Microbiologie générale - esta.ac.ma

DUT GBI S2 15/03/2020

Pr. ACHEMCHEM 1

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Microbiologie générale

◼ Filière DUT GBI -S2-

◼ Pr. Fouad ACHEMCHEM

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CHAP I : HISTORIQUE DE LA MICROBIOLOGIE

• La Microbiologie est la science qui étudie un groupe très large

et très varié de formes vivantes microscopiques, qui sont les

Protistes.Protistes

Protistes supérieurs Protistes inférieurs

(Eucaryotes)(Procaryotes)

- Protozoaires

- Algues (sauf les bleues)

- Champignons

- Algues bleues (Cyanobactéries)

- Bactéries

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Antoine van Leeuwenhoek(1632-1723)

17ème siècle van Leeuwenhoek: 1ère

observation et description de

bactéries et protozoaires qu’il adénommé "animalcules" sousmicroscope (x50 à 300). Vers 1674, il

a décrit ce que nous appelonsaujourd’hui des protozoaires, surtoutdes ciliés auxquels se mêlent des

algues (Euglena et Volvox).15/03/2020

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19ème siècleLouis Pasteur (1822-1895)

• Etude des fermentations lactique et alcoolique et découverte de la pasteurisation.

• publication de 1861 « mémoire sur les corpusculesorganisés qui existent dans l'atmosphère: examen

de la doctrine de générations spontanées » :Discrédit théorie de la génération spontanée(organismes vivants peuvent se développer à partir

de matière non vivante ou en décomposition)

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Fiole contenant du milieu nutritif stérile

avec un col en bec-de-cygne:

aucune croissance n'apparaît même si le

contenu est exposé à l'air car la

poussière et les germes sont piégés sur

les bords du goulot. Si les goulots sont

cassés ou en renversant le récipient, la

croissance commence immédiatement.

C'est l'origine de toute la technique microbiologique

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- bacille du charbon (immunisation)- choléra du poulet (méthode de l'atténuation de la

virulence des microbes : vieilles cultures ne donnent plus la maladie, mais injectées à des anx sains = R à la maladie)

- vaccin contre la rage: Il applique à l'homme la méthode d'atténuation (13 injections en 10j), le 6 juillet 1885, à Joseph Meister

→fondements de l'immunologie

1886 création de l'institut Pasteur

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Robert Koch (1843-1910)

Observation du bacille du charbon (Bacillus anthracis) dans le sang de patients décédés, isolement de la

bactérie et ré-innoculation à des animaux sains --> conduit à la maladie et à l'isolement de la même bactérie qui est donc l'agent infectieux.

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Postulats de Koch :

1er : Le microbe doit être présent dans tous les cas de maladie

2ème : Le microbe doit pouvoir être isoler de l’hôte et cultivé en culture pure

3ème infecter un hôte sain et montrer que cet organisme présente alors les mêmes symptômes cliniques

4ème ré-isoler le "même " microbe à partir du malade expérimentalement infecté


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Isolement de Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch)

Observation de colonies bactériennes sur des tranches de pomme de terre bouillies

Fannie Eilshemius-Hesse: agar pour solidification des milieux (gélatine dégradée et fond >28°C)

R.J. Petri: les boîtes pour milieu de culture solide du même nom

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Découverte des virus:

A l’Institut Pasteur (France) on fabriquait des filtres qui ne laissaitpas passer les bactéries, des liquides ainsi filtrés sont stériles.

1892 : Dimitri Ivanowsky observe que la maladie de la mosaïquedu tabac est transmise par des agents non retenus par filtration→ Notion d’agents ultrafiltrables. Mais il pense qu’il s’agit d’une

toxine bactérienne.

1898 : Martinus Beijerinck fait la même observation puis démontre quel’agent est transmissible d’une plante à une autre sur plusieurs générations

→l’agent se multiplie → ce n’est pas une toxine → fluide contagieux. Lepremier virus identifié est un virus de plante: le virus de la mosaïque dutabac (MTV).

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Rôle des microbes dans la nature:

A la fin du 19ème siècle les microbiologistes ont découvert que lesmicrobes interviennent dans la fertilité des sol et dans le cycle dela matière: cycle d’azote, du carbone, du soufre,…

Fixation de l’azote atmosphériqueNodules racinaires du Sojase développant suite àl’infection par une bactérie

Effets de la nodulation sur la croissance des plantes.Plants de soja inoculés par Bradyrhizobium japonicum (à droite) et non inoculés (à gauche)dans un sol pauvre en azote.

ABS / 6, 9 11 16 17 20 25 26 32 42 50 53 56 65 71 74 78 80 83 98 109 110

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Conclusion

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Impact des microorganismessur les activités humaines

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CHAP II : EUCARYOTES ET PROCARYOTES

Les bactéries furent inclues, au siècle dernier, dans un groupe pluslarge, les protistes, sur des bases morphologiques. Les protistes

comprennent des êtres unicellulaires simples et syncytiaux et des

êtres pluricellulaires à cellules indifférenciées. On s’est, par la suite,aperçu que ces protistes comprennent des êtres inférieurs (bactéries)et des êtres supérieurs (algues, protozoaires, champignons …).

