même bactérie et dans des

conditions différentes n'a été révélée que récemment. Sinorhizobium meliloti code pour quatre

orthologues de Ku et quatre de LigD (numérotés de 1 à 4 respectivement). L'équipe de C. Bruand

a montré que les gènes ku2 et ligD2 forment un système NHEJ capable de ligaturer un plasmide

préalablement linéarisé dans des cellules en phase exponentielle de croissance. Ces mêmes

gènes sont efficaces dans des conditions de stress (croissance à haute température ou phase

stationnaire), mais dans ces conditions ils sont secondés par un deuxième set de gènes NHEJ:

ligD3, ku3 et ku4. Ces derniers sont spécifiquement induits en stress et sont sous le contrôle du

facteur sigma EcfG (Dupuy et al. 2019). Cette étude renforce les premières observations du rôle

des multiples Ku chez cette bactérie (Kobayashi et al. 2008) et montre pour la première fois que

différents homologues de Ku et LigD sont impliqués dans le NHEJ dans des phases de

croissances ou des conditions de vie spécifiques. Ceci pose la question de l'existence de

systèmes NHEJ multiples dans d'autres bactéries, comme S. ambofaciens.

Cette étude remet aussi en lumière le fait déjà observé chez les mycobactéries (Gong et al.

2004, Gong et al. 2005, Aniukwu et al. 2008) qu'il existe chez des bactéries, des conditions dans

lesquelles le NHEJ est opérationnel en même temps que la RH (phase exponentielle) et soulève

la question de la compétition entre ces deux systèmes de réparation des CDB. Il est à noter que

la mise en évidence d'un NHEJ fonctionnel en phase exponentielle chez les mycobactéries et S.

meliloti a nécessité l'utilisation d'approches comme la ligature de plasmides linéarisés ou la

coupure de site unique sur le chromosome (système I-SceI), une cassure non réparable par RH

en raison de l'absence de régions homologues. En effet, la survie NHEJ-dépendante de cellules

irradiées n'a pu être observée que sur des cellules en phase stationnaire, la mutation des gènes

du NHEJ n'ayant pas, ou très peu, d'impact après irradiation sur la survie des cellules en phase

exponentielle de croissance. Il est intéressant de noter que l'inactivation de gènes de NHEJ chez

Streptomyces avermitilis et M. smegmatis stimule la RH, montrant ainsi que les deux systèmes

sont en compétition (Gupta et al. 2011, Zhang et al. 2012). A l'inverse, l'inactivation de recA

55

n'augmente pas l'efficacité de réparation de cassures I-SceI induite chez M. smegmatis (Gupta

et al. 2011). Ceci suggère que le mécanisme de NHEJ est particulièrement inefficace sur des

DSB en phase réplicative bien que ces protéines soient présentes dans cette phase dans les

bactéries non sporulantes étudiées (Bhattarai et al. 2014, Zhou et al. 2015). Se pose alors la

question de la régulation de ce mécanisme dans cette condition.

Ces différents questionnements sur le NHEJ multiple, associés aux aspects plus moléculaires

révélés par notre étude sur la Ku de B. subtilis, ont été à la base de différents projets de recherche

collaboratifs ayant fait l'objet de demandes de financement à l'ANR. Dans un premier temps,

ces projets visaient à caractériser spécifiquement le mécanisme chez B. subtilis et étaient basés

sur une collaboration entre les équipes de J.B. charbonnier (structure), E. Le Cam (MET), P.

Roblin (SAXS) et moi-même (biochimie et génétique). Ces projets et demandes de financement

ont évolués vers la compréhension de ce mécanisme dans des bactéries à NHEJ multiples (C.

Bruand et P. Leblond), tout en gardant un aspect moléculaire sur un système minimal (E. Le

Cam et moi-même). Les 5 demandes réalisées depuis 2014 n'ont pas été retenues. Je poursuis

néanmoins ces études sur le NHEJ via l'étude d'un homologue de Ku chez les phages (voir ci-

dessous).

56

IV- Travaux réalisés dans l’équipe du Dr. M.A. Petit : de mars 2015 à aujourd'hui

Mécanistique de la recombinaison chez les phages tempérés et rôles pour le

phage et son hôte

La connaissance que j’ai acquise sur le NHEJ chez les bactéries est une aide précieuse pour

mes recherches sur les phages, les virus des bactéries, depuis 2015 dans l’équipe du Dr. Marie-

Agnès Petit, que j’ai rejointe suite au départ de P. Noirot de l'INRA. La lutte contre les bactéries

pathogènes pose un problème de santé majeur du fait de i) l’adaptation d’un grand nombre de

ces pathogènes aux antibiotiques actuels et ii) l’absence de recherche de nouvelles molécules

pendant de nombreuses années dans les industries pharmaceutiques. Dans ce contexte, les

phages pourraient offrir une alternative intéressante dans le traitement de maladies infectieuses,

par le biais de la phagothérapie. Cependant, les phages sont capables d’évoluer avec une

efficacité remarquable, ce qui pourrait poser des problèmes de contrôle de ces entités au cours

de leur utilisation chez l’hôte (pour exemple, (De Sordi et al. 2017)). Un premier aspect de ma

recherche porte sur l’étude des machineries moléculaires impliquées dans les mécanismes de

recombinaison, à la base de l’évolution des génomes phagiques, qui est donc cruciale pour

comprendre les dynamiques phages/hôtes. Un deuxième aspect de ma recherche vise à

comprendre en quoi ces mécanismes de recombinaison interviennent dans le cycle de vie des

phages et s'ils peuvent interférer dans la physiologie de leur hôte bactérien, dans des

environnements "naturels", où les conditions sont potentiellement moins propices à la

réplication des génomes et où les bactéries sont par conséquent potentiellement plus vulnérables

aux CDB. Dans cette équipe, je cherche donc à caractériser des mécanismes phagiques de

recombinaison illégitime ou des mécanismes apparentés ne nécessitant qu’une brève région

d’ADN homologue pour recombiner, comme le SSA. Je m’intéresse à ces mécanismes dans les

phages tempérés, qui par nature sont les plus aptes à influencer la physiologie de leur hôte sans

nécessairement les éliminer.

Introduction

1) Le mosaïcisme, les morons et la recombinaison chez les phages

Les phages, dont le génome est très majoritairement à ADNdb (plus de 95%, pour ceux

disponibles dans les banques de données (Dion et al. 2020)), se catégorisent en deux grands

groupes définis par la nature des cycles infectieux qu'ils réalisent. Les phages dits virulents

n'effectuent qu'un seul type de cycle, i.e. un cycle lytique. Ce cycle se décompose en trois

57

grandes étapes correspondant à i) l'infection de l'hôte bactérien par le phage et à l'injection du

génome de ce dernier, ii) la réplication du matériel génétique du phage et la synthèse des

protéines nécessaires à la formation des nouvelles capsides et iii) l'empaquetage du génome dans

ces capsides et la libération des nouveaux virions après lyse cellulaire (Figure 12). Le deuxième

groupe correspond aux phages dits tempérés. Ces phages, en plus de pouvoir réaliser un cycle

lytique comme il est observé avec les phages virulents, sont également capables de réaliser un

cycle lysogénique au cours duquel le génome du phage, après injection, n'est pas directement

répliqué, mais au contraire maintenu dans la cellule sous forme épisomale ou intégrée dans le

chromosome bactérien, on parle alors de prophage. Le prophage est alors maintenu dans la

bactérie lysogène de façon stable au cours des divisions, en se répliquant en même temps que le

chromosome bactérien, jusqu'à ce qu'un stimulus extérieur aboutisse à son réveil et à la mise en

place d'un cycle lytique, comme décrit précédemment ((Lwoff 1953), Figure 12). La lysogénie

est un phénomène fréquemment rencontré dans le monde bactérien puisqu'environ la moitié des

espèces séquencées à ce jour présentent au moins un prophage dans leur chromosome et qu'un

génome bactérien peut contenir jusqu'à 20% de séquences phagiques (Casjens 2003, Touchon

et al. 2016). D'autres types de cycles existent chez les phages comme les cycles chroniques et

pseudolysogèniques. Ceux-ci ne seront pas décrits ici mais schématisés dans la figure 12

(Weinbauer 2004). De même, les phages dits défectifs ou cryptiques sont d'anciens phages

tempérés intégrés dans le chromosome bactérien et ayant perdu la capacité à s'induire et à

réaliser un cycle lytique. Ils peuvent toutefois intervenir, selon leur degré de dégradation, dans

la physiologie de leur hôte (pour exemples, (Kunkel et al. 1990, Ansaldi et al. 2004, Wang et al.

2010, Lang et al. 2012, Ragunathan et al. 2019)) et interviennent dans le cycle de phages actifs

en échangeant avec eux des gènes via des mécanismes de recombinaison (De Paepe et al. 2014).

A l'état prophage, les phages tempérés sont considérés comme dormants et seuls quelques

gènes les composant sont exprimés. Il s'agit majoritairement des gènes du module de lysogénie

impliqués dans la répression du cycle lytique (exemple du gène cI du phage lambda). Cependant,

d'autres gènes peuvent s'exprimer dans cet état. Ces gènes, acquis par transfert horizontaux,

échappent en effet au contrôle transcriptionnel du prophage puisqu'ils portent leurs propres

promoteurs et terminateurs transcriptionnels. Ces gènes autonomes font partis des morons

(Juhala et al. 2000), i.e. des gènes "accessoires" n'ayant pas de fonction dans le cycle de vie du

phage à proprement parler, mais qui peuvent conférer à l'hôte bactérien un avantage sélectif

(protection contre d'autres phages, capacité à coloniser différentes niches et à survivre dans ces

environnements, capacité souvent associée à la virulence (Taylor et al. 2019)).

58

Figure 12. Les différents types de cycles de vie des phages. Tiré de (Weinbauer 2004).

Par conséquent, les morons sont indirectement impliqués dans le maintien des phages qui les

codent (Hendrix et al. 2000). Toutefois, les gènes phagiques codant pour les protéines Acr (anti-

CRISPR) sont souvent classés parmi les morons, bien qu'ils affectent directement le cycle

phagique (Borges et al. 2017). Enfin, il est à noter que certains morons interviennent en première

ligne dans la virulence de bactéries pathogènes, les exemples les plus connus étant probablement

les morons codant la shiga-toxine, la toxine cholérique ou encore la toxine diphtérique (Cumby

et al. 2012). L'identification des morons dans les phages tempérés est souvent aisée puisque ces

gènes sont rarement conservés entre phages apparentés et leur intégration dans le phage perturbe

souvent la synténie des gènes (Figure 13). En effet, le génome des phages, et plus

particulièrement celui des tempérés, peut être considéré comme une combinaison spécifique de

modules de gènes impliqués dans une même fonction. On distingue les modules d'intégration,

de régulation de la lysogénie, de réplication /recombinaison, de structure et d'assemblage et de

lyse. Les études de génomique comparative des génomes phagiques, et plus anciennement la

recherche d'hybrides entre phages apparentés, montrent que ces modules géniques sont

échangeables entre phages : on emploie ainsi le terme de mosaïque pour définir la structure des

génomes de phages (pour revue, (Hatfull 2008), Figure 13).

59

Figure 13. Alignements du génome de différents phages tempérés apparentés à P2. Cette figure

illustre la composition modulaire des phages (fonction des gènes homologues indiquée en haut). Elle

illustre également la notion de mosaïcisme puisqu'on peut voir que dans ces modules tous les gènes ne

sont pas nécessairement conservés. Ceci suggère des transferts plus ou moins complets de gènes dans

ces modules entre phages au cours de leur évolution. L'acquisition de morons peut perturber la synténie

des gènes (ici en position 2), ou se produire en extrémité de module fonctionnel (position 1). Enfin cette

figure pose la question de la nature des événements de recombinaison ayant lieu aux bornes de ces

différents modules puisque les morons intégrés et leurs extrémités ne sont pas homologues. Cette figure

suggère que des évènements de recombinaison illégitime, en plus de la recombinaison homologue,

pourraient être à l'origine de l'acquisition des morons et de l'interchangeabilité des modules phagiques

(tirée de (Wiles et al. 2013)).

Ce mosaïcisme est plus important chez les tempérés que chez les virulents, les échanges de

gènes au cours de leur évolution y étant plus importants (Mavrich et al. 2017). L'insertion d'un

gène de fonction différente dans ces modules, ou à leur extrémité, permet facilement d'émettre

l'hypothèse que ce gène est un moron.

Le mosaïcisme observé dans les génomes phagiques et l'acquisition de morons ont pour

origine des évènements de recombinaison entre phages ou entre phages et génome bactérien. Le

type de recombinaison utilisé a longtemps été un sujet d'étude important et âprement discuté.

En effet, la longueur limitée des séquences aux bornes de ces modules, souvent correspondantes

aux bornes de gènes, et leur similarité souvent restreinte entre phages phylogénétiquement

éloignés suggèrent que les évènements de recombinaison entre ces modules soient de nature

illégitimes ou tout au plus homéologues (séquences recombinées non parfaitement homologues)

(Juhala et al. 2000).

60

2) La recombinaison hom(é)ologue chez les phages et la famille des Sak4

Comment les phages recombinent-ils ? Bien qu'ils puissent tirer parti de la recombinase RecA

de leur hôte bactérien, les phages codent souvent pour leur propre machinerie de recombinaison

(pour revue, (Menouni et al. 2015)). Les recombinases phagiques ont été classées en trois super-

familles : les Rad52-like, les Rad51-like et les Gp2.5-like (Lopes et al. 2010). De manière

intéressante, les phages codant pour une recombinase ont plus de chance d'avoir acquis

récemment au cours de leur évolution des gènes d'un phage non apparenté, montrant le rôle de

ces recombinases dans l'évolution et le mosaïcisme de leurs génomes (de Sousa et al. 2021).

Les gènes codant des recombinases ne sont pas retrouvés de façon aléatoire dans les phages.

En effet, les phages dont le génome est inférieur à 20kb en sont dépourvus (incluant tous les

phages à génome à ARN simple et double brin ainsi que ceux à ADNsb). Pour les autres, des

phages à ADNdb exclusivement, environ 60% d'entre eux, en contiennent (Lopes et al. 2010).

De plus, la nature de la recombinase (très peu de phages codent pour plusieurs d'entre elles)

codée par un phage reflète le type de cycle infectieux. Les recombinases Rad52-like sont ainsi

essentiellement rencontrées dans les génomes de tempérés alors que les orthologues de Rad51

sont majoritairement rencontrés dans les virulents. Les recombinases Gp2.5-like sont quant à

elles retrouvées dans les deux types de phages (Lopes et al. 2010). Gp2.5 du phage virulent T7,

Redβ du phage tempéré λ et UvsX du phage virulent T4, tous infectant E. coli, sont

respectivement les recombinases des familles Gp2.5-like, Rad52-like et Rad51-like les plus

étudiées.

Gp2.5 de T7 est une protéine de fixation à l'ADNsb essentielle à la réplication de T7 et

impliquée également dans sa recombinaison (pour revue, (Hernandez et al. 2019)). Cette

protéine est un homodimère, chaque monomère étant constitué i) d'un domaine de fixation à

l'ADNsb (OB-fold) similaire à celui de la SSB bactérienne, à l'exception de la présence d'une

longue hélice α et ii) d'une queue C-terminale acide de 28 résidus rappelant la TIP des SSB

bactérienne ((Hollis et al. 2001) et voir précédemment). Cette dernière est essentielle à la

formation de particules infectieuses et est requise pour interagir avec l'ADN polymérase et

l'hélicase-primase de T7 (Kim et al. 1994). Contrairement à la SSBEc, Gp2.5 présente une

activité d'appariement simple-brin (SSA, voir Figure 8), potentiellement dépendante de l'hélice

α spécifique à Gp2.5 (Rezende et al. 2003, Lopes et al. 2010), mais sa capacité à tolérer une

divergence entre les séquences à apparier reste inconnue. Cette protéine, dans un extrait

cellulaire de E. coli et en présence de l'exonucléase gp6 de T7, est à l'origine de la réparation in

vitro de CDB (Yu et al. 2001).

61

Redβ du phage lambda a été particulièrement bien étudiée depuis sa découverte en 1966

((Radding 1966, Radding et al. 1966) et pour revue (Brewster et al. 2020)). Cette protéine

présente une activité SSA, ATP-indépendante (Kmiec et al. 1981) permettant in vivo

l'appariement de deux ADNsb pouvant présenter une divergence de séquence jusqu'à 17% (Li

et al. 2013) sur quelques dizaines de nucléotides. Le module de recombinaison du phage λ est

également 100 fois plus efficace que RecA dans la formation de recombinants entre séquences

inversées présentant une divergence de 22% (Martinsohn et al. 2008). Redβ est directement

responsable d'une grande partie des évènements de recombinaison observés sur des séquences

présentant 12% de divergence entre le phage λ et le prophage défectif Rac chez E. coli, RecA

n'ayant qu'un effet limité (De Paepe et al. 2014). Ainsi, les propriétés de Redβ, partagées par

d'autres recombinases Rad52-like, permettent d'expliquer son rôle dans le mosaïcisme et les

échanges de gènes par recombinaison homéologue entre phages.

