Les potentialités métaboliques des bactéries lactiques ...

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la

Recherche Scientifique

UNIVERSITE D’ORAN ES-SENIA Faculté des Sciences

Département de Biologie Laboratoire de Microbiologie Appliquée

Thèse de Doctorat d’Etat Option : Microbiologie Alimentaire

Titre

Les potentialités métaboliques des bactéries lactiques isolées du lait cru de

chèvre dans le bio-contrôle de Staphylococcus aureus

Présentée par : GUESSAS Bettache

Président : Pr. EL-ABOUDI A. K. Université d’Oran

Examinateur : Pr. HENNI J. E. Université d’Oran

Examinateur : Pr. AOUES A. Université d’Oran

Examinateur : Dr. MOUSSA BOUDJEMA B. Université d’Oran

Rapporteur : Pr. KIHAL M. Université d’Oran

Année Universitaire 2006-2007

I

Sommaire

Résumé ....................................................................................................................................... IIISummary....................................................................................................................................VIIntroduction ................................................................................................................................11. Revue bibliographique ........................................................................................................31. 1. Problématique. .................................................................................................................31.2 Les bactéries lactiques .....................................................................................................41.3. Définition des bactériocines ..........................................................................................51.4. Ecologie des Bactériocines.............................................................................................81.5. Détermination de l’activité de la bacteriocine .........................................................91.6. Classification des Bactériocines ................................................................................121.7. Génétique, Biosynthèse et Mode d'Action ..............................................................15

1.7.1. Organisation des gènes: génétique et biosynthèse ......................................151.7.2. Les voies de biosynthèse ......................................................................................161.7.3. Modification post-translationnelle, activation et transport ......................201.7.4. Régulation de la biosynthèse ..............................................................................221.7.5. L’immunité chez la souche productrice...........................................................231.7.6. Mode d'action ...........................................................................................................24

1.8. Production et Modélisation du processus ..............................................................301.9. Purification des bactériocines ....................................................................................311.10. Résistance.......................................................................................................................321.11. Caractérisation des bactériocines...........................................................................33

1.11.1. La nisine ..................................................................................................................341.12. Spectres d'activité des bactériocines .....................................................................401.13. Propriétés ........................................................................................................................431.14. Applications dans les aliments ................................................................................44

1.14.1. Biopreservation des produits à base de viande..........................................451.14.2. Biopreservation des produits laitiers .............................................................491.14.3. Biopreservation des produits de la mer ........................................................52

1.15. Obstacles technologiques et sécurité alimentaire .............................................531.16. Bactériocines et emballage........................................................................................551.17. Observations finales ....................................................................................................582. Matériel et méthodes......................................................................................................... 582.1. Provenances des échantillons du lait ..................................................................... 582.2. Isolement et identification de la flore lactique ...................................................... 58

2. 2.1. Préparation de l’échantillon ............................................................................... 582.2.2. Identification des isolats. ..................................................................................... 59

2.2.2.1. Caractérisation morphologiques macroscopique et microscopique592.2.2.2. Identification des souches bactériennes ................................................. 59

2.3. Conservation des souches bactériennes................................................................. 642.3.1. Conservation courte durée .................................................................................. 642.3.2. Conservation longue durée.................................................................................. 64

2.4. Caractérisation technologiques ................................................................................. 652.4.1. Production de l’acidité titrable ........................................................................... 652.4.2. Utilisation du citrate en présence de sucre fermentescible (glucose) ... 662.4.3. Production des composés aromatiques........................................................... 662.4.4. Production des enzymes protéolytiques .......................................................... 662.4.5. Production de dextran. ......................................................................................... 67

II

2.5. Etude des interactions bactériennes........................................................................682.5.1. Recherche des substances antimicrobiennes................................................682.5.2. Détermination de la nature de l’agent inhibiteur. .......................................692.5.3. Etude des interactions Staphylococcus-bactéries lactiques ....................70

2.6. Etude de la cinétique de croissance en culture mixte........................................713. Résultats ...............................................................................................................................754. Discussion générale.........................................................................................................1185. Conclusion générale ........................................................................................................1246. Références bibliographiques .........................................................................................127الملخص ..........................................................................................................................................144Annexe ......................................................................................................................................145

III

A mes parentsA ma femme et mes enfants

IV

Remerciements

V

Résumé

Les bactéries lactiques sont utilisées depuis plusieurs siècles comme des

agents protecteurs dans les aliments fermentés. Ces bactéries sont présentes

dans une grande variété d'aliments, tel que les laits fermentés, les yaourts, les

fromages, et les produits carnés fermentés. Ainsi, différentes souches d'intérêt

commerciale ou scientifique y sont couramment isolées. La contamination des

aliments est un problème majeur pour le consommateur surtout dans la

période estivale. Dans ce travail, 206 souches de bactéries lactiques ont été

isolées et identifie à partir du lait cru de chèvre des régions ouest du pays. Les

lactocoques est le groupe représentatif de cette flore avec 76,16%, les

streptocoques thermophiles ne sont représentés que par 14,78%, En revanche,

les leuconostoques ne représente que 8,6% de cette flore lactique. L’espèce

dominante est Lactococcus lactis subsp. lactis. Chez les lactobacilles,

Lactobacillus curvatus est l’espèce dominante. Lactobacillus acidophilus est la

mois représentée avec seulement 2,19%. L’étude des interactions a révélé la

capacité de deux souche Lc7 et Lc8 à inhiber Staphylococcus aureus. En

culture mixte, la souche lactique Lc8 diminue considérablement la croissance

de Staphylococcus aureus après quelques heures et elle est de 6 log cfu. Les

différents tests révèlent la nature proteique de cette substance impliquée dans

l’inhibition de Staphylococcus aureus. L’optimisation de la méthode de

recherche de souches lactiques protéolytiques a été investie et la concentration

de 2% était celle qui permet de déceler les souches faiblement protéolytiques

comme celle de forte activité prteolytique.

Mots clés : lait cru, chèvre, bactéries lactiques, Staphylococcus, culture mixte,bactériocine-like, protéolyse

VI

Summary

The lactic acid bacteria have been used for several centuries like

protective agents in fermented food. These bacteria are present in a large

variety of food, such as fermented milks, the fermented yoghourts, cheeses,

and meat products. Thus, various strains of commercial interest or scientist

are usually isolated there. The contamination of food is a major problem for the

consumer especially during the estival time. In this work, 206 strains of lactic

acid bacteria were insolated and identifies from raw goat’s milk in western

areas of the country. The lactocoques is the representative group of this flora

with 76,16%, thermophilous streptocoques are represented only by 14,78%, On

the other hand, the leuconostoques accounts are only 8,6% of this lactic flora.

The dominant species is Lactococcus lactis subsp. lactis. At the lactobacilles,

Lactobacillus curvatus is the dominant species. Lactobacillus acidophilus is the

month represented with only 2,19%. The study of the interactions revealed the

capacity of two strains Lc7 and Lc8 to inhibit Staphylococcus aureus. In mixed

culture, the lactic strain Lc8 decreases considerably the growth of

Staphylococcus aureus after a few hours and it is 6 log cfu. The various tests

reveal the proteic nature of this substance implied in the inhibition of

Staphylococcus aureus. The optimization of the method of search for proteolytic

lactic stocks was invested and the concentration of 2% was that which makes

it possible to detect the strains slightly proteolytic like that of strong prteolytic

activity

Key words: raw milk, goat, lactic acid bacteria, Staphylococcus, mixed culture,

bactériocine-like, proteolysis

1

Introduction

Depuis toujours, les bactéries sont présentes dans notre alimentation.

Certaines d'entre elles dont les bactéries lactiques, sont utiles, d'autres, comme

les bactéries pathogènes ne le sont pas. Depuis l'époque de Louis Pasteur et

Robert Koch, il y a eu un besoin essentiel d'identification scientifique pour

contrôler les micro-organismes de l’environnement. En plus, la découverte de

la pénicilline par Alexander Flemming en 1929 a ouvert la porte pour l’usage

thérapeutique des antibiotiques dans le domaine médical et vétérinaire afin de

lutter contre les microorganismes pathogènes. Bien que l'utilisation des

antibiotiques soient interdite dans les aliments, il y a d'autres agents

chimiques de conservation et additifs alimentaires, qui ont des propriétés

antimicrobiennes, sont devenus une conduite de la marque dans la sécurité et

la conservation des aliments. Actuellement, les scientifiques exploitent les

interactions microbiennes pour assurer la salubrité des aliments et pour

réduire d’une façon considérable la présence des microorganismes indésirables

et nuisibles. En plus de l’effet protecteur de l’acide lactique, l’acide acétique, le

diacetyle et le peroxyde d’oxygène, la découverte des bactériocines a donné un

élan pour le développement d’aliments de qualité sanitaire meilleure.

Le but de cette étude a donc été l'isolement des souches de bactéries lactiques

productrices de substances antimicrobiennes type bactériocine. De pouvoir

identifier correctement l'agent et la substance active. De plus. il a fallut

identifier les souches productrices et les souches sensibles et de déterminer

ainsi le spectre d'activité vis avis des microorganismes impliqués dans les

intoxications alimentaires en Algérie. Finalement, l'étude d'interaction et la

confrontation en milieu lait entre la souche de bactérie lactique productrice et

une souche de Staphylococcus aureus a été réalisée. Les objectifs de recherche

de la thèse ont donc été les suivantes :-

-.Isolement des souches de bactéries lactiques productrices de

bactériocines

- Caractérisation des substances antimicrobiennes

- Effet antagoniste vis-à-vis de Staphylococcus aureus en milieu lait.

2

Revue bibliographique sur les

bactériocines des bactéries

lactiques et leurs applications

dans la conservation des aliments

Revue bibliographique

3

1. Revue bibliographique

1. 1. Problématique.

Les bactéries lactiques sont utilisées depuis plusieurs siècles comme des

agents protecteurs dans les aliments fermentés. Ces bactéries sont présentes

dans une grande variété d'aliments, tel que les laits fermentés, les yaourts, les

fromages, et les produits carnés fermentés. Ainsi, différentes souches d'intérêt

commerciale ou scientifique y sont couramment isolées. Les bactéries

lactiques, comme les lactocoques et les lactobaciIles, sont utilisées pour leurs

différentes propriétés, surtout celle de pouvoir fermenter le lactose. Cette

propriété permet d'améliorer les qualités organoleptiques d'un aliment grâce

aux différents composés de la fermentation (diacétyl, divers acides organiques,

etc.). La fermentation permet également d'augmenter la durée de vie des

aliments. En effet. I'acidification des aliments par la production d'acide lactique

permet d'inhiber la croissance de la plupart des bactéries indésirables.

Ces deux dernières décennies, une variété de bactériocines, produites par des

bactéries et inhibant la croissance d'autres bactéries, ont été identifiées et

caractérisées biochimiquement et génétiquement. Cette revue bibliographique

est consacrée à l'étude de l'écologie des bactériocines, détermination de leurs

activités, leur biosynthèse et leur mode d'action. La modélisation de la

production de bactériocines est aussi discutée. La nisine est la seule

bactériocine actuellement purifiée et approuvé pour son usage dans la

biopréservation des aliments. La nisine est utilisée avec succès comme un

agent de conservation des aliments dans plus de 50 pays. Ce travail est axé sur

l'étude des bactériocines du produites par les bactéries lactiques. Le

développement des études sur les bactériocines permet de révéler d'autres

molécules qui ont un large spectre d'activité et qui seront utilisées comme

agents de conservation des aliments. Bien que utilisation de la nisine soit

autorisée dans plus de 50 pays (Sahl et Bierbaum, 1998), l'émergence de

souches résistantes à la nisine accroît l'intérêt porté sur les autres

bactériocines. En effet, des souches résistantes à certaines bactériocines ont

déjà été isolées; c'est notamment le cas pour la nisine et la pediocine (Goulhen

et al., 1998; Ennahar et al., 2000a). Ceci dit, l'émergence de souches

résistantes à la nisine sur le marché alimentaire, doit être considérée et les


4

précautions appropriées doivent être prises. Ainsi, la recherche de nouvelles

bactériocines et la caractérisation de leurs propriétés physiologique,

biochimique et génétique dans différents domaines de recherche mis de l'avant

pour offrir aux industriels des alternatives à la nisine.

1.2 Les bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont des micro-organismes utiles à l'homme lui

permettant de fabriquer et de conserver un grand nombre de ses aliments. Les

bactéries lactiques ont été isolées pour la première fois à partir du lait

(Metchnikoff, 1908; Sandine et al., 1972; et Carr et al., 2002). Les bactéries

lactiques sont Gram positive, immobiles, asporulées, de formes coccoide ou

bâtonnet, fermentant toutes les carbohydrates en acide lactique

principalement.

Figure 1. Schéma montrant l’arbre phylogénique basée sur la comparaison dugène de l’ARN 16 S, en groupant les bactéries lactiques à faible pourcentageCG et la relation lointaine avec les germes à gram positif de haut pourcentageCG du genre Bifidobacterium et propionibacterium (Holzapfel et al., 2001)


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Les bactéries lactiques appartiennent aux genres suivants: Carnobacterium,

Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc,

Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,

Vagococcus et Weissella (Vandamme et al., 1996; Stiles et Holzapfel, 1997,

Axelson, 2004)(Figure 1). D’autres bactéries gram positive non sporulées et

productrices d’acide lactique appartenant à la famille des actinobacteriacée et

au genre, Aerococcus, Microbacterium, et Propionibacterium (Sneath et Holt,

2001) ainsi que le genre Bifidobacterium (Gibson et Fuller, 2000; Holzapfel et

al., 2001) sont aussi impliquées dans l’industrie agro-alimentaire.

Les travaux récents sur la taxonomie effectué sur la caractérisation des

bactéries lactiques basée l’étude de la comparaison de l’ARN ribosomal 16S ont

révélé une différence dans les relation entre les la caractérisation phénotypique

et la caractérisation phylogénique. Les techniques de biologie moléculaire

spécialement la PCR (réaction de la chaine polymerase) , RFLP (Restriction

Fragment Long Polymorphisme), DGGE (Electrophorèse en Gradient Gel

Dénaturé) et TGGE (Gèl Eléctrophorèse en Gradient de Température) sont

utilisées pour confirmer l’identification précise des espèces bactériennes.

1.3. Définition des bactériocines

La découverte de la première bactériocine remonte à 1925. Cette

dernière, isolée d'Escherichia coli, possédait une activité bactéricide envers une

autre souche de E. coli. Elle fut nommée colicine V (Gratia 1925). À cette

époque, le concept de compétition entre diverses bactéries était instauré et bien

accepté. Par contre, celui où des bactéries inhibent la croissance de souches de

la même famille diffère des conceptions établies. La découverte d'une

bactériocine chez les lactocoques remonte à 1933. À cette époque, Whitehead

(1933) avait observé dans un lot de lait spécifique que la présence de deux

souches de lactocoques inhibait la croissance d'un ferment de culture

fromagère. L'étude démontra que les deux lactocoques produisaient une

substance de nature protéique résistante au traitement thermique. Ce n'est

qu'en 1944 que la première bactériocine d'origine lactique, la diplococcine, fut

identifiée. C'est en 1951 que l'utilisation de bactériocine pour protéger les

aliments fut proposée. En effet, Hirsch et al. (1951) démontrèrent que la nisine


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inhibait la croissance de Clostridium lors de la maturation d'un fromage de type

suisse.

Les bactériocines diffèrent de la plupart des antibiotiques thérapeutiques par

leur composition protéique et possèdent généralement une spécificité d'action

étroite contre les mêmes espèces (Tagg et al., 1976). Les bactériocines sont des

polypeptides synthétisés par les ribosomes et possédant une activité

bactéricide. Elles sont produites par les bactéries et possédant des propriétés

antibactériennes, mais ne portant pas le nom d'antibiotiques afin d'éviter la

confusion; car les antibiotiques thérapeutiques conservent des réactions

potentiellement allergiques chez les êtres humains (Cleveland et al., 2001).

Vue leur composition protéique, les bactériocines sont dégradées rapidement

par les protéases dans le tube digestif (Joerger et al., 2000). Les bactériocines

sont un groupe très hétérogène, elles sont caractérisées et sélectionnées pour

être utilisées en tant qu’antagoniste vis-à-vis des bactéries de contaminations

et pathogènes; cependant, leur efficacité dans les aliments est limitée pour

plusieurs raisons. Il reste que leur coût de production entrave leur usage

comme additifs alimentaires. Les recherches récentes sur les bactériocines

continuent non seulement pour révéler d'autres bactériocines plus efficaces,

mais aussi pour le développement progressif pour l'optimisation de l’utilisation

des bactériocines existantes pour répondre aux inquiétudes biologiques et

économiques.

Depuis 1950, de nombreux pays utilisent la nisine comme agent bio-

préservateur dans les aliments. Seulement, dès 1988 l'organisation mondiale

de l'agriculture FDA a autorisée et élargie l’addition de la nisine dans les

produits laitiers fabriquées à partir de laits pasteurisés, comme additifs

alimentaires (FDA, 1988). La nisine est la principale bactériocine

commercialisée, bien que d'autres bactériocines ont été caractérisées et

développées pour un possible approbation et utilisation (Chi-Zhang et al.,

2004 ; Chikindas et Montville 2002).

Les bactéries lactiques et leurs métabolites ont été consommés en grande

quantité depuis plusieurs générations sans aucun effet indésirable, de ce fait

les bactéries lactiques continuent à être la source préférée de bactériocines

utilisées dans les aliments. L'obtention de bactériocines brutes se réalise en

cultivant les bactéries lactiques productrices de bactériocines sur substrat


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naturel brut, en particulier le lait. La fermentation par les bactéries lactiques

produit d'autres substances impliquées dans l'activité antimicrobienne. Le

terme de purification de bactériocines implique que la substance

antibactérienne active est la seule substance antimicrobienne contenue dans la

préparation purifiée. L'usage intensif des bactéries lactiques dans l'industrie

alimentaire a poussé les scientifiques à créer des souches modifiées

génétiquement pour répondre aux exigences technologiques telle que la

production de bactériocines pour lutter contre la prolifération des germes

indésirables. Etant donné l'utilisation des bactéries lactiques comme levain

pour la fabrication des aliments fermentées, elles sont ainsi des candidates

évidentes pour une éventuelle modifications génétiques, afin d’améliorer

génétiquement la régulation de la production de bactériocines.

En plus de la sécurité alimentaire confirmée par les travaux scientifiques, une

perception des consommateurs d’un rôle probiotique a été sentit. Actuellement,

les scientifiques révèlent progressivement le rôle thérapeutique des bactéries

lactiques. Le terme GRAS (Generally Recognized As Safe), désigne le rôle

nutritionnel et sanitaire attribuer aux bactéries lactiques.

L'utilisation des bactériocines dans les aliments fut introduite par Hirsh et al.,

en 1951, lorsqu'il démontra que la nisine était en mesure d'inhiber la

croissance de Clostridium dans un fromage fait de lait pasteurisé. Cette

découverte eut comme effet de propulser les études sur les bactériocines. En

effet, grâce à l'activité anti-microbienne de leurs bactériocines, les bactéries

productrices ont la capacité de diminuer la charge microbienne d'un aliment et

donc de contribuer à leur innocuité. Malgré tout, seule la nisine est autorisée à

ce jour comme additif alimentaire (Delves-Broughton, 1996). En effet, la nisine

est la seule bactériocine à posséder le statut GRAS (Generally Recognized As

Safe), décerné en 1988 par la FDA des Etats-Unis (FDA, 1988).

Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont efficaces contre les

bactéries pathogènes gram-positif et ont un impact direct sur les maladies

transmises par les aliments. Les bactériocines inhibent les germes pathogènes

tels que Listeria monocytogenes, une bactérie pathogène répandue dans

l'environnement et difficile à contrôler dans les aliments. Ammor et al., (2006a

et 2006b) ont pu appliqué les bactériocines des bactéries lactiques dans des

films alimentaires afin d’inhiber la croissance des bactéries de contaminations.


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Arqués et al., (2006) ont montré l’efficacité des bactériocines des bactéries

lactiques à inhiber la croissance de plusieurs bactéries pathogènes telle que

Staphylococcus aureus dans des fromages. C’est le cas de d’autres études

(Millette et al., 2007). Pour ces raisons, l'intérêt de rechercher des bactériocines

a continué inchangé depuis les 25 derniers années et ne semble pas s'affaiblir

de manière significative.

1.4. Ecologie des Bactériocines

Il paraît que la capacité d'en synthétiser une ou plusieurs bactériocines a

été une caractéristique très avantageuse. Une opportunité claire pour la survie

et la prolifération d'un organisme peut être envisagée s'il peut éliminer un

micro-organisme en compétition là où la compétition peut être tout à fait

intense créant ainsi une diversité des espèces et la croissance rapide des

bactéries (Dykes 1995). Les antibiotiques de faible poids moléculaire (par

exemple, la tétracycline), agents lytiques, toxines, enzymes lytiques, les

bactériophages, et les métabolites secondaires, tel que les acides organiques,

l'eau oxygénée, et le diacétyle, agissent également d’une manière similaire.

Mais néanmoins la capacité de produire des bactériocines et la protéine

d’immunité par la cellule productrice se produit abondamment chez les

procaryotes, eubactéries et les archaebactérie. Les bactériocines jouent un rôle

fondamental dans la dynamique de la population bactérienne bien que le degré

d'interactions de la bactériocine soit si complexe au niveau écologique et

évolutif dans les cultures mixtes.

Comme noté par Riley (1998), le suivit des bactériocines dans les milieux

naturels, chez Lactobacillus plantarum dans la fermentation des olives vert,

chez Escherichia coli dans la conjonctive du cobaye, et Streptococcus mutans

dans la cavité orale humaine, a indiqué que l'avantage de la compétition est

augmenté substantiellement pour les bactéries productrices de bactériocines

envers les bactéries sensibles dans le même environnement.

Dans l’exemple du L. plantarum, une souche productrice de bactériocine a été

utilisée pour fermenter les olives vertes d’Espagne (Leal-Sánchez et al., 2003 ;

Ruiz-Barba et al., 1994). La souche productrice de bactériocines se maintient à

un niveau très élevé dépassant 12 semaines de fermentation. En revanche,


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quand une souche, non productrice, de la même espèce est utilisée en

fermentation, celle-ci n’est pas détectée après 7 semaines.

Sur ceci, les modèles mathématiques ont été conçus pour évaluer les

interactions entre souches productrices de bactériocine et variantes sensibles.

La plupart des modèles écologiques de bactériocines ont été fait avec la colicine

(bactériocine produite par Escherichia coli et montrant habituellement une

activité envers d’autres souches d'E. coli et des membres apparentés des

Enterobacteriaceae).

L’induction s’opère habituellement sous conditions stressantes telles

qu'épuisement nutritionnelle ou un surplus (Riley et Wertz 2002; Riley et

Gordon 1999). La colicine diffèrent des bactériocines des bactéries gram-positif

dans le sens qu'ils ont trois mécanismes d'action généraux: formation de canal

dans la membrane cytoplasmique, (le mécanisme commun est rencontré avec

les bactériocines des bactéries à gram-positif ), dégradation de l'ADN cellulaire,

et inhibition de la synthèse protéique. Il est estimé qu'approximativement 30%

des populations naturelles d'E. coli produisent des bactériocines (Riley 1998).

Plus de 25 types de colicine ont été identifiés (Pugsley 1984). Il est aussi

estimé qu’approximativement 70% de la population d'E. coli sont résistantes à

un sel type de colicine, et 30% sont résistantes à tout types de colicine produite

dans une population avec le du colicine-sensitive des cellules restantes

(Smarda 1992). Le nombre relatif aux souches productrices de colicine

dépendait de l'énergie associée avec la synthèse de la colicine (Riley et Gordon

1999).

1.5. Détermination de l’activité de la bactériocine

L’étude des interactions bactériennes est très commune. Les

bactériocines représentent une catégorie de substances produites par les

bactéries qui inhibent d’autres. Dès 1676, Antonie van Leeuwenhoek a défini

l’antibiose comme étant le produit excrété par un micro-organisme capable

d’inhiber un autre (Joerger et al., 2000). En 1877, Louis Pasteur et Joubert ont

rapporté l'effet inhibiteur de bactéries de l'urine sur Bacillus anthracis. Comme

mentionné plutôt, en plus des bactériocines, les substances inhibitrices

produites par les bactéries incluent les antibiotiques cliniques ou

thérapeutiques de faible poids moléculaire, les agents lytiques, toxines,


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enzymes bactériolytiques, bactériophages, et autres métaboliques secondaires,

tel que l’eau oxygénée et le diacétyle. Ainsi, dans une niche écologique, un seul

type de bactérie peut être plus compétitif qu'un autre vis-à-vis de la source

nutritionnelle ou la sensibilité à un facteur environnemental, tel que la

disponibilité de l’oxygène. Avec une telle variabilité de produits inhibiteurs ou

conditions environnementales, l’antagonisme n’est pas dû dans sa totalité par

les bactériocines. L’étude des bactériocines des bactéries lactiques doit prendre

en compte la grande quantité d’acides organiques produite au cours du

métabolisme bactérien et devrait écarter l’inhibition due à ces acides.

Un moyen commun pour rechercher l'activité des bactériocines est l'utilisation

des milieu gélosé en boite de Petri. Mayr-Harting et al. (1972), Piddock (1990),

Parente et Riccardi (1999) et Akçelik (2006) ont passés en revue les méthodes

de détection et d’évaluation de l’activité des bactériocines. Il y a beaucoup de

variations dans ces méthodes, la plupart d'elles dérivent de la méthode dite de

la double couche, un test direct, dont la souche productrice et sensible sont

co-cultivées et incubées puis des zones d’inhibition autour de la colonie de la

souche productrice sont recherchées. L’exemple conçu est la culture de la

souche productrice par touche ou strie, sur milieu gélosé sur laquelle une

surcouche de gélose moelle contenant la souche indicatrice ou sensible

(Sabine, 1963). Les différentes méthodes permettent de respecter le temps et

les conditions de culture relatives à la souche productrice et sensible, ces

dernières sont plus sensibles que les méthodes directes (Tagg et al., 1976).

Kekessy et Piguet (1970) décrivaient une procédure ou la souche productrice et

indicatrice étaient cultivées chacune sur leur milieu optimal respectif. La

souche productrice était cultivée sur milieu gélosé et après incubation le milieu

est complètement délogé à l’aide d’une spatule et déposé dans une autre boite

en sens inverse (culture au dessous). Une surcouche de gélose moelle

ensemencée par la souche indicatrice est coulée sur le premier milieu. Après

incubation, la production de bactériocine se traduit par l’apparition d’un halo

claire sur la surcouche contenant la souche indicatrice. Cet essai minimise les

effets d'acides et l’action des bactériophages, du fait que les deux souches sont

séparées physiquement par une couche d’agar. La composition du milieu de

culture est un facteur important dans les essais en boite de pétri, mais la

question va au-delà des exigences nutritionnelles de la souche productrice et la


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souche cible. L’utilisation de l’agar dans les milieux solides peut perturber la

diffusion de la bactériocine, donc limiter l’efficacité de la méthode utilisée

(Lindgren et Clevstrom 1978). Les autres composés peuvent entraver les

résultats. Par exemple, Hoover et al., (1989) ont trouvés que β-glycérol

phosphate (utilisé comme tampon) dans le milieu M17 avec la méthode

Kekessy-Piguet interfère avec les zones d'inhibition causées par Pediococcus

acidilactici (PO2) comparé à d’autre milieu de culture et substance tampon.

Cependant, Spelhaug et Harlander (1989), n’ont rencontré aucune difficulté à

faire exprimer l'antagonisme de la bactériocine produite par Pediococcus

pentosaceus FBB61 et FBB63-DG2 sur milieu solide M17-glucose. Peut-être,

ceci est dû à une bactériocine différente produite par ces souches ou la

méthodologie utilisée était légèrement différente.

