LES COSMIDES

Dans le phage lambda, on peut introduire un

fragment d'ADN eucaryotique de 15 à 20 kb.

Cependant, certains gènes ont une taille supérieure à

20 kb. D'autre part, il est parfois nécessaire d'isoler et

d'analyser une portion d'ADN chromosomique qui

contient une famille de gènes. La famille des gènes de

globine s'étend sur 70 kb et des familles plus

complexes peuvent occuper plusieurs centaines de kb.

C'est pourquoi on a mis au point le clonage dans les

cosmides .

INTRODUCTION

1-DÉFINITION

Cosmide: site cos du phage + plasmide→ Clonage de fragment de 45 kb maximum

(capacité ×3)Sites cos → Encapsidation in vitro→ Particules virales capables d'infecter E.

coli (efficacité > transformation)Origine de réplication plasmidique→ Multiplication dans la bactérie de la

même façon qu'un plasmide

2-STRUCTURE

-un gène de résistance à un ou

plusieurs antibiotiques

-une origine de réplication de plasmide

-un ou plusieurs sites de restriction

unique(s) pour le clonage (polylinkers

ou MCS)

-une ou deux séquences cos

-une petite taille : environ 6 kb

FIGURE 1: STRUCTURE DE COSMIDE AVEC UN SEUL COS .

3-ETAPES DU CLONAGE DANS UN COSMIDE

Il existe deux stratégies de clonage associées à

deux cosmides différents. Ces stratégies ne

diffèrent que dans la structure et l’arrangement

des signaux cos dans les cosmides:

Cosmide à une séquence cos : ce type de

cosmide ne contient qu’une seule séquence cos. Il

correspond à la première génération de cosmides.

Il nécessite une sélection de la taille des inserts

afin de limiter les phénomènes de co-ligation.

Cosmide à deux séquences cos :

dans ce type de cosmide, les sites cos

sont répliqués en tandem. Ils

permettent un clonage rapide et

efficace des inserts, sans présélection

sur leur taille.

PRINCIPE

  La construction d’une banque d’ADN

génomique à partir de cosmides revient

à cloner l’ensemble d’un génome par

fragments dans des cosmides. Le

principe général de cette technique a

été établi à partir des premiers

cosmides, contenant une seule

séquence cos (cosmide simple cos).

Les grandes étapes sont les suivantes :

1-FRAGMENTATION D’ADN :

2-FRAGMENTAION DE COSMIDE

Parallèlement à la digestion de

l’ADN génomique, le vecteur est

linéarisé par une enzyme de restriction

à site unique, qui coupe dans le

multisite de clonage. L’enzyme BamHI

est couramment utilisée.

3-LIGATION

Les vecteurs linéarités et les inserts d’ADN génomiques

sélectionnés sont ensuite mélangés pour la légation.

Celle-ci est effectuée grâce à la T4 DNA ligase. Cette étape

doit être réalisée à haute concentration d’ADN pour favoriser

les associations intermoléculaires par rapport aux

associations intramoléculaires.

Des concatémères se forment par l’association, par

exemple d’un ADN g entouré de deux cosmides linéarisés.

Cette ligation est possible par la complémentarité des bouts

collants générés par MboI et BamHI.

 

4-ENCAPCIDATION

Le vecteur recombinant est alors encapsidé in vitro

comme celui d’un phage à partir des extraits de

capsides préparés préalablement in vitro ou d’extraits

commerciaux .

Décongelés et mélangés, les extraits complémentaires

sont mis en présence des cosmides recombinants, ce

qui active la machinerie pour l’assemblage de la tête de

phage et l’insertion d’ADN.

Cet empaquetage se fait dans une capside vide de

bactériophage grâce à la reconnaissance des deux

sites cos séparés d’environ 40 kb.

5- INFECTION ET MULTIPLICATION.

Les bactéries hôtes (E.coli souche DH5α)

sont ensuite infectées par le vecteur.

Une fois dans la bactérie, le cosmide se

réplique comme un plasmide car il ne

possède pas les gènes du phage

nécessaires à la production de nouvelles

particules phagiques.

6- SÉLECTION DES COSMIDES RECOMBINANTS

Les bactéries contenant les cosmides

sont sélectionnées sur la base de leur

résistance à un antibiotique (gène de

sélection présent sur le cosmide).

Seules les bactéries ayant intégrées

un cosmide seront résistantes et

pourront pousser sur ce milieu.

FIGURE 2 : MODE D'EMPLOI D'UN COSMIDE POUR LA CONSTITUTION D'UNE BANQUE.

Les cosmides ont donc l’avantage sur les autres vecteurs de

clonage d’accepter de plus grands fragments d’ADN et sont

surtout utiliser pour caractériser des génomes.

Dans le projet d’analyse génomique à grande échelle, les

cosmides pourraient être utilisés pour la cartographie

physique détaillée, pour convertir des contigs YAC en contigs

cosmides, ainsi que pour les cartes de restriction ou

l’isolement de gènes, l’analyse  cytogénétique par hybridation

in situ haute résolution et d’autres stratégies encore…

 

CONCLUSION