Cette capacité de Redβ, et d'autres Rad52-like phagiques comme son homologue RecT du

phage Rac, à apparier deux ADNsb plus ou moins complémentaires, est à l'origine du

développement d'un outil d'édition du génome particulièrement efficace chez E. coli et les

bactéries apparentées, appelé le recombineering, au début des années 2000 par les équipes des

Dr. Francis Stewart et Don Court (pour revue (Court et al. 2002)). Brièvement, cet outil repose

sur l'appariement d'un oligonucléotide (porteur d'une ou plusieurs mutations) avec le brin retardé

au niveau de la fourche de réplication du chromosome bactérien (Figure 14). Redβ augmente de

104 à 105 fois cet évènement extrêmement rare dans un contexte sauvage (Ellis et al. 2001). Un

ADNdb peut également être utilisé, permettant par exemple d'introduire une cassette de

résistance à un antibiotique. Dans ce cas, l'expression ectopique du module de recombinaison

complet du phage λ est requise. Ce module contient redα codant pour une exonucléase 5'-3'

interagissant avec Rebβ. Redα génère des extrémités d'ADNsb 3' sortantes sur l'ADNdb utilisé

(ou dégrade l'intégralité de l'un des deux brins) afin que Redβ se charge sur l'ADNsb généré et

promeuve l'appariement simple brin avec une région complémentaire sur le chromosome au

niveau du brin retardé. Un autre gène du module de recombinaison, gam, intervient aussi dans

ce processus en codant pour une protéine inhibant l'activité de l'exonucléase RecBCD (Karu et

al. 1975), protégeant ainsi la molécule d'ADNdb transformée dans la bactérie avant sa prise en

charge par le couple Redα-Redβ. Bien que le modèle de fonctionnement du recombineering à

partir d'ADNsb soit bien admis par la communauté (Court et al. 2002), celui à partir d'ADNdb

reste sujet à discussion ((Brewster et al. 2020) et Figure 14). Nous verrons ci-dessous que ces

modèles sont continuellement mis à jour et que la protéine SSB de l'hôte bactérien a été

récemment mise en évidence comme acteur de la recombinaison dépendante de Redβ.

62

Figure 14. Recombinaison

dépendante du système Red

du phage λ. Le

recombineering. A. Modèle

du recombineering simple

brin. L'oligonucléotide couvert

de Redβ est apparié à la

séquence homéologue

(mutation d'intérêt en jaune)

sur le brin retardé. B, C et D.

Modèles de recombineering

double-brin nécessitant la

maturation de la molécule

d'ADNdb par Redα soit

uniquement aux extrémités

(B), soit seulement sur un brin

(C et D). Des modèles

d'appariement d'un ADNsb

maturé complètement avant

son appariement (C) ou

parallèlement à la dégradation

du brin non complémentaire

(D) ont été proposés (Figure

tirée de (Weller et al. 2014)).

La superfamille des Rad51-like est composée de deux familles de recombinases. Les

recombinases de type UvsX sont des orthologues des recombinases RecA et Rad51. UvsX est

ainsi capable de catalyser la réaction d'invasion et d'échange de brins (pour revues, (Liu et al.

2010, Morrical 2015)). Comme pour RecA, UvsX nécessite des cofacteurs pour catalyser cette

réaction. La formation d'extrémités d'ADNsb est assurée par l'exonucléase de T4 (Gp46/47).

Ces extrémités sont rapidement fixées par la SSB du phage (Gp32) et le chargement de UvsX,

ATP-dépendant, va nécessiter l'intervention de UvsY, une protéine médiatrice de la

recombinaison (RMP pour Recombination Mediator Protein, homologue fonctionnel de

RecOR), interagissant avec UvsX et capable de lever la barrière Gp32. La réaction d'invasion

de brin peut alors avoir lieu. Celle-ci est suivie par l'étape de migration de branche, étape

facilitée en présence de l'hélicase UvsW (Gajewski et al. 2011).

La deuxième famille est composée des recombinases de type Sak4. Le premier gène sak4 a

été initialement identifié via la recherche de mutations permettant à des prophages infectant

Lactococcus lactis d'échapper au système AbiK de leur hôte, un système de défense inhibant

l'infection. Quatre groupes de mutations dans les gènes, nommés sak, sak2, sak3 et sak4, ont été

63

identifiés. Les trois premiers codent pour des recombinases de type Rad52 et par analogie il a

été proposé une fonction de recombinase au produit de sak4 (Bouchard et al. 2004). La capacité

d'une Sak4 à promouvoir des évènements de recombinaison in vivo a été validée plus tard en

montrant que l'expression du gène sak4 du phage PA73 infectant Pseudomonas aeruginosa est

capable de promouvoir des évènements de recombineering à partir d'ADNsb, aussi efficacement

que UvsX de T4 mais bien moins (<1000 fois) que Redβ (Lopes et al. 2010). Est-ce que cette

activité de recombineering faible est une propriété intrinsèque à cette enzyme, ou Sak4 requiert-

elle un (ou des) cofacteur protéique pour l'aider dans cette activité ?

D'autre part, Sak4 est constituée du domaine cœur de RecA et de Rad51, un domaine

impliqué dans la fixation et l'hydrolyse de l'ATP ainsi que dans la fixation à l'ADN. Ce domaine

est également retrouvé dans les paralogues eucaryotes (ou archéens) de Rad51, impliqués dans

la formation du filament de Rad51 sur l'ADNsb et dans sa stabilisation (pour revue, (Bonilla et

al. 2020); Figure 15). Sak4 est dépourvue du domaine N-terminal de RecA, notamment des 30

premiers résidus qui sont impliqués dans l'interaction entre les protomères de RecA dans les

filaments hélicoïdaux formés par cette protéine (Story et al. 1992). Sak4 est également

dépourvue du domaine C-terminal de RecA contenant un deuxième site de fixation à l'ADN

impliqué dans la réaction d'invasion et d'échange de brin (Yang et al. 2020), suggérant que Sak4

n’est pas capable de catalyser ces deux réactions. Aucune autre étude n'a été réalisée sur cette

mini-RecA et le mécanisme lui permettant d'apparier deux ADNsb entre eux reste à caractériser.

Une première partie de ma recherche actuelle, résumée ci-dessous, vise donc à caractériser le

mécanisme de recombinaison dépendant de Sak4 du phage HK620 infectant E. coli et à identifier

l'ensemble des acteurs impliqués dans ce processus.

3) Autres fonctions des recombinases phagiques

La fonction première d'une recombinase est d'assurer la réparation des CDB. Comme nous

l'avons vu, cette propriété est utilisée par les phages pour assurer leur évolution via des transferts

de gènes. Cette propriété peut également être utilisée pour une autre fonction qui, à l'inverse du

transfert de gènes et du mosaïcisme, n'est pas conservée entre phages. En effet, un rôle plus ou

moins important dans la réplication du génome a pu être identifié pour certains phages. Un

mutant redβ produit par exemple environ cinq fois moins de phages λ au cours d'un cycle lytique

(De Paepe et al. 2014), alors que la recombinase Gp35, une autre recombinase de type Rad52

produite par le phage virulent SPP1 infectant B. subtilis, est essentielle à la réplication du

génome phagique (pour revue, (Weigel et al. 2006)).

64

Figure 15. La protéine Sak4. A. Alignement de Sak4 avec différentes recombinases de la superfamille

Rad51-like. B. Modèle de structure 3D de Sak4 et comparaison avec les structures de différentes

recombinases de cette superfamille, tirée de (Lopes et al. 2010).

Ce rôle essentiel de Gp35 serait lié à sa capacité, via son activité SSA, à promouvoir la transition

de la réplication en cercle roulant (σ) de SPP1 à partir d'une forme réplicative bidirectionnelle

de type θ (Ayora et al. 2002). La réplication en cercle roulant permet la production de

concatémères requis pour l'empaquetage des chromosomes phagiques dans les capsides. Dans

le cas de λ, cette transition ne semble pas être liée à la recombinaison, mais plutôt à des

changements d'activité transcriptionnelle au niveau de l'origine de réplication du phage

(Takahashi 1977, Narajczyk et al. 2007). Du côté des recombinases de type Rad51, UvsX est

requise pour l'initiation de la réplication recombinaison-dépendante du phage T4 (George et al.

2001, Morrical 2015). Il apparaît donc une hétérogénéité dans le rôle de ces recombinases au

niveau de la réplication des phages, en cohérence avec l'absence de recombinases dans 40% des

phages à ADNdb (>20kb).

65

4) La recombinaison illégitime chez les phages

Comme déjà mentionné, l'absence de régions homologues, aux bornes d'un certain nombre

d'évènements de recombinaison identifiés dans les génomes phagiques, a longtemps laissé

supposer que la recombinaison chez les phages pouvait aussi être illégitime (Hendrix et al. 1999,

Hendrix et al. 2000, Juhala et al. 2000, Morris et al. 2008). La présence d'un gène codant pour

une protéine homologue à la protéine Ku bactérienne dans le génome de certains

mycobacteriophages et son implication, avec la LigD de l'hôte bactérien, dans la

recircularisation du chromosome phagique après infection, a été une première preuve de

recombinaison illégitime chez les phages (Pitcher et al. 2006). Cependant, la forte similarité de

séquence de cette Ku phagique avec la Ku bactérienne et son absence dans tous les autres phages

séquencés à ce jour suggèrent que le gène codant pour Ku a été acquis récemment par ces

mycobactériophages en infectant des mycobactéries, famille de bactéries compétentes en NHEJ.

Des orthologues phagiques plus lointains de la protéine Ku bactérienne et partageant le

domaine cœur de cette dernière ont toutefois été identifiés (voir Figure 9A). Ces orthologues

présentent in vitro des propriétés de fixation et de protection de l'ADNdb très similaires à Ku.

La plus étudiée, la protéine Gam du phage Mu (dénommée par la suite Mu-Gam, à ne pas

confondre avec la Gam de λ) inhibe l'activité de RecBCD en se fixant aux extrémités double-

brins de l'ADN (Williams et al. 1981, Akroyd et al. 1986a, Akroyd et al. 1986b, Abraham et al.

1990, d'Adda di Fagagna et al. 2003). Cette capacité de Mu-Gam à se fixer efficacement aux

DSB est d'ailleurs à l'origine de la production d'un outil permettant de visualiser les DSB in vivo

et de mesurer la fréquence de tels évènements chez E. coli (et dans des cellules humaines) dans

différentes conditions de croissance (Shee et al. 2013). Mu-Gam a été initialement proposée

comme étant une protéine intervenant dans la transposition du phage Mu (Goosen et al. 1982).

Cependant, l'absence d'extrémités d'ADNdb dans les différentes étapes de ce mécanisme et la

présence d'orthologues de Mu-Gam dans d'autre phages tempérés à cycle lysogénique sans

transposition suggèrent que Mu-Gam est impliquée dans un autre processus. L'absence

d'homologues de LigD chez les phages ne permet toutefois pas de conclure quant à un rôle d'une

Mu-Gam dans la recombinaison illégitime de type NHEJ.

66

Travaux de recherche en cours et projets

1) Caractérisation de l'activité de recombinaison de Sak4 du phage HK620

1.1) Identification de la machinerie de recombinaison impliquant Sak4 (Hutinet et al.

2018)

Un gène codant pour une Sak4 est présent dans plus de 20% des phages codant pour une

recombinase, faisant de ce gène de recombinaison le deuxième plus abondant, derrière les gènes

codant une RAD52-like (50%, (Lopes et al. 2010)). Une approche in vivo a montré que la Sak4

du phage PA73 présente une activité de recombineering permettant l’intégration de molécules

d’ADNsb au niveau des fourches de réplication actives chez les bactéries (Lopes et al. 2010).

Toutefois, cette Sak4 ne présente qu'une activité limitée, similaire à celle d'UvsX, et très

inférieure à la recombinase de type RAD52 Redβ (Lopes et al. 2010). Est-ce que ce type

d'activité est une spécificité des RAD52-like, ou d'autres cofacteurs sont-ils requis pour que

Sak4 soit efficace ? Cette activité de recombineering est-elle synonyme d'une activité de SSA

pour Sak4, comme proposé pour Redβ ? Enfin, Sak4 est-elle capable de réaliser, à l'instar de

ses paralogues RecA et UvsX, des évènements d'échanges de brins, des étapes essentielles à la

Réparation des DSB Dépendante d'Homologie de séquence (HDR). Ces différentes questions

ont fait l'objet du travail de thèse de Mr Geoffrey Hutinet, encadrée par M. A. Petit avant mon

arrivée dans l'équipe.

G. Hutinet avait initié la caractérisation in vitro de la Sak4 du phage PA73 présentant une

étiquette en N-Terminale destinée à faciliter sa purification, dont la présence s'est révélée par

la suite essentielle au maintien de la solubilité de cette Sak4. Cependant, il s'est avéré que cette

étiquette modifiait les activités de cette protéine. J’ai donc repris ce travail en purifiant et

caractérisant une Sak4 non étiquetée d'un autre phage (HK620, phylogénétiquement proche du

phage P22 et infectant E. coli). J'ai montré que cette protéine (Sak4HK620) requiert de l'ATP pour

se fixer à l’ADNsb et qu'elle ne se fixe pas à l'ADNdb. Sak4HK620 présente une activité de SSA

in vitro, ATP-dépendante, et limitée par rapport à UvsX, RecA et Redβ. Cependant, comme

pour RecA et Redβ, Sak4 est capable d'apparier deux oligonucléotides présentant jusqu'à 20%

de divergence.

Via la dissection du module de recombinaison, nous avons montré que Sak4HK620, comme

son homologue chez PA73, présente une activité de recombineering faible (fréquence d'environ

3.10-7, c’est-à-dire 15 fois au-dessus du recombineering spontané), indépendante de RecA, mais

que la co-expression du gène sak4 et de celle du gène situé immédiatement après lui dans

l'opéron, stimule fortement cette activité de recombineering (fréquence de 10-5, similaire à celle

67

obtenue avec le module de recombinaison de λ). La recherche de fonction à ce second gène via

l'utilisation de l'outil Phagonaute (Delattre et al. 2016) a montré i) qu'il code pour une protéine

présentant une homologie lointaine avec la SSB bactérienne (nommée SSBHK620) et ii) qu'un

gène sak4 et un gène ssb-like sont très souvent co-occurrents chez les phages et proches l'un de

l'autre sur le génome. La stimulation de l'activité SSA de Sak4HK620 est dépendante de la

présence des six derniers acides-aminés de SSBHK620, des résidus similaires à ceux de la TIP de

la SSBEc et impliquée dans les interactions protéine-protéine (voir précédemment). Le module

de recombinaison de HK620 est capable d'apparier un oligonucléotide présentant jusqu'à 12%

de divergence avec son homologue sur le brin retardé, comme le module de recombinaison de

λ, faisant de Sak4 une recombinase potentiellement à l'origine du mosaïcisme des génomes

phagiques l'exprimant.

J’ai montré que SSBHK620, bien que moins affine, présente des propriétés de fixation à

l'ADNsb similaires à celle de la SSBEc et qu'elle stimule fortement l'activité SSA de Sak4HK620

in vitro. Cette dernière propriété est remarquable puisque l'activité SSA de RecA est a contrario

inhibée par SSBHK620, comme elle l'est par la SSBEc, la conséquence pour RecA étant sa

dépendance vis-à-vis de protéines médiatrices de la recombinaison pour assurer son chargement

sur l'ADNsb. De même, l'activité SSA des recombinases phagiques caractérisées jusqu'alors

n'était pas connue pour être dépendante d'une protéine de type SSB.

La stimulation de l'activité SSA de Sak4HK620 est dépendante de la partie C-terminale de

SSBHK620, comme observé pour le recombineering in vivo. J’ai caractérisé le mécanisme

moléculaire de cette stimulation de Sak4HK620 par SSBHK620 en montrant que ces deux protéines

interagissent sur l’ADN, de façon dépendante du C-terminus de SSBHK620.

Comme nous venons de le voir, Sak4 présente certaines similarités fonctionnelles avec

RecA, dont elle partage le domaine central impliqué dans la fixation et l'hydrolyse de l'ATP.

Cependant, RecA n'est pas capable de réaliser l'activité de recombineering simple-brin in vivo.

Une autre différence notable que nous avons montrée est que, à l'inverse de RecA et SSBEc,

Sak4HK620 et SSBHK620 sont incapables de promouvoir la réaction d'échange de brins in vitro, et

que le duo Sak4HK620/ SSBHK620 est environ 500 fois moins efficace que RecA pour recombiner

un ADN exogène via conjugaison. Enfin, Sak4 n'interfère pas sur l'activité d'échange de brins

de RecA.

Cette étude nous a permis de montrer que Sak4 est une recombinase ATP-dépendante

capable d'apparier in vitro et in vivo des molécules d'ADNsb (SSAP pour Single Strand

Annealing Protein). D'un point de vue évolutif et fonctionnel, Sak4 est une recombinase très

intéressante, à mi-chemin entre une RMP et une recombinase de type RecA catalysant la

68

réaction d'échange de brins. En effet, Sak4 partage la fonction de SSAP avec des RMP chez les

eucaryotes (RAD52), les bactéries (RecO) et les phages (UvsY). Ces RMP sont capables de

stimuler l'activité de leurs recombinases respectives (Rad51, RecA et UvsX) lorsque la SSB

correspondante (RPA, SSB et Gp32) bloque leur accessibilité à l'ADNsb (pour revues,

(Kowalczykowski 2015, Morrical 2015)). Ces RMP interagissent avec leurs SSB respectives,

de la même manière que Sak4. Cette dernière n'est cependant pas une RMP puisqu'elle n'affecte

pas l'activité de RecA. D’un autre côté, Sak4, qui serait structurellement une mini-RecA (Lopes

et al. 2010), ne présente qu'une partie de l'activité de recombinaison de RecA, i.e. le SSA, mais

pas l'échange de brin. A l'inverse de RecA, Sak4 ne requiert pas de RMP puisque c'est sa propre

SSB qui lui permet d'être recrutée sur l'ADNsb. Ceci soulève la question suivante : est-ce que

le gain de la fonction d'échange de brins par RecA (via son domaine C-terminal, absent chez

Sak4) pourrait avoir eu pour conséquence une perte d'interaction avec la SSB bactérienne et

donc la nécessité d'avoir recours à des RMP pour accéder à son substrat ADN ? En ce sens,

nous avons pu montrer que les SSBBs et SSBEc sont aussi capables de stimuler (bien que moins

efficacement que SSBHK620) l'activité SSA de SAk4HK620 (résultats non publiés).

