BIOCHIMIE, 1979, 61, 379-384.

Les activitds cytidine et ddsoxycytidine aminohydrolases des parties adriennes de Zea mays L. :

existence probable de 2 isozymes poss6dant chacune les deux activitds.

Albert GUILLOT ~ et Mich61e BRILLARD.

(5-7-1978).

Universit~ Franfois Rabelais, Facult~ des Sciences, Laboratoire de Biologie et Physiologie V~g~tales, Parc de Grandmont, 37200 Tours.

R~sum6. Summary .

Les courbes repr6sentant les cin6tiques de d6naturation thermique des activit6s d6soxy- cytidine et cytidine arninohydrolases d'une pr& paration partiellement purifi6e de parties a6riennes de Mais peuvent ~tre consid6r6es comrne les sommes de deux fonctions expo- nentielles, suqcj6rant ainsi l 'existence de deux isozymes pour ces activit6s. Cette hypoth~se est confirm6e par la s6paration partielle de ces deux isozyrnes par chrornatoqraphie sur co- lonne de DEAE-cellulose : en effet, si le pic d'61ution de chacune des deux activit6s enzy- rnatiques est apparemment unique, l'6tude cin6tique de la d6naturation thermique con- duite sur chacune des fractions individuelles qui le constituent, fait apparaltre qu'il est en r6alit6 la somme de deux pics distincts mais se recouvrant larqernent. Les constantes de d6naturation thermique des prot6ines respon- sables des deux types d'activit6s enzymatiques cit6es ne sont pas siqnificativement diff6rent~s tant ~ 60°C qu'& 70°C, et aussi bien en l 'absence qu'en presence de sulfate d'amrno- niurn M. La pr6sence de ce dernier sel a un effet protecteur non seulernent vis-a-vis de la d6naturation thermique, mais aussi vis-&-vis d'un cycle concj61ation-fusion pour les deux types d'activit6s enzyrnatiques. L'ensernble de ces r6sultats suqq~re forternent que les extraits des parties a6riennes de Mais contiennent deux isozyrnes pr6sentant chacune aussi bien une activit6 d6soxycytidine arninohydrolase qu'une activit6 cytidine arninohydrolase.

© To whom all correspondence should be addressed.

Enzymatic proteins with deoxycytidine and cytidine aminohydrolase activities were par- tially purified from Zea rnays L. aerial parts by usinq ammonium sulfate fractionation, adsorp- tion on calcium phosphate qel and chromato- graphy on DEAE-cellulose.

The tirne-course of their thermal denaturation was followed by assayinq enzymatic activities of extracts. The curve profiles obtained were found to be the sum of two exponential func. tions, suqqestinq the presence in extracts of two isozyrnes. Further evidence for this con- clusion was given by the time course study of the thermal denaturation of each individual fraction collected from DEAE-cellulose (these individual fractions were usually pooled in the other experiments). This study showed that each enzymatic activity which appears as a single peak, represents in fact the elution of two broadly overlappinq peaks.

Rate constants for the thermal denaturation were determined at 60 ° or 70°C, either in 0.02 M phosphate buffer pH 7.5, or in the same buffer containinq 1 M ammonium sulfate. Iden. tical values were obtained under these various conditions both for the cytidine aminohydro- lase and the deoxycytidine arninohydrolase activities. Furthermore, 1 M ammonium sulfate protects both enzymatic activities aqainst the injurious effect of a freezinq-thawinq cycle. These activities are lost in the course of such a cycle performed at low ionic strength. These results suqqest that the same protein species are responsible for the deaminatien of both cytidine and deoxycytidine.

380 A. Galliot et M. Brillard.

Present data and those previously obtained [3] lead us to think that the Zea Mays extracts contain two isozymes both of them beinq able to catalyze the deamination of cytidine as well as deoxycytidine. The A isozyme is first eluted from DEAE-cellulose columns. It appears to be quantitatively the most important and it is the most heat-stable. The B isozyme is the most responsive to the protective effect of 1 M ammo- nium sulfate against thermal denaturation.

Present investic~ations were completed by usinq an improved radioisotopic method in all assays of enzymatic activities. This method in- volved a very quick (10 to 15 rnin) and favou- rable separation of substrate and product by thin layer chromatoqraphy on CM-cellulose plates (26 ~ 76 ram); the chromatoqrams were developed by using ethylacetate/metha- nol/water (12/6/4 v / / v / v ) .

