Les activateurs du plasminogène: aspects généraux et développements récents

BIOCHIMIE, 1985, 67, 1197-1216 Revue

Les activateurs du plasminog6ne • aspects g6n6raux et d6veloppements r6cents.

Mich61e R E B O U D - R A V A U X .

Laboratoire de Biochhnie du Ddveloppement, lnstitut Jacques Monod, Universitd Paris VIL Tour 43, 2, place Jussieu, 75251 Paris Cedex 05, France.

(Refu le 7-5~1985. accept~ apr~s rdvision le 17-5-1985).

R ~ s u m ~ - - Les activateurs du plasmhlog~ne sont l'objet d'un enjeu biotechnologique considd- rable. Rdpartis en deux classes immunologiquement disthlctes, les u-PA ou activateurs de t)Te urokinase (ddpourvus d'affinitd pour la fibrine) et les t-PA ou activateurs de t)Te tissulaire (prdsentant de l'affinitd pour la fibrine), ils sont prdsents de fafon ubiquitaire dans les tissus normaux olt tumoraux d'origine animale ou humaine. Intervenant dans de nombreases situations physiologiques ou pathologiques, ils maintiennent lTntdgritd du systOme vasculaire et sont impliquds dans les processus de migration cellulaire et de remodelage tissulaire. C'est leur activitd fibrinolytique, via la catalyse de la formation de plasmhle fi partir du plasmhlog~ne circalant, qui en font des agents thrombolytiques actuels (urokinase, streptokinase) ou potentiels (t-PA). Les structures primaires de l'urokinase et du t-PA ont dtd ddtermindes et ces deux enzymes ont dtd clondes. En rue d'une utilisation massive clans le traitement d'infarctus du myocarde, ¢te thromboses cdrdbrales et d'embolies puhnonaires, les efforts de l'industrie pharmaceutique se concentrent actuellement sur l'obtention, par gdnie g~n~tique, de grandes quantitds de t-PA. Cette revue pr~sente les propridtds moldculaires et structurales des activatears du plasmhlogOne ainsi que les principaux aspects physiologiques, pathologiques et thdrapeutiques les concernant.

Mots-cl~s : activateurs du plasminog~ne / t-PA / urokinase / fibrinolyse / tumeurs / th~rapie thrombolytique.

S u m m a r y - - Considerable hlterest hi plasmhlogen activators as human thrombolytic drugs has stimulated rapid biotechnologic progresses. These enzymes have been classified hl two hnmuno- chemically distinct groups : "'urokinase-like" activators or u-PA which do not interact with fibrin and "tissue activator-like" activators or t-PA which hlteract with fibrin. Plasmhlogen activators are widely distributed hi normal and malignant tissues and the), are inlplicated hl various physiological and pathological processes. They mahztahl the fimctional integriO' of the vascular system and their presence may be o f importance hi tissue remodeling and cell migration. Urokinase and streptokinase are used in human thrombolytic therapy. However, the properties displayed by t-PA suggest that this enzyme may be a superior fibrinolytic agent. The primary structures of urokinase and t-PA are known; both enzymes have been synthesized by DNA technology, hi order to produce t-PA in large quantities by gene cloning, intensive studies are conducted by pharmaceutical hldustries. Clinical trials ushlg t-PA for dissolving thrombi in coronary heart disease, strokes and puhnonary embolism are in progress. This review presents the molecular and structural properties o f plasminogen " ' as activators, well as related physiological, pathological and therapeutic aspects.

Key-words : plasminogen activators / t-PA / urokinase / fibrinolysis / tumors / thrombol)tic therapy.

1198 M. Reboud-Ravaux

Introduction

Le plasminog6ne (ou profibrinolysine) est un pr6curseur plasmatique d'une enzyme fibrinolytique, la plasmine, ou fibrinolysine (EC3.4.21.7) [I, 2]. L'activation du plasminog~ne en plasmine est catalys6e par des enzymes, les activateurs du plasminog~ne (not6s PA). L'histoire de leur d6- couverte et de leurs fonctions dans diff6rents syst~mes a fait l'objet d'un certain nombre de revues d6j& anciennes [3-7]. La conversion du plasminog~ne en plasmine est li6e ~. i'hydrolyse d'une seule liaison peptidique du zymog~ne (Arg560 -- Va1561) [8-11]. Tous les activateurs connus actuellement sont capables de catalyser directement ou indirectement l'hydrolyse de cette liaison peptidique.

Les activateurs du plasminog~ne sont r~perto- ri6s en trois classes correspondant & trois voles diff6rentes d'activation du plasminog6ne [121. Dans la voie intrins6que ou humorale, tous les composants impliqu6s (activateurs du plasmino- g6ne, plasminog6ne, inhibiteurs) sont pr6sents dans le sang sous forme de pr6curseurs. Dans la vole extrins6que, i'activateur du plasminog6ne est lib6r6 par la paroi vasculaire ou les tissus sous l'influence de certains stimuli ou traumatismes : c'est le cas de l'urokinase urinaire (EC 3.4.21.31) et de l'activateur dit vasculaire. Enfin, la voie exog~ne correspond & l'activation du plasmino- g6ne sous l'influence d'activateurs inject6s h des fins th6rapeutiques tels que I'urokinase ou la streptokinase d'origine bact6rienne (prot6ine qui, en formant un complexe avec le plasminog6ne, acquiert des propri6t6s activatrices). La kalli- kr6ine est 6galement capable d'activer le plasmi- nog6ne, mais son r61e ne serait pas significatif physiologiquement.

Initialement impliqu6s dans la fibrinolyse humorale en tant qu'agents cellulaires activant physiologiquement le plasminog~ne [13], les activateurs ont 6t6 reconnus responsables de I'activit6 fibrinolytique pr6sent6e par les cellules de I'endo- th61ium vasculaire [14-16] ainsi que de celle pr6sent6e par d'autres endoth61iums de surface [17-20]. lls jouent 6galement un r61e dans la r6paration tissulaire [20,21]. A la suite de ces premiers travaux, les 6tudes conduites sur les activateurs du plasminog~ne ont vis6 & d6terminer leur distribution dans les tissus de diff6rentes esp~ces et & analyser leurs fonctions probables. Le caract6re ubiquitaire des activateurs a ainsi 6t6 d6montr6: pr6sents dans la quasi-totalit6 des

tissus animaux normaux [22], ils ont 6t6 retrouv6s ~t des taux 61ev6s dans de nombreux tissus tumoraux [22-25]. Une production 61ev6e d'activateurs s'est r6v616e 6tre caract6ristique de certaines cultures de cellules malignes [4]. Leur lib6ration peut ~tre induite par des promoteurs de tumeurs [26], des carcinog6nes chimiques [27] et des 16sions du DNA [28]. Outre leur r61e bien d6montr6 dans la fibrinolyse et la fibrinog6nolyse [29, 30], ils sont impliqu6s dans une grande vari6t6 de processus physiologiques : invasion du trophoblaste [31], diff6renciation [32]. La plasmine g6n6r6e sous raction des activateurs est la seule enzyme plasmatique dou6e d'une large sp6cificit6. De type trypsique, elle catalyse l'hydrolyse non seulement de la fibrine mais aussi d'autres prot6ines: prot6ines des membranes cellulaires [33], diff6ren- tes prot6ines impliqu6es dans la coagulation [34, 35] par exemple. Ainsi, la pr6sence d'activateurs du plasminog6ne dans de nombreuses cellules pr6sentant un caract6re migratoire et /ou invasif [31, 36, 37] sugg~re qu'ils jouent un r61e important dans le remodelage et l'invasion tissulaire [38] ainsi que dans la migration cellulaire [39]. Par suite de leur pr6sence quasi-g6n6ralis6e dans des extraits et des s6cr6tions de tissus normaux ou tumoraux d'origine animale et humaine, Reich [5] a sugg6r6 que leur intervention pourrait constituer un processus g6n6ral de pro- t6olyse extracellulaire localis6e.

Les activateurs du plasminog~ne de diverses origines diff6rent les uns des autres par leur taille et par leurs propri6t6s immunologiques [22]. Ils ne sont cependant class6s qu'en deux groupes. Les activateurs de type urokinase, not6s u-PA, sont neutralis6s par des anticorps anti-urokinase; leur interaction avec la fibrine est faible [40]. Au contraire, les activateurs de type tissulaire, not6s t-PA ne r6agissent pas avec les anticorps anti-urokinase [41] mais avec des anticorps pr6par6s avec certains activateurs extraits de tissus.comme le coeur de porc [42]; ils pr6sentent une bonne affinit6 pour la fibrine [40]. Les abr6viations t-PA et u-PA ont 6t6 propos6es au XXVIII Meeting de ~t The International Committee on Thrombosis and Haemostasis ~, Bergame, Italie, 27 Juiilet 1982.