1.2) Etude mécanistique de la réaction de recombinaison catalysée par Sak4HK620 et

SSBHK620 (en cours)

Une partie de mon projet de recherche actuel vise désormais à décrire le mécanisme de

recombinaison dépendant de Sak4 par des approches mutationnelles (mutants ATPase) et

structurales, réalisées en collaboration avec les Dr. E. Le Cam (IGR, Villejuif) et F. Ochsenbein

(CEA, Saclay). J'ai tout d’abord montré de manière surprenante que Sak4 est une ATPase DNA-

indépendante (non observé avec RecA) et que sa fixation à l'ADNsb augmente son activité

ATPasique (propriété partagée avec RecA). La présence d'un nucléotide dérivé de l'adénosine

promeut la formation de filaments de Sak4 (Figure 16A). La taille de ces structures dépend de

la nature du nucléotide utilisé, allant d'une dizaine de nm en présence d'ADP à plusieurs µm en

présence d'ATPγS, un nucléotide faiblement hydrolysé par Sak4 (10 fois moins que l'ATP en

présence d'ADNsb). RecA forme également des filaments (ainsi que d'autres structures

quaternaires, non visualisées avec Sak4), mais ces derniers ne requièrent pas la présence de

nucléotides (Williams et al. 1986). Au contraire même, l'ATP (mais pas l'ATPγS) inhibe la

formation de ces filaments (Flory et al. 1982).

69

Comme RecA, Sak4 forme des nucléofilaments sur l'ADNsb (Figure 16B). Ces structures

requièrent la présence d'ATP mais pas son hydrolyse. Cependant, un mutant ATPase - de Sak4

présente une affinité plus faible pour l'ADNsb.

Figure 16. Structures formées

par Sak4. A. Formation de

filaments de Sak4 en présence de

différents nucléotides dérivés de

l'adénosine et de MgCl2 en

microscopie électronique par

transmission (MET). En leur

absence les grilles sont vierges de

toutes structures visibles. B.

Formation de nucléofilaments de

Sak4 sur l'ADNsb (flèche rouge

pour exemple) en présence de

MgCl2 et d'ATP. Le substrat

ADN est une molécule double

brin de 600pb (flèche bleue pour

exemple) étendue par une

extension 5' simple brin (flèche

jaune pour exemple).

Nous cherchons à savoir désormais si cette diminution d'affinité est liée à un défaut de fixation

sur l'ADN ou à une diminution de la stabilité du nucléofilament. Enfin, j'ai pu montrer que

l'activité d'hydrolyse de l'ATP était nécessaire à la réaction d'appariement de brin catalysée par

Sak4, cette même activité ne nécessitant pas d'ATP pour RecA (Hutinet et al. 2018). Malgré

plusieurs tentatives de cristallisation, aucune piste n'a pour le moment été trouvée pour obtenir

des cristaux de Sak4. Nous travaillons actuellement à caractériser la fixation de SSBHK620 sur

l'ADN par MET. L'ensemble de ces nouvelles données associé à notre précédente étude nous

permet de proposer deux modèles non exclusifs permettant de décrire le mécanisme utilisé par

Sak4 pour réaliser la recombinaison par SSA (Figure 17). L'utilisation de la microscopie à super

résolution et/ou la MET nous permettra de trancher entre ces deux modèles.

Des études récentes, postérieures à notre publication sur Sak4, montrent que le duo SSAP

phagique / SSB n'est plus une spécificité de Sak4. En effet, le domaine C-terminal de Redβ du

phage λ présente une structure 3D proche de celle de la protéine Orf du même phage (Caldwell

et al. 2019), connue pour interagir avec la SSBEc (Maxwell et al. 2005) et faciliter le chargement

de RecA sur des ADNsb recouverts de SSB en absence de RecFOR (Sawitzke et al. 1992,

Poteete 2004). Comme Orf, Redβ interagit physiquement avec la SSBEc et un modèle de

recombineering simple-brin mis à jour, proche de celui présenté dans la Figure 17 (panneau de

B

A

70

droite), a été proposé ((Caldwell et al. 2019). La SSB, présente sur le brin retardé, faciliterait

l'évènement d'appariement entre ce brin et un oligonucléotide recouvert de Redβ, via une

interaction entre les deux protéines.

Figure 17. Modèles mécanistiques de l'appariement simple brin par Sak4HK620 et sa SSBHK620. Ces

deux modèles se différencient par la manière dont sont prise en charge les deux molécules d'ADNsb

complémentaires. A gauche, SSBHK620 se fixe en premier et attire Sak4HK620, facilitant ainsi la fixation de

cette dernière sur l'ADN (monomérique ou déjà polymérisée ?) et ainsi la réaction d'appariement. A

droite, chaque molécule d'ADN est prise en charge par une protéine distincte et l'affinité des deux

protéines l'une pour l'autre facilite le mécanisme SSA dépendant de Sak4HK620.

Des données récentes montrent que la surexpression de la SSBEc augmente l'efficacité de

recombineering simple-brin (mais pas double-brin !) par Redβ, chez E. coli elle-même, mais

aussi chez des espèces bactériennes phylogénétiquement éloignées, dans lesquelles l'expression

de la SSAP seule ne permet pas ou très peu d'évènements de recombinaison de ce genre, et

semblent conforter ce nouveau modèle mécanistique (Filsinger et al. 2021). Il est à noter que

cette dernière étude va sans doute permettre de développer et d'uniformiser l'outil de

recombineering à de multiples espèces bactériennes, jusqu'alors réfractaires au système λ-Red.

De même, nous serons amenés à rechercher si le couple Sak4-SSB d'HK620 peut-être

transférable chez d'autres espèces bactériennes. Le but ici n'est pas tant de rentrer en

compétition avec le système λ-Red mais plutôt de proposer une alternative à ce système en ce

sens que le recombineering double-brin λ-Red-dépendant ne semble pas être transférable

(Filsinger et al. 2021). Le modèle de recombinaison catalysée par le phage λ propose que

l'exonucléase Redα dégrade l'ADNdb substrat et recrute Redβ sur l'ADNsb naissant.

71

Le couple Sak4HK620/SSBHK620 ne présente pas d'activité exonucléase et nous n'avons pas non

plus identifié d'activité hélicase, une activité qui aurait aussi pu permettre de générer de

l'ADNsb. Cependant, la co-expression de sak4HK620 et ssbHK620 permet de réaliser des

évènements de recombineering à partir d'ADNdb in vivo (résultat non publié). Ceci suggère

qu'E. coli code pour une (des) enzyme(s) capable(s) de préparer un ADNdb en vue de sa prise

en charge par Sak4-SSB. Nos premières études montrent que RecBCD est en partie impliquée,

mais que d'autres enzymes bactériennes peuvent intervenir. Les gènes phagiques à proximité

immédiate de sak4 et ssb sur le génome de HK620 ne sont pas impliqués dans ce processus

(non publié), mais d'autres gènes pourraient intervenir. Pour cela, je chercherai d'éventuels

partenaires à Sak4 et SSB en utilisant la méthodologie TAP, efficace pour identifier des

complexes de protéines phagiques (voir ci-dessous).

Pour finir, une autre question que l'on se pose sur Sak4HK620 concerne son rôle dans le

métabolisme du phage. Ce travail est réalisé avec la Dr. Mireille Ansaldi (Lab. de Chimie

Bactérienne, Marseille). Nous avons déjà montré que Sak4 n'est pas essentielle à la formation

de virions HK620 (non publié). Ce résultat s'est révélé surprenant suite à la mise en évidence

de l'essentialité de l'homologue de Sak4 codé par le phage tempéré φ11 infectant

Staphylococcus aureus (Neamah et al. 2017). Cette dernière étude propose que Sak4φ11 soit

requise dans la réplication du génome phagique en assurant la transition de la réplication θ à σ.

Nous devrons chercher à savoir si un mutant de sak4HK620 altère la production de virions et si

oui, identifier l'étape limitante du processus d'induction.

L'ensemble de ce projet de recherche fera l'objet d'une demande de financement à l'ANR en

2021.

2) Caractérisation du module de recombinaison du phage Gally d'E.coli LF82 et impact

sur la physiologie de son hôte bactérien

L'absence de recombinase dans plus de 40% des phages à ADNdb (>20kb, (Lopes et al.

2010)) et le fait que leur présence ait un impact variable sur le cycle de vie phagique (voir

précédemment) soulève la question d'un éventuel rôle de ces protéines dans la physiologie de

leur hôte bactérien. En d'autres termes, est ce que certaines de ces recombinases pourraient se

comporter comme des morons ? En effet, de par leur capacité à réparer des CDB, les

recombinases de phages tempérés pourraient en théorie être utilisées par leur hôte bactérien pour

améliorer leurs capacités de réparation des cassures générées suite à des stresses génotoxiques.

Bien sûr, ces recombinases, au même titre que les autres protéines impliquées dans le cycle

72

lytique des phages tempérés, ne sont pas produites à l'état lysogénique, tout du moins en

conditions classiques de laboratoire et dans les phages modèles étudiés jusqu'alors. Comme nous

l'avons vu précédemment, un certain nombre de gènes phagiques échappent au contrôle

transcriptionnel du phage. Dans quelle mesure cette observation ne pourrait-elle pas s'étendre à

d'autres gènes du phage, et notamment des gènes codant pour des recombinases ?

Quel sens cela aurait-il pour les bactéries ? En conditions de croissance compatibles avec la

réplication, ces dernières disposent déjà d'un mécanisme de recombinaison homologue

dépendant de RecA pour réparer leurs CDB. Mais dans des conditions peu propices à la

réplication, et donc à la présence de régions homologues au sein d'une même cellule, nous avons

vu que seul 20 % des bactéries codent pour un système NHEJ. Ceci soulève la question des 80%

de bactéries restantes et la façon dont elles réparent leur ADN dans ces conditions. Comme

environ la moitié des bactéries séquencées à ce jour contiennent a minima un prophage

(Touchon et al. 2016), il serait possible que des mécanismes phagiques de recombinaison

illégitimes, ou des mécanismes ne nécessitant qu'une courte région d'homologie portée par la

même molécule d'ADN, comme le SSA, soient détournés par l’hôte bactérien à son profit pour

survivre.

L'étude récente de Battacharyya et al. tend à conforter cette hypothèse. En effet, la protéine

orthologue de Ku, Mu-Gam, du phage Mu, stimule in vitro spécifiquement l'activité de ligature

de la ligase réplicative LigA et de la ligase LigB de E. coli (Bhattacharyya et al. 2018). In vivo,

l'expression de mu-gam chez E. coli augmente la fréquence de réparation de plasmides linéaires

après leur transformation dans les cellules, ce qui est caractéristique d'un mécanisme de NHEJ.

De manière remarquable, une souche lysogène pour Mu présente, dans des conditions de

laboratoire, une meilleure viabilité en phase stationnaire, en milieu minimum ou en présence

d'un radiomimétique par rapport à une souche lysogénéisée avec un Mu dépourvu du gène mu-

gam (Bhattacharyya et al. 2018). Cette étude tend donc à montrer que Mu est capable d'induire

des évènements de recombinaison illégitime et que ceux-ci peuvent améliorer la survie de son

hôte bactérien dans des conditions de laboratoire où la RH serait limitée ou saturée. Cette

hypothèse peut-elle être étendue à d'autres homologues de Mu-Gam ? A d'autres protéines de

réparation des CDB comme les SSAP ? Dans des conditions plus proches des conditions

naturelles de vie de la bactérie ?

Pour répondre à ces questions, j'ai entrepris une collaboration avec le Dr. Olivier Espéli

(Collège de France, Paris). Ce dernier travaille sur la survie et la persistance induite en

macrophage de la souche entéropathogène E. coli LF82 impliquée dans la maladie de Crohn

(MC). Cette maladie provoque une inflammation chronique généralisée de l’appareil gastro-

73

intestinal humain dont les causes sont clairement multifactorielles, à la fois génétiques et

environnementales (Torres et al. 2017a). Une perturbation importante du microbiote intestinal

est observée chez ces malades, avec notamment une augmentation de la quantité

d’entérobactéries, dont les AIEC (Adherent-Invasive E. coli) ((Gevers et al. 2014, Nadalian et

al. 2020) et pour revues (Rolhion et al. 2007, Palmela et al. 2018)). Les AIEC, dont fait partie

LF82, sont suspectées de jouer un rôle actif dans la maladie. En effet, LF82 est capable de

survivre et de se multiplier dans les phagolysosomes des macrophages, malgré le pH acide, le

stress oxidant, la présence de protéases et de différents composés antibactériens. Dans cet

environnement, LF82 provoque la sécrétion de la cytokine TNF-α, marqueur principal de

l’inflammation des malades atteints de MC (Boudeau et al. 1999, Glasser et al. 2001, Carvalho

et al. 2009).

La survie de LF82 dans les macrophages dépend d'une capacité élevée de la bactérie à

surmonter les différents stresses rencontrés dans les macrophages (Palmela et al. 2018). Cette

survie dépend notamment de la réponse stringente et de la réponse SOS (Demarre et al. 2019),

cette dernière impliquant que LF82 subit des stresses génotoxiques dans les macrophages. Une

autre propriété de LF82 est sa capacité à entrer dans un état de persistance au cours de l'infection

en macrophage, un état au cours duquel une fraction d’une population bactérienne est apte à

résister à des antibiotiques, sans acquisition de gènes de résistance (Harms et al. 2016, Demarre

et al. 2019). Cette propriété pourrait être à la base des échecs thérapeutiques de la MC malgré

l’utilisation d’une antibiothérapie.

De manière remarquable, des données préliminaires, obtenues par l'équipe d'O. Espéli et la

nôtre, suggèrent que des gènes portés par un prophage de LF82, que nous avons nommé par la

suite Gally, sont impliqués dans la physiologie de la souche LF82 en macrophage. En effet, une

région du génome de Gally est moins propice à l’intégration d’un transposon dans des LF82

infectant des macrophages, par comparaison à des LF82 en croissance en milieu liquide. Cette

région contient trois gènes (encadré rouge dans la Figure 18A). Ceux-ci sont de plus surexprimés

lorsque LF82 infecte un macrophage en comparaison d'une croissance en milieu liquide et sont

également parmi les gènes les plus exprimés du prophage dans cette condition (Figure 18B).

L'ensemble de ces résultats préliminaires suggèrent un rôle de ces trois gènes dans la viabilité

de LF82 en macrophage. De manière inattendue, le profil des ratios d'expression des gènes de

ce prophage en macrophage suggère que le cycle lytique du prophage Gally n'est pas induit (les

gènes codant les répresseurs C2 (homologue au C1 de λ) et Mnt (également impliqué dans le

maintien de la lysogénie chez P22) sont sur-exprimés alors qu'une majorité des gènes de capside

sont sous-exprimés.

74

Figure 18. Le prophage Gally et l'expression de ces gènes dans la souche LF82 en macrophages. A. Génome du prophage Gally intégré dans la souche AIEC E. coli LF82. La couleur des gènes est

associée à leur fonction prédite (en jaune : régulation transcriptionnelle, en rouge : intégrase/excisionase,

en orange : métabolisme de l'ADN, en vert : capside et système d'empaquetage de l'ADN, en bleu sombre

: queue, en bleu clair : fibre de queue, en rose : lyse bactérienne, en gris : fonction inconnue). B. Ratio

de l'expression des gènes de Gally lorsque LF82 est internalisée en macrophages (6h post-infection)

comparée à celle des mêmes gènes lorsque LF82 est en culture liquide en milieu minimum. Chaque

histogramme correspond au ratio pour un gène phagique. Les trois gènes encadrés en rouge sont

potentiellement impliqués dans la survie de LF82 en macrophage (voir texte).

L'expression des 3 gènes d'intérêt semble donc, au moins en partie, échapper au système de

régulation transcriptionnelle du phage. Enfin, une souche LF82 curée du prophage Gally

(construite au laboratoire, Mr Jeffrey Cornuault, non publié) forme environ cinq fois moins de

persisteurs (bactéries persistantes) que la souche sauvage après infection en macrophages. Ce

dernier résultat corrobore d'ailleurs une étude du groupe du Dr. Kenn Gerdes qui a mis en

évidence un rôle des prophages portés par la souche E. coli K12 dans sa capacité à induire in

vitro la formation de persisteurs résistants à la ciprofloxacine (Harms et al. 2017).

Une analyse in silico de la région d'intérêt sur le génome de Gally montre qu'elle contient un

gène codant un homologue potentiel de Mu-Gam, un gène codant un homologue de la RecT du

phage Rac d’E.coli, une SSAP de la famille des RAD52-like (Hall et al. 1993, Lopes et al. 2010),

et un gène codant un homologue d'Abc1 du phage P22, potentiellement impliqué dans la

régulation de RecBCD (Murphy et al. 1987) (Figure 18A). Les fonctions prédites et la

modularité des phages, i.e. le regroupement de gènes dans le génome assurant une fonction

commune, suggèrent que les produits des trois gènes renommés mu-gam, recT et abc1 de Gally

Ab

c1

A

B

75

sont impliqués dans un mécanisme de recombinaison commun. Ce mécanisme serait inédit (si

les fonctions étaient conservées) car il ferait intervenir une protéine de NHEJ (Mu-Gam) et une

SSAP (RecT).