Introduct ion.

Les e x t r a i t s pa r t i e l , l emen t pur i f i6s de la feu i l le de Zea Malls L. p r 6 s e n t e n t 'des ac t iv i t6s c y t i d i n e et d 6 s o x y c y t i d i n e a m i n o h y d r o l a s e s (E.C. 3.5.4.5., et E.C. 3.5.4.14 r e s p e c t i v e m e n t ) [8]. Ces ac t iv i t6s s e m b l e n l .devoir 6tre a. t tr ibu6es h u n m 6 m e s i te c a t a l y t i q u e , car , d ' u n e pa r t , l es r ap ,por t s ac t iv i t6 d 6 s o x y c y t i d i n e a m i n o h y d r o l a s e / c y t i d i n e a m i n o - h y d r o l a s e ne v a r i e n t pas de m a n i b r e s ignif i ,cat ive au c o u r s des 6 tapes s u c c e s s i v e s de la p u r i f i c a t i o n , et, d ' a u t r e pa r t , c y t i d i n e et d 6 s o x y c y t i d i n e sere- b l e n t se c o m p o r t e r v is-h-vis l ' u n e de l ' au t r e corn- m e d e s inh ib i t . eu r s e o m p 6 t i t i f s [3]. Les r6su l t a t s p r 6 c 6 d e n l s n ' e x e l u e n t p~as c e p e n d a n t l ' e x i s t e n c e de p l u s i e u r s e spbces p r o t 6 i q u e s de p r o p r i 6 t 6 s voi- s i n e s d a n s ,la m 6 m e f r a c t i o n e n z y m a t i q u e pur i f i6e . Nous r a p p o r t o n s ic i les i n f o r m a t i o n s o b t e n u e s sur ce p o i n t p a r l ' 6 tude c i n 6 t i q u e de la d 6 n a t u r a t i o n t h e r m i q u e des p r o t 6 i n e s r e s p o n s a b l e s des ac t iv i t6s e n z y m a t i q u e s c i t6es .

Methods.

1. Obtention du matdriel oEgdtal.

Les semenees de Mais (Dekalb XL 12) sont st~rilis6es, apr~s lavage rapide h l 'aleool, dans une solution de ehlorure mercur ique h 0,1 p. cent pendant 3 minutes, puts rinc~es dans l 'eau sterile. Les semenees, germ~es sur papier filtre st~rilis~ humide pendant 5 h 6 jours, sont raises en eulture St l 'obseurit~ h 25"C sur vermicu- lite st~rilis~e et arros~e d'eau d~sionis6e. Les part ies a6riennes sont r~eolt~es environ 15 jours apr~s la raise en germinat ion. Elles sont pes~es, congel~es dans l 'azote l iquide et eonserv6es h - - 3 0 ° C jusqu'st ut i l isa- t ion.

2. Extraction et purification de l 'enzyme.

L'extraet ion est pratiqu~e selon ]a m6thode de Loomis et Battaile [9] sur un lot de 100 h 120 g. La purification est eonduite selon une m~thode qui est une modification de celle de Le Floc 'h et Guillot [8]. Les t rois premieres ~tapes sont ex~cut~es eonform~ment h cette derni~re et fournissent ]es fract ions I, II et IIl respect ivement :

BIOCHIMIE, 1979, 61, n ° 3.

1) precipi ta t ion par le sulfate d ' ammon ium St 70 p. cent de sa tura t ion suivie d 'un tamisage mol6cnlaire sur Sephadex G 25 : f ract ion I ;

2) pr6eipitat ion fractionn~e entre 35 p. cent et 50 p. cent de sa turat ion suivie d 'un tamisage mol~cnlaire sur Sephadex G 25 : f ract ion II ;

3) adsorpt ion n~gative sur gel de phosphate : frac- t ion III.

Le reste de ta purification est poursuivie de la mani~re suivante : la fract ion III est chromatographi6e sur une colonne de DEAE-cellulose (diambtre : 25 mm ; longueur : 50 mm), 61u~e par un gradient l in6aire de C1Na (0 h 1,5 M) dans un tampon pH 7,5, 0,05 M (volume total d'61ution : 100 ml ; volume frac- t ions : 2,5 ml ; d6bit : 60 ml /h) .