Les 6tudes biochimiques de ces enzymes ont connu un essor consid6rable au cours des trois derni6res ann6es par suite de l'obtention de pr6paration pures [42-51]. Les structures primaires compl6tes de l'urokinase humaine et du t-PA produit par une culture de cellules de m61anome humain ont 6t6 61ucid6es dans les deux cas, & la

Activateurs du plasmhlogOne 1199

fois par s6quence de prot6ines [52-54] et par clonage de leur c-DNA [55, 56]. La pr6paration de t-PA recombinant [56] ouvre d'immenses espoirs en th6rapie thrombolytique [57]. Les caract6risti- ques int6ressantes de cette mol6cule, analys6es dans la revue [58], en font un candidat privil6gi6 pour combattre les thromboses art6rielles et veineuses [59-61], les embolies pulmonaires [62] et les infarctus du myocarde [63]. Les 6tudes cliniques intenses conduites actuellement visent proposer le t-PA comme agent th6rapeutique en remplacement de l'urokinase et de la streptokinase actuellement utilis6es.

Cette revue pr6sentera les donn6es biochimiques et physiologiques r6centes concernant les activateurs du plasminog6ne ainsi que l'arri6re- plan biochimique de la th6rapeutique thrombolytique sans toutefois traiter celle-ci.

Localisation et purification

Des activateurs du plasminog~ne ont 6t6 locali- s6s et caract6ris6s dans de tr6s nombreux tissus animaux et humains normaux [22, 45, 64, 65] tels que rembryon de Souris [66], de Ratte [67-69], de Trifle [70] et de Brebis [69], l'ut6rus humain [46,711, de Rat [72] et de Truie [73], la glande mammaire [38], le rein humain [74] et porcin [75], le c~ur de Pore [43], les h6patocytes [76] et les il6ts de Langerhans [77]. Le surnageant de certaines cultures de cellules normales en contient 6galement : endoth61ium vasculaire humain [78-80], bovin [81] et canin [821, neurones [83, 84], trophoblaste humain [85], 6pith61iums divers (peau, cesophage, vessie, thyro'/de) [84], aorte de b~euf [86], fibroblastes de poumon [84]. Une teneur 61ev6e en activateurs du plasminog~ne s'est r6v616e ~tre caract6ristique d'un certain nombre de tissus canc6reux [24]: tumeurs de poumons [24, 65], vessie [87], ovaires [88, 89], pancr6as [90], sein [24], cerveau [91]. Ces enzymes sont 6gale- ment pr6sentes dans le surnageant d'un certain nombre de cultures de cellules tumorales [84, 92] : fibroblastes de Souris transform6s [93], m61anome humain [47], cellules HeLa [94], vessie [95]. Enfin, elles ont ~t6 retrouv6es dans un certain nombre de s6cr6tions : urine (urokinase synth6tis6e par les cellules du rein), liquide s6minal [96], s6cr6tions ut6rines [73] et plasma [97, 98]. Le taux sanguin des activateurs augmente apr6s occlusion veineuse [991.

La purification des activateurs du plasmino- g~ne est difficile compte tenu de leur tr~s faible concentration dans les tissus et les fluides biolo- giques ainsi que de certaines de leurs propri6t6s •

hydrophobicit6, adh6rence tr~s importante aux fragments tissulaires. La pr6paration des activateurs du plasminog6ne n6cessite en g6n6ral l'utilisation de solutions fortement salines (thiocyanate de potassium), de tampons acides, ou de d6ter- gents (Triton X-100, Tween-80). Des 6tapes chro- matographiques ou d'immunoadsorption sont fr6quemment utilis6es. L'urokinase est un produit commercial obtenu h partir de l'urine humaine ou de milieux de culture de cellules de rein humain [44] dans lesquels renzyme est ~ concentration tr~s faible (10 b. 50 ng/ml). Par suite de difficult6s de purification, les pr6parations commerciales peuvent 6tre, dans certains cas, h6t6rog6nes. Des anticorps monoclonaux dirig6s contre la chaine 16g6re de l'urokinase ont 6t6 utilis6s avec succ6s pour purifier l'urokinase pr6sente dans l'urine, un milieu de culture ou un extrait d'E. coli[lO0]. Des pr6parations pures d'activateurs du plasminog~ne extraits de tissus ont 6t6 obtenues r6cemment partir de cmur de pore [42,49], de liquide de perfusion de vaisseaux sanguins [43], d'ovaire de truie [45], d'ut6rus humain [46]. Les activateurs contenus dans les surnageants d'une culture de cellules de m61anome humain Bowes [47, 48, 50, 101] et de cellules d'ad6nocarcinome de prostate (rat) [51] ont 6t6 ~galement obtenus ~ l'6tat pur. La pr6paration d'activateur ~ partir du surnageant de cultures de cellules Bowes s'est r6v616e ~tre d'une particuli6re importance. En effet, l'enzyme monochaine obtenue en pr6sence d'inhibiteurz de prot6ases est tr~s proche ou identique ~ l'activateur tissulaire isol6 de l'ut6rus humain [47, 50, 101]. Des diff6rences au niveau de l'extr6mit6 N-terminale ont 6t6 d6crites [102]. On peut cependant consid6rer que l'activateur s6cr6t6 par les cellules de m61anome est un activateur extrins~- que de type tissulaire. La culture de ces cellules a constitu6 une source d'activateur tissulaire permettant d'en obtenir des quantit6s suffisantes pour r6aliser des essais th6rapeutiques [48]. La pr6paration de l'activateur ~ partir de ce milieu de culture fait intervenir diff6rentes 6tapes chro- matographiques, utilisant [101] ou non [47] un immunoadsorbant. La forte affinit6 du t-PA pour la fibrine a 6t6 utilis6e dans certaines pr6parations (coeur de porc [49], plasma sanguin [97]).

Techniques de ddtection et de dosage

Seion les objectifs particuliers des exp6rimen- tateurs, diff6rents types de techniques sont utili- s6s. La production globale d'activateurs du plas- minog6ne par les tissus est, classiquement, d6- tect6e en 6talant directement les cellules ou des


parties aliquotes d'un milieu de croissance sur des films de fibrine; des mesures semi-quantitatives sont rendues possibles en utilisant de la fibrine marqu6e h l'iode-125 [103-108]. La m6thode d6crite par Shaw et coll. [I09] permet de rendre quantitative cette technique. I1 est n6cessaire d'6tre vigilant sur ia pr6sence 6ventuelle de facteurs susceptibles de modifier la validit6 du dosage [110, 111]. La technique des plaques de fibrine permet la localisation de l'activateur du plasminog6ne dans des coupes de tissus [112] ainsi que la d6termination de la production de cette enzyme par des cellules isol6es ou des petites colonies [113].

Les dosages utilisant les films de fibrine ainsi que la technique des films de cas6ine-agar [114] et de la guanidinobenzoate fluoresc6ine [115] ne d6truisent pas les cellules, permettant ainsi leur ~r6cup6ration apr+s analyse. Une autre technique I o

!class~que consiste ~ d6terminer, en fonction du !temps, le degr6 de lyse d'un caillot de fibrine ou d e plasma marqu6 h riode-125 [116, 1171. Les m6thodes zymographiques [118-120], en copoly- m6risant du plasminog6ne et un substrat de la

plasmine dans les gels de polyacrylamide, permet- :tent la d6tection d'activateurs de plasmin6g~ne avec une tr6s grande sensibilit6 ainsi que la d6termination de leur poids mol6culaire et de leur activit6 approximative.

Des dosages rapides, quantitatifs et sensibles sont r6alis6s ~ l'aide de substrats chromog6niques synth6tiques des activateurs eux-m6mes, ou par d6tection de l'activation du plasminog+ne ~ l'aide de substrats synth6tiques de la plasmine lib6r6e. A la premi6re cat6gorie appartiennent le H-D-VaI-Gly-L-Arg-p-nitroanilide (S-2322) [121], le H-Glu-Gly-L-Arg-p-nitroanilide (S-2227), le L-pyro Glu-Gly-L-Arg-p-nitroanilide (S-2444) [122], le H-D-Ile-Pro-L-Arg-p-nitroanilide (So2288), l'ester de p-nitroph6nyle de la L-lysine-t~-CBZ [123] et l'acide 5,5'-dithiobis(2-ni- trobenzoi'que) (DTNB), tr6s sensible [124]. Un substrat tr6s utilis6 appartenant h la deuxi~me cat6gorie est le H-D-Val-L-Leu-L-Lys-p-nitroanilide (S-2251) [125, 126]. Une autre technique tr6s sensible est bas6e sur la lib6ration d'une mol6cule fluorescente lors de l'hydrolyse de substrats fluo- rog6niques: CBZ-GIy-GIy-Arg-AMC [127] et CBZ-GIy-Pro-Arg-AEC [128]. Les m6thodes chromog6niques et fluorog6niques sont suffi- samment sensibles pour 6tre utilis6es au cours de la purification d'activateurs ou d'analyses cin6ti- ques. Des titrants de l'urokinase ont 6t6 d6crits : p'-guanidinobenzoate de p-nitroph6nyle (NPGB)

[129], p-guanidinobenzoate de 4-m6thylumbellif6- ryle (MUGB) [130] et FDE, diester de la fluo- resc6ine [131].