L’ensemble de ces données met en lumière un rôle inédit d’un prophage, et de ses gènes de

recombinaison, dans la viabilité de son hôte bactérien en macrophages et dans l’induction ou le

maintien de la persistance bactérienne induite dans cet environnement. La caractérisation i) du

mécanisme original de recombinaison impliquant des homologues potentiels de Mu-Gam, RecT

et Abc1, ainsi que ii) du lien existant entre recombinaison phagique et viabilité/persistance de

la bactérie en macrophage, ont défini les objectifs du projet de recherche de Mlle Pauline Misson,

l’étudiante dont je dirige la thèse depuis novembre 2018. Ce travail est intégré dans le projet

Persist3R financé par l’ANR (2019-2021; coordinateur : M.A Petit) dont le but est de

caractériser i) la réponse transcriptionnelle d'E. coli LF82 à l'établissement et à la sortie de la

persistance dans différentes conditions de croissance, ii) les dommages à l'ADN subits dans ces

conditions et les voies de réparation nécessaires au redémarrage de la réplication des persisteurs

et iii) l'effet des prophages hébergés par LF82 sur la viabilité et la persistance induite en

macrophages. Ce dernier aspect implique plus particulièrement notre équipe et notamment le

travail de thèse de P. Misson dont les premiers résultats sont résumés ci-dessous.

2.1) Caractérisation du mécanisme de recombinaison impliquant les produits des

trois gènes recT, mu-gam et abc1

Sur la base de leurs similarités lointaines avec des protéines de recombinaison de phages

connues, P. Misson a étudié les capacités de recombineering (voir précédemment) d’une souche

de E. coli exprimant les gènes recT, mu-gam et/ou abc1 de Gally. Elle a montré i) que

l'expression de recT est nécessaire et suffisante pour réaliser du recombineering in vivo à partir

d'un oligonucléotide et ii) que la co-expression de recT et mu-gam est requise pour le

recombineering à partir d'ADNdb (Figure 19). Ce résultat suggère un rôle de Mu-Gam de Gally

dans la formation de molécules d’ADNsb à partir d’ADNdb dans un contexte cellulaire, et un

rôle inattendu de cette protéine dans la recombinaison homologue par SSA catalysée par RecT.

De manière également inattendue, P. Misson a montré que l'expression du gène mu-gam de

Gally n'influe pas sur le taux de ligature de plasmides linéaires aux extrémités cohésives (5' ou

3') et transformés chez E. coli, contrairement à ce qui a été montré pour son homologue potentiel

Mu-Gam du phage Mu (Bhattacharyya et al. 2018).

76

Figure 19. Mu-Gam de Gally est

impliquée dans la recombinaison

dépendante de RecT. Activité de

recombineering (taux de SSA, in vivo)

de RecT sur de l'ADNsb ou de

l'ADNdb utilisés comme source

d'édition du génome bactérien. Les

différents gènes de Gally exprimés (+)

ou non (-) de façon ectopique dans

notre souche test de recombineering

sont indiqués. Le module de

recombinaison de λ est utilisé comme

témoin. Les * indiquent la

significativité des résultats selon un

test de Student.

Parallèlement à ce travail, P. Misson a entamé la caractérisation biochimique des protéines

RecT et Mu-Gam. Pour ce faire, elle a développé les protocoles de purification de ces deux

protéines. RecT de Gally est une protéine multimérique et son degré d'oligomérisation (penta à

décamérique voire plus) dépend du milieux réactionnel (la présence de NaCl et MgCl2 tendant

à diminuer la multimérisation). Cette protéine se fixe à l'ADNsb et db en absence de MgCl2, la

présence de ce dernier inhibant préférentiellement son interaction avec l'ADNdb. Enfin, RecT

présente une activité SSA, similaire en efficacité à celle de Redβ dans nos conditions, stimulant

l'appariement de deux ADNsb complémentaires, faisant de RecT de Gally un homologue de

RecT du phage Rac.

Malgré de multiples essais d'expression dans diverses conditions de purification ou de co-

expression avec RecT, la Mu-Gam de Gally a toujours été produite sous forme de corps

d'inclusion, contrairement à son homologue chez Mu. P. Misson a donc développé un protocole

de purification en conditions dénaturantes, puis procédé à la renaturation de la Mu-Gam purifiée.

Le rendement très faible de purification de Mu-Gam sous forme soluble nous a quand même

permis de montrer que Mu-Gam de Gally est un tétramère en solution (Mu-Gam de Mu est un

dimère) qui se fixe préférentiellement à l'ADNdb plutôt qu'à l'ADNsb et qui stimule légèrement

l'activité SSA in vitro de RecT. Ce dernier résultat, non reflété dans les tests de recombineering

in vivo, démontre que ces deux protéines peuvent agir de concert dans un mécanisme de

recombinaison de type SSA lorsque le substrat initial est double brin, avec une Mu-Gam

strictement requise, mais aussi lorsqu'il est simple brin. Dans ce dernier cas, Mu-Gam

77

n'interviendrait que de façon modérée selon un mécanisme restant à identifier. Nous travaillons

à améliorer le rendement de renaturation de Mu-Gam afin de valider ces résultats préliminaires.

Aucune activité nucléase ou hélicase n'a pu être mise en évidence ni pour la Mu-Gam

renaturée ni pour RecT, suggérant que l'une ou l'autre de ces activités, selon le modèle actuel du

recombineering, est apportée par une troisième protéine avec laquelle Mu-Gam interagirait.

L'expression du gène abc1 n'affecte aucune des activités révélées par nos tests génétiques,

montrant qu'Abc1 de Gally n'est pas impliquée dans le SSA dépendant de RecT. Pour identifier

un éventuel troisième partenaire, nous avons adapté la méthodologie de TAP à LF82 et

caractérisé les complexes protéiques impliquant Mu-Gam ou RecT après induction du phage à

la ciprofloxacine (induction vérifiée via qPCR, voir ci-dessous). Les premiers résultats obtenus

récemment montrent que la purification d'une Mu-Gam étiquetée avec l'étiquette SPA entraîne

la co-purification d'une seule autre protéine phagique, RecT. Ainsi, ces deux protéines

pourraient interagir et cette interaction pourrait être nécessaire à l’activité de recombinaison de

RecT. P. Misson cherchera, une fois les conditions de purification de Mu-Gam optimales

identifiées, à confirmer cette interaction physique entre les deux protéines. De plus, elle

cherchera à expliquer la stimulation de l'activité SSA de RecT par Mu-Gam en comparant les

affinités relatives de RecT pour l'ADNsb et l'ADNdb en présence ou en absence de Mu-Gam.

Ceci nous permettra de proposer un premier modèle mécanistique pour la recombinaison par

SSA dépendante de ces protéines chez Gally dans une publication que P. Misson signera en

premier auteur.

Nous travaillons aussi à l'optimisation de la procédure TAP afin d'identifier une liste

exhaustive des contaminants classiques générés par cette méthodologie chez LF82, ce qui est un

pré-requis à l'identification des autres protéines interagissant avec Mu-Gam potentiellement

intéressantes pour l'activité de recombineeering de RecT. C'est à ma connaissance la première

étude de caractérisation de complexes protéiques impliquant des protéines phagiques au cours

de l'induction du cycle lytique in vivo. La faisabilité de la méthode sur des protéines de Gally

ouvre également de nouvelles perspectives pour la caractérisation de complexes impliquant des

recombinases d'autres familles (ou toute autre protéine de phage) et la compréhension des

mécanismes de recombinaison associés (ou d'autres processus phagiques).

2.2) Caractérisation des prophages de E. coli LF82

Pour comprendre le rôle éventuel des trois gènes recT, mu-gam et abc1 sur la physiologie

de leur hôte bactérien, une caractérisation préalable du prophage Gally et des autres prophages

78

de la LF82 est nécessaire. En effet, cinq prophages ont été identifiés au cours du séquençage du

génome de la souche LF82, dont un sous forme épisomale (tout d’abord appelé plasmide

pLF82) (Miquel et al. 2010). Cependant, aucune donnée n'a été publiée sur l'éventuelle

induction de ces prophages, ni sur leur capacité à infecter des bactéries, des activités qu'il est

important de connaitre si l'on veut comprendre la physiologie de LF82 en conditions de stresses

génotoxiques et sous l'effet de mutations.

P. Misson a caractérisé ces prophages en annotant leurs gènes (voir Figure 18A pour

l'exemple de Gally) et en les observant, après isolement ou non et amplification, par MET. Ainsi

Gally est un podovirus de la famille des P22-like, alors que Perceval et Tritos sont des

siphovirus proches de λ. Cartapus, un P2-like, n'a pu être isolé. Enfin le phage Cyrano,

extrachromosomique, est un autre siphovirus de la famille des SSU5-like (Figure 20).

Figure 20 : Photographies des phages de la souche E. coli LF82 par MET. *: vésicules.

Le séquençage du virome de la souche LF82, obtenu après croissance en milieu riche, nous

a permis de montrer que Gally réalise de la transduction latéralisée. Ce processus serait lié à la

réplication du génome du phage avant son excision du chromosome bactérien et aboutirait soit

à l'encapsidation du phage, soit à des portions de chromosome bactérien, présents à une seule

des extrémités du prophage et de longueur similaire à celle du génome phagique (Chen et al.

2018). De manière remarquable, le prophage Perceval, à environ 140kb de Gally sur le

chromosome bactérien, est dans une région génomique amplifiée par la transduction latéralisée

dépendante de Gally. Son génome est ainsi internalisé dans des capsides produites par le phage

Gally. La quantité de virions contenant de l'ADN de Perceval est environ deux fois plus faible

dans une souche dépourvue de Gally que dans une souche sauvage, suggérant que près de la

moitié des génomes de Perceval identifiés par séquençage proviennent de transduction

latéralisée ! Le mécanisme moléculaire à la base de l'encapsidation du génome de Gally complet

dans ce processus transductionnel reste inconnu, mais P. Misson a pu montrer qu'il ne requiert

79

pas ses gènes de recombinaison (recT, mu-gam et abc1), même si leur inactivation affecte la

quantité de virions Gally produits (environ 4 fois moins).

La transduction latéralisée, comme les autres types de transduction, permettrait

théoriquement d’assurer le transfert de gènes de LF82 vers d'autres souches bactériennes

sensibles à Gally. Cependant, pour le moment, nous n'avons pas été en mesure de trouver une

souche bactérienne sensible à ce phage. Même une souche LF82 dans laquelle Gally a été

supprimé, et une souche d'E. coli TD2158, sensible au phage HK620 phylogénétiquement

proche de Gally et appartenant à la famille des P22, sont insensibles à Gally, soulevant la

question de l'activité de ce phage. Les multiples tentatives d'isolement de Gally ont toutefois

permis d'isoler des phages hybrides résultant d'évènements de recombinaison entre les génomes

de Gally et de Perceval (Figure 20). Ces hybrides constitués des modules de structure,

d'assemblage et de lyse de Perceval ont les mêmes capacité d'infection que le phage Perceval.

Ces résultats soulèvent la question de savoir si Gally est un phage en cours de domestication

par son hôte. La souche LF82 aurait-elle un intérêt particulier à garder Gally dans son génome

? La question se pose également pour Cartapus (dont nous n'avons pas trouvé les conditions

d'induction) et Cyrano (qui n’a pas d'hôte bactérien identifié). A l'inverse, P. Misson a montré

que Perceval et Tritos sont des phages infectieux, capables d'infecter une souche d'E. coli

MG1655.

Gally est le prophage le plus induit (au moins 100 fois plus que les autres phages de LF82)

lors d'une croissance en milieu riche sans ajout d'inducteurs particuliers (5.108 phages /mL de

milieu de culture ayant contenu des LF82 en phase exponentielle de croissance). L'ajout de

ciprofloxacine augmente d'un log environ cette induction, montrant que Gally est probablement

inductible par le SOS. La même observation a été réalisée pour Perceval et Cyrano, même si la

concentration en phages obtenue après induction à la ciprofloxacine reste encore environ 100

fois plus faible que celle de Gally. Tritos et Cartapus ne semblent pas être induits en présence

de cette drogue. Comme il a été mentionné précédemment, la viabilité de LF82 en macrophage

dépend en partie de la réponse SOS (Demarre et al. 2019) et le profil d'expression des gènes de

Gally dans cet environnement suggère qu'il n’est pas induit (Figure 18B). Ces résultats sont à

première vue contradictoires avec nos résultats indiquant que la réponse SOS induit le cycle

lytique de Gally, de Perceval et de Cyrano in vitro et soulève la question de l'induction de ces

phages dans la LF82 en macrophage. Pour y répondre, une approche de quantification par qPCR

des phages produits dans les macrophages est en cours de développement par P. Misson. Cette

approche sera complétée par la visualisation des bactéries induisant les phages dans les

macrophages. Cette visualisation est rendue possible grâce à l'utilisation de souches LF82 dont

80

les gènes codant pour les protéines de capside majeures des différents phages ont été fusionnés

à la GFP. Nous avons montré qu'en culture en milieu riche et 30 minutes après l'ajout de

ciprofloxacine, environ 50% des bactéries induisent le cycle lytique de Gally et de Perceval, ce

chiffre étant au moins 100 fois plus faible en absence de l'inducteur. Ces résultats indiquent que

ces souches sont utilisables pour estimer la fréquence d'induction de ces deux phages dans les

macrophages.

L'ensemble des résultats générés au cours cette étude fera l'objet d'une prochaine publication

que P. Misson signera en premier auteur.

2.3) Etude du rôle potentiel joué par les protéines phagiques RecT, Gam et Abc1 sur la

survie et la persistance aux antibiotiques induite en macrophages de E. coli LF82

Les résultats préliminaires obtenus par P. Misson au cours de son stage de M2 indiquaient

que les gènes recT, mu-gam et abc1 pourraient être impliqués dans la persistance aux

antibiotiques induite en macrophage de la souche LF82. En effet, après 1h en macrophage, bien

que la viabilité d’une souche inactivée pour ces trois gènes ne soit pas affectée par rapport à la

souche sauvage, la persistance du mutant à la céfotaxime (céphalosporine de troisième

génération utilisée dans le traitement des abcès pouvant survenir chez des patients atteints de la

maladie de Crohn) est trois fois moins importante que celle d’une souche sauvage. Ce résultat

est similaire à celui obtenu avec une souche LF82 curée du phage Gally et suggère que le défaut

de persistance dans cette dernière souche est lié à l'absence des gènes de recombinaison de

Gally plutôt qu'à d'autres gènes phagiques. P. Misson a de plus montré que la céfotaxime

n’influe pas sur l’induction des prophages de E. coli LF82, et que l’effet observé est donc

directement dépendant de l’expression de ces trois gènes.

Cependant, à la lumière de la publication récente de l'équipe d'O. Espéli montrant i)

l'impact positif de la réponse SOS et de RecA sur la survie de LF82 sur les phases tardives de

l'infection (après 6 heures) et ii) l'augmentation de la persistance à la céfotaxime d’un facteur

dix entre 1h et 24h post-infection (Demarre et al. 2019), nous devons confirmer nos résultats

en étudiant l’impact des gènes recT-gam-abc1 de Gally sur l’évolution de la survie et de la

persitance de E. coli LF82 au cours du temps. Pour savoir si l’expression de recT, mu-gam et

abc1 est suffisante à l’établissement d’une augmentation de la survie et/ou de la persistance

induite en macrophage, nous effectuerons également des infections, selon le même protocole,

avec une souche E. coli MG1655 sauvage et une E. coli MG1655 exprimant les trois gènes

d'intérêt en ectopique. La MG1655 ne possédant aucun prophage actif et ne produisant que très

81

peu de persisteurs résistants à la céfotaxime, les effets observés sur sa physiologie seront

directement dépendants de l’expression des gènes recT, mu-gam et abc1. Enfin, nous

évaluerons par microscopie la fréquence d’expression de protéines RecT et Gam fusionnées à

des marqueurs fluorescents parmi les E. coli LF82 en macrophage. Nous localiserons les

cellules les exprimant dans les macrophages et nous comparerons ce profil de localisation à

celui de l'expression du gène de capside de Gally fusionné au gène gfp. Cette analyse nous

permettra de confirmer, ou non, que l'induction des gènes de recombinaison de Gally est bien

dissociable de l'induction des gènes de structure de ce phage dans une population de bactéries

infectant le macrophage, comme suggéré par l'analyse transcriptomique réalisée par O. Espéli

(Figure 18B). Ce travail sera réalisé par P. Misson sous réserve de l'obtention d'une bourse de

4ème année de thèse et nous permettra de démontrer pour la première fois que i) des phages

d’AIEC peuvent jouer un rôle dans le processus de virulence de leur hôte bactérien E. coli LF82

et ii) que des gènes phagiques peuvent être impliqués dans la persistance bactérienne aux

antibiotiques.

82

V- Conclusion

Alors que les recombinases Redβ (de type RAD52) et UvsX (RAD51) ont fait l'objet de

nombreuses études ayant permis, tout du moins en partie, de comprendre le mécanisme

moléculaire dans lequel elles interviennent, beaucoup de travail reste à faire pour élucider les

mécanismes faisant intervenir Sak4 mais également Gp2.5. Pour Sak4, tel qu'indiqué, je

poursuis sa caractérisation biochimique et m'intéresse désormais aux étapes synaptiques et post-

synaptiques impliquant l'hydrolyse de l'ATP. Pour Gp2.5, nous venons d'initier une

collaboration avec le laboratoire du Dr. Laurent Debarbieux (Institut Pasteur, Paris), afin de

caractériser un homologue lointain de Gp2.5 de T7, potentiellement impliqué dans un

mécanisme de recombinaison à l'origine d'un évènement de changement d'hôte, donc d'un

intérêt primordial pour la phagothérapie.

A côté de ces recombinases, il a été récemment identifié un autre moyen de faire de la

recombinaison chez les phages via le NHEJ et la protéine Mu-Gam. Nous travaillons à la

caractérisation de l'une de ces protéines.