Rose et al., (1999) ont adapté la spectrométrie de masse pour une détection

rapide de la pediocin, la nisine, la brochocins A et B, et l’enterocins A et B à

partir de surnageants de culture. La méthode est dite matrix-assisted laser

desorption/ionization time-of-flight mass spectroscopy (MALDI-TOF MS) qui a

été conçue originairement pour l'examen de grandes molécules, tel que les

biopolymers. Dans ce protocole, un lavage du surnageant pendant 30 seconde

est opéré afin d’éliminer les impuretés puis la procédure est suivit jusqu’à

purification complète de la bactériocine.

La PCR est utilisée pour détecter les gènes responsables de la production et la

régulation de la bactériocine dans les cultures bactériennes. Rodriguez et al,

(1995) ont pu amplifier le gène structural de la lactocine S chez 7 souches de

lactobacilles isolés du saucisson fermenté. Dans un autre travail, Garde et al.,

(2001) ont détecté le gène de production du lacticine 481 et la nisine en

utilisant la PCR avec une spécificité dans l’isolement de Lactococcus lactis

subsp. lactis à partir du fromage de lait cru. Rodriguez et al., (1998) ont détecté

l’enterocine AS-48 à partir des entérocoques isolés du lait et les produits

laitiers en utilisent la méthode d'hybridation des colonies. Martinez-Bueno et

al., (1994) ont réalisé le séquençage des gènes codant la synthèse de

l’enterocine AS-48. Une technique PCR a été développée pour détecter

rapidement ces gènes (Joosten et al., 1997).

Mugochi et al., (2001) ont développé une méthode rapide et sensible pour

détecter les bactériocines à partir du milieu de fermentation. Les faibles


12

concentrations d'ions de potassium ont été mesurées, ainsi la quantité libérée

par la souche bactérienne sensible corrélée avec la quantité de bactériocine

présente dans la portion de bouillon nutritif entrant dans celle-ci. Cette

méthode se compare facilement à celle de la méthode de diffusion en milieu

solide.

1.6. Classification des Bactériocines

Découvert en premier par Gratia en 1925, “principe V” a été produit par

une souche d'E. coli envers une autre souche de la même espèce. Le terme

“colicine” a été utilisé par Gratia et Fredericq (1946); “bactériocine” a été utilisé

par Jacob et al. (1953) comme un terme général pour les protéines

antibactériennes très spécifiques. Maintenant le terme colicine désigne une

protéine à caractère bactéricide produite par une souche d'E. coli et d’autres

membres apparentés aux Enterobacteriaceae (Konisky 1982). Bactériocines

(comme les colicines) ont été défini originairement comme protéines

bactéricides caractérisées par leur action létale, un large spectre d'activité, et

une adsorption spécifique sur des récepteurs de la membrane cellulaire (Jacob

et al., 1953).

Plus tard, la biosynthèse des bactériocines par les plasmides a été ajoutée à

leur description. La définition a depuis été modifié pour incorporer les

propriétés des bactériocines produites par les bactéries à gram-positif (Tagg et

al., 1976).

Chez les bactériocines, différentes règles de nomenclature ont déjà été

proposées (Hamon et Peron, 1963). Par contre, aucune n'a réellement été

adoptée de façon unanime. Bien que l'addition du suffixe «ine» soit

généralement employée, il demeure qu'il y a beaucoup de variabilité dans la

nomenclature. En fait, la nomenclature d'une bactériocine est parfois basée

sur le genre bactérien (Takeya et Tokiwa, 1974) ou parfois sur l'espèce

(Hamada et Ooshima. 1975). Il est même arrivé que pour une même espèce, la

bactériocine soit nommée selon les deux méthodes désignées. C'est notamment

le cas de Corynebacterium diphtheriae où les bactériocines sont nommées

corycine ou diphthericine selon l'équipe qui a isolé la bactériocine (Krylova,

1969; Gibson et Colman, 1973). Malgré tout, et pour des raisons de


13

simplification, il arrive fréquemment que la désignation donnée aux nouvelles

bactériocines inclut le nom de souche de la bactérie productrice (Ross et al.,

1999).

Les bactériocines des bactéries à gram-positif ne possèdent pas de récepteurs

spécifiques pour l'adsorption mais des exceptions existent (Gravesen et al.,

2002b), ces dernières sont pour la plupart de faible poids moléculaire que les

colicines, ont une large gamme de bactéries cibles, avec différents modes

d'excrétion dans le milieu externe et de transport membranaire (Jack et al.,

1995; James et al., 1991; Riley 1998). Aujourd'hui, les peptides ou les

protéines à caractère bactéricide, produites par les bactéries font typiquement

référence aux bactériocines. Habituellement, la nature protéinique d'une

bactériocine récemment caractérisé est démontrée par sa sensibilité aux

enzymes protéolytiques telles que la trypsine, l’α-chymotrypsine, et la pepsine.

Son évaluation pour être utilisé comme additif alimentaire exige l’estimation de

sa résistance à la température, un facteur très utilisé dans l’industrie

alimentaire. Durant des années, plusieurs publications ont passé en revue les

colicines, bactériocines des bactéries lactiques et l’application de bactériocines

spécifiques. Les exemples incluent Reeves (1972), Franklin et Snow (1975),

Hardy (1975), Tagg et al., (1976), Konisky (1982), Klaenhammer (1988, 1993),

Jack et al., (1995), de Vos et al., (1995), Sahl et al., (1995), Venema et al.,

(1995c), Abee et al., (1995), Nes et al., (1996), et Cleveland et al., (2001).

La plupart des bactériocines des bactéries lactiques sont cationiques,

hydrophobes, ou des molécules amphiphiliques composées de 20 à 60 résidus

d'acide aminé (Nes et Holo 2000).

Afin de faciliter leur identification, différentes méthodes de classification ont

été proposées. En 1976, une méthode de classification des bactériocines isolées

des bactéries à Gram positif fut proposée (Tagg et al., 1976). Compte tenu du

nombre important de bactériocines et de leurs multiples origines, une première

classification des bactériocines produites par les bactéries lactiques f'ut

proposée (Klaenhammer, 1988) et remise à jour par le même auteur

(Klaenhammer, 1993). Essentiellement, cette méthode classe les bactériocines

selon leur résistance à la chaleur, leur taille, certaines propriétés physico-

chimiques, leur spectre d'activité et la présence ou non d'acides aminés


14

modifiés. Pour ce faire, elle sépare les bactériocines produites par les bactéries

lactiques en quatre classes distinctes.

La classe I est formée des lantibiotiques. Ces petits peptides, de poids

moléculaire inférieure à 5 kDa, agissent au niveau de la membrane

cytoplasmique. Elles ont toute la caractéristique commune de posséder des

acides aminés modifiés. Ces derniers résultent de modifications post-

traductionnelles de la sérine, la thréonine et la cystéine en lanthionines. P-

méthylelanthionines ainsi qu'en résidus déshydratés. La nisine, la subtiline, la

duramycine ainsi que la cytolysine L1 sont des exemples de lantibiotiques

(Delves-Broughton et al., 1996; Saris et al., 1996; Sahl et Bierbaum, 1998).

La classe II est caractérisée par des petits peptides dont la masse moléculaire

est généralement inférieure à 10 kDa. Ces bactériocines sont stables à la

chaleur et sont caractérisées par un site de maturation conservé Gly-Gly situé

sur le peptide signal. Ces dernières ne contiennent pas d'acide amine modifié.

Par ailleurs, les bactériocines matures sont prédisposées à former des hélices

amphiphiles avec des régions d'hydrophobicité variable et il est prédit que la

structure secondaire de forme native possède des feuillets p. Cette classe est

subdivisée en trois sous-classes:

- classe IIa Bactériocine active contre les espèces de Listeria ayant une

séquence constitué en N-terminale de Tyr-Gly-Ans-Gly-Val-X-CyLsa. La

pédiocine PA- 1, la sakacine P, la leucocine A-UAL187 et la curvacine A

n'en sont que quelques exemples (Hastings et al., 1991 ; Holck et al.,

1992; Tichaczek et al., 1992).

- classe IIb Complexe de poration qui nécessite deux peptides pour être

actif. La lactococcine G et la lactacine F en sont deux exemples (Mulet-

Powell et al., 1998).

- classe IIc Peptides thiol-actives requérant la réduction du résidu

cystéine pour être actif. La lactococcine B en est un exemple classique

(Venema et al., 1993).

La classe III comprend toutes les bactériocines de poids moléculaire élevé (>30

kDa). Les bactériocines de cette classe ont la caractéristique d'être

thermosensible, c'est-à-dire qu'elles ne résistent pas aux traitements


15

thermiques sévères. L'helveticine I et les lacticines A et B en sont trois

exemples (Joerger et Klaenhammer, 1986; Toba et al., 1991).

La classe IV englobe les bactériocines qui nécessitent une partie non protéique

pour être active. Klaenhammer (1993) a suggéré cette quatrième classe,

comportant des bactériocines complexes qui exigent des carbohydrates ou des

fractions lipidiques pour leur activité. Cependant, les bactériocines de cette

classe n'ont pas été suffisamment caractérisées au niveau biochimique vu que

leur définition nécessite des informations supplémentaires (Jimenez-Diaz et al.,

1995; McAuliffe et al., 2001). C'est le cas notamment de la pédiocine SJ-1 et de

la lactocine 27 (Upreti et Hinsdill, 1975; Schlyter et al., 1993).

1.7. Génétique, Biosynthèse et Mode d'Action

1.7.1. Organisation des gènes: génétique et biosynthèse

La synthétise des bactériocines est ribosomiale. Les gènes qui codent la

production et l’immunité sont organisés habituellement en opéron (Nes et al.,

1996; Sahl et Bierbaum 1998; McAuliffe et al., 2001). La synthèse des

bactériocines linéaires non modifier inclue la plantaricine, la carnobacteriocine

et la sakacine, paraît induite par des peptides spécifiques. Cette synthèse est

localisée sur le même opéron (Quadri et al., 1997; Brurberg et al., 1997;

Anderssen et al., 1998). Les gènes de synthèse des bactériocines peuvent être

localisés sur le chromosome, comme dans le cas de la subtiline (Banerjee et

Hansen 1988) et la mersacidine (Altena et al., 2000) ou plasmidique, comme

dans le cas de la divergicine A (Worobo et al., 1995) et la sakacine A (Axelsson

et Holck 1995), ou sur un transposon comme dans le cas de la nisine (Rauch

et de Vos 1992) et la lacticine 481 (Dufour et al., 2000).

Les opérons de la biosynthèse des lantibiotiques contiennent généralement des

gènes qui codent pour le prépeptide LanA – lan. Cette l'abréviation faisant

référence aux gènes homologues du gène des différents groupes de

lantibiotiques. Des enzymes responsables des réactions de transformation de la

prébacteriocine (LanB,C/LanM), des protéases responsables du clivage du

peptide (LanP), le système de transport ABC (ATP-binding cassette), un système

de transport protéique responsable dans la translocation du peptide (LanT),

des protéines de régulation (LanR, K), qui sont des protéines impliqué dans


16

autoprotection chez la souche productrice (immunité) (LanI, FEG). Ces

informations ont été récoltées à partir d’une multitude d’analyse génétiques sur

plusieurs lantibiotiques, l’epidermine (Schnell et al., 1992, Bierbaum et al.,

1996; Geissler et al., 1996), nisine (Buchmann et al., 1988; Mulders et al.,

1991; de Vos et al., 1995), subtiline (Banerjee et Hansen 1988; Klein et al.,

1992; Klein et al., 1993, Klein et Entian 1994), lacticine 481 (Piard et al., 1993;

Rince et al., 1997; Uguen et al., 2000), et mersacidine (Bierbaum et al., 1995;

Altena et al., 2000).

La régulation génétique des bactériocines de la classe II, les lactococcines A, B,

et M (Holo et al., 1991; Van Belkum et al., 1991; Stoddard et al., 1992; Van

Belkum et al., 1992; Venema et al., 1995b), pédiocine PA- 1/AcH (pédiocine

PA-1 et AcH représentent la même molécule; le nom de pédiocine le PA-1 est

plus couramment utilisé) (Marugg et al., 1992; Motlagh et al., 1992;

Bukhtiyarova et al., 1994; Venema et al., 1995a), et plantaricine A (Diep et al.,

1994; 1995; 1996) ont été étudiées. Les gènes responsables de la biosynthèse

des bactériocines de la classe II se partagent plusieurs similitudes dans

l’organisation génétique. Elle en consiste dans le gène structural codant pour le

peptide précurseur, par le gène codant pour la protéine d’immunisation et

celles du système de transport ABC ainsi que d’autres protéines essentielles

dans l'excrétion dans le milieu. Ces protéines ne sont pas présentes chez les

lantibiotiques (Nes et al., 1996; Sablon et al., 2000). Enfin, dans certains cas,

on rencontre le gène de régulation. La génétique des lantibiotique et non

lantibiotique a été largement débattue par Klaenhammer,(1993), Jack et al.,

(1995), Nes et al., (1996), Sahl et Bierbaum (1998), Van Kraaij et al., (1999),

Ennahar et al., (2000b), Sablon et al., (2000), et McAuliffe et al., (2001).

1.7.2. Les voies de biosynthèse

La biosynthèse d'une bact6riocine nécessite l'interaction de plusieurs

facteurs qui sont généralement contrôlés par des protéines. L'induction de la

synthèse d'ARN, la maturation, l'exportation et finalement l'immunité de la

souche productrice sont toutes contrôlées par des familles de protéines

distinctes. De façon générale, la biosynthèse d'une bactériocine débute par le

signal provoqué par un facteur d'induction. En générale, ces facteurs

d'induction provoquent un signal chez une histidine-kinase située à la surface


17

de la membrane. Celle-ci provoque la phosphorylation d'un régulateur de

réponse qui interagit directement avec les différents promoteurs présents sur

l'opéron de la bactériocine. Quelques facteurs d'induction sont bien connus.

Par exemple, la biosynthèse de la nisine est induite par la nisine elle-même

alors que pour les bactériocines de classe II, c'est un peptide similaire à la

bactériocine qui induira la biosynthèse (Kuipers et al., 1995; Nes et al., 1996a).

Ces peptides sont généralement inactifs. Par contre, le facteur d'induction de la

plantaricine démontre une activité bactéricide (Anderssen et al., 1998).

Suite à l'induction, les bactériocines sont synthétistes par la voie ribosomique

sous forme de pré-peptides. Ces derniers possèdent un peptide signal en N-

terminal qui doit être clive pour que la bactériocine mature soit active. La

présence du peptide signal joue un double rôle. En premier lieu, tout indique

que la présence du peptide signal inactive la bactériocine (Ennahar et al.,

2000b). De plus, cette séquence en N-terminal garantit que le pré-peptide sera

exporté via le transporteur dédié ou sec-dépendant approprié (Nes et al., 1996).

Ainsi, le peptide signal pourra être clivé par une peptidase spécifique ou,

comme c'est le cas pour la plupart des bactériocines de classe II, il sera clivé

par le domaine protéolytique du transporteur lors de la sécrétion de la

bactériocine par ce même transporteur (Havantein et al., 1995). Cette

reconnaissance du peptide signal est due principalement à sa séquence. En

effet, chez les bactériocines de classe II, il est très fréquent d'observer un

doublet glycine à la position -1 et -2 du site de clivage. C'est ce doublet qui

garantit une reconnaissance du site de clivage par la peptidase dédiée.

La plupart des bactériocines sont synthétisées comme un prépeptide

biologiquement inactif qui porte une extrémité N-Terminale attachée à

l’extrémité C-Terminale du propeptide. Pour les lanthibiotiques, la sérine,

thréonine, et les résidus cystéiniques dans leurs parties du propeptide

subissent une post-translation extensive pour former Lan/MeLan. La voie de

biosynthèse des lanthibiotique suit un schéma global (Figure 1): formation du

prépeptide, réaction de modification, clivage protéolytique de l’amorce

peptidique, transport du prépeptide modifié ou du prépeptide mûr à travers la

membrane cytoplasmique.

Le clivage de l’amorce se déroule soit durant l’opération de synthèse ou après

l’excrétion de la cellule. Sur la base de cette voie de biosynthèse les


18

lantibiotiques sont génétiquement divisées en deux groupe I et II (Sahl et

Bierbaum 1998; Guder et al., 2000; McAuliffe et al., 2001). Ce plan de

classification n'est pas lié à la classification précédente qui divise les

lantibiotiques en type A et B, ainsi le groupe I et II peuvent être de type A ou B.

Par exemple, la lacticine 481 qui appartient au grouper II d'après ce plan

d'organisation génétique est un lantibiotique de type A. Dans la production des

lantibiotiques du groupe I, comme dans le cas de la nisine, l’épidermine, la

subtiline, et le Pep5, la réaction de déshydratation est catalysée

vraisemblablement par l'enzyme LanB, pendant que LanC est impliqué dans la

formation du thioether. Le prépeptide modifié est traité par une sérine-protéase

LanP et transporté à travers le système de transport ABC LanT. Par contre, les

lantibiotiques du groupe II, comme dans le cas de la cytolysine, la lacticine

481, et la mersacidine, sont modifiées par un seul enzyme LanM (Van Kraaij et

al., 1999; McAuliffe et al., 2001), et la maturation prend place de façon

concomitante au cours du transport par LanT(P). La lactocine S est l'exception

de cette classification. Elle est modifiée par un seul enzyme LanM et sa

maturation se fait avant son transport, de ce fait elle peut représenter un

nouveau groupe (Skaugen et al., 1997).


19

Figure 2 : Schémas représentant les modifications post-translationelle du Pep 5. En haut leprépeptide Pep5 non modifié. A l’éxtremité, le site d’action de la protéase. Au milieu,Dehydratation du groupement gydroxyl de l’acide aminé (R=H pour Serine ou R=CH3

pour la thréonine) et la formation du thioether (R=H pour le Lantibiotique ou

R=CH3 pour le methionine lantibiotique). En bas, cleavage du peptide amorce et la

désamination du groupement N-terminal donnant le Pep5 mature et actif.

La classe II des bactériocines (Table 1) sont synthétisées comme un prépeptide

qui contient une extrimité N-Terminale qui demeure inchangée et un site

protéolytique avec deux molécules de glycine très caractéristique pour sa

maturation, à l’exception avec la classe IIc des bactériocines, qui sont

synthétisées avec une séquence typique N-terminal dite du type sec et sont

par la suite traitées et sécrétées par la voie de sécrétion générale (Leer et al.,

1995; Worobo et al., 1995).


20

Figure 3. représente le schéma de la biosynthèse des lantibiotiques: (1) Formation dela prébactériocine; (2) la prébactériocine est modifiée par LanB et LanC, transloquée àtravers le système Abc de transport LanT, résultant de la maturation de labactériocine; (3) l’histidine a protéine kinase (HPK) phosphorylant la bactériocine; (4)le groupement phosphorylé (P) est transféré par la suite au régulateur répondant RR;(5) le RR active transcrit des gènes régulés; et (6) production de la protéines de

l'immunité, LanI, et les protéines de Transport, LanFEG (Leer et al., 1995).

Contrairement au lantibiotiques, la classe II des bactériocines ne subissent pas

une modification post-translationnelle. Le suivi de la formation du prépeptide

montre que ce dernier subit un traitement pour éliminer l’amorce peptidique

pendant son transport à travers le système ABC et ses protéines auxiliaires

(Nes et al., 1996; Ennahar et al., 2000b). La voie de biosynthèse de cette classe

est représentée dans la figure 3.

Plusieurs fonctions de l’amorce peptidique ont été proposées. Il peut servir

comme un site de reconnaissance qui dirige le prépeptide vers sa maturation et

vers la protéine du transport, protège la souche productrice en gardant le

lantibiotique dans son état inactif pendant qu’il se trouve à l’intérieur de la

cellule productrice et réagit avec le propeptide pour assurer une conformation

convenable qui est essentiel pour l’interaction du complexe enzyme-substrat

(van Der Meer et al., 1994; van Belkum et al., 1997; Sablon et al., 2000;

McAuliffe et al., 2001).

1.7.3. Modification post-translationnelle, activation et transport

Ingram (1969; 1970), le premier à avoir proposé deux étapes de réaction

de modification post-translationnelle d'un pre-lantibiotique menant à la

formation du Lan/MeLan. Initialement, les acides aminés hydroxylés, la sérine

et la thréonine, sont déshydratés pour former respectivement le 2,3-


21

didehydroalanine et le 2,3-didehydrobutyrine. Quelques acides aminés

dehydratés ne contiennent pas de résidus de cystéine et restent comme tel

dans le peptide mûr; D’autres subissent une réaction intramoléculaire

d’addition de Michael qui implique le groupement thiol des résidus cystéine

avoisinants et la double liaison de l’acide didehydroamino, donnant ainsi lieu à

la formation de ponts thioether.

Le suivit des réactions de modification, montrent que les prélantibiotiques

modifiés subissent une protéolyse pour libérer la séquence terminale menant

ainsi à l’activation du lantibiotique. Pour le groupe I des lantibiotiques, la

séquence terminale est enlevée par une protéase à sérine, LanP, et, selon

l'emplacement du LanP, cela peut avoir lieu avant ou après la sécrétion du

peptide de cellule productrice par le système de transport ABC, LanT.

Figure 4. schématise la voie de la biosynthèse de bactériocines de la classe II: (1)Formation de la prébactériocine et le facteur initial prépeptide IF; (2) Laprébactériocine et le pré IF sont traités et transportés par le système de transport Abc,produisant la bactériocine mature et l’IF; (3) l’histidine kinase (HPK) capte l’IF et lephosphorolyse par l’ATP; (4) Le groupe phosphate (P) est par la suite transféré aurégulateur RR; (5) le régulateur RR active transcrit les gènes de régulation; et (6)

production de la protéine d’immunité (Leer et al., 1995).

Par exemple, les protéases LanP de l'epicidin 280 et Pep5 (Sahl et Bierbaum

1998) sont intracellulaire afin que la protéolyse prend place dans la cellule. Par

contre, les protéases de la nisine (van der Meer et al., 1993) et l’epidermine

(Geissler et al. 1996), lesquels sont extracellulaire, activent le lantibiotique

seulement après exportation par le système de transport ABC. Ce system

contient entre 500 et 600 acides aminés et est caractérisé par deux domaine N

et C-terminal. Le domaine N-terminal consiste en 6 hélices couvrant la

membrane qui peuvent reconnaître le substrat et créer son chemin à travers la


22

membrane, pendant que le domaine cytoplasmique C-Terminal contient deux

domaines porteur d’ATP en conservant la liaison avec l’ATP. L'hydrolyse de

l'ATP se produit vraisemblablement au niveau du domaines de rattachement de

l’ATP, fournissant ainsi de l'énergie d''exportation (Fath et Kolter 1993;

McAuliffe et al., 2001). Les enzymes LanB et LanC, avec le transporteur LanT,

forment probablement un complexe multi-métrique associé à la membrane

(Siegers et al., 1996; Kiesau et al.1997). Pour le groupe II des lantibiotiques,

possédant un site de clivage di-glycine, le processus protéolytique se déroule en

concomitante avec l’exportation à travers un système de transport ABC

hybride. Cet ABC-Transporteur unique possède une protéase du domaine N-

Terminal fait approximativement de 150 résidus d'acide aminé qui clive la

séquence de tête diglycine (Nes et al., 1996; Sablon et al., 2000) (Figure 4).

Les ressemblances substantielles existent entre la séquence de tête peptidique

de la classe IIa et b et celles du groupe II des lantibiotiques. Les deux

contiennent le site de clivage à double glycine (Nes et al., 1996; Ennahar et al.,

2000b).

La conservation du site de clivage recommande fortement que le mécanisme de

traitement et de translocation des bactériocines de la classe IIa et b soit très

semblable à celui du groupe II des lantibiotiques. Les bactériocines de la classe

IIc sont traitées par une peptidase signal pendant la translocation à travers la

membrane cytoplasmique.

Figure 5. Le système de transport ABC avec un domaine N-Terminal de la protéase

(Sablon et al., 2000).

1.7.4. Régulation de la biosynthèse

La biosynthèse des lantibiotiques et nonlantibiotiques est régulée

habituellement à travers 2 systèmes régulateurs. Ces systèmes régulateurs

consistent en 2 protéines productrices de signal, une protéine kinase

membranaire représentant le site histidine (HPK), et un régulateur de la


23

réponse cytoplasmique (RR) (Stock et al., 1989; Parkinson 1993; Nes et al.,

1996). Dans la voie de transduction du signal, le HPK opère une auto

phosphorylation du résidu histidine dans son domaine intracellulaire quand il

excrète une certaine concentration de bactériocine dans le milieu externe. Le

groupe phosphorylé est transféré vers le résidu de l'acide aspartique sur le

domaine récepteur du RR et les changements intramoléculaires résultants

déclenchent une réponse de régulation pour activer la transcription du gène

régulé. Ces gènes régulés incluent le gène structurel, les gènes exportateurs,

les gènes de l'immunité, et dans quelques cas, les gènes régulateurs eux-

mêmes (Kuipers et al., 1998).

Pour la nisine et la subtiline, la molécule de bactériocine, apparemment elle-

même agit comme un signal externe pour autoréguler sa propre biosynthèse

via un signal de transduction (Kuipers et al., 1995; Guder et al., 2000). Par

contre, la plupart des bactériocines de la classe II produisent un peptide

similaire à la bactériocine sans activité antimicrobienne et utilisé comme un

facteur d’induction (IF), pour activer la transcription des gènes de régulation.

Le facteur d’induction (IF) est un petit peptide, thermostable, cationique et

hydrophobe qui est synthétisé en premier comme une prépeptide avec une

séquence de tête à double glycine. Le system de transport ABC relatif clive

spécifiquement la séquence de tête du facteur IF en concomitance avec

l'exportation du peptide mûr à partir de la cellule. Le facteur IF ainsi sécrété

agit comme un signal externe qui déclenche la transcription des gènes

impliqués dans la production de la bactériocine (Nes et al., 1996; Ennahar et

al., 2000b).

1.7.5. L’immunité chez la souche productrice

Suite à la sécrétion de bactériocines matures, l'immunité doit être

conférée à la souche productrice. Pour les bactériocines de classe I identifiées

chez les lactocoques, deux systèmes participent à l'immunité. La majorité de

l'immunité est attribuable à des protéines d'immunité dont le mode d'action

exact demeure inconnu. Il est cependant postulé que ces dernières sont

présentes sur la surface externe de la membrane bactérienne et que leur

structure est modifiée par des lipides (Kuipers et al., 1993). Deux systèmes

d'immunité des lantibiotiques de la cellule productrice ont été identifiés. La

protection peut être véhiculée par la protéine d’immunité LanI, et son système


24

de transport ABC relatif, LanFEG (Reis et al., 1994; Siegers et Entian 1995;

Peschel et Gotz 1996; Saris et al.,1996; McAuliffe et al.,2001). Ces deux

systèmes d'immunité fonctionnent synergitiquement pour protéger la cellule

productrice de leur propre bactériocine (Klein et Entian 1994). LanI, lequel est

attaché très probablement à la face externe de la membrane cytoplasmique,

donne une immunité aux cellules productrices en empêchant la formation de

pores par la bactériocine. LanFEG agit apparemment en transportant la

bactériocine qui est insérée sur la membrane vers le milieu environnant et

garder ainsi la concentration de la bactériocine dans la membrane à des

niveaux critiques.

Pour les bactériocines de la classe II, le gène d'immunisation code

habituellement pour une protéine qui est généralement associée avec la

membrane cytoplasmique. Quadri et al., (1995) ont utilisé la technique de

Western blot (immunoblot) pour ces analyses et ont indiqué que la majeure

partie de la protéine de l'immunité (CbiB2) de la carnobacteriocine B2 est

trouvée dans le cytoplasme et qu'une plus petite proportion est associée à la

membrane. Abdel-Dayem et al., (1996) ont démontré que la majorité des

protéines de l'immunité (MesI) de la mésentericine Y105 se situe dans le

cytoplasme, avec seulement une petite proportion détectée dans la membrane.