Des d6tections immunologiques et immunora- diom6triques ont 6t6 r6cemment mises au point pour l'urokinase et l'activateur tissulaire [132-1381.

Les activit6s des activateurs du plasminog6ne sont exprim6es en unit6s internationales (UI) en utilisant le ~ World Health Organization 1st In- ternational Reference Preparation of Urokinase )~ [46]. Un standard international pour le t-PA a 6t6 r~cemment propos6 [138a]. La comparaison entre diff6rents activateurs peut ~tre facilit6e en utilisant le substrat synth6tique S-2322 s61ectionn6 par AB KABI (Suede) pour les activateurs tissulaires.

Types moldculaires

Les extraits ainsi que les s6cr6tions de tissus humains et animaux contiennent des activateurs du plasminog6ne de poids mol~culaire variable (Mr, 30 000-200 000) [22]. L'obtention d'anticorps sp6cifiques dou6s de propri~t6s inhibitrices diri- g6s contre des activateurs purifi6s (urokinase et activateur tissulaire) a permis de caract6riser chez l'homme deux types d'activateurs, distincts sur le plan immunologique: les activateurs de type urokinase (u-PA) et de type tissulaire (t-PA) [84, 132, 133]. Sauf en ce qui concerne l'activateur s6rique d6pendant du facteur de Hageman, tous les activateurs connus appartiennent h l'un ou l'autre de ces deux cat6gories. Dans le groupe des u-PA, les enzymes d'un poids mol6culaire approximatif de 58 000 et 33 000 pr6dominent. Des esp6ces de poids mol6culaire de 46 000 et 100 000 sont 6galement observ6es [84]. C'est le cas pour l'urokinase elle-mfime off des formes de tr~s haut poids mol6culaire (100000 ~ 200000) ont 6t6 trouv6es dans des cultures pr~coces de tissus ainsi que dans l'urine fraichement 6mise. Ces formes constitueraient un proactivateur qui est trans- form6 en urokinase active apr~s incubation en pr6sence de faible quantit6 de prot6ases [139, 140]. L'urokinase ~ classique, de haut poids mol6culaire (54000) ou H-UK est transform6e par prot6olyse limit6e en urokinase ~ classique )~ de bas poids mol6culaire (33 000) ou L-UK [141], chacune de ces deux enzymes ~tant constitu6e par deux chaines polypeptidiques li6es par un pont disulfure (Fig. 1). En pr6sence d'inhibiteuss de prot6ases (aprotinine ou benzamidine), une urokinase de haut poids mol6culaire h cha~ne unique (56 000) a 6t6 isol6e de I'urine [142]. La pr6sence

F

Domaine du facteur de "Kringle" croissance

REDUCTIONs/~

Activateurs du plasminogOne

Hydrate de Carbone

I 198

0 ~ Asn 144

:-=-~Phe 157

B

H - U K

Al-Phe 157 . PROTEOLYSE x ~ Phe 157

B

1201

+ i L - U K A _ S A 1

d-

FiG. I. -- Reprdsentation schdmatique de I'urokinase humaine (double chaine) de haut (H-UK) et de bas (L-UK) poids moldculaire. La position de l'histidine du centre actif (His 46) est not6e ainsi que celles pr6sum6es de l'aspartate (Asp 97) et de la sfrine

(Ser 198) de la triade catalytique. La fl~che indique le site de coupure prot~olytique conduisant ~ L-UK ,h partir de H-UK. Par r6duction, les deux chaines A et B de H-UK sont lib~r6es.

de proenzymes inaetives de rurokinase est d6- montr6e dans quelques syst6mes [143, 144]. Les aetivateurs de type tissulaire sont repr6sent6s le plus souvent par des mol6cules de poids mol6- eulaire 72 000 daltons avee, en quantit6 moindre, des enzymes d'un poids mol6eulaire approximatif de 115 000, 68 000 et 38 000 [84]. Dans certains cas [46, 145, 146], le t-PA obtenu pr6sente deux chaines li6es par un pont disulfure. Un aetivateur monochaine a 6t6 obtenu en perfusant un vais- seau sanguin par un tampon eontenant de l'arginine [43]. Wall6n et coll. [49] ont montr6 que raetivateur h double ehaine de eceur de pore se formait par d6gradation prot6olytique de l'aetivateur monochaine. En pr6sence d'inhibiteurs de prot6ase (aprotinine, acide 6-amino-hexanoique), la forme monochaine est obtenue.

Un m~me tissu ou une m6me lign6e cellulaire peut s6er6ter des activateurs appartenant aux deux eat6gories [66, 80, 81, 96, 147, 148]. Cette possibilit6 de synth~se de deux types d'activateurs du plasminog~ne par la m6me eellule peut au-

jourd 'hui ~tre explor6e par la mise en 6vidence, l 'aide des deux sondes cADN u-PA et cADN

t-PA, des mARN correspondants. Dans le plasma, des activateurs de type urokinase [93, 149] et de type tissulaire [150] ont 6t6 identifi6s. En effet, l 'activateur sanguin, lib6r6 par la paroi vasculaire (activateur vasculaire), repr6senterait la m6me mol6cule que ractivateur tissulaire [150]. Les activateurs de type urokinase sont souvent pr6- sents de faqon pr6dominante dans les tumeurs et les surnageants de culture de cellules malignes [65, 84, 142, 151, 152].

Spdcif ici td

Les aetivateurs du plasminog~ne sont caract6- ris6s par une sp6cifieit6 tr~s &roite : ils catalysent rhydrolyse d 'une seule liaison peptidique Args60-Va156~ de leur substrat naturel, le plasmino- g~ne, glyeoprot6ine constitu6e d 'une seule chaine polypeptidique d'un poids mol6eulaire voisin de 92 000 [8-11]. Le m6canisme mol6eulaire de l'acti-

1202 ~L Reboztd-Ravaux

GIt,

UK P M G - G l u I = PM-Glu 1

[PM I ~ G I u I -Lys 76 G I u 1-Lys 76

+ UK + PMG-Lys77 ~ PM-Lys77

.a. B

FIG. 2. -- A) ModUle pour la moldcule de plasminog~ne humain d'apr~s Wiman [148]. Les ponts disulfures sont repr&ent6s par des barres. Les liaisons Arg_,~Valset, sp6cifiquement coup& par les activateurs du plasminog6ne, et Lys76-Lys,, couple par la plasmine, sont indiqu6es (=. et ~ , respectivement). La plasmine r6sultante (PM-Lys,) est constitu6e d'une chaine lourde (O o o) prfisentant 5 structures en triple boucle ou (( kringles ~) et d'une chaine Idg~re (o • o) porteuse du centre actif. Les positions suppos6es des acides aminfs de la triade catalytique (acide aspartique, histidine, s6rine) sont repr6sent6s respectivement par D. H et S. Le peptide Glu~-Lys76 (* * *) est 61imii16. B) Conversion, catalys& par I'urokinase (UK), du plasminog~ne (PMG) en plasmine (PM) d'apr~s Summaria et al. [91 et Violand et Castellino [101.

vation du plasminog6ne par l 'urokinase est r6- sum6 dans la Figure 2 (A, B) [9, 10, 1531. L'urokinase catalyse l 'hydrolyse de la liaison Arg560-Va156z du plasminog6ne poss6dant en position N-terminale un r6sidu glutamyle (not6 PMG-Glu0. La plasmine PM-Glu, obtenue est instable et est transform6e, de faqon autocatalytique [I0] par suite de la coupure de la liaison Lys76-Lys77, en plasmine PM-Lys77 alors que le peptide Glu~-Lys76 est lib6r& La plasmine PM-Gluz et (ou) la plasmine PM-Lys77 sont aussi capables de couper la liaison Lys76-Lys77 du plasminog6ne PMG-GIu, conduisant au plasminog+ne PMG-Lys77. Celui-ci peut alors ~tre converti en plasmine PM-Lys77 par l 'urokinase. Un m6canisme analogue serait impli- qu6 pour les autres activateurs extrins6ques. Le's activateurs du plasminog6ne catalysent 6galement l 'hydrolyse des substrats synth6tiques, esters ou amides de l 'arginine ou de ia lysine [121-128].

