Mecanismos patogénicos de

Escherichia coli

Dr. Fernando Navarro García1). Nataro JP and Kaper JB,

Clinical MicrobiologyReviews, 11:142-201 (1998)

2). Kaper JB, Nataro JP and Mobley HLTNature reviews 2:123-140 (2004)

Escherichia coli

�Familia Enterobactericeae

�Tribu Escherichia

�Bacilo Gram Negativo

�Anaerobio facultativo predominante en colon

�Escherich 1884

�Serotipificación Kauffman 1944

�Tamaño de su genoma 4 X 109 pb

Escherichia coli Patogénica

�Infección del tracto urinario

�Meningitis/sepsis

�Enfermedad entérica (diarrea)

Síndromes clínicos

1.1. E. E. colicoli enterotoxigenterotoxigéénicanica (ETEC)(ETEC)

2. E. coli enteropatogénica (EPEC)

3.3. E. E. colicoli enterohemorrenterohemorráágicagica (EHEC)(EHEC)

4. E. coli enteroagregativa (EAEC)

5.5. EE. . colicoli enteroinvasivaenteroinvasiva (EIEC)(EIEC)

6. E. coli con adherencia difusa (DAEC)

Escherichia coli Diarreogénica

Patogenicidad de Escherichia coliDiarreogénica

Serotipos característicos de Escherichia coli diarreogénica

Características clinicoepidemiológicas de E. coli

Categoría Síndrome clínico

Distribución geográfica

Edad de

incidencia

ETEC Diarrea acuosa Países en desarrollo

Niños, viajeros adultos

EPEC Diarrea acuosa Países en desarrollo

Bebes menores de 6 meses

EIEC Disentería Mundial Niños mayores de 1 año,

preescolares

EHEC Colitis hemorrágica,

HUS

Países en desarrollo,

Latinoamérica

Niños de 2 a 7 años

EAEC Diarrea persistente

Países en desarrollo

Principalmente infantes

DAEC Diarrea acuosa Desconocido Preescolares

Tomado de: M.M. Levine and M.B.Sztein. Chapter 12 in Effects of Microbes on the inmune systemLippincott Williams and Wilkins

Diagnóstico fenotípico

•Ensayo de adherencia con células HEp-2

Diagnóstico de EPEC, DAEC y EAEC

•Se observan tres patrones de adherencia

•Adherencia localizada (LA) BFP•Adherencia agregativa (AA) AAF/I y II•Adherencia difusa (DA) F185

Adherencia Localizada (LA)

Adherencia Agregativa (AA)

Adherencia Difusa (DA)

CFA/III fimbriae of ETEC (5-7 nm) CFA/I fimbriae of ETEC (5-7 nm) P pili of UPEC (10 nm)

CS3 fibrillar structure of ETEC (2-3 nm) BFP of EPEC (>10 µµµµm) Thin, coiled aggregative curli fibres

Fimbrias de adhesiónFactores de colonización de E. coli

Virulencia

•Colonización de la mucosa•Evasión de las defensas del huésped•Multiplicación•Daño a los tejidos del huésped

Estrategia de E. coli

Principales Causas de Diarrea

•Producción de enterotoxina (ETEC y EAEC)•Invasión (EIEC)•Adherencia intima (EPEC y EHEC)

Toxinas y efectores de E. coliPatogénica (1/2)

Toxinas y efectores de E. coliPatogénica (2/2)

Versatilidad del genoma de E. coli

•Fimbrias•Toxinas•Genes reguladores•Moléculas de adhesión

Plasmidos relacionados con virulencia

Islas de patogenicidad

•Locus de adhesión y esfacelamiento (EPEC y EHEC)

Elementos individuales

•Transposones (tal como ST)•Codificado en fagos (tal como Shiga toxin)

Elementos genéticos móviles en E. coli patogénica

Categoría Plásmido de virulencia

Interacción con mucosas

Toxinas

ETEC 60 Md CFA LT, ST

EPEC 60 Md BFP, Intimina

EspC*

EIEC 140 Md IPAs ShET-2

EHEC 60 Md Intimina ShET 1 y 2

EAEC 65 Md AAF EAST1, Pet

DAEC 60 Md F1845, OMP AIDA-1

Ninguna

Mecanismo de patogenicidad en E. coli diarreogénica

Tomado de: M.M. Levine and M.B.Sztein. Chapter 12 in Effects of Microbes on the inmune systemLippincott Williams and Wilkins

Factores de Virulencia de E. coli(1/2)

Factores de Virulencia de E. coli(2/2)

•Elabora al menos un miembro de los dos grupos de enterotoxinas conocidas como ST y LT (termoestable y termolábil), estimulan al intestino y provoca excesiva secreción de fluidos.