La protéine de l'immunité qui est cationique et constituée de 51 à 254 acides

aminés, fournit une immunité totale contre la bactériocine. L’interaction de la

protéine de l'immunité avec la membrane paraît protéger la souche productrice

contre sa propre bactériocine (Nissen-Meyer et al., 1993a, b; Venema et al.,

1994; Nes et Holo 2000). L'immunité serait en fait attribuée à une seule

protéine de surface. Ces protéines sont généralement de petite taille et

montrent un faible degré d'homologie entre elles. Par contre, Eijsink et al.,

(1998) stipulent que ces dernières pourraient avoir une conformation

structurelle similaire.

1.7.6. Mode d'action

La plupart des bactériocines produites par les lactocoques qui ont été

caractérisées démontrent un mode d'action semblable. En effet, à part la

lactococcine 972 qui sera décrite par la suite, les bactériocines semblent former

des pores dans la membrane des cellules sensibles. Certaines bactériocines,


25

comme la nisine, n'ont pas de récepteur spécifique (Abee et al., 1995). En effet,

la nisine semble se lier aux lipides et phospholipides cationiques présents à la

surface de la cellule (Rink et al., 2005; Moll et al. 1999). Par contre, il

semblerait que pour les lactococcines A, B et M. l'initiation de la formation de

pores nécessite la présence d'un récepteur spécifique qui permet la fixation de

la bactériocine à la membrane cellulaire (van Belkum et al., 1991). De plus,

certaines bactériocines, telles que, la bactériocine J46 dont l’activité dépendent

de la présence d'une force proton motrice sur la membrane pour pouvoir s'y

lier (Huot et al., 1996). Le modèle actuel propose que les bactériocines se

concentrent à la surface de la membrane avant de s'y insérer en adoptant une

structure en forme de tonneau. Il résulte généralement de la formation des

pores une perte du potentiel de membrane ainsi qu'une perte du gradient de

pH, les deux facteurs responsables de la force proton motrice. En plus, les

lipides anioniques de la membrane cytoplasmique sont les récepteurs

primaires de la bactériocine des bactéries lactiques pour initier la formation

des pores (Abee 1995; Moll et al., 1999). La conductivité et la stabilité des

pores induits par les lantibiotiques, peuvent être surélevés en fixant des

molécules membranaires (lipide II, le précurseur du peptidoglycan). Dans le cas

des bactériocines de la classe II, apparemment, les récepteurs dans la

membrane cible agissent pour déterminer la spécificité (Venema et al., 1995b;

1995c). Les bactériocine de la classe I, peuvent induire la formation de pore par

un mouvement transmembranaire selon le modèle de Wedge (Figure 6-A), et

celles de la classe II, peuvent fonctionner en créant des pores sous forme de

pores en barils (Figure 6-B, Figure 7) ou par un mécanisme de moquette par

lequel les peptides s’orientent en parallèle à la surface de la membrane et

interagit avec la structure de la membrane (Moll et al., 1999).

Pour la nisine par exemple, les pores peuvent atteindre une dimension de 1,2

nm. La présence de ces pores induit la perte de plusieurs composés de faible

poids moléculaire (ions, acides aminés et ATP) qui vont quitter l'intérieur de la

cellule. La perte d'ions est ainsi responsable de la déstabilisation du potentiel

de membrane, de la perte d'ATP et du gradient de pH. La disparition de la force

proton motrice et l'inhibition de la synthèse de macromolécules provoquent la

mort de la cellule sensible après 20-30 minutes de contacte (DeVuyst et

Vandamme, 1994).


26

Figure 6. Montre l’action des bactériocine de la classe I qui peuvent induire laformation de pore par un mouvement transmembranaire selon le modèle de Wedge (A)et celles de la classe II, qui peuvent fonctionner en créant des pores sous forme depores en barils (B) ou par un mécanisme de moquette par lequel les peptidess’orientent en parallèle à la surface de la membrane et interagit avec la structure de lamembrane (Moll et al., 1999).


27

Figure 7. Schéma représentant la structure et le mécanisme d’action desbactériocines de la classe-IIa à travers la perforation de la membrane cellulaire: (a)structure de la bactériocine; (b) possibilité d’interactions avec la surface de lamembrane; (c) insertion de la molécule de bactériocine et la formation des poreshydrophiliques.

Gravesen et al., (2002b) ont examiné la résistance de Listeria

monocytogenes à la classe II des bactériocines et ont trouvés un rapport avec

le site spécifique de reconnaissance. Huit mutants de L. monocytogenes


28

résistants aux bactériocines de la classe IIa, tel que la pediocine PA-1 et la

leucocine A, ont été isolés et étudiés. La mutation trouvée dans toutes les

souches mutantes résistantes était dûe à une sous unité d'une enzyme dans

un système d’enzyme appartenant à la phospho-transférase

phosphoenolpyruvate-dépendant mannose-spécifique régulée par le facteur de

transcription spécifique nommé σ54. Il a été interprété que la résistance à ces

bactériocines dans L. monocytogenes et autres bactéries gram-positives est

fondamentalement en rapport avec ce site commun sans aucun rapport avec la

souche, ni le type de bactériocine de la classe IIa, ou les conditions de cette

expérience. Il a été suggéré que la mutation à cette sous unité spécifique

localisée dans la membrane a changé le site de reconnaissance de la cible des

bactériocines de la classe IIa.

La lacticine 3147 est un lantibiotique constitué de 2 composants, 2 peptides

appelés lac 1 et lac 2 (McAuliffe et al., 1998); les deux composants sont

nécessaire pour exercer une activité antagoniste complète résultant de la

formation de pores ioniques spécifiques dans la membrane de la cellules gram

positive cible. McAuliffe et al., (2000) ont démontrés que la lacticine 3147 exige

une enzyme de modification séparée pour chacun des prepeptides lac1 et lac2.

Deux autres bactériocines à deux composants connues sont la lacticine F (Abee

et al., 1994), la lactococcine G (Nissen-Meyer et al., 1992), et la thermophiline

13 (Marciset et al., 1997).

La première étape d’action dans son adsorption à la membrane cellulaire

bactérienne nécessaire dans la rupture de la membrane par la nisine est

souvent comparée à un détergent cationique actif en surface. Cela est suivi par

une inactivation du groupe sulfhydryl. Bruno et al., (1992) ont démontré que

la nisine dissipe complètement la force protonique motrice chez L.

monocytogenes Scott A. D’autres souches de L. monocytogenes ont été trouvées

également sensibles à la nisine, en exprimant une réponse similaire à la

détérioration du gradient pH et le potentiel membranaire. D’autre bactériocines

de la classe I des bactéries lactiques se comportent d’une manière similaire. La

carnocine UI49 agit sur la membrane cytoplasmique dans un modèle

semblable à la nisine (Stoffels et al., 1994). La perméabilité aux ions ou la

formation de canaux dans les membranes cytoplasmiques provoqués par les

bactériocines de Lactobacillus acidophilus, a été démontrée en utilisant des


29

membranes lipidiques artificielles (Palmeri et al., 1999). L’augmentation de la

conductance de la membrane a été détectée et des canaux avec une

conductance élémentaire de 68 à 70 mV a été mesurée en appliquant un

voltage externe de polarité différente.

La lactocine 27, produite par Lactobacillus helveticus LP27, a été décrite dans

les travaux de Upreti et Hinsdill (1975) comme une bactériocine dont l'effet

était bactériostatique. Elle a été adsorbée aussi bien par des souches sensibles

que par des souches résistantes en inhibant la synthèse des protéines.

Cependant, il y avait un effet remarquable sur l’ADN, la synthèse de l’ARN et

l'ATP. Zajdel et al., (1985) trouvez que la lactostrepcine, Las 5, bloque

immédiatement la synthèse d'ADN, de l’ARN, et les protéines, mais ces

conséquences étaient probablement une réaction secondaire à de multitude

ruptures sévère membranaire et perte de composants intracellulaires. Les

souches bactériennes sensibles et résistantes adsorbent de la même manière la

bactériocine Las 5. Les protoplastes des souches bactériennes sensibles n'ont

pas été affectés par Las 5, indiquant ainsi la nécessité les récepteurs

membranaires cellulaires pour l'action de la bactériocine.

Andersson (1986) a démontré que les souches gram-négatif résistantes telle

que Escherichia coli, Erwinia carotovora, Pseudomonas aeruginosa, et Serratia.

marcescens pourraient être rendus sensible à la bactériocine de Lactobacillus

plantarum en transformant les cellules gram-négatif en sphéroplastes. Des

travaux subséquents ont montré l’inactivation de bactéries pathogènes à gram-

négatif avec les bactériocines de bactéries gram-positives avec l'usage d'agents

chélateurs (EDTA), qui diminue les propriétés des barrières fourni par les LPS

membranaires externes de ces bactéries gram-négatives (Stevens et al., 1991;

Shefet et al.,1995; Scannell et al., 1997; Helander et al., 1997). Des stress

supplémentaires aux bactéries gram-négatives comme une approche à savoir

l’application simultanée de plusieurs processus peut rehausser l'efficacité

d'une bactériocine. Cutter et Siragusa (1995) ont montré que la nisine (à 2000

IU/ml) était efficace contre les bactéries gram-négatives (E. coli O157:H7 et

Salmonella enterolytica serovar typhimurium) quand elle est utilisée avec

l’EDTA, le citrate, ou le lactate. Ganzle et al., (1999) ont démontré que la

curvacine A et la nisine en combinaison avec un pH bas, une concentration de

NaCl supérieure à 5%, ou le propylparabene provoque une augmentation de la


30

sensibilité de Salmonella et E. coli envers ces bactériocines. Tel effet est

suggérer par de nombreux travaux, la combinaisons de l’action de la

bactériocine avec des agents additionnels et d’une manière appropriée qui peut

élargir considérablement le spectre d’action de quelques bactériocines des

bactéries lactiques contre les bactéries gram négative.

1.8. Production et Modélisation du processus

Dans le but de rendre l’usage commercial des bactériocines économiquement

faisable, il est nécessaire d’optimiser le rendement pendant la production.

Dans une étude de production de la nisine, la pediocine PA-1 de Pediococcus

acidilactici, la leuconocine Lcm1 par Leuconostoc carnosum, et la sakacine A

par Lactobacillus sake Lb 706, Yang et Ray (1994) ont trouvé que dans le

milieu de culture, le facteur clé est le maintien d’un pH optimal et l’addition

dans le milieu, d’éléments nutritifs spécifiques pour chaque souche ou espèce.

Les conditions favorisant l’obtention d’une concentration élevée de cellules

résulte en une augmentation comparable dans la bactériocine libérée

représentant ainsi un indice de métabolite primaire. Pour augmenter le

rendement et la pureté des bactériocines des bactéries lactiques à partir des

fermentations industrielles et avec des frais de production inférieurs, Coventry

et al., (1996) ont démontré que la nisine, la pediocin PO2, la brevicine 286, et

la piscicoline 126 pourrait être synthétisé en excès dépourvu de protéines de

contamination (92 à 99%) en utilisant la diatomite au silicate de calcium et

plusieurs agents de désorption comparé aux surnageant de la culture d’origine

et aux extraits par le sulfate d'ammonium. Pour réduire les frais de production,

On continu à améliorer la vitesse et la production par la méthode de

purification de la bactériocine à partir du bouillon de culture (Guyonnet et al.,

2000). Carolissen-Mac Kay et al., (1997) ont examiné des protocoles pour

purifier des bactériocines des bactéries lactiques. Dans le but d'obtenir des

modèles de production qui ont été divisé pour prévoir l’efficacité commerciale

de la bactériocine basée sur les informations rassemblées dans les systèmes

tests afin d'optimiser les applications des bactériocines.

Blom et al., (1997) ont conçu une méthode pour l’examen simultané de l'effet

de facteurs intrinsèques (pH, concentration de la souche indicatrice, agar,

huile de soja, et la concentration du NaCl) sur la diffusion et l’efficacité de la


31

bactériocine sur milieu gélosé en boite. En effet, la Sakacine A et P, piscicoline

61, pediocine PA-1, et la nisine chacune d'elle étaient dépendante d’un facteur

intrinsèque unique, bien que le pH et la concentration de la souche indicatrice

affecte toutes les bactériocines d’une manière similaire. A l'exception de la

préparation commerciale de nisine, les autres bactériocines ont été

synthétisées en utilisant des souches génétiquement modifiées de Lactobacille

Lb790.

Parente et al., (1998) ont analysé la régression de donnée catégoriques pour

générer des modèles prédictives pour la probabilité de survie pour Listeria

monocytogenes, comparé avec la leucocine F10 et la nisine dans un bouillon de

soja trypsique avec 0.6% d’extrait de levure. La nisine avait un effet

considérable sur la probabilité de survie, mais l’addition de la leucocine F10

était nécessaire pour éliminer Listeria monocytogenes. Une baisse dans le pH

du milieu de culture diminué la survie pendant que le NaCl et l’EDTA ont

exercé un effet limité. Pleasants et al., (2001) ont étudié comme modèle la

croissance de Listeria monocytogenes L70 en réponse à l’égard de la

bactériocine sakacin A de Lactobacillus sake 706. Dans le bouillon MRS, il a

été trouvé que Lactobacillus sake croit plus rapidement que Listeria

monocytogenes L70 à pH réduit. L’éxcrétion de la sakacine A par la souche

productrice réduit rapidement la présence de Listeria monocytogenes dans la

culture mixte. Il a été montré aussi que le modèle pourrait prévoir

correctement la croissance et l’interaction entre les deux bactéries dans le

milieu de culture utilisé.

1.9. Purification des bactériocines

Grâce a leurs caractéristiques intrinsèques, plusieurs bactériocines sont

purifiées selon un profil classique. A savoir, la purification de plusieurs

bactériocines de classe I et II s'accomplit à l'aide de trois étapes distinctes. La

première et la deuxième résident en une concentration, accompagnée d'une

pré-purification sur une colonne de chromatographie à basse pression. L'étape

finale consiste en une purification sur HPLC (chromatographie en phase

liquide). Ainsi, la plupart des protocoles de purification à l'échelle analytique

regroupent une étape de précipitation au sulfate d'ammonium (NH4)2SO4 suivie

d'une série de colonnes ionique ou hydrophobe et finalement d'une étape de


32

chromatographie à phase inverse (Parente et Ricciardi, 1999). En revanche, il

arrive que la chromatographie puisse être remplacée par une étape

préparatoire selon le point isoélectrique (Venema et al., 1995b). De même,

lorsque les anticorps sont disponibles, I'immunoaffinité permet la purification

de bactériocine, telle que la nisine Z, en une seule étape (Bouksaim et al.,

2000). La concentration par précipitation au sulfate d'ammonium consiste en

l'ajout graduel du sel à une solution afin de précipiter les protéines. Compte

tenu que la précipitation des protéines dépend de leur charge nette, l'ajout

progressif de sel conduit à une première étape de purification avec l'obtention

d'un facteur purification de 2 à 3. Bien que mineure, le premier rôle de la

précipitation consiste à concentrer les protéines à un volume adéquat destiné à

la chromatographie sur colonne. La chromatographie à basse pression permet

de purifier partiellement les fractions avant I'HPLC. La chromatographie à

haute pression permet une séparation rapide, accompagnée d'une résolution et

d'une sensibilité accrue par rapport à la chromatographie à basse pression.

Compte tenu de la nature hydrophobe des bactériocines, la chromatographie à

phase inverse où la phase mobile est hydrophile et la phase non mobile est

hydrophobe, est fréquemment employée à cette étape.

1.10. Résistance

La présence d'une substance antibactérienne dans un environnement

donné, sélectionnera éventuellement une variété de bactéries résistantes aux

composants antagonistes. Comme, dans le cas de la résistance bactérienne aux

antibiotiques thérapeutiques dans l'environnement, on constate aussi,

l’émergence de mutants bactériocine-résistants.

Gravesen et al., (2002a) ont examiné les réponses de plusieurs souches de L.

monocytogenes à la pediocine le PA-1 et à la nisine, et ont trouvé une grande

gamme de résistances aux deux bactériocines qui se produisent naturellement.

L'influence du stress du milieu (abaissement du pH, basse température, et la

présence du NaCl) paru spécifique aux bactériocines; ceci dit, ces stress n'ont

pas influencé la fréquence de résistance à la pediocine PA-1, mais la fréquence

de résistance à la nisine a été considérablement réduite. La stabilité du

phénotype de résistance à la nisine a varié considérablement, cependant la

résistance à la pediocine était stable avec une croissance continue de L.


33

monocytogenes. La diminution du taux de croissance chez les mutants

pediocine-résistants de L. monocytogenes a été démontrée, mais les mutants

nisine-résistants ont montré une réduction limitée du taux de croissance. Les

mutants de L. monocytogenes résistants aux bactériocines ne sont pas plus

sensibles aux stress environnementaux comparé à la souche sauvage; dans un

model de croissance sur saucisse les différences étaient faibles.

Horn et al., (1999) ont transférés les gènes de la biosynthèse de la pediocine

PA-1 dans une souche de L. lactis FI5876 productrice de nisine. En

conséquence, toutes les deux bactériocines, la pediocine PA-1 et la nisine A

sont synthétisées simultanément par cette souche de Lactococcus. Le niveau de

production de la pediocine PA-1 a été similaire à celui trouvé dans la souche

productrice d’origine de la pediocine, Pediococcus acidilactici 347. Vu que la

pediocine PA-1 et la nisine A sont des bactériocines sans aucun rapport,

l’utilisation de L. lactis FI5876 comme une culture starter dans les produits

laitiers fermentés devrait empêcher l’émergence d’isolats de L. monocytogenes

résistants aux bactériocines parce que la fréquence d’apparition d'une souche

résistante aux deux peptides devrait être très bas.

Modi et al., (2000) ont évalué la résistance de L. monocytogenes à la nisine afin

de répondre à la question, est-ce la résistance spontanée à la nisine conduit à

l’augmentation de la résistance à la chaleur relative aux souches de type

sauvage. En l'absence de nisine, il n'y avait aucune différence significative dans

la résistance à la chaleur. Quand la souche de L. monocytogenes résistante à la

nisine est cultivée en présence de nisine à 55°C, ses cellules deviennent plus

sensibles à la chaleur. Quand les cellules résistantes à la nisine ont été

soumises à un traitement combiné de la chaleur et la nisine, il y avait un effet

synergétique d'inactivation. Après exposition à la chaleur, les cellules

résistantes à la nisine, une fois encore, sont devenues sensibles aux effets de la

nisine. Dans le cas de L. moncytogenes, la résistance à la nisine ne paraît pas

être particulièrement stable, Aucune donnée sur l’effet indésirable de la

résistance à la chaleur surélevée n'a été enregistrée.

1.11. Caractérisation des bactériocines

L'analyse approfondie des différentes bactériocines produites par les

lactocoques sera abordée dans cette partie avec quelques caractéristiques

générales qui sont résumées au tableau 1.


34

1.11.1. La nisine

A un moment donné, il était exacte de dire que les colicines étaient les

plus étudiés et la plupart très connues; cependant, c'est maintenant sûr de

dire que les bactériocines produites par les bactéries gram positives, est le

groupe le plus étudié des peptides antibactériens, permettant une possibilité

pour leur applications commerciales dans les produits alimentaire. La nisine

est devenue populaire à cause de sa longue histoire de son utilisation et son

efficacité ainsi que sa documentation sur son action contre les bactéries

pathogènes à gram positif et les microorganismes de contamination. Ce n'était

pas exceptionnel pour les fabricants de fromage d’observer des fermentations

manquées ou lentes. Pendant que l'infection avec les bactériophages était un

contributeur majeur à ce problème, il a été reconnu que quelques

streptocoques lactiques pourraient inhiber d’autres, responsables des

problèmes dans la fabrication fromagère. En 1928, Rogers et Whittier en

premier, ont publié sur l'effet inhibiteur implicite de la nisine dans laquelle

Streptococcus lactis (maintenant Lactococcus lactis subsp. lactis) a inhibé

Lactobacillus bulgaricus (Rogers 1928; Rogers et Whittier 1928). Whitehead et

Riddet (1933) ont décrit “streptocoques inhibiteurs” dans le lait. Le nom nisine

a été inventé par Mattick et Hirsch (1947) de “N inhibitory substance” depuis L.

lactis a été classé originairement comme appartenant au groupes sérologique

de Lancefield N. Des efforts récents, afin de mettre au point une application

pratique pour la nisine à savoir son efficacité pour le traitement des mammites

des troupeaux laitiers (Taylor et al., 1949). Hirsch et al., (1951), en premier,

ont examiné la possibilité de l’utilisation de la nisine comme conservateur

alimentaire


35

Tableau 1 : représente différents types de bactériocines produites par lesbactéries lactiques (Chen et Hoover, 2003).

Bactériocines Souches productrices

Classe I-type A lantibiotique

Nisine Lactococcus lactis

lactocine S Lactobacillus sake

Epidermine Staphylococcus epidermidis

Gallidermine Staphylococcus gallinarum

Lacticine 481 L. lactis

Classe I-type B lantibiotique

Mersacidine Bacillus subtilis

Cinnamycine Streptomyces cinnamoneus

Ancovenine Streptomyces spp.

Duramycine S. cinnamemoneus

Class IIa

pediocine PA-1/AcH Pediococcus acidilactici

sakacine A L. sake

sakacine P L. sake

leucocine A-UAL 187 Leuconostoc gelidum

mesentericine Y105 Leuconostoc mesenteroides

enterocine A Enterococcus faecium

lactococcine MMFII L. lactis

Class IIb

lactococcine G L. lactis

lactococcine M L. lactis

lactacine F Lactobacillus johnsonii

plantaricine A Lactobacillus plantarum

plantaricine S L.plantarum

plantaracine EF L.plantarum

plantaracine JK L.plantarum

Class IIc

acidocine B Lactobacillus acidophilus

Camobacteriocine A Carnobacterium piscicola

divergicine A C. divergens


36

enterocine P E. faecium

enterocine B E. faecium

Class III

helveticine J Lactobacillus helveticus

Helveticine V-1829 Lactobacillus helveticus


37

Tableau 2: Indique les différentes classes de bactériocines I et IIa produitentpar les bactéries lactiques et leur spectre d’activité (Chen et Hoover, 2003).

Bacteriocines Souches productrice Spectre d’activité (fréquence de sensibilité)

Classe I

Acidocine

J1132

Lactobacillus

acidophilus JCM1132

Active contre différentes espèces de Lactobacillus (9/32)*. nonactive contre Lactococcus (0/6), Pediococcus (0/5), Streptococcus(0/7), Listeria monocytogenes (0/4), Bacillus spp. (0/7), etStaphylococcus spp. (0/2).

Lacticine

3147

Lactococcus lactis

DPC3147

Active contre différentes espèces de Enterococcus (4/4),Lactobacillus (14/14), Lactococcus (17/18), Leuconostoc (1/1),Pediococcus (3/3), Streptococcus (2/2), L. monocytogenes (1/1),Listeria innocua (1/1),Staphylococcus aureus (1/1), Bacillus spp. (2/2) et Clostridiumspp. (2/2).

Lactocine S Lactobacillus sake L45

Active contre différentes espèces de Enterococcus (1/1),Lactobacillus (8/8), Lactococcus (1/3), Leuconostoc (1/1),Pediococcus (3/3), L. monocytogenes (5/5), L. innocua (1/1),Staphylococcus (6/6), Bacillus cereus (1/1), et Clostridium spp.(5/5).

Nisine Lactococcus lactis subsp. lactis

Active contre différentes espèces de Enterococcus (2/2),Lactobacillus (9/9), Lactococcus (5/5), Leuconostoc (1/1), Pediococcus(4/4), L. monocytogenes (14/14), L. innocua (2/2), Listeria grayi(1/1), Listeria ivanovii (1/1), Listeria murrayi (1/1), Listeria seeligeri(1/1), Listeria welchimeri (1/1), et Staphylococcus spp. (7/7).Empèche la germination des spores de Bacillus spp. et Clostridiumspp. et un effet bactericide sur les formes végétatives.

Plantaricine C Lactobacillus plantarum LL441

Active contre différentes espèces de Enterococcus (1/1),Lactobacillus (8/11), Lactococcus (1/1), Leuconostoc (2/2),Pediococcus (2/2), Streptococcus (2/2), Staphylococcus carnosus(1/1), Bacillus spp. (2/3), et Clostridium spp. (2/2). Aucune activitécontre L. innocua (0/1).

Thermophiline 13 Streptococcus thermophilus SFi13

Active contre differentes éspèces de Enterococcus (1/1),Lactobacillus (3/3), Lactococcus (1/1), Leuconostoc (2/2),Streptococcus (1/1), L. monocytogenes (1/1), L. innocua (1/1), S.carnosus (1/1), Bacillus spp. (2/2), et Clostridium spp. (2/2).Empèchela germination des spores de B. cereus et Clostridiumbotulinum

Classe IIa

Acidocine ALactobacillus acidophilusTK9201

Active contre différentes espèces de Enterococcus (1/5),Lactobacillus (13/32), Pediococcus (2/7), Streptococcus (8/13), andL. monocytogenes (5/5). Aucune activité contre Bacillus subtilis(0/6) et S. aureus (0/2).

Bavaricine ALactobacillus sake

MI401

Active contre différentes espèces de Enterococcus (2/2),Lactobacillus (11/25), Lactococcus (5/15), Leuconostoc (4/7),Pediococcus (2/5), et L. monocytogenes (9/10). Aucune activitécontre Carnobacterium (0/1), Streptococcus (0/2), Brochothrixthermosphacta (0/1), Bacillus spp. (0/7), et Staphylococcus spp.(0/5).

Curvacine ALactobacillus curvatus

LTH1174

Active contre differentes éspèces de Carnobacterium (3/3),Enterococcus (1/2), Lactobacillus (10/23), Lactococcus (1/12),Pediococcus (5/8), L. monocytogenes (7/7), L. innocua (1/1), et L.ivanovii (1/1). Sans aucune activité contre Leuconostoc (0/3) etClostridium spp. (0/12).

Divercine V41 Carnobacterium divergens V41

Active contre différentes espèces de Enterococcus (4/4),Lactobacillus (2/5), Pediococcus (2/2), L. monocytogenes (1/1), L.innocua (1/1), et L. ivanovi (1/1). Sans aucune activité contreLactococcus (0/1) et Leuconostoc (0/3).

Enterocine AEnterococcus faecium

CTC492

Active contre différentes espèces de Enterococcus (4/4),Lactobacillus (2/2), Pediococcus (2/2), L. monocytogenes (4/4), et L.innocua (2/2).

Lactococcine Lactococcus lactis Active contre différentes espèces de Enterococcus (3/3),

Mesentericine

Y105

Leuconostoc mesenteroidesY105

Active contre différentes espèces de Carnobacterium (1/1)Enterococcus (2/2), Lactobacillus (2/2), Leuconostoc (2/2),Pediococcus (2/2), L. monocytogenes (1/1), et L. innocua (1/1).Empèche la germination des spores et la croissance des formesvégétatives de Clostridium botulinum

Mundticine Enterococcus mundtii ATO6

Active contre différentes espèces de Carnobacterium (3/3)Enterococcus (2/3), Lactobacillus (23/31), Lactococcus(1/14),Leuconostoc (3/4), Pediococcus (8/11), L. monocytogenes (12/12), L.innocua (2/2), L. ivanovii (1/1) Staphylococcus spp. (2/6), B. cereus(1/1), et Clostridium spp.