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Par rapport aux cellules eucaryotes, les cellules procaryotes n’ont pas de - membrane nucléaire,

- pas d’appareil de Golgi- pas d’histones- pas de mitochondries

- ni de chloroplastes;Par contre, elles possèdent une structure externe à la membrane plasmique qui s’appelle la paroi (mis à part les mycoplasmes et les chlamydies),

et de nombreuses petites molécules d’ADN circulaires, indépendantes du chromosome, qu’on appelle plasmides et qui jouent un rôle très important

dans des propriétés telles que la résistance à des antibiotiques et antiseptiques, la virulence, la dégradation de certains substrats…

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Caractéristiques Eucaryotes Procaryotes

Taille de la cellule Grande Petite

Noyau

Enveloppe nucléaire

Acides nucléiques liés aux histones.

Plusieurs molécules d’ADN par

cellule et qui s’individualise en

chromosome durant la division

(Mitose, Méiose)

Pas d’enveloppe nucléaire

Pas d’histones.

Une seule molécule d’ADN par cellule

Pas de formation de chromosome durant

la division

Cytoplasme

Ribosome 80S

Présence d’organites:

mitochondries,platses, RE,…

Ribosome 70S

Pas d’organites

Paroi Cellulosique chez les algues et les

plantes, chitineuse chez les

champignons

A base de peptidoglycane (muréïne,

mucocomplexe, mucopeptide) qui n’a

jamais été trouvé chez les eucaryotes

Mouvement Flagelles

Cils

Mouvements amiboïdes

Flagelles (de composition et structure

différentes des Eucaryotes)

Par glissement sur les surface (chez les

Cyanobactéries et les Myxobactéries)

TABLEAU 1 : Caractères différentiels généraux des cellules eucaryotes des cellules procaryotes

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Schéma d’un procaryote

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Schéma d’une cellule bactérienne

Ribosomes Capsule

ChromatophoreCytoplasme

Paroi

ADN

Membrane cytoplasmique

Granule

FlagelleFimbriae/Pili

Eléments communs Eléments facultatifs

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La paroi cellulaire

C'est la couche la plus externe des bactéries. On distingue ces deux couchespar leur épaisseur, leur composition, leur structure ainsi que leur réactivité vis-à-visdes colorants.

Coloration de Gram

1. Les bactéries sont tuées grâce à la chaleur2. Coloration au violet de gentiane3. Traitement à l'iode4. Action d'un solvant organique5. Coloration à la fuchsine

On obtient alors deux colorations possibles :Coloration bleu-violette : bactéries Gram +Coloration rouge-rose : bactéries Gram –

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Angine fuso-spirochétienne

Coques en chaînette Gram + ➔caractéristiques des Streptococque

Bacilles Gram + ➔ caractéristiques des Lactobacille

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Lipide A du LPS (G-) toxicité

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Flagelles ou cils:

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CHAP III : Classification des êtres vivants : notions de systématique bactérienne

Le monde vivant est très diversifié, qu'il soit visible ou microscopique. C'est pourquoi une classification est nécessaire afin d'exploiter et de comprendre le monde vivant.

En 1673, Antoine Leeuwenhoek met au point le premier microscope et il effectue les premières observations du monde microbien. On remarque que certains êtres vivants ont des ressemblances, c'est ainsi que l'on va les hiérarchiser en taxa (un taxon des taxa).

I. POURQUOI CLASSER LES ETRES VIVANTS ?

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CHAP III : Classification des êtres vivants : notion de systématique bactérienne

II. COMMENT CLASSER LES ETRES VIVANTS ?

II.1. La taxonomie ( = taxinomie )

On l'appelle aussi systématique.

La taxonomie est l'ensemble des principes et théories permettant de classer et valider le classement des organismes vivants. C'est une classification rationnelle, basée sur la ressemblance et les relations entre les organismes.

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II.2. Nomenclature binomiale

Les premiers biologistes: Comment nommer les organismes vivants? Doit-on donner le même nom à deux groupes de lapins qui ne diffèrent que par leur couleur? Doit-on

donner des noms différents à deux groupes d'oiseaux identiques mais dont l'un vit en Amérique du Nord et l'autre en Russie?

Donc, il faut d'abord trouver une unité de classification: Au 17ème siècle, un Anglais, John Ray, propose le concept de l'espèce comme unité de

base de la classification. Les êtres vivants seront séparés en espèces distinctes, chaque espèce possédant son propre nom. Aujourd'hui, l'espèce est définie comme étant:

Groupe d'individus morphologiquement et génétiquement semblables, capables de se reproduire entre eux dans des conditions favorables et

donnant naissance à des individus fertiles.

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Or, cette définition pose souvent des problèmes:

• Ne s'applique qu'aux organismes à reproduction sexuée ce qui n'est pas le cas pour tous les êtres vivants.

• Il est parfois difficile de vérifier si des organismes peuvent effectivement se reproduire entre eux, …

Malgré ces cas particuliers, la définition d'espèce est, dans la grande majorité des cas,

un bon critère de classification.

Maintenant que l'unité de base de la classification est définie, il s'agit de trouver un système universel pour nommer les différentes espèces répertoriées.

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Toujours en 18ème siècle, Carolus Linnaeus (ou Linné) propose un système qui s'imposera: la nomenclature binomiale. Chaque espèce est identifiée par deux mots: Genre et

espèce.

Ex.: Acer saccharum Marshall (érable à sucre) saccharum = espèce Acer = genre

Marshall = nom du premier taxonomiste à avoir répertorié et nommé suivant le système Linnéen cette espèce. Ainsi, tous les organismes répertoriés puis nommés par Linné sont suivis de la lettre L. Ex. Acer saccharinum L. (érable argenté).