Pour complexifier encore un peu plus les choses, nous avons vu que Mu-Gam de Gally

coopère avec une recombinase RecT (de type RAD52) dans un mécanisme de recombinaison

par SSA. Ainsi, il apparait que les machines moléculaires déjà décrites par le passé ne sont pas

"figées" et que les briques les constituant peuvent être interchangeables, au moins dans une

certaine mesure. Ceci permet d'avoir à disposition un arsenal de protéines de réparation de

l'ADN dont les différentes combinaisons opérationnelles aboutissent à leur sélection dans les

phages contemporains. Ceci laisse aux chercheurs, intéressés par la compréhension de ces

mécanismes, une liste de sujets de recherche quasi inépuisable, sans compter les mécanismes

de recombinaison encore à découvrir étant donnée l'énorme quantité de phages restant à

caractériser.

83

VI- Références

Abraham, Z. H. and N. Symonds (1990). Purification of overexpressed gam gene protein from bacteriophage Mu

by denaturation-renaturation techniques and a study of its DNA-binding properties. Biochem J 269(3): 679-684.

Accornero, F., R. L. Ross and J. D. Alfonzo (2020). From canonical to modified nucleotides: balancing translation

and metabolism. Crit Rev Biochem Mol Biol: 1-16.

Agris, P. F., A. Narendran, K. Sarachan, V. Y. P. Vare and E. Eruysal (2017). The Importance of Being Modified:

The Role of RNA Modifications in Translational Fidelity. Enzymes 41: 1-50.

Akey, D., A. Martins, J. Aniukwu, M. S. Glickman, S. Shuman and J. M. Berger (2006). Crystal structure and

nonhomologous end-joining function of the ligase component of Mycobacterium DNA ligase D. J Biol Chem

281(19): 13412-13423.

Akroyd, J. and N. Symonds (1986a). Localization of the gam gene of bacteriophage mu and characterisation of

the gene product. Gene 49(2): 273-282.

Akroyd, J. E., E. Clayson and N. P. Higgins (1986b). Purification of the gam gene-product of bacteriophage Mu

and determination of the nucleotide sequence of the gam gene. Nucleic Acids Res 14(17): 6901-6914.

Alberti, S., A. Gladfelter and T. Mittag (2019). Considerations and Challenges in Studying Liquid-Liquid Phase

Separation and Biomolecular Condensates. Cell 176(3): 419-434.

Alonso, J. C., P. P. Cardenas, H. Sanchez, J. Hejna, Y. Suzuki and K. Takeyasu (2013). Early steps of double-

strand break repair in Bacillus subtilis. DNA Repair (Amst) 12(3): 162-176.

Aniukwu, J., M. S. Glickman and S. Shuman (2008). The pathways and outcomes of mycobacterial NHEJ depend

on the structure of the broken DNA ends. Genes Dev 22(4): 512-527.

Anreiter, I., Q. Mir, J. T. Simpson, S. C. Janga and M. Soller (2020). New Twists in Detecting mRNA Modification

Dynamics. Trends Biotechnol.

Ansaldi, M., L. Theraulaz and V. Mejean (2004). TorI, a response regulator inhibitor of phage origin in Escherichia

coli. Proc Natl Acad Sci U S A 101(25): 9423-9428.

Antony, E. and T. M. Lohman (2019). Dynamics of E. coli single stranded DNA binding (SSB) protein-DNA

complexes. Semin Cell Dev Biol 86: 102-111.

Aravind, L. and E. V. Koonin (1998). Phosphoesterase domains associated with DNA polymerases of diverse

origins. Nucleic Acids Res 26(16): 3746-3752.

Aravind, L. and E. V. Koonin (2001). Prokaryotic homologs of the eukaryotic DNA-end-binding protein Ku, novel

domains in the Ku protein and prediction of a prokaryotic double-strand break repair system. Genome Res 11(8):

1365-1374.

Ayora, S., R. Missich, P. Mesa, R. Lurz, S. Yang, E. H. Egelman and J. C. Alonso (2002). Homologous-pairing

activity of the Bacillus subtilis bacteriophage SPP1 replication protein G35P. J Biol Chem 277(39): 35969-35979.

Banos, B., J. M. Lazaro, L. Villar, M. Salas and M. de Vega (2008a). Characterization of a Bacillus subtilis 64-

kDa DNA polymerase X potentially involved in DNA repair. J Mol Biol 384(5): 1019-1028.

Banos, B., J. M. Lazaro, L. Villar, M. Salas and M. de Vega (2008b). Editing of misaligned 3'-termini by an

intrinsic 3'-5' exonuclease activity residing in the PHP domain of a family X DNA polymerase. Nucleic Acids Res

36(18): 5736-5749.

Banos, B., L. Villar, M. Salas and M. de Vega (2010). Intrinsic apurinic/apyrimidinic (AP) endonuclease activity

enables Bacillus subtilis DNA polymerase X to recognize, incise, and further repair abasic sites. Proc Natl Acad

Sci U S A 107(45): 19219-19224.

84

Barajas-Ornelas Rdel, C., F. H. Ramirez-Guadiana, R. Juarez-Godinez, V. M. Ayala-Garcia, E. A. Robleto, R. E.

Yasbin and M. Pedraza-Reyes (2014). Error-prone processing of apurinic/apyrimidinic (AP) sites by PolX

underlies a novel mechanism that promotes adaptive mutagenesis in Bacillus subtilis. J Bacteriol 196(16): 3012-

3022.

Barbieri, I. and T. Kouzarides (2020). Role of RNA modifications in cancer. Nat Rev Cancer 20(6): 303-322.

Bentchikou, E., P. Servant, G. Coste and S. Sommer (2010). A major role of the RecFOR pathway in DNA double-

strand-break repair through ESDSA in Deinococcus radiodurans. PLoS Genet 6(1): e1000774.

Bertrand, C., A. Thibessard, C. Bruand, F. Lecointe and P. Leblond (2019). Bacterial NHEJ: a never ending story.

Mol Microbiol 111(5): 1139-1151.

Bhattacharyya, B., N. P. George, T. M. Thurmes, R. Zhou, N. Jani, S. R. Wessel, S. J. Sandler, T. Ha and J. L.

Keck (2014). Structural mechanisms of PriA-mediated DNA replication restart. Proc Natl Acad Sci U S A 111(4):

1373-1378.

Bhattacharyya, S., M. M. Soniat, D. Walker, S. Jang, I. J. Finkelstein and R. M. Harshey (2018). Phage Mu Gam

protein promotes NHEJ in concert with Escherichia coli ligase. Proc Natl Acad Sci U S A 115(50): E11614-

E11622.

Bhattarai, H., R. Gupta and M. S. Glickman (2014). DNA ligase C1 mediates the LigD-independent

nonhomologous end-joining pathway of Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol 196(19): 3366-3376.

Bianco, P. R., S. Pottinger, H. Y. Tan, T. Nguyenduc, K. Rex and U. Varshney (2017). The IDL of E. coli SSB

links ssDNA and protein binding by mediating protein-protein interactions. Protein Sci 26(2): 227-241.

Blasius, M., I. Shevelev, E. Jolivet, S. Sommer and U. Hubscher (2006). DNA polymerase X from Deinococcus

radiodurans possesses a structure-modulated 3'-->5' exonuclease activity involved in radioresistance. Mol

Microbiol 60(1): 165-176.

Blasius, M., S. Sommer and U. Hubscher (2008). Deinococcus radiodurans: what belongs to the survival kit? Crit

Rev Biochem Mol Biol 43(3): 221-238.

Boccaletto, P., M. A. Machnicka, E. Purta, P. Piatkowski, B. Baginski, T. K. Wirecki, V. de Crecy-Lagard, R.

Ross, P. A. Limbach, A. Kotter, M. Helm and J. M. Bujnicki (2018). MODOMICS: a database of RNA

modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Res 46(D1): D303-D307.

Bonacossa de Almeida, C., G. Coste, S. Sommer and A. Bailone (2002). Quantification of RecA protein in

Deinococcus radiodurans reveals involvement of RecA, but not LexA, in its regulation. Mol Genet Genomics

268(1): 28-41.

Bonilla, B., S. R. Hengel, M. K. Grundy and K. A. Bernstein (2020). RAD51 Gene Family Structure and Function.

Annu Rev Genet 54: 25-46.

Borges, A. L., A. R. Davidson and J. Bondy-Denomy (2017). The Discovery, Mechanisms, and Evolutionary

Impact of Anti-CRISPRs. Annu Rev Virol 4(1): 37-59.

Bouchard, J. D. and S. Moineau (2004). Lactococcal phage genes involved in sensitivity to AbiK and their relation

to single-strand annealing proteins. J Bacteriol 186(11): 3649-3652.

Boudeau, J., A. L. Glasser, E. Masseret, B. Joly and A. Darfeuille-Michaud (1999). Invasive ability of an

Escherichia coli strain isolated from the ileal mucosa of a patient with Crohn's disease. Infect Immun 67(9): 4499-

4509.

Bouthier de la Tour, C., S. Boisnard, C. Norais, M. Toueille, E. Bentchikou, F. Vannier, M. M. Cox, S. Sommer

and P. Servant (2011). The deinococcal DdrB protein is involved in an early step of DNA double strand break

repair and in plasmid transformation through its single-strand annealing activity. DNA Repair (Amst) 10(12):

1223-1231.

85

Brewster, J. L. and G. Tolun (2020). Half a century of bacteriophage lambda recombinase: In vitro studies of

lambda exonuclease and Red-beta annealase. IUBMB Life 72(8): 1622-1633.

Brezellec, P., I. Vallet-Gely, C. Possoz, S. Quevillon-Cheruel and J. L. Ferat (2016). DciA is an ancestral

replicative helicase operator essential for bacterial replication initiation. Nat Commun 7: 13271.

Brissett, N. C. and A. J. Doherty (2009). Repairing DNA double-strand breaks by the prokaryotic non-homologous

end-joining pathway. Biochem Soc Trans 37(Pt 3): 539-545.

Bruand, C., S. D. Ehrlich and L. Janniere (1995). Primosome assembly site in Bacillus subtilis. EMBO J 14(11):

2642-2650.

Bruand, C., M. Velten, S. McGovern, S. Marsin, C. Serena, S. D. Ehrlich and P. Polard (2005). Functional interplay

between the Bacillus subtilis DnaD and DnaB proteins essential for initiation and re-initiation of DNA replication.

Mol Microbiol 55(4): 1138-1150.

Buescher, J. M., W. Liebermeister, M. Jules, M. Uhr, J. Muntel, E. Botella, B. Hessling, R. J. Kleijn, L. Le Chat,

F. Lecointe, U. Mader, P. Nicolas, S. Piersma, F. Rugheimer, D. Becher, P. Bessieres, E. Bidnenko, E. L. Denham,

E. Dervyn, K. M. Devine, G. Doherty, S. Drulhe, L. Felicori, M. J. Fogg, A. Goelzer, A. Hansen, C. R. Harwood,

M. Hecker, S. Hubner, C. Hultschig, H. Jarmer, E. Klipp, A. Leduc, P. Lewis, F. Molina, P. Noirot, S. Peres, N.

Pigeonneau, S. Pohl, S. Rasmussen, B. Rinn, M. Schaffer, J. Schnidder, B. Schwikowski, J. M. Van Dijl, P. Veiga,

S. Walsh, A. J. Wilkinson, J. Stelling, S. Aymerich and U. Sauer (2012). Global network reorganization during

dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science 335(6072): 1099-1103.

Cadman, C. J. and P. McGlynn (2004). PriA helicase and SSB interact physically and functionally. Nucleic Acids

Res 32(21): 6378-6387.

Caldas, T., E. Binet, P. Bouloc, A. Costa, J. Desgres and G. Richarme (2000). The FtsJ/RrmJ heat shock protein

of Escherichia coli is a 23 S ribosomal RNA methyltransferase. J Biol Chem 275(22): 16414-16419.

Caldwell, B. J., E. Zakharova, G. T. Filsinger, T. M. Wannier, J. P. Hempfling, L. Chun-Der, D. Pei, G. M. Church

and C. E. Bell (2019). Crystal structure of the Redbeta C-terminal domain in complex with lambda Exonuclease

reveals an unexpected homology with lambda Orf and an interaction with Escherichia coli single stranded DNA

binding protein. Nucleic Acids Res 47(4): 1950-1963.

Calsou, P., P. Frit, O. Humbert, C. Muller, D. J. Chen and B. Salles (1999). The DNA-dependent protein kinase

catalytic activity regulates DNA end processing by means of Ku entry into DNA. J Biol Chem 274(12): 7848-

7856.

Carbone, M. L., M. Solinas, S. Sora and L. Panzeri (1991). A gene tightly linked to CEN6 is important for growth

of Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet 19(1): 1-8.

Carrasco, B., E. M. Seco, M. Lopez-Sanz, J. C. Alonso and S. Ayora (2018). Bacillus subtilis RarA modulates

replication restart. Nucleic Acids Res 46(14): 7206-7220.

Carvalho, F. A., N. Barnich, A. Sivignon, C. Darcha, C. H. Chan, C. P. Stanners and A. Darfeuille-Michaud (2009).

Crohn's disease adherent-invasive Escherichia coli colonize and induce strong gut inflammation in transgenic mice

expressing human CEACAM. J Exp Med 206(10): 2179-2189.

Casjens, S. (2003). Prophages and bacterial genomics: what have we learned so far? Mol Microbiol 49(2): 277-

300.

Chen, J., N. Quiles-Puchalt, Y. N. Chiang, R. Bacigalupe, A. Fillol-Salom, M. S. J. Chee, J. R. Fitzgerald and J.

R. Penades (2018). Genome hypermobility by lateral transduction. Science 362(6411): 207-212.

Chujo, T. and K. Tomizawa (2021). Human transfer RNA modopathies: diseases caused by aberrations in transfer

RNA modifications. FEBS J.

Confalonieri, F. and S. Sommer (2011). Bacterial and archaeal resistance to ionizing radiation. Journal of Physics:

86

Conference Series 261: 012005.

Costes, A., F. Lecointe, S. McGovern, S. Quevillon-Cheruel and P. Polard (2010). The C-terminal domain of the

bacterial SSB protein acts as a DNA maintenance hub at active chromosome replication forks. PLoS Genet 6(12):

e1001238.

Court, D. L., J. A. Sawitzke and L. C. Thomason (2002). Genetic engineering using homologous recombination.

Annu Rev Genet 36: 361-388.

Cox, M. M., M. F. Goodman, K. N. Kreuzer, D. J. Sherratt, S. J. Sandler and K. J. Marians (2000). The importance

of repairing stalled replication forks. Nature 404(6773): 37-41.

Culotta, V. C. and M. J. Daly (2013). Manganese complexes: diverse metabolic routes to oxidative stress resistance

in prokaryotes and yeast. Antioxid Redox Signal 19(9): 933-944.

Cumby, N., A. R. Davidson and K. L. Maxwell (2012). The moron comes of age. Bacteriophage 2(4): 225-228.

Curth, U., J. Genschel, C. Urbanke and J. Greipel (1996). In vitro and in vivo function of the C-terminus of

Escherichia coli single-stranded DNA binding protein. Nucleic Acids Res 24(14): 2706-2711.

d'Adda di Fagagna, F., G. R. Weller, A. J. Doherty and S. P. Jackson (2003). The Gam protein of bacteriophage

Mu is an orthologue of eukaryotic Ku. EMBO Rep 4(1): 47-52.

Daly, M. J. (2012). Death by protein damage in irradiated cells. DNA Repair (Amst) 11(1): 12-21.

Daly, M. J., E. K. Gaidamakova, V. Y. Matrosova, A. Vasilenko, M. Zhai, A. Venkateswaran, M. Hess, M. V.

Omelchenko, H. M. Kostandarithes, K. S. Makarova, L. P. Wackett, J. K. Fredrickson and D. Ghosal (2004).

Accumulation of Mn(II) in Deinococcus radiodurans facilitates gamma-radiation resistance. Science 306(5698):

1025-1028.

Daly, M. J. and K. W. Minton (1996). An alternative pathway of recombination of chromosomal fragments

precedes recA-dependent recombination in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. J Bacteriol

178(15): 4461-4471.

Daly, M. J., L. Ouyang, P. Fuchs and K. W. Minton (1994). In vivo damage and recA-dependent repair of plasmid

and chromosomal DNA in the radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans. J Bacteriol 176(12): 3508-

3517.

de Crecy-Lagard, V., P. Boccaletto, C. G. Mangleburg, P. Sharma, T. M. Lowe, S. A. Leidel and J. M. Bujnicki

(2019). Matching tRNA modifications in humans to their known and predicted enzymes. Nucleic Acids Res 47(5):

2143-2159.

de Crecy-Lagard, V. and M. Jaroch (2020). Functions of Bacterial tRNA Modifications: From Ubiquity to

Diversity. Trends Microbiol.

de Ory, A., C. Carabana and M. de Vega (2019). Bacterial Ligase D preternary-precatalytic complex performs

efficient abasic sites processing at double strand breaks during nonhomologous end joining. Nucleic Acids Res

47(10): 5276-5292.

de Ory, A., K. Nagler, B. Carrasco, M. Raguse, O. Zafra, R. Moeller and M. de Vega (2016). Identification of a

conserved 5'-dRP lyase activity in bacterial DNA repair ligase D and its potential role in base excision repair.

Nucleic Acids Res 44(4): 1833-1844.

de Ory, A., O. Zafra and M. de Vega (2014). Efficient processing of abasic sites by bacterial nonhomologous end-

joining Ku proteins. Nucleic Acids Res 42(21): 13082-13095.