Structure et biologie moldculaire

L'activateur tissulaire ( M r - 7 0 000 [47]) isol6 du milieu de culture de m61anome humain est une glycoprot6ine constitu6e d 'une seule chaine poly-

peptidique lorsqu'elle est isol6e en pr6sence d'inhibiteurs de prot6ases. La s6quence des 527 acides amin6s (Fig. 3) a 6t6 d6termin6e par analyse du eDNA correspondant [56], des extr& mit6s N-terminales [50] e t a 6t6 confirm6e par 61ucidation de la s6quence de la mol&ule prot6i- que [54]. Un fragment plus court de eDNA avait 6t6 pr6alablement clon6 [154]. En pr6sence de plasmine ou de trypsine, la mol6cule est coup6e au niveau d 'une seule liaison peptidique de la r6gion centrale (Arg27s-Va1276) [101], concluisant fl la formation de deux chaines polypeptidiques li6es par un seul pont disulfure. Ces chaines A ( M , - 4 0 000) et B ( M , = 3 0 000) correspondent aux r6gions N- et C-terminales, respectivement. Le t-PA monochaine poss~de une activit6 ami- dolytique et est inactiv6 par le f luorophosphate de diisopropyle (DFP) [155, 156]. I1 ne constitue done pas un proenzyme au sens classique du terme. L'enzyme isol6e du milieu de culture de cellules de m6lanome existe sous deux formes qui peuvent &re s6par6es par gel d'6lectrophor6se 6n pr6sence de SDS et qui sont caract6ris6es par des poids mol6culaires de 63 000 et 65 000 [47, 56]. La diff&ence observ6e entre les poids mol&ulaires

A c t i v a t e u r s d u p la smh togOne

"Kringles"

I" \

1203

Domaine du facteur de croissance

o ) 0 0 0

0 ' 0 0 o o

O. o o

Domaine en doigt

Ser 478

Peptide . ~ signal et s~quence"pro'

G l y - 3

Asp 371

FIG. 3. -- Repr6sentation sch6matique du pr6curseur du t-PA humain d'apr~s Pennica et al. [56]. Bfnyai et al. [159] et Ny et al. [162]. Les barres indiquent les positions potentielles des ponts disulfures et les losanges les sites potentiels de glycosylation. Les extr6mit6s N-terminales des formes Let S sont respecti~:ement Gly-3 et Ser,. Les positions attribu6es aux acides amin6s de la triade catalytique (AspaTt; His3:: et Ser4:~) sont rep6r6es. La fl~che indique le site de coupure Arg.,75-11e:Tb conduisant .~ la formation des chaines lourdes et 16g~res.

de ces variants (nomm6s I e t II selon leur ordre d'61ution fi la sortie d 'une colonne d'arginine- S6pharose [50]) r6side dans la chaine A [50] sans que puisse 6tre invoqu6e une d6gradation de l'extr6mit6 N.terminale [50, 157]. Pohl et coll. [54] ont montr6.que les cartes peptidiques trypsiques obtenues par HPLC pour les deux variants diff6rent par l'61ution d 'un seul peptide. Ce peptide contenant un site potentiel de N-glycosylation (Asni84), les auteurs ont conclu qu 'une glycosylation diff6rente au niveau de ce peptide serait responsable de la diff6rence de taille obser- v6e. Des hydrates de carbone ont 6t6 trouv6s dans deux autres positions (Asn,t7 et Asm48); le qua- tri~me site potentiel de glycosylation, Asn2,s, n'6tant apparement pas utilis6 [54].

La chaine B contient le centre actif et pr6sente une homologie structurale importante (30 ~ 35 %) avec les autres prot6ases ~ s6rine (trypsine, chymotrypsine, plasmine et facteur X) [56, 157]. Les

s6quences au voisinage de la triade catalytique Asp I His I Ser sont tr6s conserv6es par rapport ~t la trypsine et fi la chymotrypsine [157] et les positions 371, 322 et 478, respectivement, ont 6t6 attribu6es aux amino-acides correspondants. La chaine A pr~sente un certain nombre de caract6- ristiques structurales retrouv6es chez d'autres prot6ines plasmatiques. Elle poss~de deux arran- gements typiques faisant intervenir chacun trois ponts disulfures (Fig. 3) ou <( kringles , , analogues fi ceux retrouv6s dans la prothrombine [158], dans le plasminog~ne ( , kringles )> 4 et 5) [159] et dans la chaine A 16g~re de rurokinase HoUK [53]. Dans la mol6cule de plasminog6ne, les (t kringles >> pr6sentent de l'affinit6 pour les acides o~-aminocarboxyliques et sont responsables de l'affinit~ pr6sent6e par cette mol6cule pour la fibrine [159-163]. La r6gion in ter - t (kr ingle , et celle situ6e entre ceux-ci et la liaison disulfure interchaine sont d6pourvues de sites susceptibles


d'6tre coup6s par la plasmine (r6sidus lysine ou arginine). I1 existe 6galement une homologie entre la r6gion 53-90 de la chaine A du t-PA et le facteur de croissance 6pith61ial murin et humain [164]. Les tissus tumoraux produisant en g6n6ral plus d'activateurs du plasminog6ne que les tissus normaux correspondants [92], il a 6t6 sugg6r6 que cette s6quence N-terminale pourrait jouer un feed-back positif et stimuler la croissance tumorale. Enfin, la chaine A poss~de un domaine homologue des structures ~t en doigt~ de la fibronectine [164]. L'affinit6 de la fibronectine pour la fibrine a ~t6 corr~l~e ~ la pr6sence, dans la fibronectine, de neuf domaines ~ en doigt ~) [165]. L'existence de sites potentiels pour la fixation de la fibrine ~ la fois darts le domaine , en doigt ~ et dans les kringles pose le probl6me de l 'importance, pour la fixation h~ vivo sur la fibrine, de chacun de ces deux types de structure.

Une h6t6rog6n6it6 au niveau de rextr6mit6 N-terminale a 6t6 observ6e pour la mol6cule de t-PA monochaine [47, 166]. Environ 50% [166] (5 % dans certaines pr6parations [157]) des mol6- cules de t-PA secr6t6es par les cellules de m61a- home (formes L) pr6sentent 3 r6sidus amino- acides suppl6mentaires HEN-Gly_3-Arg_2-Arg_~ (Fig. 3) par rapport aux autres mol6cules pr6- sentes (formes S). La plasmine, dont l'action g6n~re le passage du t-PA h simple chaine au t-PA

double chaine, catalyse 6galement la coupure Arg_~Ser~ conduisant ~ une chaine A toujours de type S. On ne salt pas actuellement si c'est effectivement la plasmine qui joue un r61e dans la conversion physiologique de la forme L ~ la forme S. Un activateur tissulaire de type U r6sultant d 'une coupure Gin3-Val~ (en se basant sur la num6rotation de la chaine de type S) a 6t6 trouv6 dans le tissu ut6rin [102]. On observe la m6me h6t6rog6n6it6 au niveau du tripeptide N-terminal par les deux variants I et II de m6Ianome. Un 6change Ser /Gly en position Ser~ serait 6galement possible [101].

La structure du g6ne du t-PA humain a 6t6 d6termin6e [167]. I1 est form6 d'au moins 14 exons et de I3 introns, les exons codant vraisemblable° ment pour des domaines structuraux et fonction- nels. Ce sont des exons s6par6s qui codent pour le peptide signal, le propeptide, les domaines homologues au facteur de croissance et ~ la structure ~ en doigt ~ de la fibronectine. Chaque boucle triple (ou tt kringle ~) est cod6e p a r ' u n exon diff6rent. Les domaines ~ en doigt ~ de la fibronectine et du t-PA ont probablement 6volu6 ~t partir du m6me g6ne ancestral [167].

Les 35 acides amin6s pr6c6dant la chaine mature S dans le t-PA double chaine ( - 3 5 h - 1) comprennent le peptide signal dont la taille n'est pas connue (12 ~ 15 acides amin6s) suivi d 'une s6quence hydrophile analogue au segment ~ pro ~ de la s6rumalbumine puis des trois acides amin6s ( - 3 h - l ) responsables de l'h6t6rog6n6it6 N- terminale des chaines matures [56, 167]. La coupure par la peptidase signal se fait probablement du c6t6 carboxylique de la s6rine - 1 5 ou - 1 3 . La s6quence Phe_6-Arg_s-Arg_4 est analogue celle terminant le segment tt pro )~ de la s6rumal- bumine [167]. Comme pour les autres prot6ases, la chaine 16g~re Best cod6e par une r6gion divis6e en 5 exons par 4 introns. Cette structure conserv6e intron-exon au niveau du g~ne s 'accompagne de r6gions conserv6es d'acides amin6s homologues dans les structures [168].