Les fract ions pr~sentant une activit6 enzymat ique (rep~r6es par ]a m6thode spectrophotom6tr ique Ia d6crite par Le Floc'h et Guillot [8] mats modifi6e de fagon St ramener le volume d ' incubat ion St 600 jxl) sont r6unies pour const i tuer la f ract ion IV. Cette dernibre f ract ion est addit ionn6e de sulfate d ' ammon ium h 70 p. cent de saturat ion. Le cnlot recueilli par centr i fu- gation est redissous dans du tampon phosphate 0,02 M, pH 7,5 et la solution obtenue est tamis6e sur une colon- ne de gel Sephadex G 25 (diam~tre : 10 mm ; longueur 250 mm). Les fract ions pr~sentant nne activit~ enzyma- t ique sont r~unies et const i tuent la fract ion V. Celle-ci est addit ionn6e de sulfate d ' ammonium (concentration 1 M) et congel~es (--25°C) jnsqu'st ut i l isat ion. La pre- sence du sulfate d ' ammonium est absolument indispen- sable pour stabil iser l 'enzyme, car tout cycle cong~la- t ion-fus ion accompli en l 'absence de sulfate d ' ammo- n ium St concentrat ion suffisante ent ra lne une perte complSte d'activit6 enzymatiquc, rant vis-h-vis de la d~soxycytidine que de la cytidine. En presence de sul- fate d ' ammonium 1 M, l 'enzyme peut ~tre conserv6e h - -25~C plusieurs mois sans perte notable d'activit6.

3. M~thode radioisotopique de mesnre des activitds enzymatiques.

Les incubat ions sont ex~eut6es h 40°C dans des tubes pr~l~vement Eppendorf h usage unique de 1,5 ml et

const i tutes en in t rodnisant suceessivement h la seringue 10 Fxl de tampon (PO4HeK/PO4HK~, 0,2 M, pH 7,5 g6n~ralement), 10 ~1 d'eau (on de solution d 'une substance dont on d~sire 6tudier les effets sur l 'aetivit6 enzymatique) , 10 jxl de eytidine [U-14C] ou de 2'D~soxy eytidine [U-14C1 (Amersham) (4 m M ; activit~ sp~ei- fique : 1 mCi/mMole) et enfin, apr~s pr~incubation du m6lange obtenu pendant 3 minutes, 10 ~xl de solution enz~*matique. Apr~s 10 minutes d ' ineubat ion exaete-

Isozymes & activitd (ddsoxy)cytidine aminohydrolase. 381

ment (la vitesse de ddsaminat ion est sensiblement cons- tante pendant au moins 10 minutes si la concentrat ion en subst ra t est suffisante), ]es essais et les t6moins n6cessaires sont stabilis6s au ba in-mar ie boui l lant pen- dant 2 minutes exactement (dur6e trbs la rgement suf- fisante pour inactiver complbtement l 'enzyme, car au bout d 'une minute, i ] ne subsiste que des traces d 'acti- vit6 enzymatique) .

L 'analyse des m~langes ineub6s est ex6eut6e par chromatographic en couche mince de C. M. cellulose TLC Serva cyclde ~t la mani6re habituelle. Le support de la couche mince est une lame de verre pour micro- scopie (26 X 76 mm). Les plaques sont pr6levfes selon les indicat ions de Randera th [13] et s6ch6es h l '6tuve h l l0°C pendant 30 minutes avant ut i l isat ion. 1 I~1 d 'une solution contenant 30 nMoles de subst ra t et 30 nMoles de produi t non radioact i fs est ensuite ddpos6e en un point situ6 h 1 cm du bas de la plaque. On applique ensuite an m~me point 5 Ixl du m61ange incub6 (micro-

4. CinEtique de dJnaturation thermique.

La solution enzymat ique est in t rodui te dans un tube Eppendorf h pr61~vement de 0,4 ml. Le tube bouch~ est plae6 au ba in-mar ie h 60 ou 70°C et des pr616vements sont fai ts p6r iodiquement et inject6s dans des incuba- t ions pr~par~es selon les indicat ions ei-dessus (voir § 3). La valeur des activit6s init iales est d6termin~e juste avant l ' in t roduct ion de ] 'enzyme au bain-marie .

R~sultats et Discussion.

L '6 tude cin&tique d e la d 6 n a t u r a t i o n t h e r m i q u e des p r o t 6 i n e s r e s p o n s a b l e s des ac t iv i t6s d 6 s o x y c y - f i d i n e et c y t i d i n e a m i n o h y d r o l a s e s c o n t e n u e s d a n s

f ' N

i254 _~ 20.