De Paepe, M., G. Hutinet, O. Son, J. Amarir-Bouhram, S. Schbath and M. A. Petit (2014). Temperate phages

acquire DNA from defective prophages by relaxed homologous recombination: the role of Rad52-like

recombinases. PLoS Genet 10(3): e1004181.

87

de Paiva, A. R. B., D. S. Lynch, U. S. Melo, L. T. Lucato, F. Freua, B. D. R. de Assis, I. Barcelos, C. Listik, D. de

Castro Dos Santos, L. I. Macedo-Souza, H. Houlden and F. Kok (2019). PUS3 mutations are associated with

intellectual disability, leukoencephalopathy, and nephropathy. Neurol Genet 5(1): e306.

De Sordi, L., V. Khanna and L. Debarbieux (2017). The Gut Microbiota Facilitates Drifts in the Genetic Diversity

and Infectivity of Bacterial Viruses. Cell Host Microbe 22(6): 801-808 e803.

de Sousa, J. A. M., E. Pfeifer, M. Touchon and E. P. C. Rocha (2021). Causes and consequences of bacteriophage

diversification via genetic exchanges across lifestyles and bacterial taxa. Mol Biol Evol.

de Vega, M. (2013). The minimal Bacillus subtilis nonhomologous end joining repair machinery. PLoS One 8(5):

e64232.

de Vries, E., W. van Driel, W. G. Bergsma, A. C. Arnberg and P. C. van der Vliet (1989). HeLa nuclear protein

recognizing DNA termini and translocating on DNA forming a regular DNA-multimeric protein complex. J Mol

Biol 208(1): 65-78.

Delattre, H., O. Souiai, K. Fagoonee, R. Guerois and M. A. Petit (2016). Phagonaute: A web-based interface for

phage synteny browsing and protein function prediction. Virology 496: 42-50.

Della, M., P. L. Palmbos, H. M. Tseng, L. M. Tonkin, J. M. Daley, L. M. Topper, R. S. Pitcher, A. E. Tomkinson,

T. E. Wilson and A. J. Doherty (2004). Mycobacterial Ku and ligase proteins constitute a two-component NHEJ

repair machine. Science 306(5696): 683-685.

Delumeau, O., F. Lecointe, J. Muntel, A. Guillot, E. Guedon, V. Monnet, M. Hecker, D. Becher, P. Polard and P.

Noirot (2011). The dynamic protein partnership of RNA polymerase in Bacillus subtilis. Proteomics 11(15): 2992-

3001.

Demarre, G., V. Prudent, H. Schenk, E. Rousseau, M. A. Bringer, N. Barnich, G. Tran Van Nhieu, S. Rimsky, S.

De Monte and O. Espeli (2019). The Crohn's disease-associated Escherichia coli strain LF82 relies on SOS and

stringent responses to survive, multiply and tolerate antibiotics within macrophages. PLoS Pathog 15(11):

e1008123.

Devigne, A., S. Mersaoui, C. Bouthier-de-la-Tour, S. Sommer and P. Servant (2013). The PprA protein is required

for accurate cell division of gamma-irradiated Deinococcus radiodurans bacteria. DNA Repair (Amst) 12(4): 265-

272.

Dion, M. B., F. Oechslin and S. Moineau (2020). Phage diversity, genomics and phylogeny. Nat Rev Microbiol

18(3): 125-138.

Doherty, A. J., S. P. Jackson and G. R. Weller (2001). Identification of bacterial homologues of the Ku DNA repair

proteins. FEBS Lett 500(3): 186-188.

Downs, J. A. and S. P. Jackson (2004). A means to a DNA end: the many roles of Ku. Nat Rev Mol Cell Biol 5(5):

367-378.

Dupuy, P., B. Gourion, L. Sauviac and C. Bruand (2017). DNA double-strand break repair is involved in

desiccation resistance of Sinorhizobium meliloti, but is not essential for its symbiotic interaction with Medicago

truncatula. Microbiology (Reading) 163(3): 333-342.

Dupuy, P., L. Sauviac and C. Bruand (2019). Stress-inducible NHEJ in bacteria: function in DNA repair and

acquisition of heterologous DNA. Nucleic Acids Res 47(3): 1335-1349.

Earl, A. M., M. M. Mohundro, I. S. Mian and J. R. Battista (2002). The IrrE protein of Deinococcus radiodurans

R1 is a novel regulator of recA expression. J Bacteriol 184(22): 6216-6224.

Edwards, A. M., M. A. Addo and P. C. Dos Santos (2020). Extracurricular Functions of tRNA Modifications in

Microorganisms. Genes (Basel) 11(8).

Ellis, H. M., D. Yu, T. DiTizio and D. L. Court (2001). High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of

88

chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A 98(12): 6742-6746.

Ertl, H. A., D. P. Russo, N. Srivastava, J. T. Brooks, T. N. Dao and J. R. LaRocque (2017). The Role of Blm

Helicase in Homologous Recombination, Gene Conversion Tract Length, and Recombination Between Diverged

Sequences in Drosophilamelanogaster. Genetics 207(3): 923-933.

Filsinger, G. T., T. M. Wannier, F. B. Pedersen, I. D. Lutz, J. Zhang, D. A. Stork, A. Debnath, K. Gozzi, H.

Kuchwara, V. Volf, S. Wang, X. Rios, C. J. Gregg, M. J. Lajoie, S. L. Shipman, J. Aach, M. T. Laub and G. M.

Church (2021). Characterizing the portability of phage-encoded homologous recombination proteins. Nat Chem

Biol 17(4): 394-402.

Flory, J. and C. M. Radding (1982). Visualization of recA protein and its association with DNA: a priming effect

of single-strand-binding protein. Cell 28(4): 747-756.

Freude, K., K. Hoffmann, L. R. Jensen, M. B. Delatycki, V. des Portes, B. Moser, B. Hamel, H. van Bokhoven,

C. Moraine, J. P. Fryns, J. Chelly, J. Gecz, S. Lenzner, V. M. Kalscheuer and H. H. Ropers (2004). Mutations in

the FTSJ1 gene coding for a novel S-adenosylmethionine-binding protein cause nonsyndromic X-linked mental

retardation. Am J Hum Genet 75(2): 305-309.

Frit, P., V. Ropars, M. Modesti, J. B. Charbonnier and P. Calsou (2019). Plugged into the Ku-DNA hub: The NHEJ

network. Prog Biophys Mol Biol 147: 62-76.

Gajewski, S., M. R. Webb, V. Galkin, E. H. Egelman, K. N. Kreuzer and S. W. White (2011). Crystal structure of

the phage T4 recombinase UvsX and its functional interaction with the T4 SF2 helicase UvsW. J Mol Biol 405(1):

65-76.

George, J. W., B. A. Stohr, D. J. Tomso and K. N. Kreuzer (2001). The tight linkage between DNA replication

and double-strand break repair in bacteriophage T4. Proc Natl Acad Sci U S A 98(15): 8290-8297.

Gevers, D., S. Kugathasan, L. A. Denson, Y. Vazquez-Baeza, W. Van Treuren, B. Ren, E. Schwager, D. Knights,

S. J. Song, M. Yassour, X. C. Morgan, A. D. Kostic, C. Luo, A. Gonzalez, D. McDonald, Y. Haberman, T. Walters,

S. Baker, J. Rosh, M. Stephens, M. Heyman, J. Markowitz, R. Baldassano, A. Griffiths, F. Sylvester, D. Mack, S.

Kim, W. Crandall, J. Hyams, C. Huttenhower, R. Knight and R. J. Xavier (2014). The treatment-naive microbiome

in new-onset Crohn's disease. Cell Host Microbe 15(3): 382-392.

Glasser, A. L., J. Boudeau, N. Barnich, M. H. Perruchot, J. F. Colombel and A. Darfeuille-Michaud (2001).

Adherent invasive Escherichia coli strains from patients with Crohn's disease survive and replicate within

macrophages without inducing host cell death. Infect Immun 69(9): 5529-5537.

Gong, C., P. Bongiorno, A. Martins, N. C. Stephanou, H. Zhu, S. Shuman and M. S. Glickman (2005). Mechanism

of nonhomologous end-joining in mycobacteria: a low-fidelity repair system driven by Ku, ligase D and ligase C.

Nat Struct Mol Biol 12(4): 304-312.

Gong, C., A. Martins, P. Bongiorno, M. Glickman and S. Shuman (2004). Biochemical and genetic analysis of the

four DNA ligases of mycobacteria. J Biol Chem 279(20): 20594-20606.

Goosen, T., M. Giphart-Gassler and P. Van de Putte (1982). Bacteriophage Mu DNA replication is stimulated by

non-essential early functions. Mol Gen Genet 186(1): 135-139.

Graille, M., L. Cladiere, D. Durand, F. Lecointe, D. Gadelle, S. Quevillon-Cheruel, P. Vachette, P. Forterre and

H. van Tilbeurgh (2008). Crystal structure of an intact type II DNA topoisomerase: insights into DNA transfer

mechanisms. Structure 16(3): 360-370.

Grosshans, H., F. Lecointe, H. Grosjean, E. Hurt and G. Simos (2001). Pus1p-dependent tRNA

pseudouridinylation becomes essential when tRNA biogenesis is compromised in yeast. J Biol Chem 276(49):

46333-46339.

Gu, J. and M. R. Lieber (2008). Mechanistic flexibility as a conserved theme across 3 billion years of

nonhomologous DNA end-joining. Genes Dev 22(4): 411-415.

89

Gupta, R., D. Barkan, G. Redelman-Sidi, S. Shuman and M. S. Glickman (2011). Mycobacteria exploit three

genetically distinct DNA double-strand break repair pathways. Mol Microbiol 79(2): 316-330.

Guy, M. P. and E. M. Phizicky (2014). Two-subunit enzymes involved in eukaryotic post-transcriptional tRNA

modification. RNA Biol 11(12): 1608-1618.

Guy, M. P., B. M. Podyma, M. A. Preston, H. H. Shaheen, K. L. Krivos, P. A. Limbach, A. K. Hopper and E. M.

Phizicky (2012). Yeast Trm7 interacts with distinct proteins for critical modifications of the tRNAPhe anticodon

loop. RNA 18(10): 1921-1933.

Hall, S. D., M. F. Kane and R. D. Kolodner (1993). Identification and characterization of the Escherichia coli RecT

protein, a protein encoded by the recE region that promotes renaturation of homologous single-stranded DNA. J

Bacteriol 175(1): 277-287.

Han, L., M. P. Guy, Y. Kon and E. M. Phizicky (2018). Lack of 2'-O-methylation in the tRNA anticodon loop of

two phylogenetically distant yeast species activates the general amino acid control pathway. PLoS Genet 14(3):

e1007288.

Han, L., Y. Kon and E. M. Phizicky (2015). Functional importance of Psi38 and Psi39 in distinct tRNAs, amplified

for tRNAGln(UUG) by unexpected temperature sensitivity of the s2U modification in yeast. RNA 21(2): 188-201.

Hansen, F. G. and T. Atlung (2018). The DnaA Tale. Front Microbiol 9: 319.

Hansen, M. T. (1978). Multiplicity of genome equivalents in the radiation-resistant bacterium Micrococcus

radiodurans. J Bacteriol 134(1): 71-75.

Harami, G. M., Z. J. Kovacs, R. Pancsa, J. Palinkas, V. Barath, K. Tarnok, A. Malnasi-Csizmadia and M. Kovacs

(2020). Phase separation by ssDNA binding protein controlled via protein-protein and protein-DNA interactions.

Proc Natl Acad Sci U S A 117(42): 26206-26217.

Harms, A., C. Fino, M. A. Sorensen, S. Semsey and K. Gerdes (2017). Prophages and Growth Dynamics Confound

Experimental Results with Antibiotic-Tolerant Persister Cells. mBio 8(6).

Harms, A., E. Maisonneuve and K. Gerdes (2016). Mechanisms of bacterial persistence during stress and antibiotic

exposure. Science 354(6318).

Harris, D. R., M. Tanaka, S. V. Saveliev, E. Jolivet, A. M. Earl, M. M. Cox and J. R. Battista (2004). Preserving

genome integrity: the DdrA protein of Deinococcus radiodurans R1. PLoS Biol 2(10): e304.

Heller, R. C. and K. J. Marians (2006). Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading

strand. Nature 439(7076): 557-562.

Helm, M. and Y. Motorin (2017). Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nat

Rev Genet 18(5): 275-291.

Hendrix, R. W., J. G. Lawrence, G. F. Hatfull and S. Casjens (2000). The origins and ongoing evolution of viruses.

Trends Microbiol 8(11): 504-508.

Hendrix, R. W., M. C. Smith, R. N. Burns, M. E. Ford and G. F. Hatfull (1999). Evolutionary relationships among

diverse bacteriophages and prophages: all the world's a phage. Proc Natl Acad Sci U S A 96(5): 2192-2197.

Hernandez, A. J. and C. C. Richardson (2019). Gp2.5, the multifunctional bacteriophage T7 single-stranded DNA

binding protein. Semin Cell Dev Biol 86: 92-101.

Hoff, G., C. Bertrand, E. Piotrowski, A. Thibessard and P. Leblond (2018). Genome plasticity is governed by

double strand break DNA repair in Streptomyces. Sci Rep 8(1): 5272.

Hoff, G., C. Bertrand, L. Zhang, E. Piotrowski, L. Chipot, C. Bontemps, F. Confalonieri, S. McGovern, F.

Lecointe, A. Thibessard and P. Leblond (2016). Multiple and Variable NHEJ-Like Genes Are Involved in

Resistance to DNA Damage in Streptomyces ambofaciens. Front Microbiol 7: 1901.

90

Hoitsma, N. M., A. M. Whitaker, M. A. Schaich, M. R. Smith, M. S. Fairlamb and B. D. Freudenthal (2020).

Structure and function relationships in mammalian DNA polymerases. Cell Mol Life Sci 77(1): 35-59.

Hollis, T., J. M. Stattel, D. S. Walther, C. C. Richardson and T. Ellenberger (2001). Structure of the gene 2.5

protein, a single-stranded DNA binding protein encoded by bacteriophage T7. Proc Natl Acad Sci U S A 98(17):

9557-9562.

Hopper, A. K. (2013). Transfer RNA post-transcriptional processing, turnover, and subcellular dynamics in the

yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics 194(1): 43-67.

Hua, Y., I. Narumi, G. Gao, B. Tian, K. Satoh, S. Kitayama and B. Shen (2003). PprI: a general switch responsible

for extreme radioresistance of Deinococcus radiodurans. Biochem Biophys Res Commun 306(2): 354-360.

Hutinet, G., A. Besle, O. Son, S. McGovern, R. Guerois, M. A. Petit, F. Ochsenbein and F. Lecointe (2018). Sak4

of Phage HK620 Is a RecA Remote Homolog With Single-Strand Annealing Activity Stimulated by Its Cognate

SSB Protein. Front Microbiol 9: 743.

Iyer, L. M., E. V. Koonin and L. Aravind (2002). Classification and evolutionary history of the single-strand

annealing proteins, RecT, Redbeta, ERF and RAD52. BMC Genomics 3: 8.

Jain, K., E. A. Wood, Z. J. Romero and M. M. Cox (2020). RecA-Independent Recombination: Dependence on

the Escherichia coli RarA protein. Mol Microbiol.

Jameson, K. H. and A. J. Wilkinson (2017). Control of Initiation of DNA Replication in Bacillus subtilis and

Escherichia coli. Genes (Basel) 8(1).

Jolivet, E., F. Lecointe, G. Coste, K. Satoh, I. Narumi, A. Bailone and S. Sommer (2006). Limited concentration

of RecA delays DNA double-strand break repair in Deinococcus radiodurans R1. Mol Microbiol 59(1): 338-349.

Jones, J. M. and H. Nakai (1999). Duplex opening by primosome protein PriA for replisome assembly on a

recombination intermediate. J Mol Biol 289(3): 503-516.

Jones, J. M. and H. Nakai (2001). Escherichia coli PriA helicase: fork binding orients the helicase to unwind the

lagging strand side of arrested replication forks. J Mol Biol 312(5): 935-947.

Juhala, R. J., M. E. Ford, R. L. Duda, A. Youlton, G. F. Hatfull and R. W. Hendrix (2000). Genomic sequences of

bacteriophages HK97 and HK022: pervasive genetic mosaicism in the lambdoid bacteriophages. J Mol Biol

299(1): 27-51.

Juhling, F., M. Morl, R. K. Hartmann, M. Sprinzl, P. F. Stadler and J. Putz (2009). tRNAdb 2009: compilation of

tRNA sequences and tRNA genes. Nucleic Acids Res 37(Database issue): D159-162.

Karu, A. E., Y. Sakaki, H. Echols and S. Linn (1975). The gamma protein specified by bacteriophage gamma.

Structure and inhibitory activity for the recBC enzyme of Escherichia coli. J Biol Chem 250(18): 7377-7387.

Khairnar, N. P. and H. S. Misra (2009). DNA polymerase X from Deinococcus radiodurans implicated in bacterial

tolerance to DNA damage is characterized as a short patch base excision repair polymerase. Microbiology

(Reading) 155(Pt 9): 3005-3014.

Kim, Y. T. and C. C. Richardson (1994). Acidic carboxyl-terminal domain of gene 2.5 protein of bacteriophage

T7 is essential for protein-protein interactions. J Biol Chem 269(7): 5270-5278.

Klassen, R. and R. Schaffrath (2017). Role of Pseudouridine Formation by Deg1 for Functionality of Two

Glutamine Isoacceptor tRNAs. Biomolecules 7(1).

Kmiec, E. and W. K. Holloman (1981). Beta protein of bacteriophage lambda promotes renaturation of DNA. J

Biol Chem 256(24): 12636-12639.