•Involucrada en brotes epidémicos transmitidos por agua ó alimentos, alrededor de 79,420* casos por año en EU.

•Características clínicas : diarrea acuosa o sanguinolenta, dolor abdominal con o sin fiebre, nauseas.

•Enfermedad se desarrolla de 1 a 3 días del contacto con la bacteria, usualmente por un periodo de 3 a 4 días.

*http://www.cdc.gov

ETEC

Factores de Colonización de ETEC

•CFAs (CS, coli surface antigen)•Codificados en plásmidos

Nombre original CS Diámetro (nm)

CFA/I* CFA/I 7

CSI* CSI 7

CS2* CS2 7

CS4* CS4 6

CFA/III+ CS8 7

Longus+ CS21 7

CS3♠ CS3 2-3

CS5 ♠ CS5 5*Rigids rods, + Bundle-Forming, ♠♠♠♠ Fibrillar

cfa (I )(I )(I )(I ) a b c d

ETEC

Diarrea acuosaEnterocitoEnterocito

ETEC

ETEC

Toxina Termolábil (LT)

•Tóxinas oligoméricas

•LTI expresada por cepas patógenas para

humanos y animales.

•80% de identidad con CT

•Proteína de 86 kDa

•Gen elt reside en plásmido

•subunidad A de 28 kDa

•Cinco subunidades ídénticas B de 11.5 kDa

•LTII Animales, rara en humanos

•57 a 55% de identidad a LTI y CT

•Gen etx

LT1

Mecanismo de Acción de LT

ββββ

γ γ γ γ

GDPProteínas G

GTPαααα

GTP

ADPr

αααα

NAD

adenilato ciclasa“activada”

ATP cAMP

Cinasa A

Fosforilación de proteínas

Célulasde lascriptas

Célulasabsorbentes

Cl- NaCl

A

B

•Toxinas monoméricas con residuos de cisteínas

•Genes encontrados en plásmidos

•STa: ETEC, Y. enterocolítica, V. cholerae No-O1

•Variantes STIa ó STp y STIb o STh

•Idénticos en 13 residuos necesarios para

enterotóxicidad

•Incrementa niveles de GMPc

•STb: Encontrada solo en ETEC

•Induce daño histológico

Toxina termoestable (ST)

STa

Receptor/

Guanilate

cyclase C

GTP cGMP G-kinase

Cl- NaCl

Enterocito

Pruebas en ETEC

Detección de STDetección de LT

Células Y1 adrenales Asa ligada de conejo

�Patotipo productor de diarrea infantil en países en desarrollo.

�Histopatológicamente lesión A/E “attaching and effacing”

•Adhesión intima Bacteria y membrana celular.

�Se producen cambios en el citoesqueleto con acumulación de actina.

�Estructura semejante a un pedestal.

•Hafnia alvei, Citrobacter rodentium, EHEC.

�Las lesiones A/E contiene altas concentraciones de filamentos de actina polimerizados (F-actina) además de proteínas como talina, ezrina y cadenas ligeras de miosina.

EPEC

Genes de Patogenicidad

EPECEPECEPECEPEC

CromosomaCromosomaCromosomaCromosomaCromosomaCromosomaCromosomaCromosoma

EAFEAFEAFEAFEAFEAFEAFEAF

bfpbfpbfpbfp A GA GA GA Gpilinpilinpilinpilin

BBBBOMPOMPOMPOMP

C U C U C U C U perAperAperAperA B CB CB CB C EAF EAF EAF EAF probeprobeprobeprobe

escRSTU escCJ escV escN

Type III secretion apparatus

tir orfU eae espADB

LEE

Modelo de patogénesis de EPEC

1. Adherencia localizada• EAF, BFP

2. Transducción de señales3. Adherencia intima

Adherencia localizada de EPEC

� Secreción:

Secreta cinco proteínas: EspA, EspB, EspD y EspF

(sistema tipo III)

Están codificadas en una isla de patogenicidad de 35.6

kb llamada LEE

Tir (receptor para intimina), adhesina de EPEC,

codificada dentro de LEE

EspA, EspD y EspB forman un translocón

Isla de patogenicidad LEE

Sistema de secreción tipo III en EPEC

Señales de transducción EPEC

�Isla de patogenicidad LEE 35 kb

�Proteínas del sistema de secreción tipo III (sec, esp)

�EspA, EspB, EspD, Intimina

�Aumento de Ca+2 intracelular en células epiteliales

�Fosforilación de proteínas (PKC y Miosina)

•aumenta la permeabilidad de la uniones estrechas intracelulares

�Fosforilación de tirosina Hp90 es parte de la lesionA/E y su distribución se presenta bajo la bacteria adherida, en la parte superior del pedestal.