Les urokinases classiques H-UK et L-UK sont des glycoprot6ines [169] constitu6es de deux chaines polypeptidiques li6es par un pont disulfure (Fig. 1). Leur structure primaire a 6t6 compl~- tement d6termin6e [51, 52, 170]. Les deux chaines A (157 acides amin6s, M r - 20000) et B (253 acides amin6s, M r - 30 000) de H-UK peuvent ~tre s6par6es par r6duction du pont disulfure intercha~ne [171]. La cha~ne B contient le centre actif et pr6sente 30 h 40% d'homologie avec d'autres prot6ases h s6rine (plasmine, trypsine, kallikr6ine, thrombine [52] et t-PA [157]). Sur la base de cette importante homologie, les positions de la s6rine, de l'histidine et de l'aspartate du centre actif ont 6t6 attribu6es aux loci 198, 46 et 97, respectivement, et les ponts disulfures intra- et interchaines ont 6t6 localis6s [52]. L'asparagine 144 est glycosyl6e. H-UK et L-UK poss~dent la m~me chaine B (taille, composition en acides amin6s, contenu en hexosamine, s6quences N- et C-terminales identiques [170], Figure l). La diff6- rence observ~e entre ces deux enzymes r6side dans leur cha~ne 16g6re [170] puisque la transfor- mation de H-UK en L-UK est le r6sultat d 'une prot6olyse limit6e localis6e au niveau de la chaine A (Fig. I). La chaine A~ r6sultante (21 acides amin6s) est donc enti6rement contenue dans la chaine A de H-UK. La comparaison avec d'autres prot6ines a permis de distinguer trois domaines dans la chaine A de H-UK [52]. La r6gion du peptide de connection [152-157] contient la chaine A~ et le pont disulfure interchaine. La s6quence de la r6gion centrale [50-131] pr6sente 41% d'homologie avec le ~t kringle ~ 5 du plasmitio- g6ne humain. Enfin, la r6gion N-terminale pr6- sente, comme chez le t-Pa, une homologie de s6quence avec le facteur de croissance 6pith61ial

Activateurs du plasminogOne 1205

murin. Les facteurs 6pith~liaux ~tant consid6r6s comme des produits de d6gradation des prot6ases /~ s6rine [172], la r6gion N-terminale de la chaine A pourrait ~tre un facteur de croissance de fonction inconnue [52].

Le g~ne de rurokinase humain a 6t6 r6cem- ment clon6 et exprim6 dans E. coli[551. Le produit purifi6 de traduction est une urokinase active /~ double chaine [55] mais une forme monochaine peut 6tre obtenue si la d6gradation prot6olytique est 6vit6e en cours de purification. Les s6quences de fragments de cDNA isol6s correspondent exactement aux donn6es obtenues par s6quence de prot6ine [173]. Le cDNA de rurokinase humaine code pour un pr6zymog~ne, d'un poids mol6culaire de l'ordre de 50 000 constitu6 d'une seule chaine. Par coupure du peptide signal dans ia r6gion N-terminale, on obtient rurokinase monochaine. Celle-ci, par enl6vement de la lysine en positioln 158, est transform6e en urokinase H-UK co/npos~e des chaines A et B d6crites pr6c6demment [174]. Le clonage du cDNA de rurokinase humaine a donc permis d'6tablir la relation existant entre les formes monochaines de l'urokinase pr6c6demment isol6es [139, 140, 142-144, 174-1771 et H-UK. L'urokinase obtenue par recombinaison g6n6tique (Rec-UK) pr6sente des propri~t6s structurales, physicochimiques et fonctionnelles analogues /~ celles de l'urokinase extraite de rurine [178, 179]. Des cartes peptidiques de l'urokinase avaient 6t6 au pr6alable r6alis6es [93, 180, 181] et avaient effectivement sugg6r6 qu'un m6me g~ne 6tait impliqu6 dans le codage de H-UK et L-UK [181].

Centre actif

Les activateurs du plasminog6ne sont des prot6ases /t s6rine comme le montre leur inacti- vation par le DFP ou le p'-guanidinobenzoate de p-nitroph6nyle [155, 156, 182, 183]. La pr6sence d'une histidine dans le centre actif a 6t6 d6mon- tr6e en utilisant des chlorom6thylc6tones peptidiques [184]. La localisation de cette histidine en position 46, sugg6r6e sur ia base d'homologie de s6quence avee les autres prot6ases /l s6rine [52, 185], a 6t6 prouv6e par traitement de H-UK par un r6actif suicide marqu6 (dihydro-3,4-di- bromo-3,4-bromom6thyl-6-coumarine) [186]. Les peptides marqu6s obtenus apr6s digestion pepsi- que de l'urokinase modifi6e ont 6t6 s6quenc6s. L'utilisation de r6actifs ¢( suicide )) [186], de chlo- rom6thyic6tones peptidiques [187] et de sondes fluorescentes [188] ont permis ranalyse du centre actif de l'urokinase. L'efficacit6 du marquage par

affinit6 r6alis6 par des chlorom6thylc6tones peptidiques d6riv6es de l'arginine varie de mani~re importante selon la nature de l'acide amin6 fix6 au niveau des sous-sites $2 et Sj [187]. Les marqueurs les plus efficaces pr6sentent (comme le substrat physiologique, le plasminog~ne) un r6sidu glycyle en P2. Les sites primaires de fixation des substrats pour H-UK et L-UK sont consid6rablement plus apolaires que le site correspondant de la trypsine [188]. Effectivement, un d6riv6 halom6thyl6 de dihydrocoumarine porteur d'un substituant benzylique s'est r6v616 ~3tre d'une remarquable efficacit6 dans rinactivation de ces deux enzymes [186]. Le sous-site Sa jouerait un r61e dans la s61ectivit6 et la grande sp6cificit6 des activateurs du plasminog6ne [188]. De petites diff6rences d'accessibilit6 au solvant ont 6t6 d6crites entre les deux formes H-UK et L-UK; elles pourraient expliquer les diff6rences d'activi- t6s observ6es dans certains cas entre ces deux types mol6culaires [181, 189].

Activitd. b~uence de la fibrine Des cin6tiques d'activation du plasminog~ne-

Glul et/ou du plasminog~ne-Lys77 par I'urokinase ont 6t6 r6alis~es [189-1921. De grandes variations sont observ~es dans les valeurs trouv6es pour les param~tres cin6tiques de l'activation du plasminog~ne-Glu~ (de 1,7 ~t 200 I-tM pour la constante de Michaelis par exemple) [189-191]; ceci peut probablement s'expliquer par la formation non d6tect6e de plasminog6ne-Lys, et de sa transfor- mation ult6rieure en plasmine (Fig. 2B). L'activation du plasminog6ne par le t-PA [193, 194] et le t-PA recombinant [195] a 6galement fait I'objet d'6tudes cin6tiques.Le t-PA et l'urokinase pr6sen- tent des diff6rences d'activit6 vis-h-vis de certains petits substrats peptidiques [196]; ractivit6 fibrinolytique du t-PA est 10 fois sup6rieure h celle de rurokinase [117]. Des activit6s identiques ont 6t6 trouv6es pour la catalyse de l'hydrolyse par H-UK et L-UK de substrats synth6tiques: CBZ-lysinate de p-nitroph6nyle [123], pyroGlu- GIy-Arg-AMC [197] et CBZ-GIy-GIy-Arg-AMC (Reboud-Ravaux, non publi6). Par contre, H-UK est plus active dans la conversion plasminog~ne- plasmine [1981 et dans la lyse du caillot [199, 200] et pr6sente une affinit6 plus grande pour le plasminog~ne [197]. Par r6duction douce et alky- lation de la liaison disulfure interchaine de H-UK, - la chaine polypeptidique not6e H (Mr - 31 000) pr6sente des param6tres cin6tiques pour l'activation du plasminog~ne-Glul identiques ~ ceux de L-UK [201]. Une m~me activit6 fibrinolytique (d6tect6e par la technique de la lyse

1206 l~L Reboud-Ravaux

du caillot) a 6t6 observ6e pour H-UK native, Rec-UK et Rec-pro-UK [202], le t-PA demeurant plus efficace [1171. Au contraire, l'urokinase monochaine pr6sente une activit6 thrombolytique sup6rieure fi celle de H-UK [178, 203].