(1707 - 1778)« Nomina si nescis, perit et cognitio rerum »Si tu ignores le nom des choses, même leur

connaissance disparaît

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On regroupe à l'intérieur d'un même genre plusieurs espèces semblables; ainsi dans le genre Acer on retrouve:

Acer saccharum Marshall ..............érable à sucre Acer negundo L. ...........................érable à Giguère Acer rubrum L. .............................érable rouge Acer pensylvanicum L. ..................érable de Pensylvanie

Le genre s'écrit toujours avec une majuscule et l'espèce avec une minuscule. On doit souligner ou écrire en italique les deux mots. Pour désigner une espèce, les deux mots (genre et espèce)

doivent être mentionnés. Ainsi, saccharum employé seul est insuffisant pour désigner l'érable à sucre.

(1707 - 1778)

« Nomina si nescis, perit et cognitio rerum »Si tu ignores le nom des choses, même leur

connaissance disparaît

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Suivant le système de Linné, les espèces semblables sont regroupées en un même genre. Toujours suivant la règle des ressemblances, les genres semblables seront regroupés en un groupe commun plus vaste. Ce groupe plus vaste peut être à nouveau regroupé avec d'autres semblables pour former un groupe encore

plus vaste etc. On nomme taxon chacun de ces groupes.

Ainsi: • plusieurs genres semblables forment une famille • plusieurs familles semblables forment un ordre

• plusieurs ordres semblables forment une classe • plusieurs classes semblables forment un embranchement (ou phylum)

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Règne Animal Animal Végétal

Embranchement Cordé Cordé Trachéophyte

Classe Mammifère Oiseau Angiosperme

Ordre Primate Passériforme Térébinthale

Famille Hominidé Turdidé Acéracé

Genre Homo Turdus Acer

Espèce sapiens migratorius saccharum

Nom

commun

Homme Merle

d’Amérique

Érable à sucre

Système RECOFGE

Domaine Bacteria

Règne Procariotae

Embranchement

Classe Schizomyctes

Ordre Micrococcales

Famille Micrococcaceae

Genre Staphylococcus

Espèce S. aureus

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II.3. Notion de l’espèce

C'est l'unité de base de la taxonomie. Elle regroupe les organismes qui possèdent de nombreux caractères en commun. Elle est caractérisée par un ensemble d'individus et

tient compte de la variabilité génotypique et phénotypique d'une population.

II.3.1. Espèce chez les organismes à reproduction sexuée :C'est une communauté d'êtres vivants reconnaissables par leurs caractères et capables de se reproduire sexuellement entre eux en donnant naissance à une progéniture fertile.

Dans une population panmictique, tous les organismes sont libres de se croiser au hasard.* Les gènes sont constamment redistribués et les mutations peuvent se répandre au sein de l'espèce, et l'espèce évolue

* Il est possible que des mutations rendent impossible la reproduction au sein de l'espèce. On parle d'évolution divergente, une nouvelle espèce est créée.

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II.3.2. Espèce chez les organismes à reproduction asexuée :

La définition ne convient pas pour ces organismes, en effet, une espèce bactérienne n'est pas panmictique, les individus sont isolés génétiquement et ils n'ont pas de

critères reproductifs.

Une espèce bactérienne est la souche-type et l'ensemble des souches suffisamment proches.

En systématique bactérienne il existe des taxons inférieurs à l’espèce :

Définition d'une sous-espèceLa notion de sous-espèce devrait reposer sur la mise en évidence de petites variations phénotypiques ou sur la présence de critères génétiques (homologies ADN-ADN et/ou

stabilité thermique des hybrides) permettant de diviser les souches d'une espèce en deux ou plusieurs sous-espèces.

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Définition des principaux taxons d'un rang hiérarchique inférieur à la sous-espèce

. Biovar : taxon caractérisé par ses propriétés biochimiques ou physiologiques.

. Chimiovar : taxon caractérisé par la production d'un composé chimique.

. Cultivar : taxon caractérisé par ses caractères culturaux.

. Morphovar : taxon caractérisé par sa morphologie.

. Pathovar : taxon caractérisé par son pouvoir pathogène.

. Phagovar (ou lysovar) : taxon caractérisé par sa sensibilité à différents

bactériophages.. Sérovar : taxon caractérisé par ses propriété antigéniques.

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III. Différentes approches taxinomiques

C'est le regroupement des espèces qui se ressemblent.

A. Approche phénotypique

Depuis la classification proposée par Cohn en 1872 et jusqu'au début des années 1960, toute la taxonomie bactérienne reposait sur une classification phénotypique. La classification phénotypique utilise un faible nombre de caractères considérés comme

importants tels que la morphologie, la présence d'une spore, la mise en évidence d'un caractère biochimique jugé essentiel... Une classification phénotypique a l'inconvénient de ne refléter qu'une quantité d'information réduite. De plus le choix des critères qualifiés "d'importants" est subjectif et il peut varier d'un auteur à un autre ce qui est une source potentielle d'instabilité.

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III. Différentes approches taxinomiques

C'est le regroupement des espèces qui se ressemblent.