Señales de transducción EPEC

•Intimina, proteína de membrana externa de 94 a 97 kDa.

•Genes eae presentes en EPEC, EHEC, C. Rodentium y H. alvei.

•Región Carboxilo terminal, sitio de unión al receptor en la célula epitelial Tir.

•Resultados con voluntarios demostraron que la intimina participa activamente en la patogenicidad.

•Podría jugar un papel preponderante en la inmunidad a la reinfección.

Adherencia Intima EPEC

Adherencia Intima EPEC

EPEC Lesión A/E

Pedestales: EPEC Lesión A/E

Proteínas EPEC

Esenciales para el fenotipo A/E�EspA 25 kDa�EspB 38 kDa�EspD 40 kDa

Proteína EspC�Auto transportadoras, sistema de secreción Tipo IV�MUTACION EN GEN NO AFECTA 1998�Señales de transducción�Daño A/E�Cualquier otro fenotipo patogénico

•espC marco de lectura abierta con 3,924 pb.

•Molécula precursora de 140 kDa, secretada por el sistema tipo V como una proteína activa de 110 kDa.

•No está presente en LEE

•PAI espC, G-C (40.5%)Motivo de serina proteasa EspC

Péptido señal Dominio pasajero Dominio ββββ

MNK GGDSGSG

Tomado de : Stein et al. 1996. J. Bacteriol. 178:6546-54

Mellies, J. et al. 2001. Infect. Immun. 69:315-324.

Proteína EspC

Tomado de : Mellies, J. et al. 2001. Infect. Immun. 69:315-324.

espC

pJML174

Enterotoxicidad de EspC

•Produce efectos citotoxicos sobre células epiteliales.

•Se une y degrada a fodrina in vitro.

•EspC necesita ser internalizada para producir daño al citoesqueleto, la internalización se lleva a cabo a las 8 horas.

•El daño al citoesqueleto producidos por EspC se debe probablemente a su motivo de serín proteasa.

•EspC se internaliza por receptores en la membrana de las células epiteliales, aunque la naturaleza del receptor se desconoce.

EspC de EPEC

ed

r

Citotoxicidad Citoesqueleto Internalización Transfección

Efectos de EspC en células

epiteliales

Regulación de factores de

virulencia de EPEC

��Colitis hemorrColitis hemorráágica (HC)gica (HC)••Dolor abdominal, diarrea acuosa, diarrea con sangre y Dolor abdominal, diarrea acuosa, diarrea con sangre y fiebre escasa.fiebre escasa.••Brote de enfermedad por alimentos en 1983 asociado Brote de enfermedad por alimentos en 1983 asociado con hamburguesas mal cocidas. con hamburguesas mal cocidas.

��SindromeSindrome ururéémico hemolmico hemolíítico (HUS) tico (HUS) ••Diarrea inicial aguda indistinguible de HC.Diarrea inicial aguda indistinguible de HC.••Falla renal aguda, Falla renal aguda, trombocitopeniatrombocitopenia, anemia hemol, anemia hemolííticatica

��EscherichiaEscherichia colicoli O157:H7O157:H7••SLT (SLT (ShigaShiga likelike toxintoxin) ) ““SLTECSLTEC””••VerotoxinaVerotoxina ““VTECVTEC””••LesionLesion A/EA/E

EHEC

EHEC

Genes de patogenicidad

Cromosoma

Plasmido

60 MDa

EHEC�Stx�EAST1�Enterohemolisina�OMP intimina 94 a 97 kDa

Genoma de EHEC secuenciado

Shiga like toxin

�Principal factor de virulencia de EHEC•Stx1 y Stx2•Toxina identica a Stx1 de S. dysenteriae I•Estructura A-B clásica de la familia de toxinas Shiga•Subunidad B se une a un receptor glicolipido (Gb3).

�Subunidad A•Peptido A1 contiene la actividad enzimática.•Se trasloca a el citoplasma, actua en la subunidadribosomal 60S (N-glicosidasa adenina de 28s rRNA).