Pediocine PA-1Pediococcus acidilactici PAC1.0


38

En 1957, la nisine a été rapporté pour être généralement un produit utilisé

dans le fromage de ferme (Chevalier et al., 1957). Dans cette même année,

Aplin et Barrett ont développé des préparations commerciales à utiliser dans

les aliments (Delves-Broughton et al., 1996). Les substances de nisine sont

habituellement trouvées parmi la flore fromagère (Hurst 1967). Actuellement, il

est connu que les lactocoques peuvent produire d'autres bactériocines et des

substances inhibitrices en plus de la nisine. Gross et Morrell en 1971, sont les

premier à élucider la structure de la nisine qui est faite de 34 acides aminés.

Au moins 6 formes différentes ont été caractérisées (désigné par A jusqu’à E et

Z), avec la nisine A représentant le type le plus actif. La Nisine Z est un variant

naturel de la nisine qui différe de la nisine A par la substitution d'un résidu

histidine par l’acide aspartique. La forme commercialement disponible la plus

établie de la nisine utilusée comme conservateur alimentaire est a la

NisaplinTM, avec comme composant actif 2,5% de nisine A et le composant

prédominant est représenté par du NaCl (77.5%) et du lait sec sans matière

grasse (12% protéine et 6% carbohydrates). Plusieurs marques de produits

antimicrobiens vendues contiennent de la nisine.

La nisine est un lantibiotique. Le terme lantibiotique vient de l’antibiotique

contenant la lanthionine. Cette agent antimicrobien contient des acides aminés

inhabituels postranslationnellement modifiés, reliés par un pont thioether

lanthionine et 3-methyllanthionine, et le 2,3-didehydroalanine insaturé et le

2,3-didehydrobutyrine (van Kraaij et al., 1999). Ces résidus insaturés ou

déshydratés caractérisés par des centres électrophiliques qui peuvent réagir

avec les groupes nucléophiles proches (McAuliffe et al., 2001). Par conséquent,

les lantibiotiques caractérisés par des structures polycycliques qui sont très

important pour la propriété de l’insertion membranaire de la bactériocine. Ces

structures en bague maintiennent la rigidité du peptide (Kuipers et al., 1996)

aussi bien ils protègent la bactériocine des enzymes protéolytiques et la

dénaturation thermique (Hurst 1981). La nisine appartient à la classe I des

bactériocines et du type A des lantibiotiques (c'est un peptide étiré avec une

charge positive nette). Les lantibiotiques apparentés à la nisine qui ne sont pas

produites par les bactéries lactiques incluant la subtilins de Bacillus subtilis et

l'epidermins à partir de Staphylococcus epidermidis. Comme la Nisine, ces


39

peptides fonctionnent en désorganisant par rupture de l'intégrité de la

membrane.

La nisine n'a habituellement aucun effet sur les bactéries gram négatif, les

levures, et les moisissures, bien que les bactéries gram négatif puissent être

sensibilisées à la nisine par la permeabilization de couche membranaire

externe similaire à celle causé par chauffage létale, la congélation, et les agents

chélateurs (Delves-Broughton et al., 1996).

Normalement seule les bactéries gram positif sont affectés, et ces types

incluent les bactéries lactiques, cellules végétative des bactéries pathogènes

tels que Listeria, Staphylococcus, et Mycobacterium, et les bactéries sporulales,

Bacillus et Clostridium. Les spores des bacilles et les clostridium sont

réellement plus sensibles à la nisine que leurs cellules végétatives, bien que

l'effet antagoniste soit sporostatique et pas sporicidale, ceci, exige la présence

continue de la nisine pour empécher la germination des spores. Les dégât

provoqués par la chaleur sur les spores substantiellement augmente leur

sensibilité à la nisine, afin que la nisine soit efficace contre les spores dans les

aliments à faible acidité et traités par un processus thermique, résultat de son

usage comme un complément de traitement dans les légumes en conserve. Le

mécanisme par lequel la nisine inhibe la germination des spores n’est pas clair,

bien qu'il ait été déterminé que l'action sporostatique de la nisine est causée

par son attachement aux groupes sulfhydrate des résidus de proteines (Morris

et al., 1984). Le mécanisme de son action sporostatique est distinct de son effet

bactéricide sur la membrane cytoplasmique de cellules végétatives.

La nisine purifié a été évalué pour l’effet toxicologique et a été trouvé

inoffensive ou au moins avec une toxicité très basse en utilisant des rats

comme cobaye (Frazer et al., 1962; Shtenberg et Ignatev, 1970). Son usage est

approuvé comme un additif alimentaire dans plus de 50 pays. C'est

probablement sûr de dire que dans la plupart de ces pays, la nisine est la seule

bactériocine autorisée comme un conservateur alimentaire. L'acceptation

Internationale de la Nisine a été donnée en 1969 par les experts des additifs

alimentaires de la FAO/WHO (WHO, 1969). Le seul autre composé utilisé

comme anti-microbiens avec une approbation similaire en tant qu'agent de

conservation sont les composés antimycotiques de surface, pimaricine

(Henning et al., 1986). Le Comité FAO/WHO a recommandé une prise


40

journalière maximale de nisine de 60 mg de nisine pure ou 33000 Unités pour

une personne de 70kg (Hurst et Hoover, 1993). Cependant, la nisine est

autorisé dans la fabriquation fromagère en Australie, en France, et en Grande-

Bretagne sans limite maximale de doses. Aux Etats-Unis, la limite maximale

est de 10000 UI/g; en Russie, la limite maximale est de 8000 UI/g, pendant

qu'en Argentine, Italie, et Mexique, la limite est de 500 UI/g pour les fromages

et dans d’autres produits (Chi-kindas et Montville, 2002). Les exemples de

produits alimentaire internationaux qui peuvent être améliorer légalement par

la nisine sont, des conserves de soupes (Australie), de la glace pour conserver

du poisson frais (Bulgarie), aliments pour bébés, aliments subissant une

cuisson et la mayonnaise (République tchèque) (Hurst et Hoover 1993).

Cependant, la majorité des types de produit approuvés sont les produits

laitiers (surtout dans les fromages) et les conserves en boites. Aux Etats-Unis,

l'usage de levains produisant la nisine n’a jamais été régularisé, comme les

lactocoques considérés comme GRAS. Comme déduis du code FDA (1988)

concernant l’usage de bactériocines comme additifs alimentaires, quand la

substance antimicrobienne naturelle (c'est, les bactériocines tel que Nisine) est

utilisée comme agents de conservation des aliments, la culture qui la produise

doit être considérée comme un micro-organisme GRAS (d'où la recherche

d’agents de conservation des aliments à partir des bactéries lactiques).

Le service de sécurité et d’inspection des aliments (FSIS) de l'USDA, évalue la

sécurité et l’efficacité des bactériocine dans les denrées alimentaires tel que la

viande et les produits de volaille. Donc selon le type de produit, le FDA ou FSIS

approuvent l’usage de nouvelles bactériocines avant toutes autorisations

d’applications (Chikindas et Montville, 2002).

1.12. Spectres d'activité des bactériocines

La plupart des bactériocines de la classe I, ont un spectre inhibiteur assez

large. Ils n’inhibent pas seulement les bactéries apparentées, tel que des

espèces du genre Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc,

Pediococcus, et Streptococcus, mais inhibent aussi beaucoup de bactéries gram

positif, tel que L. monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et

Clostridium botulinum. Plusieurs bactériocines dans cette classe, tel que la

nisine et la thermophiline 13, empêchent la germination des spores de B.


41

cereus et C. botulinum. De façon intéressante, l’acidocine J1132 a un spectre

d'action très étroit et les souches sensibles sont limitées aux membres du

genre Lactobacillus (Table 2), pendant qu'à l'autre extrême, la plantaricine LP84

(produite par Lactobacillus plantarum NCIM 2084) a montré un antagonisme

contre E. coli (Suma et al., 1998).

Comparé à la classe I des bactériocines. La plupart des bactériocines de la

clase IIa, ont des spectres d'activité comparativement étroits et inhibent

seulement des bactéries gram positif apparentées. En général, les membres du

genre Enterococcus, Lactobacillus, Pediococcus sont sensibles à cette classe IIa,

et les membres du genre Lactococcus sont résistants. Eijsink et al., (1998)

trouvent que la pediocine PA-1 était active contre des espèces différentes des

Enterococcus, Lactobacillus, et Pediococcus; cependant, seulement 1 parmis 11

souches de Lactococcus testées (Lactococcus lactis LMG 2070) était sensible à la

bactériocine. Quelques unes des bactériocines IIa, tel que la pediocine PA-1,

ayant des spectres inhibiteurs assez large et pouvant inhiber des bactéries, tel

que S. aureus et des cellules végétatives de Clostridium sp. et de Bacillus sp.

Quelques bactériocines de la classe IIa, tel que la mundticine produite par

Enterococcus mundtii, empêche la germination des spores de C. botulinum.

Les bactériocines de la classe IIa, sont généralement actives contre Listeria.

Eijsink et al., (1998) ont trouvé que 9 souches de Listeria testées, y compris L.

monocytogenes, Listeria innocua, et Listeria ivanovii, étaient très sensibles à 4

bactériocines de la classe IIa (la pediocine PA-1, l’enterocine A, la sakacine P, et

la curvacine A). D'ailleurs, l'étendue de la sensibilité varié de souche en

souche. Les concentrations minimales inhibitrices contre L. monocytogenes

pour les 4 bactériocines précités variés de 0.1 à 8 ng/ml; cependant, quelque

Listeria, tel que L. monocytogenes V7 et L. innocua LB1, résistent aux

bactériocines de la classe IIa (enterocine A, mesentericine Y105, divercine V41,

et la pediocine AcH) (Ennahar et al., 2000a).

Dans une comparaison directe, Il a été montré que la nisine a un spectre

d’inhibition plus large contre L. monocytogenes que la pediocin PA-1 (Ennahar

et al., 2000a). Rasch et Knochel (1998) trouvent seulement 2 sur 381 souches

de L. monocytogenes testées étaient capables de croître faiblement quand elles

sont exposées à 500 UI de nisine/ml.


42

La majorité des souches ont été capable de pousser à 100 UI/ml mais pas à

500 UI/ml. Bien qu'une grande portion des 381 souches testées (67.5%)

étaient incapables de croître a des concentrations faibles de pediocine (100

AU/ml) et seulement 20 souches ont poussé normalement à 1600 AU /ml. Les

études supplémentaires ont indiqué qu'une grande partie de ces 20 souches

pediocine-résistantes étaient capables de croître normalement à de

concentration élevées de pediocine (12800 AU/ml).

Il peut paraître que les bactériocines avec des spectres d'activité plus large

seraient toujours préférables pour la conservation des aliments, mais dans

certains circonstances, des bactériocines a spectre d'inhibition plus étroits sont

plus désirable. Par exemple, la sakacine P qui a une activité limité contre les

bactéries lactiques mais elle est presque aussi efficace que la pediocine PA-1

contre Listeria, elle peut être appliquer dans les produits de fermentation par

les bactéries lactiques qui sont exposés aux contamination par L.

monocytogenes (Eijsink et al., 1998).


43

Tableau 3. Caractéristiques générales des bactériocines produites par

différentes espèces des bactéries lactiques (Lactococcus lactis, Lactobacillus et

Pediococcus).

1.13. Propriétés

La classe I et classe IIa des bactériocines, sont habituellement très stables à pH

acide (Table 3). Rodriguez et al., (2002) ont observé que la pediocine PA-1 était

parfaitement stable après 21jours de stockage à 15 °C et à un pH 4 à 6;

cependant, la moitie de l'activité a été perdue à pH 7. Larsen et al., (1993) ont


44

remarqué que la bavaricine A était très stable à pH 2.0 à 9.7, mais l'activité de

la bavaricine est complètement perdue à pH 12.5. De plus, les bactériocines de

ces 2 classess sont thermostables à pH acide. Plus l’acidité augmente, plus

leurs thermopstabilité baisses. Jack et al., (1996) ont noté que le chauffage de

la piscicoline 126 pendant 2 h à pH 2 et 3 n'ont pas affecté son activité

bactéricide, en la chauffant pendant 15 min à pH 4 ou 5, son activité est

réduite de 50%. En général, les bactériocines sont habituellement sensibles

aux enzymes protéolytiques gastriques, tel que la trypsine, dû à leur nature

protéolytique.

1.14. Applications dans les aliments

Les consommateurs sont directement concernés par la présence d'additifs

chimiques dans leurs aliments. En conséquence, ils sont attirés par des

produits alimentaires frais et sans ajout d’agents de conservation chimiques.

Cette perception, associée avec la demande croissante pour les aliments issus

de traitement de transformation minimale avec une longue durée de

conservation, a stimulé les recherches à trouver des agents de conservation

naturels mais efficaces.

Les bactériocines produites par les bactéries lactiques, peuvent être considéré

comme des conservateurs naturels ou biopreservateurs qui accomplissent ces

exigences. La conservation Bio fait référence à l'usage de microorganismes

antagonistes ou leurs produits métaboliques inhibent ou détruisent des

microorganismes indésirables dans les aliments, afin de augmenter la sécurité

alimentaire et prolonger leur durée de vie de conservation (Schillinger et al.,

1996).

Trois approches sont utilisées couramment dans l'application de bactériocines

comme biopreservateurs dans les aliments (Schillinger et al., 1996):

(1) inoculation des aliments avec les bactéries lactiques produisant

des bactériocines dans le produit alimentaire. La capacité des

bactéries lactiques à croître et produire des bactériocine dans les

produits est cruciale pour son usage prospère.

(2) addition de la bactériocine purifiée ou partiellement purifiée

comme agents de conservation dans les aliments.


45

(3) l'usage d'un produit fermenté précédemment avec une souche

productrice de bactériocine comme un ingrédient dans la

transformation d’un aliment.

1.14.1. Biopreservation des produits à base de viande

Listeria monocytogenes est une bactéries gram positif, asporulale,

bâtonnet anaérobie facultative largement distribuée dans la nature. Elle peut

pousser dans un pH allant de 4.1 à 9.6 et à une température variant de 0 à

45°C. De plus, elle est résistante à la dessiccation et peut croître à des valeurs

de l'Aw (activité de l’eau) aussi bas comme 0.90. La nature ubiquiste de L.

monocytogenes, sa structure robuste et sa capacité de pousser à des

températures de réfrigération et les conditions anaérobies la rendent une

menace à la sécurité des aliments. Il est considéré comme un problème majeur

de sécurité alimentaire pouvant causer des maladies sérieuses et voir même

des décès. Certains pays comme les USA possèdent la politique la plus sévère

concernant L. monocytogenes et ne tolérance pas la présence de L.

monocytogenes dans les aliments prêt manger (Jay, 1996; Ryser et Marth,

1999). Elle a été détectée dans une grande variété d’aliments et impliquée dans

plusieurs maladies transmises par des aliments (Jay, 1996). Beaucoup

d'études ont été menées pour contrôler L. monocytogenes dans les la viande et

ses dérivés depuis l’abattoir jusqu’à emballage (Ryser et Marth 1999).


46

Tableau 4. Propriétés et caractéristiques de quelques bactériocines de la classeI et IIa produites par les bactéries lactiques (Chen et Hover, 2003)

PropriétésBacteriocines MW* (Da)

Classe IStable à 100 °C pendant 10 min à pH 5 ou 90 °Cpendant 10 min à pH 7.

Lacticine 3147A2847

Sensible à la trypsine l’α-chymotrypsine, laprotéinase K, et la pronase E, résistant à la pepsine.

Lacticine 3147B3322

Stable à 121 °C à pH 2. Devient moins Stable à pH5-7. Sensible à l’α-chymotrypsine, résistante à latrypsine, elastase, carboxypeptidase A, la pepsine, etla erepsine.

Nisine 3488

Stable à la température basse, à 100 °C pendant 60min ou 121 °C pendant 10 min. Moins stable à pHacide et neutres. Sensible à pronase, la trypsine, etl’α-chymotrypsine, résistante à la pepsine, laprotéinase K, l’ α-amylase, et à la lipase.

Plantaricin C 3500

Classez IIaStable à 100 °C pendant 60 min à pH 2.0 à 9.7.Sensible à la pepsine, la trypsine, la pronase E, laprotéinase K et l’α-chymotrypsine A4, résistante àcatalase.

Bavaricin UN 3500-4000

Stable à 70 °C pendant 30 min à pH 5 à 8. Sensible àla protéinase K, la trypsine et à la papaïne, résistanteà la glucoamylase, la lipase, l’ α-amylase et lelysozyme.

Lactococcin MMFII4143

Stable à pH 4 à 6, devient moins stable quand le pHaugmente. Stable à 80 °C pendant 60 min ou 100 °Cpendant 10 min. Sensible à la trypsine, la papaïne, laficine, l’α-chymotrypsine, la protéase IV, XIV, et XXIV,et à la protéinase K, résistante à la phospholipase C,la catalase, le lysozyme, la DNAses, la RNAses, et lalipase.

Pediocin PAPA 14624

Stable à pH 2 après 2 mois de stockage à 4 °C. stableà 100 °C pendant 120 min à pH 2 à 3. Devient moinsstable quand le pH augmente. Sensible à l’α-chymotrypsine, les différents types de protéase IV,XIV, XXIII, et la trypsine, résistante à la catalase, lalipase, et le lysozyme.

Piscicolin 126 4416

Seule l'activité de la nisine à des concentrations de 400 et 800 UI/g et en

combinaison avec 2% d’NaCl contre L. monocytogenes dans la viande de boeuf

crue hachée a été examiné par Pawar et al., (2000). Les échantillons de viande

crue hachée était inoculée avec 103 ufc/g de L. monocytogenes et a entreposée

à 4°C. Le dénombrement de L. monocytogenes dans l’échantillon témoin a


47

augmenté de 3.0 Log à 6.4 Log ufc/g après 16 jours de stockage; cependant, la

nisine à réduit considérablement L. monocytogenes. L’addition de la nisine à

400 UI/g augmente la durée de la phase de latence de L. monocytogenes, et à

un niveau de 800 UI/g, résulte en un nombre de L. monocytogenes de 2.4 Log

cycles inférieur à celui trouvé dans l’échantillon témoin après 16 jours de

stockage. Quand la température de stockage est augmentée jusqu’à 37°C,

l’effet inhibiteur de la nisine a été moins prononcé. L’addition de 2% d’NaCl en

combinaison avec la nisine, augmente l'efficacité de la nisine aux deux

températures de stockage.

Les sections de carcasse de bœuf ont été inoculées avec approximativement 4

Log ufc/cm2 de Brochothrix thermosphacta, Carnobacterium divergens, ou L.

innocua par Cutter et Siragusa (1994) pour évaluer l'efficacité de la nisine pour

aseptiser la surface des carcasses de viande rouge. Le traitements par

vaporisation d'eau n'ayant aucun changement sur les populations

bactériennes; cependant, le traitement par vaporisation de la nisine (5000

AU/ml) a réduit les populations bactériennes de 1.8 à 3.5 Log ufc/cm2 au

premier jour et de 2.0 à 3.6 Log ufc/cm2 après stockage à 4°C pour une

journée.

Fang et Lin (1994) ont remarqué que l’addition de 10000 UI/ml de nisine au

filet de porc cuit inhibe la croissance de L. monocytogenes, mais pas

Pseudomonas fragi. La nisine a été trouvé pour être plus efficace quand elle est

utilisée en combinaison avec un emballage sous atmosphère modifiée (MAP,

100% CO2, 80% CO2 + 20% air). MAP et la nisine (1000 ou 10000 IU/ml)

inhibent la croissance de deux microorganismes, et cet effet inhibiteur

MAP/nisine en combinaison est plus prononcé à 4 °C qu'à 20 °C.

Murray et Richard (1997) ont évalué l'activité des substances antilisteriales la

nisine A et pediocine AcH dans la décontamination artificiellement de

morceaux de porc cru. La nisine A était considérablement plus efficace que la

pediocine AcH, mais après 2 jours de stockage, la survie des bactéries dans la

viande traitée avec chacune des bactériocines reprend un taux semblable à

celui du témoin. De plus, la nisine était plus stable que la pediocine AcH. La

perte d'efficacité, surtout de la pediocine AcH, a été attribuée à une

dégradation rapide par les protéases de la viande.


48

En plus de la nisine et la pediocine, les autres bactériocines des bactéries

lactiques ont été examinées pour contrôler la croissance de Listeria. Les

exemples incluent Laukova et al., (1999), qui ont examiné l'efficacité de

l'enterocine CCM 4231 dans la lutte contre L. monocytogenes dans le saucisson

fermenté et séché de salami. L’ajout de l'enterocin reduit le nombre de L.

monocytogenes de 1.7 Log cycle immédiatement après l’addition de la

bactériocine (nombre initial: 108 ufc/ml). Après une semaine de maturation du

salami, le nombre de L. monocytogenes dans le témoin (sans ajout enterocine) a

atteint 107 ufc/g, pendant que dans l'échantillon traité (avec ajout enterocine),

le nombre était 104 ufc/g, une différence qui a été maintenue après 2 et 3

semaines de maturation. Aussi, Hugas et al., (1998) ont trouvé que la sakacine

K, une bactériocines produite par Lactobacillus sake CTC494, inhibe la

croissance de L. innocua dans des échantillons de poitrines de volaille emballés

sous vide et de porc cuit, et dans des échantillons de porc haché cru emballés

dans une atmosphère modifié.

Schöbitz et al., (1999) déterminaient la capacité inhibitrice d'une substance

semblable aux bactériocines produite par Carnobacterium piscicola L103 contre

L. monocytogenes, et ont trouvé que la bactériocine a complètement inhibé L.

monocytogenes dans la viande emballée sous vide après 14 jours de stockage à

4°C. Vignolo et al., (1996) ont montré que la lactocine 705 produite par

Lactobacille casei CRL 705 a inhibé la croissance de L. monocytogenes dans du

bifteck haché; cependant, quand la souche productrice a été ajoutée à la

melange liquide, aucune inhibition considérable n'a été détectée. Degnan et al.,

(1992) ont démontré la possibilité d'utiliser des cultures bactériocinogènes de

Pediococcus acidilactici (souche productrice de pediocine AcH) pour inhiber la

croissance de L. monocytogenes dans les aliments emballées sous vide comme

la saucisse de bœuf (Table 4). Quand les saussices étaient inoculés en surface

avec L. monocytogenes et P. acidilactici et emballés sous vide, L.

monocytogenes et le pediocoque ont survécu dans les paquets tenus à 4 °C,

mais le pediocoque n'a pas produit d’acide ou la pediocine pendant le stockage

réfrigéré. Quand les paquets étaient gardés à une températures ambiante de 25

°C pour 8 jours, le nombre total de L, monocytogenes dans le test témoin (sans

ajout du pediocoque) a augmenté de 3.2 Log ufc/g. En revanche, L.

monocytogenes a été inhibée (moyenne de réduction de 2.7 Log ufc/g) dans les


49

paquets inoculés avec Pediococcus acidilactici. La production de la bactériocine

a commencé tôt et coïncide avec la phase logarithmique de croissance du

pediocoque et continue tardivement avec cette phase.

La raisonne primaire de l’utilisation des nitrites pour la fumigation des viandes

est de stabiliser la couleur de la viande rouge et inhiber la flore de

contamination et les microorganismes d’intoxication alimentaire, tel que le C.

botulinum; cependant, la nitrite peut réagir avec les amines secondaires dans

les viandes pour former les nitrosamines cancérigènes. Cet effet nocif possible

a incité des chercheurs à explorer la possibilité d'utiliser les bactériocines

comme une alternative aux nitrites. Rayman et al., (1981) ont rapporté qu'une

combinaison de 3000 UI/g de nisine et de 40 ppm de nitrite presque inhibe

complètement la germination des spores de Clostridium sporogenes dans les

viandes en preparation liquide à 37 °C pendant 56 jours. Cependant, dans une

étude plus tardive (Rayman et al., 1983), ils ont trouvé que jusqu'à 22000 UI/g

de nisine en combinaison avec 60 ppm de nitrite ne peuvent inhiber la

germination des spores de C. botulinum dans ces préparations liquide de viande

à pH 5.8. La diminution du pH augmente l'activité de la nisine. Par exemple,

8000 UI/g de nisine en combinaison avec 60 ppm de nitrite ont inhibé la

germination des spores dans les préparations liquide de porc à pH 5.5. Taylor

et al., (1985) ont montré que la combinaisons de la nisine et les nitrites étaient

capables de différer la formation de la toxine botulinique dans les émulsions de

saucisse de poulet (pH 5.9 à 6.2). Des échantillons témoins (aucuns agents de

conservation n'ont été ajoutés) sont devenus toxiques après une semaines,

pendant que l’ajonction de 4000 UI/g de nisine et 120 ppm de nitrite ont

retardé la formation de la toxine à 5 semaines.

1.14.2. Biopreservation des produits laitiers

Les espèces de Listeria monocytogenes sont responsables de plusieurs

intoxications associées avec les produits laitiers, tel que le lait pasteurisé

(Fleming et al., 1985) et fromage (James et al., 1985). La nisine a montré son

efficacité contre L. monocytogenes dans les produits laitiers. Ferreira et Lund

(1996) ont trouvé qu’après inoculation d’une souche résistante à la nisine dans

du fromage blanc de longue durée de conservation à pH 4.6 à 4.7, le nombre de

L. monocytogenes décroit approximativement 1-Log ufc/ml pendant le stockage


50

à 20°C pour 7 jours. L’addition de nisine (2000 IU/g) au fromage blanc

augmenterait le taux d'inactivation d’approximativement 3-Log ufc/ml dans 3

jours. Davies et al., (1997) ont déterminé l'efficacité de la nisine pour contrôler

L. monocytogenes dans les fromages du type ricotta de plus de 70 jours à 6-

8°C. L’addition de la nisine (100 UI/ml) inhibe efficacement la croissance de L.

monocytogenes pour une période de 8 semaines ou plus (dépendant sur type de

fromage). Le fromage témoin contient des niveaux dangereux du

microorganisme après 1 à 2 semaines de stockage. Zottola et al., (1994)

utilisent le fromage du cheddar contenant la nisine produite par un lactocoque

comme composant du fromage au lait pasteurisé. La durée de vie du fromage

au lait pasteurisé (301 et 387 UI/g de nisine) était considérablement plus

grande que celle de l’échantillon témoin de fromage. Dans le fromage en paquet

réfrigéré, la nisine (100 et 300 IU/g) a réduit largement le nombre de L.

monocytogenes, S. aureus, et des spores de C. sporogenes ayant subi un

choque thermique. Un autre problème dans la production fromagère est la

fermentation butyrique des Clostridium. La nisine est ajouté fréquemment aux

fromages au lait pasteurisé pour prévenir la germination des spores de

Clostridium, tel que Clostridium tyrobutyricum (Schillinger et al.,1996).

Une application de la lacticine 3147, une bactériocine à large spectre et à deux

2 composants produite par L. lactis. subsp. lactis DPC 3147, est le maintien de

la qualité du cheddar en réduisant le nombre de bactéries lactiques de la

population exogènes aux ferments pendant la maturation (Ross et al., 1999). Le

fromage produit avec L. lactis 3147 DPC4275 transconjuguée productrice de

lacticine 3147, contient 2 Log ufc/ml de bactéries lactiques exogènes aux

ferments que dans l’échantillon témoin après 6 mois de maturation.

De plus, le fromage fabriqué avec 3 souches productrices de lacticine 3147

n'avait aucune bactérie lactique exogène à la culture initiale détectable sur la

même période. Dans le fromage blanc la population de L. monocytogenes a été

réduite de 3-Log ufc/ml sur une période d’une semaine de maturation que

lorsqu’il a été fabriqué avec L. lactis DPC4275; cependant, le nombre de Listeria

dans l’échantillon témoin fabriqué par culture non productrice de lacticine

3147 reste inchanger (104 ufc/g). La culture transconjugante produisant la

lacticine 3147 a aussi été utilisée comme une culture protectrice pour inhiber

Listeria sur la surface d'un fromage à maturation par les moisissures. La


51

présence de la souche productrice de la lacticine 3147 sur la surface du

fromage a réduit le nombre de L. monocytogenes de 3-Log ufc/ml (Ross et al.,

1999).