'18B

15. N14,4 u.I

"~ 10.

o i HEURES

FIG. 1. - - Cin~tique de ddnaturation thermique (60°C) des protdines responsables des actiuit~s cytidine el d~soxycytidine aminohydrolases en l'absence de sulfate d'ammonium.

Enzyme (fraction V) en solution duns du tampon phosphate 0,02 M, pH 7.5.

CydAH : courbe relative h l 'aetivit~ cytidine a mi n o h y d r o l a s e . . dCydAH : courbe relative h l 'activit6 d6soxycytidine aminonydrolase .

pipette capil laire h usage unique). Le d6veloppement est effectu6 duns des tubes de Borel contenant 3 ml du m61ange d6veloppant : ac6tate d '6thyle-m6thanol-eau (12/6/4 en volume). Ce syst~me s 'est r6v61d le meil leur apr6s de nombreux essais sur cellulose TLC ou sur CM-cellulose TLC dans diff6rents solvants. La s6para- t ion du substra t et du produi t est excellente (Rf cyti- dine et ur idine : 0,13 et 0,58 respect ivement ; Rf d6soxycytidine et d6soxyuridine : 0,20 et 0,75 respec- t ivement) et tr6s rapide (10 h 15 minutes) .

Apr~s s6chage des plaques, subst ra t et produi t sont rep6r~s sous la ]ampe h UV ()~ = 254 nm). La poudre de CM-cellulose situ6e h chacun des emplacements rcp6- r6s est alors transf6r6e directement dans unc fiole h scintil lation. Apr6s addi t ion de 10 ml de m61ange scin- t i l lant (4 g de PPO et 50 mg de POPOP pour 1 l i tre de tolubne), l a radioactivit6 est mesur6e h l 'aide d 'un scint i l lateur Mark I Nuclear Chicago. L'efficacit6 du comptage dans ces condit ions est d 'environ 75 p. cent.

BIOCHIMIE, 1979, 61, n ° 3.

la f r a c t i o n V, a 6t6 r6al is6e h 60°C soi t en l ' a b s e n - ce (fig. 1), soi t en p r 6 s e n c e de su l fa te d ' a m m o n i u m 1 M (fig. 2). C h a c u n e des 4 c o u r b e s o b t e n u e s p e u t 6tre v a l a b l e m e n t c o n s i d 6 r 6 e c o m m e la s o m m e de d e u x e x p o n e n t i e H e s , a ins i que l e m o n t r e le b o n a j u s t e m e n t des c o u r b e s ca lcu l6es aux p o i n t s exp6- r i m e n t a u x . Cec i sugg~re que la f r a c t i o n V c o n t i e n t 2 i s o z y m e s auss i b i e n p o u r l ' a c t i v i t 6 d 6 s o x y c y t i - d i n e a m i n o h y d r o l a s e que p o u r l ' ac t iv i t6 c y t i d i n e a m i n o h y d r o l a s e : l ' une t r~s i n s t ab i e , l ' ,autre p lus s table . L '6 tude d.e la c i n 6 t i q u e de d 6 n a t u r a t i o n t h e r m i q u e d e s p r o t 6 i n e s r e s p o n s a b l e s des ac t iv i t6s c y t i d i n e et d 6 s o x y c y t i d i n e a m i n o h y d r o l a s e s con- t e n u e s duns les f r a c t i o n s I, II ou III f o u r n i t des c o u r b e s du m 6 m e t y p e que ce lu i obse rv6 avec la f r a c t i o n V, et p e r m e t d o n c d '61 iminer u n e h y p o -

382 A. Guillot et M. Brillard.

thbse, poss ib le a p r i o r i , se lon l aque l l e l ' une des z y m e la m o i n s s table et aussi la mo ins a b o n d a n t e i sozymes se ra i t en r6al i t6 un a r t e fac t a p p a r a i s s a n t (B) (fig. 3).

32

o 32 17,1 ~ , i 6 : Lu 13,7- :D

>- N z

., 4_ I -

> i...-

0 6 1'2 1'8 2'4 3'0 3'6 HEURES

FIO. 2. - - CinEtique de ddnaturat ion thermique (60°C) des activitEs cyt id ine et d~soxycyt id ine aminohydrolases en presence de sul[ate d ' a m m o n i u m M.