�Efectos•Hemorragia y edema en la lamina propia.•Necrosis focal e infiltración de neutrófilos.•Se infiltra en torrente sanguíneo.•Inflamación de células endoteliales glomerulares y deposición de plaquetas y fibrina.

EHEC citotoxicidad in vivo e in vitro

Monocapa de células VeroSíndrome disentérico

Epidemiología

��Reservorio Reservorio ••Ganado vacuno, ovejas, carneros, gatos, perros, Ganado vacuno, ovejas, carneros, gatos, perros, gallinas, cerdos.gallinas, cerdos.••Anualmente se reportan 200,000 casos y 250 muertes Anualmente se reportan 200,000 casos y 250 muertes por EHEC.por EHEC.

��TransmisiTransmisióónnPeriodo de incubaciPeriodo de incubacióón de 3 a 4 dn de 3 a 4 díías.as.••Alimentos y bebidas.Alimentos y bebidas.••Persona a persona.Persona a persona.

��DiagnDiagnóóstico stico ••Aislamiento de la bacteria en Aislamiento de la bacteria en agaragar SMAC.SMAC.••SerotipificaciSerotipificacióónn••ELISAELISA••DetecciDeteccióón de n de stxstx, , fliCfliC, , eaeeae, , pO157pO157

EAEC

��DefiniciDefinicióónn••No secreta No secreta enterotoxinaenterotoxina LT o ST. LT o ST. ••PatrPatróón de adherencia n de adherencia agregativoagregativo (AA).(AA).

��PatogPatogéénesisnesis••Aumenta la secreciAumenta la secrecióón de moco.n de moco.••LocalizaciLocalizacióón de la bacteria entre el moco y la cn de la bacteria entre el moco y la céélula.lula.••Toxina PET (Toxina PET (plasmidplasmid encodedencoded toxintoxin).).••Fimbrias AAF/I y AAF/IIFimbrias AAF/I y AAF/II

��ModeloModelo••ColonizaciColonizacióón y localizacin y localizacióón inicial.n inicial.••Aumento en la secreciAumento en la secrecióón de moco.n de moco.••ElaboraciElaboracióón de n de citotoxinacitotoxina PET.PET.

Detección y Diagnóstico

��PatrPatróón de adherencia n de adherencia agregativaagregativa••Aislamiento del microorganismo.Aislamiento del microorganismo.••Ensayo en cEnsayo en céélulas lulas HEpHEp--2. 2. ••SerotiposSerotipos asociados a EAEC.asociados a EAEC.

��PlPláásmidosmido••Sondas de DNA.Sondas de DNA.••PCR.PCR.

Adhesión de EAEC en intestino

Structural subunit of the fimbria

Role of the fimbria on the adhesion to

intestinal mucosa

Daño a celulas epiteliales por EAEC

� Enterotoxina 1 termoestable de EAEC (EAST1)produce incremento en la secreción de iones,codificada en el pAA, 6 kDa

�Pic (proteína implicada en la colonización intestinal)116 kDa, motivo de serín-proteasa, mucinasa,cromosomal

�Pet (toxina codificada por plásmido)

Factores tóxicos EAEC

Efecto enterotóxico de EAST1

PET

� Toxina de 104 kDa

� Codificada por el plásmido pAA en la bacteria

� Posee un motivo serín-proteasa (GDSGSP)

�Sistema de secreción tipo V(proteínas autotransportadoras)

�Miembro de la subfamilia SPATE (serín-proteasas autotransportadoras deEnterobacteriaceae)

Alignment of Pet protein with its closest

homologs, EspP, EspC, and SepA

Dr. Fernando Navarro-García

Pet - Plasmid encoded toxin

Signal α-domain β-domain

Serine protease domain

Cleavage Cleavage

Fernando Navarro Garcia

Signal peptidase Outer membrane protease

RGD motif

Serine protease

active site

(GDSGSP)

AutoproteolysisRole in virulence

N-terminal

signal sequenceαααα-domain

(AXB)

Extended N-

terminal signal

sequence

Signal peptidase

recognition site

Walker

A box

AUTOTRANSPORTER PROTEIN

RGD motif

C-terminal motif([Y/W/V/I/f]-X-[F/W])

antiparallel ββββ-sheet structure

ββββ-domain

Dr. Fernando Navarro-García

Outer

membrane

Cytoplasm

Periplasm

Inner

membrane

GSP machineryPolyprotein

ββββ-barrel formation

Cleavage of signal

sequence

Translocation of αααα-domain

A B C

External milieu

Type IV Secretion

Fernando Navarro Garcia

Morphologic effect of Pet protein on

epithelial cells

Dr. Fernando Navarro-García

Proteolytic activity of Pet protein on

zymogram gel

Dr. Fernando Navarro-García

203

116

83

48

33

28

Pet

pCEFN1

– + PMSFpCEFN1

SDS-PAGE Zymogram

Serine protease active site

(GDSGSP) Native Pet260

Autoproteolysis?Role in virulence?

antiparallel β-sheet structure

C-

terminal

motif

N-terminal

signal sequence

αααα-domain ββββ-domain

(GDIGSP)Pet S260I mutant

A B

1019NLNKRMGDLR...