Tableau 5 : Obstacles technologiques pour rehausser la sécurité alimentaireeffets d’inactivationBacteriocines

En combinaison avec la températurela nisine (1000 IU/g) rehausse l’inactivation de Listeriamonocytogenes dans le homard par la température douce (60 ou 65°C).

Nisine

la nisine (500 à 2500 IU/ml) rehausse l’inactivation de Salmonellaenteritidis par La température douce (55 °C).

Nisine

les deux bacteriocines ont réduit la viabilité des bactéries à gram-négatif et à gram-positif qui survivent aux stresses subléthales.

Nisine,Pediocine AcH

En combinaison avec les agents chélateursquand elle est utilisée avec l’EDTA, du citrate, ou du lactate, laNisine (2000 IU/ml) est efficace contre les bactéries gram-négatif(Salmonella typhimurium et E. coli O157:H7). En combinaison avecl’emballage sous atmosphère modifiée.Quand elle est utilisée en combinaison avec l’emballage sousatmosphère modifiée et la température basse, la Nisine à un niveaude 400 IU/ml augmenterait la phase de latence de L.monocytogenes, et à 1250 IU/ml empèche sa croissanceLa combinaison emballage sous atmosphère modifiée (100% CO2,80% CO2 + 20% air) et la Nisine (1000 ou 10000 IU/ml) inhibe lacroissance de L. monocytogenes et Pseudomonas fragi

Nisine

En conbinaison avec les substances antimicrobiennes

l'utilusation combinée de sorbate de potassium (0.3%) et la Nisine(400 IU/ml) inhibe la croissance de L. monocytogenes.

Nisine

Un effet synergistique avec le diacétate de sodium (0.3 et 0.5%) et lapediocine (5000 AU/ml) contre L. monocytogenes.

Pediocin AcH

effet synergétique les esters d'acide gras, du saccharose et la nisinesur inhibition bactéries gram-positif.le dioxyde de carbone et la nisine jouent un rôle synergétiquecontre L. monocytogenes.

Nisine

quand elle est combinée avec le carvacrol (0.3 mmol / l), la nisine (6IU/ml) est plus efficace.Pour réduire le nombre de Bacillus cereus que lorsqu’elle estappliquée seule.

Nisine

la nisine (100 IU/ml) et le monolaurin (0.25 mg/l) agissentsynergétiquement contre les cellules végétatives de Bacillus sp.dans le lait.

Nisine

En combinaison avec les lactoperoxidaseseffet synergétique et bactéricide sur L. monocytogenes entre lanisine (100 ou 200 IU/ml) et le système des lactoperoxidases.Nisine

Effet synergétique de la nisine (10 ou 100 IU/ml) et le système deslactoperoxidases sur l’inactivation de L. monocytogenes dans laitécrémé.

Nisine

En combinaison avec d’autre bacteriocines

quand elle est utilisée avec la nisine, la lacticine 481, ou lalactacine F, la pediocine AcH donne un effet synergétique.

Pediocine AcH

En combinaison avec la nisine, la leucocine F10 fournit la plusgrande activité contre L. monocytogenes.

Leucocine F10

L’addition simultanée ou séquentielle de la nisine (50 IU/ml) et lacurvaticin 13 (160 AU/ml) induit un plus grand effet inhibiteurcontre L. monocytogenes que lors qu‘elle est utilisée seule.

Curvaticine


52

1.14.3. Biopreservation des produits de la mer

L'efficacité des bactériocines et les cultures protectrices pour contrôler la

croissance de L. monocytogenes dans le saumon fumé emballé sous vide a été

démontrée par plusieurs chercheurs. Katla et al., (2001) qui ont évalué l'effet

inhibiteur de sakacin P et/ou la culture de L. sake (productrice de sakacin P)

contre L. monocytogenes dans le saumon fumé. Les échantillons de saumons

emballés sous vide ont été incubés à 10°C pour 4 semaines. La sakacin P avait

un effet inhibiteur initial sur la croissance de L. monocytogenes pendant que la

culture de L. sake avait un effet bactériostatique. Quand L. sake a été ajoutée

au saumon avec la sakacin P, un effet bactéricide contre L. monocytogenes a

été observé. Nilsson et al., (1999) ont montré qu'une souche non productrice de

bactériocine de C. piscicola était aussi efficace qu'une souche productrice de

bactériocine de Carnobacterium piscicola pour l'inhibition de L. monocytogenes

dans le saumon fumé emballé sous vide. Ils ont suggéré que l'inhibition de la

croissance de L. monocytogenes était probablement due à une compétition

nutritionnelle de C. piscicola qui en résulte en un épuisement d'éléments

nutritifs essentiels.

L'effet inhibiteur de la Nisine en combinaison avec le CO2 et la basse

température sur la survie de L. monocytogenes dans le saumon fumé a aussi

été étudié (Nilsson et al., 2000 ; Nilsson et al., 1997). L’ajout de la Nisine (500

ou 1000 UI/g) au saumon inoculé avec L. monocytogenes et entreposé à 5°C a

retardé, mais n'a pas empêchée la croissance de L. monocytogenes dans des

emballages sous vide. Le nombre de L. monocytogenes a augmenté jusqu’à 108

ufc/g dans du saumon emballé sous vide en 8 jours, alors que l’emballage du

saumon fumé par le CO2 résulté en une phase de latence de 8 jours pour L.

monocytogenes avec un nombre qui atteignent finalement 106 ufc/g dans 27

jours. L’addition de la Nisine au saumon fumé emballé au CO2 résulte en une

réduction de 1 à 2log10 de L. monocytogenes suivi par une phase de latence de

8 et 20 jours dans le saumon en utilisant la Nisine à 500 et 1000 UI/g,

respectivement. Le niveau de L. monocytogenes reste au-dessous de 103 ufc/g

pendant 27 jours de stockage pour les deux concentrations de Nisine.

Pour améliorer la durée de vie, les saumures de crevette sont préparées par

l'addition d'acides sorbique et benzoïques. Les inquiétudes au sujet de l'usage

de ces acides organiques ont mené des chercheurs à explorer la possibilité


53

d'utiliser des bactériocines pour leur conservation. L'efficacité de la Nisine Z, la

carnocine UI49, et une préparation brute de bavaricine A sur l’augmentation

de la durée de vie de saumure de crevette a été évalué par Einarsson et Lauzon

(1995). La carnocine UI49 n'a pas affecté la durée de vie comparée au témoin

(10 jours de vie), pendant qu’avec la bavaricine A, la durée de vie a été de 16

jours. La nisine Z donne une durée de vie de 31 jours. La solution du benzoate-

sorbate était supérieure en préservant les saumures de crevette pour une

période de conservation de 59 jours.

Dans une étude utilisant la truite fumée emballée sous vide et réfrigerée,

Nykänen et al. (2000) ont examiné l'inhibition de L. monocytogenes et les

bactéries aérobie mesophile par la Nisine, le lactate de sodium, ou leur

combinaison. Les échantillons de la truite ont été entreposés à 8 °C pendant 17

jours ou à 3°C pendant 29 jours. La nisine et le lactate, tout deux, ont inhibé

la croissance de L. monocytogenes dans du poisson fumé, mais la combinaison

des 2 composés était plus efficace. La combinaison de la nisine et le lactate du

sodium injecté dans le poisson fumé ont diminué le nombre de L.

monocytogenes de 3.3 à 1.8 log pour plus de 16 jours de stockage à 8°C. Le

niveau de L. monocytogenes est resté presque constants (4.7 à 4.9 log) pendant

29 jours à 3°C dans les échantillons qui ont subi l’injection avant de les fumer

et lesquel ont contenu la nisine et le lactate de sodium.

1.15. Obstacles technologiques et sécurité alimentaire

Les limitations majeures pour l'application des bactériocines dans les aliments,

sont leurs spectres d'activité relativement étroits et leurs effets antibactériens

modérés. De plus, elles ne sont pas généralement actives contre les bactéries

gram négatif. Pour surmonter ces limitations, de plus en plus les chercheurs

utilisent le concept d’obstacles technologiques d’améliorer la durée de vie et

rehausser la sécurité alimentaire (Tableau 5 et 6). De multiples documents

scientifiques, montrent que les bactéries gram négatif deviennent sensibles aux

bactériocines si les propriétés de la barrière de la perméabilité de leur

membrane externe sont affaiblies. Par exemple, les agents chélateurs, tel que

l’EDTA, peuvent lier magnésium de fer des couches de lipopolysaccharides et

par conséquent rompre la membrane externe des bactéries gram négatif, donc

permettre à la Nisine de gagner l'accès à la membrane cytoplasmique (Abee et


54

al., 1995). La nisine rehausse l’inactivation thermique des bactéries, donc

réduire le temps du traitement et donner ainsi un plus à la qualité de l’aliment

(Tableau 5). Par exemple, Boziaris et al., (1998) trouvent que l’addition de

Nisine (500 à 2500 UI/ml) dans le milieu, ou une solution d’oeuf entier, ou le

blanc d'oeuf, réduit le temps de pasteurisation exigé jusqu'à 35%. Budu-

Amoako et al., (1999) ont trouvé que la Nisine réduit la résistance à la chaleur

de L. monocytogenes dans la viande du homard et réduit considérablement le

temps du traitement comparé avec le traitement thermique seul. La réduction

du processus de traitement à la chaleur réduit, en conséquence, la perte du

poids de l’aliment qui pèsera sur le coût de fabrication.

L’effet synergétique entre bactériocines et d’autres processus technologiques

sur l'inactivation des micro-organismes a aussi été rapporté fréquemment dans

la littérature (Tableau 5). Schlyter et al., (1993) ont rapporté l’effet synergétique

entre le diacetate de sodium et la pediocine contre L. monocytogenes dans la

préparation liquide de viande. Dans les échantillons témoin, le nombre de L.

monocytogenes a augmenté de 4.5 log à approximativement 8 log dans 1 jour à

25 °C et dans 14 jour à 4 °C. Un effet listericidal (approximativement 7 log de

différence comparé aux échantillons témoin) était observé dans des traitements

qui contiennent la pediocine (5000 UA/ml) avec 0.5% de diacétate à 25 °C et la

pediocine avec 0.3% de diacétate à 4°C. Zapico et al. (1998) ont montré un effet

synergique de la nisine (10 ou 100 UI/ml) et le système lactoperoxidase sur

l’inactivation de L. monocytogenes dans le lait écrémé. L'addition de la nisine et

le système lactoperoxidase affecte le nombre de L. monocytogenes jusqu'à 5.6

log inférieur que dans l’échantillon témoin de lait après 24 h à 30°C, pendant

que la nisine seule n'avait aucun effet sur le nombre. Cette synergie

d’inactivation a aussi été observé dans les bactéries gram négatives qui sont

normallement insensibles à ces bactériocines (Boziaris et al., 1998). L'usage

d’une combinaison de plusieurs bactériocines a aussi été révélé pour

augmenter l'activité antibactérienne (Hanlin et al., 1993; Mulet-Powell et al.,

1998). Quand elle est utilisée en combinaison avec la nisine, la leucocin F10

fournit la plus grande activité contre L. monocytogènes (Parente et al., 1998).

L'intérêt dans l'industrie alimentaire à utiliser des traitements non thermique,

tel que la haute pression hydrostatique (HP) et par champs électriques pulsés

(PEF) dans la conservation des aliments est très recherché. Il est fréquemment


55

observé que les bactériocines, en combinaison avec ses techniques de

traitement, rehaussent l’inactivation bactérienne (Tableau 6). De plus, les

bactéries gram négatif qui sont habituellement insensibles aux bactériocines

des bactéries lactiques, tel qu'E. coli O157:H7 et S. typhimurium, deviennent

sensibles en suivant les traitements HP/PEF qui induisent des dégâts létales

aux cellules bactériennes (Kalchayanand et al., 1994). Il a été démontré que la

Nisine augmente l'inactivation par pression des spores de Bacillus coagulans,

Bacillus subtilis, et Clostridium sporogenes (Roberts et Hoover 1996; Stewart et

al., 2000).

1.16. Bactériocines et emballage

L’incorporation des bactériocines dans l’emballage en plastique pour contrôler

la détérioration des aliments et les micro-organismes pathogènes ont été une

aire de recherche très active pour la dernière décennie. L’emballage en

plastique antimicrobien empêche la prolifération microbienne sur surface de

l’aliment par contact direct de l’emballage avec la surface de l’aliment, tel que

les viandes et fromage. Pour cette raison, et pour qu’il soit correcte, l’emballage

en plastique antimicrobien qui doit entrer en contacte avec la surface de

l’aliment, pour que les bactériocines puissent diffusent à la surface. La

libération graduelle de la bactériocine du film d'emballage vers la surface de

l’aliment peut avoir un avantage dans le trempage et la vaporisation des

aliments avec la bactériocine. Dans le dernier processus, de l’activité

antimicrobienne peut être perdue ou réduite dû à l’inactivation de la

bactériocine par les composants de l’aliment ou diluée au-dessous de

concentration active dû à sa migration dans l’aliment (Appendini et Hotchkiss

2002).

Deux méthodes ont été utilisées communément pour préparer un emballage en

film de plastique avec bactériocines (Appendini et Hotchkiss 2002, Durango et

al., 2006). Le premier est l’incorporation directement de la bactériocine dans le

polymère. L’exemple de l’incorporation de la Nisine dans des films en protéines

biodégradables (Padgett et al., 1998). Le deuxième, est la méthode de film

d'emballage par presse thermique et celle du moulage, ont été utilisées pour

incorporer la Nisine dans des films fait de protéines du soja et les protéines de

maïs dans cette étude. Les films de presse thermique et le moulage ont formé

des films excellents et ont inhibé la croissance de Lactobacillus plantarum.


56

Comparé aux films par presse thermique, le moulage a montré de plus grandes

zones d’inhibition quand les mêmes niveaux de Nisine ont été incorporés.

L’incorporation de l'EDTA dans les films a augmenté l'effet inhibiteur de la

Nisine contre E. coli. Siragusa et al., (1999), ont incorporé la Nisine dans un

film en plastique de polyéthylène qui a été utilisé dans l’emballage sous vide de

carcasse de bœuf. La Nisine est resté active contre Lactobacillus helveticus et B.

thermosphacta inoculés en surface dans des sections de tissu de carcasse. Une

réduction initiale de 2 log de B. thermosphacta a été observé avec un emballage

de boeuf imprégné de Nisine dans les premiers 2 jours de stockage à 4°C.

Après 20 jours de stockage à 4 ou 12°C (pour simuler le mauvais usage de la

température), la population de B. thermosphacta à partir d'échantillons

enveloppés en plastique et imprégné de Nisine, était considérablement moins

que celle dans l’échantillon témoin (sans Nisine). Coma et al., (2001) ont

incorporé la nisine dans des films cellulosiques comestibles faits avec

l’hydroxypropylmethylcellulose en ajoutant la nisine à la solution de fabrication

du film. L'effet inhibiteur pourrait être démontré contre L. innocua et S. aureus,

mais l’addition de l'acide stéarique utilisé pour améliorer les propriétés

d’évaporation d’eau du film, réduit significativement l’activité inhibitrice. Il a

été noté que la désorption du film et la diffusion dans l’aliment exige

d’avantage d'optimisation de l’activité de la nisine pour une efficacité en tant

qu’agent préservatif dans les aliments emballés.

Une autre méthode pour incorporer les bactériocines dans les films d’emballage

est d’enrober ou d’adsorber les bactériocines aux surfaces du polymère. Les

exemples incluent l’enrobage des films de polyéthylène par des couches de

nisine, methylcellulose. La nisine est enrobée par les produits adsorbant telles

que le polyéthylène, l’acétate du vinyle de l'éthylène, le polypropylène, le

polyamide, le polyester, le fibre acrylique, et le chlorure de polyvinylique

(Appendini et Hotchkiss 2002). Dawson et al., (2005) ont démontré que

l’adsorption de la nisine sur des surfaces de silice inhibe la croissance de L.

monocytogenes. Les films à nisine ont été exposés à un milieu contenant L.

monocytogenes et les surfaces en contact ont été évaluées à 4 h d’intervalle

pendant 12 h. Les cellules sur la surface qui avaient été en contact avec une

haute concentration de nisine (40000 UI/ml) n’ont montré aucune croissance

et beaucoup d’entre elles sont complètement détruites. Les surfaces ont


57

contacte avec une concentration faibe de nisine (4000 UI/ml) montrent un

degré d'inhibition faible. En revanche, les surfaces des films à nisine ou cette

dernière est dénaturée par traitement thermique, ont permis la croissance L.

monocytogenes.

Listeria innocua et S. aureus (en plus de L. lactis sp. lactis) ont été aussi étudié

par Scannell et al., (2000) dans des isolants bioactives à base de cellulose et

des pochettes antimicrobiennes en polyéthylène/polyamide. La lacticin 3147 et

la nisine étaient les bactériocines testées. Bien que, la lacticin 3147 adhére

faiblement au film en plastique, la nisine se fixe mieux et les films bioactives

font avec la nisine un produit stable pour 3 mois avec ou sans réfrigération. La

réduction bactérienne jusqu'à 2 log dans le fromage emballé sous vide a été

constatée conjointement avec une atmosphère modifiée lors de l’emballage

(MAP) avec stockage à température réfrigérante. Les isolants bioactives à base

de cellulose sont placés entre les tranches de fromage et jambon sous MAP. Les

isolants avec de la nisine immobilisée, ont réduit la croissance de L. innocua

(inoculum initial etait de 2 à 4x105 ufc/g) de plus de 3 log dans le fromage

après 5 jours à 4°C, et par approximativement 1.5 log dans le jambon en

tranches après 12 jours, pendant que S. aureus (inoculum initial était de 2 à

4x105 ufc/g) a été réduite de 1.5 et 2.8 log dans le fromage et le jambon

respectivement. L'efficacité de l’enrobage par la bactériocine sur l'inhibition des

bactéries pathogènes a aussi été démontrée dans d’autres études. Par exemple,

l’enrobage avec la pediocine sur boîtes en cellulose et les sacs en plastique ont

été efficace pour inhiber complètement la croissance de L. monocytogenes

inoculée dans les viandes et volaille durant 12 semaines de stockage à 4°C

(Ming et al., 1997). Enrober une solution contenant la nisine, l’acide citrique,

l’EDTA, et le Tween 80 sur chlorure de polyvinyle, polyéthylène linéaire à basse

densité, et les film en nylon réduisent le nombre de Salmonella typhimurium

dans la peau de volaille de 0.4- à 2.1-log après incubation à 4°C pour 24 h

(Natrajan et Sheldon 2000).

Bien que la durée de vie ait été étendue dans les denrées alimentaires par

réduction de la population des micro-organismes de contamination dans les

aliments, les essais fondamentaux étaient de prévenir les microorganismes

pathogènes anticipant le produit. Dans cette considération, l’entreprise Rhodia,

a développé des boîtes utilisées dans la fabrication de sandwich et d’autres


58

viandes cuites. Le film consiste en une combinaison de propriétés de

bactériocines, des enzymes, et substances végétales, la cible visée est L.

monocytogenes et les résultats sont décrits comme très prometteuses. Le coût

ajouté est considéré économiquement sans effet sur le consommateur.

1.17. Observations finales

Bien que les études intensives sur la dernière décennie ont énormément

progressés sur les connaissances de bactériocines, un travail supplémentaire

est exigé avant que nous soyons capables de comprendre complètement les

mécanismes moléculaires, rapports de la structure-fonction, et mécanismes

d'action de bactériocines. Dans la biosynthèse de lantibiotics, le mode d’action

des enzymes responsables pour les réactions de la modification n'est pas

encore clairement demontré. Les principaux mécanismes de l'immunité des

souches productrices reste à déterminer. Entreprendre des recherches dans ce

domaine aiderait pour les applications efficaces de bacteriocines et

développerait les méthodes de production et de regulation génétique de

bacteriocines avec une meilleure activité, solubilité, et stabilité.

La génie génétique ou la modification chimique des bactériocines sont réalisées

afin d’améliorer et de développer efficacement l’activité, la propriété et la

stabilité de la structure active. Rollema et al., (1995) ont démontré la solubilité

et la stabilité de la nisine Z en remplaçant l’asparagine (acide aminé n° 27 ) ou

la serine (acide aminé n° 31) par la lysine; Johnsen et al., (2000) ont amélioré

la stabilité de la pediocine PA/1 à 4°C et à la température ambiante en

remplaçant la méthionine (acide aminé n° 31) par l’alanine, l'isoleucine ou la

leucine. Miller et al., (1998) trouvent que la pediocine PA/1 modifiée est de 2,8

fois plus efficace sur la souche test de Lb. plantarum. Ces exemples

représentent des solutions aux problèmes rencontrés lors des applications des

bactériocines. Cependant, la réglementation de l'approbation pour l'usage de la

bactériocine serait très difficile actuellement car considérées comme nouvelles

protéines, nécessitant ainsi une recherche plus approfondie afin d’écarter les

effets secondaires indésirables possible (Montville et al., 1995).

Néanmoins, l’étude des bactériocines est en plein essor, l’optimisation de leur

activité vis-à-vis des germes indésirables nécessite la recherche des conditions

d’association avec d’autres facteurs physico-chimiques complémentaires tel


59

que la température basse, conditionnement sous-vide, réduction de l’activité de

l’eau et la haute pression qui agissent en synergie et en complémentarité. Cette

stratégie vise à élargir le spectre d’action des bactériocines.

La recherche de nouvelles bactériocines permettra de combattre plus

efficacement les diverses bactéries d’altération ou pathogènes. La résistance

des bactéries indésirables aux composés antibiotiques est un phénomène

préoccupant, et c'est pour cette raison que de nouvelles molécules

d’antibiotiques sont constamment recherchées. Cela s'applique aussi aux

bactériocines puisque la sélection de bactéries devenues résistantes à ces

peptides est possible. La recherche de nouvelles bactériocines trouve aussi

raison dans l'acquisition de connaissances fondamentales sur la structure, la

biosynthèse, le mécanisme et le spectre d'action ainsi que l'organisation

génétique des ces molécules antimicrobiennes.

58

Matériel et méthodes


58

2. Matériel et méthodes

2.1. Provenances des échantillons du lait

Les échantillons de laits crus de chèvres proviennent de différentes

régions dans l’ouest algérien (Saida, Oran, Tiaret, Bechar, Tindouf,

Messerghine, Boutelelisse et Arzew). Les échantillons du lait sont prélevés dans

des conditions d’hygiène parfaites dans des flacons de 250 ml stériles. Ces

derniers sont transportés immédiatement au laboratoire pour analyse. Dans

les cas des zones lointaines, les échantillons sont conservés à 4 °C lors de leur

transport au laboratoire, le temps de transport ne doit pas dépasser 24 h

après le prélèvement. Certains isolats, proviennent directement de la collection

du Laboratoire de Microbiologie Appliquées L.M.A.

Les souches de bactéries tests sont à gram positif Staphylococcus aureus, et à

gram négatif Escherichia coli proviennent aussi du laboratoire LMA

2.2. Isolement et identification de la flore lactique

2. 2.1. Préparation de l’échantillon

1 ml de l'échantillon est pippeté aseptiquement dans 10 ml d'eau peptonée et

des dilutions décimales sont réalisées (10-1 à 10-8). Les dilutions ainsi

préparées, un ml de la dilution appropriée est ensemencé en profondeur dans

l'un des milieux suivant :

- Le milieu MRS solide (De Man et al., 1960) incubé en anaérobiose à 30 et

à 45°C pendant 48h pour l'isolement des lactobacilles et les

streptocoques thermophiles. Le MRS est aussi incubé à 30°C pour

l'isolement des lactobacilles et Leuconostoc mésophiles (composition des

milieux dans l’annexe milieu)

- Le milieu MRS acidifié, pH 5,4 (MRSA) utilisé pour l'isolement des

lactobacilles.

- Le milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) est incubé à 30 °C pour

l'isolement des lactocoques

- Le milieu MRS + Lait écrémé à 10% (MRSL) incubé à 28 °C pendant 24

à 48h pour l'isolement de la flore protéolytique. Les colonies présentant

des halos transparents tout autour représente un résultat positif.


59

- Le milieu Kempler et Mac Kay (1980) KMK est utilisé pour l'isolement

des microorganismes fermentant le citrate.

2.2.2. Identification des isolats.

2.2.2.1. Caractérisation morphologiques macroscopique et microscopique

Dix colonies typique de bactéries lactiques à savoir leur apparence

macroscopique (aspect de la colonie: forme, taille, pigmentation, contour,

viscosité) sont prises au hasard, à partir de boites contenant entre 25 et 250

colonies des différents milieux de cultures utilisés (MRS, M17, MRSA, MRSL et

KMK) et sont ensuite repiquées dans le bouillon MRS et incubées à 28 °C.

Après incubation, les colonies sont réensemencées dans du MRS solide. Les

souches seront examinées pour leur coloration de Gram et le test de la

catalase. Les bactéries Gram positives et catalase négatives sont présumées

des bactéries lactiques et seront conservées dans le milieu lait écrémé à

l’extrait de levure (LEY) supplémenté de 20% de glycérol et conservé à -20°C.

Les souches conservées seront davantage examinées pour les identifier.

2.2.2.2. Identification des souches bactériennes

Afin de pouvoir identifier correctement les bactéries lactiques, deux type

d’identification sont à suivre, une identification selon le genre et une autres

selon selon l’espèces.

Determination du genre selon Carr et al., (2002). :

Les tests a, b, c, d, e sont à considérer comme identification du genre. Cette

derniere suit un schéma montrer sur la figure 9.

a- température

La croissance bactérienne est évaluée par un trouble en milieu MRS après

72 h d'incubation à 10, 15, 45°C.

b- Type fermentaire

Le bouillon MRSG (Bouillon MRS + glucose au lieu du lactose) + cloche de

Durham est utilisé pour mettre en évidence la production du CO2 et de

savoir ainsi le type fermentaire de nos souches (hétéro ou homolactiques).

c- Tolérance à la salinité

La détermination des isolats appartenant au genre Streptococcus et

Lactococcus est effectuée selon les tests physiologiques utilisés par Samelis

et al. (1994), Garvie (1983), Schleifer et al., (1985) et Carr et al., (2002).


60

Afin de différencier les lactocoques des streptocoques fécaux, plusieurs test

confirmatifs sont utilisés.

Etant donnée que les lactocoques et le Streptococcus thermophilus ne

poussent pas à 6,5% d’NaCl, les souches de formes cocci, sont testées pour

leur capacité à croître dans le bouillon hypersalé contenant 4,5% et 6,5%

d'NaCl. L’incubation se fait à 28°C pendant 4 jours.

d- Tolérance au pH alcalin

Le bouillon MRS alcalininé à pH 9,6 est aussi utilisé pour différencier les

lactocoques des streptocoques fécaux. Ainsi seuls les enterocoques fécaux

poussent dans ce type de milieu (Carr et al., (2002)).

e- Hydrolyse de l’arginine

La recherche de l’arginine déhydrolase (ADH) est étudiée sur le milieu M16

BCP (Thomas, 1973).

Ce milieu contient du lactose (2 mg / ml) et de l’arginine (4 mg / ml) et un

indicateur de pH le pourpre de bromocrésol (0,05 mg / ml). Les bactéries

lactiques utilisent le lactose en acidifiant le milieu, les colonies donnant

ainsi une coloration jaunatre. D’autres bactéries lactiques sont capables

d’utiliser l’arginine et réalcalinisent le milieu, leurs colonies apparaissent

blanchatres. La couleur de l’indicateur de pH demeure inchangée.