Enzyme (fraction V) en solution dans du tampon phosphate 0,02 M, pH 7,5, additionn6 de sulfate d ' ammonium M.

Cyd AH : eourbe relat ive h l 'aetivit6 eytidine aminohydrolase. dCydAH : courbe relat ive h l 'aetivit6 d6soxyeytidine aminohy-

drolase.

au cour s de la c h r o m a t o g r a p h i e sur DEAE-ce l l u - lose. A ins i se t r o u v e just if i6e la r6a l i sa t ion d ' exp6- m e n c e s d6er i tes au p a r a g r a p h e su ivan t .

Les f r a c t i o n s i n d i v i d u e l l e s r e c u e i l l i e s au cour s d ' u n e c h r o m a t o g r a p h i c sur D'EAE~cel lulose (el h a b i t u e H e m e n t r6un ie s p o u r e o n s t i t u e r la f r a c t i o n IV) ont fair c h a c u n e l ' ob je t d ' u n e 6tude e i n 6 t i q u e de la d d n a t u r a t i o n t h e r m i q u e des p r o t 6 i n e s enzy - m a t i q u e s 6tudi6es ici. Ces 6tu4es, ex6cut6es 70°C, ont m o n t r 6 que la f r a c t i o n de t6te c o n t i e n t une seule i sozyme p o u r l '~lne et l ' au t r e a c t iv i t6 en- z y m a t i q u e ; en effet, la r e l a t i o n en t r e l o g a r i t h m e s des ac t iv i t~s d :6soxycy t id ine e t c y t i 4 i n e a m i n o h y - d ro lases c o n t e n u e s dans ce t te f r a c t i o n et dur6e de la d d n a t u r a t i o n est l in6a i re . Les f r a c t i o n s su ivan - tes con t i e n n e n t un m61ange des d e u x i sozymes avec une p r o p o r t i o n e ro i s s an t e du deux ibme .

Les ca lcu l s effeetu6s h p a r t i r des donn6es exp6. r i m e n t a l e s p e r m e t t e n t d ' a n a l y s e r les p ics d '61ution de c h a q u e t y p e d ' ac t iv i t6 e n z y m a t i q u e c o m m e 6rant en r6al i t6 la s o m m e de deux p ics se r e c o u - v r a n t l a r g e m e n t , q u o i q u e 16gbrement d6cal6s, et d ' i m p o r t a n c e trbs d i f f6 ren te : le p r e m i e r co r res - p o n d h l ' i s o z y m e le p lus s table (A), et aussi le p lus abond~ant t a n d i s que ]e s e c o n d c o r r e s p o n d h l ' i so-

BIOCHIMIE, 1979, 61, n ° 3.

dCyd aminohydrolase 20

16

12

i i !

5 7 9 11

Cyd aminohydrolase

/ Fro. 3. - - Pro~il d'Elulion des deux i sozymes A el

B it activitE cyt id ine-dEsoxycyt id ine aminohyclrolase d'une colonne de DEAE-cellulose.

Courbes T : aetivit6s enzymatiques totales mesur6es exp6rimentalement direetement sur chaque fraction.

Courbes A : aetivit6s enzymatiques a t t r ibutes h l ' iso- zyme A, ealeul6es h par t i r des cin6tiques de d6natura- tion thermique des prot6ines enzymatiques contenues dans chaque fraction.

Courbes B : activit~s enzymatiques attribu6es h l ' iso- zyme B, caleul6es h par t i r des m~mes cin6tiques de denaturat ion thermique.

En abseisses : num6ros des fractions. En ordonn~es : aetivit6s enzymatiques exprim6es en

pieokatal.

I s o z y m e s h activitd (ddsoxll)c!ttidine aminohydrolase . 383

I1 est donc c l a i r que les extra,its de feuil les de Mais cont iennent , pour chacun des deux types d 'ac t iv i tds enzymat iques consid6rds ici , 2 iso- zymes, de propr id tds phys i coch imiques 6videm- ment assez voisi, nes p.uisqu'Hs ont le m6me com- portemen.t au cours de la pu r i f i ca t i on partie.lle rdalis6e ici .

C o n c l u s i o n s .

De nombreux auteurs ont obtenu des p rdpa ra - t ions enzymat iques plus ou moins purif ides pr~- sen tan t soit une act ivi td cy t id ine aminohydro ]a se [141 soit une a ctivit6 d6soxycy t id ine a m i n o h y d r o -

TABLEAU I.