Kobayashi, H., L. A. Simmons, D. S. Yuan, W. J. Broughton and G. C. Walker (2008). Multiple Ku orthologues

91

mediate DNA non-homologous end-joining in the free-living form and during chronic infection of Sinorhizobium

meliloti. Mol Microbiol 67(2): 350-363.

Kowalczykowski, S. C. (2015). An Overview of the Molecular Mechanisms of Recombinational DNA Repair.

Cold Spring Harb Perspect Biol 7(11).

Kozlov, A. G., M. M. Cox and T. M. Lohman (2010). Regulation of single-stranded DNA binding by the C termini

of Escherichia coli single-stranded DNA-binding (SSB) protein. J Biol Chem 285(22): 17246-17252.

Kozlov, A. G., E. Weiland, A. Mittal, V. Waldman, E. Antony, N. Fazio, R. V. Pappu and T. M. Lohman (2015).

Intrinsically disordered C-terminal tails of E. coli single-stranded DNA binding protein regulate cooperative

binding to single-stranded DNA. J Mol Biol 427(4): 763-774.

Kragelund, B. B., E. Weterings, R. Hartmann-Petersen and G. Keijzers (2016). The Ku70/80 ring in Non-

Homologous End-Joining: easy to slip on, hard to remove. Front Biosci (Landmark Ed) 21: 514-527.

Krisko, A. and M. Radman (2013). Biology of extreme radiation resistance: the way of Deinococcus radiodurans.

Cold Spring Harb Perspect Biol 5(7).

Krogan, N. J., G. Cagney, H. Yu, G. Zhong, X. Guo, A. Ignatchenko, J. Li, S. Pu, N. Datta, A. P. Tikuisis, T.

Punna, J. M. Peregrin-Alvarez, M. Shales, X. Zhang, M. Davey, M. D. Robinson, A. Paccanaro, J. E. Bray, A.

Sheung, B. Beattie, D. P. Richards, V. Canadien, A. Lalev, F. Mena, P. Wong, A. Starostine, M. M. Canete, J.

Vlasblom, S. Wu, C. Orsi, S. R. Collins, S. Chandran, R. Haw, J. J. Rilstone, K. Gandi, N. J. Thompson, G. Musso,

P. St Onge, S. Ghanny, M. H. Lam, G. Butland, A. M. Altaf-Ul, S. Kanaya, A. Shilatifard, E. O'Shea, J. S.

Weissman, C. J. Ingles, T. R. Hughes, J. Parkinson, M. Gerstein, S. J. Wodak, A. Emili and J. F. Greenblatt (2006).

Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature 440(7084): 637-643.

Kunkel, B., R. Losick and P. Stragier (1990). The Bacillus subtilis gene for the development transcription factor

sigma K is generated by excision of a dispensable DNA element containing a sporulation recombinase gene. Genes

Dev 4(4): 525-535.

Kushwaha, A. K. and A. Grove (2013a). C-terminal low-complexity sequence repeats of Mycobacterium

smegmatis Ku modulate DNA binding. Biosci Rep 33(1): 175-184.

Kushwaha, A. K. and A. Grove (2013b). Mycobacterium smegmatis Ku binds DNA without free ends. Biochem

J 456(2): 275-282.

Lang, A. S., O. Zhaxybayeva and J. T. Beatty (2012). Gene transfer agents: phage-like elements of genetic

exchange. Nat Rev Microbiol 10(7): 472-482.

Lecointe, F., G. Coste, S. Sommer and A. Bailone (2004a). Vectors for regulated gene expression in the

radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. Gene 336(1): 25-35.

Lecointe, F., C. Serena, M. Velten, A. Costes, S. McGovern, J. C. Meile, J. Errington, S. D. Ehrlich, P. Noirot and

P. Polard (2007). Anticipating chromosomal replication fork arrest: SSB targets repair DNA helicases to active

forks. EMBO J 26(19): 4239-4251.

Lecointe, F., I. V. Shevelev, A. Bailone, S. Sommer and U. Hubscher (2004b). Involvement of an X family DNA

polymerase in double-stranded break repair in the radioresistant organism Deinococcus radiodurans. Mol

Microbiol 53(6): 1721-1730.

Lecointe, F., G. Simos, A. Sauer, E. C. Hurt, Y. Motorin and H. Grosjean (1998). Characterization of yeast protein

Deg1 as pseudouridine synthase (Pus3) catalyzing the formation of psi 38 and psi 39 in tRNA anticodon loop. J

Biol Chem 273(3): 1316-1323.

Lemon, K. P. and A. D. Grossman (1998). Localization of bacterial DNA polymerase: evidence for a factory model

of replication. Science 282(5393): 1516-1519.

Lenhart, J. S., J. W. Schroeder, B. W. Walsh and L. A. Simmons (2012). DNA repair and genome maintenance in

Bacillus subtilis. Microbiol Mol Biol Rev 76(3): 530-564.

92

Leslie, M. (2021). Separation anxiety. Science 371(6527): 336-338.

Leulliot, N., L. Cladiere, F. Lecointe, D. Durand, U. Hubscher and H. van Tilbeurgh (2009). The family X DNA

polymerase from Deinococcus radiodurans adopts a non-standard extended conformation. J Biol Chem 284(18):

11992-11999.

Levin-Zaidman, S., J. Englander, E. Shimoni, A. K. Sharma, K. W. Minton and A. Minsky (2003). Ringlike

structure of the Deinococcus radiodurans genome: a key to radioresistance? Science 299(5604): 254-256.

Li, J., Y. N. Wang, B. S. Xu, Y. P. Liu, M. Zhou, T. Long, H. Li, H. Dong, Y. Nie, P. R. Chen, E. D. Wang and

R. J. Liu (2020). Intellectual disability-associated gene ftsj1 is responsible for 2'-O-methylation of specific tRNAs.

EMBO Rep: e50095.

Li, X. T., L. C. Thomason, J. A. Sawitzke, N. Costantino and D. L. Court (2013). Bacterial DNA polymerases

participate in oligonucleotide recombination. Mol Microbiol 88(5): 906-920.

Li, Y., Z. Chen, L. A. Matthews, L. A. Simmons and J. S. Biteen (2019). Dynamic Exchange of Two Essential

DNA Polymerases during Replication and after Fork Arrest. Biophys J 116(4): 684-693.

Li, Z., J. Wen, Y. Lin, S. Wang, P. Xue, Z. Zhang, Y. Zhou, X. Wang, L. Sui, L. J. Bi and X. E. Zhang (2011). A

Sir2-like protein participates in mycobacterial NHEJ. PLoS One 6(5): e20045.

Lim, S., J. H. Jung, L. Blanchard and A. de Groot (2019). Conservation and diversity of radiation and oxidative

stress resistance mechanisms in Deinococcus species. FEMS Microbiol Rev 43(1): 19-52.

Liu, J. and S. W. Morrical (2010). Assembly and dynamics of the bacteriophage T4 homologous recombination

machinery. Virol J 7: 357.

Liu, Y., J. Zhou, M. V. Omelchenko, A. S. Beliaev, A. Venkateswaran, J. Stair, L. Wu, D. K. Thompson, D. Xu,

I. B. Rogozin, E. K. Gaidamakova, M. Zhai, K. S. Makarova, E. V. Koonin and M. J. Daly (2003). Transcriptome

dynamics of Deinococcus radiodurans recovering from ionizing radiation. Proc Natl Acad Sci U S A 100(7): 4191-

4196.

Lopes, A., J. Amarir-Bouhram, G. Faure, M. A. Petit and R. Guerois (2010). Detection of novel recombinases in

bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res 38(12): 3952-

3962.

Lwoff, A. (1953). Lysogeny. Bacteriol Rev 17(4): 269-337.

Makarova, K. S., L. Aravind, Y. I. Wolf, R. L. Tatusov, K. W. Minton, E. V. Koonin and M. J. Daly (2001).

Genome of the extremely radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans viewed from the perspective of

comparative genomics. Microbiol Mol Biol Rev 65(1): 44-79.

Marians, K. J. (1992). Prokaryotic DNA replication. Annu Rev Biochem 61: 673-719.

Marians, K. J. (2018). Lesion Bypass and the Reactivation of Stalled Replication Forks. Annu Rev Biochem 87:

217-238.

Marintcheva, B., A. Marintchev, G. Wagner and C. C. Richardson (2008). Acidic C-terminal tail of the ssDNA-

binding protein of bacteriophage T7 and ssDNA compete for the same binding surface. Proc Natl Acad Sci U S A

105(6): 1855-1860.

Markillie, L. M., S. M. Varnum, P. Hradecky and K. K. Wong (1999). Targeted mutagenesis by duplication

insertion in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans: radiation sensitivities of catalase (katA) and

superoxide dismutase (sodA) mutants. J Bacteriol 181(2): 666-669.

Marsin, S., S. McGovern, S. D. Ehrlich, C. Bruand and P. Polard (2001). Early steps of Bacillus subtilis primosome

assembly. J Biol Chem 276(49): 45818-45825.

93

Martinsohn, J. T., M. Radman and M. A. Petit (2008). The lambda red proteins promote efficient recombination

between diverged sequences: implications for bacteriophage genome mosaicism. PLoS Genet 4(5): e1000065.

Massenet, S., Y. Motorin, D. L. Lafontaine, E. C. Hurt, H. Grosjean and C. Branlant (1999). Pseudouridine

mapping in the Saccharomyces cerevisiae spliceosomal U small nuclear RNAs (snRNAs) reveals that

pseudouridine synthase pus1p exhibits a dual substrate specificity for U2 snRNA and tRNA. Mol Cell Biol 19(3):

2142-2154.

Mavrich, T. N. and G. F. Hatfull (2017). Bacteriophage evolution differs by host, lifestyle and genome. Nat

Microbiol 2: 17112.

Maxwell, K. L., P. Reed, R. G. Zhang, S. Beasley, A. R. Walmsley, F. A. Curtis, A. Joachimiak, A. M. Edwards

and G. J. Sharples (2005). Functional similarities between phage lambda Orf and Escherichia coli RecFOR in

initiation of genetic exchange. Proc Natl Acad Sci U S A 102(32): 11260-11265.

McCown, P. J., A. Ruszkowska, C. N. Kunkler, K. Breger, J. P. Hulewicz, M. C. Wang, N. A. Springer and J. A.

Brown (2020). Naturally occurring modified ribonucleosides. Wiley Interdiscip Rev RNA 11(5): e1595.

McGovern, S., S. Baconnais, P. Roblin, P. Nicolas, P. Drevet, H. Simonson, O. Pietrement, J. B. Charbonnier, E.

Le Cam, P. Noirot and F. Lecointe (2016). C-terminal region of bacterial Ku controls DNA bridging, DNA

threading and recruitment of DNA ligase D for double strand breaks repair. Nucleic Acids Res 44(10): 4785-4806

Meile, J. C., L. J. Wu, S. D. Ehrlich, J. Errington and P. Noirot (2006). Systematic localisation of proteins fused

to the green fluorescent protein in Bacillus subtilis: identification of new proteins at the DNA replication factory.

Proteomics 6(7): 2135-2146.

Menouni, R., G. Hutinet, M. A. Petit and M. Ansaldi (2015). Bacterial genome remodeling through bacteriophage

recombination. FEMS Microbiol Lett 362(1): 1-10.

Michel, B. and S. J. Sandler (2017). Replication Restart in Bacteria. J Bacteriol 199(13).

Miquel, S., E. Peyretaillade, L. Claret, A. de Vallee, C. Dossat, B. Vacherie, H. Zineb el, B. Segurens, V. Barbe,

P. Sauvanet, C. Neut, J. F. Colombel, C. Medigue, F. J. Mojica, P. Peyret, R. Bonnet and A. Darfeuille-Michaud

(2010). Complete genome sequence of Crohn's disease-associated adherent-invasive E. coli strain LF82. PLoS

One 5(9).

Morrical, S. W. (2015). DNA-pairing and annealing processes in homologous recombination and homology-

directed repair. Cold Spring Harb Perspect Biol 7(2): a016444.

Morris, P., L. J. Marinelli, D. Jacobs-Sera, R. W. Hendrix and G. F. Hatfull (2008). Genomic characterization of

mycobacteriophage Giles: evidence for phage acquisition of host DNA by illegitimate recombination. J Bacteriol

190(6): 2172-2182.

Motorin, Y., G. Keith, C. Simon, D. Foiret, G. Simos, E. Hurt and H. Grosjean (1998). The yeast

tRNA:pseudouridine synthase Pus1p displays a multisite substrate specificity. RNA 4(7): 856-869.

Murphy, K. C., A. C. Fenton and A. R. Poteete (1987). Sequence of the bacteriophage P22 anti-recBCD (abc)

genes and properties of P22 abc region deletion mutants. Virology 160(2): 456-464.

Nadalian, B., A. Yadegar, H. Houri, M. Olfatifar, S. Shahrokh, H. Asadzadeh Aghdaei, H. Suzuki and M. R. Zali

(2020). Prevalence of the pathobiont adherent-invasive Escherichia coli and inflammatory bowel disease: a

systematic review and meta-analysis. J Gastroenterol Hepatol.

Nakane, S., H. Ishikawa, N. Nakagawa, S. Kuramitsu and R. Masui (2012a). The structural basis of the kinetic

mechanism of a gap-filling X-family DNA polymerase that binds Mg(2+)-dNTP before binding to DNA. J Mol

Biol 417(3): 179-196.

Nakane, S., N. Nakagawa, S. Kuramitsu and R. Masui (2009). Characterization of DNA polymerase X from

Thermus thermophilus HB8 reveals the POLXc and PHP domains are both required for 3'-5' exonuclease activity.

Nucleic Acids Res 37(6): 2037-2052.

94

Nakane, S., N. Nakagawa, S. Kuramitsu and R. Masui (2012b). The role of the PHP domain associated with DNA

polymerase X from Thermus thermophilus HB8 in base excision repair. DNA Repair (Amst) 11(11): 906-914.

Narajczyk, M., S. Baranska, A. Wegrzyn and G. Wegrzyn (2007). Switch from theta to sigma replication of

bacteriophage lambda DNA: factors involved in the process and a model for its regulation. Mol Genet Genomics

278(1): 65-74.

Narumi, I., K. Satoh, S. Cui, T. Funayama, S. Kitayama and H. Watanabe (2004). PprA: a novel protein from

Deinococcus radiodurans that stimulates DNA ligation. Mol Microbiol 54(1): 278-285.

Narumi, I., K. Satoh, M. Kikuchi, T. Funayama, T. Yanagisawa, Y. Kobayashi, H. Watanabe and K. Yamamoto

(2001). The LexA protein from Deinococcus radiodurans is not involved in RecA induction following gamma

irradiation. J Bacteriol 183(23): 6951-6956.

Neamah, M. M., I. Mir-Sanchis, M. Lopez-Sanz, S. Acosta, I. Baquedano, A. F. Haag, A. Marina, S. Ayora and J.

R. Penades (2017). Sak and Sak4 recombinases are required for bacteriophage replication in Staphylococcus

aureus. Nucleic Acids Res 45(11): 6507-6519.

Nicolas, P., U. Mader, E. Dervyn, T. Rochat, A. Leduc, N. Pigeonneau, E. Bidnenko, E. Marchadier, M. Hoebeke,

S. Aymerich, D. Becher, P. Bisicchia, E. Botella, O. Delumeau, G. Doherty, E. L. Denham, M. J. Fogg, V.

Fromion, A. Goelzer, A. Hansen, E. Hartig, C. R. Harwood, G. Homuth, H. Jarmer, M. Jules, E. Klipp, L. Le Chat,

F. Lecointe, P. Lewis, W. Liebermeister, A. March, R. A. Mars, P. Nannapaneni, D. Noone, S. Pohl, B. Rinn, F.

Rugheimer, P. K. Sappa, F. Samson, M. Schaffer, B. Schwikowski, L. Steil, J. Stulke, T. Wiegert, K. M. Devine,

A. J. Wilkinson, J. M. van Dijl, M. Hecker, U. Volker, P. Bessieres and P. Noirot (2012). Condition-dependent

transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis. Science 335(6072): 1103-1106.

Norais, C. A., S. Chitteni-Pattu, E. A. Wood, R. B. Inman and M. M. Cox (2009). DdrB protein, an alternative

Deinococcus radiodurans SSB induced by ionizing radiation. J Biol Chem 284(32): 21402-21411.

Oz, R., J. L. Wang, R. Guerois, G. Goyal, S. Kk, V. Ropars, R. Sharma, F. Koca, J. B. Charbonnier, M. Modesti,

T. R. Strick and F. Westerlund (2021). Dynamics of Ku and bacterial non-homologous end-joining characterized

using single DNA molecule analysis. Nucleic Acids Res.

Paillard, S. and F. Strauss (1991). Analysis of the mechanism of interaction of simian Ku protein with DNA.

Nucleic Acids Res 19(20): 5619-5624.

Palmela, C., C. Chevarin, Z. Xu, J. Torres, G. Sevrin, R. Hirten, N. Barnich, S. C. Ng and J. F. Colombel (2018).

Adherent-invasive Escherichia coli in inflammatory bowel disease. Gut 67(3): 574-587.

Paschalis, V., E. Le Chatelier, M. Green, H. Nouri, F. Kepes, P. Soultanas and L. Janniere (2017). Interactions of

the Bacillus subtilis DnaE polymerase with replisomal proteins modulate its activity and fidelity. Open Biol 7(9).

Phizicky, E. M. and J. D. Alfonzo (2010a). Do all modifications benefit all tRNAs? FEBS Lett 584(2): 265-271.

Phizicky, E. M. and A. K. Hopper (2010b). tRNA biology charges to the front. Genes Dev 24(17): 1832-1860.

Pintard, L., F. Lecointe, J. M. Bujnicki, C. Bonnerot, H. Grosjean and B. Lapeyre (2002). Trm7p catalyses the

formation of two 2'-O-methylriboses in yeast tRNA anticodon loop. EMBO J 21(7): 1811-1820.