Determination de l’espèce

f- Profile fermentaire

La fermentation des carbohydrates a été mené sur milieu MRS sans extrait

de viande et additionné au pourpre de bromocrysol (BCP) comme indicateur

de pH (MRSBCP-EV). La source de carbone est représentée par l'un des

sucres suivant : arabinose, glucose, fructose, galactose, lactose, maltose,

mannitol, raffinose, rhamnose, saccharose, et xylose. Les solutions sucres

sont préparée à 3% et stérilisées par autoclavage. Un millilitre de la

solution sucrée est additionné à 10 ml de MRSBCP-EV. Vu le nombre

important de souches étudiées ainsi que le nombre de tubes à essai à

utiliser avec chaque souche, un mini préparation est réalisé au laboratoire.

Une plaque d'Elisa est utilisée pour ses puits. Les puits de chaque ligne

contiendront une source de carbone qui sera utilisée par différentes

souches (figure 8).


61

Une solution bactérienne servant à ensemencer les puits contenant les

différentes source de carbonne à été préparée. Une culture de 18 heures de

la souche appropriée est centrifugée à 8000 tr/mn pandant 15 min. Le culot

ainsi récupéré est additionné de 2 ml de tampon phosphate puis

recentrifugé aux mêmes conditions pour le débarrasser des restes du milieu

de culture et obtenir un cullot cellulaire pur. A ce culot, 5 ml de milieu

MRSBCP-EV est additionné pour former la solution cellulaire servant à

ensemencer les puit contenant différentes source de carbone ; 100 µl de

cette solution bactérienne est déposée dans chaque puit. La lecture des

résultats sa fait après 24 et 48 heures d’incubation.

Sucres utilisés

Souches

Figure 8: schéma représentant la mini préparation pour le test de la fermentation

des sucres

L’identification complète de nos souches bactériennes a été achevée selon les

schémas de systématique illustré dans le schéma ulustré dans les figure

9,10,11,12,13,14.

Figure 9. Schéma de différentiation des genres appartenant aux bactéries lactiques


62

Figure 10. Schéma d’identification rapide des streptobacterie

Figure 11. Schéma d’identification rapide pour lactobacilles heterofermentatifs


63

Figure 12. Schéma pour différentier le Group D des streptococci de celui desstreptocoques lactiques (Deibel et Seeley, 1978).

Figure 13. Schéma pour l’identification présomptive des Leuconostoc spp (Mathohet al., 1994 ; Kihal et al.,, 1996)


64

Figure 14. Schéma général servant pour l’identification des aerocci et des pediococci

(Carr et al., (2002)).

2.3. Conservation des souches bactériennes

Deux types de conservation de nos souches sont à noter. Une de courte durée

et l’autre à longue durée.

2.3.1. Conservation courte durée

Les souches sont ensemencées sur gélose MRS (ou M17) incliné en tube.

Ces cultures sont gardées à 4 °C. Les repiquages se font toutes les deux

semaines (Saidi et al., 2002).

2.3.2. Conservation longue durée

A partir de jeunes cultures (18-48 h) sur milieu liquide, les cellules sont

récupérées par centrifugation à 4000 t / min pendant 10 min. Une fois le

surnageant éliminé, on ajoute le milieu de culture de conservation sur le culot.

Le milieu de conservation contient du lait écrémé, 0,2% d’extrait de levure et

30% de glycérol. Les cultures sont conservées en suspension dense et en tubes

eppendorfs à –20 °C. Accolas et al. (1972) indiquent que des suspensions très

concentrées résistent mieux à la congélation. En cas de besoin, les cultures

sont repiquées dans du lait écrémé à 0,5 % d’extrait de levure, avant utilisation

(Figure 15).


65

Culture de 18 h sur bouillon MRS

Centrifugation à 4000 tr/mn pendant 10 min

Conservation du culot

Culot est additionné de 2ml de lait écrémé stérile

à l’extrait de levure plus 30 % de glycérol.

Répartition dans des tubes Eppendorfs

Conservation à – 20 °C.

Figure 15. Schéma de conservation longue durée des bactéries lactiques purifiées

(Saidi et al., 2002)

2.4. Caractérisation technologiques

2.4.1. Production de l’acidité titrable

Cette manipulation a pour but de déterminer par titrage la concentration

molaire en ions H3O+ dans un échantillon de lait. Cette concentration est

exprimée en "degrés Dornic". Le matériel nécessaire est le suivant: un statif

avec noix et pince, une fiole conique de 100 mL, une solution de NaOH N/9,

une burette de 25 mL, une pipette jaugée de 10 mL et une solution de

phénolphtaléine à 1% dans l'éthanol. Remplir la burette de la solution de

NaOH N/9 et la fixer au statif. Régler le niveau du liquide à zéro. À l'aide de la

pipette de 10 mL, prélever 10 mL de lait et transférer dans la fiole conique de

100 mL. Ajouter 5 gouttes de solution de phénophtaléine et titrer jusqu'à

apparition d'une couleur rose persistante. Noter le volume de solution titrante

utilisé en dixièmes de millilitres. Nombre de dixièmes de millilitre de NaOH =

1°D


66

Figure 16. Instruments pour la mesure de l’acidité titrable.

2.4.2. Utilisation du citrate en présence de sucre fermentescible

(glucose):

L’utilisation du citrate est étudiée sur milieu Kempler et Mc Kay (1980)

(Annexe). Ce milieu contient une solution de ferricyanide de potassium et une

solution de citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieu inhibe la

réaction entre l’ion ferrique et le potassium ferricyanide. Les colonies qui

fermentent le citrate lancent la réaction entre ces ions il en résulte la formation

de colonies bleues ou ayant un centre bleu (après 18 h-72 h d’incubation). Les

colonies incapables de fermenter le citrate restent blanches.

2.4.3. Production des composés aromatiques.

La production d’acetoîne est testée sur milieu Clark et Lubs (FIL, 1996). Les

souches sont cultivées sur ce milieu ; Après 24h d’incubation, on test par la

réaction de Voges-Proskaeur dite réaction de V.P.

Dans un tube à hémolyse, 2ml de cette culture sont transvasés, 0,5 ml de

réactif α-naphtol à 6% dans l’alcool absolu (VP1) et 0,5 ml d’une solution de

soude (NaOH) à 16% dans l’eau distillée (VP2). On agite soigneusement les

tubes et on laisse au repos 5 à 10 min à température ambiante. La production

d’acétoîne se traduit par l’apparition d’un anneau rose à la surface du milieu.

2.4.4. Production des enzymes protéolytiques

La recherche de l'activité protéolytique au sein de nos souches lactiques

à été conduite par une recherche qualitative et quantitative.

Les souches présumées des bactéries lactiques isolées des différents

échantillons de lait ont été cultivées sur milieu MRSL. Les bactéries possédant

une activité protéolytique donne des zones clair autour de la colonie. Les


67

mêmes souches sont cultivées dans du bouillon MRS additionné de caséine.

L'appréciation de l'activité protéolytique se fait par l'apparition d'un coagulum

dû à l'hydrolyse de la caséine. On remarque que plus la souche est

protéolytique plus le coagulum s'hydrolyse à son tour.

La quantification de l'activité protéolytique à été réalisée par la recherche de la

vitesse d'hydrolyse de la caséine en utilisant la méthode de la ninhydrin. Cette

méthode se base sur la quantification des groupements -NH2 libérés à partir

de la caseine.

Le culot cellulaire est obtenu par centrifugation des cultures jeune en milieu

MRS des souches retenus (après 18 h d'incubation). Le culot est lavé dans du

tampon phosphate (TP) par centrifugation 4000 tr pendant 5 min. Le culot

ainsi obtenu est dilué dans 2 ml du TP, cette solution est désignée par CTP.

Une série de tube (6 tubes) pour chaque souche, contenant 5ml de TP à 1% de

caséine (le milieu est stérilisé par autoclavage à 120°C pendant 20 min) est

ensemencé par 0,2 ml du CTP de la souche à tester. L'incubation se fait à la

température de croissance optimale de chaque souche. Une lecture de la

densité optique est faite à intervalle de temps.

Après incubation et à intervalle de temps, un tube est retiré de l'incubateur, la

culture est centrifugée et le surnagent est récupéré. 0,5 ml du surnageant est

prise puis traitée par la solution de la ninhydrin puis chauffée à 85 °C pendant

5 min puis aussitôt refroidie dans de l'eau glacée. La densité optique est lue à

une longueur d'onde de 507 nm. La quantité de -NH2 libéré est exprimée en

meq de leucine libéré dans le milieu (Chekroun et al., 1998).

2.4.5. Production de dextran.

La production du dextrane à partir du saccharose est mise en évidence

sur milieu solide MSE (Mayeux et al., 1962). Les souches productrices de

dextrane sont caractérisées par la formation de colonies larges, visqueuses et

gluantes. Ce test est aussi considéré comme clé d’indentification permetant

aussi de différencier entre les leuconostoques productrices et non productrice

de dextran.


68

2.5. Etude des interactions bactériennes

2.5.1. Recherche des substances antimicrobiennes

Les bactéries lactiques isolées sont testées pour leur activité antagoniste selon

deux méthodes.

a- méthode directe

L’activité antimicrobienne de nos souches a été évaluée sur milieu solide selon

la méthode de Barefoot et Klaenhammer (1983). Le milieu MRS est ensemencé

en touche par nos souches. Après 24 heures d’incubation une couche de gélosé

moelle (0,7%) ensemencée par la souche de Lactobacillus curvatus (souche de

bactéries lactique sensible aux substances antimicrobiennes et ne produisant

pas ces dernières, offerte par le Dr Hammes, laboratoire de hohenhain,

Allemagne) est coulée à la surface puis réincubée pour 24 à 48 heures

supplémentaire. Les souches présentant une zone claire tout au tour sont

considérées comme productrices de substances antimicrobiennes.

b- méthode indirecte

Cette méthode permet de mettre en contacte le surnageant de la souches

lactiques productrice de substance antimicrobienne avec la souche test. Les

souches précédemment sélectionnées pour leur production de substances

antimicrobienne sont concernées par ce test.

Les souches sont cultivées dans du milieu MRS liquide et incubées pendant 18

heures. Après incubation, le milieu est centrifugé (8000 tr/mn 10 min) et le

surnagent est conservé. Dans une boite de Pétri contenant du MRS solide et

ensemencé par la souche test, des puits sont réalisés avec un emporte pièce et

celée par 10 µl de gélose MRS (figure 17). Les puits recevront 100 µl du

surnageant de la souche à testée et les boites sont incubée pendant 24 à 48

heures. Les colonies entourées d'une zone claire dans la nappe de culture de la

souche test et ayant un diamètre supérieur à 2 mm sont considérées comme

positive.


69

Figure 17. Les différentes méthodes utilisée pour la recherche de substances

antimicrobienne. (a) méthode de la double couche, (b) méthode de diffusion en puits

2.5.2. Détermination de la nature de l’agent inhibiteur.

Afin de déterminer la nature de la substance inhibitrice produite par nos

bactéries lactiques, il est impératif de réaliser une série de test.

a- inhibition due au peroxyde d’hydrogène

Pour écarter l’effet du peroxyde d’hydrogène dans l’inhibition de Staphylococcus

aureus, les surnagents des cultures des bactéries lactiques sont traités par 1

mg/ml de catalase puis incubée à 37°C pendant 1 heure. Le surnageant est

stérilisé par filtration et testé par la méthode des puits sur Staphylococcus

aureus.

b- inhibition due à l’acide lactique

L’acide lactique est un facteur majeur dans les inhibitions par les bactéries

lactiques. Afin d’éliminer son effet, les bactéries lactiques sont cultuvées dans

du MRS liquide tamponé; ainsi l’acide lactique produit par la souche lactique

sera neutralisé et seule la substance antimicrobienne si elle est produite

exprime son action sur Staphylococcus aureus.

c- inhibition due aux bactériophages

Avec une pipette Pasteur, on découpe un fragment de gélose dans la zone

d’inhibition. Ce fragment est mis en suspension dans 1 ml de milieu contenant

50 µl de chloroforme. Après agitation, on laisse décanter 5 min, puis on prélève

300µl de milieu que l’on ajoute à 7 ml de gélose molle contenant la souche


70

indicatrice. Le mélange est coulé stérilement dans une boite de Pétri et incubé

48 h à 28°C. La présence de plage de lyse indique la présence de phages.

d- recherche de la nature proteique de la substance antimicrobiene

La recherche de substances antimicrobiennes comme les bactériocines,

nécessitent la recherche de la nature de cette substance qui si elle appartenait

aux bactériocines devrait avoir une nature protéique. Pour ce faire le filtrat de

culture de la bactérie lactique productrice est traité par différents types

d’enzymes protéolytiques. Ainsi, 1 ml du filtrat de culture est traité par 1

mg/ml de trypsine ou chymotrypsine et incubé à 37°C pendant 1 heure. Le

filtrat ainsi traité est stérilisé par filtration sur filtre millipore de 45 µm de

diamètre. L’action de ce filtrat est testé par la méthode des puits sur milieu

Chapman et incubé à 37°C pour 24 à 48 heure.

e-Effet de la température

Les substances antimicrobiennes ont été testées pour leur résistance à la

température et la conservation de leur activité vis-à-vis de Staphylococcus

aureus. Le filtrat de culture de la souche lactique productrice est traité par

différentes températures (75, 80 et 100°C) puis testé sur Staphylococcus

aureus sur milieu gélosé Chapman par la méthode des puits.

2.5.3. Etude des interactions Staphylococcus-bactéries lactiques

L’étude des interaction de Staphylococcus aureus et nos souches de

bactéries lactiques productrices de substances antimicrobienne à été conduite

selon les deux méthodes déjà décrites en haut. Les bactéries lactiques

donnant un résultat positif avec la méthode directe sont retenues et tester de

nouveau par la méthode indirecte en puits sur gélose Chapman; L’incubation

se fait à 37°C pour 24 à 48 heures. L’inhibition de la croissance de

Staphylococcus aureus par nos bactéries lactiques peut être due à la

production de peroxyde, à l’acide lactique, aux bactériophage ou à des

substances antimicrobiennes produites dans le milieu externe (extracellulaire).

Afin de confirmer la nature antimicrobienne des substances produites, il est

impératif d’éliminer l’action des autres facteurs inhibiteurs. Il faut noter que

seules les souches inhibant Staphylococcus aureus par la méthode des puits

est retenue.


71

2.6. Etude de la cinétique de croissance en culture mixte

L’étude de la cinétique de croissance de Staphylococcus aureus en

présence et en absence de bactéries lactiques productrices de substance

antimicrobienne a été faite sur milieu lait (figure 18).

La souche LC8 et Staphylococcus aureus sont d’abord ensemencés sur milieu

lait pendant 18 heures. Trois fioles contenant chacune 100 ml de lait écrémé

stérilisé sont préparées puis ensemencer par 3 % de culture bactérienne. La

première série reçoit la bactéries lactique seule, la deuxième Staphylococcus

aureus et la troisième représentera la culture mixte et contenant la bactérie

lactique et Staphylococcus aureus. Chaque fiole ainsi préparée est répartie en

10 tubes à raison de 10 ml chacun. Les tubes sont incubés et à chaque heure

d’incubation des comptages sur milieu solide sont effectués selon la méthode

officielle (IDF). Pour la culture mixte seule le staphylocoque est compté. Le

comptage se fera sur les milieux appropriés à savoir sur gélose MRS pour la

bactérie lactique et sur gélose de Chapman pour Staphylococcus aureus.


72

Pour chaque culture et à intervalle de temps égale on réalise :1- des cultures pures : un dénombrement de Staphylococcus aureus sur milieuChapman.et celui de la bactérie lactique sur milieu MRS.2- de la culture mixte : un dénombrement de Staphylococcus aureus sur milieu

Chapman, on mesure le pH du milieu. Et on calcule l'acidité produite

Figure 18. Schéma résumant la méthodologie utilisée pour l'étude des culturesmixtes

Répartition 10 ml dans des tubes

St. aureus La souchelactique

St. aureus+

la souche lactique

1ml1ml

0.1ml0.1ml

Culture de 18h deLa souche lactique

Sur MRS

10ml delait écrémé

18hCulture de 18h de

St. aureus surBouillon nutritif

100ml de laitécrémé stérile

0h 4h 8h 24h 48h

58

Résultats et discussion

Journal Algérien des Régions Arides 2002 . 01 :01-14 Résultats

75

3. Résultats

Caractérisation des Bactéries Lactiques Isolées du LaitCru de Chèvre des Régions Arides d’Algérie.

N. SAIDI (*), B. GUESSAS (*), F. BENSALAH (*), A. BADIS , M. HADADJI(*), D.EHENNI, H. PREVOST (**) et M. KIHAL (*)

(*)Laboratoire de Microbiologie Appliquée, Département de Biologie, Faculté des Sciences,Université d'Oran. BP 16 Es-Sénia, 31100, Oran, Algérie,

(*) Chercheurs associés au CRSTRA,(**)Département Sciences des Aliments, Laboratoire Microbiologie Alimentaire et Industrielle,

ENITIAA, BP 82225, 44322 Nantes Cedex 3 France.

SUMMARYDiversity and density of lactic acid bacteria isolated from Algerian raw goats'

milk in arid zones were studied. Microbiological, phenotypical, physiological andbiochemical analysis were realised.The study of 206 isolates revealed the presence of 115 cocci and 91 lactobacilli.The representative species of the total cocci were Lactococcus species (76,16%),Streptococcus thermophilus (14,78%) and Leuconostoc species. (8,6%). Thedominating species is Lactococcus lactis subsp. lactis.Lactobacilli species found in local raw goats' milk and their proportion were: Lb.curvatus (25,25 %), Lb. helviticus (10,98%), Lb. plantarum (9,89%), Lb. reuteri(9,89%), Lb. casei (7.69%), Lb. brevis (5,49%), Lb. bulgaricus (5,49%) Lb. paracasei(4,39 %) and Lb. acidophilus (2,19%). Only two isolates of Lactococcus lactissubsp. lactis shown high proteolytic activity.The amount of lactic acid production by several strain was between 42,2 mM and110,6 mM in pure culture in milk. Whereas, in the mixed culture the resultrevealed positive and negative interactions.This investigation of goats' raw milk microflora should have many industrial andbiotechnological applications

KEY-WORDS: Goats' raw milk - Lactic acid bacteria - Characterization -Identification - Acidification - Proteolytic activity.


76

KIHAL Mebrouk E-mail : [email protected]

RESUME

La diversité et la densité des bactéries lactiques du lait cru de chèvre des

zones arides de l’ouest d’Algérie ont fait l'objet d’analyses bactériologiques,

phénotypiques, physiologiques et biochimiques.

L'étude de 206 souches de bactéries lactiques a révélé la présence de 115 de

formes cocci et 91 bâtonnets. Les cocci sont représentés par les genres

Lactococcus (76,16%), Streptococcus thermophilus (14,78%) et Leuconostoc (8,6%).

Lactococcus lactis subsp lactis est l’espèce dominante. Les espèces de lactobacilles

détectées sont curvatus (25,25%), helviticus (10,98%), plantarum (9,89%), reuteri

(9,89%), casei (7.69%), brevis (5,49%), bulgaricus (5,49%), paracasei (4,39%) et

acidophilus (2,19%).

Deux souches de Lactococcus lactis subsp lactis possèdent une activité

protéolytique considérable. Le pouvoir acidifiant obtenu par les différentes

souches testées en milieu lait se situe entre 42,2 mM et 110,6 mM en culture

pure. En revanche, l’évaluation de la cinétique d’acidification en culture mixte fait

apparaître différentes interactions positives et négatives.

Mots clefs: Lait de chèvre, bactéries lactiques, identification, pouvoir acidifiant,

protéolyse.

INTRODUCTION

Le lait de chèvre joue un rôle alimentaire important dans régions arides [38,

39, 43]. La production de lait de chèvre dans le monde est évaluée à 7.2 millions

de tonnes par an [38]. Elle ne cesse d’augmenter vu sa valeur nutritionnelle [1,

16, 48]. La sélection de souches de bactéries lactiques pour leurs aptitudes

industrielles ou leur probables potentialités thérapeutiques a pris tout son essor

dans de nombreux pays [1, 19]. Ainsi des bactéries lactiques sont recherchées


77

dans leurs divers écosystèmes naturels telle que les plantes [4, 27, 35], les

fromages [36, 40] et les produits carnés et marins [35].

La nécessité d'obtention de nouvelles souches lactiques performantes et

stables a reçu un intérêt particulier. La sélection de ces souches utilisées comme

starter est basée sur la production d'acide lactique, de composés aromatiques, de

bactériocines et de leur résistance aux bactériophages [5, 7, 9, 13, 14, 17, 18, 20,

24].

L'objectif de cette étude est d'une part l'isolement, la caractérisation et

l'identification de bactéries lactiques du lait cru de chèvre des zones arides

algériennes, et d'autre part l'évaluation de leurs aptitudes technologiques.

MATERIEL ET METHODES

Isolement des souches

Les échantillons de lait cru de chèvre proviennent des villes suivantes:

Béchar, Saïda, Ghardaïa, Béni-Abbès, Tamanrasset et Tiaret. Dans des conditions

d’asepsie, les échantillons du lait cru sont recueillis par la traite dans des flacons

stériles conservés à 4°C et sont transportés le même jour au laboratoire pour

analyse. Chaque échantillon du lait cru est réparti en tube à raison de 10 ml.

Deux des tubes sont maintenus à température ambiante, deux incubés à 30°C, et

deux autres à 45°C jusqu'à coagulation par les bactéries endogènes. L’isolement

des souches bactériennes mésophiles et thermophiles est réalisée selon les

méthodes décrites par FIL (Fédération Internationale du Lait) [11]. Les souches

retenues sont conservées à – 20°C dans une solution contenant 70% de lait

écrémé (enrichie par 0.5 g/l d'extrait de levure et 0.5 g/l de glucose) et 30% de

glycérol à 40% [42].

Caractérisation physiologique et biochimique

Tous les isolats sont préalablement testés pour la coloration de Gram, la

catalase et la sporulation. Les caractéristiques des colonies sont aussi

déterminées sur milieux solides M17 [45] et MRS [6]. Seules les bactéries à Gram

positif et à catalase négative sont par la suite identifiées par le test de Sherman

[22].


78

L’effet de la température sur la croissance est testé pendant 5 jours à 15°C,

37°C et 45°C. En outre la résistance à une température élevée (60°C , 30 mn) est

réalisée selon la méthode de Joffin et Leyral [22]. La production de gaz à partir de

glucose a été déterminée sur milieu liquide contenant des tubes de Durham [15].

L'hydrolyse de l'arginine et l'utilisation du citrate ont été testées sur milieu

M16BPC de Thomas [46, 47] et milieu Kempler et Mc Kay [23]. L'aptitude à croître

en présence de 4% et 6,5% de NaCl et à pH 9.6 a été observée en milieu liquide

M17 à 30°C pendant 2 jours. La production de dextranes à partir de saccharose a

été déterminée sur milieu solide MRS [33]. La production d'acétoïne à partir de

glucose est réalisée selon le test de Voges-Proskauer [42].

Fermentation des carbohydrates

Elle est déterminée sur milieu liquide MRS additionné de 0.04 g/l de

pourpre de bromocrésol comme indicateur de pH, et supplémenté avec 1% des

carbohydrates suivants: L-Arabinose, Ribose, D-Xylose, Galactose, D-Fructose,

Mannitol, Sorbitol, Cellobiose, Maltose, Lactose, Mélibiose, Saccharose, Tréhalose,

et D-Raffinose. Après inoculation, les conditions d'anaérobiose sont assurées par

l'addition d'huile de paraffine stérile à la surface [42]. Ces tests sont complétés

par celui de l'hydrolyse de l'esculine [34]. Enfin, le système d’identification API

50CH (Biomerieux Marcy l'Etoile France) a servi pour l’établissement du profil

fermentaire des souches.

Activité protéolytique

L'aptitude à la protéolyse des différentes espèces de Lactococcus est

recherchée sur milieu à base de lait écrémé Y.M.A [37]. L’intensité de la réponse

est notée à chaque fois (-, +, ++).

Croissance et production d'acide sur milieu lait

L'évaluation de l'acidité produite par les souches en cultures pures ou en

cultures mixtes (mélange de deux souches) est réalisée par titrimétrie ( titrage de

10 ml d'échantillon de culture avec NaOH N/9 en présence de 5 gouttes de

phénolphthaléine) et par pH-métrie. Ce test est réalisé dans le lait écrémé qui est

reconstitué à 10%, enrichi par 0.5 g/l d'extrait de levure et stérilisé à 110°C

pendant 10 mn. La pré-culture est obtenue par l'inoculation du lait écrémé (6 ml)


79

par une seule colonie de bactéries lactiques. Après incubation à la température

convenable et après coagulation, le tout est transvasé stérilement dans 200 ml de

lait écrémé. La cinétique de croissance et d'acidification sont réalisées

simultanément à des intervalles de temps régulier [20, 24]. La production d'acide

lactique est exprimée en mM selon la méthode de Kumar et al., [26].

RESULTATS.

Caractérisation des souches bactériennes

Les isolats à Gram positif, catalases négatifs et non sporulés sont

étudiées. La croissance des souches en présence de 6.5% de NaCl, à 45°C et à pH

9.6 permet de séparer les entérocoques. Par contre les formes cocci qui ne

poussent pas dans de telles conditions sont classées parmi les bactéries lactiques

(115 souches) (Tableau1).

Les tests physiologiques et biochimiques ont facilité la répartition des

isolats en 6 groupes : coques homofermentaires mésophiles (groupe 1: 88

souches), coques hétérofermentaires mésophiles (groupe 2: 10 souches), coques

homofermentaires thermophiles (groupe 3: 17 souches).

Dans le groupe 1, (88 souches) la recherche de l'ADH et de l'acétoïne ont

permet l’identification de l’espèce et la sous-espèce : c'est le cas de Lactococcus

lactis subsp. lactis ADH+ (74 souches) et Lactococcus lactis subsp. cremoris ADH-

(14 souches) et même la sous-espèce, c'est le cas de la production d'acétoïne et

l'utilisation du citrate caractéristique de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar

diacetylactis (39 souches).

Pour les autres groupes, contrairement aux lactocoques, ces deux tests

s'avèrent insuffisants quant à leur identification; car elle repose essentiellement

sur la fermentation des carbohydrates. Les 10 souches du groupe 2 appartiennent

au genre Leuconostoc (Tableau 1). Parmi ces dernières, deux sont caractérisées

par un profil fermentaire réduit, ne dégradent pas l'arginine et ne produisent pas

de dextranes. Ces caractères nous permettent de les classer dans l'espèce

Leuconostoc mesenteroïdes subsp. cremoris. L'espèce dominante de ce genre

appartient à Leuconostoc mesenteroïdes subsp. mesenteroïdes qui dégrade

l’arabinose et produise du dextrane.


80

Le troisième groupe (17 souches) possèdent les caractéristiques de

Streptococcus thermophilus qui sont un profil fermentaire réduit, ne poussent pas

en milieu Sherman. Cette souche ne supporte pas le pH 9.6 et 6.5 % de NaCl.

Les lactobacilles sont représentés par 91 souches, les bâtonnets

homofermentaires mésophiles (groupe 4: 53 souches), bâtonnets

homofermentaires thermophiles (groupe 5: 20 souches) et bâtonnets

hétérofermentaires mésophiles (groupe 6: 18 souches). Les résultats obtenus lors

de la fermentation des carbohydrates (Tableau 1) permet de les répartir selon

différentes espèces. Le groupe 4 est constitué de Lb. plantarum 9 (9.89 %), Lb.

casei 7 (7.69 %), Lb. curvatus 23 (25.27 %), Lb. rhamnosus 10 (10.98 %) et Lb.

paracasei 4 (4.39 %); le groupe 5 renferme Lb. acidophilus 2 (2.19 %); Lb.

helviticus 10 (10.98 %), Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus 5 (5.49 %) et Lb.

delbrueckii ssp. lactis 3 (3.29 %); quant à Lb. brevis 5 (5.49 %), Lb. reuteri 9 (9.89

%) et Lb. fermentum 4 (4.39 %), elles font partie du groupe 6.