B. Approche numérique

Elle prend en compte plus de 300 caractères : morphologiques, biochimiques, culturaux,

présence ou absence d'un constituant cellulaire particulier (un acide gras membranaire, une protéine, une quinone...)…But : comparer deux souches et trouver le degré de ressemblance :

CoefAB = 100 * points communs AB / ( A + B + AB )

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B. Approche numérique

C. Approche phylogénétique

Elle regroupe les organismes apparentés par leurs ressemblances entre séquences génomiques. En effet pour une séquence de 100 nucléotides, on a 1,6 x 1060

séquence possible. L'apparition de deux séquences apparentées ou identiques ne peut

être fortuite.

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Détermination de G+C% :En 1949, Chargaff montre que ce paramètre est constant au sein d'une espèce.

* Moins de 5% de différences : même espèce* Moins de 10% de différences : même genre

Hybridation des acides nucléiques :Comparer les souches A et B pour savoir si elles sont de la même espèce :

Mélange d'ADNA marqué et d'ADNB en grand nombre (1000 à 5000 fois plus) par dénaturation puis renaturation :

%Réassociation = 100 * marquage expérimental / marquage témoin

* Rappariement à plus de 70 % : même espèce* Rappariement à plus de 85 % : même sous-espèce

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Détermination de G+C%

Hybridation des acides nucléiques

Étude des ARNr :On utilise les homologies de séquences d’ADN (gène) de l'ARNr 16S ( = procaryotes ) et

18S ( = eucaryotes ) pour la détermination des espèces et ainsi construire l’arbre phylogénétique. (Woese 1980 :premier arbre phylogénétique)

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IV. Une complication : le transfert horizontal d’ADNLes bactéries ne sont en fait pas totalement isolées génétiquement, un échange d'informations génétiques se produit : c'est un moteur d'évolution.

1. La transformationTransfert d'information génétique par l'intermédiaire d'ADN extracellulaire présent dans le milieu (provenant par exemple d'une bactérie morte).

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2. La transduction

Transfert d'informations par l'intermédiaire d'un bactériophage

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3. La conjugaison

Transfert d'information génétique d'une bactérie donneuse (mâle) à une bactérie receveuse (femelle) par contact physique.

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CHAP IV : Nutrition microbienneles milieux de culture

Les micro-organismes comme tous les êtres vivants ont besoin de nutriments pour croître. Ces nutriments doivent apporter les éléments chimiques: structure cellulaire / activité cellulaire. -Source de carbone (organique ou inorganique)-Source d’azote (nitrique ou ammoniacal ou azote atmosphérique)

-Éléments minéraux : sels (cations ou anions) deux catégories:1. Les macroéléments: besoins de la cellulaire sont élevés: Soufre,

phosphore, potassium, magnésium, calcium et fer. (acides aminés, acides nucléiques, enzymes et endospores, cytochromes,…)

2. Les oligoéléments: indispensables mais en faible [ ]: Zinc, manganèse, sodium, chlore, molybdène, sélénium, cobalt, nickel, tungstène. Le zinc se trouve dans les ARN et ADN polymérases, molybdène et sélénium dans certaines enzymes…

I – LES BESOINS DES MICRO-ORGANISMES

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Source de carbone ( formation de squelette, de molécules organiques )• Autotrophe: le CO2 est la seule ou principale source de carbone• Hétérotrophe: Molécules organiques réduites provenant d'autres organismes

Source d'H+/e-• Lithotrophe: molécules inorganiques réduites• Organotrophe: molécules organiques réduites

Besoin en facteurs de croissance :

Les facteurs de croissance sont des constituants essentiels que le micro-organisme mais qui ne peut pas fabriquer et doit alors les trouver dans l'environnement. Ils peuvent être des acides aminés, des bases puriques et pyrimidiques et/ou des vitamines ( biotine, thiamine ).• Auxotrophe: pas de synthèse de facteurs de croissance• Prototrophe: synthèse d'un facteur de croissance à partir de molécules organiques

I – LES BESOINS DES MICRO-ORGANISMES

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1 – Quelques constituants des milieux de culture

• Extraits de viande

• Extraits de levures

•Peptones

•Gélose (Agar-agar)

•Autres composés: lait, sang, œuf, sérum, pomme de terre…

II – LES MILIEUX DE CULTURE

Ce sont des solutions qui contiennent les nutriments nécessaires pour la croissance du micro-organismes.

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2 – Classification des milieux de culture

- Les milieux naturels ou empiriques: leur composition n’est pas connue avec exactitude.

Exemple : Bouillon nutritif (g/l)

Extrait de viande…………..10Peptone trypsique………….15NaCl………………………………..5

Eau distillée……………………………1000 ml

- Les milieux synthétiques: chimiquement définis: composés organiques et inorganiques connus à des concentration connues.

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Exemple : Milieu pour Thiobacillus thiooxydans (bactérie oxydant le S)

(NH4)2 SO4…….….………..0,2g(Mg SO4) 7H2O.….……….0,5gKH2PO4………………………..3,0g

CaCl2…………………..……….0,25gSoufre………………………..10g


-Les milieux sélectifs: milieux spécifiques permettant de sélectionner et

isoler une espèce donnée dans un mélange poly-microbien.

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- Exemple1: Gélose Chapman (MSA :mannitol-salt-agar)

La gélose Chapman est le milieu sélectif des bactéries halophiles et plus particulièrement fermentant le mannitol. Milieu semi-synthétique.Isolement des Staphylocoques

* Composition pour la préparation d'un litre de milieuPeptone...........................................10,0 g Extrait de viande de bœuf..................1,0 g

Chlorure de sodium...........................75,0 g Mannitol...........................................10,0 g Rouge de phénol................................0,025 g Agar-Agar.........................................15,0 g Eau distillée....................................qsp 1Litre

pH = 7,4

Préparation : 111 g par litre de milieu. Autoclavage classique.