De faqon remarquable, des modifications dans l'activit6 des activateurs du plasminog6ne peuvent ~tre observ6es en pr6sence de fibrine, ou de son pr6curseur le fibrinog~ne, ou de fragments de fibrine [200, 204-206]. Ainsi l'activation du plas° minog6ne par le t-PA est consid6rablement acc6- 16r6e en pr6sence de fibrine [155, 193, 194, 207, 208]. En effet, contrairement aux activateurs de type urokinase [209], une des caract6ristiques du t-PA est sa forte affinit6 pour la fibrine [209, 210]; par des d6terminations cin6tiques et des 6tudes de fixation directe, on trouve que le Kd vaut 150 nM [58, 155]. Les t-PA monochaine et ~ double chaine isol6s /~ partir d'une culture de cellules de m61anome sont adsorb6s de faqon identique sur des caillots purifi6s de fibrine; leurs propri6t6s activatrices du plasminog~ne sont alors analogues [155, 193] alors qu'en absence de fibrine, le t-PA monochaine est 2/~ 10 fois moins efficace que la mol6cule h double chaine [193, 211]. Des 6tudes c!n6tiques ont montr6 que la constante KM pour l'activation du plasminog~ne-Glu~ par le t-PA double chaine 6tait consid6rablement diminu6e en pr6sence de fibrine [193, 194] tandis que le kcat 6tait non modifi6 [194] ou augment6 I193]. De toute manihre, l'activation, h~ vitro du plasmino- g~ne est acc616r6e d'un facteur variant de 10 ~ fi 10 ~ en pr6sence de fibrine. Cet effet est expliqu6 par le fait que, h la fois, le plasminog6ne [207, 209] et le t-PA se fixent sur la fibrine. I1 faut d'ailleurs remarquer qu'en pr6sence de plasminog6ne-Glu~, l'affinit6 du t-PA pour Ia fibrine augmente consi- d6rablement. De m~me, Ia fixation du plasmino- g~ne sur Ia fibrine est plus forte en pr6sence de t-PA. L'adsorption sur la fibrine induirait des changements conformationnels au niveau du plasminog6ne et du t-PA; la fibrine faciliterait ainsi l'activation du plasminog6ne par alignement de l'enzyme avec son substrat [194]. Le fibrino- g~ne au contraire, ne provoque qu'une faible augmentation de l'activation du plasminog~ne; en sa pr6sence, la constante de second ordre corres- pondante est augment6e de 10 (au lieu de 600 en pr6sence de fibrine) [194]. Si le fibrinog~ne a 6t6 pr6alablement dig6r6 par le bromure de cyano- g~ne [195], l'efficacit6 catalytique du t-PA est augment6e d'un facteur de 1800. L'identification du site de la fibrine (du fibrinog6ne) impliqu6 dans cette acc616ration (fragment FCB-2) a 6t6 r6alis6e [212, 213].

L'activation du plasminog6ne par l'urokinase est faiblement augment6e en pr6sence de fibrino- g~ne [192, 205, 206] (facteur 4 pour kcat/KM [192] en pr6sence de fibrinog6ne, facteur 2 en pr6sence du fragment E obtenu par coupure plasmique du fibrinog~ne). Ces r6sultats sont du m6me ordre de grandeur que ceux observ6s pour kcat/K.~t (facteur 10) lors de l'activation du plasminog6ne-Glut par H-UK Iorsqu'elle se produit en pr6sence de fibrinog6ne dig6r6 par le bromure de cyanog6ne [214], c'est-h-dire tr6s inf6rieurs ~ ceux obtenus dans des conditions analogues avec le t-PA [195]. Bien qu'une augmentation ait 6t6 observ6e dans certains cas [207, 208], il est largement admis que l'urokinase ne voit pas son activit6 augment6e en pr6sence de fibrine [204, 210]. Ceci constitue une diff6rence majeure par rapport h l'activateur tissulaire, qu'il soit natif ou recombinant. Le t-PA recombinant d6pourvu d'hydrate de carbone est cependant actif [56].

Le t-PA natif d6glycosyl~ pr~sente la propri~t6 typique des t-PA, c'est-h-dire la facult6 d'activer le plasminog~ne uniquement en pr6sence de fibrine [215]. Ainsi, Faction du t-PA va-t-elle 6tre

essentiellement dirig6e vers la lyse de la fibrine [12, 216]. En effet, lorsque la fibrine est form6e, une petite quantit6 du plasminog6ne circulant (2 laM) s'y fixe sp6cifiquement par l'interm6diaire de ses sites de fixation ~t lysine ~. Le t-PA pr6sent dans le sang ou lib6r6 h partir de l'endoth61ium vasculaire est adsorb6 ~ la surface de la fibrine et active le plasminog~ne adsorb6. La plasmine form6e, toujours adsorb6e sur la fibrine, la d6- grade: son site actif 6tant occup6, elle r6agit lentement avec l'ctz-antiplasmine circulante. Au contraire, lorsqu'elle est lib6r6e de la fibrine dig6r6e, elle est rapidement et irr6versiblement neutralis6e par l'ctz-antiplasmine circulante [216]. L'activation du plasminog~ne fix6 sur la fibrine par le t-PA lui-m~me adsorb6 sur la fibrine constitue un premier niveau de r6gulation de la fibrinolyse physiologique: en se fixafit sur la fibrine, le t-PA, peu efficace dans des syst6mes purifi6s, voit son activit6 consid6rablement aug- ment6e. Au contraire, dans la th6rapie thrombolytique par l'urokinase (ou la streptokinase), l'activation du plasminog~ne se produit dans la phase liquide plut6t qu'~ la surface de la fibrine. Un autre niveau de r6gulation est constitu6 par le couple plasmine/ct2-antiplasmine. L'ct2-antiplasmine (glycoprot6ine monochaine, Mr-70000, 1 l.tM dans le plasma) fixe rapidement la plasmine circulante (demi-vie de 100 ms) [216] et prot6ge le fibrinog6ne de la d6gradation. L'activation du plasminog~ne au niveau de la fibrine peut 6tre

Actirateurs

emp6ch6e ou retard6e par l'a~-antiplasmine selon deux voies [217]. L'u~-antiplasmine en se com- plexant au plasminog~ne peut inhiber la fixation du plasminog6ne sur la fibrine, donc diminuer la quantit6 totale de plasminog~ne ii6. D'autre part, i'ct~-antiplasmine peut se fixer de mani6re cova- lente sur la fibrine (0,2 ~M d'inhibiteur fix6 pour un plasma normal coagul6) et inhiber ainsi la plasmine g6n6r6e. Enfin, une r6gulation a lieu au niveau des m6canismes contr61ant la lib6ration des activateurs du plasminog6ne par les cellules de l'endoth61ium vasculaire [218]. Une lib6ration anormale de l'activateur vasculaire par ces cellules a 6t6 d6crite chez des families pr6sentant une forte tendance aux thromboses et aux h6morrha- gies [219, 220]. Des plasminog6nes anormaux sont 6galement responsables de thromboses r6curren- tes [221-224].

hlhibition

Les activateurs du plasminog~ne sont susceptibles d '6tre inhib6s r6versiblement par un certain nombre dqnhibiteurs synth6tiques charg6s, tels que la benzamidine [225], propri6t6 qui a d'ailleurs 6t6 utilis6e pour r6aliser des chromatogra- phies d'affinit6 lors de la purification d'activateurs du plasminog6ne [226]. Ces enzymes peuvent ~tre inactiv6es par le DFP, le NPGB [182, 183], des marqueurs d'affinit6 [187, 227] et des substrats suicide [186, 228].

