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Méthodes dʼisolement dʼune bactérie,

Antibiogramme

Emilie Bessède, Laboratoire de Bactériologie, CHU Pellegrin

Etapes classiques dudiagnostic bactériologique

• Mise en culture du prélèvement

• Examen microscopique (direct)- numération leucocytaire (état frais)

- coloration de Gram

• Identification +/- antibiogramme

• Examen macroscopique

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Examen macroscopique

• trouble, GR, débris, odeur…

• GB, GR, bactéries, levures,cristaux…

• numérationleucocytaire

Examen microscopique (1)

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• Coloration du prélèvement par la colorationde Gram

Examen microscopique (2)

• Morphologie des bactéries- bacilles

- cocci

• Couleur- rose : Gram négatif

- violet : Gram positif

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Streptocoque

Méningite à N. meningitidiscoloration de Gram

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Méningite à N. meningitidiscoloration de Gram

Ensemencement

• Incubation dans une atmosphère adaptée

• Milieux de culture adaptés aux bactéries à rechercher

- gélosés, ou liquides

- ordinaires, enrichis ou sélectifs

• Délai de culture variable

• Obtention des bactéries en culture nécessaire à lʼidentification et aux tests de sensibilité aux antibiotiques

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Techniques d’ensemencement

• calibré : quantification des bactéries possible (ECBU, LBA..)

• en quadrants

Exemple de différents milieux utilisés

• LBA, – Géloses au sang

– Géloses chocolat

– Gélose BCP

• Urines– BCP

• LCR– Géloses au sang

– Géloses chocolat

– Bouillons

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Incubation des différents milieux

• Atmosphère à 37°C plus ou moins enrichie en CO2

• Atmosphère anaérobie à 37°C

Identification des bactéries

• Couleur, aspect, odeurs des colonies- gélosés ou liquides

- ordinaires, enrichis ou sélectifs

• Exigences de culture

• Recherche de caractères respiratoires- oxydase, catalase

• Recherche de caractères biochimiques- galeries dʼidentification

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Identification des bactéries

Automatisation des identifications

• Utilisation de galeries automatisées et miniaturisées : – Délai de 8 à 24h

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Principe de la spectrométrie de masse MALDI-TOF

Visualisation dʼun spectre

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Tableau de scores

Interprétation des cultures

• La ou les bactéries isolées sont elles potentiellement pathogènes?

• Réalisation dʼun antibiogramme- en milieu gélosé

- en milieu liquide automatisé

• La ou les bactéries isolées sont elles en situation pathogène?

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Lʼantibiogramme

• C'est la détermination de la sensibilité d'une bactérie aux antibiotiques

• Intérêt : comparer la valeur de la CMI d'un antibiotique par rapport à celle de deux concentrations critiques c et C (mg/L). Il permet de catégoriser la souche à étudier en confrontant la CMI d'un antibiotique donné à celle de la concentration c ou C

Catégorisation clinique: S,I,R

• Souches SensiblesProbabilité de succès thérapeutique forte en cas de traitement systémique à posologie recommandée (AFSSAPS)

• Souches RésistantesForte probabilité dʼéchec thérapeutique quel que soit le type de traitement et la posologie

• Souches Intermédiaires Succès thérapeutique imprévisible car:

- dissociation in vitro - in vivo- mécanisme de résistance faible cédant à une forte concentration locale ou à une augmentation de posologie- recouvre les incertitudes techniques et biologiques

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• Définition : + faible concentration dʼantibiotique qui inhibe tout croissance bactérienne visible à lʼœil nu.

• En milieu liquide

• En milieu solide

• �Antibiogrammes

• E-TEST

�

Détermination de la CMI

Non réalisé en routine

Antibiogramme en milieu gélosé

Réalisation d’unesuspension bactérienne àpartir de la bactérie isolée

Ensemencement sur lagélose

Dépôt des disques

24h d’incubation

Lecture del’antibiogramme

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Lecture des boîtes

• Catégorisation : diamètre, courbe de concordance, S, I ou R– Lʼantibiotique déposé diffuse

au sein de la gélose et réalise ainsi un gradient de concentration

– Le diamètre dʼinhibition autour du disque est proportionnel à la CMI, et comparé au diamètre critique

• Lecture interprétative, basée sur la connaissance des phénotypes de résistance

Exemples d’interprétation

K. pneumoniae BLSE : image en « bouchon de champagne »

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P. aeruginosa: détection d'une carbapénémase de la classe B (VIM-2) par la méthode de diffusion (pour les antibiotiques en jaune, apport de

20 µl d'une solution de EDTA)

E. coli, hyperproductrice de sa céphalosporinase chromosomique a été examinée d'une part vis-à-vis d'un milieu de Mueller-Hinton normal (à droite) et d'autre part vis-à-vis d'un milieu de Mueller-

Hinton supplémentée en cloxacilline (300 mg/L) (à gauche)

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E-Test

• Définition : technique de diffusion en gélose qui permet une estimation directe et rapide de la CMI dʼun antibiotique donné vis-à-vis dʼune souche bactérienne

• Bandelette– Sur un côté : échelle de CMI

(µg / mL)– Autre côté : gradient de

concentrations croissantes de lʼAB

Intérêts des E-tests

• Validé pour de nombreuses espèces bactériennes

• Intérêt pour PSDP

• Glycopeptides (méthode des disques insuffisante)

• Estimation du niveau de sensibilité dʼune souche en cas dʼinfection grave

• Coût élevé

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Antibiogrammes automatisés

80-85 cupules-1 témoin de croissance

-3 à 5 cupules/ATB pour les Gram –

-3 à 6 cupules/ATB pour les Gram +

-ensemencement manuel

Bactéries antibiogrammées-entérobactéries et non fermentants

-staphylocoques

-streptocoques

-entérocoques

• Détermination de la CMI réelle :- minimum 3 dilutions par antibiotique…

• Technologie basée sur une double lecture :- réaction colorée d’un indicateur

redox (Bleu Alamar, métabolisme)

- turbidité pour mesurer la croissanceCMI

0,25

0,5

1,0

2,0

4,0

8,0

16,0

32,0

Principe de lecture des ATB Phoenix

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Intérêts et limites des automates

• Gain de temps

• Calibration rigoureuse des suspensions bactériennes

• Estimation réelle des CMI

• Pas d’images de mécanismes de résistance

• Vérification de la pureté de l’inoculum impossible sur l’automate

Particularités des hémoculturesPrélèvement

Incubation & détection de la croissance bactérienne automatisées

Etat fraisGram

Isolement/repiquage sur géloses

Identification des coloniesRéalisation dʼun antibiogramme

Rendu des résultatsRésultat rendu négatif

Positif Négatif après 5 jours d’incubation, sauf

cas particuliers

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Traitement des hémocultures positives

• Systèmes automatiques alarme

• 4 étapes1. Gram2. Ensemencement sur milieu solide

• Pas de recommandations• Adaptés selon le Gram

– GS, aérobie, 37°C, 24h – GS, anaérobie, 37°C, 48h– Chocolat, CO2, 37°C, 24h– BCP, 37°C, 24h

3. Lecture et identification des colonies4. Antibiogramme

Conclusion

• Automatisation de plus en plus présente au laboratoire de Bactériologie

• Étape de « pousse » des bactéries inévitable, retardant souvent le diagnostic !

• Développement de la biologie moléculaire …

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