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- Exemple1: Gélose Chapman (MSA :mannitol-salt-agar)

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- Exemple2: Milieu sélectif pour les Entérobactéries

* Composition pour la préparation d'un litre de milieuPeptone de caséine..............................17,0 g Peptone de viande……………..……………….30,0gLactose………………………………………………10,0gSels biliaires…………..…………………………….1,5gChlorure de sodium................................5,0 g Rouge neutre.........................................0,03 g

Cristal violet………………………………………….0,001gAgar-Agar..............................................13,5 g Eau distillée....................................qsp 1Litre

Le cristal violet inhibe la croissance des germes Gram(+), et les sels biliaires favorisent la croissance des Entérobactéries.

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-Les milieux d’identification: mettre en évidence les caractères biochimiques des micro-organismes.

Exemple : Milieu pour les souches uréase-positives (qui dégradent l’urée)

KH2PO4………...…………..3,64gNa2PO4…………..………….3,8gUrée…………………………….8,0gExtrait de levure………….0,04gRouge de Phénol………….0,02g


Dégradation d’urée → changement de couleur (pH)→ souche uréase +

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CHAP V : Nutrition microbienneles milieux de culture

-Les milieux vivants: Milieux formés de cellules vivantes (culture des virus par exemple).

L'aspect des colonies est le caractère primaire utilisé pour orienter le diagnostic effectué par le bactériologiste. La forme des colonies dépend de :

A) facteurs intrinsèques à la bactérie : mobilité,

morphologie : taille, forme, contour, relief, surfaceproduction d'une capsule,production de matériel extracellulaire,Pigmentation.

3 – Apparences des colonies

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B) facteurs extrinsèques : gradients de solutés créés autour de la colonieprésence de colorants dans le milieu de culture.

Exemple : Aspects de colonies bactériennes sur le milieu sélectif dénommé

Drigalski

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Autre exemple : Aspects de colonies bactériennes sur le milieu enrichi au sang

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Comment obtenir des cultures pures?

Méthode des stries

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Conservation des cultures pures

1 – Collections de souches

CCMM (Collections Coordonnées Marocaines de Microorganismes)ATCC (American Type Culture Collection)NCTC (National Collection of Type Culture)(UK)CIP (Collection de l’Institut Pasteur)CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)

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2 – Procédés

Conservation sur la pente de gélose- température ambiante- à 4°C

LyophilisationCongélation (-20°C, -80°C)

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CHAP V : Physiologie - Croissance bactérienne

I - DIVISION BACTERIENNE

La bactérie se multiplie par fission binaire : la bactérie grandit puis se divise en deux cellules filles séparées par un septum de division formé par la paroi cellulaire. Durant la division, l'ADN se duplique ainsi que les autres

constituants cellulaires.

C'est le cycle cellulaire ou le cycle de division cellulaire. Il dure pendant letemps de génération ou le temps de doublement.

Exemple : Pour Escherichia coli tg= 20 minPour Treponema pallidum tg= 34 h

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La croissance bactérienne est l'accroissement ordonné de tous les composants de la bactérie. Elle aboutit à l'augmentation du nombre de bactéries.

Au cours de la croissance, il se produit, d'une part, un appauvrissement du milieu de

culture en nutriments et, d'autre part, un enrichissement en sous-produits du métabolisme, éventuellement toxiques.

1 - Courbe de croissance :

La croissance d'une bactérie s'étudie en milieu liquide. Il existe 6 phases dont l'ensemble constitue la courbe de croissance.

II - DYNAMIQUE DE LA CROISSANCE DE POPULATON BACTÉRIENNE


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Exemple d'une courbe de croissance

1 : phase de latence, 2 : phase de croissance exponentielle, 3 : phase de ralentissement, 4 : phase stationnaire, 5 : phase de déclin.


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•Phase de latence : le taux de croissance nul (µ = 0). La durée de cette phase dépend de l'âge des bactéries et de la composition du milieu. C'est le temps nécessaire à la bactérie pour synthétiser les enzymes adaptées au nouveau substrat (pas de phase de latence si repiquage sur milieu identique au précédent).

• Phase d'accélération : il se produit une augmentation de la vitesse de croissance.

• Croissance exponentielle : le taux de croissance atteint un maximum (µ=max). Cette phase dure tant que la vitesse de croissance est constante. Le temps de

doublement des bactéries est le plus court. La masse cellulaire est représentée par des cellules viables (mortalité nulle).

• Phase de ralentissement : la vitesse de croissance régresse. Il y a un épuisement du milieu de culture et une accumulation des déchets. Il existe un début d'autolyse

des bactéries.


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• Phase maximale stationnaire : le taux de croissance devient nul (µ = 0). Les bactéries qui se multiplient compensent celles qui meurent.

• Phase de déclin : le taux de croissance est négatif (µ < 0). Toutes les ressources

nutritives sont épuisées. Il y a accumulation de métabolites toxiques. Il se produit une diminution d'organismes viables et une lyse cellulaire sous l'action des enzymes protéolytiques endogènes. Cependant, il persiste une croissance par consommation de substances libérées lors de la lyse cellulaire.