Activité protéolytique et pouvoir acidifiant

Un pourcentage de 39.47 des lactocoques ne présentent aucune activité

protéolytique; 53.9% un halo d'hydrolyse inférieur à 10 mm; 5.26% un halo

compris entre 10mm et 20 mm. Seule une espèce de Lactococcus lactis subsp.

lactis possède une activité protéolytique importante (halo égale à 26 mm).

La production maximale d'acide (Figure 1) des cultures pures se situe entre

42.2 mM et 110.6 mM. Les vitesses maximales moyennes obtenues entre deux

heures et dix heures d'incubation sont respectivement de 1.9 mM h-1 et 9 mM h-1.

Les figures 2a et 2b présentent la production d'acide lactique en cultures mixtes

de deux couples de lactocoques. La production d’acide lactique est stimulée entre

la souche LL.9LMA (31.1 mM) et la souche LL.30LMA (50 mM) celle-ci atteint

127.6 mM après 16 h d'incubation (Fig 2a). L’augmentation de la production

d'acide est significative (+ de 57.3 %). La deuxième montre l'effet antagoniste entre

la souche LL.9LMA (31.1 mM) et la souche LL.11LMA (55.5 mM) se manifeste par

une réduction de 33.3 mM en co-culture après 10h d'incubation (Fig 2b).

DISCUSSION

Notre présente étude a permis d’isoler, de caractériser, et d’identifier 206

souches de bactéries lactiques réparties essentiellement entre de lactocoques (Lc.


81

lactis subsp. lactis (35 souches), Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, (39

souches), Lc. lactis subsp. cremoris (14 souches), de streptocoques (Sc.

Thermophilus 17 souches), de leuconostocs (Ln. mesenteroides subsp.

mesenteroides 8 souches, Ln. mesenteroides subsp. cremoris 2 souches), et de

lactobacilles (Lb. plantarum 9 souches, Lb. casei 7 souches, Lb. curvatus 23

souches, Lb. rhamnosus 10 souches, Lb. paracasei 4 souches, Lb. acidophilus 2

souches, Lb. helviticus 10 souches, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, 5 souches, Lb.

delbrueckii ssp. lactis 3 souches, Lb. brevis 5 souches, Lb. reuteri 9 souches et Lb.

fermentum 4 souches).

Les espèces de bactéries lactiques détectées dépendent essentiellement de la

nature du lait cru et des conditions d’analyse. Ainsi, à partir du cheddar, la

caractérisation phénotypique et génotypique de la microflore lactique a permis de

recenser les espèces dominantes de Lb. paracasei, de Lb. plantarum, de Lb.

curvatus, et de Lb. brevis [12]; alors que pour Bissonnette et al., [2], l'espèce

dominante du même fromage était Lc. lactis subsp. cremoris. Les espèces de

bactéries lactiques dominantes des levains artisanaux appartiennent à Lb.

plantarum, Lb. curvatus, et Lb. brevis [32]. Pour le poisson, ce sont Lc. lactis

subsp. lactis et Ln. citreum. et pour le riz bouilli Lb. paracasei [3, 35]. Dans les

produits carnés, Hugas et al., [21] ont trouvé que Lactobacillus plantarum

représente 8 % des lactobacilles isolées et l'espèce dominante était Lactobacillus

sake avec 55 %; en revanche, Rovira et al., [41] trouvèrent Lactobacillus plantarum

l'espèce dominante de la flore lactique isolée. Dans les produits végétaux tels que

le sorgho, les espèces de bactéries lactiques dominantes appartiennent aux

lactobacilles (Lactobacillus plantarum 34.7 %, Lactobacillus sake-Lactobacillus

curvatus 15 %), aux leuconostocs (Leuconostoc mesenteroides 28.2 %) et aux

pédiocoques (Pediococcus pentosaceus 10.2 % et Pediococcus acidilactici 7.8 %);

par contre les lactocoques ne représentent que 4 % [27].

La deuxième étape a permis de recenser des souches possédant des

propriétés technologiques intéressantes telles que le pouvoir acidifiant et l’activité

protéolytique. Dans notre cas, les souches les plus acidifiantes appartiennent aux

deux sous espèces Lc. lactis subsp. lactis et Lc. lactis subsp. lactis biovar

diacetylactis.


82

Une stimulation de la production d’acide entre LL.9LMA et LL.30LMA. est

obtenue. Cette protocoopération a été observé entre les souches de bactéries

lactiques [10]. Elle peut aboutir à une augmentation de la croissance de ces

souches et à une acidification du lait plus importante que la somme de ces

activités propres à chacune des deux espèces [10].

Les méthodes utilisées pour la mise en évidence de l’activité protéolytique

sont cependant assez dissemblables et les résultats obtenus sont difficilement

comparables. Elles diffèrent notamment par la nature des substrats protéiques et

la spécificité des activités enzymatiques. Pour notre cas nous avons utilisé le

milieu Y.M.A. pour détecter l’activité protéolytique. En plus de son action sur la

coagulation du lait lors de la croissance des bactéries lactiques, la protéolyse

d’origine bactérienne est essentielle à l’affinage des fromages par le développement

de flaveurs [29] et de la texture [31]. La composition du milieu de croissance et les

conditions de culture peuvent modifier l’activité protéolytique totale ou

activer/inhiber une activité protéasique ou peptidasique donnée [25, 28]. Les

souches les plus protéolytiques que nous avons isolées appartiennent à l’espèce

Lc. lactis subsp. lactis. Desmazeaud et Vassal [8, 30] ont montré que les souches

les plus protéolytiques sont Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis. Les

bactéries lactiques testées sont peu protéolytiques et rejoignent les résultats

obtenus par Reinheimer et al. [40].

Les souches présentant un halo de lyse entre 5 et 10 mm de diamètre, ont

une acidité de 65.5 mM. La valeur maximale de production d’acide lactique

obtenue est de 99,9 mM. Alors que pour 3 sous-espèces protéolytiques de Lc.

lactis subsp. lactis, le pouvoir acidifiant varie entre 74.4 mM. et 99.9 mM. De

telles constatations ont été enregistrées par Sodini et al., [44].

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85

Tableau 1: Propriétés physiologiques et biochimiques des différentes souches debactéries lactiques isolées à partir du lait cru de chèvre.

Cocci BâtonnetGroupe 1 2 3 4 5 6

Type Fermentaire Homo hétéro homohomohomo hétérNombre desouches

35 39 14 8 2 17 53 20 18

ADH + + - - - 6 10Croissance à 15°C

37°C

45°C

++-

++-

++-

++-

++-

-++

-+-

-++

-+-

Croissance à 4%NaCl

6.5%NaCl

+-

+-

--

--

--

--

--

--

--

Production deDextrane

Acétoïne

--

-+

--

+-

-+

--

--

--

--

Fermentation deArabinoseRiboseXyloseGalactoseFructoseMannitolSorbitolCellobioseMaltoseLactoseMelibioseSaccharoseTrehaloseRaffinose

1133234+31633+332523321

13+3373029112131+3522+1

4+-++13-

12111326+-

++-6+--+++5++-

-+-1----1++-+-

55-57--32++16+-

15473050514435+

49522133278

2+3141846411181217-

1013-

12+167+13127167-

+: réaction positive; -: réaction négative; les chiffres indiquent le nombre de souches positives.

Tableau 2: Activité protéolytique des différentes espèces de Lactococcus sur milieuYMA.

Degré de protéolyseEspèces Nombre 0 + ++ +++

Lactococcus lactis subsp lactisLactococcus lactis subsp lactisbiovar diacetylactisLactococcus lactis subsp cremoris

3539

14

1618

8

1421

6

40

0

10

00: absence d'un halo d'hydrolyse; +: halo 10mm; ++; halo de 10mm à 20 mm; +++: halo 20mm.


86

Figure1: Cinétique d'acidification en mM d’acide lactique produit enculturespures.LL.111LMA º, LL.150 LMA et LL.8 LMA ).

Figure 2: Cinétique d'acidification en mM d'acide lactique produit en culturespures et mixtes.(A) LL.9 LMA , LL.30 LMA o, LL.9 LMA +, LL.30 LMA observées et LL.9 LMA + , LL.30 LMA calculées ▲. (B) ) LL.9 LMA , LL.11 LMA o, LL.9 LMA + LL.11 LMA observées et LL.9 LMA + LL.11 LMA calculées ▲

0

20

40

60

80

100

120

140

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Temps(h)

Acid

ité

pro

du

ite

(mM

)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Temps(h)

Aci

dit

ép

rod

uit

e(m

M)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Temps (h)

Aci

dit

épro

duit

e(m

M)

A B

Dirasat, Agricultural Sciences, Volume 32, No.3 2005 Résultats

91

Inhibition of Staphylococcus aureus growth by lactic acid

bacteria in milk

bettache GUESSAS*, Miloud HADADJI, Noureddine SAIDI and Mebrouk. KIHAL

Laboratoire de Microbiologie appliqué, Département de biologie, Faculté des Sciences,

Université d’Oran, BP 1524 El mnaouer, Oran 31000 Algeria.

Abstract

Lactic acid bacteria (LAB) from raw goat and ewes' milk, from arid and semi-

arid zones in west Algeria were tested for the production of antimicrobial

substances against Staphylococcus aureus in milk. Twenty samples of raw milk

were collected from which 96 LAB strains were isolated and exhibited

antagonistic effects on solid agar medium. Two strains exhibited inhibition

towards S. aureus from their supernatant culture medium. A Lactococcus lactis

subsp lactis biovar diacelylactis (Lc8) strain proved by far the most efficient,

produced a heat stable bactericid substance with a proteinaceous nature,

suggesting a bacteriocin. Lc8 inhibited S. aureus. in milk, so that no cell was

counted after 48h of incubation. This strain acts either by decreasing the pH

or by bacteriocin production which makes it a good candidate strain in cheese

making and useful in preventing growth of S. aureus.

Key words: Lactic acid bacteria, bacteriocin, Staphylococcus aureus, milk,

bactericidal, Lactococcus lactis .

*Corresponding author

e-mail : [email protected] or [email protected]


93

Gram-negative species (Blackburn et al., 1989; Lewus et al., 1991; Stevens et

al., 1991; Kalchayanand et al., 1992; Arihara et al., 1996). The mode of action

of some bacteriocins has been identified, but for many others only a general

description of the bacteriostatic (Lewus et al., 1992; Thompson et al., 1996) or

bactericidal effects (van Belkum et al., 1991; Venema et al., 1993; Schved et al.,

1993; Samelis et al., 1994; Enan et al., 1996) has been reported.

In the arid zones of Algeria, the mil preservation factories are unavailable,

hence most raw goat’s or ewes’ milk is made into cheese, using goat’s rennet

for coagulation. This type of cheese is subject to spoilage especially by

pathogenic bacteria like Staphylococcus aureus. If milking goat and ewes have

mastitis, then large numbers of infectious micro-organisms may be shed in

their milk (De Vries, 1975) and consequently form a significant part of the flora

of raw milk products such as farmhouse cheeses.

The aim of this work was to isolate bacteriocin-producing LAB capable of

inhibiting Staphylococcus aureus in order to use them as starter for traditional

production of cheese in arid and semi-arid zones.

Materials and methods

Bacterials strains and cultures

Staphylococcus aureus and Lactobacillus curvatus LTH1432 (WP Hammes) was

chosen as indicator strains to demonstrate and measure bacteriocin activity.

All cultures were maintained as frozen stocks held at -20°C MRS broth with

25% (v/v) glycerol (Difco Laboratories, Detroit, M1, USA). Before experimental

use, cultures were propagated twice in broth for 18 to 24 h. The following

strains were grown in the indicated media: lactobacilli, pediocococci, and

enterococci, in MRS (de Man, Rogosa, and Sharp) broth (Difco); and lactococci,

in M17 (Difco); and Staphylococcus aureus in Tryptic Soy Broth (TSB, Difco).

Isolation and identification of antistaphylococcal LAB and activity assays

The search for anti-S. aureus LAB was carried out by using raw milk as source

of this bacteria. A total of 12 samples of raw goats and ewes’ milk were

aseptically collected from different farms in west Algerian arid zones (Table 1)

and stored frozen at -20°C with glycerol (10%) until use. Samples were thawed

and kept at 25 °C for 4h. Ten fold dilutions of milk samples were spread out on

the surface of four MRS agar (0,1 ml of appropriate dilution is used ). Plates

were incubated anaerobically at 30 °C for 2 days and then overlaid with 5 ml of


94

Tryptic Soy Broth with 0.75% agar which was previously inoculated with 0.1

ml of 18 h culture of Staphylococcus aureus in TSB. After overnight incubation,

bacterial colonies found positive for anti–staphylococcal activity were identified

by their inhibition zones, streaked for single colony isolation, and tested

further (from each sample, ten colonies were kept from higher dilution).

Isolates were inoculated in MRS broth to yield an initial concentration of ca.

103 cfu/ml and incubated for 18 h at 37 °C. After centrifugation (2700Xg for 10

min), the pH of the supernatant was adjusted to 6 with 0.1 M NaOH and filter

sterilized ( 0.45-μm pore size). Antistaphylococcal activity of the obtained cell-

free filtrate (culture extract) was tested by the well diffusion assay (deferred

method) described by Tagg and McGiven (1971), with double layer consisting of

MRS agar and Chapman agar seed with Staphylococcus aureus as for the direct

method. To quantitate inhibitory activity, the diameter of the inhibition zone (in

millimetres) was measured.

All isolates were tested for their Gram reaction, catalase activity using H2O2,

shape by observation of overnight cultures using a phase contrast microscope

standard and presumptively classified as lactic acid bacteria. Full identification

was carried as described in Guessas and Kihal (2004).

Determination of bacteriocin activity

Bacteriocin activity was determined by an agar well diffusion assay, as

described by Ryan et al. (1996). Molten agar at 48°C was seeded with the

indicator strain Lactobacillus curvatus (50 μl of an overnight culture per 20 ml

agar), dispensed into sterile Petri dishes, and allowed to solidify. Wells of

approximatively 4-6 mm in diameter were made and bottom selled by one drop

sterile agar. Fifty μl aliquots of two fold serial dilution of bacteriocin

preparation were dispensed into the wells. After incubation overnight at 30 °C,

bacteriocin activity was calculated as the inverse of the latest dilution that gave

a definite zone of clearance. Activity units were expressed per millilitre

(1/dilution x 20).

Sensibility to heat and proteolytic enzymes

The culture extract of the selected strain was treated with several enzymes:

trypsin; α-amylase and catalase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). All

samples were adjusted to pH 7 with 1.0 M NaOH, filter sterilized (0.45 millipore

size), and held for 1 h at 25 °C. The residual activity of the treated and control


95

samples was determined by measuring the diameters of the inhibition zones in

the well diffusion assay. To determine the heat sensitivity, cell-free

supernatants were heated at 80, 100, 110, and 120 °C each for 10, 15 and 30

min; they were then cooled and tested for residual activity by the agar well

diffusion assay.

Growth of S. aureus strain in the presence of a bacteriocin producer

To demonstrate the effect of bacteriocin-producing strain on a growing culture

of Staphylococcus aureus strain. This bacterium was grown together with the

strain Lc8 in reconstituted milk. Selected LAB strains Lc8, and S. aureus were

grown in skimmed milk (100g/l) for 24 h. Reconstituted milk was divided into

10 ml portions, placed into 45 flasks and heat treated at 80°C for 10 min. Each

15 flasks were inoculated with a 3% of a 24-h culture consisting of Lc8 strain,

Staphylococcus aureus, the mixed culture of Staph. and Lc8 respectively. The

flasks were finally incubated at 30 °C. In order to estimate growth in single and

mixed cultures, variation in cell density of Staphylococcus aureus and Lc8 was

determined by plating the samples onto specified agar plates medium

(Chapman and MRS respectively); in mixed cultures, however only

Staphylococcus aureus count was made in single cultures.

Lactic acid production

The lactic acid production by the screened strains of LAB was determined by

measuring the pH expressed as Dornic degree (°D) in heat treated (5 min at

121°C) reconstituted skimmed milk (100 g/L). Three percent of 24-h pre-

cultured milk was added, and the pH was measured after incubation at 30 °C.

Results and discussion

The inactivation of pathogenic and food spoilage micro-organisms is a major

concern with respect to food processing. The food-borne pathogens which are

of particular importance in dairy foods include Staphylococcus aureus and

Listeria monocytogenes. S. aureus is one of the most problematic

microorganisms present in raw milk. If milking goat and cows have mastitis,

then large numbers of infectious microorganisms may be shed in milk (De

Vries, 1975) and consequently form a significant part of the flora of raw milk

products such as farmhouse cheeses.


96

A total of 96 bacterial isolates with antagonistic effects on S. aureus were

isolated from 12 raw goat and ewes milk samples. In most cases the

antagonistic effect was due to a decrease in the pH resulting from the

production of organic acids. The culture extracts from two strains were shown

to be active against Staphylococcus aureus by the action of antibacterial

substances other than organic acids. These bacterial isolates were Lactococcus

lactis subsp lactis (Lc7) and Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacelylactis

(Lc8) (Figure 1,2). The latter one proved to be by far the most efficient, with a

culture extract activity of 14,025 AU/ml (arbitrary units).

Similar results were obtained by Geis et al., (1983), who tested 93 strains

Lactococcus lactis subsp. Cremoris and found that 36 strains exhibited

antagonistic effects on agar, but only one of them produced an antibacterial

substance in the liquid medium. Also Schillinger and Lucke (1989) found only

one strain exhibiting antibacterial action in liquid medium from 221 isolates.

Noonpakdee et al., (2003), isolated 14020 lactic acid bacteria isolates in which

only one strain exhibited inhibition toward Staphylococcus aureus. The Lc8

strain showed a high capability to inhibit S. aureus growth. Vaughan et al.,

(1994), demonstrate the ability of LAB isolated from raw milk to inhibit S.

aureus.

The antibacterial substances contained in the culture extract of Lc8 strain were

inactivated in the presence of catalase, which exclude an inhibition by

hydrogen peroxide. They were however inactivated by the proteolytic enzyme

trypsin, and no change in their activity was observed when they were treated

with α-amylase. In fact although the initial culture extract produced an

inhibition zone with a diameter of 10 mm in Staphylococcus aureus culture.

Later, no inhibition zone was detected after treatment with these enzymes

(Figure 3). The antibacterial substance is, therefore, a substance of a

proteinaceous nature. Since no change was observed upon treatement with α-

amylase, it can be inferred that no carbohydrate moiety is essential for the

bacteriocin activity (Jack and Jung, 2000). To evaluate the heat stability of

these antistaphylococcus substances, cell-free supernatants were incubated at

80, 100, 110, and 120 °C for various periods of time. There was no remarkable

reduction in the antibacterial activity after heating at 80°C for 30 min.


97

The addition of the concentrated neutralized culture supernatant of Lc8 to a

culture of S. aureus in TSB broth resulted in a rapid inactivation of the

sensitive cells. The number of viable cells per millilitre declined from 1.5x106 to

1.2x104 after 8 hours of incubation (Figure 4) and below 500 cells per ml after

24 hours, and cells did not regrow within 48 h. In contrast, the culture of S.

aureus was unaffected by the addition of a concentrated supernatant of the

bacteriocin-negative strain. These results indicate a bactericidal mode of action

of the antibacterial compound. The bactericidal mode of action and the

proteinaceous nature of this substance are typical characteristics of bacteriocin

(Tagg et al., 1976). Similar results were reported by Galvin et al., (1999) who

found that Lactococcus lactis subsp. lactis DPC3147 is active against S. aureus

and reduced considerably cell numbers after 2 h in time-kill curve conducted

in broth medium.

The acidity produced by Lc8 strain in skimmed milk evaluated by the amount

of lactic acid released and expressed as Dornic degree show a production of 17

°D lactic acid after 6 h and 35 °D after 8 h of culture. The production increased

to reach 40 °D after 24 h of culture. The final pH is about 4.64 at 8 h and

about 4.36 after 24 h of incubation.

The inhibition of a growing culture of S. aureus by adding a bacteriocin-

producing strain Lc8 in milk was examined and compared with the growth of

Staphylococcus aureus in milk (figure 5). A decrease in S. aureus count after 8h

was noted; on the other hand, in single culture, the growth of S. aureus

increased after the same period of time. After 24 h the decrease in S. aureus

growth was considerable and continued until only two bacteria were counted

after 48 h.

We note the double action of Lc8 either by acidifying action and/or a

bacteriocin production. The acidity is the first step in cheese making to reach

suitable pH to form a curd. Acidity and bacteriocin production together play an

important role in cheese making as described by Ryan et al., (1996). The

inhibition of S. aureus by Lc8 strain is due to bacteriocin production however

the acidity plays a combined role in this inhibition. Similar results were

reported by Noonpakdee et al., (2003) who isolated about 14020 strains from

fermented sausage and found that only one strain was capable of reducing pH

in a manner similar to our finding.


98

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100

thiolo-activated bacteriocin from Lactococcus lactis. Applied EnvironmentMicrobiology, 59,1041-1048.

Table 1: Type and source of raw milk sample used in this study

Region Tiaret Saida Bechar El bayed

Type Goat Ewe Goat Goat Goat

Number 3 2 3 2 2

Fig 1: Inhibition of Staphylococcus aureus by lactic acid bacteria by agar well

diffusion assay. Symbols: (a) Lc8; (b) Lc7

Fig 2 : Inhibition of Staphylococcus aureus by lactic acid bacteria by an agar

spot test. Symbols (a), Lc7; (b), Lc8.

a

b

a

a

b


101

Fig 3: Inhibition of Staphylococcus aureus by Lc8 culture supernatant by the

agar well diffusion assay. Wells contained cell-free supernatant which were

treated by adding lipase (well 1); adding catalase (5 mg/ml)(well 2), or trypsin

(0,5 mg/ml)(well 3).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 4 8 24 30 48 52

hours

Lo

gu

fc/m

l

Fig. 4: Bactericidal effect of the bacteriocin produced by Lactococcus lactissubsp lactis biovar diacelylactis Lc8 on Staphylococcus aureus. Symbols : ,without adition of the cell-free concentrated supernatant; ■, cell-freeconcentrated supernatant from Lc8 added.

2

1

3


102

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 4 8 24 30 48hours

Lo

gu

fc/m

l

Fig 5: Growth of Staphylococcus aureus in presence of Lactococcus lactis subsplactis biovar diacelylactis in Milk at 37 °C. Symbols:, Lc8; ■, Staphylococcusaureus; ●, Staphylococcus aureus in a mixed culture with Lc8.

Article soumis à Journal of Applied microbiology Résultats

103

Proteolytic activity detection in cultivable lacticacid bacteria isolated from Algerian raw goat’s

milk

M. Moulay.1, H. Aggad1, Z. Benmechernene2, B. Guessas 2, D.E. Henni2 andM. Kihal2*

1Faculty of Sciences Agro-Vétérinairy, Tiaret University , BP 78 , Tiaret. Algeria2Laboratory of Applied Microbiology, University of Oran. Department of Biologie, Faculté of

Sciences, Oran University BP 16. Es-senia, 31100, Oran, Algeria.

Summary

The proteolytic systems play an essential role in nitrogen metabolism of lacticacid bacteria in milk. The extracellular cell wall-bound proteinase is a keyenzyme in this system, in which its activity is necessary for the growth of lacticacid bacteria in milk by initiating the breakdown of casein to smaller peptides.The screening of the proteolytic strains has been achieved on three solid mediaYMA, PCA and FSDA. The strain of Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcuslactis subsp. lactis, biovar. diacetylactis and the Enterococcus were tested.Lactococcus lactis produced a large hydrolysis zone more than 10 mm ofdiameter. The concentration of 3 and 5% of inoculum produced the highestacidity which was superior to 60°D. The proteolytic strains of Lactococcus lactissubsp. lactis biovar. diacetylactis at 3% of inoculum showed a maximalacidification rate 5°D/h and 0.3 unit pH/h. The strongest proteolytic strainLactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis produced an acidificationrate of 8 °D/h and a pH rate which decreases to 0.28 unit of pH/h with a finalpH value of 4.29. The rate of casein hydrolysis by the original Lactococcus lactissubsp. lactis biovar. diacetylactis (90 mg/h) was three times higher. Theproteolytic activity of this strain can be exploited for the selection ofperformante lactic acid bacteria for the Algerian dairy industry.

Keys words : lactic acid bacteria, proteolysis, caseins, goat's milk.

Corresponding author. : KIHAL Mebrouk, ([email protected])


104

INTRODUCTION

The primary role of lactic acid bacteria is the production of lactic acid from

carbohydrates, resulting in a pH decrease and proteolysis as to liberate short

peptides and free amino acids. These compounds affect flavour and texture of

products (Meijer and Hugenholtz 1997). The proteolytic system of lactic acid

bacteria consists of a cell envelope associated proteinase, specific peptide and

amino acid transport systems, and several cytoplasmic peptidases. An

important metabolic function that influence the fast growth of lactococci in

milk is their proteolytic system, which is required to obtain the amino acids

needed for growth to high cell density (Palaez and Requena 2005). Mills and

Thomas (1981) reported that the concentration of amino acids especially

isoleucine and leucine is very low in milk. However, the lactococcal proteinase

remains the only proteolytic enzyme whose extracellular localization is

ascertain. The type of proteinase was shown to play a crucial role in the

interaction between proteolytic and nonproteolytic lactococci associatively

cultured in milk (Juillard et al. 1995; Flambard et al. 1998; and Garault et al.

2001). A proteinase, located at the outer surface of the cell catalyses partial

hydrolysis of one or more of the casein components of bovine milk to a number

of oligopeptide products (El Soda 1993).

The selection of new strains of lactic acid bacteria for technological interest and

the exploitation of their potentialities is a subject to their growth capacity in

milk. The objective of this study is to select some strains of Lactococcus sp

which have a high proteolytic activity and susceptible to be integrated as a

starter in fermented milk. The microbiological methods used here permitted to

classify the Lactococcus sp strains by their proteolytic activity levels.

MATERIAL AND METHODS

Bacterial strains and growth conditions.

Lactic acid bacteria strains were isolated from Algerian raw goat's milk and

they belong to the culture collection of Applied Microbiology Laboratory,

Department of Biology, Sciences Faculty, Oran University Algeria, were used in

this study. 32 strains of lactic acid bacteria isolates are listed in table I. All

strains were stored at -80°C in a reconstituted skimmed milk containing 30%

(wt/vol) glycerol. For cultivation, aliquots were reactivated in M17 broth at


105

30°C for 24h (Mathot et al. 1994). Cultures were stored at 4°C and maintained

in M17 medium every month.

Strains selection:

After activation of the cultures in M17 broth, the purification was achieved in

M17 agar medium and incubated at 30°C for 24 h. For the tests of proteolytic

activity, strains were grown on three types of media containing 1% of sterile

skimmed milk: The solid media plates count agar (PCA), yeast milk agar (YMA)

and FSDA agar were used (Huggins and Sandine 1984; Badis et al. 2004). The

plates were evaluated by measuring the diameter of the hydrolysis and clear

zones formed around the colonies which served into classifying the strains

according to their proteolytic activity. In all cases, the average value from three

replicates and standard deviation were calculated.

Proteolytic strains identification :

Strains were identified as to possess the proteolytic activity and they were

subsequently characterized according to the criteria described by Badis et al.

(2004). Strains were subcultured in M17 broth, incubated at 30°C until visible

growth occurred. Strains were checked for their purity by streaking colonies on

M17 agar. Plates with pure culture were used to rapidly test for cell

morphology by microscopy, Gram and catalase reaction. Gram-positive and

catalase negative strains were further identified by a limited number of

biochemical and physiological tests : gaz production, arginine hydrolysis on

M16 BCP agar (Thomas 1973), which differentiates between the strains of the

Leuconostoc genus and the heterofermented Lactobacillus genus. Citric acid

degradation on solid medium of Kempler and Mac Kay (1980) separated the

subspecies of Lactococcus. The MSE agar medium (Mayeux et al. 1962)

differentiates the subspecies of Leuconostoc and the Sherman test used in

order to differentiate the Streptococcus and the Lactococcus species. Other tests

were applied such as, the growth in salt, pH 9.6 broth and thermoresistance as

to separate the Enterococcus sp. (Mathara et al. 2004; Badis et al. 2004).