Pitcher, R. S., N. C. Brissett and A. J. Doherty (2007a). Nonhomologous end-joining in bacteria: a microbial

perspective. Annu Rev Microbiol 61: 259-282.

Pitcher, R. S., A. J. Green, A. Brzostek, M. Korycka-Machala, J. Dziadek and A. J. Doherty (2007b). NHEJ

protects mycobacteria in stationary phase against the harmful effects of desiccation. DNA Repair (Amst) 6(9):

1271-1276.

Pitcher, R. S., L. M. Tonkin, J. M. Daley, P. L. Palmbos, A. J. Green, T. L. Velting, A. Brzostek, M. Korycka-

Machala, S. Cresawn, J. Dziadek, G. F. Hatfull, T. E. Wilson and A. J. Doherty (2006). Mycobacteriophage exploit

NHEJ to facilitate genome circularization. Mol Cell 23(5): 743-748.

95

Plocinski, P., N. C. Brissett, J. Bianchi, A. Brzostek, M. Korycka-Machala, A. Dziembowski, J. Dziadek and A. J.

Doherty (2017). DNA Ligase C and Prim-PolC participate in base excision repair in mycobacteria. Nat Commun

8(1): 1251.

Polard, P., S. Marsin, S. McGovern, M. Velten, D. B. Wigley, S. D. Ehrlich and C. Bruand (2002). Restart of DNA

replication in Gram-positive bacteria: functional characterisation of the Bacillus subtilis PriA initiator. Nucleic

Acids Res 30(7): 1593-1605.

Pollo-Oliveira, L. and V. de Crecy-Lagard (2019). Can Protein Expression Be Regulated by Modulation of tRNA

Modification Profiles? Biochemistry 58(5): 355-362.

Poteete, A. R. (2004). Modulation of DNA repair and recombination by the bacteriophage lambda Orf function in

Escherichia coli K-12. J Bacteriol 186(9): 2699-2707.

Qi, H. Z., W. Z. Wang, J. Y. He, Y. Ma, F. Z. Xiao and S. Y. He (2020). Antioxidative system of Deinococcus

radiodurans. Res Microbiol 171(2): 45-54.

Radding, C. M. (1966). Regulation of lambda exonuclease. I. Properties of lambda exonuclease purified from

lysogens of lambda T11 and wild type. J Mol Biol 18(2): 235-250.

Radding, C. M. and D. C. Shreffler (1966). Regulation of lambda exonuclease. II. Joint regulation of exonuclease

and a new lambda antigen. J Mol Biol 18(2): 251-261.

Ragunathan, P. T. and C. K. Vanderpool (2019). Cryptic-Prophage-Encoded Small Protein DicB Protects

Escherichia coli from Phage Infection by Inhibiting Inner Membrane Receptor Proteins. J Bacteriol 201(23).

Ramsden, D. A. and M. Gellert (1998). Ku protein stimulates DNA end joining by mammalian DNA ligases: a

direct role for Ku in repair of DNA double-strand breaks. EMBO J 17(2): 609-614.

Reid, D. A., S. Keegan, A. Leo-Macias, G. Watanabe, N. T. Strande, H. H. Chang, B. A. Oksuz, D. Fenyo, M. R.

Lieber, D. A. Ramsden and E. Rothenberg (2015). Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining

machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci U S A 112(20): E2575-2584.

Rezende, L. F., S. Willcox, J. D. Griffith and C. C. Richardson (2003). A single-stranded DNA-binding protein of

bacteriophage T7 defective in DNA annealing. J Biol Chem 278(31): 29098-29105.

Rigaut, G., A. Shevchenko, B. Rutz, M. Wilm, M. Mann and B. Seraphin (1999). A generic protein purification

method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol 17(10): 1030-1032.

Roberts, S. A. and D. A. Ramsden (2007). Loading of the nonhomologous end joining factor, Ku, on protein-

occluded DNA ends. J Biol Chem 282(14): 10605-10613.

Roberts, S. A., N. Strande, M. D. Burkhalter, C. Strom, J. M. Havener, P. Hasty and D. A. Ramsden (2010). Ku is

a 5'-dRP/AP lyase that excises nucleotide damage near broken ends. Nature 464(7292): 1214-1217.

Rolhion, N. and A. Darfeuille-Michaud (2007). Adherent-invasive Escherichia coli in inflammatory bowel disease.

Inflamm Bowel Dis 13(10): 1277-1283.

Romero, H., T. C. Rosch, R. Hernandez-Tamayo, D. Lucena, S. Ayora, J. C. Alonso and P. L. Graumann (2019a).

Single molecule tracking reveals functions for RarA at replication forks but also independently from replication

during DNA repair in Bacillus subtilis. Sci Rep 9(1): 1997.

Romero, H., E. Serrano, R. Hernandez-Tamayo, B. Carrasco, P. P. Cardenas, S. Ayora, P. L. Graumann and J. C.

Alonso (2020). Bacillus subtilis RarA Acts as a Positive RecA Accessory Protein. Front Microbiol 11: 92.

Romero, H., R. Torres, R. Hernandez-Tamayo, B. Carrasco, S. Ayora, P. L. Graumann and J. C. Alonso (2019b).

Bacillus subtilis RarA acts at the interplay between replication and repair-by-recombination. DNA Repair (Amst)

78: 27-36.

96

Sage, E. and N. Shikazono (2017). Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radic

Biol Med 107: 125-135.

Sanders, G. M., H. G. Dallmann and C. S. McHenry (2010). Reconstitution of the B. subtilis replisome with 13

proteins including two distinct replicases. Mol Cell 37(2): 273-281.

Sawitzke, J. A. and F. W. Stahl (1992). Phage lambda has an analog of Escherichia coli recO, recR and recF genes.

Genetics 130(1): 7-16.

Seco, E. M. and S. Ayora (2017). Bacillus subtilis DNA polymerases, PolC and DnaE, are required for both leading

and lagging strand synthesis in SPP1 origin-dependent DNA replication. Nucleic Acids Res 45(14): 8302-8313.

Shaheen, R., L. Han, E. Faqeih, N. Ewida, E. Alobeid, E. M. Phizicky and F. S. Alkuraya (2016). A homozygous

truncating mutation in PUS3 expands the role of tRNA modification in normal cognition. Hum Genet 135(7): 707-

713.

Sharda, M., A. Badrinarayanan and A. S. N. Seshasayee (2020). Evolutionary and Comparative Analysis of

Bacterial Nonhomologous End Joining Repair. Genome Biol Evol 12(12): 2450-2466.

Shee, C., B. D. Cox, F. Gu, E. M. Luengas, M. C. Joshi, L. Y. Chiu, D. Magnan, J. A. Halliday, R. L. Frisch, J. L.

Gibson, R. B. Nehring, H. G. Do, M. Hernandez, L. Li, C. Herman, P. Hastings, D. Bates, R. S. Harris, K. M.

Miller and S. M. Rosenberg (2013). Engineered proteins detect spontaneous DNA breakage in human and bacterial

cells. Elife 2: e01222.

Shinn, M. K., A. G. Kozlov, B. Nguyen, W. M. Bujalowski and T. M. Lohman (2019). Are the intrinsically

disordered linkers involved in SSB binding to accessory proteins? Nucleic Acids Res 47(16): 8581-8594.

Shuman, S. and M. S. Glickman (2007). Bacterial DNA repair by non-homologous end joining. Nat Rev Microbiol

5(11): 852-861.

Simos, G., H. Tekotte, H. Grosjean, A. Segref, K. Sharma, D. Tollervey and E. C. Hurt (1996). Nuclear pore

proteins are involved in the biogenesis of functional tRNA. EMBO J 15(9): 2270-2284.

Sinha, K. M., M. C. Unciuleac, M. S. Glickman and S. Shuman (2009). AdnAB: a new DSB-resecting motor-

nuclease from mycobacteria. Genes Dev 23(12): 1423-1437.

Slade, D., A. B. Lindner, G. Paul and M. Radman (2009). Recombination and replication in DNA repair of heavily

irradiated Deinococcus radiodurans. Cell 136(6): 1044-1055.

Slade, D. and M. Radman (2011). Oxidative stress resistance in Deinococcus radiodurans. Microbiol Mol Biol

Rev 75(1): 133-191.

Stahl, G., L. Bidou, J. P. Rousset and M. Cassan (1995). Versatile vectors to study recoding: conservation of rules

between yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Res 23(9): 1557-1560.

Stephanou, N. C., F. Gao, P. Bongiorno, S. Ehrt, D. Schnappinger, S. Shuman and M. S. Glickman (2007).

Mycobacterial nonhomologous end joining mediates mutagenic repair of chromosomal double-strand DNA

breaks. J Bacteriol 189(14): 5237-5246.

Story, R. M., I. T. Weber and T. A. Steitz (1992). The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer.

Nature 355(6358): 318-325.

Su, X. C., Y. Wang, H. Yagi, D. Shishmarev, C. E. Mason, P. J. Smith, M. Vandevenne, N. E. Dixon and G. Otting

(2014). Bound or free: interaction of the C-terminal domain of Escherichia coli single-stranded DNA-binding

protein (SSB) with the tetrameric core of SSB. Biochemistry 53(12): 1925-1934.

Takahashi, S. (1977). Rolling circle replicative structure of bacteriophage lambda DNA in a recombination

deficient system. Mol Gen Genet 152(3): 201-204.

Tan, H. Y., L. A. Wilczek, S. Pottinger, M. Manosas, C. Yu, T. Nguyenduc and P. R. Bianco (2017). The

97

intrinsically disordered linker of E. coli SSB is critical for the release from single-stranded DNA. Protein Sci 26(4):

700-717.

Tanaka, M., A. M. Earl, H. A. Howell, M. J. Park, J. A. Eisen, S. N. Peterson and J. R. Battista (2004). Analysis

of Deinococcus radiodurans's transcriptional response to ionizing radiation and desiccation reveals novel proteins

that contribute to extreme radioresistance. Genetics 168(1): 21-33.

Taylor, V. L., A. D. Fitzpatrick, Z. Islam and K. L. Maxwell (2019). The Diverse Impacts of Phage Morons on

Bacterial Fitness and Virulence. Adv Virus Res 103: 1-31.

Thapar, U. and B. Demple (2019). Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and

multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair (Amst) 76: 11-19.

Torres, J., S. Mehandru, J. F. Colombel and L. Peyrin-Biroulet (2017a). Crohn's disease. Lancet 389(10080): 1741-

1755.

Torres, R., H. Romero, V. Rodriguez-Cerrato and J. C. Alonso (2017b). Interplay between Bacillus subtilis RecD2

and the RecG or RuvAB helicase in recombinational repair. DNA Repair (Amst) 55: 40-46.

Touchon, M., A. Bernheim and E. P. Rocha (2016). Genetic and life-history traits associated with the distribution

of prophages in bacteria. ISME J 10(11): 2744-2754.

Velten, M., S. McGovern, S. Marsin, S. D. Ehrlich, P. Noirot and P. Polard (2003). A two-protein strategy for the

functional loading of a cellular replicative DNA helicase. Mol Cell 11(4): 1009-1020.

Walker, J. R., R. A. Corpina and J. Goldberg (2001). Structure of the Ku heterodimer bound to DNA and its

implications for double-strand break repair. Nature 412(6847): 607-614.

Wang, S. T., B. Setlow, E. M. Conlon, J. L. Lyon, D. Imamura, T. Sato, P. Setlow, R. Losick and P. Eichenberger

(2006). The forespore line of gene expression in Bacillus subtilis. J Mol Biol 358(1): 16-37.

Wang, X., Y. Kim, Q. Ma, S. H. Hong, K. Pokusaeva, J. M. Sturino and T. K. Wood (2010). Cryptic prophages

help bacteria cope with adverse environments. Nat Commun 1: 147.

Ward, J. F. (1994). The complexity of DNA damage: relevance to biological consequences. Int J Radiat Biol 66(5):

427-432.

Weigel, C. and H. Seitz (2006). Bacteriophage replication modules. FEMS Microbiol Rev 30(3): 321-381.

Weinbauer, M. G. (2004). Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiol Rev 28(2): 127-181.

Weissman, J. L., W. F. Fagan and P. L. F. Johnson (2019). Linking high GC content to the repair of double strand

breaks in prokaryotic genomes. PLoS Genet 15(11): e1008493.

Weller, G. R., B. Kysela, R. Roy, L. M. Tonkin, E. Scanlan, M. Della, S. K. Devine, J. P. Day, A. Wilkinson, F.

d'Adda di Fagagna, K. M. Devine, R. P. Bowater, P. A. Jeggo, S. P. Jackson and A. J. Doherty (2002).

Identification of a DNA nonhomologous end-joining complex in bacteria. Science 297(5587): 1686-1689.

Weller, S. K. and J. A. Sawitzke (2014). Recombination promoted by DNA viruses: phage lambda to herpes

simplex virus. Annu Rev Microbiol 68: 237-258.

White, O., J. A. Eisen, J. F. Heidelberg, E. K. Hickey, J. D. Peterson, R. J. Dodson, D. H. Haft, M. L. Gwinn, W.

C. Nelson, D. L. Richardson, K. S. Moffat, H. Qin, L. Jiang, W. Pamphile, M. Crosby, M. Shen, J. J. Vamathevan,

P. Lam, L. McDonald, T. Utterback, C. Zalewski, K. S. Makarova, L. Aravind, M. J. Daly, K. W. Minton, R. D.

Fleischmann, K. A. Ketchum, K. E. Nelson, S. Salzberg, H. O. Smith, J. C. Venter and C. M. Fraser (1999).

Genome sequence of the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans R1. Science 286(5444): 1571-1577.

Wiles, T. J., J. P. Norton, S. N. Smith, A. J. Lewis, H. L. Mobley, S. R. Casjens and M. A. Mulvey (2013). A

phyletically rare gene promotes the niche-specific fitness of an E. coli pathogen during bacteremia. PLoS Pathog

9(2): e1003175.

98

Williams, J. G. and C. M. Radding (1981). Partial purification and properties of an exonuclease inhibitor induced

by bacteriophage Mu-1. J Virol 39(2): 548-558.

Williams, R. C. and S. J. Spengler (1986). Fibers of RecA protein and complexes of RecA protein and single-

stranded phi X174 DNA as visualized by negative-stain electron microscopy. J Mol Biol 187(1): 109-118.

Windgassen, T. A., S. R. Wessel, B. Bhattacharyya and J. L. Keck (2018). Mechanisms of bacterial DNA

replication restart. Nucleic Acids Res 46(2): 504-519.

Wu, M., E. K. Flynn and R. L. Karpel (1999). Details of the nucleic acid binding site of T4 gene 32 protein revealed

by proteolysis and DNA Tm depression methods. J Mol Biol 286(4): 1107-1121.

Xu, G., H. Lu, L. Wang, H. Chen, Z. Xu, Y. Hu, B. Tian and Y. Hua (2010). DdrB stimulates single-stranded DNA

annealing and facilitates RecA-independent DNA repair in Deinococcus radiodurans. DNA Repair (Amst) 9(7):

805-812.

Yang, H., C. Zhou, A. Dhar and N. P. Pavletich (2020). Mechanism of strand exchange from RecA-DNA synaptic

and D-loop structures. Nature 586(7831): 801-806.

Yansura, D. G. and D. J. Henner (1984). Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene

expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A 81(2): 439-443.

Yeeles, J. T. and K. J. Marians (2011). The Escherichia coli replisome is inherently DNA damage tolerant. Science

334(6053): 235-238.

Yoo, S. and W. S. Dynan (1999). Geometry of a complex formed by double strand break repair proteins at a single

DNA end: recruitment of DNA-PKcs induces inward translocation of Ku protein. Nucleic Acids Res 27(24): 4679-

4686.

Yu, M. and W. Masker (2001). T7 single strand DNA binding protein but not T7 helicase is required for DNA

double strand break repair. J Bacteriol 183(6): 1862-1869.

Zafra, O., L. Perez de Ayala and M. de Vega (2017). The anti/syn conformation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-

deoxyguanosine is modulated by Bacillus subtilis PolX active site residues His255 and Asn263. Efficient

processing of damaged 3'-ends. DNA Repair (Amst) 52: 59-69.

Zahradka, K., D. Slade, A. Bailone, S. Sommer, D. Averbeck, M. Petranovic, A. B. Lindner and M. Radman

(2006). Reassembly of shattered chromosomes in Deinococcus radiodurans. Nature 443(7111): 569-573.

Zhang, X., W. Chen, Y. Zhang, L. Jiang, Z. Chen, Y. Wen and J. Li (2012). Deletion of ku homologs increases

gene targeting frequency in Streptomyces avermitilis. J Ind Microbiol Biotechnol 39(6): 917-925.

Zhao, B., E. Rothenberg, D. A. Ramsden and M. R. Lieber (2020). The molecular basis and disease relevance of

non-homologous DNA end joining. Nat Rev Mol Cell Biol 21(12): 765-781.

Zhou, Y., T. Chen, L. Zhou, J. Fleming, J. Deng, X. Wang, L. Wang, Y. Wang, X. Zhang, W. Wei and L. Bi

(2015). Discovery and characterization of Ku acetylation in Mycobacterium smegmatis. FEMS Microbiol Lett

362(6).

Zhu, H. and S. Shuman (2010). Gap filling activities of Pseudomonas DNA ligase D (LigD) polymerase and

functional interactions of LigD with the DNA end-binding Ku protein. J Biol Chem 285(7): 4815-4825.

Zimmerman, J. M. and J. R. Battista (2005). A ring-like nucleoid is not necessary for radioresistance in the

Deinococcaceae. BMC Microbiol 5: 17.