2 - Croissance in vitro (milieux liquides et solides) :

Les bactéries peuvent être cultivées en milieux liquide, solide et semi-solide. Les milieux liquides sont utilisés pour la culture de bactéries pures ou lors d'infection monomicrobienne (hémoculture).


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Exemples : culture d'une bactérie dans un bouillon nutritif ou encore à partir du sang d'un malade (hémoculture en flacon)

Les milieux solides ou semi-solides, à base d'agar-agar (gélose), sont utilisés pour l'isolement de bactéries. Dans ces milieux, ont été ajoutés des nutriments favorisants la croissance des bactéries étudiées.


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Exemples : culture par isolement d'une bactérie à la surface d'un milieu gélosé contenant du sang (mouton, cheval) montrant après 18 à 24 H à 37°C d'incubation des colonies hémolytiques.


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3 - Croissance in vivo

In vivo, la croissance bactérienne n'est pas similaire à celle observée in vitro. Elle est beaucoup plus ralentie. La phase de latence est beaucoup plus longue. Les bactéries n'ont pas toujours tous les nutriments à leur

disposition pour leur croissance. In vivo, les bactéries peuvent être phagocytées par les macrophages et les polynucléaires et être inhibées par les produits antibactériens comme le lysozyme ou le complément.


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4 - Croissance en culture continue

Il y a maintien d'une croissance exponentielle continue lorsque le milieu de culture est renouvelé régulièrement et que les métabolites sont éliminés

en même temps. La valeur µ est maximale et constante.Il existe plusieurs appareils paremettant ce type de croissance, parmi eux le plus simple est le chemostat.


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5 - Croissance en culture synchrone

Les bactéries se multiplient toutes au même moment. La courbe de croissance montre des paliers successifs. Ce type de

culture permet d'étudier la division cellulaire indépendamment de la croissance.


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6 - Croissance en biofilmLes bactéries peuvent s'attacher aux surfaces, s'associer entre elles et s'entourer d'un polymère organique pour constituer un biofilm. Leur organisation et leur métabolisme dépendent de la nature de la surface et de l'environnement physico-chimique. Les biofilms intéressent tous les

domaines de la microbiologie et de la médecine (matériels d'exploration, matériels implantés, muqueuses lésées). Les biofilms sont caractérisés par une hétérogénéité spatiale : il existe des variations métaboliques importantes à l'intérieur du biofilm et à l'interface milieu liquide/milieu solide.

Schéma d'organisation d'un biofilm


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Les biofilms correspondent à des croissances de bactéries en surface de liquides ou sur support organique ou inorganique. C’est une croissance naturelle très répandue et très différente de l’état

planctonique

Les biofilms présentent des caractéristiques propres etsont, entre autres, plus difficiles à éliminer.


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7 - Effets de carence et de stress

En situation de carence ou de stress, la bactérie peut adopter deux types de stratégie pour sa survie :

1 - la bactérie se différencie vers une forme de résistance métaboliquement inactive : c'est le cas des Bacillus qui produisent une spore.

2 - la bactérie développe des systèmes de régulation

pour contrôler cette période de carence en adaptant son métabolisme pour faire un maximum d'économie: C'est le cas de Escherichia coli.Dans ce type de situation, la bactérie présente les adaptations suivantes:


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•Dégradation de l'ARN cellulaire total, libérant des nucléotides utilisables pour la synthèse de nouveaux ARN ou comme source d'énergie

• Dégradation des protéines : libération d'acides aminés réutilisés ou dégradés pour la production d'énergie

• Synthèse de protéines de stress qui protègent la bactérie de la privation de nutriments et d'autres stress (existence de gènes impliqués dans les phénomènes de carence ou de stress)…


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1 - Sources d'énergie

Les bactéries doivent trouver dans leur environnement les substances nécessaires à leur énergie et à leurs synthèses cellulaires.

Les bactéries phototrophes utilisent l'énergie lumineuse pour la photosynthèse (synthèse d'ATP à partir d'ADP et de phosphate inorganique).

Les bactéries chimiotrophes puisent leur énergie à partir de composés minéraux ou organiques. Elles utilisent des donneurs et des accepteurs

d'électrons (élément minéral : bactérie chimiolithotrophe ; élément organique : bactérie chimioorganotrophe).

La grande majorité des bactéries d'intérêt agro-alimentaire et médical sont chimioorganotrophes.

III - CONDITIONS FAVORABLES A LA CROISSANCE


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2 -Sources de carbone

Le carbone est l'un des éléments les plus abondants de la bactérie. Le plus simple des composés est l'anhydride carbonique ou CO2. Celui-ci peut être utilisé par la bactérie pour la synthèse de certains métabolites essentiels qui

ferait intervenir une réaction de carboxylation.

Le CO2 est la seule source de carbone pour les bactéries autotrophes. Les bactéries hétérotrophes utilisent facultativement le CO2. Les bactéries hétérotrophes dégradent une grande quantité de substances hydrocarbonées

(alcool, acide acétique, acide lactique, polysaccharides, sucres divers).


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3 - Sources d'azote et besoins en soufre

Les bactéries ont besoin de substances azotées pour synthétiser leurs protéines. La provenance de cet azote peut se faire par fixation directe de l'azote atmosphérique ou

par incorporation de composés azotés (réactions de désamination, de transamination)

Le soufre est incorporé par les bactéries sous forme de sulfate ou de composés soufrés organiques.