Valeurs des conslantes de oitesse de d~naturation thermique pour les deux isozymes clans diffdrentes conditions.

Tempdrature SO4 INH4) ~ Fractions 'C M

lsozyme A Isozyme B

Activitd Activil6 Activitd hctivitd ddsoxyeytidine cytidine d6soxyeytidine eytidine arninohydrolase aminohydrolase aminohydrolase eminohydrolase

F V 60 - - 22 23 404 387 F V 60 -~- 14 15 115 116 F I V - 7 (1) 70 + 144 145 1 282 1 253

Valeurs de k exprimdes en see-1 et multiplides par 106. (1) 7 e fraction dlude de la colonne de DEAE-cellulose.

L ' examen du tab leau I sugg6re for tement que les act ivi t6s d6soxycy t id ine et cy t id ine a m i n o h y d r o - lases sont en rdali t6 impu tab le s aux m6mes esp6- ces ,prot6iques. En effet, quelles que soient les con- d i t ions (60 ou 70°C, absence ou pr6sence de sul- fate d ' ammonium) , tes constantes de d6na tu ra t ion the rmique sont les m~mes pour les deux types d 'ac t iv i t6s anainohydrolases .

On peut r emarquer , en pa r t i cu l i e r , que l 'effet s t ab i l i sa teur du sulfate d ' a m m o n i u m vis-h-vis de la d6natura t ion the rmique est exac tement le m6me pour l es deux types d 'ac t iv i tds enzymat iques , qu ' i l s 'agisse de l ' i sozyme A ou de l ' i sozyme B, cet effet s t ab i l i sa teur 6rant p lus marqu6 pour l ' i sozyme B que pour l ' i sozyme A.

De m6me, ,les act ivi t6s tant cy t id ine que d6soxy- cy t id ine aminohydro l a se s des deux isozymes en solut ion dans un t ampon phospha te p H 7.5, 0,02 M, sont to ta lement pe rdues lors d 'un cycle congdla- t ion-fus ion alors qu 'un tel cycle peut 6tre accom- p l i sans pe r t e d 'ac t iv i t6s enzymat iques en pre- sence de sulfate d ' a m m o n i u m 1 M.

Ces diffdrentes observat ions , jo intes aux r6sul- tats acquis p r6cddemment [3], p ermet tent de con_ c lure qu 'un m6me site ca ta ly t ique est capab le de ca ta lyse r aussi b ien la d6samina t ion de la cy t id ine que celle de la d6soxycyti ,dine.

BIOCHIMIE, 1979, 61, n ° 3.

lase [5], ou bien encore, le plus souvent, les deux a.etivitds [1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 15 et 16]. Cepen- dant , aucun d 'eux n 'a jamais signal6 l ' ex is tence d ' i sozymes mani fes tan t ces activitds. L ' a t t r ibu t ion de ces deux a ct ivi tds enzymat iques h une m~me pro td ine est, chez les Bact6ries, une hypo th&se fondde sur des observa t ions g6ndtiques [6, 11]. P a r con tre, chez les Eucaryotes , aucun autenr n 'a p ro- posd de rdsul tats expdr imen taux pe rme t t an t de just if ier une tel le hypoth6se , h l ' excep t ion toute- fois de Acha r et al. [1] dont les a rguments expdr i - mentaux sont cependan t t r op peu ddveloppds pour 6tre v ra imen t convaincants .

C'est donc la p remi6re lois qu 'est mise en 6vi- dence l ' ex is tence d ' i sozymes capables de ca ta lyser la d6samina t ion aussi b ien de la d6soxycy t id ine que de la cy t id ine au niveau de m6mes sites cata- lyt iques, quoique ~ des vitesses un peu diff6rentes dans les condi t ions exp6r imenta les uti l is6es ici .

Cepen.dant, pour just if ier t ' emplo i du te rme isozy- me dans le cas p rdsen tement dtudid, il c onv i e nd ra de m o n t r e r que les deux formes moldcula i res de (desoxy)cy t id ine a minohyd ro l a se s raises en 6vi- dence sont gdndt iquement d is t inctes , conformd- ment h la ddfinit ion des isozymes donnde p a r ]a Commiss ion de Nomenc la tu re et de Classif icat ion des Enzymes de I'I.U.P.A.C. et de I'I.U.B. [17].

384 A. Guillot el M. Brillard.

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