Ralisation de lantibiogrammeDr Nathalie GuessenndUnit des antibiotiques guessennd@yahoo.fr,

Dfinition (2) antibiogramme = outil valid par un biologiste mdical mdecin de choisir le bon antibiotique, ou l'association d'antibiotiques permettant de traiter efficacement un patient.

L ANTIBIOGRAMME Gurir rapidement

Du prlvement l'antibiogramme On recueille les bactries :o o o o o dans dans dans d dans dans le sang (hmoculture). les urines, l selles, les excrments (animaux), les ll l t ( i ) les crachats, les lavages broncho-alvolaires, le liquide cphalo-rachidien,

BUT :Trouver un traitement efficace pour le malade

Les bactries sont mises en culture et ensuite identifies et s'il est ncessaire de raliser un antibiogramme (dcision du biologiste).

Dfinition (1) Antibiogramme permet de mesurer la capacit dun antibiotique inhiber la croissance bactrienne in vivo Il doit tre ralis selon les mthodes standards

Pour tre fiable la mthode doit tre standardiseSTANDARDISATION :- de l'inoculum : quantit de bactries b i - de la glose Mueller-Hinton : Muellercomposition du milieu - de l'paisseur de la glose : diffusion de l'antibiotique - de la charge dantibiotique du disque

La standardisation permet: un antibiogramme reproductible et fiable d antibiotiques un choix adquat dantibiotiques un minimum de variation une bonne lecture une bonne interprtation

Lantibiogramme repose sur la notion de:

CMI: concentration minimale inhibitrice

Concentration minimale inhibitrice (CMI) De dilution milieu solide mili lid milieu liquide De diffusion E-test

Diffrentes mthodes

Concentration Minimale inhibitrice (CMI) CMI= plus faible concentration dantibiotiques capable dinhiber in vitro toute culture visible de la souche tudie pendant une priode de temps dfinieElle sexprime en mg/l ou g/ml

disques

Antibiogramme

Mthodes (1) la mthode par diffusion des disques imprgns dantibiotiques et la mesure des diamtres ou mthode de Kirby Bauer est celle recommande par lOMS

Mthode de diffusion de disques

Mthode standardiseSelon le Comit de lantibiogramme de la Socit Franaise de Microbiologie(http://www.sfm.asso.fr/nouv/general.php?pa=2)

Principe de lantibiogramme par diffusionDisque antibiotique(6mm) Charge connue

Milieu recommand: Mueller Hinton Epaisseur 4 mm et horizontal et bonne composition Inoculum des colonies adjacentes mais non confluentes Pr-diffusion et pr-incubation

Inoculation par talement en p CMI CMI surface de la gloseCulture Culture

Glose Mueller Hinton (4mm)

Zone dinhibition de la culture

Mthode de diffusion en gloseUtilise des disques de papier filtre (buvard) sur lesquels un antibiotique a t incorpor, sch et stabilis inoculation de toute la surface de la glose les disques sont placs sur la surface de la bote. les antibiotiques diffusent dans la glose zone d'inhibition

Gradient de diffusion et zone dinhibitionDisque dantibiotique C1 C2 C3 C4 Gradient dantibiotique dcroissant Colonies

Zone dinhibition de la culture

C1 > C2 > C3 > C4

Diamtre dinhibition

Dmarche mthodologiquePrincipe de la diffusion dun antibiotique en milieu glos partir dun disqueDisque surfae fond radiale Diffusion

Standardisation

Dmarche de qualit

Milieu Mueller Hinton Composition, paisseur (4mm), horizontalit Inoculum Choix des antibiotiques Dpt des disques et incubation lecture et interprtation

en profondeur

InoculumMatriel Bactrie vivante: Colonies jeunes en phase exponentielle d croissance (18 h ti ll de i 24h) sur milieu non slectif Eau physiologique strile Anse pour prlever les colonies, densitomtre,

Milieu pour antibiogramme

Matriel et ractifs :Milieu de culture en fonction des germes Milieu de Mueller Hinton non supplment entrobactries, pseudomonas staphylocoque.

une colonie

2ml eau physiologique : mulsionner les colonies sur le bord du tube ensuite agiterAjuster la densit de l inoculum celle de ltalon 0.5 Mac Farland en y ajoutant soit un fragment de colonie soit de leau physiologique

.