4 - Besoins inorganiques

Le phosphore fait partie des acides nucléiques et de nombreuses réactions enzymatiques. Il permet la récupération, l'accumulation et la distribution de l'énergie

dans la bactérie. Il est incorporé sous forme de phosphate inorganique.


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5 - Autres éléments

D'autres éléments jouent un rôle dans le métabolisme bactérien (sodium, potassium, magnésium, chlore) et dans les réactions enzymatiques (calcium, fer, magnésium, manganèse, nickel, sélénium, cuivre, cobalt, vitamines)

Exemple d'un milieu solide minimum pour étudier le transfert de marqueurs d'auxotrophie (cf. découverte de la conjugaison)

Composition: SO4(NH2)2 1 g, PO4K2H 7g, PO4KH2 2g, citrate 0,5g, SO4Mg, 7H2O 1g, eau distillée 500 ml

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1 - Effet de l'oxygène

Il existe plusieurs classes de bactéries en fonction de leurs rapports avec l'oxygène.

IV - CONDITIONS PHYSICO-CHIMIQUES DE LA CROISSANCE

1 - Les bactéries aérobies strictes ne se développent qu'en présence d'air. Leur source principale d'énergie est la respiration. L'oxygène moléculaire, ultime accepteur d'électron, est réduit en eau (Pseudomonas, Acinetobacter, Neisseria).

2 - Les bactéries microaérophiles se développent mieux ou exclusivement lorsque la pression partielle d'oxygène est inférieure à celle de l'air (Campylobacter, Mycobacteriaceae).15/03/2020


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4 - Les bactéries anaérobies strictes ne se développent qu'en absence totale ou presque d'oxygène qui est le plus souvent toxique. Ces bactéries doivent se cultiver sous atmosphère réductrice. La totalité de l'énergie est produite

par fermentation.C'est le cas des bactéries intestinales (Bacteroides,Fusobacterium, Clostridium) et de nombreuses bactéries présentes dans les flores normales de l'organisme.

3 - Les bactéries aéro-anaérobies facultatives se développent avec ou sans air. C'est le cas de la majorité des bactéries pathogènes : les entérobactéries (Escherichia, Salmonella), les staphylocoques. L'énergie provient de l'oxydation des substrats et de la voie fermentaire.

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La toxicité de l'oxygène s'explique par la production de radicaux superoxydes que les bactéries anaérobies ne peuvent pas détruire (absence de superoxyde dismutase) et/ou par l'absence d'une activité enzymatique à type de catalases et de peroxydases.

Exemple : Etuve avec culture de bactéries anaérobies stricts en jarre d’anaérobie.

Autre exemple : culture de bactéries anaérobies stricts en sachet plastique et en atmosphère contrôlée

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2 - Effet de la température

Les bactéries peuvent être classées selon leur température optimale de croissance.

- Bactéries mésophiles (Ex. : Escherichia coli) : température de croissance proche de celle du corps humain (37°C)

- Bactéries thermophiles (Ex. : Thermus aquaticus) : températures de croissance comprises entre 45°C et 70°C .

- Bactéries hyperthermophiles (Ex. : Archaea) : températures de croissance supérieures à 80°C .

- Bactéries psychrophiles (Ex. : ) :Températures proches de 0°C (optimum à 10-15°C).

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- Bactéries psychrotrophes (Ex. : Pseudomonas) : températures de croissance proches de 0°C avec optimum de croissance proche des bactéries mésophiles.

Exemple : Dans un laboratoire de microbiologie on utilise des étuves dont la température intérieure est réglée à différentes température: 10, 37, 45°C,…

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3 - Effet du pH

Le pH (concentration en ion hydrogène [H+]) de l'environnement varie entre 0,5 (sols acides) et 10,5 (eaux alcalines des lacs).

Les bactéries pathogènes ou liées à l'écosystème humain se développent le plus souvent dans des milieux neutres ou légèrement alcalins.

On distingue les bactéries:

- Bactéries neutrophiles qui se développent pour des pH sont compris entre 5,5 et 8,5 avec un optimum voisin de 7. La plupart des bactéries à intérêt médicale/alimentaire sont neutrophiles.

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- alcalophiles qui préfèrent les pH alcalins: cas de Pseudomonas et Vibrio, donc milieux de culture particuliers

- acidophiles qui se multiplient mieux dans des milieux acides : cas des Lactobacillus.

Exemple : isolement d'une souche de Escherichia coli sur un milieu usuel

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4 - Effet de la pression osmotique

Les bactéries sont assez tolérantes aux variations des concentrations ioniques. Certaines espèces sont osmotolérantes (staphylocoques, Vibrio cholerae).

5 - Effet de l’activité de l’eau

La disponibilité de l'eau présente dans l'atmosphère ou dans une substance intervient dans la croissance bactérienne. L'activité de l'eau (Aw) est inversement

proportionnelle à la pression osmotique d'un composé. Ainsi, elle est affectée par la présence plus ou moins importante de sels ou de sucres dissous dans l'eau.

- Présence de sels : Les bactéries halophiles nécessitent du sel (NaCl) pour leur croissance. Cette concentration peut varier de 1-6% pour les faiblement halophiles

jusque 15-30% pour les bactéries halophiles extrêmes (Halobacterium).

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Les bactéries halotolérantes acceptent des concentrations modérées de sels mais non obligatoires pour leur croissance (Ex. : Staphylococcus aureus).