Des inhibiteurs naturels, en particulier certains inhibiteurs plasmatiques des prot6ases, sont capables d'agir sur les activateurs du plasminog6ne [137, 229, 230]. Le t-PA [230, 231] et l 'urokinase [232] r+agissent rapidement avec I'az-antiplasmine (avec une constante de vitesse de 60 et 130 M -t s -t pour le t-PA monochaine et double cha~ne, respectivement). Une interaction plus lente du t-PA avec l'ct2-macroglobuline a 6t6 observ6e [230,231]. L'urokinase se fixerait de faqon non sp6cifique, probablement par interaction 61ectrostatique, sur l'ctz-macroglobuline [233] et forme un complexe stoechiom6trique avec l'ct~-antitrypsine [234]. La dur~e de vie du t-PA inject+ in vivo est tr/~s courte (2 h 5 minutes) [235,236] et ne peut 6tre expliqu6e par l 'action des inhibiteurs connus des prot6ases qui est trop lente. Une accumulation h6patique a 6t6 invo- qu6e. Cependant, r6cemment, un inhibiteur plasmatique labile en milieu acide et h action extr~- mement rapide a ~t6 d6crit [58, 237-239]. Cet anti-activateur r6agit avec le t-PA avec une constante de vitesse de l 'ordre de 107 M -~ s -~ [58, 237, 238]. Le poids mol6culaire de cet inhibiteur,

du plasmhTogOne 1207

qui peut 6galement r6agir avec l'urokinase, est de 40 000 environ [240]. Sa concentration plasmatique est faible (de 0,5 ~ 3 nM [58]) mais des cas off sa concentration est plus 61ev6e ont 6t6 d6crits [241]. Des inhibiteurs tissulaires des activateurs du plasminog~ne ont 6galement 6t6 mis en 6vi- dence [73, 242-246]. En particulier, Loskutoff et coll. [245,246] ont isol6 et purifi6 un inhibiteur (anti-activateur) h partir de cultures de cellules endoth61iales vasculaires. Particuli~rement stable dans des conditions d6naturantes, cet inhibiteur tissulaire (Mr N 50 000), produit majoritairement par ces cellules, neutralise les deux formes d'activateurs qu'elles secr6tent (u-PA et t-PA) [81] (ce qui met en 6vidence la complexit6 du potentiel fibrinolytique des cellules endoth61iales). Les inhibiteurs tissulaires agissent donc intracellulai- rement en ~t pi6geant >> ies activateurs du plasmi- nog6ne avant qu'ils ne soient secr6t6s; des com- plexes de grande stabilit6 peuvent ainsi ~tre form6s. Un inhibiteur d'origine v6g6tale extrait d 'Erythrina latissima (Mr - 20 000) [247] inhibe le t-PA sans inhiber l 'urokinase; il peut ~tre utilis6 pour la purification du t-PA. Enfin, des inhibiteurs d'activateurs du .plasminog~ne ont 6t6 d6- cel6s dans les tumeurs [248,249] et une bonne corr61ation entre la quantit6 d'inhibiteurs pr6sents et de degr6 de malignit6 des tumeurs de la vessie a ~t6 d6crite [249].

Aspects physiologiques

Le plasminog+ne circulant, repr6sentant environ 0,5 % des prot6ines plasmatiques, constitue un v6ritable r6servoir d'activit6 prot6olytique poten- tielle. II est largement admis que son activation par les activateurs du plasminog6ne (produits par une grande vari6t6 de cellules normales) consti- tuerait un processus de prot+olyse extracellulaire iocalis6e tr~s r6pandu [5]. Les activit6s biologi- ques associ6es h ce m6canisme impliquent en g6n6ral un remodelage tissulaire, une invasion ou " une migration cellulaire [38, 39]. On peut en effet citer rintervention d'activateurs du plasminog6ne dans l'ovulation [I07], l ' implantation du trophoblaste [31, 69, 85], les processus d'inflammation [250, 251] et de diff6renciation [32], rinvolution de la glande mammaire [38], l 'invasion par les fibroblastes [2521, la migration neuronale [78, 253]. La plasmine lib6r6e sous r inf luence.des activateurs du plasminog~ne joue un r61e important clans di'verses fonctions circulatoires: mainte- nance du lit vasculaire par dissolution de caillots via le syst6me fibrinolytique du plasma [12], conversion de prohormone [254] et des formes


proenzymes des activateurs du plasminog~ne eux-m6mes [255]. La pr6sence d'activateurs du plasminog~ne associ~s aux fibroblastes du poumon contribuerait au maintien d'alv6oles bien a&&s.

Un r61e majeur est attribu~ aux activateurs du plasminog~ne dans l 'augmentation ~ court terme du pouvoir fibrinolytique [256]. Le t-PA (dou6 d'une forte affinit6 pour la fibrine) volt son taux plasmatique varier avec I'activit6 fibrinolytique [134, 150, 257, 258]; il serait done majoritairement responsable des variations physiologiques du pouvoir fibrinolytique du plasma. Chez des vo- lontaires a u repos, des concentrations plasmatiques tr~s faibles, voire nulles (<0,05 unit~ de UK/ml), ont ~t~ trouv&s pour le t-PA libre [259] alors que la concentration de I'antig~ne t-PA d&ermin6 par des m&hodes radioimmunom~triques sont de l'ordre de 0,3 h 1 unit6 d 'UK/ml [137]. La presque totalit~ du t-PA est done, au repos, complex~e avee i'anti-activateur :~ action rapide [237, 260]. II est habituellement admis que le t-PA sanguin est d'origine vaseulaire [261]. Sa lib&ation :~ partir de l'endoth~iium vaseulaire est stimul& par un certain nombre de facteurs parmi lesquels I'exercice [258], I'adr6naline [262], un stress mental important [263], l'occlusion veineuse [150, 264, 265], l'injection de substances vasocons- trictrices (vasopressine et un de ses analogues, la d~samino 8-D-arginine vasopressine ou DDAVP) [263, 265, 266]. Par suite de la faible concentration de l'anti-activateur ~ action rapide, la concentration du t-PA iibre apr~s les stimulations d&rites ci-dessus augmente consid&ablement [239, 258, 260, 266] mais pour un temps limit~ compte tenu du turn-over rapide du t-PA [235, 236]. La perfusion de tissus isol~s (pattes de chien [267] ou de rat [268], oreille de pore [269-271]) a permis de montrer que l'adr~naline par exemple agit diree- tement sur les tissus de stockage du t-PA contrairement fi la DDAVP qui, inactive sur de tels syst~mes, en perfusion l'est sur l'organisme entier. La thrombine [272], la prot~ine C activ6e [273], pr6sentes lors de la formation du caillot, provo- quent la lib&ation de t-PA. L'augmentation du t-PA circulant apr~s occlusion veineuse (maxi- mum au bout de 20 minutes [274]) s'accompagne d'une diminution du contenu de la paroi veineuse en activateur du plasminog~ne [256]. Le m6ca- nisme mis en jeu pour la lib6ration du t-PA observ6e lors de la stase veineuse demeure in- certain; des voies neurog6niques seraient impli- qu6es [256,264]. Le stress et des substances comme la DDAVP agiraient indirectement au niveau d'un r6cepteur c6r6bral provoquant la

lib6ration d'un facteur RF [275]. Une augmentation au long cours (s'6tendant sur plusieurs se- maines) du contenu en t-PA de la paroi veineuse et du taux sanguin de cette enzyme est observ6e sous I'inflnence de st6roides anaboliques [276]. Le stanazolol seul ou 1'6thylestr6nol en pr6sence de phenformine ont 6t6 utilis6s avec succ~s dans le cas de thromboses r6currentes [256]. Des 6tudes in vitro ont montr6 que l'cestradiol augmente, dans des cultures de ceilules canc6reuses de sein (MCF-7), l'activit6 ~activatrice du plasmino- g~ne ~ de type tissulaire sans modification de celle li6e aux u-PA [277]. La dexam6thasone au contraire diminue l'activit6 li6e aux activateurs du plasminog~ne [244, 278-281]. Deux effets oppos6s de glucocorticoides ont 6t6 observ6s sur une lign6e d'h6patome de rat [244]: une diminution de l'activit6 li6e aux activateurs du plasminog~ne, probablement par induction d'un inhibiteur, et une amplification de I'action stimulatrice r6alis6e par les d6riv6s du cAMP. Des gonadotrophines et des prostaglandines stimulent la production in vitro d'activateurs du plasminog~ne par les cellules de la granulosa [107]. La production d'activateurs du plasminog~ne est stimul6e par la prolactine et des extraits pituitaires dans des carcinomes mammaires de rat et de souris alors qu'elle est inhib6e par l 'hydrocortisone [282]. Elle est stimul6e par la calcitonine dans les cellules tubulaires r6nales de porc [283].