The fermentative profil of several carbohydrates (glucose, lactose, xylose,

fructose and sucrose) was carried out (Durlu-Ozkaya et al. 2001; Mannu et al.

2002; Guessas and Kihal 2004).


106

Optimization of proteolysis detection on solid media:

Lactic acid bacteria which were cultured by multipoint system on the surface of

three different media PCA, YMA and FSDA containing various concentrations of

skimmed milk (1%, 2% and 4% w/v) which serve in evaluating the proteolytic

activities of the strains. Hydrolysis proteolytic zones of the strain were

compared and statistical analysis was carried out. The calculation of the

difference between two observed average measurement were compared to the

standard variance, using the T Student test (Huggins and Sandine 1984).

Strains which showed positive proteinase phenotypes on assays were grown on

11% sterilized skimmed milk medium which was sterilized by autoclaving at

110°C for 10 min. Acidifying activity of strains was measured according to

the International Dairy Federation (IDF) standard 306 (1997), Kihal et al.

(1996) and Alonso-Calleja et al. (2002). The dornic acidity as well as the pH

were measured every two hours.

Sterilized milk was inoculated at 0.2% with each pre-cultured strain in

MRS broth at 30°C for 24 h, in order to obtain approximately 106 cfu ml-1,

and then were incubated at 30°C for 24 h. The proteolytic activity of the

strains was determinate by the tyrosine method, according to the

International Dairy Federation (IDF) standard 149A (1997).

After incubation until coagulation of milk at 30°C, the culture was inoculated

in 200 ml of sterilized skimmed milk and homogenized. The mixture was

distributed in tubes and the kinetics of growth and acidification were measured

every 2 hours. Determination of the specific growth rate µ and the calculation

of some arithmetic parameters permitted to get values of the differences

existing in the results (Kihal et al. 1996).

Determination of caseolytic activity

Kinetic of growth in presence of casein : The proteolysis of casein was

determinate in M17 broth medium containing 1 g l-1 of casein as a substrate :

10 ml of 18 h freshed culture M17 broth was centrifugation (4000 rpm during

10 min at 4 °C). The Cell pellets were collected and washed twice in tryptone

salt. They served to inoculate 100 ml of M17 casein broth. The growth of all

strains was measured every hour by optical density at 600 nm by

spectrophotometer. Casein residue was measured according to Bradford

method (Meijer and Hugenholtz 1997).


107

RESULTS AND DISCUSSION

Strains characterization.

All strains were gram positive and had a cocci form in pair or chains. A 28 of

32 purified strains are proteolytic giving clear visible zone on PCA and YMA

+2% skimmed milk medium respectively. Morphological, physiological and

biochemical characteristics (Kempler and Mc Kay 1980; Stiles and Holzapfel

1997; Badis et al. 2004) allowed the identification of: 17 strains which belongs

to Lactococcus lactis species, 11 strains belonging to the genus Enterococcus

and 4 species belonging to Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis

(table 1).

Table 1 : Identification of lactic acid bacteria strains.

Strain code Identification

La12, La15, La16, La32, La34, La36,

La38, Ma4, Ma6, Ma18, Ma19, Ma21,

Ma26, Ma37, Max, SLO3+, LcX1

Lactococcus lactis subsp. lactis

La4, La20, La21, La23, La24, La30,

La35, Ma20, Ma24, Ma25, SD17

Enterococcus sp.

La11, Ma1, Ma2, Ma27 Lactococcus lactis subsp. lactis biovar.

diacetylactis

Proteolytic activity:

Four strains La11, Ma1, Ma2, and Ma27 have presented a proteolytic activity

which raised on the three tested concentrations of milk and also on the two

solid media culture PCA (Fig. 1) and YMA. On PCA medium, milk

concentrations resulted in the appearance of a hydrolysis zone whilst a

significant difference was observed between the presence of the concentrations

(1% and 4%) of skimmed milk however, it was highly significant in the presence

of 1% and 2% of skimmed milk. On YMA medium, the difference was highly

significant between 1% and the other two concentrations of skimmed milk

therefore 1% of skimmed milk is a suitable concentration for detecting

proteolytic activity in lactic bacteria strains. On FSDA medium, in addition to

the proteolytic activity, the use of lactose and the production of acid lactic were

also ascertained by the turn of bromocresol purple colour indicator to Yellow as

shown in (Fig. 1).


108

Most of these strains yielded most visible zones with diameters varying between

0.15mm to 11.5mm which were established in the presence of 1% of skimmed

milk. All strains have presented a hydrolysis zone of 11mm diameter and which

was identical to La11, Ma1 and Ma2 Ma27 strains (11 mm).

Fig. 1 Optimization of the detection of proteolysis on PCA medium (1%, 2 %

and 4 % of skimmed milk) (A, B and C) on FSDA medium (D) and YMA medium

(E)

Statistical evaluation of strains activity:

Screening for hydrolysis zones produced by several proteolytic strains were

achieved on three different media and as a result a hydrolysis zones of 5mm to

10mm of diameter were produced by 73% of strains on FSDA medium, 70% on

PCA medium and 59% on YMA medium. However, strains producing hydrolysis

zones which their diameters higher than 10mm was represented by 15.38% on

FSDA, only 3.7% on PCA medium and 7.4% on YMA medium. Therefore, from

these observations we can postulate that FSDA is the most favourable medium

for detecting proteolytic lactic acid bacteria.

Moreover, proteolysis zone of diameter higher than 1cm was represented in

7.5% of the strains on YMA medium and it reached 15.38% on FSDA medium

A

D

CB

E


109

and this led to differentiate between the strongly and slightly proteolytic strains

(Huggins and Sandine 1984, Wehrle et al. 1999).

pH Kinetic on skimmed milk :

The inoculum concentration of 3% to 5% of strain (Ma2) which was incubated

for 24hours in skimmed milk produced the highest acidity which was superior

to 60°D however, the latter decreased to 35°D with an inoculum

concentrations that varied between 0.1% and 0.5%. Moreover, the same

phenomenon was observed with concentrations of 3% and 5% of inoculum

incubated in skimmed milk for only 6 hours whilst the pH decreased rapidly

(inferior than 5). Therefore, the production of lactic acid is related to the

concentration of the initial inoculum.

A maximal speed of 5°D per hour is obtained while using a concentration of 2%

of inoculum, this speed rate is steady even if the concentration of the inoculum

gets higher however the former gets lower than 5°D/h if the concentration

deceases to less than 2%. The fall of velocity of the pH was about 0.35Unit per

hour for Ma2 strain.

In order to follow the kinetics of growth on milk medium and M17 synthetic

medium Dudley and Steele (2001) used an inoculum of 1% and in order to

study the kinetic of caseins degradation (Herreros et al. 2003), which is going

to be in relation with the strain used. Demarigny et al. (1994) obtained a

maximum pH rate which varied between 0.34 and 0.51Unit of pH/h using the

same concentration of inoculum 1%. Kinetic of acidity for 12 strains varied

between 0.75 and 3.5°D per hour, and pH decreases from 0.03 to 0.14Unit of

pH per hour, final dornic acidity and pH were of 35°D and 4.63 in strains LcX1

respectively.

Strain Ma2 produced a velocity of acidity of 8°D/h and a varied velocity of pH

of 0.28 Unit of pH/h, the maximum rate of the produced acidity is 51°D with a

final pH of 4.29. Juillard et al. (1995) obtained a final pH of 4.5 after 9 hours of

growth for Lactococcus lactis which is identical to Ma2 (diacetylactis). strain

used in this work. Lactococcus lactis subsp. cremoris studied by Ruas-Madiedo

et al. (2005) achieved a final pH of 4.4 on milk medium. Ma2 strain had

showed both good kinetic acidity and growth on milk medium.

La38 is a weak proteolytic strain which is characterised by a weak pH variation

in relation with a weak dornic acidity evolution. Maximal velocities for pH and


110

acidity are of 0.0475Unit of pH per hour and 3.75°D/h, and a final value of pH

24°D was achieved after 24hours of incubation.

Growth Kinetic in mixed culture

Lactococcus lactis (Ma2) and Leuconostoc mesenteroides (19D) strains have

produced on a pure culture (5% of inoculum) a final acidity of 56 and 46°D

respectively. On the mixed culture, the dornic acidity remained stable and

identical to the one produced by Lactococcus lactis (56°D) (Fig. 2). pH variations

followed the same speed of dornic acidity in pure and mixed culture on milk

medium. Ma2 and 19D strains produced maximum velocity of 0.32, 0.33 and

0.32 in pure and mixed cultures respectively. Moreover, maximum velocities

obtained for the variation of dornic acidity is of 7°D/h for Ma2 strain and 5°D

for 19D strains in mixed culture.

Curve obtained for the weak proteolytic strains were characterized by a weak

velocity of milk acidity; however, the inverse was obtained with the proteolytic

strains. In the mixed culture, samples that have been studied did not show any

relation neither with synergy or antagonism.


111

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

0 4 8 12 16 20 24

Time (h)

pH

19D Ma2 19D+Ma2

0

10

20

30

40

50

60

0 4 8 12 16 20 24

Time (h)

°D

19D Ma2 19D+Ma2

Fig. 2 Kinetics of pH and dornic acidity evolution in pure and mixed culture on

skimmed milk

In milk medium, the kinetics showed that the pure cultures of Leuconostoc

mesenteroides (19D) and Lactococcus lactis (Ma2) have a growth rate of 0.49 h-1

and 0.12 h-1 respectively; however, it is slightly higher (0.53h-1) in the mixed

culture (Fig 3). In MRS or M17 medium, this rate is practically identical in

Leuconostoc mesenteroides species due to the richness of the medium with

nutritive elements (Courtin et al. 2002).


112

6

7

8

9

10

11

0 4 8 12 16 20 24

Time (h)

Gro

wth

Lo

gcfu

/ml

Ma2 19D 19D+Ma2

Fig. 3: Kinetics of growth of the 19D and Ma2 strains in pure culture and

mixed culture

The same rate (0.24 h-1 to 0.4 h-1) was obtained with Bifidobacterium species

which are originally from human, cultivated in skimmed milk medium (Hadadji

et al. 2005), and also with Lacctococcus sp. (0,32 h-1to 0,48 h-1) (Chambellon

and Yvon 2003).

We have noted a different behaviour within the chosen species, while

exponential phase for both, pure culture of Leuconostoc mesenteroides and the

mixed culture (19D and Ma2), is accelerated between 2 and 6 hours of

incubation and this is due to the effect of citrate on the stimulation of

Leuconostoc mesenteroides species (Kihal et al. 1996). Lactococcus lactis

subsp. lactis biovar. diacetylactis culture had presented a regular growth whilst

the exponential phase is not accelerated.

Kinetic growth on M17 casein medium

Hence La38 strain hardly bear casein (rate of 0.564 h-1 ) the Ma2 strain had

developed rapidly (rate of 1.162 h-1). Lactococcus strain’s behaviour towards

casein (Juillard et al. 1998; Parra et al. 1999) can be referred to the cell wall

bound protease which is responsible for casein degradation into amino acids

and peptides (Flambard et al. 1998). In addition, the rapid development for

Ma2 strain in the presence of caseins is due to its enzymatic equipment.


113

Dosage of residual casein

The Velocity average of the consumption of casein (90mg/h) by Lactococcus

lactis subsp. lactis biovar diacetylactis (Ma2) is three times higher than the one

consumed by Lactococcus lactis subsp. lactis (La38) (23.3 mg/h). Final

concentrations of casein residues are 0.1g/l and 0.54g/l in Ma2 and La38

strains respectively, which is identical to other studies (Huggins et Sandine

1984).

0

0.5

1

1.5

2

0 1 2 3 4

Time (h)

Do

60

0n

m

La38 Ma2

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 1 2 3 4

Time (h)

Casein

g/l

La38 Ma2

Fig. 4: Growth of La38 and Ma2 strains on M17 casein broth medium

incubated at 30°C

CONCLUSION

The effect of culture media on hydrolysis zones of casein by Lactococcus chosen

species is weak; however skimmed milk concentrations had a remarkable

influence.


114

The majority of strains (more than 60%) produced hydrolysis zones of 5mm to

10mm of diameter. The proportion of Lactococcus lactis species which posses

hydrolysis zones superior than 10mm was inferior than 10%. Among strongly

proteolytic strain, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis strain

gave a velocity of acidity of 8°D/h and a varied pH velocity of 0.28Unit of pH/h

and the final pH was 4.29.

Leuconostoc mesenteroides and Lactococcus lactis had growth rate of 0.49 h-1

and 0.12 h-1 in pure culture of milk media, however, their growth was a bit

higher (0.53 h-1) in mixed culture.

The growth of Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis and the

slightly proteolytic strain Lactococcus lactis subsp. lactis on M17 casein

medium, have showed that the first strain developed rapidly with a rate of

1.162 h-1; however, it was weak in the case of the second strain (0.564 h-1)

(Demarigny et al., 1994).

The results obtained suggest that lactic acid bacteria found in goat’s raw milk

can be used in dairy industry by their proteolytic and acidifying activities. Our

results have also shown that a rich source of strain variability exists in the

proteoltytic activities. Goats’ milk may, therefore, constitute a source of strains

with physiological properties of biotechnological interest.

Further studies should be directed on the identification and characterization of

the peptides that are accumulated in the milk after the various strains

application which play an important role in the proteolytic enzymes activities.

The choose of used strain could be an instrumental knowledge in the

improvement of the organoleptic quality of fermented dairy products.

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Discussion générale

118

4. Discussion générale

Notre présente étude sur la microflore lactique du lait cru de chèvre a

permis d’isoler, de caractériser, et d’identifier 206 souches de bactéries

lactiques réparties essentiellement entre de lactocoques (Lc. lactis subsp.

lactis (35 souches), Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, (39 souches),

Lc. lactis subsp. cremoris (14 souches), de streptocoques (Sc. Thermophilus 17

souches), de leuconostocs (Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides 8 souches,

Ln. mesenteroides subsp. cremoris 2 souches), et de lactobacilles (Lb. plantarum

9 souches, Lb. casei 7 souches, Lb. curvatus 23 souches, Lb. rhamnosus 10

souches, Lb. paracasei 4 souches, Lb. acidophilus 2 souches, Lb. helviticus 10

souches, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, 5 souches, Lb. delbrueckii ssp. lactis 3

souches, Lb. brevis 5 souches, Lb. reuteri 9 souches et Lb. fermentum 4

souches).

Les espèces de bactéries lactiques détectées dépendent essentiellement de la

nature du produit et des conditions de culture. L’analyse de 35 produits laitiers

traditionnels dont des fromages est effectuée et 4379 isolats ont été

caractérisés. La flore dominante est représentée par les lactocoques à 38%. Les

lactobacilles thermophiles ne représente que 9% (Cogan et al., 1997). Une

étude récente sur la flore lactique du fromage artisanal en Egypte menée par

Ayad et al., (2006), montre une flore equilibrée représenté par les lactocoques

(Lactococcus lactis subsp. lactis et cremoris) et les lactobacilles. A partir du

cheddar, la caractérisation phénotypique et génotypique de la microflore

lactique a permis de recenser les espèces dominantes de Lb. paracasei, de Lb.

plantarum, de Lb. curvatus, et de Lb. brevis (Fitzsimmons et al., 1999); alors

que pour Bissonnette et al., (Bissonnette et al., 2000), l'espèce dominante du

même fromage était Lc. lactis subsp. cremoris. Les espèces de bactéries


119

lactiques dominantes des levains artisanaux appartiennent à Lb. plantarum,

Lb. curvatus, et Lb. brevis (Lopez et Mayo, 1997). Dans l’étude de Medina et al.,

(2001), les enterocoques était la flore dominante avec 48 % et les lactobacilles

avec 30%. En revanche les lactocoque représentent que 14% et moindre les

leuconostocs avec 9%. La caractérisation des bactéries lactiques d’un fromage

mexicain révèle que les lactocoques étaient la flore dominante avec

Enterococcus faecium et Lactobacillus casei (Torres-Llanes et al., 2006).

Dans les produits carnés, Hugas et al., (1993) ont trouvé que

Lactobacillus plantarum représente 8 % des lactobacilles isolées et l'espèce

dominante était Lactobacillus sake avec 55 %; en revanche, Rovira et al., [1997]

trouvèrent Lactobacillus plantarum l'espèce dominante de la flore lactique

isolée. Samelis et al., (1994) ont montré une grande diversité de cette flore

lactique lors de l’analyse de 348 souches isolées à partir des produits de

charcuterie en particulier du salami fermenté, qui sera réparti en deux grands

groupes, des lactobacilles et des leuconostoques ( ou Weissella). Les espèces

de bactéries lactiques présentes dans le poisson, ce sont Lc. lactis subsp. lactis

et Ln. citreum, pour le riz bouilli c’est l’espèces de Lb. paracasei qui domine

[Bouton et al.,1998 ; Paludan-Muller et al., 1999].

Dans les produits végétaux tels que le sorgho, les espèces de bactéries

lactiques dominantes appartiennent aux lactobacilles (Lactobacillus plantarum

34.7 %, Lactobacillus sake-Lactobacillus curvatus 15 %), aux leuconostocs

(Leuconostoc mesenteroides 28.2 %) et aux pédiocoques (Pediococcus

pentosaceus 10.2 % et Pediococcus acidilactici 7.8 %); par contre les

lactocoques ne représentent que 4 % [Kunene et al., 2000]. Les bactéries

lactiques isolées des pousses de luzerne ont été aussi investies dans le but de

limiter les dégâts produits par des bactéries pathogènes. Les bactéries


120

représentatives sont Lactococcus lactis subsp. lactis et Pediococcus acidilactici

(Wilderdyke et al., 2004).

Quatre souches La11, Ma1, Ma2, et Ma27 ont présenté une activité

protéolytique qui a augmenté sur les trois concentrations en lait écrémé

examinées et également sur le milieu PCA et YMA. Les concentrations de lait

écrémé utilisées en milieu PCA donne des zones d’hydrolyse tandis qu'on

observait une différence significative entre la présence des concentrations 1%

et 4% en lait écrémé. Cependant, la protéolyse était fortement significative en

présence de 1% et de 2% de lait écrémé. Sur le milieu YMA, la différence était

fortement significative entre 1% et les deux autres concentrations de lait

écrémé, ceci qui montre que la concentration de 1% de lait écrémé est une

concentration optimale pour la détection de l'activité protéolytique des souches

de bactéries lactiques. En plus, le milieu FSDA, permet de détecter à la fois

l’activité protéolytique et l'utilisation du lactose par la production de l’acide

lactique. La plupart des souches testées ont montré des zones d’hydrolyse

visible avec des diamètres variant entre 1,5 mm et 11.5 mm en présence de

1% de lait écrémé. Cependant, les souches produisant des zones d'hydrolyse

supérieures ou égale à 10 mm sont réparties comme suit : 15.38% sur FSDA,

3.7% sur milieu PCA et 7.4% sur milieu YMA. Par conséquent, de ces

observations nous pouvons postuler que le milieu FSDA est le plus favorable

pour détecter les bactéries protéolytiques. D'ailleurs, le diamètre de la zone de

protéolyse supérieure à 10 mm a été observé dans 7.5% des souches sur le

milieu YMA et elle a atteint 15.38% sur le milieu FSDA et ceci a mené à

différencier entre des souches lactiques fortement et légèrement protéolytiques

(Huggins et Sandine 1984, Wehrle et al., 1999).

L'acidité produite par la souche Lc8 en milieu lait est évaluée par la

quantité d'acide lactique libérée et exprimée en degré Dornic. Une production

d'acide lactique de 17 °D après 6 h et 35 °D après 8 h de culture. La

production a augmenté pour atteindre le 40 °D après 24 h de culture. Le pH

final est environ 4.64 à 8 h et d’environ 4.36 après 24 h d'incubation.

L'inhibition des micro-organismes pathogènes et la flore de

contamination des aliments sont un souci important en ce qui concerne la

transformation des produits alimentaires. Les micro-organismes pathogènes

d'importance particulière en produits laitiers, incluent Listeria monocytogenes,


121

Staphylococcus aureus. Cette dernière est l'un des micro-organismes les plus

problématiques présents dans le lait cru. Si l’animal présente une mammite,

un grand nombre de micro-organismes indésirables contamine le lait (De Vries,

1975) et par conséquent constituent une partie importante de la flore du lait

cru et de ses produits tels que des fromages de ferme. Un total de 96 isolats

bactériens avec des effets antagoniques sur Staphylococcus aureus a été

detecté. Dans la plupart des cas l'effet antagonique était dû à une diminution

du pH, résultante de la production d’acides organiques. Les extraits de culture

de deux souches se sont avérés actifs contre Staphylococcus aureus par l'action

de substances antibactériennes autres que les acides organiques. Ces souches

bactériennes appartenaient à Lactococcus lactis subsp. lactis (Lc7) et

Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis (Lc8). La souche Lc8 s'est

avéré de loin la plus efficace, avec une activité d'extrait de culture de 14.025

AU/ml (unités arbitraires). Des résultats semblables ont été obtenus par Geis

et al., (1983), qui ont examiné 93 souches de Lactococcus lactis subsp. cremoris

et ont constaté que 36 souches ont montré des effets antagoniques sur milieu

solide, mais seulement une seule espèce produit une substance

antibactérienne dans le milieu liquide. En outre Schillinger et Lucke (1989) ont

trouvé seulement une souche exprimant une action antibactérienne dans le

milieu liquide sur 221 isolats étudiés. Noonpakdee et al., (2003), ont isolés

14020 isolats de bactéries lactiques dans lesquels seulement une souche était

capable d'inhiber Staphylococcus aureus. La souche Lc8 a montré des

possibilités élevées, empêchant ainsi la croissance de Staphylococcus aureus.

Vaughan et al., (1994), démontrent les capacités des bactéries lactiques isolées

du lait cru à inhiber la croissance de Staphylococcus aureus. La substance

anti-staphylococcus contenue dans l'extrait de culture de la souche Lc8 n’a pas

été inactivée en présence de la catalase, qui exclue une inhibition par le

peroxyde d'hydrogène. En revanche, elle a été inactivée par la trypsine. En fait

bien que l'extrait initial de culture ait produit une zone d'inhibition de 10 mm

de diamètre dans la culture de Staphylococcus aureus. Après traitement,

aucune zone d'inhibition n'a été détectée. Par contre aucun changement de

l’activité antimicrobienne n'a été observé quand il a été traité avec de l'α-

amylase. La substance antibactérienne est, donc, une substance de nature

protéique. Du fait, qu’aucun changement n’a été décelé après traitement avec


122

de l'α-amylase, il peut impliquer qu'aucune partie d'hydrate de carbone n'est

essentielle pour l'activité de cette substance (Jack et Jung, 2000). Pour évaluer

la stabilité à la chaleur de cette substance anti-staphylococcus, Le surnageant

de la culture a été traité par différentes température 80°C, 100°C, 110°C, et

120°C. Il n'y avait aucune réduction remarquable de l'activité antibactérienne

après chauffage à 80°C pendant 30 minutes.

La croissance de Staphylococcus aureus en culture mixte avec la souche

a été évaluée sur milieu lait. Après 4 h d’incubation la croissance de

Staphylococcus aureus commence à diminuer est était de 0,2 Log cfu. Cette

décroissance continue est atteinte 0,8 Log cfu après 24 h d’incubation. A 48 h

de temps d’incubation le nombre de cfu de Staphylococcus aureus était

inférieur à 10 cellules.

L'addition du surnageant de culture concentré de la souche Lc8 et traiter

avec 1mg/ml d’α-chymotrypsin pendant 1h à 37 °C à une culture de

Staphylococcus aureus en milieu TSB a eu comme conséquence une

inactivation rapide des cellule de Staphylococcus aureus; Le nombre de cellules

viables par millilitre diminuées de 6,7 Log cfu après 8 heures d'incubation et

en-dessous de 500 cellules par ml après 24 heures. En revanche, aucune

croissance n’a été décelée après 48 h d’incubation. Par contre, la culture de

Staphylococcus aureus en culture pure est restée inchanger. Ces résultats

indiquent un mode bactéricide de l'action du composé antibactérien. Le mode

bactéricide de l'action et la nature protéique de cette substance sont des

caractéristiques typiques de bactériocine (Tagg et al., 1976). Des résultats

semblables ont été rapportés par Galvin et al., (1999) qui ont constaté que

Lactococcus lactis subsp. lactis DPC3147 était active contre Staphylococcus

aureus., le nombre de cellule est considérablement réduit après 2 h

d’incubation. Otero et Nader-Macías (2006) ont constaté l’inhibition de

Staphylococcus aureus par l’H202 produit par Lactobacillus gasseri ; ceci mis en

évidence l’effet combiné dû H202 et de la bactériocine produite par cete souche.

Nous notons la double action de Lc8 par la production d’acide et/ou une

production de substance antimicrobienne (bacteriocin-like). L'acidité est la

première étape dans la production de fromage pour atteindre le pH approprié

pour former un lait caillé. L'acidité et la production de bactériocine jouent


123

ensemble un rôle important en production fromagère comme décrit par Ryan et

al., (1996). L'inhibition de Staphylococcus aureus par la souche Lc8 est dû à la

production de substances antibactérienne cependant l’acidité produite joue un

rôle combiné dans cette inhibition. Des résultats semblables ont été rapportés

par Noonpakdee et al., (2003) qui ont isolé un nombre considérable de

bactéries lactiques à partir des produits de charcuterie et ont constaté que

seulement une souche était capable de ramener le pH en quelque sorte

semblable à notre conclusion.

Conclusion générale

124

5. Conclusion générale

Les bactéries lactiques isolées du lait cru de chèvre possèdent des

potentialités très intéressantes et très variées, non seulement par leur capacité

à se développer dans le lait avec une croissance lente et d’autre avec une

croissance rapide qui est due surtout à la présence des enzymes protéolytiques

capables de fournir les acides aminés essentiels à leur croissance. Les souches

aromatiques sont bien représentées. La détection de l’activité protéolytique sur

milieu solide, a été optimisée par l’usage de 2 % de lait écrémé. La technique

permet de déceler non seulement les souches fortement protéolytiques mais

aussi les souches faiblement protéolytiques ainsi que les activités

intermédiaires.

La confrontation de 256 souches de bactéries lactiques sur milieu solide

révèle la présence de souches productrices de substances antimicrobiennes (%

des souches). La nature et la composition de l’agent inhibiteur a été

déterminée, ce qui nous a encouragé à déterminer le spectre d’activité sur les

germes impliquées dans les intoxications alimentaires. La cinétique de

croissance de Staphylococcus aureus a été évaluée en culture pure et en

culture mixte dans le milieu naturel le lait en présence des souches

productrices de substances antimicrobiennes (bacteriocin-like).

Ce travail nous a permet de détecter plusieurs souches de bactéries

lactiques capable d’inhiber Staphylococcus aureus en milieu lait. L’un des

intérêts de recherche actuelle sur les bactéries lactiques est de développer une

stratégie permettant de contrôler et de limiter la croissance des germes

indésirables par les potentialités des bactéries lactiques qui sont capable

d’assurer une qualité hygiénique désirable des produits alimentaires. Le

Conclusion générale

125

développement d’un levain spécifique doter d’un pouvoir bio-conservateur

permet d’augmenter la durée de conservation des produits alimentaires et

d’assurer une qualité hygiénique suffisante par l’élimination des germes

indésirable. L’exemple dans cette étude, des interactions entre les souches de

bactéries lactiques locales et Staphylococcus aureus nous amène à une

possibilité de développer un levain possédant ces caractéristiques préventives.

126

Références bibliographiques


127

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