- Présence de sucres : Les bactéries osmophiles nécessitent des sucres pour leur

croissance. Celles osmotolérantes acceptent des concentrations modérées de sucres mais non obligatoires pour leur croissance. Enfin les bactéries xérophilespeuvent se multiplier en l'absence d'eau dans leur environnement.


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6 – Mesure de la croissance

A. Mesure du nombre des micro-organismes:

a/ Comptage direct: Comptage des cellules dans un hématimètre.Méthode rapide et directe mais elle a plusieurs inconvénients

b/Comptage des cellules vivantes:

Cellule de Petroff-Hausser


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B/ Mesure de la masse:

Mesure du troubleDétermination du poids sec• centrifugation ou filtration• séchage à 100-110°C

• inconvénients : peu précis, pas de distinction

cellules mortes et vivantes


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B/ Mesure de l’activité:

a) Mesure de la consommation de substrat (Oxygène, glucose…)

b) Mesure des constituants cellulaires (ATP, peptidoglycane,…)

c) Mesure des produits d’excrétion (CO2, …)

d) Mesure des variations physico-chimiques du milieu

– Mesure du pH• acidification au cours de la croissance• apprécier qualité bactériologique du lait• fermentation du lait (Lactobacillus bulgaricus)


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CHAP VI : Contrôle des populations microbiennes

I. Introduction

II. Techniques de Contrôle des microorganismes

1. Moyens physiques

Chaleur: -5 °C → 80 °C

Radiation: UV, rayons X,

Filtration: effet de taille

2. Moyens chimiques

Désinfectant vs. Antiseptiques

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•Interférence avec la biosynthèse de la paroi

Inhibition des enzymes de transpeptidation impliquées dans le pontage des chaînes

polysaccharidiques du peptidoglycane etactivation des enzymes lytiques de la paroiExemples: pénicilline, ampicilline...NB : sont + efficace sur Gram+

Interfère avec l’action du transporteur lipidique qui transfère les précurseurs du peptidoglycane.Ex.: bacitracine

Cibles des antibiotiques

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•Destruction de la membrane cellulairePolymyxine B se fixe à la membrane interne et en perturbant sa structure agit sur sa perméabilité

•Biosynthèse des acides nucléiquesRéplication: Quinolones : inhibition ADN gyrase Transcription: Rifanpine : inhibe l’ARN polymérase-ADN dépendante

•Traduction des acides nucléiques

Tétracyclines : se fixe à la sous-unité 30S du ribosome et interfère avec la liaison de l’aminoacyl-ARNtChloramphénicol : se fixe à la sous-unité 50S et empêche la formation de liaison peptidique

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Tube

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Solution mère

d’antib iotique à 200mg/L

1 mLRejeter

Diluant 1 mL

}1mL

final

Dilution de l’Antib iotique

}Détermination de la CMI et CMB par la méthode en milieu liquide

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Ajout de l’inoculum

1 mL

}2mL

finaux

Tube

1 2 3 4 5 6 7 ...

Inoculum

Diluant 1 mL

}

Gamme antibiotique

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Tube

1 2 3 4 5 6

+ + - - - + + +

Dénombrement survivants.

Tube n°2

Tube n°3

Tube n°4

Détermination

CMI

Détermination

CMB

Lecture après incubation de 18h à 37°C

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Rapport CMB/CMI :Utilisé pour distinguer- ATB bactéricides (CMB/CMI < 2)- ATB bactériostatiques (CMB très éloignée de la CMI)

CMB = Concentration Minimale Bactéricide :Conc. d’ATB laissant subsister moins de 0,01 %(0,1 % chez les anglo-saxons) de survivants

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CHAP VII : Métabolisme microbien

Le métabolisme microbien est l’ensemble des réactions

cataboliques, consistant à dégrader les éléments nutritifs dumilieu, à transférer et à stocker l’énergie résultant de cesdégradations, afin de réaliser les réactions anaboliquespermettant aux bactéries de réaliser la synthèse de ses propresconstituants.

Pour leur vie, leur développement et l’expression de leurspropriétés les micro-organismes ont besoin d’énergie etd’éléments nutritifs.

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Métabolisme énergétique

2 groupes majeurs de réactions de production d’énergie (ATP)

• Fermentation• Respiration

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Respiration chez les bactéries

• Pas de mitochondries• Le cycle de Krebs se produit dans lecytoplasme• La chaîne de phosphorylation oxydative alieu au niveau des replis de la membrane plasmique de la bactérie

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La fermentation

• Se déroule dans le cytosol sans utilisationd’oxygène = processus anaérobie.• Rq: glycolyse est une partie de la fermentation.• 2 grands types:1. Fermentation alcoolique2. Fermentation lactique

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Glycolyse : étape commune à lafermentation et à la respiration.

Bilan glycolyse :1 glucose → 2 pyruvates + 2 ATP

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ATTENTION

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Les bactéries Phototrophes font appel à des composés minéraux ou organiques comme sources d'électrons.

Si le substrat oxydable est minéral, la bactérie est dite Photolithotrophe: elle est capable de se développer dans un milieu purement minéral comme le font les végétaux :exemple les bactéries sulfureuses pourpres ou vertes.

Si le substrat oxydable est organique, la bactérie est dite Photoorganotrophe:

exemple les bactéries pourpres non sulfureuses.

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