Milieu de Mueller Hinton additionn de 5% de sang frais de mouton pour les streptocoques. Glose chocolat (sang cuit) + sang cuit isovitalex pour Haemophilus et Neisseria.

Ajustement de la turbidit de linoculumSelon la famille de la bactrie : Enterobacteries et Pseudomonaceae 106 UFC/ml : diluer linoculum (0 5 l inoculum (0.5 Mac Farland 108) au 1/100 Streptococcaceae et Staphylococcaceae:107 UFC : diluer linoculum (0.5 Mac Farland) au 1/10.

Souches fragilesS. pneumoniae Neisseriaceae , Haemophilus et

Ensemencement des botes Ensemencer sur toute la surface de la bote 3 reprises Passer enfin lcouvillon sur le bord de la glose. g Laisser scher la bote pendant quelques minutes temprature ambiante, le couvercle tant ferm. Incuber 35-37C Staphylococcus et oxacilline: incuber 30C

107 UFC : diluer linoculum (0.5 Mac Farland) 1/10: 1000l dans 10ml

Ensemencement des botes E t d b t

Choix et disposition des disques di

Inondation prconise ( CA-SFM)1ml, tourner et retourner pasteur+poire aspirer avec pipette

Choix et disposition des disques dATB Choix dantibiotiques est fait selon le genre de la bactrie (voir : les antibiotiques tester de chaque espce CASFM) La disposition des antibiotiques est faite selon leur classification : -Lactamines, aminosides, quinolones et fluoroquinolones, macrolides, lincosamides, Permettant ainsi linterprtation de lantibiogramme

Ecouvillonnage (OMS/NCCLS) :Tremper un couvillon strile sec dans linoculum liminer lexcs dinoculum (en pressant lcouvillon et en le faisant rouler contre les parois du tube au dessus du niveau du liquide).

LECTURE Disposition des disques dantibiotiqueso Distributeur o Pince Disques 25mm de centre centre

Faire la lecture le lendemain Mesurer et noter le diamtre de chaque zone dinhibition en mm d inhibition Les rsultats seront interprts en fonction des diamtres critiques figurant dans des tableaux dinterprtation

Lecture des diamtres des zones dinhibition interprtation

Disposition des disques dantibiotiques Dposer les disques d ATB laide d une paire de pinces striles ou dun distributeur de disques Respecter 25 30mm entre les disques Sur une bote de 90mm, disposer au maximum 7 disques et sur une bote carre de 120 x120mm 16 disques

Lecture

OSIRISAutomate de lecture

Appuyer doucement sur chaque disque pour assurer un contact uniforme avec le milieu Laisser diffuser 10 min (prdiffusion). Mettre les botes incuber 37C dans les 30 min qui suivent la prparation pendant 18 24 h

diamtre dinhibition pour chaque atb Ce diamtre correspond la CMI Ce diamtre est report en S, R, I en fonction des f i d diamtres officiels donns par les comits dexperts

LANTIBIOGRAMMELES RESULTATS

A

B

Bactrie sensible : S La bactrie ne pousse pas en prsence de lantibiotique Le traitement avec cet antibiotique sera un succs

G

C H

Bactrie rsistante : R La bactrie pousse en prsence de lantibiotique Le traitement avec cet antibiotique sera un chec

F E

D

Bactrie intermdiaire : I Rsultat intermdiaire

Ralisation de lantibiogrammesouche par couvillonnage Ensemencer Laisser scher Dposer les disques dantibiotiques 7/bote 90 ou 16/bote 120 Incuber 37C 18h 24h Mesurer les diamtres des zones dinhibition Interprter rendu des rsultats Par inondation

Les rsultats sont rendus au mdecin en :

PRINCIPALES CAUSES D ERREURS Elles sont lies aux : -Inoculum -Disques d Di dantibiotiques ibi i -Milieu de culture -Conditions dincubation -Lecture et interprtation -Contrle de qualit

S R I

Sensible Rsistant Intermdiaire

Facteurs influenant les rsultats Facteurs influenant lantibiotique :

la diffusion de

Epaisseur de la glose : 4 mm Concentration en agar Taille et charge du disque Pr-incubation / Pr-diffusion

Facteurs influenant les rsultats Facteurs influenant lactivit de lantibiotique : Concentrations ioniques du milieu (Ca2+, Mg2+) pH du milieu Concentration de linoculum bactrien