Ainsi la modulation de la synth~se et de la s6cr&ion des activateurs du plasminog6ne par les hormones et les effecteurs de type hormonal (promoteurs de tumeurs, d6riv6s de l'acide r6ti- no~'que, prostaglandines et divers oncog6nes) est d'une importance consid6rable. Reich et coll. 6tudient la r6gulation hormonale de l'expressio_n des g~nes des activateurs du plasminog~ne. A cet effet, les cDNA et les s6quences g6nomiques d'activateurs du plasminog~ne (u-PA) de porc [284] et de souris [285] ont 6t6 clon6s. Nagamine et Reich [286] ont montr6 que la transciiption du g~ne de l'urokinase est la cible premi6re de l'effet stimulateur de la calcitonine pour la production de u-PA par les cellules de rein de porc. La dexam&hasone diminue l'induction du mRNA-PA lorsqu'elle est ajout6e en m~me temps que la calcitonine [286].

htvas ion lumorale et mdtas tases

La signification r6elle de l ' intervention,des activateurs du plasminog~ne dans la transforma- tion maligne, la croissance tumorale et les m6- tastases [3, 5, 22, 287-289] demeure incompl&e-

Activateurs du plasmh~ogOne 1209

ment comprise. Le probl6me est encore compli- qu6 par la pr6sence d'autres prot6ases dans ies tumeurs. Bien que les activateurs du plasmino- g6ne soient trouv6s h l'6tat de traces dans tousles tissus normaux, leur production semble accrue lorsqu'il y a canc6risation [4, 22-25, 47, 65, 89-92, 147, 290]. Les virus oncog6nes [93, 106] et les promoteurs de tumeurs [26] induisent une syn- th6se cellulaire et une lib6ration d'activateurs du plasminog~ne.

Ces enzymes pourraient jouer un r61e au nivau local dans rinvasion tumorale. En effet, la pr6- sence de fibrine (fibrinog6ne) h l'int6rieur, et souvent autour des tumeurs primaires, a 6t6 d6montr6e immunologiquement chez le Rat et chez rHomme [291-293] bien que ce r6sultat ne soit pas universel. Dans les cancers humains, les activit6s fibrinolytiques pr6sent6es par les tumeurs, ont~6t6 corr616es au caract6re invasif de celles-ci. Oh pense g6n6ralement que la plasmine lib6r6e sous l'influence des activateurs du plasmi- nog6ne, en d6gradant la fibrine entourant les tumeurs, permet l'envahissement des r6gions voisines par les cellules tumorales [294]. Les produits de d6gradation pourraient 6galement constituer pour la tumeur une r6serve nutritive [295] ainsi qu'un r6servoir de facteurs d'angiog6- n6se ce qui faciliterait la croissance des vaisseaux sanguins h l'int6rieur de la tumeur [296]. L'activation possible de la procollag6nase par la plasmine [297], la d6gradation de la laminine par cette m6me enzyme [298] et l'intervention d'autres prot6ases telles que les cathepsines B et D [299] sont 6galement des processus susceptibles d'intervenir dans l'invasion tumorale. Bien que des cultures de cellules m6tastatiques puissent produire de grandes quantit6s d'activateurs du plasminog~ne [300], l'intervention des activateurs du plasminog~ne via la plasmine lors de la lib6ration des cellules tumorales par la tumeur primaire demeure incertaine. Cependant, des observations h~ vitro sur des cultures de cellules [301] ou in vivo sur l'embryon d e poulet [288] ont montr6 que l'adjonction d'anticorps dirig6s contre les activateurs du plasminog6ne emp~che la lib6ration des cellules (dans le premier cas) et r6duit le nombre des m6tastases (dans le second cas). Les activateurs du plasminog~ne ne sont peut 6tre pas absolument n6cessaires pour que se manifeste ie comportement m6tastatique des cellules tumorales, mais leur pr6sence peut sans ambiguit6 l'ai- der.

La relation cancer-activateur du plasminog~ne ne se r~duit probablement pas h une action

uniquement fibrinolytique. Ce sont en effet les activateurs de type urokinase qui pr6dominent dans les tumeurs. Or ceux-ci pr6sentent une affinit6 pour la fibrine consid6rablement moins importante que le t-PA et lear activit6 n'est pas augment6e de faqon notable en pr6sence de fibrine. Leur acti~,it6 fibrinolytique, ~ concentration 6gale, est donc moins importante que celle du t-PA. Une analyse quantitative bas6e uniquement sur l'outil fibrinolytique a d'ailleurs pu conduire, dans certains cas, ~ des r6sultats erron6s en donnant l'impression que certains tissus n6o- plastiques contenaient moins d'activateurs que les tissus normaux correspondants. La pr6sence, dans les tumeurs, d'inhibiteurs des activateurs [248, 249] peut 6galement expliquer les diff6rences dans les r6sultats parfois obtenus entre diff6rents laboratoires. Le r61e de r6gulation in vivojou6 par ces inhibiteurs demeure inconnu. Eux-m6mes peuvent 6tre r6gul6s et lib6r6s diff6remment par rapport aux activateurs du plasminog~ne. La croissance tumorale et la production d'activateurs du plasminog6ne pourraient, dans certaines tumeurs, 6tre r6gul6es de fa~on coordonn~e sous rinfluence d'hormones [282, 302, 303].

Intdr~t thdrapeutique

La formation anormale de thrombus :~ l'int6- rieur de l'arbre vasculaire est responsable d'un nombre tr6s important de d6c6s. La th6rapeutique thrombolytique fait appel depuis de nombreuses ann6es & l'urokinase isol6e de I'urine ou de culture de tissus et h la streptokinase, activateur du plasminog6ne d'origine bact6rienne [44, 304-306]. L'urokinase recombinante n'est pas actuellement disponible & des fins th6rapeutiques. Compte tenu des proc6d6s d'obtention commer- ciaux, un traitement prolong6 & I'urokinase demeure on6reux [307]. Moins on6reux, le traitement par ia streptokinase expose aux accidents allergiques en cas de traitements r6p6t6s. En effet, prot6ine h6t6rog~ne ~ notre esp~ce, ia streptokinase est immunog6ne. De plus, l'urokinase comme la streptokinase provoque une activation syst6mique du plasminog6ne circulant; en cons6- quence, le risque h6morragique est important et entraine de nombreuses contre-indications. Le t-PA au contraire, dont la fixation et l'activit6 sont fibrino-d6pendants, a la propri6t6 d'activer le plasminog6ne fix6 sur les caillots; la formation de pouvoir prot6olytique susceptible d'hydrolyser les facteurs de la coagulation, le plasminog~ne et le fibrinog~ne circulants est donc 6vit6e. Le t-PA a 6t6 test6 avec succ6s, essentiellement par Collen


et coil., dans le traitement d'infarctus du myocarde, de thromboses veineuses et art6rielles [57-63, 308-312]. C'est le t-PA obtenu par ex- pression du g~ne clon6 de t-PA humain dans des cultures de cellules de mammif~res qui est actuellement utilis6 pour des essais cliniques sur des malades atteints d'affections cardiaques et de thromboses art6rieiles p~riph~riques. Les essais les plus r6cents en clinique humaine ont montr6 que l'efficacit6 du t-PA recombinant administr6 par voie intraveineuse est clairement sup6rieure

celle de la streptokinase dans le traitement des infarctus du myocarde [63,312]. On connait de nombreuse s lign6es cellulaires produisant le t-PA et il est int6ressant de noter qu'une m6thode vient d'etre d6crite permettant de produire le t-PA partir de cultures de ceilules normales (cellules embryonnaires de poumon) [313]. A c6t6 du t-PA, .objet d 'une comp6tition biotechnologique /l il'6chelle mondiale, d'autres voies sont explor6es !en vue de la production d'agents thrombolytiques efficaces : recherche de stimulants pour la syn- "th6se des activateurs du plasminog6ne, utilisation de pro-urokinase (dou6e d'affinit6 pour la fibrine) [203, 314, 315] et d'acyl-enzymes [316-318]. I1 a 6t6 id6montr6 qu'en pr6sence d'inhibiteurs, l'activation du plasminog~ne par la pro-urokinase a lieu au niveau de la fibrine exclusivement (comme I'activation pr6alable de la pro-urokinase), donc sans d6gradation secondaire du fibrinog~ne circulant [315]. Des r6sultats analogues ont 6t6 trouv6s in vivo chez le chien et le lapin [315]: la pro- urokinase apparait donc comme un agent thrombolytique efficace et pr6sentant peu de risques. Par ailleurs, des d6riv6s acyl6s de la plasmine et du complexe plasmine-streptokinase [316, 317] se montrent dou6s d'activit6 thrombolytique chez l 'homme [318]. Le risque syst6mique est potentiel- lement 6vit6 avec de telles mol6cules puisque la plasmine est d6pourvue d'activit6 puisqu'acyl6e au moment de son injection. Sa d6sacylation se produit apr6s la fixation sur la fibrine. La production d'activateurs du plasminog~ne acyl6s est 6galement une vole prometteuse de la th6rapie thrombolytique.

Remerciements

Je remercie le Professeur Fran¢ois Chapeville pour son intdr~t constant et l'.4ssociation pour le D~veloppement de la Recherche sur le Cancer pour son soutien financier.

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Les activateurs du plasminogène: aspects généraux et développements récents

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