1019NLNKRMGDLR...Native Pet

Pet S260I mutant

ββββ-domain N-terminal

sequence

Fraction N o.

0 20 40 60 80 100 120 140

O.D

. (280 nm)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Pet protein

N ative Pet proteinS260I mutant

DC

Pet S260I

Pet S260I

NativePet

proteinase K

Construction of Pet S260I mutant

Dr. Fernando Navarro-García

Enterotoxic and Cytotoxic Activities of

Pet Protein

Fernando Navarro García

Pet

PetS260I

Hep-2 cells HT29 cells

∆∆ ∆∆PD (mv)

-1

0

1

2

3

4

∆∆ ∆∆Isc (µA/cm 2)

0

100

200

Pet

pSPORT1

PetS260I

A

B

Untreated Hep-2 cells

stained with anti-Pet

Pet-treated Hep-2 cells

S260I-treated Hep-2 cells

Hep-2 cell cytoskeleton

visualised by FAS

Pet-treated Hep-2 cells

S260I-treated Hep-2 cells

Both Pet and its mutant are internalized

but only Pet produces cytoskeletal damage

Dr. Fernando Navarro-García

Espectrin II

222 3 4 765 98 121110 13 14 15 1716 1918 21201COOHNH2

(Fodrin)

222 3 4 765 98 121110 13 14 15 1716 1918 21201COOHNH2

(Fodrin)

Espectrin IIαααα

150100

75

50

37

25

250 WM

10 min

30 min

1 h

2 h

0 6 h

8 h

4 h

C

SDS-PAGE

Fodrin-GST

809 AAs 1529 AAs

Fodrin( 8-14)

98 121110 13 14GSTCOOHNH2

( 8-14)

98 121110 13 14GSTCOOHNH2

109 kDa

809 AAs 1529 AAs

Fodrin is cleavaged by Pet and occurs within

11th repetitive unit

10 min

30 min

1 h

2 h

0 6 h

8 h4 h

C

Immunoblot

37 kDa72 kDa

A

CB

Inmunocolocalization of Pet, fodrin

and actin within HEp-2 cells

B C D

E F G H20 µµµµm

A

Portada mostrando la interacción de Pet y

fodrina dentro de células epiteliales

Pet

Efectos citotóxicos

•En preparaciones de yeyuno de rata4444Incremento en la secreción de iones por las células

epiteliales (cámara de Ussing, ↑↑↑↑ ISC y ↑↑↑↑ PD)

4444 Acortamiento de las vellosidades

4444 Liberación de moco

4444 Exfoliación de células

4444 Liberación de los contactos focales

4444 Redondeamiento de la célula

4444 Contracción del citoesqueleto

4444 Pérdida de las fibras de estrésAmbos efectos no son producidos cuando se bloquea la

actividad de serín-proteasa

Efectos enterotóxicos

EIEC

�Definición•Bioquímica, genéticamente, patológicamente relacionada a Shigella spp.•Invasión del epitelio colónico.

�Invasividad•Mediada por pInv 140 MDa•Locus cromosomal mxi y spa aparato de secreción tipo III.•IpaA,B,C,D necesarias para el fenotipo de invasividad.•VirG provoca nucleación de los filamentos de actina y movimiento a través del citoplasma.

EIEC genes de virulencia

EIECEIECCromosoma

Plasmido140 MDa

SS tipo III

•Penetración de la célula epitelial.

•Lisis de la vacuola endocítica.

•Multiplicación intracelular.

•Movimiento direccional a travéz del citoplasma.

•Traslocación a células adyacentes.

EIEC modelo de patogénesis

Polimerización de actina por bacterias

Diagnóstico EIEC

��Prueba de Prueba de SerenySereny..��Sonda Sonda pMR17pMR17 derivado derivado pInvpInv..��Sonda Sonda ialial derivada derivada pInvpInv..��PCR PCR ialial..��ELISA para detectar ELISA para detectar ipaCipaC..

Fimbrias de adhesión